WO2017089947A2 - Composición que comprende bacteriófagos para reducir, eliminar y/o prevenir salmonella enteritidis, salmonella typhimurium y salmonella paratyphi b - Google Patents

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Ana Paula JIMÉNEZ SÁNCHEZ
Angela Victoria HOLGUIN MORENO
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Definitions

  • the present invention relates to a new bacteriophage cocktail with specific lithic activity against Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B., for its reduction, elimination and / or prevention in farm animals and animals from the poultry sector, such as poultry corral, chickens and breeders. BACKGROUND OF THE INVENTION
  • Salmonellosis is one of the major causes of bacterial gastroenteritis in humans (Brenner, et al. 2000). Each year, 93.8 million cases are reported worldwide, producing high rates of morbidity and mortality (155,000 deaths / year) (Majowicz, et al. 2010;
  • Salmonella Enteritidis (64.5%) and Salmonella Typhimurium (16.5%) (WO2004071324 A2; EP 2 550 870 A1).
  • Salmonella Enteritidis Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B
  • Salmonella Enteritidis Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B
  • they cause disease in humans when they consume contaminated poultry products because Salmonella penetrates the intestinal barrier, destroying the microvilli of epithelial cells and consequently affecting the absorption capacity (Zhao, 2002; Keller, et al. nineteen ninety five).
  • Salmonella control in the poultry chain has historically been based on a combination of biosecurity on the farm, taking adequate sanitary measures of accommodation, production and marketing, in addition to the use of antimicrobials and vaccines (Atterbury, 2007).
  • Contamination in poultry farms is the result of infected birds and cross contamination during the production chain (San Myint, 2004; Carrasco, et al. 2012).
  • Cross contamination occurs due to the lack of implementation of good manufacturing practices, where the lack of hygiene, errors in the cooling stages and the transport of products, make biosecurity conditions during the production chain not the most appropriate (Carrasco, et al. 2012; San Myint, 2004). In any case, the initial source of contamination by
  • Salmonella is due to the status of infected poultry. The importance of the above lies in the control of the bacterium from its initial inoculum, in order to reduce Salmonella contamination in the following stages of the poultry food production process (San Myint, 2004).
  • Antimicrobials have been used in agriculture since the early 1950s for the treatment of bacterial infections and to improve food efficiency both in the livestock and poultry sector (Angulo, et al. 2004). In recent years, the excessive application of antimicrobials in the poultry industry has led to the emergence of Salmonella strains resistant to these drugs (INS, 201 1). The problem is that most are used for bacterial control in animals for human consumption and in hospitalized patients who require clinical therapy. Therefore, this increases the likelihood that zoonotic bacteria develop resistance to drugs used in humans (Angulo, et al. 2004).
  • MDR multi-drug resistant Salmonella strains
  • Phago-therapy has gained high importance in recent years as the results are promising.
  • Bacteriophages are viruses that kill bacteria and are widely distributed in all types of environments. Its use has proven to be an effective method for the control of zoonotic bacteria, as they have unique advantages compared to antimicrobials (Atterbury, 2007).
  • bacteriophages can be strain-specific or specific species. This characteristic is of great importance because they prevent the imbalance of the intestinal microbiota contrary to what is frequently caused by broad-spectrum antimicrobials (Atterbury, 2007; Kutter & Sulakvelidze, 2005).
  • bacteriophages replicate for as long as the bacteria is viable, that is, by eliminating phages, they naturally limit themselves (Atterbury, 2007). Bacteriophages are not toxic to animals or humans because they only attack bacteria. On the other hand, they have the capacity to increase their initial concentration, because by infecting the bacteria they multiply within them until they are eliminated (Kutter & Sulakvelidze, 2005; Summers, 2001); The advantage obtained from the previous process is to reduce the initial dose necessary to eliminate bacterial contamination.
  • compositions comprising specific phages or combinations of phages have been reported, which are used for the control of bacteria, especially Salmonella.
  • One of the reported cases corresponds to patent WO2013024304, which discloses the use of bacteriophages for the lysis of Salmonella bacteria.
  • Said document discloses compositions comprising bacteriophages selected from ⁇ $> SH17, ⁇ $> SH18, ⁇ $> SH19 or a variant of one of these bacteriophages, wherein the variant retains the phenotypic characteristics of the parental bacteriophage.
  • patents US20090297561, WO2005024005, US8293515, US200801 18468, US20130336932, US8685696, US8597928 and WO2013014273 describe different types of bacteriophages that have specific activity against Salmonella and which are also used for the preparation of compositions useful for the control, treatment of infection in animals or humans as well as in the colonization of processed and unprocessed food products by Salmonella, or colonization of equipment involved in the processing of the same food products.
  • patent RU2232808 teaches a biological preparation for treating and preventing salmonellosis in farm animals and poultry, where said biopreparations contain different strains of bacteriophages, which are taken in an efficient amount.
  • WO2013169102 refers to a bacteriophage, a polypeptide and a corresponding polynucleotide, a nucleic acid molecule and / or vector and / or cell comprising said polynucleotide, a composition comprising said bacteriophage, polypeptide, polynucleotide , construct, vector and / or cell, for the prevention, treatment or diagnosis of contamination with Salmonella.
  • the main objective of the present invention is to provide a new bacteriophage cocktail with bactericidal activity against serovars of Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B.
  • the cocktail contains bacteriophages resistant to chlorine and stable at ambient conditions and at 4 ° C. Therefore, the new cocktail can be used prophylactically for the prevention of colonization of Salmonella strains in farm animals, poultry and eggs.
  • a further object of the invention is to prevent the cycle of colonization of pathogenic bacteria in farm animals and poultry by reducing and / or eliminating the transmission of bacterial pathogens during the life cycle of farm animals. you see.
  • Another object of the invention is to reduce, eliminate or prevent the colonization of eggs by bacterial pathogens such as Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B.
  • Typhimurium and Salmonella Paratyphi B which colonize farm animals, eggs and poultry, by applying the new bacteriophage cocktail in the environment where they they find farm animals, chickens, eggs and poultry.
