WO2017072378A1 - Procedimiento para la descelularización de órganos y tejidos biológicos - Google Patents

Procedimiento para la descelularización de órganos y tejidos biológicos Download PDF

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WO2017072378A1
WO2017072378A1 PCT/ES2016/070715 ES2016070715W WO2017072378A1 WO 2017072378 A1 WO2017072378 A1 WO 2017072378A1 ES 2016070715 W ES2016070715 W ES 2016070715W WO 2017072378 A1 WO2017072378 A1 WO 2017072378A1
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tissue
organ
nerve
peripheral nerve
prosthesis
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PCT/ES2016/070715
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Inventor
Manuel José GAYOSO RODRÍGUEZ
Original Assignee
Universidad De Valladolid
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/60—Salicylic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to the use of methyl salicylate for the decellularization of organs and / or tissues, preferably of nervous tissue.
  • the tissues and organs obtained by such use are useful for the regeneration of tissues and / or organs. Therefore the present invention can be framed in the field of medicine.
  • Decellularization involves the removal of cells from an organ or tissue, trying to maintain the highest possible integrity of the remaining extracellular matrix, to generally use this matrix as a support or scaffold for repair or, if possible, the replacement of injured tissues or organs. Decellularization is carried out by destroying the cells and suppressing cell debris. The elimination of cells and their remains leads to the disappearance of antigens that produce both inflammatory and immune reactions, while the components of the extracellular matrix are proteins whose structure is very similar in different individuals of the same species and even among individuals of different species because they are proteins that are phylogenetically very conserved that do not usually produce inflammatory or immune reactions, which will replace the damaged tissue or organ (Constantinou and Jiménez. 1991. Matrix 11: 1-9).
  • the extracellular matrix once decellularized can serve as scaffolding or support for subsequent recelularization with the cells of the recipient or other immunocompatibles that will not produce immune rejection.
  • Decellularization and recelularization are being carried out in numerous organs and tissues, such as: heart valves, tendon, ligaments, blood vessels, urinary bladder, liver, kidney, lung, skeletal muscle, skin and nerves. (Gilbert et al. 2006. Biomaterials 27; 3675-3683; Isaac Perea-Gil et al. 2015. Am J Trans ⁇ Res; 558-573; Ott et al. 2008. Nat Med; 14: 213-221).
  • Decellularization generally begins with the physical destruction of cells. After destroying the cells, cell debris is usually removed with Enzymatic or detergent treatments that disorganize cell membranes and facilitate the removal of debris while trying to preserve, as far as possible, the structure and functions of the extracellular matrix.
  • the peripheral nerve has the ability to regenerate its nerve fibers after a section in favorable conditions. That is, if a nerve is sectioned for trauma, surgical resection of a tumor or other cause if the conditions are favorable, it can regenerate its nerve fibers and restore its functions. The most favorable circumstances are a clean section of the nerve without separation of the proximal and distal ends of the section. This ideal situation is not usually frequent and the proximal and distal ends tend to be more or less separated.
  • the tension prevents the regeneration of the nerve fibers, so it is necessary to interpose a material as a bridge between the ends of the sectioned nerve.
  • the most effective so far is the autologous nerve implant, that is, a generally sensory nerve of the individual is sacrificed to recover a motor nerve.
  • This method has as main drawbacks the morbidity caused and the shortage of the material available for the implant.
  • different alternatives have been studied, such as the allogeneic implant but it needs immunosuppression, as well as the construction of biocompatible implants, whether biological, such as collagen tubes or biomaterials such as lactic acid, caprolactone or glycolic acid polymers.
  • His method begins with an osmotic shock with distilled water and uses amphoteric (sulfobetaine 10 and sulfobetaine 16) and anionic (Triton TM X-200) detergents to remove cell debris.
  • amphoteric sulfobetaine 10 and sulfobetaine 16
  • anionic Triton TM X-200
  • AVANCE® The only implant obtained from human allogeneic nerve and commercially available is AVANCE®.
  • This prosthesis comes from human donors and after freezing and thawing the nerve segment is decellularized with detergents and with CSPG (chondroitin sulfate proteoglycan) chondroitinase (Muir. 2010. Experimental Neurology 23; 102-1 11) .
  • the CSPG consists of a Protein nucleus and a variable number of glycosaminoglycans such as chondroitin sulfate.
  • the present invention demonstrates the use of methyl salicylate for the decellularization of organs and tissues.
  • the decellularization of the peripheral nerve is described but such use can be extended to other tissues or organs, such as for example peripheral nerve, central nervous system tract, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter and urethra.
  • the method described here does not use any type of detergent, but it is methyl salicylate the agent that performs the decellularization. This fact allows, with similar results in terms of regeneration, these prostheses have physical qualities more suitable for surgical use since they have more consistency and stiffness than other prostheses obtained with other methods.
  • Methyl salicylate also called methyl ester 2-hydroxybenzoic or methyl 2- hydroxybenzoate
  • C 8 H 8 0 3 is known to the expert by CAS number 119-36-8.
  • the structural formula of methyl salicylate is as follows:
  • methyl salicylate 100% has been used, however, it is possible to use it diluted, for example in absolute alcohol, at a lower concentration provided that it retains its decellularizing properties, so that methyl salicylate could be used for example at 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99 or 100%.
  • Methyl salicylate can be of natural origin, for example of plant origin (for example of plants of the genus Gaultheria, for example Gaultheria procumbens; or of the genus Betula) or obtained by chemical synthesis, for example obtained by reaction of salicylic acid with methanol
  • the present invention also relates to salts of methyl salicylate or its derivatives that can be generated by chemical methods known to the person skilled in the art, for example, by a reaction with an acid in water or in an organic solvent or in A mixture of both.
  • organic solvent ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile can be used.
  • the acid addition salts include mineral acid addition salts such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, iohydrate, sulfate, nitrate, phosphate, and organic acid addition salts such as, for example, acetate, maleate.
  • Salt preparation can be carried out by methods known in the state of the art.
  • Methyl salicylate has been used in the state of the art as an active ingredient in analgesic, anti-rheumatic, sunscreen creams and ointments and as a transparent histological and anatomical sections (that is, for the improvement of the visualization of cells, nuclei and cell cytoplasms ).
  • the present invention relates to a method of decellularization for organs and tissues that eliminates cells and cell debris while respecting the extracellular matrix.
  • the procedure consists in the rupture of the cells by osmotic shock, preferably by immersion in distilled or purified water.
  • osmotic shock preferably by immersion in distilled or purified water.
  • a dehydration is continued in alcohols of increasing concentration and from the absolute alcohol it is passed to methyl salicylate to extract the remains cell phones.
  • it is washed in absolute alcohol and hydrated in decreasing alcohols to water, for example, deionized, distilled or purified water, preferably deionized.
  • DNase can be used to remove, if any, excessive remains of nuclear material.
  • the process can be repeated until returning to the water from where the pieces can be passed to a physiological liquid and used as a support for recelularization or put them in a suitable medium and keep them until they are used. For example, if the prosthesis obtained is not going to be used at that time, after immersion in a freezing buffer and a slow decrease in temperature (for example -1 ° C / min), it can be kept frozen.
  • a freezing buffer and a slow decrease in temperature for example -1 ° C / min
  • the prosthesis can be recelularized "in vitro" with the desired cell type.
  • tissues and / or decellularized organs can be recelularized "in vitro" with the desired cell type.
  • desired cell type For example, with Schwann cells, bone marrow mesenchymal stem cells, adipose tissue mesenchymal stem cells, etc.
  • the present invention relates to the use of methyl salicylate for decellularization of tissues and / or organs.
  • the tissue is selected from the list consisting of: nerve tissue, nerves and nervous tracts, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter and urethra.
  • nerve tissue is nerve tissue, where the nerve tissue is a nerve, more preferably it is a peripheral nerve, more preferably a mixed peripheral nerve.
  • the use is an in vitro or ex vivo use.
  • reconstruction is used as a synonym for reconstruction, that is, for total or partial repair of the structure and / or functionality of a tissue and / or organ.
  • in vitro refers to the use being made outside the subject's body. That is, it is performed on a biological sample of a subject.
  • biological sample in the present invention refers to any sample comprising cells, tissues and / or organs of an individual, obtained by Any method known to a person skilled in the art that serves this purpose.
  • the biological sample in the present invention can be fresh or frozen.
  • ex vivo refers to the method of the invention being performed outside the subject's body under conditions similar to those found in tissue and / or organ within the subject's body.
  • the use is an in vivo use.
  • the tissues and / or organs described in the present invention may be whole tissues and / or organs or fragments thereof of any size.
  • the tissue and / or organ is isolated.
  • they are mammalian. Suitable mammals include humans, primates, dogs, cats, rodents (eg mice, rats), cows, horses, pigs, rabbits, goats and sheep. More preferably of human origin, where the human is of any age or sex.
  • rodents eg mice, rats
  • cows horses
  • pigs rabbits, goats and sheep.
  • More preferably of human origin where the human is of any age or sex.
  • they are of autologous, allogeneic, xenogenic (heterologous) origin.
  • the tissues or organs are obtained from post mortem individuals, preferably from organ donors.
  • Decellularization means the removal of cells as well as their fragments (for example, cell membranes, cytoplasmic and / or nuclear components), antigenic and / or inflammatory components.
  • the decellularization of organs comprises eliminating the nuclear and cellular components of an isolated organ or part of an organ, leaving an interstitial structure that has the same size and shape of the native organ.
  • the term "decellularized organ” as used herein refers to an organ or part thereof from which all the cellular and tissue content has been removed, leaving an interstitial structure (the extracellular matrix).
  • the organs are composed of various specialized tissues.
  • the specialized tissue of an organ is the parenchyma and provides the specific function associated with the organ.
  • Most organs also have a framework, the stroma, composed of non-specialized connective tissue that supports the parenchyma.
  • the decellularization procedure eliminates the parenchyma, leaving the three-dimensional interstitial structure of connective tissue, composed mainly of collagen.
  • the interstitial structure has the same shape and size as the native organ, providing the support framework that allows cells to join and grow on it.
  • Decellularized organs can be rigid or semi-rigid, presenting the ability to alter their shape.
  • decellularized organs include, but are not limited to, peripheral nerve, nervous tract, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter and urethra.
  • decellularized tissue is understood as that tissue to which the entire cellular content has been removed leaving the interstitial structure, ie the extracellular matrix.
  • tissues in the present invention we also refer to parts thereof.
  • isolated organ or tissue refers to an organ that has been removed from an individual, preferably a mammal.
  • Suitable mammals include humans, primates, dogs, cats, rodents (for example, mice, rats), cows, horses, pigs, rabbits, goats and sheep.
