WO2017090763A1 - 組換え発現ベクター及び当該ベクターを封入した脂質膜構造体 - Google Patents

組換え発現ベクター及び当該ベクターを封入した脂質膜構造体 Download PDF

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    • C07K2319/07—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a mitochondrial localisation signal

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant expression vector for expressing a target protein in mitochondria of animal cells, and a lipid membrane structure encapsulating the vector.
  • Mitochondrion one of the cell organelles, has genomic DNA independent of the cell nucleus. Many associations between mutations in this genomic DNA and various diseases (encephalomyopathy, neurodegenerative diseases, cancer, diabetes, etc.) have been reported, and these are collectively called mitochondrial diseases.
  • a treatment method for mitochondrial diseases gene therapy for the purpose of expressing a protein expected to have a therapeutic effect in mitochondria can be mentioned.
  • a method for realizing such treatment there are a method of transferring a target protein expressed in a cell nucleus into mitochondria, and a method of using a foreign gene expression system capable of directly expressing the target protein in mitochondria. Proposed.
  • a wide variety of expression vectors have been developed in relation to the method of transferring the target protein expressed in the cell nucleus into the mitochondria. Many of them use a mitochondrial targeting signal peptide (MTS) possessed by a mitochondrial protein encoded in the cell nucleus genome. Specifically, an expression vector encoding a target protein (MTS-added protein) having MTS upstream is delivered to the cell nucleus, and the MTS-added protein is expressed in the cytoplasm and delivered to the mitochondria.
  • MTS mitochondrial targeting signal peptide
  • mitochondrial proteins mitochondrial endogenous proteins encoded by mitochondrial genomic DNA, which are expected to be used for gene therapy.
  • mitochondrial proteins mitochondrial endogenous proteins
  • mitochondrial genomic DNA mitochondrial genomic DNA
  • Patent Document 1 discloses a method for suppressing aggregation of a target protein in the cytoplasm using an expression vector encoding an MTS-added protein consisting of MTS with increased water solubility and a specific mitochondrial endogenous protein.
  • mitochondrial endogenous proteins are often cytotoxic when they are present in intracellular organelles other than mitochondria, the range of target proteins for which the method described in Patent Document 1 can be used is limited.
  • the above-described method using an MTS-added protein may cause lethal damage to cells by interfering with or competing with the intracellular transport of the original mitochondrial endogenous protein. Concerns remain.
  • a foreign gene expression system capable of directly expressing a target protein in mitochondria
  • transcriptional expression of a necessary and sufficient amount of the target protein in mitochondria is required.
  • several expression vectors have been designed in which a promoter derived from a gene present in mitochondrial genomic DNA, such as HSP (heavy strand promoter), is selected and DNA encoding the target protein is placed under the control of the promoter. ing.
  • the expression vector is also devised to use a triplet codon that is frequently used in mitochondrial genomic DNA.
  • the expression levels of these expression vectors have not reached the necessary and sufficient range for disease treatment.
  • Non-Patent Document 1 DNA that is transcribed and induced in mitochondria under the control of HSP is encapsulated in an artificial viral vector to which MTS is added, and the target protein is introduced directly into the mitochondria.
  • a method of expressing it has been proposed. While this method has the advantage that the expression level of the target protein from the introduced viral vector is relatively high, in addition to the safety problem caused by being a viral vector, the target protein is as expected. It has not been fully verified whether it is expressed in mitochondria.
  • An object of the present invention is to provide a new expression vector capable of efficiently expressing a target protein in mitochondria and suppressing undesirable expression of the target protein in cell organelles other than mitochondria.
  • the present inventors have confirmed that a promoter having transcription activity in the cell nucleus shows higher transcription activity in mitochondria than a promoter derived from a gene present in mitochondrial genomic DNA.
  • the inventors have found that the target protein can be safely expressed in mitochondria by adding a device to suppress the undesirable expression of the target protein in the cell nucleus, and the following inventions have been completed.
  • the promoter sequence is a base sequence of a promoter selected from the group consisting of cytomegalovirus promoter, simian virus 40 promoter, rous sarcoma virus promoter, EF1 ⁇ promoter, ⁇ actin promoter, and T7 promoter.
  • the target protein can be expressed more efficiently and selectively in mitochondria.
  • the expression vector and lipid membrane structure of the present invention can be used as a safer and more effective medicament for treating mitochondrial diseases.
  • the expression level (luminescence intensity) when the mRNA transcribed from the expression vector of the present invention and the expression vector to be compared is translated into the target protein (luciferase). It is a represented graph.
  • a graph showing the expression level (luminescence intensity) of the target protein (luciferase) in the liver of a mouse to which the expression vector of the present invention from which the ND4 sequence has been removed or the expression vector of the present invention into which the human ND4 sequence has been incorporated is administered by the hydrodynamic method It is. It is a graph showing the expression level (luminescence intensity) of the target protein (luciferase) in HeLa cells transfected with the lipid membrane structure of the present invention encapsulating expression vectors having various promoter sequences.
  • a first aspect of the present invention is a promoter sequence showing transcription activity in the nucleus of an animal cell and a coding region encoding a target protein, wherein one or more TGAs are used as codons corresponding to tryptophan (Trp).
  • the present invention relates to a recombinant expression vector for expressing a target protein in the mitochondria of an animal cell having a coding region containing the promoter sequence under the control of the promoter sequence.
  • the present invention relates to a recombinant expression vector having the above-described structure and a specific use of the vector for expressing a target protein in mitochondria of animal cells.
  • the promoter sequence that can be used in the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it exhibits transcriptional activity in the mammalian cell nucleus, that is, the ability to induce transcription of mRNA.
  • Examples thereof include cytomegalovirus (CMV) promoter
  • Examples include nucleotide sequences such as a simian virus (SV) 40 promoter, a rous sarcoma virus (RSV) promoter, an EF1 ⁇ promoter, a ⁇ actin promoter, and a T7 promoter, and the use of a CMV promoter or an RSV promoter is preferred. These may be those obtained by adding substitution or other mutations to the base sequence as long as the transcription activity is not impaired.
  • the target protein in the present invention may be any protein that is desired to be expressed in mitochondria, in other words, to exhibit its function.
  • examples include proteins that have an academic interest in expression.
  • the target protein is any of a protein encoded by the nuclear nucleus genomic DNA, a mitochondrial protein encoded by the mitochondrial genomic DNA, a heterologous protein for cells transfected by the vector of the present invention, and the like. Also good.
  • the coding region means a base sequence of DNA serving as a template for mRNA that is translated into a target protein sandwiched between a start codon and a stop codon.
  • the coding region may consist of a single open reading frame (ORF), or a plurality of exons separated by introns. That is, any DNA base sequence that can provide mRNA that is transcriptionally induced by the promoter sequence and finally translated into the target protein in the mitochondria as will be described later.
  • a coding region containing one or more TGAs as a codon corresponding to Trp is used.
  • the coding region in the mitochondrial genomic DNA the coding region in which TGG (UGG on mRNA) that is a codon corresponding to Trp is artificially changed to TGA, the target protein even if an amino acid residue is substituted for Trp residue
  • a coding region in which the codon at a position capable of retaining the activity of ⁇ is artificially changed to TGA is used.
  • Such artificial alteration of codons can be performed by a general gene recombination technique.
