WO2017119542A1 - 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트 - Google Patents

이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트 Download PDF

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WO2017119542A1
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albumin
heterologous
rejection
organ
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강희정
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한림대학교 산학협력단
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention is a kit for testing for organ transplant rejection, specifically, for rejection of transplantation by heterologous antibodies according to transplantation of heterologous organs, the antigen-antibody reaction against heterologous albumin of heterologous organ recipients, ie, antigen-antibody reaction against swine albumin.
  • the present invention relates to a test kit that can measure the rejection of organ transplantation in xenografts.
  • organ transplantation has been accepted as a clinically effective treatment, but the limited supply of organs serves as the most serious limiting factor in clinical treatment.
  • heterogeneous organs are being accepted as a new new technology to replace the insufficient donor organs in the future.
  • organs of pigs are readily available and conceptually limited as alternatives.
  • Xenograft xenograft transplantation using this pancreatic islet has been identified as the closest clinical application.
  • Anti-algalgal antibodies to the glycoprotein gal_a -1,3—gaKGal a— 1,3 Gal, a—Gal) produced by 1,3-galactosyltransferase, al, 3-gal -Gal is a substitute land for different species (Article 26) It has been reported to be the cause of hyper acute reject ion in non-human primate test animals after transplantation. In addition, this has been reported to be overcome by using the organs of pigs genetically lacking the ⁇ -1,3-galactosyltransferase synthase.
  • the anti-alphagal antibodies have been identified in a variety of human antibodies, namely IgM, IgG and IgA i sotypes.
  • the ⁇ -Gal is a protein identified in lower animals of primates or less, and when transplanting organs of lower animals, ie, heterologous organs, causes rejection in primates. It has been reported that it may be an important judgment ground in confirming organ damage and monitoring other immune responses induced by the ⁇ -Gal. Therefore, the accurate measurement of the rejection response to a—Gal has been reported to be very important in providing basic data regarding the judgment of high-risk patients and the use of immunosuppressive agents in xenotransplantation.
  • Patent Document 1 KR10-0313841B
  • Patent Document 2 KR10-2002-0090087A
  • Patent Document 3 KR10-0987547B
  • An object of the present invention is to solve the problems of the prior art as described above, the present invention relates to a test method and a test kit that can effectively identify the graft rejection response to organ transplantation of xenograft.
  • the present invention relates to a test kit for determining the anti-heteroalbumin antibody response by determining the reaction rejection by the heterologous antibody following the transplantation of the organs of the heterogeneous organ.
  • the test kit is an organ transplant rejection reaction using heterologous albumin for measuring graft rejection following organ transplantation in the long-term transplant which includes at least one heterologous albumin selected from the group consisting of pig-derived albumin and bovine-derived albumin.
  • the heterologous albumin may be pig-derived albumin or bovine-derived albumin, more preferably pig-derived albumin.
  • the heterologous albumin may be provided in a form for coating the substrate or membrane containing the heterologous albumin or the antigen solution containing the heterologous albumin in a kit for organ transplant rejection test using the heterologous albumin.
  • the present invention comprises an antigen comprising at least one heterologous albumin selected from the group consisting of pig-derived albumin and bovine-derived albumin to achieve the above object; Capable of measuring antigenic antibody response to the heterologous albumin; Provided is a kit for testing the rejection of organ transplantation using heterologous albumin to measure the rejection response following transplantation of organs in different organs.
  • the organ transplant rejection test kit using heterologous albumin is a test kit for performing an enzyme immunoassay (ELISA). It may be a kit for organ transplant rejection test using xenoalbumin to measure the.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • a heterologous antigen that is a carbohydrate-derived antigen that is expressed in a lower animal, which is a cause of acute rejection is usually related to an immune response generated by heterologous antibody transplantation.
  • antibody reactions that can occur after long-term transplantation in recipients of heterologous organs are determined using antigen-antibody reaction using heterologous protein-derived antigens, such as pig-derived albumin or bovine-derived albumin. By doing so, it is possible to effectively predict the rejection response to xenotransplantation more accurately.
  • FIG. 1 is a view showing whether the production of Ant i-Gal IgG and Ant i-non-Gal IgG caused by xenotransplantation in primate animals after porcine pancreas transplantation according to an embodiment of the present invention
  • La is a graph showing the results confirmed by the ELISA Ant i-Gal IgG
  • lb is Ant i-non-Gal IgG 1,3_alpha-galgalactose transferase gene pigs
  • Figure 3 shows the results of f low cy tome try using porcine endothelial cells (PEC69) of 3-a galactosyl transferase gene knockout (GTK0).
  • Figure 2 is to determine the type of specific IgG antibodies caused by xenotransplantation in primate animals after pig pancreas transplantation according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2a is Western blotting using a 2-DE gel
  • Western blot is a photograph showing the results
  • Figure 2b is human albumin (HA), pig albumin (PA), bovine albumin (BA) and, HA conjugated ⁇ -in plasma before and after transplantation of the non-human primate of Figure 2a
  • It is a graph which shows the result of measuring the antibody reactivity to Gal by ELISA.
  • 1 means BA (bovine serum albumin, gi 1351907)
  • 2 means PA (albumin, part iaKSus scrofa) and gi 164318).
  • 3 means calret icul in precursor (Sus scrof a, gi 291622246)
  • 4 means poly 4-hydroxylase beta polypept ide (Sus scrofa, gi 358009193)
  • 5 means cytoskeletal beta act in (part ial (Sus scrofa) ), gi 45269029).
  • FIG. 3 is a diagram showing human albumin (HA) and human albumin (HA) in human non-human primate plasma before and after transplantation in order to confirm the induction of antibodies to pig albumin by xenotransplantation in primate animals after islet transplantation according to an embodiment of the present invention.
  • PA bovine albumin
  • BA bovine albumin
  • the first and second lines are the angles before and after the xenograft for group 1.
  • ELISA results for the antibodies, line 3 is the ELISA results for each antibody before and after xenograft for group 2.
  • Group 1 and Group 2 differed in the types of immunosuppressants used. All.
  • the white bar graph means before organ transplantation and the black bar graph means after organ transplantation.
  • Alternative Paper (Article 26) 4 is a diagram showing human albumin (HA) and human albumin (HA) in human non-human primate plasma before and after transplantation in order to confirm the induction of antibodies to pig albumin by xenotransplantation in primate animals after islet transplantation according to an embodiment of the present invention.
  • PA bovine albumin
  • PA bovine albumin
  • ELISA the result of measuring EL antibody reaction against HA conjugated ⁇ -Gal by ELISA, which is the ELISA result for each antibody before and after xenograft for group 2.
  • FIG. 5 shows IgG antibody reaction against human albumin (HA), porcine albumin (PA), bovine albumin (BA), and HA conjugated a-Gal after xenograft transplantation by xenotransplantation according to an embodiment of the present invention.
  • the dotted line indicates the time point at which the xenotransplantation failed.
  • ⁇ ant i—Gal means that the ant i-Gal antibody did not increase after xenotransplantation.
  • ⁇ ant i-Gal indicates the ant i-Gal antibody. Means increased after transplantation.