  • the term "isolated organ” also includes an organ removed from a subject that needs an artificially reconstructed organ. Suitable organs may be any organ or part of the organ required for implantation in a subject. Examples include, but are not limited to, peripheral nerve, nervous system tract, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, ureter and urethra.
  • An organ or part of an organ can be isolated from the subject that requires an artificial reconstructed organ.
  • a diseased organ of a subject can be removed and decellularized, provided that the disease affects the parenchyma of the organ, but does not harm the connective tissue, for example by tissue necrosis.
  • the diseased organ can be removed from the subject and decellularized.
  • the decellularized organ, or part of the organ can be used as a three-dimensional scaffolding to reconstruct an artificial organ.
  • An autologous artificial organ can be reconstructed using the subject's own decellularized organ as scaffolding and recelularizing it with a population of cells derived from the subject's own tissues.
  • cell populations derived from the skin, bone marrow, adipose tissue, liver, pancreas, arteries, veins, umbilical cord and placental tissues of the subject If the cells are not autologous they cause their immunological rejection, unless an immunosuppressive treatment is established.
  • An allogeneic artificial organ can be reconstructed using as scaffolding, the decellularized organ of another individual of the same species and recelularizing it with populations of cells derived from the subject itself.
  • the scaffolding would be allogeneic and autologous cells.
  • different populations of cells can be derived from mammals such as primates, dogs, cats, rodents (eg mice, rats), cows, horses, pigs, rabbits, goats and sheep.
  • the recelularization would be performed with populations of cells derived from the subject himself, in this case the xenogeneic (heterologous) prosthesis and autologous cells would be considered.
  • Standard procedures for the isolation of a target organ are well known to those skilled in the art and can be used to isolate the organ.
  • An organ, or part of an organ can also be derived from a human corpse or from mammalian species other than the subject, such as organs from primates, dogs, cats, rodents (eg mice, rats), cows, horses, rabbits , pigs, goats and sheep. Standard procedures for the isolation of a target organ are well known to those skilled in the art and can be used to isolate the organ.
  • the present invention relates to a method for decellularizing a tissue or an in vitro organ comprising the following steps: a. rupture of the cells of an organ or tissue;
  • the present invention relates to a method for decellularizing a tissue or an organ comprising the following steps:
  • step (a) is performed in the lifeless body of a subject.
  • at least one of the steps is performed by perfusion.
  • tissues and / or organs obtained from a "lifeless subject" are obtained from corpses from medical-legal autopsies and from deceased organ donors, all obtained according to current legislation.
  • tissues and / or organs from a "lifeless subject" can be obtained at the time of death or after hours or days after it.
  • tissues and / or organ fragments in the present invention can also come from biopsies of living organisms.
  • steps (a) to (e); that is, (a), (b), (c), (d) and (e); they are performed more than once, preferably twice.
  • step (d) is performed at least three times, for at least 12 hours one of the washes.
  • methyl salicylate is extracted.
  • the tissue is selected from the list consisting of: peripheral nerve, central nervous system tract, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder , ureter and urethra.
  • the peripheral nerve is a mixed peripheral nerve.
  • the term "subject” refers to a mammal, preferably primate, more preferably to a human, where the human is of any age or sex.
  • the individual can also be a dog, cat, rodent (for example, mouse, rat), rabbit, cow, horse, pig, goat and sheep.
  • the cell rupture is performed by osmotic shock, sonication or by freezing and thawing.
  • the osmotic shock is performed by immersion (or perfusion) in a hypotonic solution, distilled water, double distilled water or purified water, preferably in distilled water.
  • Sonication procedures include, but are not limited to, acoustic horns, piezoelectric crystals or any other method for producing stable sonic waves, for example with sonication probes. Sonication should be carried out at a frequency that selectively removes cell membranes and / or cellular material without destroying the interstitial structure.
  • the sonication frequencies that are appropriate will depend on the size and type of isolated organ that is decellularized. Typical sonication frequencies are between 40 kHz and 50 kHz. However, it is foreseeable that a wide range of frequencies, from the subauditive to the ultrasonic (between approximately 7 Hz and 40 MHz, preferably between 7 Hz and 20 MHz), will provide a sonically increased dissociation of the tissues. Variations in the type of sonication are also contemplated in the invention and include pulsating versus continuous sonication.
  • the power levels of the sonication source are between 10-4 and approximately 10 watts / cm 2 .
  • the method further comprises after step (e) the use of nuclease or (DNase) on the hydrated organ or tissue (ie, in a step (f)) .
  • the method further comprises a step (g) where the decellularized organ or tissue is introduced into a liquid selected from the group consisting of distilled water, double distilled water, purified water, alcohol (of any gradation), physiological buffer and culture medium. Preferably it is in distilled water. Subsequently it can be introduced into another liquid from those selected above.
  • At least one of the above mentioned steps is carried out under stirring (to improve the diffusion of the liquids).
  • the mechanical stirring process involves the use of a mechanical stirring plate (for example an orbital motion plate).
  • the isolated organ or tissue, or part thereof is introduced into a container (sealed or not) with an adequate volume of fluid and stirred on the plate at a suitable speed.
  • the proper speed to agitate the isolated organ will depend on its size. For example, a rotation speed between about 50 revolutions per minute (r.p.m.) and about 150 r.p.m.
  • a large organ will require faster speed compared to a smaller organ, as is known to the person skilled in the art.
  • the volume of fluid into which the isolated organ is introduced and the time it remains in it will also depend on the size of the isolated organ, as is known by the person skilled in the art.
  • any of the steps (a), (b), (c), (d) (e) or (f) can be performed at least twice.
  • steps (a) to (e) are carried out at least twice.
  • the times and volumes of solutions in which the tissue and / or organ are submerged or perfused will vary depending on the size thereof.
  • the osmotic shock will be used, by immersing the piece in distilled or purified water for at least 24 hours. Water will be changed at least three times, preferably four times.
  • the volume of the immersion liquids will be at least 20 times the volume of the piece and the times will depend on the size of the pieces that are processed, as is known by the person skilled in the art.
  • step (b) dehydration is carried out in alcohols of increasing concentration, preferably alcohols of 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%, more preferably 70, 96 and 100% (absolute alcohol). More preferably the pieces the tissue or organ to be decellularized at each concentration of alcohol is maintained for at least 30 min and at least three changes are made.
  • step (c) immersion in methyl salicylate or contact with methyl salicylate is made with at least three changes in said liquid, preferably in the last of which It will remain for about 6-24 hours, preferably 18-22 hours.
  • step (e) the hydration is carried out in alcohols of decreasing concentration preferably 100, 99, 98, 97 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89 , 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71 or 70%, more preferably OO, 96 and 70%.
  • concentration of alcohol preferably 100, 99, 98, 97 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89 , 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71 or 70%, more preferably OO, 96 and 70%.
  • 30 min will be maintained and at least three changes will be made.
  • the last step is to distilled water (ie after the last concentration of alcohol used), preferably with at least three changes of between 15-45 minutes, more preferably 30 min.
  • tissue and / or organ can be maintained before step (a) and / or after step (e) in a suitable cell culture medium, for example, depending on the tissue and / or organ the most suitable one will be used as the person skilled in the art knows, for example, but not limited to, RPMI 1640, Fisher's medium, Iscove's medium, McCoy's medium, Dulbecco's medium and the like.
  • the methods of the invention may further comprise drying or freezing of the decellulated organ or tissue.
  • the dried or frozen decellulated organ or tissue can be stored at a suitable temperature or equilibrated in a balancing fluid prior to use.
  • Balancing of the decellulated organ takes place in a balancing fluid.
  • equilibration fluid include, but are not limited to, distilled water, alcohol (of any gradation), physiological buffer and culture medium (for example, but not limited to, RPMI 1640, Fisher's medium, medium from Iscove, half from McCoy, half from Dulbecco and the like.)
  • Drying procedures of the decellulated organ or tissue include freeze drying or lyophilization of the organ to remove residual fluid.
  • the lyophilized decellulated organ or tissue can be stored at a suitable temperature until its use is required.
  • a fourth aspect of the invention relates to decellulated tissue or organ (or fragments thereof) according to the method described in the second or third aspect of the present invention.
  • tissue and / or organ of the invention or “the tissue and / or organ decellulated of the invention”.
  • tissue or organ of the invention is also called “scaffolding", “three-dimensional scaffolding”, “three-dimensional structure”, “prosthesis” or “graft”.
  • the tissue and / or organ grafts (or parts thereof) of the present invention provide a natural tissue and / or substitute organ and retain the biological properties for the promotion of cell regeneration through the graft.
  • the native structure of the extracellular matrix is conserved, in particular, in the case of Nerve grafts, the basal lamina and endoneurium retain their natural and original structure, thus the scaffolding of the invention promotes the regeneration of axons and Schwann cells guiding them towards the distal nerve.
  • the decellularized tissues and organs of the invention are immunologically tolerated.
  • the decellularized tissues and organs of the invention can be part of a suture, a tube, a sheet or a scaffold for proper positioning in the subject's body.
  • the tissue and / or organ can be frozen before decellularization and subsequently stored until later use.
  • the tissue is selected from the list consisting of: peripheral nerve, nervous system tract, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter and urethra.
  • the peripheral nerve is a mixed peripheral nerve.
  • the tissue and / or decellularized organ of the fourth aspect of the invention can also comprise a growth factor.
  • the growth factor is selected from the list consisting of: nerve, epidermal, endothelial, fibroblastic, insulin-like growth factors, brain-derived neurotrophic factor, neuregulins and neurotrophins.
  • Neurotrophins promote survival and functionality of the nerve or glia cells. They include a factor that participates in neuronal differentiation, induces neural proliferation, influences synaptic function and / or promotes neuronal survival. Examples of neurotrophins are: ciliary neurotrophic factor (CNTF), nerve growth factor (NGF), FGF, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), glia derived neurotrophic factor (GDNF), NT-4 , NT-5, NT-6, NT-7, Purpurin and the like. Other factors that have neurotrophic activities although not classified as neurotrophins would be contemplated in the present invention.
  • these "neurotrophin-like factors” would include epidermal growth factor (EGF), heparin-binding neurite-promoting factor (HBNF), insulin-like growth factor 2 (IGF-2), fibroblastic growth factor (a-FGF and b-FGF), platelet derived growth factor (PDGF), NSE, and activin A.
  • EGF epidermal growth factor
  • HBNF heparin-binding neurite-promoting factor
  • IGF-2 insulin-like growth factor 2
  • a-FGF and b-FGF fibroblastic growth factor
  • PDGF platelet derived growth factor
  • activin A activin A
  • the tissue and / or decellularized organ of the fourth aspect of the invention can also comprise cytokines and / or hormones.