  • TGA In translation from mRNA in the cytoplasm, TGA corresponds to a stop codon, whereas in translation from mRNA in mitochondria, TGA corresponds to a codon encoding Trp. Therefore, when animal cells are transformed with the expression vector of the present invention, synthesis of the target protein encoded by the coding region is not possible even when the expression vector reaches the cell nucleus and mRNA is transcribed from the coding region. Since it stops in position, at least the entire protein of interest is not synthesized. Thereby, the negative influence by the synthesis
  • the expression vector of the present invention reaches the mitochondria and mRNA is transcribed from the coding region, synthesis of the target protein encoded by the coding region proceeds without stopping at the TGA position, and as a result, the target protein Can be properly synthesized and exert their function in mitochondria.
  • a coding region containing a plurality of TGAs in the present invention.
  • the use of a coding region containing one or more TGAs at a position closer to the 5 ′ end (N-terminal of the target protein) Further preferred.
  • the target protein is a protein that is usually translated in the cytoplasm
  • An example of the above is to change AGG encoding an Arg residue in the cell nuclear genome but encoding a stop codon in the mitochondrial genome to a CGG encoding an Arg residue in both the cell nuclear genome and the mitochondrial genome.
  • coding region under the control of a promoter sequence means that the coding region is linked to the promoter sequence so that transcription is possible, that is, the coding region exists within a range where transcription to the mRNA is initiated by the transcriptional activity of the promoter sequence. It means to do.
  • the start codon of the coding region is within the range of about 1 to 200 bases from the 3 ′ end of the promoter sequence, but such a range varies depending on the type of the promoter sequence, Can be adjusted as appropriate.
  • the expression vector of the present invention preferably further has a mitochondrial genomic DNA coding region on the 5 'end side of the coding region encoding the target protein.
  • the coding region of mitochondrial genomic DNA and the coding region encoding the target protein are linked in-frame, that is, the amino acid sequence encoded by the coding region of mitochondrial genomic DNA and the amino acid sequence of the target protein are identical.
  • the fusion protein which consists of the continued amino acid sequence is connected so that it may be synthesized.
  • the protein molecules that are transcribed and translated from the recombinant gene of the expression vector are stabilized in the mitochondria by including in part the protein molecules that are originally transcribed and translated in the mitochondria. It is considered to be done.
  • mitochondrial genomic DNA has 13 types of coding regions, and any coding region can be used in the present invention, but ND4 (NADH dehydrogenase, subunit 4) protein, particularly human The use of a coding region corresponding to the ND4 protein is preferred.
  • ND4 NADH dehydrogenase, subunit 4
  • the expression vector of the present invention includes a base sequence corresponding to the mitochondrial tRNA on the 3 ′ end side of the coding region, in particular, a base sequence including the untranslated region on the 5 ′ end side in addition to the base sequence corresponding to the tRNA. It is preferable to have it. There is no particular limitation on the type of mitochondrial tRNA selected. As an inference, the RNA molecule transcribed from the recombinant gene of the expression vector is stable in the mitochondria by including in part the base sequence of the RNA molecule that is originally transcribed in the mitochondria and that functions stably. It is thought that
  • the second aspect of the present invention provides a lipid membrane structure for introducing a nucleic acid into the mitochondria of an animal cell, and a lipid membrane structure in which the expression vector described above is encapsulated.
  • the lipid membrane structure of the present invention contains sphingomyelin (SM) as a constituent lipid of the lipid membrane, preferably dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) and SM.
  • SM sphingomyelin
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • the lipid membrane structure of the present invention preferably also has a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 (hereinafter referred to as KALA peptide) on the lipid membrane surface.
  • a preferred specific example of the lipid membrane structure is a lipid membrane structure described in detail together with its production method in Patent Document 2 (Japanese Patent No. 5067733), and contains DOPE and SM as constituent lipids of the lipid membrane, and A lipid membrane structure in which the lipid membrane surface is modified with a KALA peptide.
  • Patent Document 2 is incorporated herein by reference in its entirety.
  • KALA peptide is described in Shahen et al. (Biomaterials, 2011, 32, 6342-6350) as a lipid membrane fusion peptide having a function of promoting membrane fusion between lipid membranes.
  • the most preferred lipid membrane structure in the present invention is a lipid membrane structure in which the expression vector of the present invention is encapsulated, contains DOPE and SM as constituent lipids of the lipid membrane, and has a KALA peptide on the surface of the lipid membrane.
  • a lipid membrane structure in which the expression vector of the present invention is encapsulated contains DOPE and SM as constituent lipids of the lipid membrane, and has a KALA peptide on the surface of the lipid membrane.
  • STR-R8 stearylated octaarginine
  • octaarginine and DNA were respectively converted into KALA peptide and It can be produced by replacing with the expression vector of the invention.
  • the expression vector of the present invention and the lipid membrane structure encapsulating the expression vector can be used as a medicament for use in the treatment of mitochondrial diseases, and the third aspect of the present invention is such a medicament and an effective amount of such a medicament.
  • the present invention relates to a method for treating mitochondrial disease comprising administering a medicine to a patient.
  • the medicament of the present invention can be used according to a dosage form, usage, dosage and the like generally known as nucleic acid medicaments or liposome medicaments or preparations.
  • the medicament of the present invention can be used in the form of parenteral preparations such as injections and drops.
  • carriers that can be used in such parenteral preparations include aqueous carriers such as physiological saline, isotonic solutions containing glucose, D-sorbitol, and the like.
  • the medicament of the present invention may further be in the form of a composition containing components such as pharmaceutically acceptable buffers, stabilizers, preservatives and other additives.
  • Pharmaceutically acceptable ingredients are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can use the ingredients within the scope of their normal performance, for example, from the ingredients described in the 16th revised Japanese Pharmacopoeia and other standards, depending on the form of the formulation. Can be selected and used as appropriate.
  • the administration method of the medicament of the present invention is not particularly limited, and in the case of a parenteral preparation, examples include intravascular administration (preferably intravenous administration), intraperitoneal administration, intestinal administration, and subcutaneous administration. .
  • the therapeutic agent of the present invention is administered to a living body by intravenous administration.
  • luciferase is used as a target protein model.
  • pCMV-mtLuc This vector comprises a CMV promoter sequence, a coding region of mitochondrial genomic DNA encoding mitochondrial protein ND4 (ND4), a base sequence encoding FLAG tag (FLAG), and the 479th Trp residue in the amino acid residue shown in SEQ ID NO: 1.
  • the codon TGA encoding the 479th Trp and the codon CGG encoding the 512th Arg residue are TGG and AGG, respectively, in the wild-type luciferase.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are amino acid sequences when the base sequence of SEQ ID NO: 1 is translated using a codon used in mitochondria.
  • This vector has the same configuration as pCMV-mtLuc (CGG) of a), but the codon encoding the 601st and 630th Trp residues shown in SEQ ID NO: 1 is TGA (FIG. 1 (b) ), SEQ ID NO: 3), the expression vector of the present invention.
  • the codon TGA encoding the 601st and 630th Trp residues is both TGG in the wild type luciferase.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are amino acid sequences when the base sequence of SEQ ID NO: 3 is translated using a codon used in mitochondria.
  • this vector has three TGA codons in the coding region encoding luciferase, active luciferase is expressed in mitochondria but not expressed in the cell nucleus (not translated).
  • pCMV-mtLuc This vector has the same configuration as pCMV-mtLuc (CGG) in a), but the 512th codon shown in SEQ ID NO: 1 is TAG ((c) in FIG. 1, SEQ ID NO: 5). .