  • FIG. 6 confirms the IgG antibody response to human albumin (HA), pig albumin (PA), bovine albumin (BA) and HA conjugated ⁇ -Gal by the second xenograft transplant according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 6A is the result for experimental animal (NHP) M4
  • FIG. 6B is the result for experimental animal (NHP) M5.
  • the present invention provides a test kit and test method that can effectively identify the graft rejection reaction in organ transplantation of xenograft.
  • the test kit and test method may be a test kit and test method using a heterologous antigen, that is, a heterologous albumin.
  • the test kit may be a test kit that can effectively confirm the rejection of transplantation by heterologous antibodies according to organ transplantation using heterologous albumin, specifically pig albumin or bovine albumin.
  • the present invention is one or more heterologous albumin selected from the group consisting of porcine albumin (Porcine albumin, PA) and bovine albumin (Bovine albumin, BA), preferably porcine albumin or bovine-derived albumin, more preferably
  • it may be a kit for testing for organ transplant rejection reaction using heterologous albumin, which can effectively identify transplant rejection response by heterologous antibodies according to organ transplantation using pig-derived albumin.
  • the heterologous albumin may be provided in the form of an antigen solution in a liquid form in the kit for organ transplant rejection reaction test using the heterologous albuminol, or may be provided in a form coated on a substrate or a membrane.
  • the present invention comprises one or more heterologous albumin selected from the group consisting of porcine albumin (Porcine albumin, PA) and bovine-derived albumin (Bovine albumin, BA) as an antigen, and measuring the content of the antibody against the heterologous albumin
  • porcine albumin Porcine albumin, PA
  • bovine-derived albumin Bovine albumin, BA
  • the present invention relates to a long-term transplant rejection reaction kit that can effectively confirm the rejection of the transplant graft according to the long-term transplant.
  • the inventors of the present invention relate to the rejection reactions caused by organ transplantation of heterologous antibodies, in particular, when the pig pancreatic islet, which is a pig-derived organ, is transplanted to a primate, specifically, one of the most primate experimental models of humans, a red graft.
  • the immune response associated with the rejection may be the cause of acute rejection.
  • porcine albumin or bovine albumin was measured in relation to the pig, which is a representative organ donor, for more accurate xenotransplantation. Confirmed that the immune response can be expected to complete the present invention.
  • the present invention will be described in more detail.
  • a subject or a laboratory animal is not particularly limited to a concept that may include all animals capable of performing immune response by transplantation of heterologous tissues or organs, preferably humans, monkeys, It may be a vertebrate, such as cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelope, dogs, rabbits, mice, etc., more preferably may be primates, and even more preferably may be primates except humans.
  • an enzyme immunoassay is one of enzyme immunoassays.
  • the enzyme immunoassay for antigens and antibodies are one of enzyme immunoassays.
  • Alternative Site (Article 26) It refers to a quantitative analysis method, and means the method of measuring the results of antigen and antibody reaction by using the degree of discoloration of the material represented by the reaction of the enzyme and substrate. It is a method to measure the discoloration degree by combining enzymes such as peroxidase, alkali-phosphatease, beta-galactosidase chemically with antigen or antibody and performing enzyme staining after specific antigen antibody reaction. .
  • the enzyme immunoassay is a method of measuring the amount of antigen or antibody using an antigen antibody response using an enzyme as a marker.
  • the present invention relates to a test kit capable of effectively confirming the rejection of transplantation by heterologous antibodies according to long-term transplantation of heterologous organs.
  • the present invention relates to a test kit for identifying anti-heteroalbumin antibody reactions based on anti-heterologous antibody reactions based on heterologous antibodies according to long-term transplantation of heterologous organs.
  • Rejection of transplantation following organ transplantation of xenograft organs comprising at least one heterologous albumin selected from the group consisting of derived albumin, preferably pig-derived albumin or bovine-derived albumin, more preferably pig-derived albumin
  • the present invention relates to a kit for testing organ transplant rejection using heterologous albumin for measuring a response.
  • the heterologous albumin may be provided in a form for coating the substrate or membrane containing the heterologous albumin or the antigen solution containing the heterologous albumin in a kit for testing the organ transplant rejection reaction using the heterologous albumin.
  • the organ transplant rejection test kit is a method for measuring antigen antibody binding response, preferably, enzyme-immunoimmunoentescent assay (ELISA)
  • Alternative Paper It may be a test kit for performing, and in this regard, a buffer (buf fer) commonly used for enzyme-immunoassay, specifically a dilut ion buf fer used to dilute the reaction solution, or Blocking buf fer and antigenic solution for suppressing nonspecific reactions.
  • the antigen solution is at least one heterologous albumin selected from the group consisting of pig-derived albumin (Porc ine albumin, PA) and bovine-derived albumin (Bovine albumin, BA), preferably pig-derived albumin or bovine It may be an antigen solution containing albumin derived, more preferably pig albumin derived.
  • the present invention also includes an antigen comprising at least one heterologous albumin selected from the group consisting of pig-derived albumin and bovine-derived albumin; Capable of measuring antigenic antibody response to the heterologous albumin;
  • the present invention relates to a kit for testing the rejection of organ transplantation using heterologous albumin, which measures transplant rejection following transplantation of xenotransplant organs.
  • the kit for organ transplant rejection using the heterologous albumin is at least one heterologous albumin selected from the group consisting of pig-derived albumin (Porc i ne albumin, PA) and bovine-derived albumin (Bovine albumin, BA), preferably pigs.
  • Derived albumin or bovine-derived albumin, more preferably porcine-derived albumin as an antigen to measure the content of the antibody against the heterologous albumin contained in the sample isolated from the individual such as blood of the experimental animal, or the antigen antibody response to the heterologous albumin By measuring, it is possible to confirm the rejection reaction by heterologous albumin antibody reaction which may occur in the experimental animal or individual.
  • the quantitative confirmation of the antibody response to the heterologous albumin may be a method for measuring antigen antibody binding reaction, preferably an enzyme immunoassay method, more preferably, an enzyme immunosorbent assay (ELISA).
  • kits of the present invention are those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains in connection with the performance of additional components required to perform enzyme immunoassay, specifically, enzyme immunoassay or enzyme immunoassay.
  • Constituent means that can be easily added, for example, an antibody against heterologous albumin, for example, a secondary antibody against Ant i-non-Gal IgG, etc. may be further included.
  • the method for measuring the antigen-binding reaction may be a radioimmunoassay (RIA), a sandwich assay, an immune blotting assay, etc. in addition to the enzyme immunoassay, but is not limited thereto.
  • RIA radioimmunoassay
  • sandwich assay an immune blotting assay
  • immune blotting assay etc. in addition to the enzyme immunoassay, but is not limited thereto.
  • pancreatic cluster was subjected to immunosuppression (IS) treatment at a content of 100,000 islet equivalents / kg per kg of experimental animals.
  • IS immunosuppression
  • ATG means ant i -thymocyte globul in (Thymoglobul in Genzyme, Cambridge, USA)
  • anti-ICAMl means ant i -human intercellular adhesion molecule 1 antibody
  • MMF Means mycophenolate mofetil
  • ant i—CD154 5C8, National Institutes of Health, Bethesda, USA
  • anti-CD40 2C10R4, National Institutes of Health, Bethesda, USA
  • Sirolimus means sirol imus (Rapamune Wyeth, USA), a commercial immunosuppressant.
