WO2017065239A1 - 炎症及び過剰免疫を抑制する装置、並びに炎症及び過剰免疫を抑制するための方法 - Google Patents

炎症及び過剰免疫を抑制する装置、並びに炎症及び過剰免疫を抑制するための方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2017065239A1
WO2017065239A1 PCT/JP2016/080443 JP2016080443W WO2017065239A1 WO 2017065239 A1 WO2017065239 A1 WO 2017065239A1 JP 2016080443 W JP2016080443 W JP 2016080443W WO 2017065239 A1 WO2017065239 A1 WO 2017065239A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
inflammation
pulse
production
direct current
current
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/080443
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
甲斐　広文
剛 首藤
メリー アン ソテン スイコ
栄一 荒木
龍也 近藤
Original Assignee
国立大学法人熊本大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人熊本大学 filed Critical 国立大学法人熊本大学
Priority to US15/768,253 priority Critical patent/US11135425B2/en
Priority to EP16855492.1A priority patent/EP3363494B1/en
Priority to JP2017545471A priority patent/JP6740531B2/ja
Publication of WO2017065239A1 publication Critical patent/WO2017065239A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
    • A61N1/36—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for stimulation
    • A61N1/3605—Implantable neurostimulators for stimulating central or peripheral nerve system
    • A61N1/3606—Implantable neurostimulators for stimulating central or peripheral nerve system adapted for a particular treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/02—Details
    • A61N1/04—Electrodes
    • A61N1/0404—Electrodes for external use
    • A61N1/0408—Use-related aspects
    • A61N1/0412—Specially adapted for transcutaneous electroporation, e.g. including drug reservoirs
    • A61N1/0416—Anode and cathode
    • A61N1/042—Material of the electrode
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/02—Details
    • A61N1/08—Arrangements or circuits for monitoring, protecting, controlling or indicating
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/20—Applying electric currents by contact electrodes continuous direct currents
    • A61N1/205—Applying electric currents by contact electrodes continuous direct currents for promoting a biological process
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
    • A61N1/36—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for stimulation
    • A61N1/3605—Implantable neurostimulators for stimulating central or peripheral nerve system
    • A61N1/36128—Control systems
    • A61N1/36146—Control systems specified by the stimulation parameters
    • A61N1/36167—Timing, e.g. stimulation onset
    • A61N1/36175—Pulse width or duty cycle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N2/00—Magnetotherapy
    • A61N2/004—Magnetotherapy specially adapted for a specific therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/02—Details
    • A61N1/04—Electrodes
    • A61N1/0404—Electrodes for external use
    • A61N1/0408—Use-related aspects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
    • A61N1/36—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for stimulation
    • A61N1/36014—External stimulators, e.g. with patch electrodes
    • A61N1/3603—Control systems
    • A61N1/36034—Control systems specified by the stimulation parameters

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for suppressing inflammation generated in vivo, particularly inflammation generated by autoimmune action.
  • the present invention also relates to a device for suppressing excessive immunity generated in a living body.
  • the present invention also relates to a method for suppressing inflammation generated in a living body, particularly inflammation generated by an autoimmune action, and a method for suppressing excessive immunity.
  • Non-patent Document 3 There is a receptive mechanism that recognizes weak current stimulation with a specific pulse width, and the weak current has been attracting attention because of its enhanced response to AKT activation under insulin stimulation (Non-patent Document 1-2) and its relationship with chronic inflammatory pathologies. P53 has been reported to exert an activation effect (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Documents 4-5, etc. ischemic reperfusion injury model
  • Non-patent Document 7 chronic kidney disease It is reported to be effective in the model
  • extremely good results have been reported in clinical trials of crossover in metabolic syndrome subjects and obese type 2 diabetic patients (Non-patent Document 8).
  • IL-2 which is an inflammatory cytokine that activates immunity in this way, maintains immunity homeostasis with anti-inflammatory cytokines such as IL-10.
  • IL-10 anti-inflammatory cytokines
  • IL-2 gene expression is controlled by three transcription factors, NF- ⁇ B, AP-1, and NFAT.
  • TCR TCR on the T cell surface
  • downstream signal transduction begins with the TCR / CD3 complex and the tyrosine kinase and adapter molecules associated with it.
  • PLC- ⁇ activated by these hydrolyzes PIP2 to produce DAG and IP3
  • DAG activates PKC and MAPK
  • IP3 induces intracellular entry of calcium.
  • PKC activation is also induced downstream of the costimulatory receptor CD28.
  • PKC induces NF- ⁇ B nuclear translocation by dissociating I ⁇ B and NF- ⁇ B (PKC / NF- ⁇ B pathway), and activation of MAPK induces subsequent activation of AP-1.
  • calcineurin is one of calcium / calmodulin-dependent protein kinases.
  • calcineurin induces NFAT translocation into the nucleus by dephosphorylating and activating NFAT (calcium influx / NFAT pathway). Transcription factors activated downstream of these signals promote IL-2 transcription.
  • immunosuppressive drugs such as cyclosporin A (CsA) and tacrolimus (FK506) are used to treat autoimmune diseases and suppress rejection. These drugs are known to act markedly on IL-2 expression suppression by acting on calcineurin and inhibiting NFAT activation.
  • CsA cyclosporin A
  • FK506 tacrolimus
  • an object of the present invention is to provide a new means for suppressing inflammatory cytokine production or a means for suppressing inflammation.
  • the present inventors have shown that a weak pulse direct current (0.1 ms, 55 pps (pulse per second)) exerts an activation action of p53.
  • a weak pulse direct current 0.1 ms, 55 pps (pulse per second)
  • the pulsed direct current has no effect on the means for suppressing IL-2 production, that is, inflammation caused by immune action.
  • the pulse waveform of the input current is a rectangular wave
  • the time (hereinafter referred to as “pulse duration”) indicating the rising peak value in one cycle of the pulse wave is 0.1 milliseconds or more
  • the peak value is 1.0V or more and 20V or less (preferably 2.0V or more and 18V or less, more preferably 3.0V or more and 15V or less)
  • the duty ratio of the pulse wave (pulse current) is 5.5% or more.
  • the inflammation is inflammation caused by the production of one or more inflammatory cytokines of IL-2, IL-6, TNF- ⁇ , and INF- ⁇ , and the suppression of inflammation is a suppression of the production of the inflammatory cytokine.
  • [4] The method described in [3] above, wherein the inflammatory cytokine is IL-2.
  • the pulse duration is 10 milliseconds or longer.
  • the present invention relates to a weak pulse direct current having a specific duty ratio used for suppressing the production of inflammatory cytokines (eg, IL-2) in the living body or tissue, or the use thereof. is there.
  • the weak pulse direct current is applied to, applied to, or applied to a living body or a living tissue), and suppresses the production of inflammatory cytokines (eg, IL-2) in the living body or the living tissue or suppresses inflammation.
  • the weak pulse direct current or the mode of use of the present invention includes the following.
  • “1” is a weak pulse current generated by intermittently applying a direct current at a predetermined interval, and is applied (or given or applied) to a living body or a living tissue intermittently at a predetermined interval.