  • the 512th codon is AGG in wild type luciferase.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are amino acid sequences when the base sequence of SEQ ID NO: 5 is translated using a codon used in mitochondria.
  • This vector is a translation negative control vector in which active luciferase is not expressed (translated) in either the cell nucleus or mitochondria because TAG serves as a stop codon in both the cell nucleus and mitochondria.
  • pmtLuc This vector was obtained by deleting the CMV promoter sequence from the recombinant gene of pCMV-mtLuc (CGG) in a) (FIG. 1 (d), SEQ ID NO: 7). Since this vector does not have a promoter sequence, it is a transcription negative control vector in which the recombinant gene is not transcribed in either the cell nucleus or mitochondria.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 are amino acid sequences when the base sequence of SEQ ID NO: 7 is translated using a codon used in mitochondria.
  • pHSP-mtLuc This vector is a comparative expression vector in which the CMV promoter sequence in the recombinant gene of pCMV-mtLuc (CGG) in a) was replaced with HSP (FIG. 1 (e), SEQ ID NO: 9).
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 are amino acid sequences when the base sequence of SEQ ID NO: 9 is translated using codons used in mitochondria.
  • pHSP-mtLuc This vector is a comparative translation negative control vector in which the CMV promoter sequence in the recombinant gene of pCMV-mtLuc (TAG) in c) is replaced with HSP ((f) of FIG. 1, SEQ ID NO: 11).
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 are amino acid sequences when the base sequence of SEQ ID NO: 11 is translated using codons used in mitochondria.
  • PCMV-mtLuc (CGG) showed significantly higher luciferase luminescence than the comparison vector pHSP-mtLuc (CGG), confirming that the gene expression efficiency was high.
  • ⁇ Example 2 Introduction into HeLa cells After 24 hours of seeding of 4 ⁇ 10 4 cells (0.5 mL) of HeLa cells in a 24-well plate, 0.4 ⁇ g or 1 ⁇ g of pCMV-mtLuc (CGG) or pmtLuc ( Lipofectamine 2000 DMEM solution (0.25 mL, without serum and antibiotics) each containing CGG) is added to the cells, incubated for 3 hours at 5% CO 2 and replaced with fresh medium containing 10% serum for an additional 21 Time incubation was performed.
  • CGG pCMV-mtLuc
  • pmtLuc Lipofectamine 2000 DMEM solution (0.25 mL, without serum and antibiotics
  • the cells were washed with 0.5 mL of PBS and lysed with 75 ⁇ L of reporter lysis buffer (Promega). After incubating at ⁇ 80 ° C. for 30 minutes or more, thawing was performed at room temperature for about 10 to 15 minutes. Thereafter, the cells were recovered from the plate, transferred to an Eppendorf tube, centrifuged at 15,000 g, 4 ° C. for 5 minutes, and 50 ⁇ L of the supernatant was recovered. Luciferase activity was measured using a luminometer by adding 50 ⁇ L of NanoLuc assay reagent (Promega) to 20 ⁇ L of cell lysate. The amount of protein in the cell lysate was determined using the BCA protein assay kit (PIERCE), and the luciferase activity was corrected. The result is shown in FIG.
  • reporter lysis buffer Promega
  • lipid membrane structure 1 Construction of lipid membrane structure 1
  • a KALA peptide that is a membrane fusion peptide A condensate of KALA and stearic acid (STR-KALA) was prepared using Shaheen et al., Biomaterials, 2011, 32, 6342-6350, SEQ ID NO: 13).
  • a nucleic acid nanoparticle was prepared by dropping a 0.1 mg / mL pCMV-mtLuc (CGG) solution into a 0.1 mg / mL protamine solution (nitrogen / phosphate (N / P) ratio 3.0). ) SUV solution at a volume ratio of 1: 2 and further adding STR-KALA from 1) (equivalent to 10 mol% of the total lipid) to form a lipid membrane structure having a KALA peptide on the surface of the lipid structure A body (KALA-MITO-Porter (SM)) was prepared.
  • SM KALA-MITO-Porter
  • R8-MITO-Porter (SM) in which STR-KALA of KALA-MITO-Porter (SM) was replaced with STR-R8, and SM of KALA-MITO-Porter (SM) in an equivalent amount of phosphatidic acid (PA KALA-MITO-Porter (PA) in place of) and R8-MITO-Porter (PA) in which STR-KALA of KALA-MITO-Porter (PA) is replaced with STR-R8 were prepared.
  • the following experimental example is an experiment for confirming that the luciferase luminescence confirmed when the expression vector of the present invention is transfected is not performed through transcription and translation in the cell nucleus.
  • Example 1 In vitro translation experiment> Wild-type luciferase-mRNA prepared from HeLaScribeNuclearExtravitroTransscriptSystem (Promega) from plasmid pNL1.1 [CMV / nLuc] (Promega) in which a gene encoding wild-type luciferase was ligated downstream of the CMV promoter sequence. Furthermore, mtLuc (CGG) -mRNA and mtLuc (TAG) -mRNA were similarly prepared from pCMV-mtLuc (CGG) and pCMV-mtLuc (TAG).
  • luciferase is synthesized from wild-type NLuc-mRNA, but is not synthesized from mtLuc (CGG) -mRNA because of the stop codon TGA, and mtLuc (TAG) -mRNA. Since there is also a stop codon TAG, it is expected that active luciferase will not be synthesized. As expected, luciferase luminescence is observed in pNL1.1 [CMV / nLuc] with wild-type NLuc, but pCMV-mtLuc with pCMV-mtLuc (CGG) and mtLuc (TAG) with mtLuc (CGG). No luciferase luminescence was observed in any of TAG).
  • ⁇ -amanitin addition experiment 4 ⁇ 10 4 cells (0.5 mL) of HeLa cells were seeded in a 24-well plate and incubated in the presence of 0.0001 to 1 ⁇ g / mL ⁇ -amanitin for 24 hours. . Thereafter, the cells were transfected with pCMV-mtLuc (CGG) and pNL1.1 [CMV / nLuc] in the same manner as in Example 2, and the luciferase luminescence intensity was measured. The result is shown in FIG.
  • ⁇ -amanitin inhibits transcription in the cell nucleus
  • pNL1.1 [CMV / nLuc] encoding mRNA produced through transcription in the cell nucleus when used, transcription is inhibited and luciferase activity is reduced. It is expected to decline.
  • the luciferase luminescence intensity in the presence of ⁇ -amanitin in HeLa cells transfected with pNL1.1 [CMV / nLuc] was significantly reduced compared to the control without addition of ⁇ -amanitin.
  • pCMV-mtLuc (CGG) transcribes mRNA in mitochondria, luciferase activity is expected to be maintained regardless of the presence or absence of ⁇ -amanitin.
  • ⁇ -amanitin does not reduce luciferase luminescence intensity in HeLa cells transfected with pCMV-mtLuc (CGG) at added doses of 0.0001-0.1 ⁇ g / mL where no cytotoxicity is observed. It was.
  • Example 4 Modification of promoter sequence
  • the CMV promoter sequence in pCMV-mtLuc (CGG) of 1) a) of Example 1 is the RSV promoter sequence incorporated in pRc / RSV (invitrogen), pBluescript II SK (+ ) Expression vectors (pRSV-mtLuc (CGG), pT7-mtLuc (CGG), and pSV40-) substituted for the T7 promoter sequence incorporated in (Stratagene) or the SV40 promoter sequence incorporated in pGL3-Control (Promega), respectively.
  • mtLuc (CGG)) was constructed.