  • cytokines and / or hormones for example, but not limited to, growth hormone, erythropoietin, thrombopoietin, interleukin 3, interleukin 6, interleukin 7, macrophage colony stimulating factor, c-kit ligand stem cell factor, osteoprotegerin ligand, insulin, growth factors similar to insulin, fibroblast growth factor, nerve growth factor, ciliary neurotrophic factor, platelet-derived growth factor and bone morphogenetic protein.
  • the tissue and / or decellularized organ of the fourth aspect of the invention can also comprise materials or substances that favor its implantation.
  • it can comprise phorbol ester phorbol myristate acOUSe (PMA) for the reduction of the immune response mediated by CD4 + T cells.
  • PMA phorbol ester phorbol myristate acOUSe
  • the tissue and / or decellularized organ of the fourth aspect of the invention can also comprise an antibiotic and / or an immunosuppressant.
  • tissue and / or decellularized organ of the fourth aspect of the invention can also comprise at least one preservative.
  • Preservative means that substance that maintains the properties of the drug by inhibiting germ contamination, can be ionic or non-ionic preservative.
  • the preservative used will not be toxic, will be chemically stable, and compatible with the tissue and / or organ.
  • preservatives those known in the state of the art can be used, for example, the preservative may refer to ethyl alcohol, benzoic acid, sodium benzoate, ascorbic acid, potassium sorbate, methylparaben, ethylparaben or butylparaben.
  • "Germs" means any cell that can grow and multiply in the composition of the invention, for example bacteria, fungi or yeasts.
  • composition further comprises an antioxidant.
  • antioxidant refers to that substance that is capable of retarding or preventing oxidation.
  • antioxidant agents those known in the state of the art can be used, for example tocopherol, ascorbic acid, sodium ascorbate, tartaric acid, butylhydroxyanisole, citric acid, vitamin A or vitamin E.
  • the tissue and / or decellularized organ produced by the methods of the invention can be used as three-dimensional scaffolding to reconstruct an artificial organ.
  • autologous cell populations can be used to avoid immunosuppressive treatment, but both allogeneic and xenogenic cell populations can also be used.
  • the procedures for the isolation and culture of cells used to reconstruct an organ are known to the person skilled in the art.
  • Cells can be isolated using techniques known to those skilled in the art.
  • the tissue or organ can be broken down mechanically and / or treated with digestive enzymes and / or with chelating agents that weaken the connections between neighboring cells, making it possible to disperse the tissue in a suspension of individual cells without appreciable levels of cell breakage.
  • Enzymatic dissociation can be achieved by crushing the tissue and treating the crushed tissue with any of several digestive enzymes, either alone or in combination. These include, but are not limited to, trypsin, chymotrypsin, collagenase, elastase and / or hyaluronidase, DNase, pronase and dispase. Mechanical rupture can also be achieved by various procedures, including, but not limited to, scraping the surface of the organ, the use of crushers, mixers, sieves, homogenizers, pressure cells or sonicators, among others.
  • Preferred cell types include, but are not limited to, mesenchymal stem cells from bone marrow or adipose tissue, nerve cells, choroid, renal, urothelial cells, adipose tissue cells, skeletal or smooth muscle, myocytes ( muscle stem cells), fibroblasts, chondrocytes, adipocytes, myofibroblasts and ectodermal cells, including ductile and skin cells, hepatocytes, islet cells, cells present in the intestine and other parenchymatous cells, osteoblasts and other bone or cartilage forming cells .
  • Isolated cells can be cultured in vitro in order to increase the number of cells available for infusion in three-dimensional scaffolding.
  • the subject can be treated with immunosuppressive agents such as cyclosporine or FK506, in order to reduce the likelihood of rejection.
  • immunosuppressive agents such as cyclosporine or FK506, in order to reduce the likelihood of rejection.
  • the invention also relates to the use of a tissue and / or a decellularized organ as a three-dimensional scaffolding to reconstruct an organ.
  • the interstitial structure of connective tissue is preserved through the use of a decellularized organ. This allows the populations of cells of the patient to whom the scaffolding or cells grown in vitro in the scaffold or perfused are administered to join the three-dimensional scaffolding.
  • the conservation of a three-dimensional interstitial structure equal to the organ in vivo creates the optimal environment for cell-cell interactions and for the development and differentiation of cell populations. Therefore, a fifth aspect of the invention relates to the use of decellularized tissue or organ of the fourth aspect of the invention as a prosthesis, that is, for the preparation of a prosthesis. Preferably an implantable prosthesis.
  • prostheses are understood as tissues and / or organs that replace damaged tissue and / or organs and that fulfill their same function.
  • a sixth aspect of the invention relates to the prosthesis comprising the decellularized tissue or organ of the fourth aspect of the invention.
  • the prosthesis is selected from the list consisting of: peripheral nerve prosthesis, nervous system tract, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter and urethra.
  • the prosthesis is mixed peripheral nerve.
  • the present invention also relates to the use of the prosthesis of the sixth aspect of the invention for the regeneration of tissues and / or organs.
  • the regeneration of peripheral nerve, nervous system tract, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter or urethra is more preferably the peripheral nerve is mixed peripheral nerve.
  • a seventh aspect of the invention relates to a composition comprising the tissue and / or organ of the fourth aspect of the invention.
  • the composition further comprises at least one growth factor.
  • the growth factor is selected from the list consisting of: nerve, epidermal, endothelial, fibroblastic, insulin-like growth factors, brain-derived neurotrophic factor, neuregulins and neurotrophins (for example: ciliary neurotrophic factor (CNTF), nerve growth factor (NGF), FGF, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), glia derived neurotrophic factor (GDNF), NT-4, NT-5, NT-6, NT-7 Purpurin and the like, Other factors that have neurotrophic activities even if they are not classified as neurotrophins would be contemplated in the present invention, for example, among these "neurotrophin-like factors” would be included epidermal growth factor (EGF), heparin-binding neurite- promoting factor (HBNF), insulin-like growth factor 2 (IGF-2), fibroblastic growth factor (a- FGF and b-FGF), platelet derived growth factor (PDGF), NSE, and activin A
  • composition of the seventh aspect of the invention may further comprise cytokines and / or hormones.
  • cytokines for example, but not limited to, growth hormone, erythropoietin, thrombopoietin, interleukin 3, interleukin 6, interleukin 7, macrophage colony stimulating factor, c-kit ligand stem cell factor, osteoprotegerin ligand, insulin, growth factors similar to insulin, fibroblast growth factor, nerve growth factor, ciliary neurotrophic factor, platelet-derived growth factor and bone morphogenetic protein.
  • composition of the seventh aspect of the invention may further comprise an antibiotic, a cytokine and / or in immunosuppressant.
  • An eighth aspect of the present invention relates to the use of the composition of the seventh aspect of the invention for the manufacture of a medicament. Therefore the present invention also relates to the composition of the seventh aspect of the invention for use as a medicament.
  • pharmaceutical composition refers to any substance used for relief, treatment or cure of diseases in humans or animals.
  • pharmaceutical composition of the The invention can be used both alone and in combination with other pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical composition or medicament is characterized by comprising the composition of the seventh aspect of the invention in a therapeutically active amount.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of tissue and / or organ or fragments thereof calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, by the characteristics of the tissues, the route, form and frequency of administration thereof, and other factors, including the age, condition of the patient, as well as the severity of the alteration or disorder.
  • vehicle like the excipient, refers to a substance that is used in the pharmaceutical composition or medicament to dilute any of the components of the present invention comprised therein to a certain volume or weight.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other elements, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the composition.
  • the pharmacologically acceptable carrier is the diluent.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention are vehicles known to those skilled in the art.
  • said pharmaceutical composition is prepared in solid form or in aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention may be administered by any appropriate route of administration for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • the administration of the therapeutic composition provided by this invention is carried out, for example, parenterally, intra-intravenously, intravenously, orally, intraperitoneally or subcutaneously, preferably intravenously.
  • a ninth aspect of the invention relates to the use of the composition of the seventh aspect of the invention for the preparation of a medicament for the regeneration and / or repair of tissues and / or organs.
  • the tissues and / or organs to be regenerated are selected from the list consisting of: peripheral nerve, central nervous system tract, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter and urethra. More preferably the peripheral nerve is mixed peripheral nerve.
  • the present invention also relates to the composition of the seventh aspect of the invention for use in therapy, preferably in tissue repair and / or regeneration therapy.
  • the tissues and / or organs to be regenerated are selected from the list consisting of: peripheral nerve, tracts of the central nervous system, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter and urethra. More preferably it is mixed peripheral nerve.
  • the decellulated tissue or organ may be pretreated prior to its use in order to enhance the binding of cells to the decellulated organ.
  • the decellulated organ could be treated with, for example, collagens, elastic fibers, reticular fibers, glycoproteins, glycosaminoglycans (for example heparan sulfate, chondroitin-4-sulfate, chondroitin-6-sulfate, dermatan sulfate, keratin sulfate, etc. ). It can also be pretreated with mesenchymal, endothelial and / or parenchymal cells to allow better adhesion of the cells to the tissue and / or organ of the invention.
  • the prosthesis preferably implantable, can also comprise mesenchymal cells (for example mesenchymal cells of adipose tissue), endothelial or parenchymal cells for growth in the decellulated tissue or organ.
  • mesenchymal cells for example mesenchymal cells of adipose tissue
  • endothelial or parenchymal cells for growth in the decellulated tissue or organ.
  • nerve cells you can also comprise Schwann cells.
  • the present invention also relates to a method of tissue and / or organ regeneration comprising the use of methyl salicylate to decellularize an organ and / or tissue and implantation of tissue and / or decellulated organ in a subject.
  • the tissue or organ may be of the same subject to which it is to be implanted or of another individual of the same species or of another species.
  • the present invention also relates to the in vitro use of the tissue and / or organ of the fourth aspect of the invention, or of the composition of the seventh aspect of the invention, as scaffolding for the manufacture of an artificial tissue and / or organ.
  • the present invention also relates to a kit comprising the tissue and / or decellularized organ of the fourth aspect of the invention, the prosthesis of the sixth aspect of the invention or the composition of the seventh aspect of the invention.
  • the kit may also comprise one or more solutions useful for resuspending or rehydrating the tissue and / or organ of the fourth aspect of the invention, for example sterile saline or a pharmacologically acceptable buffer.
  • the kit can also comprise cells (for example mesenchymal cells, particularly mesenchymal cells of adipose tissue; endothelial or parenchymal for growth in decellularized tissue or organ or also in the case of nerves, Schwann cells) or other components useful for regeneration, for example, cytokines and / or comprise nerve, epidermal, endothelial, fibroblastic, insulin-like growth factors, brain-derived neurotrophic factor, neuregulins and neurotrophins.