  • a current that suppresses inflammation in a living tissue, and the applied current has a pulse waveform of a rectangular wave and indicates a rising peak value in one cycle of the pulse wave (hereinafter referred to as “pulse duration”).
  • pulse duration a pulse waveform of a rectangular wave and indicates a rising peak value in one cycle of the pulse wave
  • the peak value is 1.0 V or more and 20 V or less (preferably 2.0 V or more and 18 V or less, more preferably 3.0 V or more and 15 V or less)
  • the pulse wave A weak pulse direct current characterized in that the duty ratio of (pulse current) is 5.5% or more.
  • the inflammation is inflammation caused by inflammatory cytokine production, and the suppression of inflammation is based on suppression of production of the inflammatory cytokine
  • the weak pulse current described in “1” or [2] or use thereof.
  • the inflammation is inflammation caused by the production of one or more inflammatory cytokines of IL-2, IL-6, TNF- ⁇ , and INF- ⁇ , and the suppression of inflammation is suppression of the production of the inflammatory cytokine
  • the weak pulse current according to the above "3" based on the above or use thereof.
  • the present invention provides a new means for suppressing IL-2 production that is safe for living bodies.
  • the present invention also provides new means of suppressing inflammation (eg, based on immune effects).
  • the present invention can be used in combination with an immunosuppressive drug, so that the amount of the immunosuppressive drug used can be reduced and the occurrence of side effects can be suppressed.
  • FIG. 1 is an overall schematic configuration diagram of a treatment apparatus according to an embodiment of the apparatus of the present invention. It is a model figure of the weak electric current (MES) generator used in the in vitro experiment of an Example. It is the result of confirming the effect of alternating current (MAES) and direct current (MDES) on PMA / Io-induced IL-2 production.
  • MES weak electric current
  • MAES alternating current
  • MDES direct current
  • the expression level of mRNA was normalized with ⁇ -actin-mRNA.
  • the data shows the standard error for each group 3.
  • MPES pulse direct current
  • MPES pulse direct current
  • 0.1 ms, 55 pps pulse direct current
  • the expression level of mRNA was normalized with ⁇ -actin-mRNA.
  • the data shows the standard error for each group 3.
  • the data shows the standard error for each group 3. It is the result of confirming the effect of direct current (MDES) on IL-2 protein production in PMA / Io induction.
  • the data shows the standard error for each group 3.
  • N. D. Indicates below the detection limit.
  • MDES direct current
  • the expression level of mRNA was normalized with ⁇ -actin-mRNA.
  • the data shows the standard error for each group 3. It is the result of confirming the effect of direct current (MDES) on the production of PMA / Io or CD3 / CD28-induced inflammatory cytokines (TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , TRAF1, CCL3).
  • the expression level of mRNA was normalized with ⁇ -actin-mRNA.
  • the data shows the standard error for each group 3. It is the result of having compared the inflammatory cytokine production inhibitory effect of MDES and the existing immunosuppressive drug (F506, CsA).
  • the expression level of mRNA was normalized with ⁇ -actin-mRNA.
  • the data shows the standard error for each group 3. It is the result of confirming the effect of heat on PMA / Io-induced IL-2 production.
  • the expression level of mRNA was normalized with ⁇ -actin.
  • the data shows the standard error for each group 3.
  • the pulse waveform of the applied input current is a rectangular wave, and the time (“pulse duration”) indicating the rising peak value in one cycle of the pulse wave is 0.1 milliseconds or more, preferably 0.1 milliseconds. More than 2 seconds, more preferably 0.2 milliseconds or more, still more preferably 1 milliseconds or more, and particularly preferably 10 seconds or more.
  • the peak value voltage is preferably 1.0 V or more and 20.0 V or less, and the lower limit is more preferably 2.0 V or more, further preferably 3.0 V or more, particularly preferably 6.0 V or more, and the upper limit. Is more preferably 18 V or less, and still more preferably 15 V or less.
  • a function generator may be used for voltage input. By doing so, the input voltage can be applied accurately, and the circuit can be simplified.
  • the apparatus according to the present invention can further include a heat generating layer in the pad 204 to add a thermal effect to the target tissue.
  • a heat generating layer in the pad 204 to add a thermal effect to the target tissue.
  • a pair of electrodes are formed in a strip shape in the heat generation layer, and the resistance between the electrodes is formed by carbon fibers having orientation in a direction parallel to the strip electrode. it can.
  • the heat generating layer of the pad is formed of a pair of electrodes each in a strip shape, and the resistance between the electrodes is formed of carbon fibers having orientation in a direction parallel to the strip electrode, Heat can be generated by an appropriate resistance value between the parallel carbon fibers without being short-circuited by the carbon fibers between the electrodes, and a thermal effect can be added in addition to the effects of the present invention.
  • pulse width modulation control means any, for example but not limited to, pulse durations of 0.1 ms, 1 ms, 10 ms, and any, eg, but not limited to, 5555 pps or more, 550 pps
  • intermittent pulse waves pulse current
  • the duty ratio is, for example, 5.5% when the pulse duration is 0.1 milliseconds and the period is 550 pps.
  • the pulse duration and period are selected so that the duty ratio is 5.5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more, more preferably 30% or more, and particularly preferably 50% or more. .
  • each heat generating layer in the pair of pads is heated to 38 ° C. or higher and 45 ° C. or lower.
  • the thermal temperature is 38 ° C. or higher and 45 ° C. or lower, thermal stimulation can be appropriately given to the living body or the living tissue, and treatment can be performed effectively.
  • the pad is not particularly limited as long as a pulse direct current having a predetermined duty ratio can be applied to a living body or tissue in the living body, but the pad may be made of a substance that is less irritating to the living body. preferable. Moreover, you may use the electromagnetic wave shielding rubber
  • the device according to the present invention is characterized in that a weak pulse direct current having a duty ratio of 5.5% or more is applied to a target living body or living tissue and energized, thereby causing inflammation caused by production of inflammatory cytokines. It is characterized by suppressing.
  • the type and conditions of the weak pulse direct current are as described above.
  • inflammatory cytokines include, but are not limited to, IL-2, Il-4, IL-6, IL-13, IFN- ⁇ , and TNF- ⁇ . It is characterized by suppressing the production of at least one of these inflammatory cytokines, and in particular, it can effectively inhibit the production of IL-2.
  • cytokines cause autoimmune diseases
  • the device according to the present invention is suitable for the treatment of autoimmune diseases.
  • the device according to the present invention is not limited thereto, but suppresses inflammation in the treatment of, for example, systemic autoimmune diseases (such as rheumatoid arthritis) and organ-specific autoimmune diseases (such as psoriasis and hair loss). Suitable for the treatment or prevention of these diseases.
  • systemic autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis
  • organ-specific autoimmune diseases such as psoriasis and hair loss.
  • the device of the present invention is a pad for applying a predetermined weak pulse direct current to a part of a living body that is inflamed (for example, but not limited to, a knee, a leg, an arm, or other part). Can be used.
  • the device of the present invention can also be used on biological sites where inflammation is expected to be prevented or reduced.
  • the pad portion of the device of the present invention can be applied in vivo.
  • the pads of the device of the present invention are pasted on the right and left of the joint part causing articular rheumatism, for example, the knee part, and a predetermined weak pulse direct current is applied. Can be used.
