WO2017107885A1 - 抗人程序性死亡受体1抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

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Definitions

  • a first aspect of the invention relates to an isolated Human Program Death Receptor-1 (hPD-1) antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the heavy chain variable region CDR1 sequence is SEQ ID NO:
  • the CDR2 sequence is set forth in SEQ ID NO: 2
  • the CDR3 sequence is set forth in SEQ ID NO: 3
  • the CDR1 sequence of the light chain variable region is set forth in SEQ ID NO: 4
  • the CDR2 sequence is SEQ.
  • the CDR3 sequence is set forth in SEQ ID NO: 6
  • the CDR sequence of the heavy or light chain has at least 70% homology to the sequence set forth in SEQ ID NO: 1-6 and is retained.
  • a second aspect of the invention relates to a composition comprising the anti-hPD-1 antibody or antigen-binding fragment thereof of the above first aspect.
  • the advantages of the anti-human PD-1 antibody or antigen-binding portion thereof of the present invention are particularly manifested in that its activity of blocking PD1/PDL1 is significantly improved compared to the prior art, for example, compared with the prior art BMS01.
  • the activity of PD1/PDL1 was increased by 6-fold (as shown in Example 6 and Figure 6, the SG001 antibody half-inhibitor amount was 1.47 ⁇ 0.227 ⁇ g/mL, which was significantly better than the positive antibody BMS01 (10.62 ⁇ 0.536 ⁇ g/mL), P ⁇ 0.0001).
  • compositions comprising a therapeutically effective amount of an anti-hPD-1 antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention.
  • Such compositions are, for example but not limited to, immunoconjugates, bispecific molecules, and pharmaceutically acceptable carriers and the like.
  • the compositions of the invention may also comprise another active ingredient, such as another active ingredient for modulating the immune response of a subject.
  • the stringent hybridization conditions are for illustrative purposes, for Suitable moderately stringent conditions for testing the hybridization of a polynucleotide of the invention to other polynucleotides include pre-washing in a solution of 5 x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0); at 50-60 ° C, 5 x Hybridization under SSC, overnight conditions; further washing twice with 2 ⁇ , 0.5 ⁇ and 0.2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C for 20 minutes, suitable high stringency hybridization conditions including the above conditions, different It is the hybridization temperature that rises, for example, to 60-65 ° C or 65-70 ° C.
  • Vector includes both a shuttle vector and an expression vector.
  • plasmid constructs also include an origin of replication (such as the origin of the replicated ColE1) and a selectable marker (such as ampicillin or tetracycline resistance) for plasmid replication and selection in bacteria, respectively.
  • Expression vector refers to a vector comprising control sequences or regulatory elements required for expression of an antibody of the invention, including antibody fragments, in a bacterial or eukaryotic cell.
  • high affinity binding refers to anti-hPD-1 antibody at 1 ⁇ 10 -7 M in K D or less with human PD-1 binding, for example at least 1 ⁇ 10 -7 M, 1 ⁇ 10 -8 M, 1 ⁇ 10 -9 M, 1 ⁇ 10 -10 M, 1 ⁇ K D 10 -11 M 's.

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Abstract

抗人程序性死亡受体1抗体及其制备方法和用途。制备方法包括利用天然抗体库筛选平台筛选获得的一株新型抗人程序性死亡受体1抗体。筛选得到的抗体能够特异性识别人PD-1分子，用于阻断PD-1/PD-L1以及PD-1/PD-L2相互作用，提高免疫应答水平。

Description

抗人程序性死亡受体1抗体及其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及抗人程序性死亡受体1(Human Program Death 1Receptor，hPD-1)抗体及其制备方法和用途。