  • cells for example mesenchymal cells, particularly mesenchymal cells of adipose tissue; endothelial or parenchymal for growth in decellularized tissue or organ or also in the case of nerves, Schwann cells
  • the present invention also relates to the use of the kit for the regeneration of tissues and / or organs.
  • the kit for the regeneration of peripheral nerve, nervous system tract, optic nerve, dermis, choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter or urethra.
  • the peripheral nerve is mixed peripheral nerve.
  • FIG. 1 Cross section of a normal nerve (A), an acellular prosthesis (B) and a regenerating prosthesis (C). The arrows indicate the cell nuclei.
  • the objective is the decellularization, that is, the removal of cells and cellular debris, from an organ or tissue, conserving the extracellular matrix.
  • decellularization that is, the removal of cells and cellular debris, from an organ or tissue, conserving the extracellular matrix.
  • the chemicals used were obtained, except those detailed by Sigma-Aldrich (Madrid).
  • a rat was anesthetized, with a lethal dose (0.6 ml / kg) of ketamine (Imalgene TM 1000, MERIAL LABORATORIES).
  • the osmotic shock was used, by immersing the piece in distilled or purified water for at least 24 hours. The water was changed four times. The volume of the immersion liquids was at least 20 times the volume of the piece and the times depended on the size of the pieces that were processed. 4. Dehydrated in alcohols of increasing concentration: 70, 96 and 100%. The pieces were kept at each alcohol concentration for at least 30 min and at least three changes were made. 5. It was immersed in pure methyl salicylate, with three changes, the last of which remained overnight, about 18 hours.
  • Salicylate was extracted by absolute alcohol in which at least three changes were made and remained in the last change until the next day (about 18 hours).
  • the pieces were transferred to distilled water, with three changes of 30 min. If necessary, because the DNA residues are more than 50 ng / mg dry weight, it can be treated with DNase 0.1 mg / ml and washed with distilled water.
  • the decellularized nerve segment can, after washing in a physiological solution, be implanted, for example, in a neurectomy performed in another rat.
  • the prosthesis will be recelularized by the cells of the recipient animal thus repairing the lesion caused by the neurectomy.
  • Figure 1 shows a section of the normal sciatic nerve (A), a section of decellularized prosthesis (B) and a section of the same prosthesis with regenerated nerve fibers (C). Note the absence of nuclei in the decellularized prosthesis.
  • methyl salicylate for peripheral nerve decellularization is demonstrated in the present invention but the expert can extrapolate, without undue experimentation, its use for other organs of interest, such as other nerves, dermis , choroid, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, bladder, ureter or urethra.

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de salicilato de metilo para la descelularización de órganos y/o tejidos, preferiblemente de tejido nervioso. Además también se refiere al tejido y/u órgano obtenidos mediante dicho uso y a su utilización para la elaboración de una prótesis implantable para la regeneración de tejidos y/u órganos.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA DESCELULARIZACIÓN DE ÓRGANOS Y TEJIDOS
BIOLÓGICOS
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere al uso de salicilato de metilo para la descelularización de órganos y/o tejidos, preferiblemente de tejido nervioso. Los tejidos y órganos obtenidos mediante dicho uso son útiles para la regeneración de tejidos y/u órganos. Por lo tanto la presente invención se puede encuadrar en el campo de la medicina.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La descelularización consiste en la eliminación de las células de un órgano o tejido, intentando mantener la mayor integridad posible de la matriz extracelular restante, para, generalmente, utilizar esta matriz como soporte o andamiaje para la reparación o, si fuera posible, la sustitución de tejidos u órganos lesionados. La descelularización se lleva a cabo mediante la destrucción de las células y la supresión de los deshechos celulares. La eliminación de las células y sus restos conlleva la desaparición de los antígenos que producen tanto las reacciones inflamatorias como las inmunitarias, mientras que los componentes de la matriz extracelular son proteínas cuya estructura es muy similar en diferentes individuos de la misma especie e incluso entre individuos de especies diferentes pues son proteínas que se hallan filogenéticamente muy conservadas que no suelen producir reacciones inflamatorias ni inmunitarias, que sustituirán al tejido u órgano dañado (Constantinou y Jiménez. 1991. Matrix 11 :1-9). La matriz extracelular una vez descelularizada puede servir de andamiaje o soporte para una posterior recelularización con las células del receptor u otras inmunocompatibles que no producirán rechazo inmunológico. La descelularización y recelularización se están llevando a cabo en numerosos órganos y tejidos, tales como: válvulas cardíacas, tendón, ligamentos, vasos sanguíneos, vejiga urinaria, hígado, riñon, pulmón, músculo esquelético, piel y nervios. (Gilbert et al. 2006. Biomaterials 27; 3675-3683; Isaac Perea-Gil et al. 2015. Am J Transí Res; 558-573; Ott et al. 2008. Nat Med; 14: 213-221).
La descelularización, generalmente, comienza por la destrucción física de las células. Después de destruir las células, se suelen eliminar los restos celulares con tratamientos enzimáticos o con detergentes que desorganizan las membranas celulares y facilitan la eliminación de los restos mientras se pretende conservar, en la medida de lo posible, la estructura y funciones de la matriz extracelular. El nervio periférico tiene la capacidad de regenerar sus fibras nerviosas tras una sección en condiciones favorables. Es decir, si un nervio es seccionado por un traumatismo, resección quirúrgica de un tumor u otra causa si las condiciones son favorables, puede regenerar sus fibras nerviosas y recuperar sus funciones. Las circunstancias más favorables son una sección limpia del nervio sin separación de los cabos proximal y distal de la sección. Esta situación ideal no suelen ser frecuente y los cabos proximal y distal suelen quedar más o menos separados. En estos casos, si se intenta fraccionar de los extremos del nervio para suturarlos la tensión impide la regeneración de las fibras nerviosas, por lo que se necesita interponer un material a modo de puente entre los cabos del nervio seccionado. Lo más efectivo hasta el momento es el implante de nervio autólogo, es decir, se sacrifica un nervio generalmente sensorial del propio individuo para recuperar un nervio motor. Este método tiene como inconvenientes principales la morbilidad causada y la escasez del material disponible para el implante. Por estas razones se han estudiado diferentes alternativas como son el implante alogénico pero necesita inmunosupresión, así como la construcción de implantes biocompatibles ya sean biológicos como tubos de colágeno o de biomateriales como los polímeros del ácido láctico, de la caprolactona o del ácido glicólico.
Para el comienzo de la descelularización, la destrucción de las células, en el nervio y en otros órganos y tejidos, se han empleado métodos tales como: el choque osmótico con disoluciones hipotónicas o con agua destilada, la congelación y descongelación brusca y la sonicación (Gilbert et al. 2006. Biomaterials 27; 3675-3683). De entre los primeros estudios de descelularización en el nervio destaca el realizado por Johnson et al. 1982. (Muscle & Nerve 5; 335-344.). El objetivo principal era el estudio ultraestructural y bioquímico de la matriz extracelular del nervio. Para obtener dicha matriz libre de células, los autores utilizaron detergentes fuertes, basándose en la destrucción más o menos completa, que producen los detergentes sobre las uniones entre lípidos y proteínas. Posteriormente Sondell et al. 1998 (Brain Research, 795; 44-54) obtuvieron resultados más específicos mediante un tratamiento que combina el choque osmótico, con agua destilada, y el uso de detergentes no iónicos (Tritón™ X-100) y aniónicos (deoxicolato). La matriz extracelular obtenida de este modo parece corresponder a la lámina basal que rodea a las fibras nerviosas por lo que, según estos autores, estos tubos de lámina basal sirven como soporte o andamiaje para la regeneración, a través de su interior ahora vacío, de las prolongaciones nerviosas interrumpida. De esta forma, la lámina basal rodea a las unidades de regeneración. Hudson et al. 2004 (Tissue Engineering, 10; 1346-1358) buscaron lo que denominaron la optimización del método estudiando la acción específica de cada detergente sobre las células y la matriz extracelular. Su método comienza con un choque osmótico con agua destilada y utiliza detergentes anfóteros (sulfobetaína 10 y sulfobetaína 16) y aniónicos (Tritón™ X-200) para eliminar los restos celulares. Con prótesis de este tipo se han obtenido resultados experimentales similares a los obtenidos con implantes autólogos o isogénicos y mucho más eficaces que los obtenidos con el método de Sondell et al. 1998.
El único implante obtenido de nervio alogénico humano y comercialmente disponible, es AVANCE®. Esta prótesis procede de donantes humanos y después de congelar y descongelar el segmento de nervio se descelulariza con detergentes y con CSPG (condroitín sulfato proteoglicano) condroitinasa (Muir. 2010. Experimental Neurology 23; 102-1 11) .El CSPG está constituido por un núcleo de proteína y un número variable de glicosaminoglicanos como el condroitín sulfato. Hasta el momento actual, la descelularización de órganos y tejidos se basa, principalmente, en la acción de distintos tipos de detergentes sobre los lípidos y las proteínas de las células.
Para la regeneración de tejidos y órganos, debido a la importancia de que el andamiaje presente la forma tridimensional correcta, existe la necesidad de producir un tejido u órgano descelularizado con la misma estructura intersticial tridimensional, forma y tamaño que la del nativo. La reconstrucción de un órgano artificial utilizando un órgano descelularizado producirá de esta manera un órgano artificial que funcione tan bien como el órgano nativo debido a que conserva la misma forma, tamaño y estructura intersticial que permite que las células asuman una morfología y estructura comparables a las del órgano nativo. Además, en el caso de la regeneración de nervios motores, existe la necesidad de conseguir un nervio motor descelularizado alogénico para evitar la necesidad de sacrificar nervios sensoriales del propio individuo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se demuestra el uso de salicilato de metilo para la descelularizacion de órganos y tejidos. Como ejemplo del procedimiento de nuestra invención se describe la descelularizacion del nervio periférico pero dicho uso puede ser ampliado a otros tejidos u órganos, tales como por ejemplo nervio periférico, tracto del sistema nervioso central, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. El método aquí descrito no utiliza ningún tipo de detergente, sino que es el salicilato de metilo el agente que realiza la descelularizacion. Este hecho permite que, con resultados similares en cuanto a la regeneración, estas prótesis presentan cualidades físicas más aptas para su utilización quirúrgica ya que presentan más consistencia y rigidez que otras prótesis obtenidas con otros métodos.
El salicilato de metilo (también denominado metil éster 2-hidroxibenzoico o metil 2- hidroxibenzoato), de fórmula molecular C8H803 es conocido por el experto por el número CAS 119-36-8. La fórmula estructural del salicilato de metilo es la siguiente:
Figure imgf000005_0001
En la presente invención se ha utilizado salicilato de metilo puro (100%), sin embargo, es posible utilizarlo diluido, por ejemplo en alcohol absoluto, a menor concentración siempre que conserve sus propiedades descelularizantes, por lo que podría utilizarse por ejemplo salicilato de metilo al 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%. El salicilato de metilo puede ser de origen natural, por ejemplo de origen vegetal (por ejemplo de las plantas de género Gaultheria, por ejemplo Gaultheria procumbens; o del género Betula) u obtenido por síntesis química, por ejemplo obtenido por reacción del ácido salicílico con metanol.