  • the disease can be treated or prevented by suppressing the inflammation in the living body using the apparatus of the present invention.
  • the device of the present invention to the head, it becomes possible to treat or prevent diseases caused by inflammation caused by inflammatory cytokines in the brain, such as Alzheimer's disease.
  • the method according to the present invention is characterized in that a weak pulse direct current having a duty ratio of 5.5% or more is applied to a target living body or living tissue and energized, thereby causing inflammation caused by production of inflammatory cytokines. It is characterized by suppressing.
  • the type and conditions of the weak pulse direct current are as described above.
  • inflammatory cytokines that can be suppressed and applicable diseases are also as described above.
  • the weak pulse direct current having the duty ratio to the living body based on the method of the present invention
  • a commercially available apparatus capable of supplying the current to the living body is improved, and the weak pulse direct current having the target duty ratio is applied. You can also.
  • the weak pulse direct current having a duty ratio of 5.5% or more used in the present invention is safe for a living body, and is comfortable to the sense of irritation even when applied to a living body. No load is applied.
  • the device or method of the present invention can also be used in combination with an immunosuppressant.
  • an immunosuppressant By using together, the usage-amount of an immunosuppressant can be decreased and generation
  • the immunosuppressant include, but are not limited to, cyclosporin A (CsA) and tacrolimus (FK506).
  • RNAiso plus® (Takara) According to the manufacturer's protocol.
  • Quantitative RT-PCR method RT-PCR was performed using total RNA extracted from cultured cells.
  • PrimeScript (registered trademark) RT reagent Kit (Perfect real time) (Takara) or PrimeScript (registered trademark) RT Master Mix (Perfect real time) (Takara) is used for RT reaction, and SYBR (xRex) trademark is used for PCR reaction.
  • Taq TM II (Tli RNase H Plus) (Takara) was used.
  • ⁇ -actin was used as an internal control in order to compare the expression level of mRNA between samples. The method was performed according to the manufacturer's protocol.
  • the conditions are as follows: reverse transcription reaction (37 ° C .: 30 minutes, 85 ° C .: 10 seconds), PCR reaction (95 ° C .: 3 minutes, [95 ° C .: 10 minutes, 60 ° C .: 1 minute] ⁇ 40 cycles / Amplification reaction, 65-95 ° C .: 10 seconds / melting reaction).
  • primers sense sequence and antisense sequence
  • human IL-2, human INF- ⁇ , human IL-10, human CCL-3, human TRAF-1, ⁇ -actin were used.
  • nucleoprotein Extraction of nucleoprotein from cultured cells and measurement of concentration After culturing under the same conditions as in 3, nucleoprotein was recovered according to a conventional method, protein quantification was performed by Bradford method, and the amount of protein in each sample was made constant.
  • ELISA method Jurkat cells were seeded at a rate of 3 ⁇ 10 6 cells / dish in a 35 mm plastic culture dish for experiments. MES was treated at 37 ° C. for 10 minutes, immediately after treatment with a T cell activator, and cultured at 37 ° C. for 24 hours, and then the culture solution was collected and centrifuged (4 ° C., 12,000 rpm, 10 minutes) Went. A 1% v / v Protease inhibitor cocktail was added to the supernatant to prepare a sample. Cytokine production was quantified using an ELISA method.
  • Example 1 Effect of MES on PMA / Io-induced IL-2 production
  • PMA alternating current
  • MDES direct current
  • MES Mild electrical stress
  • the current is roughly classified into two types: an alternating current (MAES) whose magnitude and direction periodically change with time, and a direct current (MDES) whose flowing direction (positive or negative) does not change even if the magnitude changes with time. Therefore, it was examined whether or not the difference in these current conditions affects the IL-2 production inhibitory effect.
  • MAES alternating current
  • MDES direct current
  • Jurkat cells were seeded in a 35 mm dish at a rate of 5 ⁇ 10 6 cells / dish and subjected to MES (MAES, MDES) treatment at 6 V, 37 ° C. for 10 minutes.
  • MES MAES, MDES
  • PMA 10 nM
  • Ionmycin 500 nM
  • Example 2 Effect of MES on TCR stimulation-induced IL-2 production
  • T cells in vivo are activated by stimulation of TCR / CD3 complex and CD28 by antigen-presenting cells. Therefore, it was examined whether MDES has an inhibitory effect on IL-2 production induced when TCR / CD3 complex and CD28 are stimulated.
  • 1 ⁇ g / ml anti-human CD3 antibody and 1 ⁇ g / ml anti-human CD28 antibody (CD3 / CD28) were used for the stimulation.
  • Jurkat cells were seeded in a 35 mm dish at a rate of 4 ⁇ 10 6 cells / dish, and MDES treatment was performed under conditions of 3V or 6V, 37 ° C. for 10 minutes.
  • Example 3 Effect of MES on Inflammation-Related Factor Production
  • MDES MDES on T cell activator-induced cytokine and chemokine production other than IL-2 was examined.
  • Jurkat cells were seeded in a 35 mm dish at a rate of 4 ⁇ 10 6 cells / dish, and MDES treatment was performed under conditions of 6 V, 37 ° C. for 10 minutes.
  • PMA / Io or CD3 / CD28 was treated, and after culturing at 37 ° C. for 3 hours, total RNA was collected, and the expression level of each mRNA was compared by quantitative RT-PCR method. The results are shown in FIG.
  • Example 4 Comparison of inflammatory cytokine production inhibitory effect between MES and existing immunosuppressive drugs
  • Immunosuppressive drugs currently used in clinical practice include CsA and FK506. These drugs suppress the activation of NFAT, a transcription factor of IL-2, by strongly inhibiting calcineurin. Therefore, in order to compare the usefulness of MDES and these immunosuppressive drugs, we examined the degree of IL-2 production suppression effect as an index.
  • the concentration of each immunosuppressant effectively suppresses TCR stimulation-induced IL-2 production, but within a concentration range where no cytotoxicity is observed, such as induction of apoptosis of steady-state and activated T-cells (0. 1 ⁇ M to 1 ⁇ M).
  • Concanabain A-induced test using inflammation mouse model Concanavain A activates T cells and induces the production of IL-2, INF- ⁇ and other cytokines derived from T cells. In a model to which concanavain A is administered, these cytokines accumulate in the liver and spleen and cause inflammation.
  • PBS was used as a control for ConA.
  • FIG. 14 upper: spleen; lower: liver.
  • MES suppressed cytokine production.
  • H & E staining of spleen and liver tissue sections 8 hours after ConA administration showed that MES showed improvement in inflammation (data not shown). Thereby, MES improved ConA-induced inflammation.
  • CsA cyclosporin A
  • MES treatment was performed before and after the administration of ConA, as described above.
  • CsA was administered in an amount of 3.25 mg / kg 15 hours and 40 minutes before MES treatment in the MES treatment groups to be compared.
  • Kolliphor and PBS were used, respectively.
  • RNA was extracted from the spleen of mice, and the expression levels of IL-2, IL-6, IFN- ⁇ , and TNF- ⁇ were compared by quantitative RT-PCR. The results are shown in FIG. As a result, MES showed the same inhibitory effect as CsA.