  • group Kgroup I was divided into five mice that received only conventional immunosuppressant treatment, not CD40-CD154 blockers.
  • group II was divided into 25 mice that received an immunosuppressant based on CD40-CD154 blocker.
  • Group 2-A was divided into 10 rats treated with anti-ICAMl, sirolimus and anti_CD154
  • Group 2-B was divided into 7 rats treated with ATG, sirolimus and anti—CD154
  • Group 2 ⁇ C was ATG, siroliraus.
  • 7 mice treated with anti-CD40, and group 2-C was divided into 1 rat administered with sirolimus and anti-CD154.
  • the anti-CD154 via intravenous injection, 4 mg before organ transplantation, the day of organ transplantation, 3 days after organ transplantation and 7 days after transplantation, respectively, at a dose of 20 mg / kg,
  • Anti-Gal refers to an antibody against a heterologous antigen ga ⁇ ⁇ -1, 3—gal (Gal ⁇ 1,3 Gal, ⁇ -gal), and Anti-PA refers to an anti-pig albumin antibody.
  • Anti-BA refers to an anti-soalbumin antibody, and the numerical values shown in the above table refer to the number of the corresponding antibodies in the experimental animals.
  • the blood samples of each experimental animal were collected once a week before organ transplantation, on the day of organ transplantation, and until organ transplantation was confirmed to be unsuccessful, and stored in an EDTA tube. Store at -70® until used.
  • the experiment was performed by rehydration sample buffer (Bio-) from 150 cm of protein extracted from GTK0 endothelial cells (PEC6) using a DUALXtract total membrane protein extraction kit (Dual systems biotech AG, Switzerland) in 7 cm immobi 1ized H gradient (IPG) strips. Rad Laboratories, USA) was rehydrated at 20 ° C for 12 hours. Thereafter, separation was performed on a 2DE gel. First, Isoelectric focusing is performed using a 2-DE system (PROTEAN IEF Cell, Bio-Rad Laboratories, USA), 4 h vertical at 50 V, 20 min vertical at 250 V, 40 min horizontal at 2,000 V 2 hours horizontal conditions were performed. After the Isoelectric focusing, the IPG strip was equilibrated, and a 2-DE process was performed on 10% SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories).
  • protein 1 is BA
  • protein 2 is PA
  • protein 3 is calreticulin precursor
  • protein 4 is porcine poly 4 ⁇ hydroxylase beta polypeptide
  • protein 5 is porcine Cytoskeletal beta actin was identified.
  • the degree of reaction of the xenoreactive antibodies by xenotransplantation was determined by the following method (Choi HJ, Kim MK, Lee HJ, et al. Investigative ophthalmology & visual science 52: 6643-6650 (2011) ).
  • HA, PA, BA, and HA conjugated a ⁇ al were added to each well and then applied to each of 100! JS, and stored for one evening.
  • the stock solution was discarded and 5% HA blocking complete solution diluted with PBS was added to each of 100 ⁇ , followed by reaction at 37 ° C for 30 minutes. Subsequently, the reaction solution was discarded, washed five times with a wash solution containing 0.05% Tween 20, and then 100 li of a blood sample of a test animal grafted with PBS added with 1% HA was added to each well, 37 Rebounded at 30 ° C.
  • ant i-Gal IgG was confirmed in all the experimental animals of group 1, and in 1 month after organ transplantation, 4 of 25 animals, or 16%, were also detected in group 2 experimental animals.
  • Antibody responses to Ant i-PA were effectively inhibited by ant i-CD154 and sirol inius, whereas antibody responses to Ant i-Gal were limited.
  • immunosuppressive agents of ant i-ICAMl, ant i-CD154 and sirol i's were administered. Measurements prior to administration of the immunosuppressive agent showed higher antigenic antibody responsiveness to HA, BA, PA and Ga ⁇ HA than primary xenotransplantation. Blood was collected from experimental animals before and after the second xenograft transplant, and antigen antibody response to HA, BA, PA and Gal-HA in the blood sample was shown in FIG. 6. Bar

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Abstract

본 발명은 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 효과적으로 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트, 구체적으로 기존 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응의 원인으로 알려진 당단백질인 gal-α-1,3-gal에 대한 항체에 의한 항원항체반응이 아닌 이종 단백질인 이종 알부민에 대한 항체에 의한 항원항체반응을 측정하여, 보다 효과적으로 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 예측할 수 있는 검사용 키트에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트
【기술분야】
본 발명은 장기 이식 거부반응 검사용 키트 , 구체적으로 이종장기의 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반웅을 이종장기의 수여자의 이종알부민에 대한 항원항체반웅 즉， 돼지 알부민에 대한 항원항체반웅을 측정함으로써
이종장기의 장기 이식 거부반웅 여부를 측정할수 있는 검사용 키트에 관한것이다. 【배경기술】
다양한 질환에 있어서, 장기이식은 임상적으로 효과적인 치료법으로 받아들 여지고 있으나， 장기의 제한적 공급은 임상적 치료에 있어서， 가장 심각한 제한요 소로 작용되고 있다. 이러한 측면에서， 이종장기는 차후 부족한 공여장기를 대체 할 새로운 신기술로 받아들여지고 있으몌 특히 돼지의 장기는 손쉽게 활용가능하 고 개념적으로 거의 제한이 없는 대체제로 받아들여지고 있다. 이 증 돼지의 췌도 를 이용한 이종췌도이식은 가장 임상적용이 근접한 연구분야로 확인되고 있다. 그 러나， 이종장기를 이용한 장기이식의 임상활용에 있어서， 아직 많은 장벽이 존재하 고 있으며 , 특히 면역학적 장벽이 존재하고 있다.
이와 관련하여, 기존에는 1,3-알파갈락토오스 전달효소 (α
— 1,3-galactosyltransferase, a-l,3-gal)에 의해 만들어지는 당단백질인 gal_a -1，3— gaKGal a— 1,3 Gal, a— Gal)에 대한 항체즉，항 -알파갈항체 (Anti-Gal)는 이종장 대체용지 (규칙 제 26조) 기 이식 후 인간이 아닌 영장류 실험동물에서의 초급성 거부반웅 (hyper acute reject ion)의 원인이 되는 것으로 보고되고 있다. 그리고, 이는 α -1,3— galactosyltransferase의 합성효소를 유전적으로 결여시킨 돼지의 장기를 이 용함으로써 극복할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 상기 항-알파갈 항체 (Ant i-Gal )는 인간의 다양한 항체 즉， IgM, IgG 및 IgA i sotype에서 확인되었다. 상기 α -Gal은 영장류 이하의 하등동물에서 확인되는 단백질로， 하등동물의 장기 즉， 이종장기를 이식하는 경우, 영장류에서 거부반웅을 일으키는 원인이므로， 상기 α -Gal에 대한 거부반응을 측정하는 것은 장기훼손 여부의 확인 및 상기 α -Gal에 의해 유도되는 다른 면역반응을 모니터링함에 있어서 중요한 판단 근거가 될 수 있는 것으로 보고되고 있다. 그러므로， 상기 a— Gal에 대한 거부반웅을 정 확하게 측정하는 것은, 이종장기 이식에 있어서 고위험성 환자군에 대한 판단 여부 및 면역억제제 사용과 관련된 기본적인 자료를 제공함에 있어서 매우 중요한 것으 로보고되고 있다.