背景技术
程序性死亡受体-1(Human Program Death 1 Receptor，hPD-1)是一类重要的免疫负性调控分子(也称“免疫检查点分子”)，属于CD28家族成员，该家族成员还包括CD28、CTLA4、ICOS和BTLA等。
PD-1是I型跨膜糖蛋白，由细胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。它的细胞膜外部分是一个免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域，胞内部分N-端含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)，C-端含有一个免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM)，其中ITSM是PD-1分子向胞内传递抑制信号的关键基序。与CTLA-4等家族成员以同源二聚体的形式存在于T细胞表面不同，PD-1以单体的形式表达于活化的T细胞、B细胞和髓样细胞等细胞表面。
PD-1有两个配体，即PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)，属于B7家族的跨膜分子。PD-L1广泛分布于成熟的巨噬细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞以及内皮细胞、胰岛细胞、肥大细胞等非造血细胞表面，而且在多种肿瘤细胞表面均高表达；PD-L2只在巨噬细胞、树突状细胞及部分B细胞亚类等细胞表面表达。与经典的免疫负性调控分子细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)相类似，PD-1通过与其配体PDL1、PDL2相互作用发挥免疫负调控作用。当PD-1与配体相互作用时，其胞内段ITSM发生磷酸化并且招募相应的磷酸化酶SHP-1和SHP-2，导致下游信号分子去磷酸化从而下调免疫细胞应答水平。免疫系统的这一负性调控机制是维持机体免疫耐受的关键分子基础。然而，大量的研究表明，PD-1等免疫负性调控分子过度表达及其与受体PD-L1/PD-L2相互作用所诱导的机体免疫抑制状态在癌症以及HIV、HCV、HBV等慢性感染性疾病发病过程中发挥重要作用。通过阻断PD-1/PD-L1相互作用，可以逆转免疫抑制，提高免疫系统杀伤病毒和肿瘤细胞的能力；同时阻断PD-1/PD-L2相互作用，免疫抑制状态逆转效果更好。因此，靶向这类负性调控分子成为新一代癌症治疗策略，PD1/PDL1通路抑制剂的 研究备受关注。特异性阻断PD1/PDL1信号通路的抗体药物是该领域研究的重点。抗PD1抗体纳武单抗(Nivolumab，Opdivo，百时美施贵宝)和Pembrolizumab(Keytruda，默克)均获得了FDA突破性药物资格并获批上市。其中百时美施贵宝产品纳武单抗于2014年12月获FDA批准上市，用于黑色素瘤临床治疗；随后在2015年3月，FDA批准该抗体用于治疗鳞状非小细胞肺癌，标志着该类免疫疗法正式进入实体瘤临床治疗领域。
本领域依然存在对特异性阻断PD1/PDL1信号通路的抗体药物的需求。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种分离的抗人程序性死亡受体-1(Human Program Death 1Receptor，hPD-1)抗体或其抗原结合片段，其重链可变区CDR1序列如SEQ ID NO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；和/或轻链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQ ID NO:6所示，或者所述重链或轻链的CDR序列与SEQ ID NO：1-6所示序列具有至少70％的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至少75％、80％、85％、90％、91％、92％的同源性，或所述重链或轻链的CDR序列为SEQ ID NO：1-6所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1、2、3、4或5个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段包含上述重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示；和/或轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示，或者与SEQ ID NO：7-8所示序列具有至少70％的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.1％的同源性，或SEQ ID NO：7-8所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1、2、3、4、5、10、15、20、30或50个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:13、16所示；和/或轻链可变区序列如SEQ ID NO:11所示，或者与SEQ ID NO：13、16或11所示序列具有至少70％的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％或99.8％的同源性，或SEQ ID NO：13、16或11所示序 列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1、2、3、4、5、10、15、20、30、50个或100氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段为全长抗体，优选地，其为IgG1或者IgG4同种型的全长抗体。
在一些实施方案中，所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段为抗原结合片段，优选地，其为Fab片段、Fab’2片段或单链抗体。
本发明的第二方面涉及一种组合物，其包含上述第一方面所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段。
本发明的第三方面涉及一种核酸分子，其编码上述第一方面所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO：9或10所示，或者是与SEQ ID NO：9或10具有至少70％同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合片段的活性的变体分子，如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.4％、99.5％、99.6％或99.7％的同源性，或是与序列如SEQ ID NO：9或10所示的核酸分子完全互补或在中度至高度严格条件下杂交的核酸分子，所述中度严格条件的一个例子是包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50-60℃、5×SSC、过夜的条件下杂交；再于65℃下20分钟用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×的SSC各洗涤两次，合适的高严格杂交条件包括上述的条件，所不同的是杂交温度升高了，例如达到60-65℃或65-70℃。
在一些实施方案中，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO：12或14所示，或者是与SEQ ID NO：12或14具有至少70％同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合片段的活性的变体分子，如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高的同源性，或是与序列如SEQ ID NO：12或14所示的核酸分子完全互补或在中度至高度严格条件下杂交的核酸分子，所述中度严格条件的一个例子是包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50-60℃、5×SSC、过夜的条件下杂交；再于65℃下20分钟用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×的SSC各洗涤两次，合适的高严格杂交条件包括上述的条件，所不同的是杂交温度升高了，例如达到60-65℃或65-70℃。