  • a further object of the invention is to prevent and eliminate strains of Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella
  • Paratyphi B that are polluting the facilities, equipment and machinery that is involved in the process of producing animals for human consumption, such as chicken meat and eggs, by using the new phage cocktail as a disinfectant in farm work areas , on surfaces of the Benefit Plant and processed foods.
  • the present invention provides a collection of bacteriophages that can compose a cocktail of different bacteriophages against Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B.
  • the present invention is directed to the exposure and / or application of a new bacteriophage cocktail during the production of poultry and / or eggs to reduce, eliminate or prevent the colonization of bacterial pathogens such as
  • production as applied to poultry includes, but is not limited to reproduction, breeding, storage, processing and handling of poultry and all functions associated with the same.
  • production as applied to eggs includes, but is not limited to the incubation, storage and processing of eggs for consumption and all functions associated therewith.
  • production includes, but is not limited to broilers, chickens and breeders.
  • Colonization Bacterial refers to the initial exposure of a pathogen and the initial growth and expansion of the population of the microorganism or microorganisms. After colonization the infection occurs, and the bacterial population alters the homeostasis of the host and produces adverse symptoms.
  • the subject matter of protection corresponds to a new phage cocktail comprising bacteriophages of the order Caudovirales, which have lithic activity against different strains Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B.
  • Said cocktail can be used for industrial application and, It is administered by liquid means such as sprays, buffers or water, and solids such as powder or pearls.
  • Said cocktail comprises phages from a collection of phages characterized and selected for their effectiveness and their absence of virulence or toxicity genes.
  • FIGURE 1 PFGE of the 6 phages of the invention, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24 and cpSan25
  • FIGURE 2 Transmission electron microscopy of a phage [00025].
  • FIGURE 3 Efficiency in bacterial reduction of bacteriophage cocktail
  • FIGURE 4 Efficiency by burst size example of the best phage
  • the present invention relates to a new bacteriophage cocktail with specific lithic activity against Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B., for its reduction, elimination and / or prevention in farm animals, poultry and eggs. [00028].
  • the new cocktail consists of bacteriophages selected from a collection of phages, all belonging to the order Caudovirales.
  • the present invention discloses bacteriophage compositions comprising excipients and 6 phages, hereinafter referred to as cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25, which comprise the SEQ sequences. ID No.13, SEQ. ID No.14, SEQ. ID No.15, SEQ. ID No.23, SEQ. ID No.24 and SEQ. ID No. 25, respectively.
  • genomes are free of toxicity and virulence genes, which makes them ideal for industrial application by being safe for the animal that consumes them and for the human that consumes poultry products.
  • the phage cocktail makes it possible to counteract bacterial resistance unlike antibiotics and disinfectants. From the above, the phages that make up the cocktail, can be replaced by any of the phages of the collection when necessary in this way minimize the risk of resistance being generated.
  • the excipients that accompany the phage cocktail within the composition are selected from a solvent or a buffer.
  • a solvent or a buffer For example it is a solution composed of 5.8g NaCL, 5ml 2% gelatin, 50ml 1M Tris-HCI, pH 7.5, 1.2g MgS04 7H20 (Kutter & Sulakvelidze, 2005).
  • the size of phage genomes usually varies between 30 and 180 kb.
  • the new bacteriophage cocktail or composition comprises the phages: cpSan13 with a genome size of 170 Kb, cpSan14 with a genome size of 170 Kb, cpSan15 with a genome size of 159.3 Kb, cpSan25 with a genome size of 86.7 Kb, cpSan23 with a genome size of 90 Kb and cpSan24 with a genome size 90 Kb, and an additional component, such as an excipient that is selected from a solvent or buffer.
  • Its administration can be given by liquid means such as sprays, buffers, or water, and solids such as powder or pearls to be administered in the food.
  • One embodiment of the invention is the use of the bacteriophage composition cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25 for the control of Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B, on surfaces, facilities, equipment and machinery that are found on animal farms, especially poultry farms.
  • Another embodiment of the invention is the use of the bacteriophage composition cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25 for the control and / or elimination of Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B, in farm animals, birds of corral, eggs and processed foods and their packaging.
  • the bacteriophage composition cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, or cpSan25 for the prevention of Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B, is used in farm animals, poultry, eggs and processed foods and their packaging.
  • An embodiment of the invention also comprises a bacteriophage composition cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25 in a dose of 10 7-10 9 PFU / ml_
  • another embodiment of the invention corresponds to a liquid or solid food supplement comprising a bacteriophage composition comprising between one and six bacteriophages selected from the set cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25.
  • another embodiment of the invention corresponds to a disinfectant comprising a bacteriophage composition comprising between one and six bacteriophages selected from the set cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25.
  • the bacteriophage composition for the prevention, elimination and / or reduction of infections and contaminations caused by Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B is characterized in that it comprises at least 1 of the 6 lytic phages against Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, or cpSan25; or between 1 and 6 phages selected from the set cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25.
  • the bacteriophage cocktail for the prevention, elimination and / or reduction of infections and contaminations caused by Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B is characterized in that it comprises at least 2 of the 6 lytic phages against Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, or cpSan25; or between 2 and 6 phages selected from the set cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25.
  • the bacteriophage composition for the prevention, elimination and / or reduction of infections and contaminations caused by Salmonella Enteritidis,
  • Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B is characterized in that it comprises at least 3 of the 6 lithic phages against Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, or cpSan25; or between 3 and 6 phages selected from the set cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25.
  • the bacteriophage composition for the prevention, elimination and / or reduction of infections and contaminations caused by Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B is characterized in that it comprises at least 4 of the 6 lytic phages against Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, or cpSan25; or between 4 and 6 phages selected from the set cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25.
  • the bacteriophage cocktail for the prevention, elimination and / or reduction of infections and contaminations caused by Salmonella Enteritidis,
  • Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B is characterized in that it comprises the 6 lithic phages against Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, or cpSan25.
  • the present bacteriophage composition for the prevention of elimination and / or reduction of infections and contaminations may also comprise additional phages selected from the order Caudoviral, which have lithic activity against different strains Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium and Salmonella Paratyphi B.
  • the phage composition comprises only phages selected from the set cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, and cpSan25
  • composition is characterized in that each phage is in equal proportion. [00056]. Likewise, in another embodiment of the invention, the composition is characterized in that each phage is in a different proportion. [00057].