【선행기술문헌】
【특허문헌】
(특허문헌 1) KR10-0313841B
(특허문헌 2) KR10-2002-0090087A
(특허문헌 3) KR10-0987547B
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
2
대체용지 (규칙 제 26조) 본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로 서， 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반웅을 효과적으로 확인할 수 있는 검사방법 및 검사용 키트에 관한 것이다.
【과제의 해결 수단】 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반웅을 항—이종알부민 항체반웅을 측정하여 확인하는 검사용 키트에 관한 것으로, 상기 검사용 키트는 돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 항원으로 포함하는 것인 이 종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반웅을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트를 제공한다.
상기 이종 알부민은 바람직하게는 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민， 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민일 수 있다.
상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트에 상기 이종 알부민을 포함하는 항원액 또는 상기 이종 알부민을 포함하는 기 판또는 멤브레인에 코팅된 형태로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 , 돼지 유래 알부민 및 소 유 래 알부민으로 이루어진 군 증에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 포함한 항원 을 포함하고; 상기 이종 알부민에 대한 항원항체반웅을 측정할 수 있는; 이종장기 의 장기 이식에 따른 이식 거부반웅을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트를 제공한다.
3
대체용지 (규칙 제 26조) 상기 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트는 효소면역분석 법 (Enzyme- l inked Immunosorbent assay, ELISA)을 수행하기 위한 검사용 키트인 것 을 특징으로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알 부민을 이용한 장기 이식 거부반웅 검사용 키트일 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 검사용 키트의 경우， 통상적으로 이종장기의 항체이식에 의해 발 생되는 면역반웅과 관련하여， 초급성 거부반응의 원인이 되는 하등동물에서 발현되 는 탄수화물 유래 항원인 이종항원 즉， α -Gal을 측정한 기존 검사용 키트와 달리， 이종단백 유래 항원 즉, 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민을 이용하여 항원항 체반웅을 통해 이종장기의 수혜자 내에서 장기 이식 후 발생할 수 있는 항체반웅을 측정함으로써, 보다 정확하게 이종 장기 이식에 따른 거부반웅을 효과적으로 예축 할수 있다. 【도면의 간단한 설명】 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 췌장 이식 후의 영장류 동물에서 이종장기이식에 의해 유발되는 Ant i-Gal IgG 및 Ant i-non-Gal IgG의 항체 생성 여 부를 확인을 그래프로, 도 la 는 Ant i-Gal IgG는 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타 낸 그래프이고， 도 lb 는 Ant i-non-Gal IgG는 1，3_알파갈락토오스 전달효소 유전자 를 제거한 돼지 (1 ,3- a galactosyl transferase gene knockout (GTK0) )의 돼지 내피 세포 (porcine endothel ial cel l , PEC69)를 이용하여, f low cy tome try로 측정한 결 과를 나타낸 그래프이다
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대체용지 (규칙 제 26조) 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 췌장 이식 후의 영장류 동물에서 이종장기이식에 의해 유발되는 구체적인 IgG 항체의 종류를 확인하기 위한 것으로， 도 2a는 2-DE gel을 이용하여 웨스턴블롯팅 (Western blot )올 수행한 결과를 나타낸 사진이고, 도 2b는 도 2a의 인간외 영장류의 이식 전후의 혈장에서 사람 알부민 (HA) , 돼지 알부민 (PA) , 소 알부민 (BA) 및 , HA 접합 α -Gal에 대한 항체 반옹성을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2a에서 항원항체 반웅이 나타난 항 원을 화살표로 표시하였으며, 1은 BA(bovine serum albumin, gi 1351907)을 의미하 고, 2는 PA(albumin, part iaKSus scrofa) , gi 164318)을 의미하며, 3은 calret icul in precursor (Sus scrof a, gi 291622246)을 의미하고, 4는 poly 4-hydroxylase beta polypept ide(Sus scrofa, gi 358009193)을 의미하며， 5는 cytoskeletal beta act in(part ial (Sus scrofa) , gi 45269029)을 의미한다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 췌도 이식 후의 영장류 동물에서 이종 장기이식에 의해 돼지 알부민에 대한 항체 유발을 확인하기 위하여, 이식 전후의 인간외 영장류 혈장에서 사람 알부민 (HA) , 돼지 알부민 (PA) , 소 알부민 (BA) 및， HA 접합 α -Gal에 대한 항체 반웅성을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프로， 첫 번 째 줄과 두 번째 줄은 그룹 1에 대한 이종장기이식 전후의 각 항체에 대한 ELISA 결과이고, 세 번째 줄은 그룹 2에 대한 이종장기이식 전후의 각 항체에 대한 ELISA 결과이다. 표 1에 제시된 바와 같이 그룹 1과와 그룹 2는 사용한 면역억제제 종류 가 달랐다. 다. 각각의 그래프에서 흰색 막대 그래프는 장기이식 전을 의미하고， 검은색 막대 그래프는 장기이식 후를 의미한다.