本发明的第四方面涉及一种表达载体，其上述第三方面所述的核酸分子。本发明的表达载体并无特别限定，只要其能表达本发明要求保护的抗体或其抗原结合片段即可。
本发明的第五方面涉及一种宿主细胞，其包含上述第四方面所述的表达载体。
本发明的第六方面涉及一种生产上述第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括步骤：将第五方面所述的宿主细胞在适合所述抗hPD-1抗体或其抗原结合片段表达的培养条件下表达，任选地，将表达的抗体或其抗原结合片段进行纯化。
本发明第七方面涉及上述第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于调控哺乳动物包括人的免疫应答的试剂中的用途。
换言之，本发明利用天然抗体库筛选平台筛选获得一株新型抗hPD-1抗体SG001，其能够特异性识别人和猴的PD-1分子，阻断PD-1/PD-L1以及PD-1/PD-L2相互作用，调节免疫应答，提高免疫应答水平。本发明的抗人PD-1抗体与人PD1特异性结合并表现出良好的特性。这些特性包括与人PD-1的高亲和力结合，但与CD28、CTLA4、BTLA以及ICOS等其它CD28家族成员没有交叉反应。
在一些实施方案中，本发明涉及抗人PD-1抗体或其抗原结合部分，其至少表现出一项下列性质：
(1)以1×10-7M或更小的KD与人PD-1结合；
(2)不显著与CD28、CTLA4、BTLA以及ICOS等结合；
(3)在MLR实验中增加干扰素γ的表达水平；
(4)以1×10-7M或更小的KD与猴PD-1结合；
(5)抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；
(6)刺激免疫应答。
本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的优点尤其表现在其阻断PD1/PDL1的活性相对于现有技术具有显著性的提高，例如与现有技术的BMS01相比，其阻断PD1/PDL1的活性提高了6倍(如实施例6和图6所示，SG001抗体半数抑制剂量为1.47±0.227μg/mL，显著优于阳性抗体BMS01(10.62±0.536μg/mL)，P<0.0001)。本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的优点还表现在其在真核表达系统中的表达量相对于现有技术的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的表达量得到显著提升，在一些实施方案中，表达量高至少50％、至少100％，在一些实施方案中，表达量高至少150％、至少200％、至少300％、至少400％。在一些实施方案中，真核表达系统为哺乳动物细胞表达系统。在一些实施方案中，哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。在一些实施方案中，哺乳动物细胞为CHO细胞。本领域的真核表达载体都可以用于本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的表达。在 一些实施方案中，所述真核表达载体为pCMVp-NEO-BAN载体、pEGFP增强型绿色荧光蛋白表达载体、pEGFT-Actin增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体、pSV2表达载体、CMV4表达载体、pCMV-163等。在一些实施方案中，真核表达载体为pCMV-163。
本发明的某些实施方案涉及涉及抗hPD-1抗体或其抗原结合部分，其重链可变区CDR1序列如SEQ ID NO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；和/或轻链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQ ID NO:6所示，或者与SEQ ID NO：1-6所示序列具有至少70％的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同源性，或SEQ ID NO：1-6所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。。
在某些实施方案中，本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分包含上述重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在某些实施方案中，本发明抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示；和/或轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示，或者与SEQ ID NO：7-8所示序列具有至少70％的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，如至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同源性，或SEQ ID NO：7-8所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。。
在某些实施方案中，本发明的抗体为全长抗体，例如但不限于IgG1或者IgG4同种型的全长抗体；或者为抗原结合片段，例如但不限于Fab片段、Fab’2片段、单链抗体等；
本发明的另一方面涉及包含治疗有效量的本发明的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段的组合物。所述组合物例如但不限于免疫偶联物、双特异性分子以及药学上可接受的载体等。本发明的组合物还可以包含另一种活性成分，如另一种用于调节受试者免疫应答的活性成分。
本发明的另一方面涉及编码本发明的抗hPD-1抗体或其抗原结合部分的核酸分子。在某些实施方案中，上述核酸分子的序列如SEQ ID NO：9或10所示，或者与SEQ ID NO：9或10具有至少70％同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合部分的活性的变体分子，或者与序列如SEQ ID NO：9或10所示的核酸分子完全互补或在中度至高度严格条件下杂交的核酸分子。在一些实施方案中，所述严格杂交条件为为了说明的目的，用于 测试本发明的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的合适中等严格条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50-60℃、5×SSC、过夜的条件下杂交；再于65℃下20分钟用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×的SSC各洗涤两次，合适的高严格杂交条件包括上述的条件，所不同的是杂交温度升高了，例如达到60-65℃或65-70℃。
本发明的另一方面涉及包含此类核酸分子的表达载体。在某些实施方案中，所述表达载体是原核表达载体或真核表达载体。在某些实施方案中，所述表达载体是真核表达载体。在某些实施方案中，所述真核表达载体是pCMVp-NEO-BAN载体、pEGFP增强型绿色荧光蛋白表达载体、pEGFT-Actin增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体、pSV2表达载体、CMV4表达载体、pCMV-163等。在一些实施方案中，真核表达载体为pCMV-163。
本发明的还一方面涉及包含此类表达载体的宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自细菌、真菌、放线菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞，更具体地，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。