  • Table 1 is presented below, which contains the particular characteristics of each of the phages of interest, which allow their specific differentiation with respect to all the different types of phages that can be found.
  • infection rate calculated by dividing the number of Salmonella strains that the phage infects, over the total number of strains evaluated.
  • plaque efficiency index it is calculated by dividing the number of Salmonella strains that the phage infects with an EOP_> 1, over the number of strains evaluated that the phage infects, regardless of the EOP.
  • EOP Platelet efficiency
  • the phage genome size was determined by electrophoresis pulsed field (PFGE), based on the Evergreen Phage Lab protocol (Olympia, WA) of 2009. The phages were brought to a concentration of 10 9 pfu / ml. Then, agarose plugs were made which contained 400ul of the phage suspension and 400ul of 1% agarose (w / v) (Ultra Puree DNA Grade Agarose: BioRad # 162-0137) in 0.5% TBE buffer . After a lysis with proteinase K (Promega), at a final concentration of 0.1 mg / ml, lysis buffers were performed. The PFGE run conditions were as follows: 6 volts, 15h, 2 sec of initial change and 10 sec of final change. The gel was stained with geIRed (Biotium) 3X and visualized in the GelDoc System (BioRad).
  • PFGE electrophoresis pulsed field
  • TEM transmission electron microscope
  • MOI multiplicity of infection
  • Salmonella Enteritidis reductions of 3, 12 were obtained; 4.3;
  • One-step curves were made for each phage cpSan23, cpSan24, cpSan25, cpSan15, and then calculate the burst size.
  • MOI multiplicity of infection
  • a plate forming unit count (PFU / ml) was made and the following parameters were determined: the population growth rate of the phages (fitness), the number of progeny released (burst size), and the period of latency and eclipse based on non-adsorbed phages and centers of infection from treatment with chloroform and, on the other hand, the number of non-adsorbed phages from treatment without chloroform (Wang. et al. 2006).
  • the burst s / ' ze is an essential parameter that allows determining the degree of phage efficiency, where the higher the value, the more efficient it will be.
  • phage cpSan23, cpSan24, cpSan25, cpSan15, of the invention all have a high s / ' ze burst value, where for a phage infection cycle, it can generate a progeny of 165 and 200 ( Figure 4); 81, 6 and 120, respectively.
  • Figure 4 The results show us that with these efficiency values in burst s / ' ze, the phages of this invention are excellent candidates for the described application.
  • results obtained show that all phages are infective at each time. Controls where only chlorinated water was seeded showed no inhibition of bacterial growth.
  • the symbol (+) represents infection of the bacterium by the phage.
  • the results were accompanied by a description of phage plaque morphology for each trial performed. With the reading of the results, changes in plaque morphology were observed at different times.
  • Phage 5 mirt 15 min 30 min 1 hour 2 hours 24 hours cpSan23 + + + + + + + + + cpSan24 + + + + + + + cpSan25 + + + + + + + + cpSan15 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

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Description

COMPOSICIÓN QUE COMPRENDE BACTERIÓFAGOS PARA REDUCIR, ELIMINAR Y/O PREVENIR Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001 ]. La presente invención se relaciona con un nuevo coctel de bacteriófagos con actividad lítica específica contra Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B., para su reducción, eliminación y/o prevención en animales de granja y animales provenientes del sector avícola, como aves de corral, gallinas y reproductoras. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002]. La salmonelosis es una de las mayores causas de gastroenteritis bacteriana en humanos (Brenner, et al. 2000). Cada año, 93,8 millones de casos son reportados a nivel mundial, produciendo altos índices de morbilidad y mortalidad (155.000 muertes/año) (Majowicz, et al. 2010;
Cabrera, 2008). En Estados Unidos se estima que el 40% de las infecciones causadas por Salmonella ocurren en niños menores de 10 años (Angulo, et al. 2004). El tratamiento de esta enfermedad impone una carga económica considerable en muchos países; según el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA), el costo anual para el tratamiento de la salmonelosis, incluyendo la pérdida de productividad en el 2005, tuvo un costo de 2,3 billones de dólares (Atterbury, 2007). Usualmente, estos patógenos causan gastroenteritis leves y moderadas, sin embargo en casos más severos pueden causar septicemias (Zhao, et al. 2001 ).
[0003]. La transmisión de Salmonella se debe principalmente al consumo de alimentos contaminados, en especial por consumo de productos avícolas, los cuales son ampliamente aceptados como la mayor fuente de infección de esta bacteria (Atterbury, 2007). 04]. La USDA estima que entre un 50-75% de los casos de salmonelosis se deben al adquirir productos avícolas contaminados, en especial por el consumo de carne de pollo y huevos. Entre los serovares de mayor prevalencia en el mundo se encuentran Salmonella Enteritidis (64,5%) y Salmonella Typhimurium (16,5%) (WO2004071324 A2; EP 2 550 870 A1 ). Sin embargo, en el 2010, el grupo de Investigación y Vigilancia Integrada de la Resistencia Antimicrobiana - COIPARS de la Corporación Colombiana para la Investigación Agropecuaria - CORPOICA, luego de haber reportado una prevalencia de Salmonella del 41 % en granjas de producción de pollo y 26% en carne de pollo en puntos de venta, encontraron que los serovares de Salmonella Paratyphi B y Salmonella Heidelberg eran los más prevalentes en granjas de Colombia (Donado-Godoy, et al. 2012). En cuanto a Salmonella Paratyphi B, tuvo una prevalencia en granja del 76% y en carne en puntos de venta del 51 %, mientras que Salmonella Heidelberg tuvo una prevalencia del 23% y 16%, respectivamente (Donado-Godoy, 2010). Este reporte tuvo una alta importancia en el sector ya que era la primera vez que se reportaba Salmonella Paratyphi B en la cadena alimenticia del sector avícola. A partir de esta publicación, se realizó un estudio donde se serotipificaron aislamientos de Salmonella en diferentes puntos de la cadena avícola, incluyendo a los trabajadores del sector. Como resultado, los serotipos aislados a partir de las granjas y planta de beneficio fueron exactamente los mismos encontrados en los humanos, trabajadores de la compañía (comunicación personal). El anterior estudio muestra que el aumento de serotipos aislados como Salmonella Paratyphi B están llegando al humano y por tanto pueden estar generando nuevos brotes de una Salmonella patogénica que no se estaba controlando y que puede llegar a ser un nuevo problema en Salud Pública. [0005]. Una de las razones por las cuales existe una alta prevalencia de Salmonella en alimentos de origen avícola es debido a la capacidad que tienen de colonizar el intestino de los pollos; en el caso de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, no producen infección o síntomas visibles en el ave y tienen la capacidad de colonizar el interior de los huevos. Sin embargo, causan la enfermedad en el ser humano cuando éste consume productos avícolas contaminados debido a que Salmonella penetra la barrera intestinal, destruyendo las microvellosidades de las células epiteliales y como consecuencia afectando la capacidad de absorción (Zhao, 2002; Keller, et al. 1995).