  • the present invention is useful as a new means for suppressing inflammation based on immune action.
  • the present invention is also safe for living organisms.
  • the present invention can be used in combination with existing immunosuppressive drugs, can reduce the amount of existing immunosuppressive drugs used, and can suppress the occurrence of side effects. Useful as a therapy.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)

Abstract

炎症抑制又は炎症性サイトカイン産生抑制のための新たな手段を提供する。微弱なパルス電流を生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における炎症を抑制する装置を、電力供給手段と、電力の供給を受けて直流電流を所定の間隔で間欠的に印加するための電流制御手段と、を備え、該電流制御手段はパルス幅変調制御手段を含み、該パルス幅変調制御手段は、矩形波であるとともに、当該パルス波の１周期における立ち上がりのピーク値を示す時間（「パルス持続時間」）が０．１ミリ秒以上であり、当該ピーク値が１．０Ｖ以上２０Ｖ以下であり、当該パルス波のＤｕｔｙ比が５．５％以上である、パルス波を発生するように構成する。

Description

炎症及び過剰免疫を抑制する装置、並びに炎症及び過剰免疫を抑制するための方法
　本発明は、生体内において生じた炎症、特には自己免疫作用により生じた炎症を抑制するための装置に関する。本発明はまた、生体内に生じた過剰免疫を抑制する装置に関する。
　本発明はまた、生体内に生じた炎症、特には自己免疫作用により生じた炎症を抑制するための方法、並びに過剰免疫を抑制する方法に関する。
　地球上に存在するあらゆる生命は、灼熱から極寒まで過酷な地球環境の変動に暴露されつつも、その環境を受容・適応することで生存し、現代まで進化を遂げてきた。人類もそれは例外ではなく、暴露される様々な刺激を感知し、あらゆる環境に順応できるシステムを進化の過程で獲得している。このシステムを最大限に活用した人類の英知の結晶の一つが医薬品であるとも言える。しかしながら、現代においてもその受容機構が明らかにされていない刺激も存在する。その代表的な例が、脱分極を惹起させないレベルの微弱な電流である。これまで、生体に対する電流の作用については次の３つが明らかにされている。（１）能動的な電気特性として、活動電位発生を伴う現象。（２）受動的な電気特性として、抵抗損失による組織の発熱・変形・破壊。（３）極めて微弱な電流の長期作用として、骨の発育や損傷治癒の促進作用等の、元来の生理機能に対する補助的効果。このうち（３）は、長い歴史を有し、その臨床的有用性が経験的に認知されていたにも関わらず、その生体の受容・作用メカニズムについては全く不明であった。
　しかしながら、近年、微弱電流の生体の受容・作用メカニズムへの注目が集まっている。例えば、本発明者らにより、以下の報告がなされている。特定のパルス幅の微弱電流刺激を認識する受容機構が存在し、微弱電流が、インスリン刺激下のＡＫＴ活性化の増強反応（非特許文献１－２）や、慢性炎症病態との関連から注目されているｐ５３の活性化作用（非特許文献３）を及ぼすことが報告されている。この最適化された物理的療法は、正常動物には、全く作用を示さないが、糖尿病モデル（非特許文献４－５など）、虚血性再還流障害モデル（非特許文献６）、慢性腎臓病モデル（非特許文献７）において有効であることが報告されている。さらには、メタボリックシンドローム対象者や肥満２型糖尿病患者におけるクロスオーバーの臨床試験において、極めて良好な結果が報告されている（非特許文献８）。
　また、本発明者らにより、微弱電流と温熱（３８℃～４５℃）を組み合わせて、熱ショックタンパク質又はユビキチン化タンパク質を介して生体又は生体組織における正常化機能を活性化する生体組織正常化装置が提案されている（特許文献１：特許第５１４８２５４号公報）。そこでは、パルス波の１周期における立ち上がりのピーク値を示す時間が０．０５ミリ秒以上０．１ミリ秒以下であり、当該ピーク値が３．０Ｖ以上２０．０Ｖ以下であり、パルス波の立ち上がり時間が１８ナノ秒以上５０００ナノ秒以下であるの矩形波であるパルス波が用いられている。
　免疫応答反応においては多くのサイトカインが重要な役割を担っていることが知られている。なかでも、Ｔｈ１細胞が産生するＩＬ－２は、Ｔｃ細胞やＮＫ細胞を活性化し、さらに、Ｂ細胞の増殖・抗体産生細胞への分化、Ｔｈ細胞自身の増殖・分化も促進することなど、ＩＬ－２は獲得免疫全体を活性化するため、生体防御への寄与は大きいと考えられる。通常，このように免疫を活性化する炎症性サイトカインであるＩＬ－２は、ＩＬ－１０などの抗炎症性サイトカインとの間で免疫の恒常性を維持している。一方、この免疫の恒常性が破綻し、ＩＬ－２過剰に産生されると、炎症応答が誘導され、炎症関連疾患の発症を促進する因子となりうる。したがって、ＩＬ－２産生を抑制し、適切にコントロールすることは、炎症関連疾患（難治性の自己免疫疾患や潰瘍性大腸炎など）の治療に有効であると考えられる。
　ＩＬ－２の遺伝子発現制御は，ＮＦ－κＢ，ＡＰ－１，ＮＦＡＴの３つの転写因子が協調して行っている。Ｔ細胞表面のＴＣＲが刺激を受けると、その下流のシグナル伝達は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とそれに会合するチロシンキナーゼやアダプター分子から開始する。これらにより活性化されたＰＬＣ－γは、ＰＩＰ２を加水分解することでＤＡＧとＩＰ３を生じ、ＤＡＧはＰＫＣやＭＡＰＫの活性化、ＩＰ３はカルシウムの細胞内流入を誘導する。また、ＰＫＣの活性化は、補助刺激受容体であるＣＤ２８の下流でも誘導される。ＰＫＣは、ＩκＢとＮＦ－κＢを解離させることでＮＦ－κＢの核内移行を誘導し（ＰＫＣ／ＮＦ－κＢ経路）、また、ＭＡＰＫの活性化はそれに続くＡＰ－１の活性化を誘導する（ＭＡＰＫ／ＡＰ－１経路）。一方で、ＩＰ３による細胞内のカルシウム濃度の上昇は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼの１つであるカルシニューリンを活性化する。さらに、カルシニューリンはＮＦＡＴを脱リン酸化して活性化することで、ＮＦＡＴの核内移行を誘導する（カルシウム流入／ＮＦＡＴ経路）。これらのシグナルの下流で活性化された転写因子は，ＩＬ－２の転写を促進する。
　現在、臨床の現場において、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）やタクロリムス（ＦＫ５０６）などの免疫抑制薬が自己免疫疾患の治療や拒絶反応の抑制に用いられている。これらの薬物は、カルシニューリンに作用し、ＮＦＡＴの活性化を阻害することでＩＬ－２の発現抑制を標的としており、著効を示すことが知られている。しかしながら、有効治療濃度域が狭く、腎毒性や易感染性などの副作用が問題となることから、血中薬物濃度モニタリングが必須である。さらに、シクロスポリンＡやタクロリムスは、薬物代謝酵素であるＣＹＰ３Ａサブファミリーにより代謝されるため、この酵素の活性に影響する薬物や食品と併用する場合には、血中薬物濃度の上昇・低下が起こる可能性がある、実際に、これまで様々な薬物との相互作用が報告されており、生ワクチンや肺高血圧症治療薬であるボセンタンとは併用禁忌とされている。このように、免疫抑制薬には薬物ならではの欠点も存在するため、より安全性の高いＩＬ－２産生抑制法の開発が必要とされている。
特許第５１４８２５４号公報
森野ら、J. Pharmacol. Sci. 2008, 108号222-226頁 森野－古賀ら、J. Cell. Physiol. 2012, 228号439-446頁 福田ら、J. Biol. Chem. 2013, 288号16117-16226頁 森野ら、PLoS ONE 2008, 3号e4068頁 近藤ら、Diabetes 2012, 61号838-847頁 大場ら、J Surg Res 2010, 162号213-220頁 古賀ら、PLoS ONE 2012, 7号e43852頁 近藤ら、E BioMedicine 2014, 1号80-89頁