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대체용지 (규칙제 26조) 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 췌도 이식 후의 영장류 동물에서 이종 장기이식에 의해 돼지 알부민에 대한 항체 유발을 확인하기 위하여， 이식 전후의 인간외 영장류 혈장에서 사람 알부민 (HA) , 돼지 알부민 (PA) , 소 알부민 (BA) 및， HA 접합 α -Gal에 대한 항체 반웅성을 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 그래프로， 그룹 2에 대한 이종장기이식 전후의 각 항체에 대한 ELISA결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이종장기 이식에 의한사람 알부민 (HA) , 돼지 알부민 (PA) , 소 알부민 (BA) 및 HA 접합 a -Gal에 대한 IgG 항체반웅을 이종장 기 이식 후 180일 동안 확인한 각 항체에 대한 ELISA 결과이다. 각각의 그래프에서 점선은 이종장기 이식이 실패한 시점을 의미하고， →ant i— Gal은 ant i-Gal 항체가 이종장기 이식 후 증가하지 않은 것을 의미하며 , † ant i-Gal은 ant i-Gal 항체가 이 종장기 이식 후 증가한 것을 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 2차 이종장기 이식에 의한 사람 알부민 (HA) , 돼지 알부민 (PA) , 소 알부민 (BA) 및 HA 접합 α -Gal에 대한 IgG 항체반응 정 도를 확인한 그래프로, 도 6a는 실험동물 (NHP) M4에 대한 결과이고， 도 6b는 실험 동물 (NHP) M5에 대한 결과이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 이식 거부 반웅을 효과적으로 확인할 수 있는 검사용 키트 및 검사방법을 제공한다. 상기 검 사용 키트 및 검사방법은 이종 항원 즉, 이종 알부민을 이용한 검사용 키트 및 검 사방법일 수 있다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 상기 검사용 키트는 이종 알부민， 구체적으로 돼지 알부민 또는 소 알부민을 항원으로 이용한 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반웅을 효과적으로 확인할수 있는 검사용 키트일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 돼지 유래 알부민 (Porcine albumin , PA) 및 소 유래 알부민 (Bovine albumin, BA)으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부 민， 바람직하게는 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민， 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민을 항원으로 이용한 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반웅 을 효과적으로 확인할 수 있는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반웅 검사용 키트일 수 있다. 상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민올 이용한 장기 이식 거부 반응 검사용 키트에 액상 형태의 항원액으로 제공되거나， 기판 또는 멤브레인 (membrane)에 코팅된 형태로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은돼지 유래 알부민 (Porcine albumin, PA) 및 소 유래 알부민 (Bovine albumin, BA)으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 항원으로 포함하고, 상기 이종 알부민에 대한 항체의 함량을 측정하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반웅을 효과적으로 확인할 수 있는 장기 이식 거부반웅 검사용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 발명자들은 이종항체의 장기이식， 구체적으로 돼지 유래 장기인 돼지 췌도를 영장류, 구체적으로 인간과 가장 유사한 영장류 실험모델 중 하나인 붉은털 원승이에 장기이식한 경우， 발생되는 거부반응과 관련하여 항원항체 반웅에 대해 연구하던 중， 해당 거부반응과 관련된 면역반응은 초급성 거부반응의 원인이
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대체용지 (규칙 제 26조) 되는 α -Gal에 대한 Ant i-Gal의 항체반웅뿐만 아니라, 돼지 알부민에 대한 항체 (Ant i-PA)에 의한 항체반응 및 소 알부민에 대한 항체 (Ant i-BA)에 의한 항체반웅이 동반될 수 있으며， 다양한 실험 조건에서도 이러한 항원항체반응 중, 탄수화물 항 원 (carbohydrate ant igen)인 α -Gal에 대한 Ant iᅳ 63】의 항체반응과 단백 으로 구성 된 ant i-돼지 알부민 항체반웅은 구분될 수 있음이 확인되었으며, 이러한 결과로부 터 기존 α -Gal에 대한 항체반응의 측정만으로는 이종장기의 이식에 따른 면역반응 을 효과적으로 예상할 수 없으며， 이와 별도로 이종 단백질에 대한 항체반응도 측 정하는 것이 필요함을 확인하였으며, 이에 따라 대표적인 장기 공여체인 돼지와 관 련하여, 돼지알부민 또는 소알부민에 대한 항체반웅을 측정함으로써， 보다 정확한 이종장기 이식에 따른 면역반웅을 예상할 수 있을 것으로 확안하여， 본 발명을 완 성하였다. 이하, 본 발명올 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서， 개체 (subject ) 또는 실험동물이란 이종 조직 또는 기관의 이식에 의한 면역반웅을 수행할 수 있는 모든 동물이 포함될 수 있는 개념으로 특 별히 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 인간， 원숭이, 소， 말, 양， 돼지， 염소， 낙타， 영양， 개， 토끼, 마우스 등의 척추동물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 영장 류일 수 있으며， 더더욱 바람직하게는 인간을 제외한 영장류일 수 있다.
본 발명에 있어서， 효소면역분석법 (Enzyme-l inked Immunosorbent assay, ELISA)이란 효소면역측정법의 하나이다. 상기 효소면역측정법은 항원 및 항체에
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대체용지 (규칙 제 26조) 대한 정량적 분석기법을 의미하며， 항원 및 항체 반웅의 결과를 효소 및 기질의 반 웅 결과로 나타는 물질의 변색 정도를 이용하여 측정하는 방법을 의미한다. 페르 옥시데이즈, 알칼리-포스포테이즈， 베타-갈락토시데이즈 등의 효소를 화학적으로 항원 또는 항체와 결합시켜, 특이적인 항원항체 반응 후에 효소염색을 시행함으로 써， 그 변색정도를 측정하는 방법이다. 상기 효소면역분석법은 효소를 표식자로 이용하여 항원항체반웅을 이용한항원 또는 항체량을 측정하는 방법이다. 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반응을 효과적으로 확인할수 있는 검사용 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 이종장기의 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반웅을 항 -이종알부민 항체반웅을 축정하여 확인하는 검사용 키트에 관한 것으 로, 상기 검사용 키트는 돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중 에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민， 바람직하게는 돼지 유래 알부민 또는 소 유 래 알부민， 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민을 항원으로 포함하는 것인 이종장 기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트에 관한 것이다. 상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트에 상기 이종 알부민을 포함하는 항원액 또는 상기 이종 알부민을 포함하는 기 판 또는 멤브레인에 코팅된 형태로 제공될 수 있다. 상기 장기 이식 거부반응 검사용 키트는 항원항체결합반웅을 측정하는 방 법, 바람직하게는 효소면역분석법 (Enzyme- l inked Immunosorbent assay, ELISA)을
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대체용지 (규칙제 26조) 수행하기 위한 검사용 키트일 수 있으며, 이러한 점에서 통상적으로 효소면역분석 법에 사용되는 완충액 (buf fer ) , 구체적으로 반웅액을 희석시키기 위해 사용되는 희 석 완층액 (di lut ion buf fer ) 또는 비특이성 반웅을 억제하기 위한 차단 완충액 (blocking buf fer )과 항원액을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항원액은 항원으로 돼 지 유래 알부민 (Porc ine albumin, PA) 및 소 유래 알부민 (Bovine albumin, BA)으로 이루어진 군 증에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민, 바람직하게는 돼지 유래 알부 민 또는 소 유래 알부민, 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민을 포함한 항원액일 수 있다.
또한， 본 발명은 돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중 에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 포함한 항원을 포함하고; 상기 이종 알부민 에 대한 항원항체반웅을 측정할 수 있는; 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부 반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반웅 검사용 키트에 관한 것 이다.
상기 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트는 돼지 유래 알 부민 (Porc i ne albumin, PA) 및 소 유래 알부민 (Bovine albumin, BA)으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민， 바람직하게는 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민， 더욱 바람직하게는 돼지 유래 알부민을 항원으로 이용하여 실험동 물의 혈액 등 개체로부터 분리된 샘풀에 포함된 이종 알부민에 대한 항체의 함량을 측정하거나， 이종 알부민에 대한 항원항체반웅을 측정하여, 실험동물 또는 개체에 서 발생될 수 있는 이종 알부민 항체반응에 의한 거부반웅을 확인할 수 있으며， 이
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대체용지 (규칙 제 26조) 로부터 기존 Ant i-Gal 항체반응에 의한 거부반웅의 측정만으로는 확인할 수 없었던 이종장기 이식에 의한 거부반웅을 확인할 수 있다는 측면에서 이종장기 이식에 따 른 거부반웅을 보다 정확하게 예측할 수 있는 특징이 있다.