[0006]. El control de Salmonella en la cadena avícola se ha basado históricamente en una combinación de la bioseguridad en la granja, tomando medidas sanitarias adecuadas de alojamiento, producción y comercialización, además del uso de antimicrobianos y vacunas (Atterbury, 2007). La contaminación en las granjas avícolas es el resultado de las aves infectadas y la contaminación cruzada durante la cadena de producción (San Myint, 2004; Carrasco, et al. 2012). La contaminación cruzada se presenta debido a la falta de implementación de las buenas prácticas de manufactura, donde la falta de higiene, errores en las etapas de enfriamiento y el transporte de los productos, hacen que las condiciones de bioseguridad durante la cadena de producción no sean las más adecuadas (Carrasco, et al. 2012; San Myint, 2004). En todo caso, la fuente inicial de contaminación por
Salmonella se debe al estado de las aves de corral infectadas. La importancia de lo anterior radica en el control de la bacteria desde su inoculo inicial, para de esta manera reducir la contaminación por Salmonella en las siguientes etapas del proceso de producción de los alimentos avícolas (San Myint, 2004).
[0007]. El costo de los tratamientos que se utilizan para disminuir Salmonella en granjas de pollo y en alimentos es alto debido a que son patógenos ampliamente distribuidos y colonizan fácilmente (Zhao, 2002; WO 2004071324 A2). Es por esta razón que se han implementado diversos tratamientos para el control y la disminución de estos patógenos como el uso de agua clorada en spray, tratamientos físicos como lavados al vapor, calor seco y luz ultravioleta, y el uso de aditivos químicos. No obstante, en algunos casos se ha reportado que la calidad organoléptica del producto final puede verse afectada (García, et al. 2008). En cuanto al uso de desinfectantes, estos han sido utilizados para la eliminación de los patógenos y para la reducción de la contaminación cruzada durante el proceso de producción, sin embargo, la aparición de resistencia y las consecuencias medio ambientales hacen que no sea de total eficiencia (Goode, et al. 2003). Otro de los tratamientos de mayor uso en el mundo para controlar serovares de Salmonella en la industria avícola, es la vacunación. Existen reportes que muestran casos de baja eficiencia, pues las vacunas que más se utilizan son fabricadas a partir de cepas de referencia inactivadas o atenuadas que no cubren la totalidad de serotipos presentes en todas las granjas avícolas. (Zhao, 2002; Vandelplas, et al. 2010). Por otra parte, las vacunas solamente están dirigidas al control de Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, más no de Salmonella Paratyphi B, un nuevo patógeno emergente en el sector avícola colombiano, y que lo ha sido previamente en varios países europeos, lo que dificulta aún más su control (Donado-Godoy, et al. 2012; Van Immersel, et al. 2004). 08]. Los antimicrobianos han sido utilizados en la agricultura desde principios de 1950 para el tratamiento de infecciones bacterianas y mejorar la eficiencia alimentaria tanto en el sector ganadero como en el avícola (Angulo, et al. 2004). En los últimos años, la aplicación excesiva de antimicrobianos en la industria avícola ha generado la aparición de cepas de Salmonella resistentes a estos medicamentos (INS, 201 1 ). El problema radica en que la mayoría son utilizados para el control bacteriano en animales para el consumo humano y en pacientes hospitalizados que requieren de terapia clínica. Por consiguiente, esto aumenta la probabilidad que bacterias zoonóticas desarrollen resistencia a los medicamentos utilizados en humanos (Angulo, et al. 2004). La emergencia de cepas de Salmonella resistentes a múltiples medicamentos (MDR, por las siglas en inglés) está causando una gran preocupación entre médicos y veterinarios, pues según estudios epidemiológicos, la fuente más común de cepas MDR en humanos se debe al consumo de alimentos contaminados de origen animal (O'FIynn et al. , 2006).
[0009]. Ante la necesidad de nuevas estrategias para el control, eliminación y/o reducción de Salmonella en la industria avícola, la Fago- terapia ha ganado una alta importancia en los últimos años pues los resultados son prometedores. Los bacteriófagos son virus que matan bacterias y se encuentran ampliamente distribuidos en todo tipo de ambientes. Su uso ha mostrado ser un método efectivo para el control de bacterias zoonóticas, pues tienen ventajas únicas en comparación con los antimicrobianos (Atterbury, 2007). Entre las ventajas de la Fago- terapia está la especificidad, por lo que los bacteriófagos pueden ser cepa-específico o especie específico. Esta característica es de gran importancia debido a que evitan el desequilibrio de la microbiota intestinal contrario a lo causado frecuentemente por los antimicrobianos de amplio espectro (Atterbury, 2007; Kutter & Sulakvelidze, 2005). Asimismo, los bacteriófagos se replican por el tiempo que la bacteria esté viable, es decir que al eliminarla los fagos se auto-limitan naturalmente (Atterbury, 2007). Los bacteriófagos no son tóxicos para animales ni para humanos debido a que sólo atacan bacterias. Por otro lado tienen la capacidad de aumentar su concentración inicial, debido a que al infectar a las bacterias éstos se multiplican dentro de ellas hasta eliminarlas (Kutter & Sulakvelidze, 2005; Summers, 2001 ); la ventaja obtenida del proceso anterior es reducir la dosis inicial necesaria para eliminar las contaminaciones bacterianas.