　既存の免疫抑制薬は、正常な免疫系に作用する、腎障害などの副作用を引き起こすなど、過剰免疫病態を安全にコントロールするには課題がある。そこで、本発明は新たな炎症性サイトカイン産生抑制の手段又は炎症抑制の手段を提供することを目的とする。
　本発明者らにより、微弱パルス直流電流（０．１ｍｓ、５５ｐｐｓ（pulse per seconds））がｐ５３の活性化作用を及ぼすことが示されている。しかしながら、本発明者らにより検討した結果、当該パルス直流電流は、ＩＬ－２産生抑制の手段、即ち免疫作用により生じる炎症には効果が無いことが確認された。
　そこで、本発明者らは鋭意研究を重ね、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）産生抑制又は炎症抑制の手段となりうる、微弱パルス直流電流の条件を見いだし、本発明を完成した。
　本発明は、一つの態様において、特定のＤｕｔｙ比の微弱パルス直流電流（パルス波）を生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における炎症性サイトカイン（例えばＩＬ－２）産生を抑制する又は炎症を抑制する装置である。本発明の装置は以下の態様を含む。
（１）（直流電流を所定の間隔で間歇的に印加することにより生じる）微弱なパルス電流を生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における炎症を抑制する装置であって、
電力供給手段と
電力の供給を受けて直流電流を所定の間隔で間欠的に印加するための電流制御手段と、
を備え、
該電流制御手段はパルス幅変調制御手段を含み、
該パルス幅変調制御手段は、パルス波が矩形波であり、そして、当該パルス波の１周期における立ち上がりのピーク値を示す時間（以下、「パルス持続時間」という）が０．１ミリ秒以上であり、当該ピーク値が１．０Ｖ以上２０Ｖ以下（好ましくは、２．０Ｖ以上１８Ｖ以下、より好ましくは３．０Ｖ以上、１５Ｖ以下）であり、当該パルス波のＤｕｔｙ比が５．５％以上であるパルス波（パルス電流）を発生するように構成されていることを特徴とする装置。
（２）前記炎症が炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が、該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記（１）に記載の装置。
（３）前記炎症がＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－γのいずれか一以上の炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記（２）に記載の装置。
（４）前記炎症性サイトカインがＩＬ－２である上記（３）に記載の装置。
（５）前記直流電流の間歇的な間隔が５５ｐｐｓより大きくかつ前記パルス持続時間が１ミリ秒より大きい上記（１）～（４）のいずれか一つに記載の装置。
（６）前記パルス持続時間が１０ミリ秒以上である上記（５）に記載の装置。
（７）前記直流電流の間歇的な間隔が５５０ｐｐｓより大きくかつ前記パルス持続時間が０．１ミリ秒より大きい上記（１）～（４）いずれか一つに記載の装置。
（８）前記直流電流の間歇的な間隔が５５００ｐｐｓ以上である上記（７）に記載の装置。
（９）上記（１）～（８）のいずれか一つに記載の装置を用いた治療装置。
（１０）さらに、生体又は生体組織の異なる部位の表面に付着する導電性の１対のパッド
を備え、
前記電流制御手段は、さらに前記１対のパッド間に間欠的に微弱な直流電流を生じさせるように構成されている、上記（１）～（９）のいずれか一つに記載の装置。
（１１）前記炎症が、全身性自己免疫疾患（関節性リウマチなど）、臓器特異性自己免疫疾患（乾癬、脱毛など）からなる群より選ばれる疾患に基づく上記（１）～（１０）のいずれか一つに記載の装置。
（１２）全身性自己免疫疾患（関節性リウマチなど）、臓器特異性自己免疫疾患（乾癬、脱毛など）からなる群より選ばれる疾患に基づく炎症の治療のために用いられる上記（１）～（１０）のいずれか一つに記載の装置。
（１３）免疫抑制剤が投与されている患者に使用される上記（１）～（１０）のいずれか一つに記載の装置。
　本発明はまた別の態様において、特定のＤｕｔｙ比の微弱パルス直流電流（パルス波）を生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における炎症性サイトカイン（例えばＩＬ－２）産生を抑制する又は炎症を抑制する方法である。本発明の方法は以下の態様を含む。
［１］（直流電流を所定の間隔で間歇的に印加することにより生じる）微弱なパルス電流を生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における炎症を抑制する方法であって、印加される入力電流のパルス波形が矩形波であり、当該パルス波の１周期における立ち上がりのピーク値を示す時間（以下、「パルス持続時間」という）が０．１ミリ秒以上であり、当該ピーク値が１．０Ｖ以上２０Ｖ以下（好ましくは、２．０Ｖ以上１８Ｖ以下、より好ましくは３．０Ｖ以上、１５Ｖ以下）であり、当該パルス波（パルス電流）のＤｕｔｙ比が５．５％以上であることを特徴とする生体組織の炎症を抑制する方法。
［２］前記炎症が炎症性サイトカイン産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記［１］に記載の方法。
［３］前記炎症がＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－γのいずれか一以上の炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記［１］に記載の方法。
［４］前記炎症性サイトカインがＩＬ－２である上記［３］に記載の方法。
［５］前記直流電流の間歇的な間隔が５５ｐｐｓより大きくかつ前記パルス持続時間が１ミリ秒より大きい上記［１］～［４］のいずれか一つに記載の方法。
［６］前記パルス持続時間が１０ミリ秒以上である上記［５］に記載の方法。
［７］前記直流電流の間歇的な間隔が５５０ｐｐｓより大きくかつ前記パルス持続時間が０．１ミリ秒より大きい上記［１］～［４］のいずれか一つに記載の方法。
［８］前記直流電流の間歇的な間隔が５５００ｐｐｓ以上である上記［７］に記載の方法。
［９］前記炎症が、全身性自己免疫疾患（関節性リウマチなど）、臓器特異性自己免疫疾患（乾癬、脱毛など）からなる群より選ばれる疾患に基づく上記［１］～［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］全身性自己免疫疾患（関節性リウマチなど）、臓器特異性自己免疫疾患（乾癬、脱毛など）からなる群より選ばれる疾患に基づく炎症の治療のための上記［１］～［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１１］免疫抑制剤が投与されている患者の炎症の治療のための上記［１］～［８］のいずれか一つに記載の方法。
　本発明はまた別の態様において、当該生体又は生体組織における炎症性サイトカイン（例えばＩＬ－２）産生を抑制する又は炎症を抑制するために用いられる特定のＤｕｔｙ比の微弱パルス直流電流又はその使用である。本発明において、微弱パルス直流電流は、生体又は生体組織に適用され又は与えられ又は印加され）、当該生体又は生体組織における炎症性サイトカイン（例えばＩＬ－２）産生を抑制する又は炎症を抑制する。本発明の微弱パルス直流電流又はその使用の態様は以下のものを含む。
「１」直流電流を所定の間隔で間歇的に印加することにより生じる微弱なパルス電流であって、所定の間隔で間歇的に生体又は生体組織に適用（又は与え又は印加）し、当該生体又は生体組織における炎症を抑制する電流であって、印加される該電流は、矩形波のパルス波形を有し、当該パルス波の１周期における立ち上がりのピーク値を示す時間（以下、「パルス持続時間」という）が０．１ミリ秒以上であり、当該ピーク値が１．０Ｖ以上２０Ｖ以下（好ましくは、２．０Ｖ以上１８Ｖ以下、より好ましくは３．０Ｖ以上、１５Ｖ以下）であり、当該パルス波（パルス電流）のＤｕｔｙ比が５．５％以上であることを特徴とする微弱パルス直流電流。
「２」前記Ｄｕｔｙ比が５０％以上である微弱パルス直流電流又はその使用
［３］前記炎症が炎症性サイトカイン産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が、該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記「１」又は［２］に記載の微弱パルス電流又はその使用。