本发明的一个方面涉及生产本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括步骤：将上述包含本发明的表达载体的宿主细胞在适合所述抗hPD-1抗体或其抗原结合片段表达的培养条件下表达，任选地，将表达的抗体或其抗原结合片段进行纯化。本领域技术人员知晓适合抗体或其抗原结合片段表达的培养条件。
本发明的另一个方面涉及使用所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段调控哺乳动物包括人的免疫应答的方法，其包括向哺乳动物包括人施用本发明的抗体或其抗原结合片段，使得所述哺乳动物包括人的免疫应答得到调控，所述调控包括免疫应答的增强、增加或刺激。
本发明的一个方面涉及所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于调控哺乳动物包括人的免疫应答的试剂中的用途。
本发明的一个方面涉及所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其用于调控哺乳动物包括人的免疫应答。
本发明的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段能够特异性识别人和猴的PD-1分子，阻断PD-1/PD-L1以及PD-1/PD-L2相互作用，调节免疫应答，提高免疫应答水平。本发明的抗人PD-1抗体与人PD1特异性结合并表现出良好的特性。这些特性包括与人PD-1的高亲和力结合，但与CD28、CTLA4、BTLA以及ICOS等其它CD28家族成员没有交叉 反应。本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的优点尤其表现在其阻断PD1/PDL1的活性相对于现有技术具有显著性的提高。本发明的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的优点还表现在其在真核表达系统中的表达量相对于现有技术的抗人PD-1抗体或其抗原结合部分的表达量得到显著提升。
附图说明
图1表达载体pCMV-163的物理图谱。
图2双夹心ELISA检测细胞培养上清中抗体表达水平。
图3 SG001抗体和BMS01阳性抗体特异性识别抗原人PD1。
图4 SG001抗体和BMS01阳性抗体与CD28家族其他成员无特异性结合。
图5 SG001抗体特异性竞争BMS01阳性抗体识别靶抗原。
图6 SG001抗体和BMS01阳性抗体特异性阻断PD1/PDL1相互作用。
图7 SG001抗体和BMS01阳性抗体特异性阻断PD1/PDL2相互作用。
图8A：SG001抗体特异性识别猴PD1和人PD1；
图8B：BMS01阳性抗体特异性识别猴PD1和人PD1。
图9 SG001抗体和BMS01阳性抗体体外增强免疫应答反应。
图10 SG001抗体和BMS01阳性抗体体内增强免疫应答反应。
图11 SG001-IgG4抗体和Nivolumab阳性抗体抑制肿瘤生长。
具体实施方式
定义
本文所用的术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异抗体和多反应性抗体)以及抗体片段。因此，在本说明书任意语境使用的术语“抗体”包括但不限于任意的特异性结合成员、免疫球蛋白类型和/或同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE和IgM)；和其生物相关片段或特异性结合成员，包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv和scFv(单链或相关物)。本领域知晓，抗体是包含通过二硫键内部相连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1、CH2和CH3)组成。轻链是由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链和轻链两者的可变区都包括框架区(FWR)和互补决定区(CDR)。四个FWR区相对保守，而CDR区(CDR1、CDR2和CDR3)代表超变区并且从NH2末端到COOH末端排列 如下：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域，而依据同种型，恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。
同时，本文所定义的“抗体”也包括嵌合抗体、人源化抗体和重组抗体、产生于转基因非人类动物的人抗体以及选自利用本领域技术人员可使用的富集技术产生的库的抗体。
术语“可变”是指抗体间可变(V)区的某些片段在序列上存在广泛差异。所述V结构域介导抗原结合并且定义了特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而，可变性并非均匀分布在跨越110个氨基酸的可变区域中。相反，V区域由每个均长9-12个氨基酸的被称为“超变区”的具有极度可变性的较短区域所分割的具有15-30个氨基酸的相对不变的被称为框架区(FR)的片段组成。天然的重链和轻链的可变区每一个都包括四个FR，大多采取β-片层构型，通过3个超变区相连，其形成连接部分β-片层结构，并且在某些情况中形成部分β-片层结构的环。每条链中的超变区通过FR紧密相连，并与来自其它链的超变区一起促进抗体的抗原结合位点形成。
本文的术语“超变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包含来自“互补决定区”(“CDR”)的氨基酸残基。
本文所用术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即包含个体抗体的群体除可能少量存在的天然发生的突变之外是相同的。术语“多克隆抗体”是指包括抗不同决定簇(“表位”)的不同抗体的制备物。
本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与来自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列是相同或同源的，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段的相应序列是相同的或同源的，只要它们展现出期望的生物学活性。本发明提供了来自人抗体的可变区抗原结合序列。因此，本文主要关注的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结合序列(如CDR)并含有一个或多个来自非人抗体的序列如FR或C区序列的抗体。此外，本文所述的嵌合抗体是包含一种抗体类别或亚类的人可变区域抗原结合序列以及来自另一个抗体类别或亚类的另一个序列如FR或C区序列的抗体。
“人源化抗体”通常是具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基的人抗体。这些非人氨基酸残基经常称为“引入”残基，其通常取自“引入”可变区。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，如完整抗体的抗原结合部分或片段或可变区域。完整抗体的抗原结合部分或片段或可变区域包括，但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片 段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段包含由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域以紧密的非共价结合的方式形成的二聚体。从这两个结构域的折叠产生出6个超变环(从H和L链各形成3个环)，其提供氨基酸残基用于抗原结合，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区域(或Fv的一半，其仅包含3个抗原特异的CDR)也具有识别和结合抗原的能力，虽然与完整结合位点相比，其亲和力较低。
“单链Fv”(“sFv”或“scFv”)是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。sFv多肽可以进一步包含位于VH和VL结构域之间的多肽连接臂，其使得sFv形成抗原结合所需的结构。。