[00010]. A este respecto, se han reportado diferentes composiciones que comprenden fagos específicos o combinaciones de fagos, que son usadas para el control de bacterias, en especial Salmonella. Uno de los casos reportados corresponde a la patente WO2013024304, el cual divulga el uso de bacteriófagos para la lisis de la bacteria Salmonella. Dicho documento revela composiciones que comprenden bacteriófagos seleccionados de <$>SH17, <$>SH18, <$>SH19 o una variante de uno de estos bacteriófagos, en donde la variante retiene las características fenotípicas del bacteriófago parental. Además, las patentes US20090297561 , WO2005024005, US8293515, US200801 18468, US20130336932, US8685696, US8597928 y WO2013014273 describen diferentes tipos de bacteriófagos que tienen actividad específica contra Salmonella y que además, son usados para la elaboración de composiciones útiles para el control, tratamiento de la infección en animales o humanos así como también en la colonización de productos alimenticios procesados y no procesados por Salmonella, o colonización de equipos involucrados en el procesamiento de los mismos productos alimenticios.
[0001 1 ]. Así mismo, la patente RU2232808 enseña una preparación biológica para tratar y prevenir salmonelosis en animales de granja y aves de corral, en donde dichas biopreparaciones contienen diferentes cepas de los bacteriófagos, los cuales son tomados en una cantidad eficiente.
[00012]. En este orden de ideas, la patente WO2013169102 se refiere a un bacteriófago, un polipéptido y un polinucleótido correspondiente, una molécula de ácido nucleico y/o vector y/o célula que comprende dicho polinucleótido, una composición que comprende dicho bacteriófago, polipéptido, polinucleótido, constructo, vector y/o célula, para la prevención, tratamiento o diagnóstico de contaminación con Salmonella.
[00013]. Finalmente, también existen documentos, tal como la patente US20140220659, la cual divulga un método para preparar una cepa de bacteriófagos específicos para una cepa bacteriana seleccionada, cepas de bacteriófagos obtenidas de esta forma y la aplicación de bacteriófagos para la preparación de una preparación para la prevención y tratamiento contra infecciones de animales de granja, especialmente aves de corral, con cepas de bacterias patógenas sensibles a estos bacteriófagos. Además, este documento proporciona una tecnología de producción para una preparación antimicrobiana adecuada para uso como aditivo de alimentos para aves de corral y cerdos, que al mismo tiempo sería específica para las cepas patógenas de Salmonella que causan la incidencia de la salmonelosis, especialmente en seres humanos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
[00014]. El objetivo principal de la presente invención es proveer un nuevo coctel de bacteriófagos con actividad bactericida contra serovares de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B. El coctel contiene bacteriófagos resistentes a cloro y estables a condiciones ambientales y a 4°C. Por lo tanto, el nuevo coctel puede ser usado de manera profiláctica para la prevención de la colonización de las cepas de Salmonella en animales de granja, aves de corral y huevos.
[00015]. Un objeto adicional de la invención es impedir el ciclo de la colonización de las bacterias patógenas en los animales de granja y las aves de corral mediante la reducción y/o eliminación de la transmisión de patógenos bacterianos durante el ciclo de vida de los animales de granja y aves.
[00016]. Otro objeto de la invención es reducir, eliminar o prevenir la colonización de los huevos por patógenos bacterianos como Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B.
[00017]. También es un objeto adicional de la invención es reducir al mínimo o eliminar las cepas de Salmonella Enteritidis, Salmonella
Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, que colonizan a los animales de granjas, a los huevos y a las aves de corral, mediante la aplicación del nuevo coctel de bacteriófagos en el medio ambiente donde se encuentran los animales de granja, las gallinas, los huevos y las aves de corral.
[00018]. Un objeto adicional de la invención es prevenir y eliminar las cepas de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella
Paratyphi B que se encuentren contaminando las instalaciones, equipos y maquinaria que está involucrada en el proceso de producción de animales para consumo humano, como carne de pollo y huevos, mediante el uso del nuevo coctel de fagos como desinfectante en áreas de trabajo de las granjas, en superficies de la Planta de beneficio y en comidas procesadas.
[00019]. Es un objeto de la invención proporcionar alternativas para mejorar la salud de los animales de granja y de reducir, eliminar o prevenir la mortalidad de éstos.
[00020]. La presente invención, provee una colección de bacteriófagos que pueden componer un coctel de bacteriófagos diferentes contra Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B.
[00021 ]. Para cumplir estos objetivos la presente invención está dirigida a la exposición y/o la aplicación de un nuevo coctel de bacteriófagos durante la producción de aves de corral y/o los huevos para reducir, eliminar o prevenir la colonización de patógenos bacterianos como
Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B. El término "producción" como se aplica a las aves de corral incluye, pero no se limita a reproducción, crianza, almacenamiento, procesamiento y manejo de las aves de corral y todas las funciones asociadas con el mismo. El término "producción" tal como se aplica a los huevos incluye, pero no se limita a la incubación, el almacenamiento y el procesamiento de los huevos para el consumo y todas las funciones asociadas con el mismo. El término "aves de corral" incluye, pero no está limitado a pollos de engorde, gallinas y reproductoras. Colonización bacteriana se refiere a la exposición inicial de un patógeno y el crecimiento inicial y la expansión de la población del microorganismo o microorganismos. Después de la colonización se da la infección, y la población bacteriana altera la homeostasis del hospedero y produce síntomas adversos.
[00022]. Dado lo anterior, la materia objeto de protección corresponde a un nuevo coctel de fagos que comprende bacteriófagos del orden Caudovirales, que tienen actividad lítica contra diferentes cepas Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B. Dicho coctel puede ser usado para aplicación industrial y, es administrado mediante medios líquidos como sprays, buffers o agua, y sólidos como polvo o perlas. Dicho coctel comprende fagos de una colección de fagos caracterizados y seleccionados por su efectividad y su ausencia de genes de virulencia o toxicidad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[00023]. FIGURA 1 . PFGE de los 6 fagos de la invención, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24 y cpSan25
[00024]. FIGURA 2. Microscopía electrónica de transmisión de un fago [00025]. FIGURA 3. Eficiencia en la reducción bacteriana del coctel de bacteriófagos
[00026]. FIGURA 4. Eficiencia por burst size ejemplo del mejor fago
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
[00027]. La presente invención se relaciona con un nuevo coctel de bacteriófagos con actividad lítica específica contra Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B., para su reducción, eliminación y/o prevención en animales de granja, aves de corral y huevos. [00028]. El nuevo coctel se compone de bacteriófagos seleccionados de una colección de fagos, todos pertenecientes al orden Caudovirales.