  • mice administered with the above four types of expression vectors it was possible to confirm the expression of luciferase in the liver.
  • the highest expression was observed in mice administered with pRSV-mtLuc (CGG).
  • ND4 sequence Expression vector obtained by removing ND4 sequence and FLAG sequence in pCMV-mtLuc (CGG) of 1) a) of Example 1 and linking mtLuc (CGG) sequence immediately after CMV promoter sequence (PCMV-mtLuc (CGG) [-ND4] was constructed. Furthermore, the ND4 sequence in pCMV-mtLuc (CGG) of 1) a) of Example 1 is the base sequence registered as NCBI accession number NC — 012920. Expression vectors (pCMV-mtDNA (human)) substituted with base sequences up to the 10,760-12th and 136th bases (human ND4 sequence) were constructed.
  • mice administered with the above three types of expression vectors it was possible to confirm the expression of luciferase in the liver.
  • higher luciferase expression was observed in mice administered with pCMV-mtDNA (human) compared to pCMV-mtLuc (CGG).
  • Example 6 Transformation using lipid structure 1) pCMV-mtLuc (CGG) of Example 1), pRSV-mtLuc (CGG), pT7-mtLuc (CGG), SV40-mtLuc of Example 4 (CGG) and pCMV-mtDNA (human) of Example 5 were encapsulated in KALA-MITO-Porter (SM) or R8-MITO-Porter (SM) according to the method described in Example 3, and the same as in Example 2 Then, HeLa cells (8 ⁇ 10 4 cells, 0.5 mL) were transfected with each lipid membrane structure, and luciferase luminescence was measured. The result is shown in FIG.
  • Both the expression vector and the lipid membrane structure of the present invention have industrial applicability as a drug for gene therapy for mitochondrial diseases and as a research tool.

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Abstract

【課題】　本発明は、ミトコンドリアにおいて目的タンパク質を効率的に発現させ、かつミトコンドリア以外の細胞オルガネラでの目的タンパク質の望ましくない発現を抑制することのできる、新たな発現ベクターを提供することを目的とする。 【解決手段】　本発明は、動物細胞の細胞核内で転写活性を示すプロモーター配列、及び目的タンパク質をコードするコーディング領域であって、トリプトファンに対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有する、動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクター、並びに当該ベクターを封入した脂質膜構造体を提供する。本発明の発現ベクターを用いることで、ミトコンドリアにおいてより効率的に、かつ選択的に目的タンパク質を発現させることができ、より安全でかつ効果の優れたミトコンドリア病治療用の医薬として利用することができる。

Description

組換え発現ベクター及び当該ベクターを封入した脂質膜構造体
　本発明は、動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクター、及び当該ベクターを封入した脂質膜構造体に関する。
　細胞のオルガネラの１つであるミトコンドリアは、細胞核から独立したゲノムＤＮＡを有している。このゲノムＤＮＡにおける変異と種々の疾患（脳筋症、神経変性疾患、癌、糖尿病など）との関連が多数報告されており、これらはミトコンドリア病と総称される。
　ミトコンドリア病の治療方法として、治療効果が期待されるタンパク質をミトコンドリア内で発現させることを目的とした遺伝子治療が挙げられる。かかる治療を実現するための方法として、細胞核内で発現させた目的タンパク質をミトコンドリア内に移送させる方法、及びミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システムを利用する方法が提案されている。
　細胞核内で発現させた目的タンパク質をミトコンドリア内に移送させる方法に関連して、多種多様な発現ベクターが開発されている。その多くは、細胞核ゲノムにコードされているミトコンドリアタンパク質が有する、ミトコンドリア移行性シグナルペプチド（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ、ＭＴＳ）を利用している。具体的には、ＭＴＳを上流に有する目的タンパク質（ＭＴＳ付加タンパク質）をコードする発現ベクターを細胞核に送達し、細胞質においてＭＴＳ付加タンパク質を発現させ、ミトコンドリアに送達するというものである。
　この方法はある種の目的タンパク質においては有用であり得るが、遺伝子治療への利用が期待される、ミトコンドリアゲノムＤＮＡにコードされたミトコンドリアタンパク質（ミトコンドリア内因性タンパク質）に対する適用性が低いという問題を有する。ミトコンドリア内因性タンパク質の多くは細胞質内で不溶性であるために、細胞質で発現されたミトコンドリア内因性タンパク質が凝集し、ミトコンドリアへの移行が不十分となるからである。
　特許文献１は、水溶性を高めたＭＴＳと特定のミトコンドリア内因性タンパク質とからなるＭＴＳ付加タンパク質をコードする発現ベクターを用いて、目的タンパク質の細胞質での凝集を抑える方法を開示している。しかし、ミトコンドリア内因性タンパク質は、ミトコンドリア以外の細胞内オルガネラにあると細胞毒性を示すことが多いので、特許文献１に記載された方法が利用可能な目的タンパク質の範囲は制限される。
　また、ＭＴＳ付加タンパク質を利用した上記方法は、本来のミトコンドリア内因性タンパク質の細胞内輸送に干渉する又はこれと競合することで細胞に致死的ダメージを与える可能性があり、遺伝子治療のツールとしては懸念が残る。
　一方、ミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システムの利用では、第一にミトコンドリア内における必要十分な量の目的タンパク質の転写発現が要求される。かかる目的に適合するように、ミトコンドリアゲノムＤＮＡに存在する遺伝子由来のプロモーター、例えばＨＳＰ（ｈｅａｖｙ　ｓｔｒａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を選択し、その制御下に目的タンパク質をコードするＤＮＡを置いた発現ベクターが幾つか設計されている。この発現ベクターには、ミトコンドリアゲノムＤＮＡにおいて利用頻度の高いトリプレットコドンを使用するといった工夫も加えられている。しかし、これまでのところ、それら発現ベクターの発現レベルは疾患治療に必要十分な領域には達していない。
　例えば、非特許文献１には、ＭＴＳを付加した人工ウイルスベクターの内部にＨＳＰ制御下にあるミトコンドリア内で転写誘導されるＤＮＡを封入し、ミトコンドリアに直接的にウイルスベクターを導入して目的タンパク質を発現させようとする方法が提唱されている。この方法は、導入されたウイルスベクターからの目的タンパク質の発現レベルが比較的高いという利点を有する一方、ウイルスベクターであることに起因する安全性の問題を伴うことに加え、目的タンパク質が期待通りにミトコンドリア内で発現しているかについての検証が完全にはなされていない。
Ｙｕ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１２、１０９、Ｅ１２３８－４７
ＵＳ２０１５／０２２５７４０
　本発明は、ミトコンドリアにおいて目的タンパク質を効率的に発現させ、かつミトコンドリア以外の細胞オルガネラでの目的タンパク質の望ましくない発現を抑制することのできる、新たな発現ベクターを提供することを目的とする。
　本発明者らは、意外なことにミトコンドリアゲノムＤＮＡに存在する遺伝子由来のプロモーターよりも細胞核内で転写活性を有するプロモーターの方が、ミトコンドリア内においてもむしろ高い転写活性を示すことを確認し、これに細胞核内での目的タンパク質の望ましくない発現を抑制する工夫を加えることで、ミトコンドリア内で目的タンパク質を安全に発現させることができることを見いだし、下記の各発明を完成させた。
（１）動物細胞の細胞核内で転写活性を示すプロモーター配列、及び目的タンパク質をコードするコーディング領域であって、トリプトファンに対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有する、動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクター。
（２）前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の５’末端側に、ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域をさらに有する、（１）に記載の組換え発現ベクター。
（３）前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の３’末端側にミトコンドリアｔＲＮＡに対応する塩基配列を有する、（１）又は（２）に記載の組換え発現ベクター。
（４）プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、ラウスサルコーマウイルスプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、βアクチンプロモーター及びＴ７プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターの塩基配列である、（１）～（３）のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