「４」前記炎症がＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－γのいずれか一以上の炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が、該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記「３」に記載の微弱パルス電流又はその使用。
「５」前記炎症性サイトカインがＩＬ－２である上記「４」に記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「６」前記生体又は組織に適用する間歇的な間隔が５５ｐｐｓより大きくかつ前記パルス持続時間が１ミリ秒より大きい上記「１」～「５」のいずれか一つに記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「７」前記パルス持続時間が１０ミリ秒以上である上記「６」に記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「８」前記生体又は組織に適用する間歇的な間隔が５５０ｐｐｓより大きくかつ前記パルス持続時間が０．１ミリ秒より大きい上記「１」～「５」のいずれか一つに記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「９」前記生体又は組織に適用する間歇的な間隔が５５００ｐｐｓ以上である上記「８」に記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「１０」前記炎症が、全身性自己免疫疾患（関節性リウマチなど）、臓器特異性自己免疫疾患（乾癬、脱毛など）からなる群より選ばれる疾患に基づく上記「１」～「９」のいずれか一つに記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
［１１］全身性自己免疫疾患（関節性リウマチなど）、臓器特異性自己免疫疾患（乾癬、脱毛など）からなる群より選ばれる疾患に基づく炎症の治療のために用いられる上記［１］～［９］のいずれか一つに記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
　本発明により、生体に安全な、新たなＩＬ－２産生抑制の手段が提供される。本発明によりまた、（例えば免疫作用に基づく）炎症を抑制する新たな手段が提供される。
　本発明はさらには、免疫抑制薬との併用が可能であり、免疫抑制薬の使用量を少なくし、副作用の発生を抑制することができる。
本発明の装置の一実施態様に係る治療装置の全体概略構成図である。 実施例のインビトロ実験で用いた、微弱電流（ＭＥＳ）発生装置のモデル図である。 ＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生に対する交流電流（ＭＡＥＳ）と直流電流（ＭＤＥＳ）の効果を確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、β－アクチン ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。 ＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生に対するパルス直流電流（ＭＰＥＳ；０．１ｍｓ、５５ ｐｐｓ）の効果を確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、β－アクチン ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。 ＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生に対するパルス直流電流（ＭＰＥＳ）の効果を、パルス持続時間を変えて確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、β－アクチン ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。 ＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生に対するパルス直流電流（ＭＰＥＳ）の効果を、パルス数を変えて確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、β－アクチン ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。 ＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生に対する直流電流（ＭＤＥＳ）の効果を、電圧を変えて確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、β－アクチン ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。 ＰＭＡ／Ｉｏ誘導におけるＩＬ－２タンパク質産生に対する直流電流（ＭＤＥＳ）の効果を確認した結果である。データは、各群３での標準誤差を示す。Ｎ．Ｄ．は、検出限界以下を示す。 ＣＤ３／ＣＤ２８誘導性ＩＬ－２産生に対する直流電流（ＭＤＥＳ）の効果を、電圧を変えて確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、β－アクチン ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。 ＰＭＡ／Ｉｏ又はＣＤ３／ＣＤ２８誘導性炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＴＲＡＦ１、ＣＣＬ３）産生に対する直流電流（ＭＤＥＳ）の効果を確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、β－アクチン ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。 ＭＤＥＳと既存の免疫抑制薬（Ｆ５０６，ＣｓＡ）との炎症性サイトカイン産生抑制効果の比較した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、β－アクチン ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。 ＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生に対する温熱の効果を確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、β－アクチンで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。 コンカナバインＡ誘導の炎症マウスモデルを用いた炎症性サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ）産生に対する直流電流（ＭＥＳ：ＭＤＥＳとＭＰＥＳ）の効果を確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、ＨＰＲＴ ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群６個の固体での標準誤差を示す。 コンカナバインＡ誘導の炎症マウスモデルを用いた各種の炎症性サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）産生に対する直流電流（ＭＥＳ：ＭＰＥＳ）の効果を確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、ＧＤＰＤＨ ｍＲＮＡで標準化した。データは、脾臓は各群８個、肝臓は各群４個の固体での標準誤差を示す。 コンカナバインＡ誘導の炎症マウスモデルを用いた、直流電流（ＭＥＳ：ＭＰＥＳ）と既存の免疫抑制薬（ＣｓＡ）との炎症性サイトカイン産生抑制効果の比較した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、ＧＤＰＤＨ ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群８個の固体での標準誤差を示す。 ミクログリア細胞株であるＢＶ２細胞を用いて、ＬＰＳ誘導性炎症性サイトカイン産生に対する直流電流（ＭＥＳ：ＭＰＥＳ）の効果を確認した結果である。ｍＲＮＡの発現レベルは、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡで標準化した。データは、各群３での標準誤差を示す。