术语“双价抗体”是通过构建在VH和VL结构域之间具有短连接臂(约5-10个残基)的sFv片段制备的小抗体片段，使得获得V结构域的链间而不是链内的配对，形成二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异双价抗体是两个“交叉”的sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。
结构域抗体(dAb)可以以完全人的形式进行生产，是抗体的最小已知的抗原结合片段，其范围为约11kDa至约15kDa。dAb是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区(分别是VH和VL)。其高表达于微生物细胞培养物中，显示出良好的生物物理特性，包括例如但不限于，溶解度和温度稳定性，并且非常适合于在体外筛选系统如噬菌体展示中进行筛选和亲和力成熟。dAb作为单体具有生物活性，并且由于它们的小尺寸和固有的稳定性，可以形成较大的分子以产生具有延长的血清半衰期或其它药理活性的药物。
Fv和sFv是唯一的具有完整结合位点而缺少恒定区的种类。因此，它们在体内使用中适合于减少非特异结合。构建sFv融合蛋白以产生在sFv的氨基末端或羧基末端任意一端的效应蛋白的融合。抗体片段还可以是“线性抗体”。此类线性抗体片段可以是单特异的或双特异的。
抗体的其它修饰在本文中也有涉及。例如，抗体可被连接到多种非蛋白质性质的聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗体还可以通过如凝聚技术或通过界面聚合包埋在制备的微胶囊中并用于胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或用于大珠滴乳液。。
通常，本发明的抗体是重组产生的，使用的载体和方法是本领域已有的。人抗体还可以通过体外活化的B细胞来产生。人抗体也可以在转基因动物(如小鼠)中产生，其能够 在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生全组成成分的人抗体。
抗体片段通通过蛋白水解消化衍生自完整抗体。然而，这些片段也可直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可表达在E.coli中并由E.coli分泌，从而可容易地生成大量的这样的片段。Fab'-SH片段可从E.coli中直接回收并化学偶联以形成F(ab')2片段。用于生产抗体片段的技术对于技术人员是明显的。
变体抗体也包括在本发明范围之内。因此，申请中所列举的序列的变体也包括在本发明范围之内。可以通过使用本领域已知的方法获得具有改良的亲和性的抗体序列的其他变体并且这些变体也包括在本发明范围之内。例如，氨基酸替换可用于获得具有进一步改良的亲和性的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化可用于改善抗体生产中的表达系统的翻译效率。
这样的变体抗体序列与申请中列举的序列具有70％或更多(例如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高)的序列同源性。这样的序列同源性是相对于参考序列(即，申请中列举的序列)的全长计算获得的。
术语“多肽”取其常规含义，即氨基酸的序列。多肽不限于一个特定长度的产物。肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义之内，并且除非另有说明，这些术语可以互换地使用。此术语也包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。多肽可以是完整的蛋白质或其亚序列。本发明语境中感兴趣的特定多肽是含有CDR、VH和VL的氨基酸亚序列，并能够结合hPD-1。
本文所用的术语多肽“变体”是多肽，其通常不同于本文所具体公开的多肽，其具有一个或多个替换、缺失、添加和/或插入。这样的变体可以是天然存在或合成产生的，例如，通过对本发明的一个或多个上述多肽序列进行修饰，且对本文所述的多肽的一个或多个生物活性进行评估和/或使用任何数量的本领域公知的技术。
例如，某些氨基酸可以替换在蛋白质结构中的其它氨基酸而没有明显损失与其它多肽(如抗原)或细胞结合的能力。由于结合能力和蛋白性质决定了蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列上进行某些氨基酸序列的替换，从而获得具有类似性质的蛋白质。因此，考虑到的是，在所公开的组合物的肽序列或相应的编码所述肽的DNA序列中制备各种变化，而未明显损失它们的生物效用或活性。
在许多情况中，多肽变体含有一个或多个保守替换。“保守替换”是指其中氨基酸被其它具有类似性质的氨基酸所替换，使得肽化学领域中技术人员可预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不发生变化。
氨基酸替换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
“同源性”或“序列同一性”是指在序列比对和引入缺口后，多核苷酸或多肽序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在具体实施方式中，多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％的多核苷酸或多肽同源性。
这样的变体多肽序列与申请所列举的序列具有70％或以上(即80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性。在其他实施方式中，本发明提供了多肽片段，其包括本文所公开的氨基酸序列的各种长度的连续延伸段。例如，适用的情况下，本发明提供的肽序列包含至少约5、10、15、20、30、40、50、75、100、150或更多的本发明公开的一个或多个序列的连续肽以及其之间所有的中间长度的肽。
本发明的载体包括可以在任何类型的细胞或生物体中进行复制的载体，包括如质粒、噬菌体、粘粒和迷你染色体。在一些实施方式中，包括本发明多核苷酸的载体是适合于多核苷酸繁殖或复制的载体，或者是适合于表达本发明多肽的载体。这样的载体是本领域已知并可以购买的。
“载体”包括穿梭载体和表达载体。通常，质粒构建体也包括分别用于细菌中质粒复制和选择的复制起点(如复制的ColE1起点)和选择标记(如氨苄青霉素或四环素抗性)。“表达载体”是指包含用于在细菌或真核细胞中表达本发明的抗体包括抗体片段所需要的控制序列或调控元件的载体。
本文所用术语“细胞”可以是任何细胞，包括但不限于真核、多细胞物种(如与单细胞的酵母细胞相反)，例如但不限于，哺乳动物细胞或人细胞。细胞可作为单一实体或者是较大的细胞群的一部分而存在。这样的“较大的细胞群”可以包括如细胞培养物(混合的或纯的)、组织(如内皮组织、上皮组织、粘膜组织或其它组织)、器官(如肺、肝、肌肉和其它器官)、器官系统(如循环系统、呼吸系统、胃肠道系统、泌尿系统、神经系统、皮肤系统或其他器官系统)或生物体(如鸟、哺乳动物等)。
本发明的术语“高亲和力结合”是指抗hPD-1抗体以1×10-7M或更小的KD与人PD-1结合，例如至少1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M的KD。
本发明的“不显著与CD28、CTLA4、BTLA以及ICOS等结合”是指所述抗hPD-1 抗体与人PD-1结合的比例高于与CD28、CTLA4、BTLA以及ICOS等结合的比例的至少10倍，例如至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、500、1000、5000、10000倍或更多倍。
在提供了范围的值时，应该理解，除非文中另有明确说明，否则每个插入值、到下限的单位的十分之一、该范围的上限和下限之间和任何其它在所述范围内的所述值或插入值都包含于本发明范围之内。可独立地包括于较小范围内的这些较小范围的上限和下限也包含在本发明内，只要去除被特地排除在外的极限所述范围内被特定排除在外的任何界限。当所述范围包括界限的一个或两个时，排除被包括的界限的一个或两个的范围也包括于本发明中。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。虽然任何类似或等同于本文所述的方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但现在公开了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用而全部并入本文。