（５）プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーター又はラウスサルコーマウイルスプロモーターの塩基配列である、（４）に記載の組換え発現ベクター。
（６）前記目的タンパク質をコードするコーディング領域におけるトリプトファンに対応するコドンの全てがＴＧＡである、（１）～（５）のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
（７）前記ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、サブユニット４のコーディング領域である、（２）～（６）のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
（８）（１）～（７）のいずれかに記載の発現ベクターを封入した脂質膜構造体。
（９）スフィンゴミエリンを脂質膜の構成脂質として含む、（８）に記載の脂質膜構造体。
（１０）配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、（８）又は（９）に記載の脂質膜構造体。
（１１）ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつ配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、動物細胞のミトコンドリアに核酸を導入するための脂質膜構造体。
　本発明の発現ベクター及び脂質膜構造体によれば、ミトコンドリアにおいてより効率的に、かつ選択的に目的タンパク質を発現させることができる。本発明の発現ベクター及び脂質膜構造体は、より安全でかつ効果の優れたミトコンドリア病治療用の医薬として利用することができる。
本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターにおける組換え遺伝子の構造を模式的に表した図である。 本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターをハイドロダイナミクス法によってそれぞれ投与したマウスの肝臓における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターをハイドロダイナミクス法によってそれぞれ投与したマウスの肝臓における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 本発明の発現ベクターを封入した本発明の脂質膜構造体及び比較対象となる脂質膜構造体でトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 ウサギ網状赤血球を利用したインビトロ翻訳システムを用いて、本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターから転写されるｍＲＮＡを目的タンパク質（ルシフェラーゼ）へと翻訳させたときの発現量（発光強度）を表したグラフである。 細胞核における転写を阻害する活性を有するα－アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎ）の存在下での、本発明の発現ベクター及び比較対象となる発現ベクターでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 各種のプロモーター配列を有する本発明の発現ベクターをハイドロダイナミクス法によってそれぞれ投与したマウスの肝臓における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 ＮＤ４配列を取り除いた本発明の発現ベクター又はヒトＮＤ４配列を組み込んだ本発明の発現ベクターをハイドロダイナミクス法によってそれぞれ投与したマウスの肝臓における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。 各種のプロモーター配列を有する発現ベクターを封入した本発明の脂質膜構造体でトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞における目的タンパク質（ルシフェラーゼ）の発現量（発光強度）を表したグラフである。
　本発明の第一の態様は、動物細胞の細胞核内で転写活性を示すプロモーター配列、及び目的タンパク質をコードするコーディング領域であって、トリプトファン（Ｔｒｐ）に対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有する、動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクターに関する。換言すれば、本発明は、上記の構成を有する組換え発現ベクター、及び動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるという当該ベクターの特定の用途にかかる発明である。
　本発明の発現ベクターで利用可能なプロモーター配列は、哺乳動物の細胞核内で転写活性すなわちｍＲＮＡの転写誘導能を示すものであれば特に制限はなく、その例としてはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ）４０プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、βアクチンプロモーター及びＴ７プロモーターなどの各塩基配列を挙げることができ、ＣＭＶプロモーター又はＲＳＶプロモーターの利用が好ましい。またこれらは、転写活性が損なわれない限り、塩基配列に置換その他の変異が加わったものであってもよい。
　本発明における目的タンパク質は、ミトコンドリア内で発現させる、言い換えればその機能を発揮させることが望まれるタンパク質であればよく、ミトコンドリア病の治療に有効であると期待されるタンパク質の他に、ミトコンドリア内で発現させることに学術的な関心が持たれるタンパク質などを挙げることができる。かかる観点で、目的タンパク質は、細胞核のゲノムＤＮＡにコードされているタンパク質、ミトコンドリアゲノムＤＮＡにコードされているミトコンドリアタンパク質、本発明のベクターによってトランスフェクションされる細胞に対する異種のタンパク質などのいずれであってもよい。また、その大きさ（アミノ酸残基数）及び化学的特性（疎水性、親水性、電荷その他の特性）に特別な制限はない。
　本発明においてコーディング領域とは、開始コドンと終止コドンに挟まれた目的タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡの鋳型となるＤＮＡの塩基配列を意味する。この場合において、コーディング領域は単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなるものでもよく、また複数のエクソンがイントロンによって分断されてなるものであってもよい。すなわち、前記プロモーター配列によって転写誘導され、後に説明するように最終的にミトコンドリア内において目的タンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡを提供できるＤＮＡの塩基配列であればよい。
　本発明の発現ベクターでは、Ｔｒｐに対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域が利用される。好ましくは、ミトコンドリアゲノムＤＮＡにおけるコーディング領域、Ｔｒｐに対応するコドンであるＴＧＧ（ｍＲＮＡ上ではＵＧＧ）がＴＧＡに人為的に変更されたコーディング領域、Ｔｒｐ残基へアミノ酸残基を置換しても目的タンパク質の活性を保持することができる位置のコドンがＴＧＡに人為的に変更されたコーディング領域などが利用される。このようなコドンの人為的な変更は、一般的な遺伝子組換え技術によって行うことができる。
　細胞質におけるｍＲＮＡからの翻訳ではＴＧＡは終止コドンに相当するが、ミトコンドリアにおけるｍＲＮＡからの翻訳ではＴＧＡはＴｒｐをコードするコドンに相当する。したがって、本発明の発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換した場合、発現ベクターが細胞核に到達してコーディング領域からｍＲＮＡが転写されたときでも、コーディング領域にコードされる目的タンパク質の合成はＴＧＡの位置で停止するので、少なくとも目的タンパク質の全体は合成されない。これによって、細胞質内において目的タンパク質の全体が合成されてしまうことによる負の影響を抑制することができる。
　一方、本発明の発現ベクターがミトコンドリアに到達してコーディング領域からｍＲＮＡが転写されたときは、コーディング領域にコードされる目的タンパク質の合成はＴＧＡの位置で停止することなく進行し、その結果目的タンパク質の全体が適切に合成され、ミトコンドリア内でその機能を発揮することができる。
　細胞質内における目的タンパク質の望まれない発現を抑制するという観点において、本発明では複数のＴＧＡを含むコーディング領域の利用が好ましい。また、細胞質内における目的タンパク質の望まれない機能発現をより確実に抑制するという観点において、５’末端（目的タンパク質のＮ末端）により近い位置に１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域の利用がさらに好ましい。さらに、目的タンパク質が通常は細胞質内で翻訳されるタンパク質である場合は、上記ＴＧＡ以外のコドンについても、ミトコンドリアのコドンを使用するようにコーディング配列を適宜改変することが好ましい。上記の一例は、細胞核ゲノムにおいてＡｒｇ残基をコードするがミトコンドリアゲノムにおいて終止コドンをコードするＡＧＧを、細胞核ゲノム、ミトコンドリアゲノムのいずれにおいてもＡｒｇ残基をコードするＣＧＧに改変することである。
　コーディング領域をプロモーター配列の制御下に有するとは、コーディング領域がプロモーター配列に転写可能に連結されていること、すなわちプロモーター配列の転写活性によってｍＲＮＡへの転写が開始される範囲内にコーディング領域が存在することを意味する。例としては、プロモーター配列の３’末端から概ね１～２００塩基の範囲内にコーディング領域の開始コドンがある場合を挙げることができるが、そのような範囲はプロモーター配列の種類によって変化し、当業者によって適宜調節することができる。
　本発明の発現ベクターは、前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の５’末端側に、ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域をさらに有するものであることが好ましい。特に、ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域と前記目的タンパク質をコードするコーディング領域とがインフレームで連結している、すなわちミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域にコードされるアミノ酸配列と前記目的タンパク質のアミノ酸配列とが一続きとなったアミノ酸配列からなる融合タンパク質が合成されるように連結していることが好ましい。推論であるが、ミトコンドリアにおいて本来的に転写翻訳され、安定的に機能を発揮するタンパク質分子を一部に含むことで、発現ベクターの組換え遺伝子から転写翻訳されるタンパク質分子がミトコンドリア内で安定化されるものと考えられる。
　ミトコンドリアゲノムＤＮＡには、１３種類のコーディング領域が存在することが知られており、本発明ではいずれのコーディング領域でも利用することができるが、特にＮＤ４（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、サブユニット４）タンパク質、特にヒトのＮＤ４タンパク質に対応するコーディング領域の利用が好ましい。