[00029]. La presente invención revela composiciones de bacteriófagos que comprenden excipientes y 6 fagos, denominados en adelante como cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25, los cuales comprenden a las secuencias SEQ. ID No.13, SEQ. ID No.14, SEQ. ID No.15, SEQ. ID No.23, SEQ. ID No.24 y SEQ. ID No.25, respectivamente.
[00030]. Asimismo, los genomas están libres de genes de toxicidad y virulencia, los cual los hace ideales para su aplicación industrial al ser seguros para el animal que los consume y para el humano que consume los productos avícolas.
[00031 ]. Las pruebas in vivo mostraron la inocuidad del cóctel de fagos en las aves de granja. No hubo diferencias en la mortalidad con respecto al grupo control son fagos y no hubo presencia de aves enfermas al ser expuestas a los fagos. De esta manera, se confirmó la seguridad e inocuidad de los fagos de la presente invención.
[00032]. Por otro lado, el coctel de fagos permite contrarrestar la resistencia bacteriana a diferencia de los antibióticos y desinfectantes. A partir de lo anterior, los fagos que componen el coctel, pueden ser sustituidos por alguno de los fagos de la colección cuando sea necesario de esta manera minimizan el riesgo de que se genere resistencia.
[00033]. Su estabilidad se mantiene a 4°C durante dos años y temperatura ambiente a 20°C durante 1 mes. La estabilidad a pH 7.0 mantiene durante un año. [00034]. Los fagos son estables en el agua clorada que beben los animales de granja (concentración de cloro 0,000975% y se mantienen viables durante 24h. [00035]. La eficiencia in vitro del coctel de bacteriófagos disminuye la población bacteriana de Salmonella entre 3,33 y 4,62 Iog10 ufc/ml durante las 10 horas de exposición al coctel.
[00036]. La prueba in vivo en aves de corral mostró que el suministro del coctel de fagos de la invención aumentó el peso de las aves 70 gramos con respecto al control. Peso promedio del control al final del ciclo de producción: 2.252 ± 125 g y peso promedio del tratamiento con fagos al final del ciclo de producción: 2.322 ± 121 g. [00037]. Asimismo, las pruebas in vivo en aves de corral, mostraron diferencia en la conversión y/o eficiencia alimenticia de las aves, teniendo un mejor rendimiento las aves expuestas a los fagos que las aves del control sin fagos. [00038]. Un resultado adicional a las pruebas in vivo, fue el observar una mayor homogeneidad en el peso de las aves a las que se les suministró el coctel de fagos de esta invención, que a las aves del control sin fagos.
[00039]. Los excipientes que acompañan el coctel de fagos dentro de la composición son seleccionados de un solvente o un buffer. Por ejemplo es una solución compuesta por 5.8g NaCL, 5ml gelatina 2%, 50ml 1 M Tris-HCI, pH 7.5, 1 .2g MgS04 7H20 (Kutter & Sulakvelidze, 2005).
[00040]. El tamaño de los genomas de los fagos varía usualmente entre 30 y 180 kb. El nuevo coctel o composición de bacteriófagos comprende los fagos: cpSan13 con un tamaño de genoma de 170 Kb, cpSan14 con un tamaño de genoma de 170 Kb, cpSan15 con un tamaño de genoma de 159,3 Kb, cpSan25 con un tamaño de genoma de 86.7 Kb, cpSan23 con un tamaño de genoma de 90 Kb y cpSan24 con un tamaño de genoma de 90 Kb, y un componente adicional, tal como un excipiente que es seleccionado de un solvente o buffer.
[00041 ]. Su administración se puede dar mediante medios líquidos como sprays, buffers, o agua, y sólidos como en polvo o perlas para administrarse en el alimento.
[00042]. Una modalidad de la invención es el uso de la composición de bacteriófagos cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25 para el control de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, en superficies, instalaciones, equipos y maquinaria que se encuentran en granjas para animales, en especial granjas avícolas.
[00043]. Otra modalidad de la invención es el uso de la composición de bacteriófagos cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25 para el control y/o eliminación de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, en animales de granja, aves de corral, huevos y alimentos procesados y sus empaques.
[00044]. En otra realización de la invención, la composición de bacteriófagos cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, o cpSan25 para la prevención de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, se usa en animales de granja, aves de corral, huevos y alimentos procesados y sus empaques.
[00045]. Una realización de la invención, también comprende una composición de bacteriófagos cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25 en una dosis de 107-109UFP/ml_
[00046]. Además, otra modalidad de la invención corresponde a un suplemento alimenticio líquido o sólido que comprende una composición de bacteriófagos que comprende entre uno y seis bacteriófagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
[00047]. Además, otra modalidad de la invención corresponde a un desinfectante que comprende una composición de bacteriófagos que comprende entre uno y seis bacteriófagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
[00048]. En una modalidad preferida de la invención, la composición de bacteriófagos para la prevención, eliminación y/o reducción de infecciones y contaminaciones causadas por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, se encuentra caracterizada porque comprende al menos 1 de los 6 fagos líticos contra Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, o cpSan25; o entre 1 y 6 fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
[00049]. En otra modalidad de la invención, el coctel de bacteriófagos para la prevención, eliminación y/o reducción de infecciones y contaminaciones causadas por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, se encuentra caracterizado porque comprende al menos 2 de los 6 fagos líticos contra Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, o cpSan25; o entre 2 y 6 fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
[00050]. En una modalidad diferente de la invención, la composición de bacteriófagos para la prevención, eliminación y/o reducción de infecciones y contaminaciones causadas por Salmonella Enteritidis,
Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, se encuentra caracterizada porque comprende al menos 3 de los 6 fagos líticos contra Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, o cpSan25; o entre 3 y 6 fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
[00051 ]. En una modalidad diferente de la invención, la composición de bacteriófagos para la prevención, eliminación y/o reducción de infecciones y contaminaciones causadas por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, se encuentra caracterizada porque comprende al menos 4 de los 6 fagos líticos contra Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, o cpSan25; o entre 4 y 6 fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
[00052]. Finalmente, en otra modalidad preferida de la invención, el coctel de bacteriófagos para la prevención, eliminación y/o reducción de infecciones y contaminaciones causadas por Salmonella Enteritidis,
Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, se encuentra caracterizada porque comprende los 6 fagos líticos contra Salmonella, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, o cpSan25. [00053]. De manera similar, la presente composición de bacteriófagos para la prevención eliminación y/o reducción de infecciones y contaminaciones, también puede comprender fagos adicionales seleccionados del orden Caudovirales, que tienen actividad lítica contra diferentes cepas Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B.