La presente invención también se refiere a las sales de salicilato de metilo o de sus derivados que pueden ser generadas mediante métodos químicos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante una reacción con un ácido en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Como disolvente orgánico puede utilizarse éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Los ejemplos de las sales de adición de ácido incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato, y sales de adición de ácido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y ptoluenosulfonato. La preparación de sales puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en el estado de la técnica.
El salicilato de metilo se ha utilizado en el estado del arte como ingrediente activo en cremas y pomadas analgésicas, antirreumáticas, protectoras solares y como transparentador de secciones histológicas y anatómicas (es decir, para la mejora de la visualización de células, núcleos y citoplasmas celulares).
La presente invención se refiere a un método de descelularización para órganos y tejidos que elimina las células y restos celulares respetando la matriz extracelular. El procedimiento consiste en la ruptura de las células mediante choque osmótico, preferiblemente por inmersión en agua destilada o purificada. Al ser el salicilato hidrofóbico es necesario deshidratar las muestras antes de someterlas a la acción del salicilato de metilo, por lo tanto, se continúa con una deshidratación en alcoholes de concentración creciente y desde el alcohol absoluto se pasa a salicilato de metilo para extraer los restos celulares. Por último, se lava en alcohol absoluto y se hidrata en alcoholes decrecientes hasta agua, por ejemplo, agua desionizada, destilada o purificada, preferiblemente desionizada. Se puede utilizar DNasa para eliminar, si los hubiera, restos excesivos de material nuclear. Se puede repetir el proceso hasta volver al agua desde donde las piezas pueden pasarse a un líquido fisiológico y utilizarse como soporte para la recelularización o bien ponerlas en un medio adecuado y conservarlas hasta el momento de su utilización. Por ejemplo, si la prótesis obtenida no se va a utilizar en ese momento se puede, tras inmersión en un tampón de congelación y un descenso lento de la temperatura (por ejemplo de -1°C/min), conservar congelada.
La prótesis (tejidos y/u órganos descelularizados) puede ser recelularizada "in vitro" con el tipo célula que se desee. Por ejemplo, con células de Schwann, células madre mesenquimales de la médula ósea, células madre mesenquimales del tejido adiposo, etc.
Un experto en la materia podría introducir cambios o modificaciones en los ejemplos o realizaciones particulares de realización descritos sin salirse de esta invención.
En un primer aspecto la presente invención se refiere al uso de salicilato de metilo para descelularización de tejidos y/u órganos.
En una realización preferida del primer aspecto de la invención el tejido se selecciona de la lista que consiste en: tejido nervioso, nervios y tractos nerviosos, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. Preferiblemente es tejido nervioso, donde el tejido nerviosos es un nervio, más preferiblemente es un nervio periférico, más preferiblemente un nervio periférico mixto.
En otra realización preferida del primer aspecto de la invención el uso es un uso in vitro o ex vivo.
En la presente invención se utiliza "regeneración" como sinónimo de reconstrucción, es decir, de reparación bien total o parcial de la estructura y/o funcionalidad de un tejido y/u órgano. El término "in vitro" se refiere a que el uso se realiza fuera del cuerpo del sujeto. Es decir, se realiza en una muestra biológica de un sujeto.
El término "muestra biológica" en la presente invención se refiere a cualquier muestra que comprenda células, tejidos y/u órganos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica en la presente invención puede ser fresca o congelada.
El término "ex vivo" se refiere a que el método de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto en condiciones similares a las que se encuentra en tejido y/u órgano dentro del cuerpo del sujeto.
En otra realización preferida del primer aspecto de la invención el uso es un uso in vivo.
Los tejidos y/u órganos descritos en la presente invención pueden ser tejidos y/u órganos enteros o fragmentos de ellos de cualquier tamaño. En una realización preferida el tejido y/u órgano está aislado. En una realización preferida son de mamífero. Entre los mamíferos adecuados se incluyen el ser humano, primates, perros, gatos, roedores (por ejemplo ratones, ratas), vacas, caballos, cerdos, conejos, cabras y ovejas. Más preferiblemente de origen humano, donde el humano es de cualquier edad o sexo. En otra realización preferida son de origen autólogo, alogénico, xenogénico (heterólogo). En una realización preferida los tejidos u órganos se obtienen de individuos post mortem, preferiblemente de donantes de órganos.
Se entiende por "descelularización" la eliminación de células así como de sus fragmentos (por ejemplo, membranas celulares, componentes citoplasmáticos y/o nucleares), componentes antigénicos y/o inflamatorios. La descelularización de órganos comprende eliminar los componentes nucleares y celulares de un órgano aislado o parte de un órgano, dejando una estructura intersticial que presenta el mismo tamaño y forma del órgano nativo.
La expresión órgano descelularizado tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un órgano o parte del mismo del que se ha eliminado la totalidad del contenido celular y de tejidos, dejando una estructura intersticial (la matriz extracelular). Los órganos están compuestos de diversos tejidos especializados. El tejido especializado de un órgano es el parénquima y proporciona la función específica asociada con el órgano. La mayoría de órganos también presentan un armazón, el estroma, compuesto de tejido conectivo no especializado que da soporte al parénquima. El procedimiento de descelularización elimina el parénquima, dejando la estructura intersticial tridimensional de tejido conectivo, compuesta principalmente de colágeno. La estructura intersticial presenta la misma forma y tamaño que el órgano nativo, proporcionando el armazón de soporte que permite que las células se unan y crezcan sobre el mismo. Los órganos descelularizados pueden ser rígidos o semirrígidos, presentando la capacidad de alterar su forma. Entre los ejemplos de órganos descelularizados se incluyen, pero sin limitarse a ellos, nervio periférico, tracto nervioso, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. En la presente invención, "tejido descelularizado" se entiende como aquel tejido al que se le ha eliminado la totalidad del contenido celular dejando la estructura intersticial, es decir la matriz extracelular. Cuando nos referimos a tejidos en la presente invención, también nos referimos a partes de los mismos. La expresión órgano o tejido aislado tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un órgano que ha sido extirpado de un individuo, preferiblemente un mamífero. Entre los mamíferos adecuados se incluyen el ser humano, primates, perros, gatos, roedores (por ejemplo, ratones, ratas), vacas, caballos, cerdos, conejos, cabras y ovejas. La expresión órgano aislado también incluye un órgano extirpado de un sujeto que necesita un órgano reconstruido artificialmente. Los órganos adecuados pueden ser cualquier órgano o parte de órgano requerido para el implante en un sujeto. Entre los ejemplos se incluyen, pero sin limitarse a ellos, nervio periférico, tracto del sistema nervioso, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, uréter y uretra.
Un órgano o parte de un órgano puede aislarse del sujeto que requiere un órgano reconstruido artificial. Por ejemplo, puede extirparse un órgano enfermo de un sujeto y descelularizarlo, con la condición de que la enfermedad afecte al parénquima del órgano, pero que no perjudique al tejido conectivo, por ejemplo por necrosis del tejido. El órgano enfermo puede extirparse del sujeto y descelularizarse. El órgano descelularizado, o parte del órgano, puede utilizarse como andamiaje tridimensional para reconstruir un órgano artificial. Puede reconstruirse un órgano artificial autólogo utilizando el propio órgano descelularizado del sujeto como andamiaje y recelularizándolo con una población de células derivadas de tejidos del propio sujeto. Por ejemplo, poblaciones de células derivadas de la piel, médula ósea, tejido adiposo, hígado, páncreas, arterias, venas, cordón umbilical y tejidos placentarios del sujeto. Si las células no son autólogas provocan su rechazo inmunológico, a menos que se instaure un tratamiento inmunosupresor. Puede reconstruirse un órgano artificial alogénico utilizando como andamiaje, el órgano descelularizado de otro individuo de la misma especie y recelularizándolo con poblaciones de células derivadas del propio sujeto. En este caso, el andamiaje sería alogénico y las células autólogas. Por ejemplo, pueden derivarse diferentes poblaciones de células a partir de mamíferos tales como primates, perros, gatos, roedores (por ejemplo ratones, ratas), vacas, caballos, cerdos, conejos, cabras y ovejas. La recelularización se realizaría con poblaciones de células derivadas del propio sujeto, en este caso se consideraría la prótesis xenogénica (heteróloga) y las células autólogas. Los procedimientos estándar para el aislamiento de un órgano diana son bien conocidos por el experto en la materia y pueden utilizarse para aislar el órgano.
También puede derivarse un órgano, o parte de un órgano, de un cadáver humano o de especies de mamífero diferentes del sujeto, tales como órganos procedentes de primates, perros, gatos, roedores (por ejemplo ratones, ratas), vacas, caballos, conejos, cerdos, cabras y ovejas. Los procedimientos estándar para el aislamiento de un órgano diana son bien conocidos por el experto en la materia y pueden utilizarse para aislar el órgano.
En un segundo aspecto la presente invención se refiere a un método para descelularizar un tejido o un órgano in vitro que comprende las siguientes etapas: a. ruptura de las células de un órgano o tejido;
b. deshidratación del órgano o tejido del paso (a), con alcoholes de gradación creciente;
c. Inmersión del órgano o tejido del paso (b) en salicilato de metilo; ' d. Inmersión del órgano o tejido del paso (c) en alcohol absoluto;
e. hidratación del órgano o tejido descelularizado del paso (d) con alcoholes de gradación decreciente;
En adelante nos referiremos a él como al "método primero de la invención" o al "método primero de la presente invención". En un tercer aspecto la presente invención se refiere a un método para descelularizar un tejido o un órgano que comprende las siguientes etapas:
a. ruptura de las células de un órgano o tejido;
b. deshidratación de un órgano o tejido con alcoholes de gradación creciente; c. descelularización del órgano o tejido del paso (b) por contacto con salicilato de metilo;
d. eliminación del salicilato de metilo del paso (c) con alcohol absoluto;
e. hidratación del órgano o tejido descelularizado del paso (d) con alcoholes de gradación decreciente;
donde al menos una de las etapas se realiza en el cuerpo del sujeto sin vida.
En adelante nos referiremos a él como al "método segundo de la invención" o al "método segundo de la presente invención". En una realización preferida del método segundo de la invención la ruptura del paso (a) se realiza en el cuerpo sin vida de un sujeto. En una realización preferida al menos una de las etapas se realiza mediante perfusión.