　本発明の発現ベクターは、コーディング領域の３’末端側にミトコンドリアｔＲＮＡに対応する塩基配列、特に当該ｔＲＮＡに対応する塩基配列に加えてその５’末端側の非翻訳領域を含む塩基配列も併せて有するものであることが好ましい。選択されるミトコンドリアｔＲＮＡの種類に特に制限はない。推論であるが、ミトコンドリアにおいて本来的に転写され、安定的に機能を発揮するＲＮＡ分子の塩基配列を一部に含むことで、発現ベクターの組換え遺伝子から転写されるＲＮＡ分子がミトコンドリア内で安定化されるものと考えられる。
　本発明の第二の態様は、動物細胞のミトコンドリアに核酸を導入するための脂質膜構造体、及びこれに上で説明した発現ベクターを封入した脂質膜構造体を提供する。本発明の脂質膜構造体は、脂質膜の構成脂質としてスフィンゴミエリン（ＳＭ）を、好ましくはジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とＳＭとを含む。本発明の脂質膜構造体はまた、脂質膜表面に配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ＫＡＬＡペプチドと表す）を有することが好ましい。脂質膜構造体の好ましい具体例は、特許文献２（特許第５０６７７３３号公報）にその製造方法と共に詳細に記載された脂質膜構造体において、ＤＯＰＥとＳＭとを脂質膜の構成脂質として含み、かつ脂質膜表面がＫＡＬＡペプチドで修飾された脂質膜構造体である。特許文献２は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる。
　ＫＡＬＡペプチドは、Ｓｈａｈｅｅｎら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１１，３２，６３４２－６３５０）において、脂質膜同士の膜融合を促進する機能を有する脂質膜融合性ペプチドとして記載されている。本発明においては、このＫＡＬＡペプチドが脂質膜構造体の表面に置かれることで、脂質膜構造体を細胞内オルガネラであるミトコンドリアに選択的に送達させる能力が発揮されることを見いだしたことに基づき、かかるミトコンドリア送達能を利用するものである。
　本発明において最も好ましい脂質膜構造体である、本発明の発現ベクターが封入され、脂質膜の構成脂質としてＤＯＰＥとＳＭとを含み、かつ脂質膜の表面にＫＡＬＡペプチドを有する脂質膜構造体は、特許文献２に記載されたステアリル化オクタアルギニン（ＳＴＲ－Ｒ８）の調製及びオクタアルギニンで修飾され、ＤＮＡを封入した脂質膜構造体の製造法に準じて、オクタアルギニンとＤＮＡをそれぞれＫＡＬＡペプチドと本発明の発現ベクターに置き換えることで製造することができる。
　本発明の発現ベクター及びこれを封入した脂質膜構造体は、いずれもミトコンドリア病の治療に用いるための医薬として利用することができ、本発明の第三の態様はかかる医薬、及び有効量のかかる医薬を患者に投与することを含むミトコンドリア病の治療方法に関する。本発明の医薬は、核酸医薬又はリポソーム医薬若しくは製剤として一般に知られている剤形、用法、用量などに準じて利用することができる。
　例えば、本発明の医薬は、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いられることができる。また、このような非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトールなどを含む等張液といった水性担体が挙げられる。
　本発明の医薬はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の添加剤といった成分を含む組成物の形態であってもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改訂日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
　本発明の医薬の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与などを挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の治療剤は、静脈内投与により生体に投与される。
　以下の実施例及び実験例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、実施例及び実験例では、ルシフェラーゼを目的タンパク質のモデルとして利用している。
＜実施例１＞
１）発現ベクターの構築
　以下のａ）～ｆ）のベクターを、一般的な遺伝子組換え手法を用いて構築した。
ａ）ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）
　このベクターは、ＣＭＶプロモーター配列、ミトコンドリアタンパク質ＮＤ４をコードするミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域（ＮＤ４）、ＦＬＡＧタグをコードする塩基配列（ＦＬＡＧ）、配列番号１に示されるアミノ酸残基における４７９番目のＴｒｐ残基及び５１２番目のＡｒｇ残基をコードするコドンがそれぞれＴＧＡ及びＣＧＧであるコドン改変ルシフェラーゼをコードするコーディング領域（ｍｔＬｕｃ）、及び５’末端の非翻訳領域を含むミトコンドリアｔＲＮＡＡｓｐをコードする塩基配列をこの順序で有する組換え遺伝子（図１の（ａ）、配列番号１）をＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで開環したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に組み込んだ、本発明の発現ベクターである。なお、４７９番目のＴｒｐをコードするコドンＴＧＡ及び５１２番目のＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＧは、野生型ルシフェラーゼにおいてはそれぞれＴＧＧ及びＡＧＧである。また、配列番号１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
　上記組換え遺伝子はルシフェラーゼをコードするコーディング領域内にＴＧＡコドンを１つ有しているので、活性型ルシフェラーゼはミトコンドリア内では発現するが、細胞核内では発現しない（翻訳されない）。
ｂ）ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）／３×ＴＧＡ
　このベクターは、ａ）のｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と同一の構成を有するが、配列番号１に示される６０１番目及び６３０番目のＴｒｐ残基をコードするコドンがＴＧＡである（図１の（ｂ）、配列番号３）、本発明の発現ベクターである。なお、６０１番目及び６３０番目のＴｒｐ残基をコードするコドンＴＧＡは、野生型ルシフェラーゼにおいてはいずれもＴＧＧである。また、配列番号３及び配列番号４に示されるアミノ酸配列は、配列番号３の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
　このベクターは、ルシフェラーゼをコードするコーディング領域内にＴＧＡコドンを３つ有しているので、活性型ルシフェラーゼはミトコンドリア内では発現するが、細胞核内では発現しない（翻訳されない）。
ｃ）ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）
　このベクターは、ａ）のｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と同一の構成を有するが、配列番号１に示される５１２番目のコドンがＴＡＧである（図１の（ｃ）、配列番号５）ベクターである。なお、５１２番目のコドンは、野生型ルシフェラーゼにおいてはＡＧＧである。また、配列番号５及び配列番号６に示されるアミノ酸配列は、配列番号５の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
　このベクターは、ＴＡＧが細胞核内及びミトコンドリア内いずれにおいても終止コドンとなるので、細胞核及びミトコンドリアいずれにおいても活性型ルシフェラーゼが発現（翻訳）されない、翻訳ネガティブコントロールベクターである。
ｄ）ｐｍｔＬｕｃ
　このベクターは、ａ）のｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）の組換え遺伝子からＣＭＶプロモーター配列を欠失させた（図１の（ｄ）、配列番号７）ベクターである。このベクターはプロモーター配列を有しないので、細胞核及びミトコンドリアいずれにおいても組換え遺伝子が転写されない、転写ネガティブコントロールベクターである。配列番号７及び配列番号８に示されるアミノ酸配列は、配列番号７の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
ｅ）ｐＨＳＰ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）
　このベクターは、ａ）のｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）の組換え遺伝子におけるＣＭＶプロモーター配列をＨＳＰに置き換えた（図１の（ｅ）、配列番号９）、比較用発現ベクターである。配列番号９及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列は、配列番号９の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
ｆ）ｐＨＳＰ－ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）
　このベクターは、ｃ）のｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）の組換え遺伝子におけるＣＭＶプロモーター配列をＨＳＰに置き換えた（図１の（ｆ）、配列番号１１）、比較用翻訳ネガティブコントロールベクターである。配列番号１１及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１１の塩基配列をミトコンドリアで使用されるコドンを用いて翻訳した場合のアミノ酸配列である。
２）ベクターの細胞内導入及び発現の確認
　ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＨＳＰ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＨＳＰ－ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）及びｐｍｔＬｕｃの４種類のベクターについて、Ｙａｓｕｚａｋｉら（Ｊ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１３、１７２（３）：８０５－１１）に記載されたハイドロダイナミクス法を参照して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢、オス）の尾静脈内へ２７Ｇの針を用いて２ｍＬベクター溶液（１００μｇ／５％グルコース溶液）を５秒で投与した。投与６時間後に肝臓を回収し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）を製造者プロトコールに従って使用し、ルシフェラーゼ発光量を測定した。その結果を図２に示す。
　ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）は、比較用ベクターのｐＨＳＰ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と比較して著しく高いルシフェラーゼ発光量を示しており、遺伝子発現効率が高いことが確認された。
　また、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）３×ＴＧＡ及びｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）についても同様の実験を行ったところ、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）３×ＴＧＡの遺伝子発現効率はｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と同等であることが確認された（図３）。
＜実施例２＞ＨｅＬａ細胞への導入
　４×１０４ｃｅｌｌｓ（０．５ｍＬ）のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種して２４時間後に、０．４μｇ又は１μｇのｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）又はｐｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）をそれぞれ含むＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００のＤＭＥＭ溶液（０．２５ｍＬ、血清及び抗生物質なし）を細胞に加え、５％ＣＯ２で３時間インキュベーションを行い、１０％血清を含む新鮮な培地に交換してさらに２１時間インキュベーションを行った。
　細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗い、７５μＬのｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。－８０℃で３０分間以上インキュベーションした後、室温で１０～１５分程度解凍した。その後、細胞をプレートから回収しエッペンドルフチューブに移し、１５，０００ｇ、４℃、５分遠心し、上清５０μＬを回収した。ルシフェラーゼ活性は細胞ライセート２０μＬに　ＮａｎｏＬｕｃ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μＬを加え、ルミノメーターを用いて測定した。細胞ライセートのタンパク質量はＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて決定し、ルシフェラーゼ活性の補正を行った。その結果を図４に示す。
　ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）のトランスフェクションによるルシフェラーゼ発光強度は、添加量増加に伴って増強することが確認された（図４）。一方、転写ネガティブコントロールのｐｍｔＬｕｃ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００を使用せずにベクターを加えた細胞（ｎａｋｅｄ）ではルシフェラーゼ発光は観察されなかった。
＜実施例３＞脂質膜構造体の構築
１）特許文献２に記載された方法に準じて、ステアリル化オクタアルギニン（ＳＴＲ－Ｒ８）のオクタアルギニンに代えて、膜融合性ペプチドであるＫＡＬＡペプチド（Ｓｈａｈｅｅｎら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１１，３２，６３４２－６３５０、配列番号１３）を用いて、ＫＡＬＡとステアリン酸との縮合体（ＳＴＲ－ＫＡＬＡ）を調製した。
２）試験管に１ｍＭの脂質溶液（１，２－ジオレイル　ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／ＳＭ／ＣＨＥＭＳ＝９／２／１）８２５μＬとクロロホルム７５０μＬを加えて混合後、減圧乾燥して脂質膜フィルムを得た。これに１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液を１．５ｍＬ加え、室温で１５分間水和させた。次いで、バスタイプソニケーター（ＡＵ－２５Ｃ；アイワ医科工業）で３０秒間及びプローブタイプソニケーターで１０分間超音波処理を行い、ｓｍａｌｌ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＳＵＶ）溶液を調製した。
　０．１ｍｇ／ｍＬのｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）溶液を０．１ｍｇ／ｍＬプロタミン溶液に滴下することで核酸ナノ粒子を調製し（ｎｉｔｒｏｇｅｎ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｎ／Ｐ）比３．０）、これと２）のＳＵＶ溶液を１：２の体積比で混合し、さらに１）のＳＴＲ－ＫＡＬＡを添加（総脂質の１０ｍｏｌ％相当量）することで、脂質構造体の表面にＫＡＬＡペプチドを有する脂質膜構造体（ＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ））を調製した。
　比較対象として、ＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）のＳＴＲ－ＫＡＬＡをＳＴＲ－Ｒ８に代えたＲ８－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）、ＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）のＳＭを等量のホスファチジン酸（ＰＡ）に代えたＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）、ＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）のＳＴＲ－ＫＡＬＡをＳＴＲ－Ｒ８に代えたＲ８－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）を、それぞれ調製した。
　実施例２と同様にして、各脂質膜構造体を用いてＨｅＬａ細胞（８×１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍＬ）を各脂質膜構造体でトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発光を測定した。その結果を図５に示す。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００と比較して、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）を封入したＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）のルシフェラーゼ発光強度は大きく増強されるが、Ｒ８－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）のルシフェラーゼ発光強度は殆ど観察されなかった。また、Ｒ８－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）及びＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＰＡ）のルシフェラーゼ発光強度は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００と実質的に差は認められなかった。
　以下の実験例は、本発明の発現ベクターをトランスフェクションしたときに確認されるルシフェラーゼ発光が、細胞核内での転写翻訳を通じて行われるものではないことを確認するための実験である。
＜実験例１　インビトロ翻訳実験＞
　ＣＭＶプロモーター配列の下流に野生型ルシフェラーゼをコードする遺伝子が連結されたプラスミドｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］（プロメガ社）から、ＨｅＬａＳｃｒｉｂｅＮｕｃｌｅａｒＥｘｔｒａｃｔｉｎｖｉｔｒｏＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて野生型ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡを調製した。さらに、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）からも同様にしてｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）－ｍＲＮＡ及びｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）－ｍＲＮＡを調製した。
　ウサギ網状赤血球を用いたインビトロ翻訳系（プロメガ社）を用いて、上記各ｍＲＮＡからタンパク質を翻訳合成させ、ルシフェラーゼ発光を測定した。その結果を図６に示す。
　ウサギ網状赤血球にはミトコンドリアが存在しないため、ルシフェラーゼは野生型ＮＬｕｃ－ｍＲＮＡからは合成される一方、ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）－ｍＲＮＡからは終止コドンＴＧＡがあるので合成されず、またｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）－ｍＲＮＡも終止コドンＴＡＧがあるので活性型ルシフェラーゼは合成されない、と予想される。この予想のとおり、野生型ＮＬｕｃを有するｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］ではルシフェラーゼ発光は観察されるが、ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）を有するｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）を有するｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＴＡＧ）ではいずれもルシフェラーゼ発光は観察されなかった。
＜実験例２＞α－アマニチン添加実験
　４×１０４ｃｅｌｌｓ（０．５ｍＬ）のＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種し、０．０００１～１μｇ／ｍＬのα－アマニチンの存在下で２４時間インキュベートした。その後、実施例２の操作と同様にして、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］を用いて細胞をトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発光強度を測定した。その結果を図７に示す。