　以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
　本発明においては、直流電流を所定の間隔で間歇的に印加することにより生じる微弱なパルス電流は、Ｄｕｔｙ比が、５．５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、特に好ましくは５０％以上である。また、パルス電流のＤｕｔｙ比の上限は、炎症の抑制を示すかぎり特に制限がないが、制御装置の性能その他の要因より、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下である。
　印加される入力電流のパルス波形は矩形波であり、当該パルス波の１周期における立ち上がりのピーク値を示す時間（「パルス持続時間」）は、０．１ミリ秒以上、好ましくは０．１ミリ秒より大きく、より好ましくは０．２ミリ秒以上であり、さらに好ましくは１ミリ秒以上であり、特に好ましくは１０秒ミリ以上である。
　当該ピーク値の電圧は、好ましくは１．０Ｖ以上２０．０Ｖ以下であり、下限は、より好ましくは２．０Ｖ以上、さらに好ましくは３．０Ｖ以上、特に好ましくは６．０Ｖ以上であり、上限は、より好ましくは１８Ｖ以下、さらに好ましくは１５Ｖ以下である。なお、電圧の入力にはファンクションジェネレータを用いてもよい。そうすることで、入力電圧を正確に印加することが可能となり、且つ、回路を簡潔にすることができる。
　本発明に係る装置の、生体又は生体組織に特定の微弱パルス直流電流を通電するための電極２０５が配置されたパッド２０４は、対象とする炎症部位周辺、例えば、これらに限定されないが、患者の頭、顔、首、肩、体幹、胸、腹部、腕、手首、手、腰、膝、下脚、足首、足から選ばれた目標となる領域に適用される（例えば、貼られる）。
　そして、本発明の装置を用いて、任意の時間、所定の特定の微弱パルス直流電流を通電することにより、炎症を抑制できる。
　本発明に係る装置は、さらに前記パッド２０４内に発熱層を備え、標的とする組織に温熱効果を加えることもできる。係る場合は、例えば、発熱層で、１対の電極が各々短冊状に形成され、当該電極間の抵抗が短冊状の電極に平行な方向に配向性を有するカーボン繊維で形成されることにより達成できる。
　このようにして、パッドの発熱層が、１対の電極が各々短冊状に形成され、当該電極間の抵抗が短冊状の電極に平行な方向に配向性を有するカーボン繊維で形成されるため、電極間がカーボン繊維により短絡されることなく、この各平行なカーボン繊維相互間の適度な抵抗値により発熱できることとなり、本発明の効果に加えて温熱効果を付加できる。
　本発明に係る装置は、パッド内の電極２０５に直流電流を任意の周期で間歇的に供給するための電流制御部２０２、それを操作するための操作部２０１を備え、さらに、供給される電流をモニターするための表示部２０３を備えることもできる。電力供給手段（図中には示されていない）から電流制御部２０２に電力が供給されて電流を発生する。電流制御部２０２には電流制御手段が備えられている。電流制御手段により、前記電極２０５に供給される直流電流が、所定のＤｕｔｙ比を提供できる周期で間歇的に供給制御される。電流制御手段はさらにパルス幅変調制御手段を含み、それにより任意の高さ（振幅）を有するパルス波を発生する。パルス幅変調制御手段により、任意の、例えばこれに限定されないが、０．１ミリ秒、１ミリ秒、１０ミリ秒のパルス持続時間で、任意の、例えばこれに限定されないが、５５５５ｐｐｓ以上、５５０ｐｐｓ以上、５５００ｐｐｓ以上の周期で間歇的なパルス波（パルス電流）を発生する。Ｄｕｔｙ比は、例えば、パルス持続時間が０．１ミリ秒で、周期が５５０ｐｐｓであれば、５．５％となる。パルス持続時間と周期は、Ｄｕｔｙ比が、５．５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、特に好ましくは５０％以上となるように選択される。より具体的には、パルス持続時間が、０．１ミリ秒である場合は、周期は、５５０ｐｐｓ以上、好ましくは５５００ｐｐｓ以上であり、パルス持続時間が１．０ミリ秒である場合は、５５ｐｐｓ以上、好ましくは５５０ｐｐｓ以上であり、パルス持続時間が１０ミリ秒である場合は５５ｐｐｓでも好ましい結果が得られる。
　本発明に係る治療装置において温熱を同時に用いる場合は、前記１対のパッド内の各発熱層が、３８℃以上４５℃以下に加熱することが望ましい。温熱が３８℃以上４５℃以下であれば、生体又は生体組織に温熱刺激を適度に与えることができ、治療を効果的に行うことができる。
　本発明の装置においては、前記パッドは、所定のＤｕｔｙ比のパルス直流電流を生体又は生体内の組織に印加できる限り特に制限がないが、生体に刺激性の少ない物質から作られていることが好ましい。また、遠赤外線を発生する電磁波シールドゴムをもちいてもよく、係る場合は、温熱刺激も容易に達成できる。
　本発明に係る装置は、対象とする生体又は生体組織に、Ｄｕｔｙ比が５．５％以上の微弱パルス直流電流を印加して通電することを特徴とし、それにより炎症性サイトカイン産生により生じる炎症を抑制することを特徴とする。微弱パルス直流電流の種類や条件については、既に上記した通りである。
　炎症性サイトカインとしては、これに限定されないが、例えば、ＩＬ－２，Ｉｌ－４，ＩＬ－６，ＩＬ－１３，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－αをあげることができ、本発明に係る装置は、これらの炎症性サイトカインのうちの少なくとも一つ以上のサイトカインの産生を抑制することを特徴とし、特には、効果的にＩＬ－２の産生を抑制できる。
　これらのサイトカインは、自己免疫疾患の原因となっており、本発明に係る装置は、自己免疫疾患の治療に適している。
　また、本発明に係る装置は、これらに限定されないが、例えば、全身性自己免疫疾患（関節性リウマチなど）、臓器特異性自己免疫疾患（乾癬、脱毛など）、等の治療において炎症を抑制することができ、これらの疾患の治療又は予防に適している。
　本発明の装置は、炎症を起こしている生体の部位、（これに限定されないが、例えば、膝、足、腕、その他の部位）に、所定の微弱パルス直流電流を通電するためのパッドを貼り付けて使用することができる。本発明の装置はまた、炎症を起こすと予想される生体部位に使用して、炎症を予防又は軽減することもできる。また、材料として生体適合性の材料を用いることにより、生体内に本発明の装置のパッド部分を適用することも可能である。
　これに限定されないが、例えば、関節性リウマチについて説明すると、関節性リュウマチを起こしている関節部分、例えば、膝部分の左右に本発明の装置のパッドを貼り付けて所定の微弱パルス直流電流を通電することにより使用することができる。
　また、生体内で炎症性サイトカインにより炎症が生じることに起因する疾患の場合は、本発明の装置を用いて生体内での炎症を抑制することにより、該疾患の治療や予防が可能となる。例えば、頭部に本発明の装置を適用することにより、脳内での炎症性サイトカインによる炎症が原因の疾患、例えばアルツハイマー病の治療又は予防も可能となる。
　本発明に係る方法は、対象とする生体又は生体組織に、Ｄｕｔｙ比が５．５％以上の微弱パルス直流電流を印加して通電することを特徴とし、それにより炎症性サイトカイン産生により生じる炎症を抑制することを特徴とする。微弱パルス直流電流の種類や条件については、既に上記した通りである。また、抑制できる炎症性サイトカインや適用できる疾患についても上記の通りである。
　本発明の方法に基づいて上記Ｄｕｔｙ比の微弱パルス直流電流を生体に通電するために、電流を生体に通電できる市販の装置を改良して、目的のＤｕｔｙ比をもつ微弱パルス直流電流を印加することもできる。
　本発明はまた、対象とする生体又は生体組織に経皮と通して適用する又は与える又は印加する）ことにより、生体又は生体組織に生じた炎症性サイトカイン産生により生じる炎症を抑制するために用いるための、Ｄｕｔｙ比が５．５％以上の微弱パルス直流電流又はその使用に関する。微弱パルス直流電流の種類や条件については、既に上記した通りである。また、抑制できる炎症性サイトカインや適用できる疾患についても上記の通りである。
　本発明で用いるＤｕｔｙ比が５．５％以上の微弱パルス直流電流は、生体に対して安全であり、また、生体に適用した場合も快適～刺激を感じない範囲となるので、通電を受けるヒトに負荷をかけることがない。
　本発明の装置や方法はまた、免疫抑制剤と併用することができる。併用することにより、免疫抑制薬の使用量を少なくし、副作用の発生を抑制することができる。免疫抑制剤としては、これに限定されないが、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）やタクロリムス（ＦＫ５０６）などをあげることができる。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