[00054]. En una presentación de la invención, la composición de fagos comprende únicamente fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25
[00055]. Adicionalmente, en otra realización de la invención, dicha composición se encuentra caracterizada porque cada uno de los fagos se encuentra en igual proporción. [00056]. Así mismo, en otra modalidad de la invención, la composición se encuentra caracterizada porque cada uno de los fagos se encuentra en diferente proporción. [00057]. De esta forma, a continuación se presenta la Tabla 1 , la cual contiene las características particulares de cada uno de los fagos de interés, que permiten la diferenciación específica de los mismos con respecto a todos los diferentes tipos de fagos que se pueden encontrar.
Tabla 1. Características de los bacteriófagos contra S. Enteritidis, S. Typhimurium y S.
Paratyphi B
Figure imgf000016_0001
"índice de infección: se calcula dividiendo el número de cepas de Salmonella que el fago infecta, sobre el número total de cepas evaluadas.
**índice de la eficiencia de plaqueo (EOP): se calcula dividiendo el número de cepas de Salmonella que el fago infecta con un EOP_> 1 , sobre el número de cepas evaluadas que el fago infecta, sin tener en cuenta el EOP.
Eficiencia de plaqueo (EOP): es la relación del título del fago en la cepa evaluada y el título del fago en la cepa original de aislamiento.
EJEMPLOS
[00058]. EJEMPLO 1 : Caracterización por tamaño de genoma
Se determinó el tamaño del genoma de los fagos mediante una electroforesis de campo pulsado (PFGE), con base al protocolo de Evergreen Phage Lab (Olympia, WA) del 2009. Los fagos se llevaron a una concentración de 109ufp/ml. Luego, se realizaron plugs de agarosa los cuales contenían 400ul de la suspensión del fago y 400ul de la agarosa al 1 % (w/v) (Ultra Puré DNA Grade Agarose: BioRad #162-0137) en 0,5% de buffer TBE. Luego de una lisis con proteinasa K (Promega), a una concentración final de 0, 1 mg/ml, se realizaron lavados con buffer de lisis. Las condiciones de corrido del PFGE fueron las siguientes: 6 voltios, 15h, 2 seg de cambio inicial y 10 seg de cambio final. El gel se tiñó con geIRed (Biotium) 3X y se visualizó en el Sistema GelDoc (BioRad).
[00059]. Según el PFGE de los 6 fagos de la invención, cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24 y cpSan25 el tamaño de su genoma fue 170; 170; 159,3; 90; 90 y 86,7Kb, respectivamente (Figura 1 ).
[00060]. EJEMPLO 2. Microscopía electrónica de transmisión
Los fagos puros a una concentración de 1010-1011 ufp/ml, fueron colocados en una rejilla recubierta de carbono de electrones y se les realizó una tinción negativa con 1 % de ácido fosfotúngstico. Luego del secado, las preparaciones se examinaron en el microscopio electrónico de transmisión (TEM). La morfología de los fagos y sus dimensiones fueron tomadas.
[00061 ]. Los fagos cpSan15, cpSan23, cpSan24 y cpSan25 que hacen parte de esta invención, morfológicamente pertenecen a la familia Myoviridae del orden Caudovirales (Figura 2). Las micrografías electrónicas muestran que los fagos tienen cabezas icosaédricas con dimensiones entre 50 y 70 nm, con colas largas y contráctiles, con una longitud entre 120 y 180nm.
[00062]. EJEMPLO 3. Eficiencia en la reducción bacteriana del coctel de bacteriófagos
Un cultivo de Salmonella Enteritidis (OD600 = 0,01 ) fue infectado con un coctel de fagos, descrito en esta invención. Se utilizó una multiplicidad de infección (MOI) de 0, 1 . El cultivo se incubó en agitación a 37°C durante 15h. Se monitoreó la absorbancia del cultivo y la enumeración bacteriana mediante el plaqueo de diluciones seriadas.
[00063]. Se obtuvieron reducciones de Salmonella Enteritidis de 3, 12; 4,3;
3,86 y 4,29 Iog10 ufc/m, entre otros, luego de la infección con los fagos individuales de la colección y un máximo de 4,62 Iog10 ufc/ml con el coctel de fagos (Figura 3, en azul se muestra el cultivo de la bacteria sin el coctel de fagos y en rojo el cultivo de la misma bacteria con el coctel de fagos).