　α－アマニチンは細胞核内での転写を阻害するため、細胞核内での転写を経て産生されるｍＲＮＡをコードするｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］を用いた際には、転写が阻害されルシフェラーゼ活性は低下する事が予想される。この予想の通り、ｐＮＬ１．１［ＣＭＶ／ｎＬｕｃ］でトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞におけるα－アマニチン存在下でのルシフェラーゼ発光強度は、α－アマニチンを添加しないコントロールと比較して大幅に低下した。一方、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）はミトコンドリア内においてｍＲＮＡが転写されるため、α－アマニチンの有無に関わらずルシフェラーゼ活性が維持されると予想される。この予想の通り、α－アマニチンは、細胞毒性が観察されない０．０００１～０．１μｇ／ｍＬの添加量において、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）でトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ発光強度を低下させなかった。
＜実施例４＞プロモーター配列の変更
　実施例１の１）ａ）のｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）におけるＣＭＶプロモーター配列を、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込まれているＲＳＶプロモーター配列、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に組み込まれているＴ７プロモーター配列又はｐＧＬ３－Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込まれているＳＶ４０プロモーター配列にそれぞれ置換した発現ベクター（ｐＲＳＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＴ７－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｐＳＶ４０－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ））を構築した。
　ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＲＳＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＴ７－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及びｐＳＶ４０－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）の４種類の発現ベクターについて、実施例１の２）と同様に、Ｙａｓｕｚａｋｉら（Ｊ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１３、１７２（３）：８０５－１１）に記載されたハイドロダイナミクス法を参照して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢、オス）の尾静脈内へ２７Ｇの針を用いて２ｍＬベクター溶液（１００μｇ／５％グルコース溶液）を５秒で投与した。投与６時間後に肝臓を回収し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）を製造者プロトコールに従って使用し、ルシフェラーゼ発光量を測定した。その結果を図８に示す。
　上記４種類の発現ベクターを投与したマウスにおいて、いずれも肝臓におけるルシフェラーゼの発現を確認することができた。特に、ｐＲＳＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）を投与したマウスにおいて最も高い発現が観察された。
＜実施例５＞ＮＤ４配列の変更
　実施例１の１）ａ）のｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）におけるＮＤ４配列及びＦＬＡＧ配列を取り除いてＣＭＶプロモーター配列の直後にｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）配列を連結させた発現ベクター（ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）［－ＮＤ４］を構築した。さらに、実施例１の１）ａ）のｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）におけるＮＤ４配列を、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿０１２９２０として登録されている塩基配列の１０，７６０－１２，１３６番目までの塩基配列（ヒトのＮＤ４配列）に置換した発現ベクター（ｐＣＭＶ－ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ））をそれぞれ構築した。
　ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）［－ＮＤ４］及びｐＣＭＶ－ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ）を、実施例１の２）と同様に、Ｙａｓｕｚａｋｉら（Ｊ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１３、１７２（３）：８０５－１１）に記載されたハイドロダイナミクス法を参照して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢、オス）の尾静脈内へ２７Ｇの針を用いて２ｍＬベクター溶液（１００μｇ／５％グルコース溶液）を５秒で投与した。投与６時間後に肝臓を回収し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　ａｓｓａｙ　ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ社）を製造者プロトコールに従って使用し、ルシフェラーゼ発光量を測定した。その結果を図９に示す。
　上記３種類の発現ベクターを投与したマウスにおいて、いずれも肝臓におけるルシフェラーゼの発現を確認することができた。特に、ｐＣＭＶ－ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ）を投与したマウスにおいて、ｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）と比較してより高いルシフェラーゼの発現が観察された。
　＜実施例６＞脂質構造体を用いた形質転換
　実施例１の１）ａ）のｐＣＭＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、実施例４のｐＲＳＶ－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ｐＴ７－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）、ＳＶ４０－ｍｔＬｕｃ（ＣＧＧ）及び実施例５のｐＣＭＶ－ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ）を、実施例３に記載の方法に従ってＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）又はＲ８－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（ＳＭ）に封入し、実施例２と同様にして、ＨｅＬａ細胞（８×１０４ｃｅｌｌｓ、０．５ｍＬ）を各脂質膜構造体でトランスフェクションし、ルシフェラーゼ発光を測定した。その結果を図１０に示す。
　使用した全てのベクターに関して、ベクターを封入したＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒでトランスフェクションされた細胞においてベクターを封入したＲ８－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒでトランスフェクションされた細胞よりも高いルシフェラーゼ発光強度が観察された。また、ｐＣＭＶ－ｍｔＤＮＡ（ｈｕｍａｎ）を封入したＫＡＬＡ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒでトランスフェクションされた細胞において、最も高いルシフェラーゼ発光強度が観察された。
　本発明の発現ベクター及び脂質膜構造体は、いずれもミトコンドリア病の遺伝子治療を行うための医薬として、及びリサーチツールとして、産業上の利用可能性を有する。

Claims (11)

  1. 　動物細胞の細胞核内で転写活性を示すプロモーター配列、及び目的タンパク質をコードするコーディング領域であって、トリプトファンに対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含むコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有する、動物細胞のミトコンドリア内で目的タンパク質を発現させるための組換え発現ベクター。
  2. 　前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の５’末端側に、ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域をさらに有する、請求項１に記載の組換え発現ベクター。
  3. 　前記目的タンパク質をコードするコーディング領域の３’末端側にミトコンドリアｔＲＮＡに対応する塩基配列を有する、請求項１又は２に記載の組換え発現ベクター。
  4. 　プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、ラウスサルコーマウイルスプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、βアクチンプロモーター及びＴ７プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターの塩基配列である、請求項１～３のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
  5. 　プロモーター配列がサイトメガロウイルスプロモーター又はラウスサルコーマウイルスプロモーターの塩基配列である、請求項４に記載の組換え発現ベクター。
  6. 　前記目的タンパク質をコードするコーディング領域におけるトリプトファンに対応するコドンの全てがＴＧＡである、請求項１～５のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
  7. 　前記ミトコンドリアゲノムＤＮＡのコーディング領域がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、サブユニット４のコーディング領域である、請求項２～６のいずれかに記載の組換え発現ベクター。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載の発現ベクターを封入した脂質膜構造体。
  9. 　スフィンゴミエリンを脂質膜の構成脂質として含む、請求項８に記載の脂質膜構造体。
  10. 　配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、請求項８又は９に記載の脂質膜構造体。
  11. 　ジオレイルホスファチジルエタノールアミンとスフィンゴミエリンとを脂質膜の構成脂質として含有し、かつ配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、動物細胞のミトコンドリアに核酸を導入するための脂質膜構造体。
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