En la presente invención los tejidos y/u órganos obtenidos de un "sujeto sin vida" son obtenidos de cadáveres procedentes de autopsias médico-legales y de donantes de órganos fallecidos, todos ellos obtenidos según la legislación vigente.
En la presente invención los tejidos y/u órganos procedentes de un "sujeto sin vida" pueden ser obtenidos en el momento del fallecimiento o tras horas o días después del mismo.
Los tejidos y/o fragmentos de órganos en la presente invención también pueden proceder de biopsias de organismos vivos.
En una realización preferida del segundo y tercer aspectos de la invención los pasos (a) a (e); es decir, (a), (b), (c), (d) y (e); se realizan más de una vez, preferiblemente dos veces.
Preferiblemente en una realización preferida del segundo y tercer aspectos de la invención el paso (d) se realiza al menos tres veces, durante al menos 12 horas uno de los lavados. En este paso se extrae el salicilato de metilo. En una realización preferida del segundo y tercer aspectos de la invención el tejido se selecciona de la lista que consiste en: nervio periférico, tracto del sistema nervioso central, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. Preferiblemente el nervio periférico es un nervio periférico mixto.
En la presente invención el término sujeto se refiere a un mamífero, preferiblemente primate, más preferiblemente a un humano, donde el humano es de cualquier edad o sexo. El individuo también puede ser un perro, gato, roedor (por ejemplo, ratón, rata), conejo, vaca, caballo, cerdo, cabra y oveja.
En una realización preferida del segundo y tercer aspecto de la invención en el paso (a) la ruptura de las células se realiza mediante choque osmótico, sonicación o por congelación y descongelación. Preferiblemente el choque osmótico se realiza mediante la inmersión (o perfusión) en una solución hipotónica, agua destilada, agua bidestilada o agua purificada, preferiblemente en agua destilada.
Procedimientos de sonicación incluyen, pero sin limitarse a ellos, cuernos acústicos, cristales piezoeléctricos o cualquier otro procedimiento para producir ondas sónicas estables, por ejemplo con sondas de sonicación. La sonicación debe llevarse a cabo a una frecuencia que elimine selectivamente las membranas celulares y/o material celular sin destruir la estructura intersticial. Las frecuencias de sonicación que resulten adecuadas dependerán del tamaño y tipo de órgano aislado que se descelulariza. Las frecuencias de sonicación típicas se encuentran comprendidas entre 40 kHz y 50 kHz. Sin embargo, es previsible que un intervalo amplio de frecuencias, desde las subauditivas hasta las ultrasónicas (entre aproximadamente 7 Hz y 40 MHz, preferentemente entre 7 Hz y 20 MHz), proporcionen una disociación incrementada sónicamente de los tejidos. Las variaciones en el tipo de sonicación también se contemplan en la invención e incluyen la sonicación pulsante frente a la continua. Los niveles de potencia de la fuente de sonicación se encuentran comprendidos entre 10-4 y aproximadamente 10 vatios/cm2.
Si es necesario, porque los restos de ácido desoxirribonucleico (ADN) sean de más de 50 ng/mg de peso seco, se puede tratar con nucleasa (fosfodiesterasa) (por ejemplo utilizar S1 Nucleasa (Thermo Scientific) que tiene actividad DNasa y RNasa) o con desoxirribonucleasa (DNasa), por ejemplo a una concentración de 0, 1 mg/ml y posterior lavado con agua destilada. Por lo que en otra realización preferida del segundo y tercer aspecto de la invención el método además comprende después del paso (e) la utilización de nucleasa o (DNasa) sobre el órgano o tejido hidratado (es decir, en un paso (f)).
En una realización más preferida del segundo y tercer aspecto de la invención el método además comprende un paso (g) donde el órgano o tejido descelularizado se introduce en un líquido seleccionado de entre el grupo que consiste en agua destilada, agua bidestilada, agua purificada, alcohol (de cualquier gradación), tampón fisiológico y medio de cultivo. Preferiblemente es en agua destilada. Posteriormente puede introducirse en otro líquido de entre los seleccionados anteriormente.
En una realización aún más preferida del segundo y tercer aspecto de la invención al menos una de las etapas anteriormente mencionadas se realiza en agitación (para mejorar la difusión de los líquidos). Preferiblemente por agitación mecánica. En una realización particular, el procedimiento de agitación mecánica implica la utilización de una placa de agitación mecánica (por ejemplo una placa de movimiento orbital). El órgano o tejido aislado, o parte del mismo, se introduce en un recipiente (sellado o no) con un volumen adecuado de fluido y se agita en la placa a una velocidad adecuada. La velocidad adecuada para agitar el órgano aislado dependerá del tamaño de éste. Por ejemplo, una velocidad de rotación comprendida entre aproximadamente 50 revoluciones por minuto (r.p.m.) y aproximadamente 150 r.p.m. Un órgano de grandes dimensiones requerirá una velocidad más rápida en comparación con un órgano más pequeño, tal y como es conocido por el experto en la materia. El volumen de fluido en el que se introduzca el órgano aislado y el tiempo que permanezca en él también dependerá del tamaño del órgano aislado, tal y como es conocido por el experto en la materia.
En el método de la invención cualquiera de las etapas (a), (b), (c), (d) (e) o (f) se pueden realizar al menos dos veces. Preferiblemente se realizan al menos dos veces las etapas (a) a (e).
Los tiempos y volúmenes de soluciones en las que se sumerge o se perfunde el tejido y/u órgano van a variar dependiendo del tamaño del mismo. En una realización preferida del segundo aspecto de la invención en el paso (a) para romper las células se utilizará el choque osmótico, mediante la inmersión de la pieza en agua destilada o purificada durante, al menos, 24 horas. Se cambiará el agua al menos tres veces, preferiblemente cuatro veces. El volumen de los líquidos de inmersión será, al menos 20 veces el volumen de la pieza y los tiempos dependerán del tamaño de las piezas que se procesen, tal y como es conocido por el experto en la materia.
En otra realización preferida del segundo o tercer aspecto de la invención en el paso (b) la deshidratación se realiza en alcoholes de concentración creciente, preferiblemente alcoholes de 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%, más preferiblemente 70, 96 y 100 % (alcohol absoluto). Más preferiblemente las piezas se mantiene el tejido o el órgano a descelularizar en cada concentración de alcohol, al menos, 30 min y se hacen, al menos, tres cambios.
En otra realización preferida del segundo o tercer aspecto de la invención en el paso (c) la inmersión en salicilato de metilo o el contacto con el salicilato de metilo se realiza con al menos tres cambios en dicho líquido, preferiblemente en el último de los cuales permanecerá durante unas 6-24 horas, preferiblemente 18-22 horas.
En otra realización preferida del segundo o tercer aspecto de la invención en el paso (e) la hidratación se realiza en alcoholes de concentración decreciente preferiblemente 100, 99, 98, 97 96, 95, 94, 93, 92, 91 , 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81 , 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71 o 70%, más preferiblementel OO, 96 y 70 %. Preferiblemente en cada concentración de alcohol se mantendrán 30 min y se harán al menos tres cambios.
En otra realización preferida del segundo o tercer aspecto de la invención en el paso (e) el último paso es a agua destilada (es decir tras la última concentración de alcohol utilizada), preferiblemente con al menos tres cambios de entre 15-45 minutos, más preferiblemente de 30 min.
En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención todos los pasos deben realizarse en agitación continua. El tejido y/u órgano se puede mantener antes del paso (a) y/o después del paso (e) en un medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, dependiendo del tejido y/u órgano se utilizará el más adecuado tal y como conoce el experto en la materia, por ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, RPMI 1640, medio de Fisher, medio de Iscove, medio de McCoy, medio de Dulbecco y similares.
Los métodos de la invención pueden comprender adicionalmente el secado o la congelación del órgano o tejido descelulanzado. El órgano o tejido descelulanzado seco o congelado puede almacenarse a temperatura adecuada o equilibrarse en un fluido de equilibración previamente a su utilización.
La equilibración del órgano descelulanzado tiene lugar en un fluido de equilibración. Entre los ejemplos de fluido de equilibración se incluyen, pero sin limitarse a ellos, agua destilada, alcohol (de cualquier gradación), tampón fisiológico y medio de cultivo (por ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, RPMI 1640, medio de Fisher, medio de Iscove, medio de McCoy, medio de Dulbecco y similares.)
Entre los procedimientos de secado del órgano o tejido descelulanzado se incluyen el secado por congelación o la liofilización del órgano para eliminar el fluido residual. El órgano o tejido descelulanzado liofilizado puede almacenarse a una temperatura adecuada hasta que se requiera su utilización.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al tejido u órgano descelulanzado (o fragmentos de los mismos) según el método descrito en el segundo o el tercer aspecto de la presente invención. En adelante nos referiremos a él como al "tejido y/u órgano de la invención" o "el tejido y/u órgano descelulanzado de la invención".
En la presente invención el tejido u órgano de la invención también se denomina "andamiaje", "andamiaje tridimensional", "estructura tridimensional", "prótesis" o "injerto".
Los injertos de tejido y/o de órganos (o partes de los mismos) de la presente invención proporcionan un tejido y/u órgano sustituto natural y conservan las propiedades biológicas para la promoción de la regeneración celular a través del injerto. La estructura nativa de la matriz extracelular se conserva, en concreto, en el caso de injertos de nervios, la lámina basal y endoneuro conservan su estructura natural y original, de esta manera el andamiaje de la invención promueve la regeneración de axones y células de Schwann guiándolos hacia el nervio distal. Los tejidos y órganos descelularizados de la invención son tolerados inmunológicamente.
Los tejidos y órganos descelularizados de la invención pueden formar parte de una sutura, de un tubo, una lámina o un andamiaje para su correcto posicionamiento en el cuerpo del sujeto.
El tejido y/u órgano puede ser congelado antes de la descelularización y posteriormente guardado hasta su posterior uso. En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención el tejido se selecciona de la lista que consiste en: nervio periférico, tracto del sistema nervioso, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. Preferiblemente el nervio periférico es un nervio periférico mixto. El tejido y/u órgano descelularizado del cuarto aspecto de la invención además puede comprender un factor de crecimiento. Preferiblemente el factor de crecimiento se seleccionan de la lista que consiste en: factores de crecimiento nervioso, epidérmico, endotelial, fibroblástico, semejante a insulina, factor neurotrófico derivado del cerebro, neuregulinas y neurotrofinas.