本发明提供实施例一方面是用于描述本发明抗体制备过程，该制备过程仅是说明相关方法，并非是限制性的，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。本发明提供实施例另一方面是用于表明本发明抗体的特征和优点，但本发明不限于这些特征和优点。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
实施例1抗体筛选
为了避免个体免疫背景的偏向性，尽可能保证抗体库的多样性，利用淋巴细胞分离液分离162名成年健康人(男女各半)外周血及10例新生儿(男女各半)脐带血淋巴细胞(均签订知情同意书)，共收集2×109个细胞。Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，常规PCR方法扩增不同抗体亚型的可变区基因。根据抗体库载体pDF(军事医学科学院院刊，2008，32(4)：305-308，358。)信息，引入酶切位点BssH II、Nhe I和带有Loxp511序列(序列为：SGGSTITSYNVYYTKLSSSGT(SEQ ID NO：15))的连接肽，通过重叠PCR方法拼接成ScFv(单链抗体：VL-Linker(含Loxp511序列)-VH，上下游分别引入BssH II、Nhe I位点)形式(具体方法见《生物文库技术》，邵宁生等主编，军事医学科 学出版社，2011年第一版)。电泳分离后，将所获得的scFv用BssH II、Nhe I酶切后克隆入同样酶切处理的pDF载体中，电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue(Agilent Technology)。经SB培养液扩大培养后，加1×1013pfu辅助病毒VCSM13(BioVector NTCC Inc.)感染，获得初级噬菌体抗体库，测定效价为8×1012cfu/mL。按比例(感染复数MOI>200)混合初级抗体库和BS1365菌[基因型：F’kan recA1endA1gryA96thi21ΔlacU169supE44hsdR17(λimm434X12cre)](BioVector NTCC Inc.)，借助BS165菌表达的Cre重组酶介导loxp/loxp511重组(具体方法参考：Hum Antibodies.1999；9(1):67-77；J Biomol Screen.2014Feb 4；19(6):839-846.)，得到大容量重组抗体库。
利用哺乳动物细胞-中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(
Figure PCTCN2016110790-appb-000001
CCL-61TM)表达的人PD-1蛋白(人PD-1蛋白胞外段-人IgG1 Fc段融合蛋白，命名为hPD1-Fc，其中人PD-1的序列信息参考NP.054862.1，人IgG1 Fc片段的序列参考AEO21920.1)为靶点，筛选靶抗体。5％脱脂奶粉封闭hPD1-Fc包被的免疫试管(Maxisorp免疫试管，Thermo Nunc)后，加入上述噬菌体抗体库，37℃孵育2h；弃去未结合的噬菌体，TBS-T洗液洗涤5遍，充分洗去非特异吸附噬菌体；加入1mL洗脱缓冲液(0.1mol/L甘氨酸-HCl，pH 2.2)洗脱噬菌体并以40μL 2mol/L Tris溶液中和；加入对数期XL1-Blue菌、SB培养基(SB培养液：胰蛋白胨30g，酵母提取物20g，MOPS 10g，溶于950mL去离子水中，氢氧化钠调pH值至7.0，定容至1L，高压灭菌)及辅助噬菌体VCSM13进行扩增富集；重复该过程3-4轮，将洗脱下来的噬菌体感染新鲜制备的对数期XL1-Blue菌涂培养板，37℃过夜培养后，随机挑取单克隆至96孔深孔板(Corning)，扩大培养后进行phage-ELISA(具体方法参考：军事医学科学院院刊，2008，32(4)：305-308，358。)，检测与抗原的结合特性；共鉴定165个克隆，其中48个特异性结合hPD1-Fc的克隆中，SG001结合活性最好。
将SG001克隆送测序，所获得的可变区基因经IMGT(http://imgt.cines.fr/imgtvquest/vquest)在线分析，获得的SG001克隆中，重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示，其三个CDR区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；轻链可变区序列为SEQ ID NO:8，其三个CDR区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。编码所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。
实施例2抗体表达纯化
将获得的SG001克隆可变区基因克隆入含有人IgG恒定区基因的真核表达载体 pCMV-163中，构建全抗体表达载体，其物理图谱如图1所示(真核表达载体pCMV-163的各个组成成分均为本领域已知的成分，按照所示次序重组而成)。全抗体称为SG001抗体(轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.11，核苷酸序列为SEQ ID NO.12；重链氨基酸序列为SEQ ID NO.13，核苷酸序列SEQ ID NO.14)。将获得的真核表达载体，通过Lipofectamine2000脂质体介导的方法转染至CHO细胞中，经过ELISA试验(利用羊抗人IgG以及辣根酶标记的羊抗人IgG进行双夹心ELISA法检测上清中抗体的含量，以未转染上清作为阴性对照，人IgG纯品作为标准品)，检测培养上清中抗体表达量，筛选获得表达量较高的单克隆细胞株。
为了对比本发明抗体SG001的特性，本发明将同类上市抗体Nivolumab(Opdivo，百时美施贵宝)轻、重链可变区序列构建到相同载体pCMV-163上(全抗体命名为BMS01)，同样经过转染至CHO细胞获得表达上清、ELISA测定上清抗体浓度,筛选获得表达量较高的单克隆细胞株。根据抗体发挥作用的原理，BMS01抗体的活性与上市抗体Nivolumab一致，可以用作本发明抗体的阳性对照。
ELISA实验结果显示，SG001抗体以及BMS01抗体表达上清中均有抗体表达。在相同的表达载体、细胞以及表达条件下，SG001抗体表达量约为BMS01抗体表达量的2～3倍(SG001 74.5±4.9ug/mL vs BMS01 28.7±6.6，P＝0.016)，结果如图2所示。
收集足够上清，利用常规的Protein A亲和纯化目标抗体。
实施例3抗体特异性结合活性分析
将靶抗原hPD1-Fc包被ELISA板条，1ug/ml，4℃过夜；PBST洗涤后，加入1.5％的酪蛋白，4℃封闭过夜；加入不同浓度的SG001抗体或者BMS01抗体，37℃反应2小时；PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人Fab二抗(GAH-Fab-HRP，Abcam)，室温反应45分钟；PBST重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μl TMB，室温(20±5℃)避光放置3min；每孔加入100μl 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析抗体与靶抗原hPD1-Fc结合能力。SG001抗体或者BMS01阳性抗体均能特异性识别靶抗原hPD1-Fc；该识别活性呈显著的剂量依赖性，结果如图3所示。
将各CD28家族成员hPD1-FC、CD28、CTLA4、BTLA以及ICOS(北京义翘神州生物技术有限公司)分别包被ELISA板条，1ug/ml，4℃过夜；PBST洗涤后，加入1.5％的酪蛋白，4℃封闭过夜；加入不同浓度的SG001抗体或者BMS01抗体，37℃反应2小时； PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人Fab二抗(GAH-Fab-HRP)，室温反应45分钟；PBST重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μl TMB，室温(20±5℃)避光放置3min；每孔加入100μl 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析抗体与各CD28家族成员结合能力。