상기 이종 알부민에 대한 항체반응에 대한 정량적 확인은 항원항체결합반웅 을 측정하는 방법, 바람직하게는 효소면역측정법, 더욱 바람직하게는 효소면역분석 법 (Enzyme- l inked Immunosorbent assay, ELISA)일 수 있다. 이러한 측면에서 , 본 발명의 키트는 효소면역분석법을 수행하기 위해 요구되는 추가적인 구성수단, 구체 적으로 효소면역측정법 또는 효소면역분석법의 수행과 관련하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 추가할 수 있는 구성수단， 일 예 로 이종 알부민에 대한 항체, 일 예로 Ant i-non-Gal IgG 등에 대한 2차 항체 등올 더 포함할 수 있다.
상기 항원항체결합반웅을 측정하는 방법은 상기 효소면역분석법 외에 방사 선 면역측정법 (radioimmunoassay, RIA) , 샌드위치 측정법 (sandwich assay) , 면역 블롯팅 분석법 등일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 이하， 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
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대체용지 (규칙 제 26조) <실시예. 돼지 췌장 이식에 의해 유발된 항원항체체반웅의 확인 > 본 발명에서 기존 이종장기 즉， 돼지 췌장의 이식에 의한 거부 반응을 진단 하기 위한 시스템의 문제점을 개선하기 위해， 우선적으로 돼지 췌장 이식에 의해 유발되는 영장류 동물에서의 항체 종류를 확인하기 위하여 , 비인간성 영장류 (non- human primates, NHPS)로 Rh factor를 가진 의학 실험용 원숭이인 붉은털 원숭이 (rhesus monkey)에 대해 돼지 췌장 이식 (intraportal porcine islet transplantation(PITX)을 수행하고 (Kang HJ et al. , Transplantation 97 ： 999 - 1008(2014)), 투여된 면역억제제의 종류에 따른 항체의 발생 여부를 확인하였다. 간략하게， 돼지의 췌장 (porcine islet)은 축소된 성인 돼지 (miniature adult pig, 서을대학교, 대한민국)로부터 변형된 리코르디법 (Ricordi method)으로 분리하 고 (Kim HI, et al. , Xenotransplantation 16 ： 11 - 18(2009), Jin SM et a人， Xenotransplantation 18 ： 369 - 379(2011)), 돼지 췌장 이식 (porcine islet transplants ion((PITX)) 전 24시간 동안 10% 돼지 혈청 (porcine serum)이 첨가된 Medium 199(Gibco BRL, Life Technologies Ltd. , 영국)를 이용하여 37°C에서 부유 배양법 (free-floating method)으로 배양하였다.
상기 붉은털 원승이 30마리에 대해 실험을 수행하였고， 상기 분리된 췌장 클 러스터 (islet cluster)를 실험동물 1 kg 당 100,000 islet equivalents /kg의 함량 으로 면역억제제 (immunosuppression, IS) 처리를 수행한 스트랩토조토신 유래 제 1 형 당뇨병 (streptozotocin-induced type 1 diabetes)을 갖는 붉은털 원승이 (rhesus monkey)에 주입하였다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 상기 붉은털 원숭이에 대한 면역억제제 처리 종류 및 함량 (regimen)을 달리 하여 실험을 수행하였다. 상기 면역억제제 처리 종류 및 함량에 따라， 하기 표 1 과 같이 그룹을 구분하여 실험동물을 구분하였다. 하기 표 1에 기재된 면역억제제 와 관련하여 , ATG는 ant i -thymocyte globul in(Thymoglobul in Genzyme , Cambridge, USA)를 의미하고, anti—ICAMl는 ant i -human intercellular adhesion molecule 1 antibody를 의미하며， MMF는 mycophenolate mofetil를 의미하고, ant i— CD154(5C8 , National Institutes of Health, Bethesda, USA)는 CD154에 대한 항체를 의미하며， anti-CD40(2C10R4, National Institutes of Health, Bethesda, USA)는 CIMO에 대한 항체를 의미하고, sirolimus는 시판되는 면역억제제인 sirol imus(Rapamune Wyeth, USA)를 의미한다. 구체적으로, 그룹 Kgroup I)의 경우, CD40-CD154 차단제가 아닌 통상적인 면역 억제제 치료만을 투여한 5마리로 구분하였다. 반면에, 그룹 2(group II)는 CD40-CD154 차단제에 기초한 면역 억제제를 투여한 25마리로 구분하였다. 그룹 2-A는 anti-ICAMl, sirolimus 및 anti_CD154를 투여한 10마리로 구분하였고， 그룹 2-B는 ATG, sirolimus 및 anti— CD154를 투여한 7마리로 구분하였으며， 그룹 2ᅳ C는 ATG, siroliraus 및 anti-CD40를 투여한 7마리로 구분하였고， 그룹 2-C는 sirolimus 및 anti-CD154를 투여한 1마리로 구분하였다. 상기 anti-CD154의 투여와 관련하여, 정맥주사를 통하여， 장기이식 4일전， 장기이식 당일 , 장기이식 3일 후 및 7일 후 각각 20 mg/kg함량으로 투여하였고,
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대체용지 (규칙제 26조) 이 후， 3개월 동안 매주 1회 투여하였다. 이후， 그룹 2-A의 경우, 투여를 중단하였고, 그룹 2-B는 실험이 끝날 때가지 격주로 투여하였다. 상기 anti-CD40 의 투여는 정맥주사를 통하여， 장기이식 4일 전， 장기이식 당일 , 장기이식 3일 후， 7일 후 및 12일 후 각각 30 mg/kg 함량으로 투여하였고, 이 후, 실험이 끝날 때까 지 매주 1회 투여하였다. 상기 sirolimus의 투여와 관련하여， 장기이식 9일 전부 터 매일 3 /g/ml 내지 8 / /ml의 범위에서 안정적인 최저 혈중 농도가 유지되는 함 량으로 구강으로 투여하였다. 상기 anti-ICAMl 의 투여는 정맥주사를 통하여， 장 기이식 9일 전， 6일 전 및 3일 전 각각 8 mg/kg 함량으로 투여하였고， 상기 ATG의 투여는 정맥주사를 통하여, 장기이식 3일 전 및 1일 전 5 mg/kg 함량으로 투여하였 다.
하기 표 1에서 Anti-Gal은 이종항원인 ga卜 α -1 ,3— gal (Gal α 1,3 Gal, α -gal)에 대한 항체를 의미하며， Anti-PA는 항 -돼지알부민 항체를 의미하고， Anti-BA는 항-소알부민 항체를 의미하며, 상기 표에 기재된 수치는 실험동물 중 해 당 항체가 확인된 개체수를 의미한다.
【표 1】
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대체용지 (규칙 제 26조)
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상기 각 실험동물의 혈액 샘플을 장기이식 전, 장기이식 당일 및 장기이식 후 장기이식이 실패된 것으로 확인될 때까지 1주일에 1회씩 채취하여， EDTA 튜브 (EDTA tube)에 보관한후, 실험에 사용될 때까지 -70®에서 보관하였다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이， 그룹 1의 수혜자의 경우， Anti— Gal (100%) 및 Anti-PA(100%)와 관련하여 모두 개체에서 확인되었고, Anti-BA의 경우， 3개체 (60%) 에서 확인된 반면， 그룹 2의 수혜자의 경우， Anti-Gal과 관련하여 4개의 개체 (16%) 에서 항체가 확인되었을 뿐, Anti-PA와 Anti-BA에 대해서는 항체가 확인되지 아니 하였다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 구체적으로, 돼지 췌장 이식 후의 영장류 동물에서 이종장기이식에 의해 유 발되는 이종 단백질에 의한 항체 즉， Anti-non-Gal을 측정하기 위하여， Anti— Gal과 Anti-non-Gal을 상기 표 1의 M4 실험동물의 샘플을 이용하여 ELISA 및 유동세포계 수법 (flow cytometry)으로 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도 la 및 도 lb에 나타낸 바와 같이， Anti-Gal과 Anti-non-Gal 모두 이종장기이식 이후에 비인 간성 영장류 수혜자인 붉은털 원숭이로부터 채취한 혈액 샘플에서 급격한 증가가 확인되었다.