[00064]. La actividad combinada de mínimo 3 fagos en el coctel, permite una reducción mayor de Salmonella con respecto a los fagos individuales. El hecho de que los fagos individuales muestren menor eficiencia al eliminar y/o reducir Salmonella en el tiempo, justifica la importancia del uso de una mezcla con varios fagos para la composición de un coctel eficiente. [00065]. EJEMPLO 4. Eficiencia por burst si ze ejemplo del mejor fago
Se realizaron curvas one-step para cada los fagos cpSan23, cpSan24, cpSan25, cpSan15, y así, posteriormente calcular el burst size. El cultivo de Salmonella Enteritidis s25pp (OD600 = 0,2) fue infectado con cada fago, y se dividió en dos tratamientos: sin y con cloroformo. Se utilizó una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01. El cultivo se incubó a 37°C, y cada 5min se tomaron muestras de éste hasta los 40min. Las muestras del cultivo infectadas se colocaron en cloroformo y con las de sin cloroformo se les realizaron diluciones (1/10) inmediatamente en buffer SM y se plaquearon mediante el método del doble agar. Esto mismo se le realizó a las muestras con cloroformo pero al siguiente día. Por último, se hizo un conteo de unidades formadoras de placa (UFP/ml) y se determinaron los siguientes parámetros: la tasa de crecimiento poblacional de los fagos (fitness), el número de progenie liberada (burst size), y el período de latencia y eclipse con base en los fagos no adsorbidos y centros de infección provenientes del tratamiento con cloroformo y por otra parte, el número de fagos no adsorbidos provenientes del tratamiento sin cloroformo (Wang. et al. 2006). El burst s/'ze, es un parámetro esencial que permite determinar el grado de eficiencia de los fagos, en dónde entre mayor sea el valor, más eficiente será. Para los fagos cpSan23, cpSan24, cpSan25, cpSan15, de la invención, todos tienen un valor de burst s/'ze alto, dónde por un ciclo de infección del fago, puede generar una progenie de 165 y 200 (Figura 4); 81 ,6 y 120, respectivamente. Los resultados nos muestran que con estos valores de eficiencia en burst s/'ze, los fagos de esta invención son excelentes candidatos para la aplicación descrita.
[00066]. EJEMPLO 5. Estabilidad de los fagos al cloro
El efecto del cloro en la infectividad de los fagos de la presente invención cpSan23, cpSan24, cpSan25, cpSan15, fue determinada por medio de dos soluciones de hipoclorito de calcio: 1 ) comercial 2) directamente del químico puro. Cada una de las soluciones se llevó a una concentración final de 0.000975% en agua destilada estéril, la cual es usada en los bebederos de las aves de corral. La concentración inicial de la solución comercial es del 65%; mientras que la otra solución se encuentra en estado puro. Luego se procedió a poner cada uno de los fagos y el coctel en cada una de estas soluciones y se probó la viabilidad de los fagos a los 5 min, 15 min, 30 min, 1 hora, 2 horas y 24 horas. [00067]. Los resultados obtenidos muestran que todos los fagos son infectivos en cada uno de los tiempos. Los controles donde se sembró sólo el agua clorada no mostró inhibición del crecimiento de la bacteria. En la Tabla 2, el símbolo (+) representa infección de la bacteria por el fago. Los resultados fueron acompañados de una descripción de la morfología de placa del fago para cada ensayo realizado. Con la lectura de los resultados se observaron cambios en la morfología de placa en los diferentes tiempos.
[00068]. Los resultados muestran que cada uno de los bacteriófagos es infectivo hasta las 24 horas evaluadas en 2 muestras diferentes de agua clorada (una comercial y otra química). El coctel de fagos mostró tener una morfología de placa constante a los largo del tiempo, con placas claras, sin crecimiento interno, a diferencia de los fagos individuales. Tabla 2. Resultados prueba estabilidad en cloro
I Tiempo del fago en el agua clorada
Fago 5 mirt 15 min 30 min 1 hora 2 horas 24 horas cpSan23 + + + + + + cpSan24 + + + + + + cpSan25 + + + + + + cpSan15 + + + + + +
Coctel + + + + + +

Claims

REIVINDICACIONES
Una composición de bacteriófagos para la prevención, eliminación y/o reducción de infecciones y contaminaciones causadas por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, caracterizada porque comprende fagos y excipientes, en donde se seleccionan entre 1 y 6 fagos del conjunto cpSan13 de SEQ ID NO: 13, cpSan14 de SEQ ID NO: 14, cpSan15 de SEQ ID NO: 15, cpSan23 de SEQ ID NO: 23, cpSan24 de SEQ ID NO: 24 , y cpSan25 de SEQ ID NO: 25.
La composición de fagos de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la composición comprende entre 2 y 6 fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
La composición de fagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende entre
3 y 6 fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
La composición de fagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende entre
4 y 6 fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
La composición de fagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende 6 fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
La composición de fagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición comprende fagos adicionales pertenecientes al orden Caudovirales.
7. La composición de fagos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde la composición comprende únicamente fagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25. 8. La composición de fagos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en donde el tamaño de los genomas de los fagos varían entre 30 y 180 kb.
9. La composición de fagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada uno de los fagos se encuentra en igual proporción.
10. La composición de fagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada el genoma de los fagos se encuentra libre de genes de toxicidad y virulencia.
11. La composición de fagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la eficiencia in vitro del coctel de bacteriófagos disminuye la población bacteriana de Salmonella entre 3,33 y 4,62 Iog10 ufc/ml durante las 10 horas de exposición al coctel.
12. La composición de bacteriófagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los fagos que componen la composición infectan mínimo el 50% de las cepas evaluadas con una eficiencia de plaqueo (EOP) mayor o igual a 1 .
13. La composición de bacteriófagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones, caracterizada porque el excipiente es seleccionado de un solvente o buffer. 14. La composición de bacteriófagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde su administración esde forma líquida, spray o sólida.
15. La composición de bacteriófagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende una composición de bacteriófagos, seleccionada del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25, en una dosis de 107- 109UFP/ml_
16. Uso de la composición de bacteriófagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para el control de Salmonella
Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, en superficies, instalaciones, equipos y maquinaria que se encuentran en granjas para animales, en especial granjas avícolas.
17. Uso de la composición de bacteriófagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para el control y/o eliminación de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, en animales de granja, aves de corral, huevos y alimentos procesados y sus empaques.
18. Uso de la composición de bacteriófagos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la prevención de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Paratyphi B, en animales de granja, aves de corral, huevos y alimentos procesados y sus empaques.
19. Uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la manufactura de suplementos alimenticios líquidos o sólidos y desinfectantes.
20.Suplemento alimenticio que comprende una composición de bacteriófagos que comprende entre uno y seis bacteriófagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
21. Desinfectante que comprende una composición de bacteriófagos que comprende entre uno y seis bacteriófagos seleccionados del conjunto cpSan13, cpSan14, cpSan15, cpSan23, cpSan24, y cpSan25.
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