结果显示，SG001抗体或者BMS01阳性抗体均能特异性识别靶抗原hPD1-Fc，并呈显著的剂量依赖性；SG001抗体或者BMS01阳性抗体与CD28、CTLA4、BTLA以及ICOS等其他CD28家族成员无显著的结合反应；结果如图4所示。
实施例4抗体亲和力分析
采用BIACORE生物大分子相互作用仪(GE公司)分析抗体亲和力。在芯片上偶联抗人IgG-Fab抗体(Abcam)，利用抗人IgG-Fab抗体捕获SG001抗体或者BMS01阳性抗体，抗体浓度定为1μg/mL，进样时间为60-150秒；抗原hPD1-FC作为流动相，使用6个浓度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50、100nM)，结合时间为120秒；解离时间为1200S；使用10mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.1)再生，时间为60S。结果显示SG001抗体和BMS01阳性抗体分别为2.15nM、1.4nM，亲和力基本一致。结果如表1所示。
表1 SG001抗体和BMS01阳性抗体亲和力测定结果
Figure PCTCN2016110790-appb-000002
实施例5 SG001抗体竞争BMS01阳性抗体识别抗原
将hPD1-FC蛋白稀释于包被缓冲液中，包被浓度为1μg/mL，然后以100μl/孔的量加入到包被板孔中，4℃包被过夜；洗涤液(PBS+0.2％吐温20)重复洗板3遍，用1.5％酪蛋白以200μl/孔加入相应的孔中，37℃封闭1h。用PBS缓冲液稀释Biotin标记的BMS01抗体(BMS01-Biotin)至0.5μg/mL，以该抗体溶液分别稀释待测抗体SG001、BMS01。SG001和BMS01最高浓度为400μg/mL，倍比稀释，共设立12个浓度；将该梯度稀释的抗体溶液加入封闭后的ELISA反应孔中，每孔100μl，每个样品浓度设2个平行复孔，盖好封板膜，37℃水平放置1.5小时。洗涤液重复洗板3遍，加入HRP标记的亲和素， 室温(20±5℃)避光放置45分钟。洗涤液重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μl TMB，室温(20±5℃)避光放置3min；每孔加入100μl 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值。
结果显示，SG001抗体和BMS01阳性抗体都能够竞争抑制BMS01-Biotin与抗原hPD1-FC结合，且呈剂量依赖性；SG001抗体和BMS01阳性抗体之间无显著差别；结果如图5所示。
实施例6抗体阻断PD1与PDL1相互作用
将hPDL1蛋白(义翘神州公司产品)稀释于包被缓冲液中，浓度为1μg/mL，以100μl/孔的量加入到ELISA板各个孔中，4℃包被过夜。洗涤液重复洗板3遍后，每孔加入200μl 1.5％酪蛋白，37℃封闭1h。用PBS缓冲液稀释hPD1-FC-Biotin(生物素Biotin标记的hPD1-FC蛋白，其中hPD1-FC由实施例1获得，委托嘉暄生物完成标记)至5μg/mL，以该溶液稀释待测抗体SG001、BMS01。SG001和BMS01最高浓度为500μg/mL，根据预实验提示，SG001按5倍稀释，BMS01按4倍稀释，各8个浓度；将梯度稀释的抗体溶液加入封闭后的ELISA反应孔中，每孔100μl，每个样品浓度设2个平行复孔，盖好封板膜，37℃水平放置1.5小时。洗涤液重复洗板3遍后，加入HRP标记的亲和素，室温(20±5℃)避光放置45分钟。洗涤液重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μl TMB，室温(20±5℃)避光放置3min；每孔加入100μl 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值。分析抗体阻断PD1与PDL1相互作用的活性。
结果显示，SG001抗体和BMS01阳性抗体都能够阻断hPDL1与hPD1-FC结合，并呈剂量依赖性；SG001抗体半数抑制剂量为1.47±0.227μg/mL，显著优于阳性抗体BMS01(10.62±0.536μg/mL)，P<0.0001。结果如图6所示。
实施例7抗体阻断PD1与PDL2相互作用
将PDL2蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司)稀释于包被缓冲液中，浓度为1μg/mL，以100μl/孔的量加入到ELISA板各个孔中，4℃包被过夜。洗涤液重复洗板3遍后，每孔加入200μl 1.5％酪蛋白，37℃封闭1h。用PBS缓冲液稀释hPD1-FC-Biotin(生物素Biotin标记的hPD1-FC蛋白，其中hPD1-FC由实施例1获得，委托嘉暄生物完成标记)至10μg/mL，以该溶液稀释待测抗体SG001、BMS01。SG001和BMS01最高浓度为 100μg/mL，倍比稀释，共设立12个浓度；将该梯度稀释的抗体溶液加入封闭后的ELISA反应孔中，每孔100μl，每个样品浓度设2个平行复孔，盖好封板膜，37℃水平放置1.5小时。洗涤液重复洗板3遍后，加入HRP标记的亲和素，室温(20±5℃)避光放置45分钟。洗涤液重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μl TMB，室温(20±5℃)避光放置3min；每孔加入100μl 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值。分析抗体阻断PD1与PDL2相互作用的活性。
结果显示，SG001抗体和BMS01阳性抗体都能够阻断hPD1-FC-Biotin与PDL2相互作用，并呈剂量依赖性；SG001抗体和BMS01阳性抗体之间无显著差别。结果如图7所示。
实施例8抗体识别猴PD1抗原
将猴PD1(义翘神州)、hPD1-Fc分别包被ELISA板条，1ug/ml，4℃过夜；PBST洗涤后，加入1.5％的酪蛋白，4℃封闭过夜；加入不同浓度的SG001抗体或者BMS01抗体，37℃反应2小时；PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人Fab二抗(GAH-Fab-HRP)，室温反应45分钟；PBST重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μl TMB，室温(20±5℃)避光放置3min；每孔加入100μl 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析抗体与猴PD1结合能力。
SG001抗体(图8A)或者BMS01阳性抗体(图8B)均能特异性识别猴PD1蛋白，呈显著的剂量依赖性；抗体识别猴PD1蛋白活性与识别猴PD1蛋白活性没有显著差别。
实施例9抗体体外增强免疫应答
取健康人外周血，用淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)分离外周血单个核细胞(PBMC)，进一步采单核细胞分离试剂盒(Miltenyi公司)从PBMC中分离单核细胞；调整细胞浓度，按2×104/孔接种96孔细胞培养板，培养体系为1640培养基，含10％胎牛血清、25ng/ml GM-SCF(BioLegend公司)和50ng/ml IL-4(BioLegend公司)；37℃，5％CO2，常规培养；每3天更换一次新鲜培养基，培养7天，诱导树突状细胞(DC)。
实验第7天，取另外一份健康人血，分离PBMC；进一步使用CD4阳性T细胞(CD4+T)分选试剂盒(eBioscience)从分离的PBMC中分离出CD4+T细胞；调整细胞浓度，按2×105/孔接种前述诱导DC细胞的培养板中。分别加入SG001抗体和BMS01阳性抗体， 浓度梯度为0.016、0.08、0.4、2、10、50μg/ml，设置3个复孔；实验中设置阴性组(只有CD4+T、DC以及CD4+T联合DC)。