상기 결과로부터， 급격하게 증가가 유발된 anti-non-Gal 항체의 항원을 규명 하기 위하여， 이종장기 이식 전후의 상기 표 1의 M4 실험동물의 샘플을 이용하여 웨스턴블롯팅을 수행하였다.
상기 실험은 GTK0 내피세포 (PEC6)로부터 DUALXtract total membrane protein extraction kit (Dual systems biotech AG, Switzerland)을 이용하여 추출한 단백질 150 jug을 7 cm immobi 1 ized H gradient ( IPG) strips에서 rehydration sample buffer (Bio-Rad Laboratories, USA)을 이용하여 20°C에서 12시간 동안 재수화하였 다. 이후, 2DE gel에서 분리를 수행하였다. 우선， Isoelectric focusing은 2-DE system(PROTEAN IEF Cell, Bio-Rad Laboratories, USA)을 이용하여， 50 V에 서 4시간 수직， 250 V에서 20분 수직， 2,000 V에서 40분 수평ᅳ 4,000 V에서 2시간 수평의 조건으로 수행하였다. 상기 Isoelectric focusing을 수행한， IPG strip을 평형화시킨 후' 10 % SDS-PAGE(Bio-Rad Laboratories)에서 2-DE 과정을 수행하였
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대체용지 (규칙 제 26조) 다.
상기 2DE 과정을 수행한투， Coomassie brilliant blue(Coomassie brilliant blue G-250(Bio- ad Laboratories, USA))를 이용하여 염색하고， 상기 표 1의 M4 실 험동물의 이종장기 이식 전후의 혈액샘플을 이용하여 Γ¾ HA와 AmershamTM ECL prime western blotting detect ion reagent (GE Healthcare, USA)를 이용하여， 웨 스턴블롯팅을 수행한 후， 단백질을 확인하는 방법으로 수행하였다. 상기 면역염색 결과 후 단백질 확인은 트립신을 이용하여 단백질을 분리한 후, MALDI-TOF/TOF 질 량분석법 (mass spectrometry)으로 질량을 측정하여 방법으로 수행하였다. 상기 측정결과를 도 2a에 나타내었다.
상기 도 2a에 나타낸 바와 같이， 상기 도 2a의 1번 단백질은 69,248， 2번 단 백질은 71,348, 3번 단백질은 48,429， 4번 단백질은 56,763, 5번 단백질은 40,194 로 분자량이 측정되었고， MASCOT 분석 (MASCOT analysis, MASCOT 2.3.01) 결과， 각 각， 1번 단백질은 BA, 2번 단백질은 PA, 3번 단백질은 calreticulin 전구체， 4번 단백질은 porcine poly 4一 hydroxylase beta polypeptide, 5번 단백질은 porcine cytoskeletal beta actin으로 확인되었다.
상기 측정 결과， anti-non-Gal 항체 반웅의 원인이 된 항원으로， BA, porcine poly 4-hydroxylase beta polypeptide 및 porcine cytoskeletal beta act in로 예상되었다.
상기 결과와 관련하여， 장기이식 자체에 의해 어떤 항체가 증가되는지 여부 를 명확하게 하기 위하여， 이종장기이식 전후의 M4 실험동물의 혈액 샘플에 대해，
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대체용지 (규칙 제 26조) 사람 알부민 (HA), 돼지 알부민 (PA), 소 알부민 (BA) 및， HA 접합 cx-Gal(HA - conjugated Gal, Gal-HA)를 각각 포함하는 항원액을 이용하여 상기와 같은 실험을 수행하였고， 항체 결합 정도를 ELISA로 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 2b에 나 타내었다.
상기 이종장기이식에 의한 이종반응 항체 (Xenoreactive antibodies)의 반웅 정도는 다음과 같은 방법으로 측정하였다 (Choi HJ, Kim MK, Lee HJ, et al . Investigative ophthalmology & visual science 52:6643 - 6650(2011)) .
구체적으로， 각각의 well에 HA, PA, BA 및 HA 접합 a©al(Gal_HA, 5 g/mL; GlycoTech, USA) 포함 항원액 100 !JS 각각 첨가하여 도포하고, 하루 저녁 동안 보관한 후， 항원액을 버리고， PBS로 회석한 5% HA 차단 완층액을 100 ^씩 첨가한 다음, 37°C에서 30분 동안 반응시켰다. 이후， 반응액을 버리고， 0.05% Tween 20이 첨가된 세척 완층액으로 5회 세척한 후， 1% HA를 첨가한 PBS로 회석시킨 실험동물 의 혈액 샘플 100 li을 각 웰에 첨가한 후， 37°C에서 30분 동안 반옹시켰다. 이 早, per oxidase一 conjugated ant i -human IgG(Sigraa-Aldr ich, USA)를 이용하여 항원 항체 반웅 후, 발색반웅을 진행하고， 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도에 대한 수치와 1% HA를 첨가한 PBS 샘플 (음성대조군) 흡광도를 뺀 결과를 도 2b에 나 타내었다.
상기 도 2b에 나타낸 바와 같이， 이종장기이식 후에는 HA에서 항체반응아거 의 증가되지 않는 것에 비하여， BA, PA 및 Gal— HA의 경우에는 현저하게 반응성이 증가되는 것이 확인되었다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 상기 이종항원 항체반웅이 면역억제제에 따라 어떻게 영향을 받는지 확인하 기 위하여, 일반적인 면역억제제와 CD40와 CD154에 의한 항원항체반웅의 차단제 (CD40-CD154 blockade)를 사용하였을 경우 이종항원항체반응의 억제에 대해 실험을 수행하였다. 상기 실험은 상기 표 1의 실험동물 중에서 그룹 1 및 그룹 2-A에 대 해 수행하였다. 상기 실험결과를 상기 표 1 및 도 3에 나타내었다.
상기 표 1 및 도 3에 나타낸 바와 같이， CD40-CD154 blockade를 위한 면역억 제제가 투여되지 않은 그룹 1의 실험동물에서， ant i-PA IgG에 대한 항체반웅이 100% 유도된 반면， 상기 표 1 및 도 3과 도 4에 나타낸 바와 같이， 그룹 2의 실험 동물에서는 ant i-PA IgG에 대한 항체반웅이 확인되지 않았다. 또한, ant i-BA IgG 의 경우， CD40-CD154 blockade를 위한 면역억제제가 투여되지 않은 그룹 1의 실험 동물의 60%에서 항체반응이 유도된 반면， 그룹 2의 경우， 항체반웅이 확인되지 않 았다.