Las neurotrofinas (o factores neurotróficos) promueven la supervivencia y funcionalidad del nervio o células de la glía. Incluyen un factor que participa en la diferenciación neuronal, induce proliferación neural, influye en la función sináptica y/o promueve la supervivencia neuronal. Ejemplos de neurotrofinas son: ciliary neurotrophic factor (CNTF), nerve growth factor (NGF), FGF, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), glia derived neurotrophic factor (GDNF), NT-4, NT-5, NT-6, NT-7, Purpurin y similares. Otros factores que tengan actividades neurotróficas aunque no estén clasificados como neurotrofinas estarían contemplados en la presente invención. Por ejemplo entre estos "neurotrophin-like factors" se incluirían el factor de crecimiento epidérmico (EGF), heparin-binding neurite-promoting factor (HBNF), insulin-like growth factor 2 (IGF-2), fibroblastic growth factor (a-FGF y b-FGF), platelet derived growth factor (PDGF), NSE, y activina A.
El tejido y/u órgano descelularizado del cuarto aspecto de la invención además puede comprender citoquinas y/u hormonas. Por ejemplo, pero sin limitarse, la hormona del crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 7, factor estimulante de colonias de macrófagos, c-kit ligand stem cell factor, osteoprotegerin ligand, insulina, factores de crecimiento similares a la insulina, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento derivado de plaquetas y proteína morfogenética ósea.
El tejido y/u órgano descelularizado del cuarto aspecto de la invención además puede comprender materiales o sustancias que favorezcan su implantación. Por ejemplo, puede comprender phorbol ester phorbol myristate acétate (PMA) para la reducción de la respuesta inmune mediada por linfocitos T CD4+. El tejido y/u órgano descelularizado del cuarto aspecto de la invención además puede comprender un antibiótico y/o in inmunosupresor.
El tejido y/u órgano descelularizado del cuarto aspecto de la invención además puede comprender al menos un conservante.
Se entiende por conservante aquella sustancia que mantenga las propiedades del medicamento al inhibir la contaminación por gérmenes, pueden ser conservante iónico o no-iónico. El conservante empleado no será tóxico, será estable químicamente, y compatible con la el tejido y/u órgano. Como agentes conservantes pueden utilizarse los conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, el conservante puede referirse a alcohol etílico, ácido benzoico, benzoato sódico, ácido ascórbico, sorbato potásico, metilparabeno, etilparabeno o butilparabeno. Se entiende por "gérmenes" cualquier célula que pueda crecer y multiplicarse en la composición de la invención, por ejemplo bacterias, hongos o levaduras.
Otra realización preferida se refiere al uso donde la composición además comprende un antioxidante. El término "antioxidante" se refiere a aquella sustancia que es capaz de retardar o prevenir la oxidación. Como agentes antioxidante pueden utilizarse los conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo tocoferol, ácido ascórbico, ascorbato sódico, ácido tartárico, butilhidroxianisol, ácido cítrico, vitamina A o vitamina E.
El tejido y/u órgano descelularizado producido mediante los procedimientos de la invención puede utilizarse como andamiaje tridimensional para reconstruir un órgano artificial. Para la reconstrucción (o regeneración) del órgano artificial pueden utilizarse poblaciones celulares preferiblemente autólogas, para evitar un tratamiento inmunosupresor, pero también pueden utilizarse poblaciones celulares tanto alogénicas como xenogénicas. Los procedimientos para el aislamiento y cultivo de células utilizadas para reconstruir un órgano son conocidos para el experto en la materia. Las células pueden aislarse utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, el tejido u órgano puede disgregarse mecánicamente y/o tratarse con enzimas digestivos y/o con agentes quelantes que debiliten las conexiones entre células vecinas, haciendo posible dispersar el tejido en una suspensión de células individuales sin niveles apreciables de rotura celular. La disociación enzimática puede conseguirse triturando el tejido y tratando el tejido triturado con cualquiera de entre varios enzimas digestivos, sea solos o en combinación. Entre éstos se incluyen, pero sin limitarse a ellos, tripsina, quimotripsina, colagenasa, elastasa y/o hialuronidasa, DNasa, pronasa y dispasa. La ruptura mecánica también puede conseguirse mediante varios procedimientos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, raspar la superficie del órgano, la utilización de trituradores, mezcladores, tamices, homogeneizadores, celdas de presión o sonicadores, entre otros. Entre los tipos celulares preferentes se incluyen, pero sin limitarse a ellos, células madre mesenquimales de la médula ósea o del tejido adiposo, células nerviosas, células de la coroides, renales, uroteliales, células de tejido adiposo, músculo esquelético o liso, miocitos (células madre musculares), fibroblastos, condrocitos, adipocitos, miofibroblastos y células ectodérmicas, incluyendo células dúctiles y de la piel, hepatocitos, células de los islotes, células presentes en el intestino y otras células parenquimatosas, osteoblastos y otras células formadoras de hueso o cartílago. Las células aisladas pueden cultivarse in vitro con el fin de incrementar el número de células disponibles para la infusión en el andamiaje tridimensional. Si se produce una respuesta inmunológica en el sujeto tras el implante del órgano artificial reconstruido donde se hayan utilizado poblaciones celulares alogénicas o xenogénicas, el sujeto puede tratarse con agentes inmunosupresores tales como ciclosporina o FK506, con el fin de reducir la probabilidad de rechazo.
La invención se refiere también al uso de un tejido y/o un órgano descelularizado como andamiaje tridimensional para reconstruir un órgano. Mediante la utilización de un órgano descelularizado se conserva la estructura intersticial de tejido conectivo. Ello permite que las poblaciones de células del paciente al que se le administra el andamiaje o células cultivadas in vitro en el andamiaje o bien perfundidas se unan al andamiaje tridimensional. La conservación de una estructura intersticial tridimensional igual al órgano in vivo crea el ambiente óptimo para las interacciones célula-célula y para el desarrollo y diferenciación de las poblaciones de células. Por lo tanto, un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del tejido u órgano descelularizado del cuarto aspecto de la invención como prótesis, es decir, para la elaboración de una prótesis. Preferiblemente una prótesis implantable.
En la presente invención se entiende prótesis como tejido y/u órgano que reemplaza un tejido y/u órgano dañado y que cumple con su misma función.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a la prótesis que comprende el tejido u órgano descelularizado del cuarto aspecto de la invención. En una realización particular la prótesis se selecciona de la lista que consiste en: prótesis de nervio periférico, tracto del sistema nervioso, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. Preferiblemente la prótesis es de nervio periférico mixto.
La presente invención también se refiere al uso de la prótesis del sexto aspecto de la invención para la regeneración de tejidos y/u órganos. Preferiblemente para la regeneración de nervio periférico, tracto del sistema nervioso, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter o uretra. Más preferiblemente el nervio periférico es nervio periférico mixto. Un séptimo aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende el tejido y/u órgano del cuarto aspecto de la invención. Preferiblemente la composición además comprende al menos un factor de crecimiento. Más preferiblemente el factor de crecimiento se seleccionan de la lista que consiste en: factores de crecimiento nervioso, epidérmico, endotelial, fibroblástico, semejante a insulina, factor neurotrófico derivado del cerebro, neuregulinas y neurotrofinas (por ejemplo : ciliary neurotrophic factor (CNTF), nerve growth factor (NGF), FGF, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), glia derived neurotrophic factor (GDNF), NT-4, NT-5, NT-6, NT-7, Purpurin y similares, Otros factores que tengan actividades neurotróficas aunque no estén clasificados como neurotrofinas estarían contemplados en la presente invención. Por ejemplo entre estos "neurotrophin-like factors" se incluirían el factor de crecimiento epidérmico (EGF), heparin-binding neurite-promoting factor (HBNF), insulin-like growth factor 2 (IGF-2), fibroblastic growth factor (a- FGF y b-FGF), platelet derived growth factor (PDGF), NSE, y activina A.
La composición del séptimo aspecto de la invención además puede comprender citoquinas y/u hormonas. Por ejemplo, pero sin limitarse, la hormona del crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 7, factor estimulante de colonias de macrofagos, c-kit ligand stem cell factor, osteoprotegerin ligand, insulina, factores de crecimiento similares a la insulina, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento derivado de plaquetas y proteína morfogenética ósea.
La composición del séptimo aspecto de la invención además puede comprender un antibiótico, una citoquina y/o in inmunosupresor.
Un octavo aspecto de la presente invención se refiere al uso de la composición del séptimo aspecto de la invención para la elaboración de un medicamento. Por lo tanto la presente invención también se refiere a la composición del séptimo aspecto de la invención para uso como medicamento.
El término medicamento y composición farmacéutica y se utilizan en esta invención de manera indistinta. El término "composición farmacéutica" en esta memoria hace referencia a cualquier sustancia usada para alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el ser humano o en los animales. La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto sola como en combinación con otras composiciones farmacéuticas. En el contexto de la presente invención la composición farmacéutica o el medicamento se caracterizan por comprender la composición del séptimo aspecto de la invención en una cantidad terapéuticamente activa.
En la presente invención la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del tejido y/u órgano o fragmentos de los mismos calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, por las características propias de los tejidos, la ruta, forma y frecuencia de administración de los mismos, y otros factores, incluyendo la edad, estado del paciente, así como la severidad de la alteración o trastorno.
El término "vehículo", al igual que el excipiente, hace referencia a una sustancia que se emplea en la composición farmacéutica o medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la presente invención comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la composición farmacéutica de la presente invención son los vehículos conocidos por los expertos en la materia.
En otra realización particular, dicha composición farmacéutica se prepara en forma sólida o en suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable.
La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por ejemplo por vía parenteral, por vía intrarterial, por vía intravenosa, por vía oral, por vía intraperitoneal o subcutánea, preferiblemente por vía intravenosa.
La composición de la invención se puede administrar en una o en varias dosis durante la duración del tratamiento con el fin de optimizar el efecto terapéutico. Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso de la composición del séptimo aspecto de la invención para la elaboración de un medicamento para la regeneración y/o reparación de tejidos y/u órganos. Preferiblemente los tejidos y/u órganos a regenerar se seleccionan de la lista que consiste en: nervio periférico, tracto del sistema nervioso central, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. Más preferiblemente el nervio periférico es nervio periférico mixto.
Por lo tanto la presente invención también se refiere a la composición del séptimo aspecto de la invención para su uso en terapia, preferiblemente en terapia de reparación y/o regeneración de tejidos. Preferiblemente los tejidos y/u órganos a regenerar se seleccionan de la lista que consiste en: nervio periférico, tractos del sistema nervioso central, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. Más preferiblemente es nervio periférico mixto.