37℃，5％CO2，常规培养5天后收获上清，测定上清中IFN-γ表达水平。
结果显示(图9)，单纯CD4+T细胞、DC细胞以及CD4+T联合DC细胞的培养上清中，IFN-γ表达呈本底水平；在加入不同浓度梯度抗体后，IFN-γ表达显著增加，且具有剂量依赖性；SG001抗体和BMS01阳性抗体之间没有显著差别。
实施例10抗体体内增强免疫应答
取健康人外周血，用淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)分离外周血单个核细胞(PBMC)；用1640培养基(不含血清)将PBMC浓度调成为5×106/ml，尾静脉注射NPG小鼠(免疫缺陷型小鼠，维通达公司产品)，每只200μl，建立人PMBC移植小鼠的移植物抗宿主排斥(GVHD)模型；实验设置三组，分别给予SG001抗体、BMS01阳性抗体和生理盐水，抗体给药剂量为150μg/只，一周给药2次，给药2周；分析抗PD1抗体在体内增强免疫反应的生物学功能；每五天测量一次体重，记录小鼠的存活时间并计算生存率。
PMBC移植小鼠体重早期逐渐上升，到20天后体重开始下降，小鼠产生了GVHD反应，随后小鼠开始出现死亡(图10)。生理盐水对照组中位生存时间为41天，SG001抗体、BMS01阳性抗体组的中位生存时间分别为36天和39天，小鼠存活率降低(SG001vs NC，P＝0.0044；BMS01vs NC,P＝0.5240)，生存时间缩短，提示GVHD效应加剧；相比BMS01阳性抗体组，SG001抗体组小鼠平均生存时间更短，提示GVHD效应更为显著(SG001vs BMS01，P＝0.0827)。实验结果提示，SG001抗体以及BMS01阳性抗体均可以增强体内免疫反应，SG001抗体活性略优于BMS01阳性抗体。
实施例11抗体抑制肿瘤生长
将实施例2获得的真核表达载体中的抗体重链恒定区基因替换为人IgG4亚型的恒定区基因，构建IgG4亚型的SG001抗体(SG001-IgG4，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.11，重链氨基酸序列为SEQ ID NO.16)，并参考实施例2的方法和流程，制备样品SG001-IgG4。
通过在PD-1人源化的B-hPD-1小鼠上接种鼠肠癌MC38细胞(美国ATCC产品)建立肿瘤模型，评价PD1抗体抑制肿瘤生长的活性。选择雄性、4～6周龄的B-hPD-1小鼠(北京百奥赛图基因生物技术有限公司产品)。小鼠肠癌MC38细胞复苏培养至所需数量 后，收集对数期生长细胞悬浮至107细胞/mL浓度，皮下接种0.1mL(1×106细胞)至B-hPD-1小鼠上。每日观察动物情况，检查肿瘤生长，待肿瘤平均大小至100mm3时进行随机分组，开始对动物进行给药，设生理盐水对照组、SG001-IgG4组以及Nivolumab组(日本施贵宝公司)；移植后第6天开始给药，给药剂量为20mg/kg，给药周期为每4天给药一次，共给药6次，观察小鼠体重以及肿瘤生长情况。
结果显示，试验中使用的抗PD-1抗体阳性参考药物(Nivolumab原研药)和SG001-IgG4抗体均可为实验动物所接受，动物体重呈连续上升状态，给药组和阴性抗体对照无显著性差异。各组给药动物和溶剂对照组比较有明显肿瘤生长抑制效果(图11)。Nivolumab组的平均肿瘤抑制率为16％，而SG001-IgG4组的平均肿瘤抑制率为58％，SG001-IgG4组相对于Nivolumab组有统计学差异(P<0.05)。

Claims (14)

  1. 一种分离的抗人程序性死亡受体-1(Human Program Death 1 Receptor，hPD-1)抗体或其抗原结合片段，其重链可变区CDR1序列如SEQ ID NO:1所示，CDR2序列如SEQ ID NO:2所示，CDR3序列如SEQ ID NO:3所示；和/或轻链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3序列如SEQ ID NO:6所示，或者所述重链或轻链的CDR序列与SEQ ID NO：1-6所示序列具有至少70％的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，或所述重链或轻链的CDR序列为SEQ ID NO：1-6所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列。
  2. 如权利要求1所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段，其包含上述重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3。
  3. 如权利要求1或2所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段，其重链可变区序列如SEQ ID NO:7所示；和/或轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示，或者是与SEQ ID NO：7-8所示序列具有至少70％的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，或是SEQ ID NO：7-8所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列。
  4. 如权利要求1-3任一项所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:13或16所示；和/或轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或者是与SEQ ID NO：13、16或11所示序列具有至少70％的同源性且保留相应母体序列生物活性的变体序列，或是SEQ ID NO：13、16或11所示序列经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列。
  5. 如权利要求1-4任一项所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段，其为全长抗体，优选地，其为IgG1或者IgG4同种型的全长抗体。
  6. 如权利要求1-5任一项所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段，其为抗原结合片段，优选地，其为Fab片段、Fab’2片段或单链抗体。
  7. 一种组合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段。
  8. 一种核酸分子，其编码权利要求1-6任一项所述的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段。
  9. 如权利要求8所述的核酸分子，其序列如SEQ ID NO：9或10所示，或者是与 SEQ ID NO：9或10具有至少70％同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合片段的活性的变体分子，或是与序列如SEQ ID NO：9或10所示的核酸分子完全互补或在中度至高度严格条件下杂交的核酸分子。
  10. 如权利要求8或9所述的核酸分子，其序列如SEQ ID NO：12或14所示，或者是与SEQ ID NO：12或14具有至少70％同源性且仍编码具有本发明的抗体或其抗原结合片段的活性的变体分子，或是与序列如SEQ ID NO：12或14所示的核酸分子完全互补或在中度至高度严格条件下杂交的核酸分子。
  11. 一种表达载体，其包含权利要求8-10任一项所述的核酸分子。
  12. 一种宿主细胞，其包含权利要求11所述的表达载体。
  13. 一种生产权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括步骤：将权利要求12所述的宿主细胞在适合所述抗hPD-1抗体或其抗原结合片段表达的培养条件下表达，任选地，将表达的抗体或其抗原结合片段进行纯化。
  14. 权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于调控哺乳动物包括人的免疫应答的试剂中的用途。
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