한편， ant i-Gal IgG의 경우， 그룹 1의 실험동물에서는 모두 확인이 되었고， 장기이식 후 1달이 경과된 시점에서 그룹 2의 실험동물에서도 25마리중 4마리 즉， 16%에서 확인되었다. 또한， ant i-Gal IgG의 정도가 그룹 2의 4개의 개체 (0.29 士 0. 15)의 면역반웅에 비하여 그룹 1(1.66 士 0.49)이 1현저히 높은 것으로 확인되었 다 (P=0.0275 , t test ) .
상기 결과로부터， CD40-CD154 blockade를 위한 면역억제제와 sirol imus는 장 기이식 후, ant i-PA와 ant i-BA에 대한 면역반웅을 완벽히 차단하는 반면， ant i-Gal 에 대한 면역반응은부분적으로 차단하는 것으로 확인되었다.
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대체용지 (규칙 제 26조) ant i-Gal에 대한 면역반웅과 달리 ant i-PA와 ant i-BA에 대한 면역반웅은 항 원에 대한 접촉 후 천천히 진행되는 경향이 있으므로, 6개월 동안 면역반응을 관찰 하였다. 확인결과， 그룹 1의 경우， 모두 장기이식에 실패한 것으로 확인되었으나， 그룹 2의 경우， 장기이식 성공여부가 각각 상이하게 나타난 것으로 확인되었다. 특히， 그룹 2의 C 및 D의 경우, 항체반응은 효과적으로 억제되었음에도 블구하고， 장기이식은 실패한 것으로 확인되었다. 장기이식 후, 그룹 2의 A의 9 개체와 그룹 2의 B의 6개체가 인술린의 외부 주입 없이 1개월 이상 생존하여, 장기이식에 성공 한것으로 확인되었다.
도 5에 나타난 바와 같이 이식 후 180일까지 추적 관찰하였을 때， 상기 실험 동물에 적용한 면역억제제의 처방에 따라 나타난 상이한 결과로， Ant i-BA 및
Ant i-PA에 대한 항체반응은 ant i-CD154 및 si rol inius에 의해 효과적으로 억제되는 반면， Ant i-Gal에 대한 항체반응은 제한적으로 억제되는 것으로 확인되었다.
또한， 상기 이종항원 항체반웅에 의해 장기이식이 실패된 그룹 1의 실험동물 에 대해서， 6개월 후에, M4 및 M5 실험동물에 대해서， 돼지 췌도 이식 즉, 2차 장 기이식을 다시 수행하였다. 2차 이종장기 이식에 앞서서， 상기 개체에 대해 그룹
2-A와 같이, ant i-ICAMl , ant i-CD154 및 sirol i腿 s의 면역억제제를 투여하였다. 상기 면역억제제 투여 이전에 측정한 결과， 1차 이종장기 이식 보다 HA, BA, PA 및 Ga卜 HA에 대한 항원항체반옹이 더 높은 것으로 확인되었다. 2차 이종장기 이식 전 및 후 실험동물로부터 혈액을 채취하여， 혈액 샘플에서의 HA, BA, PA 및 Gal-HA에 대한 항원항체반웅을 수행한 결과를 도 6에 나타내었다ᅳ 상기 도 6에 나타낸 바와
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대체용지 (규칙 제 26조) 같이, Ant i-Gal에 대한 항체반응은 오히려 낮아진 반면, Ant i-BA 및 Ant i-PA에 대 한 항체반웅은 급격히 높아지거나， 높은 상태를 유지하는 것으로 확인되었다. 이 러한 결과로부터, Ant i— Gal에 대한 항체반응과 Ant i—BA 및 Ant i-PA에 대한 항체반 웅은 상이한 경로에 의해 조절되는 것으로 예상되었으며， 상기 Ant i-PA에 의한 반 웅과 Ant i— BA에 의한 반웅은 연관성이 있는 것으로 확인되었다
상기에서 확인된 결과로부터， Ant i-Gal 뿐만 아니라, PA를 포함한 비영장류 동물 유래 알부민과 같은 이종단백 모두 이종장기에 의한 거부반응의 원인이 되는 것으로 확인되었으며， 이러한 결과로부터 단순히 α -Gal에 대한 면억억제 뿐만 아 니라, 이종 알부민 즉， 이종 단백에 대한 면억억제와 관련된 방법도 제안되어야， 효과적인 장기이식에 의한 거부반응의 억제 전략이 수립될 수 있는 것으로 확인되 었다.
상기 결과로부터， 이종장기 이식에 있어서， 초급성 거부반응의 원인이 되는 이종항원인 α -gal과 관련된 거부반웅뿐만 아니라， 이종 단백이 항원이 되는 면역 반응도 이종장기의 이식의 성공여부를 결정하는 요인이 됨이 확인되었고， 따라서， 장기이식과 관련하여， 이종 알부민에 대한 면역반응을 확인함으로써， 이종장기를 공급받는 수여자 즉， 환자의 장기이식 가능성을 보다 정확하고 면밀하게 예측할 수 있을 것으로 확인되었다. 이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발
21
대체용지 (규칙 제 26조) 명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범 위에 속하는 것이다.
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대체용지 (규칙 제 26조)

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】 이종장기의 장기 이식에 따른 이종 항체에 의한 이식 거부반응을 항-이종알 부민 항체반웅을 측정하여 확인하는 검사용 키트에 관한 것으로， 상기 검사용 키트는 돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 항원으로 포함하는 것인 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반웅을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트.
【청구항 2]
제 1항에 있어서,
상기 이종 알부민은 돼지 유래 알부민 또는 소 유래 알부민인 것을 특징으 로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반웅을 측정하는 이종 알부민을 이 용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트ᅳ
【청구항 3]
저 12항에 있어서，
상기 이종 알부민은 돼지 유래 알부민인 것을 특징으로 하는 이종장기의 장 기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반 웅 검사용 키트.
【청구항 41
제 1항에 있어서,
23
대체용지 (규칙 제 26조) 상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민을 포함하는 항원액인 것을 특징으로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반웅을 측정하는 이종 알부민을 이용 한 장기 이식 거부반웅 검사용 키트.
【청구항 5】 제 1항에 있어서,
상기 이종 알부민은 상기 이종 알부민을 포함하는 기판 또는 멤브레인에 코 팅된 것을 특징으로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반웅을 측정하는 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트.
【청구항 6]
돼지 유래 알부민 및 소 유래 알부민으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 이종 알부민을 포함한 항원을 포함하고;
상기 이종 알부민에 대한 항원항체반웅을 측정할 수 있는;
이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반응을 측정하는 이종 알부민을 이 용한 장기 이식 거부반응 검사용 키트.
【청구항 7】 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 이종 알부민을 이용한 장기 이식 거 부반응 검사용 키트는 효소면역분석법 (Enzyme- l inked Immunosorbent assay, ELISA) 을 수행하기 위한 검사용 키트인 것을 특징으로 하는 이종장기의 장기 이식에 따른 이식 거부반웅을 측정하는 이종 알부민을 이용한장기 이식 거부반웅 검사용 키트.
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대체용지 (규칙 제 26조)
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