El tejido u órgano descelulanzado puede pretratarse previamente a su uso con el fin de potenciar la unión de células al órgano descelulanzado. Por ejemplo, podría tratarse el órgano descelulanzado con, por ejemplo, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares, glicoproteínas, glicosaminoglicanos (por ejemplo heparán sulfato, condroitín-4-sulfato, condroitín-6-sulfato, dermatán sulfato, queratín sulfato, etc.). También puede pretratarse con células mesenquimales, endoteliales y/o parenquimales para permitir una mejor adherencia de las células al tejido y/u órgano de la invención. La prótesis, preferiblemente implantable, puede también comprender células mesenquimales (por ejemplo células mesenquimales de tejido adiposo), endoteliales o parenquimales para su crecimiento en el tejido u órgano descelulanzado. En el caso de células nerviosas también puede comprender células de Schwann. La presente invención también se refiere a un método de regeneración de tejidos y/u órganos que comprende el uso de salicilato de metilo para descelularizar un órgano y/o tejido e implantación del tejido y/u órgano descelulanzado en un sujeto. El tejido o el órgano pueden ser del mismo sujeto al que se le va a implantar o de otro individuo de la misma especie o de otra especie. La presente invención también se refiere al uso in vitro del tejido y/u órgano del cuarto aspecto de la invención, o de la composición del séptimo aspecto de la invención, como andamiaje para la fabricación de un tejido y/u órgano artificial. La presente invención también se refiere a un kit que comprende el tejido y/u órgano descelularizado del cuarto aspecto de la invención, la prótesis del sexto aspecto de la invención o la composición del séptimo aspecto de la invención. El kit además puede comprender una o más soluciones útiles para resuspender o rehidratar el tejido y/u órgano del cuarto aspecto de la invención, por ejemplo solución salina estéril o un tampón farmacológicamente aceptable. Además el kit también puede comprender células (por ejemplo células mesenquimales, particularmente células mesenquimales de tejido adiposo; endoteliales o parenquimales para su crecimiento en el tejido u órgano descelularizado o también en el caso de nervios, células de Schwann) u otros componentes útiles para la regeneración, por ejemplo, citoquinas y/o comprender factores de crecimiento nervioso, epidérmico, endotelial, fibroblástico, semejante a insulina, factor neurotrófico derivado del cerebro, neuregulinas y neurotrofinas.
La presente invención también se refiere al uso del kit para la regeneración de tejidos y/u órganos. Preferiblemente para la regeneración de nervio periférico, tracto del sistema nervioso, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter o uretra. Más preferiblemente el nervio periférico es nervio periférico mixto.
En la presente invención los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente.
En la presente memoria, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras tales como "un", "una" y "el" incluyen sus correspondientes referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Sección transversal de un nervio normal (A), una prótesis acelular (B) y una prótesis en regeneración (C). Las flechas señalan los núcleos celulares.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
EJEMPLO 1 Uso del salicilato de metilo como agente descelularizador en nervio periférico
El objetivo es la descelularización, es decir, la eliminación de las células y restos celulares, de un órgano o tejido, conservando la matriz extracelular. Como ejemplo tomaremos la descelularización de un segmento de nervio. Los productos químicos utilizados se obtuvieron, excepto los que se detallan de Sigma-Aldrich (Madrid).
La pieza objeto del proceso se sometió a los siguientes pasos:
1. Se anestesió una rata, con una dosis letal (0,6 ml/kg) de ketamina (Imalgene™ 1000, MERIAL LABORATORIOS).
2. Se tomó un segmento de 1 cm de longitud de un nervio ciático.
3. Para romper las células se utilizó el choque osmótico, mediante la inmersión de la pieza en agua destilada o purificada durante, al menos, 24 horas. Se cambió el agua cuatro veces. El volumen de los líquidos de inmersión fue, al menos 20 veces el volumen de la pieza y los tiempos dependieron del tamaño de las piezas que se procesaron. 4. Se deshidrató en alcoholes de concentración creciente: 70, 96 y 100 %. Las piezas se mantuvieron en cada concentración de alcohol, al menos, 30 min y se hicieron al menos tres cambios. 5. Se sumergió en salicilato de metilo puro, con tres cambios, en el último de los cuales permaneció durante una noche, unas 18 horas.
6. Se extrajo el salicilato mediante alcohol absoluto en el que se hicieron al menos tres cambios y permaneció en el último cambio hasta el día siguiente (unas 18 horas).
7. Se hidrató en alcoholes de concentración decreciente: 100, 96 y 70 %. En cada concentración de alcohol se mantuvo durante 30 min y se realizaron tres cambios.
8. Se pasaron las piezas a agua destilada, con tres cambios de 30 min. Si es necesario, porque los restos de ADN sean de más de 50 ng/mg de peso seco, se puede tratar con DNasa 0, 1 mg/ml y lavar con agua destilada.
Todos estos pasos del 1 al 8 se realizaron en agitación continua en un agitador orbital con una frecuencia de 30 rpm.
9. Desde este punto se repitió el proceso, es decir se vuelve al paso 3.
10. Desde que se finaliza el último lavado, en agua destilada o en agua desionizada, el segmento de nervio descelularizado se puede, tras lavado en una disolución fisiológica, implantar, por ejemplo, en una neurectomía practicada en otra rata. La prótesis será recelularizada por las células del animal receptor reparando así la lesión causada por la neurectomía.
En la figura 1 se aprecia una sección del nervio ciático normal (A), una sección de prótesis descelularizada (B) y una sección de la misma prótesis con fibras nerviosas regeneradas (C). Obsérvese la ausencia de núcleos en la prótesis descelularizada.
La descripción precedente es la realizada con una prótesis implantada en nervio periférico. Si se desea descelularizar un órgano sólido como por ejemplo el pulmón, el intestino, el hígado, es necesario perfundir por la vía adecuada con los líquidos mencionados, por ejemplo: por vía aérea (pulmón), vía digestiva (intestino), vía sanguínea (hígado).
Por lo tanto, en la presente invención se demuestra la utilidad del salicilato de metilo para la descelularización de nervio periférico pero el experto puede extrapolar, sin necesidad de experimentación indebida, su uso para otros órganos de interés, como por ejemplo, otros nervios, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter o uretra.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de salicilato de metilo para la descelularización de un tejido y/o un órgano in vi tro.
2. Uso según la reivindicación 1 donde el tejido se selecciona de la lista que consiste en: nervio periférico, tracto del sistema nervioso central, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra.
3. Uso según la reivindicación 2 donde el nervio periférico es nervio periférico mixto.
4. Método para descelularizar un tejido o un órgano in vitro que comprende las siguientes etapas:
a. ruptura de las células de un órgano y/o tejido;
b. deshidratación del órgano y/o tejido del paso (a) con alcoholes de gradación creciente;
c. Inmersión del órgano o tejido del paso (b) en salicilato de metilo;
d. Inmersión del órgano o tejido del paso (c) en alcohol absoluto;
e. hidratación del órgano o tejido descelularizado del paso (d) con alcoholes de gradación decreciente.
5. Método según la reivindicación 4 donde en el paso (a) la ruptura de las células se realiza mediante choque osmótico, sonicación o por congelación y descongelación.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5 que además comprende un paso (f) donde se utiliza nucleasa o DNasa sobre el órgano o tejido hidratado del paso (e).
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 que además comprende un paso (g) donde el órgano o tejido descelularizado se introduce en un líquido seleccionado de entre el grupo que consiste en: agua destilada, agua bidestilada, agua purificada, tampón fisiológico y medio de cultivo.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 donde al menos una de las etapas se realiza en agitación.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 donde las etapas (a) a (e) se realizan al menos dos veces.
10. Método para descelularizar un tejido o un órgano en un sujeto sin vida que comprende las siguientes etapas:
a. ruptura de las células de un órgano y/o tejido en un sujeto sin vida;
b. deshidratación del órgano y/o tejido con alcoholes de gradación creciente; c. descelularización del órgano o tejido del paso (b) por contacto con salicilato de metilo;
d. eliminación del salicilato de metilo del paso (c) con alcohol absoluto;
e. hidratación del órgano o tejido descelularizado del paso (d) con alcoholes de gradación decreciente;
donde al menos una de las etapas se realiza mediante perfusión.
1 1. Método según la reivindicación 10 donde en el paso (a) la ruptura de las células se realiza mediante choque osmótico.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 que además comprende en un paso (f) la utilización de nucleasa o DNasa sobre el órgano o tejido hidratado de paso (e).
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 que además comprende un paso (g) donde se introduce el tejido y/u órgano descelularizado en un líquido seleccionado de entre el grupo que consiste en: agua destilada, agua bidestilada, agua purificada, tampón fisiológico y medio de cultivo.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 donde al menos una de las etapas se realiza en agitación.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 donde las etapas (a) a (e) se realizan al menos dos veces.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 15 donde el tejido se selecciona de la lista que consiste en: nervio periférico, tracto del sistema nervioso central, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra.
17. Método según la reivindicación 16 donde el nervio periférico es un nervio periférico mixto.
18. Tejido y/u órgano descelularizado según el método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 17.
19. Tejido y/u órgano descelularizado según la reivindicación 18 que además comprende al menos un factor de crecimiento.
20. Tejido y/u órgano descelularizado según la reivindicación 19 donde el factor de crecimiento se selecciona de la lista que consiste en: factor de crecimiento nervioso, epidérmico, endotelial, fibroblástico, semejante a insulina, factor neurotrófico derivado del cerebro, neuregulinas y neurotrofinas.
21. Uso del tejido y/u órgano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 como prótesis.
22. Uso del tejido y/u órgano descelularizado según la reivindicación 21 donde la prótesis se selecciona de la lista que consiste en: prótesis de nervio periférico, tracto del sistema nervioso central, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra.
23. Uso del tejido y/u órgano descelularizado según la reivindicación 22 donde la prótesis es una prótesis de nervio periférico mixto.
24. Prótesis que comprende el tejido y/u órgano según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.
25. Prótesis según la reivindicación 24 donde la prótesis se selecciona de la lista que consiste en: nervio periférico, tracto del sistema nervioso central, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra.
26. Prótesis según la reivindicación 25 donde la prótesis es de nervio periférico mixto.
27. Composición que comprende el tejido y/u órgano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.
28. Composición según la reivindicación 27 que además comprende al menos un factor de crecimiento.
29. Composición según la reivindicación 28 donde el factor de crecimiento se selecciona de la lista que consiste en: factor de crecimiento nervioso, epidérmico, endotelial, fibroblástico, semejante a insulina, factor neurotrófico derivado del cerebro, neuregulinas y neurotrofinas.
30. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29 para la elaboración de un medicamento.
31. Uso según la reivindicación 30 para la elaboración de un medicamento para la regeneración de tejidos y/u órganos.
32. Uso según la reivindicación 31 donde los tejidos y/u órganos a regenerar se seleccionan de la lista que consiste en: nervio periférico, tracto del sistema nervioso central, nervio óptico, dermis, coroides, corazón, riñon, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra.
33. Uso según la reivindicación 32 donde el nervio periférico es nervio periférico mixto.
34. Uso in vitro del tejido y/u órgano según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 como andamiaje para la fabricación de un tejido y/u órgano artificial.
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