材料と実験方法
１．実験装置モデル
　培養細胞を用いた、インビトロ実験で用いる装置のモデル図を図２に示す。図中のＭＥＳは、低電圧パルス電流（ＭＥＳ）発生装置を示す。プラスチック培養皿の蓋に電極用の穴を開け、電極コードを通して電極を培養液に浸した。電極は、つちやゴム（株）社製の赤外線を発生する電磁波シールドゴムを用いた。側面をテープで覆い、３７℃の恒温槽につけることで温度を一定に保った。処置時間は、通常、１０分間とした。
２．細胞及び培養条件
　ＡＴＣＣより入手したヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＡＴＣＣより入手したマウスミクログリア細胞株ＢＶ２を用い、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｗａｋｏ）を基礎培養液として培養した。細胞は、３ ×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超えない細胞数で、静置培養した。実験では無血清の培養液を用い、細胞死は、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色により確認した。
３．培養細胞からの全ＲＮＡ抽出
　３５ ｍｍのプラスチック培養皿にＪｕｒｋａｔ細胞（或いは、ＢＶ２細胞）を３～５×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で播種し、実験を行った。ＭＥＳを、３７℃で、１０分間で処置し、直後にＴ細胞活性化薬を処理し、３７℃で３時間培養した後、全ＲＮＡの抽出をＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ）を用いて、製造元のプロトコールに従って行った。
４．定量的ＲＴ－ＰＣＲ法
　培養細胞から抽出した全ＲＮＡを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ反応にはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ （Ｐｅｒｆｅｃｔ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）（Ｔａｋａｒａ）もしくはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｐｅｒｆｅｃｔ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）（Ｔａｋａｒａ）を、ＰＣＲ反応にはＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ＴａｑTMII（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｔａｋａｒａ）を用いた。また、サンプル間のｍＲＮＡの発現量を比較するために、インターナルコントロールとしてβ－ａｃｔｉｎを用いた。方法は、製造元のプロトコールに従って行った。条件は、以下の通りである：逆転写反応（３７℃：３０分間，８５℃：１０秒間）、ＰＣＲ反応（９５℃：３分間，［９５℃：１０分間，６０℃：１分間］ｘ４０ｃｙｃｌｅｓ／増幅反応，６５～９５℃：１０秒間／融解反応）。プライマー（センス配列、アンチセンス配列）は、ヒトＩＬ－２，ヒトＩＮＦ－γ，ヒトＩＬ－１０，ヒトＣＣＬ－３，ヒトＴＲＡＦ－１，β－アクチンを用いた。
５．培養細胞からのタンパク質抽出および濃度測定
　３と同様の条件で培養した後、常法に従い、タンパク質を回収し、ＢＣＡ法によりタンパク質定量を行い、各サンプルのタンパク質量を一定にした。
６．培養細胞からの核タンパク質抽出および濃度測定
　３と同様の条件で培養した後、常法に従い、核タンパク質を回収し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質定量を行い，各サンプルのタンパク質量を一定にした．
７．ウェスタンブロット法
　培養細胞から抽出したタンパク質をサンプルとして用いて、各サンプルのタンパク質量を一定にし、常法に従い、ウェスタンブロット法を行った。用いた一次抗体及び二次抗体を、以下に示す。
１次抗体：Rabbit anti-phospho-IκB-α (Ser32), Rabbit anti-IκB-α, Mouse anti-NF-κB p65, Mouse anti-NF-κB p50, Rabbit anti-NFAT1, Rabbit anti-phospho-AMPK-α (Thr172), Rabbit anti-AMPK-α, Rabbit anti-phospho-JNK (Thr183/Tyr185), Rabbit anti-JNK, Rabbit anti-phospho-p38 (Thr180/Tyr182), Rabbit anti-p38, Rabbit anti-phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr185), Rabbit anti-ERK1/2 はCell signaling Technology, Inc から, Mouse Ubiquitinated protein はBIOMOL, Inc から, Goat anti-β-actin, Goat anti-γ-tubulin はSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, Inc からそれぞれ購入した。
二次抗体：Anti-rabbit IgG-HRP, Anti-mouse IgG-HRP, Anti-goat IgG-HRP は Jackson Immuno Research LABORATORIES, Inc からそれぞれ購入した。
８．ＥＬＩＳＡ法
　３５ ｍｍのプラスチック培養皿にＪｕｒｋａｔ細胞を３×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で播種し、実験を行った。ＭＥＳを３７℃、１０分間で処置し、直後にＴ細胞活性化薬を処理し、３７℃で２４時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離（４℃，１２，０００ｒｐｍ，１０分間）を行った。その上清に１％ ｖ／ｖ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌを加え、サンプルとした。ＥＬＩＳＡ法を用いて、サイトカインの産生を定量した。
実施例１：ＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生に対するＭＥＳの効果
（１）交流電流（ＭＡＥＳ）と直流電流（ＭＤＥＳ）の効果
　微弱電流（mild electrical stress：ＭＥＳ）が免疫細胞に直接的に作用することで炎症性サイトカインの産生を抑制するかを検討した。Ｔ細胞が産生する主な炎症性サイトカインの一種であり、免疫抑制薬の標的分子にもされているＩＬ－２に着目し、ＩＬ－２産生誘導薬としてＰＫＣの活性化薬であるＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）とカルシウムイオノフォアであるＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｉｏ）を用いた。電流は、時間と共に周期的に大きさと向きが変化する交流電流（ＭＡＥＳ）と時間により大きさが変化しても流れる方向（正負）が変化しない直流電流（ＭＤＥＳ）の２種類に大別されるので、これらの電流条件の違いがＩＬ－２の産生抑制効果に影響を及ぼすか否かを検討した。
　Ｊｕｒｋａｔ細胞を３５ ｍｍ ｄｉｓｈに５×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で播種し、６Ｖ，３７℃，１０分間の条件で、ＭＥＳ（ＭＡＥＳ，ＭＤＥＳ）処置を行った。ＭＥＳ処置直後に、ＰＭＡ（１０ ｎＭ）とＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（５００ ｎＭ）で併用処理（ＰＭＡ／Ｉｏ）をし、３７℃で３時間培養後、全ＲＮＡを回収し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によりＩＬ－２ ｍＲＮＡの発現量を比較した。結果を図３に示す。その結果、ＰＭＡ／Ｉｏにより誘導されたＩＬ－２産生に対してＭＡＥＳは抑制効果を示さなかったが、ＭＤＥＳは、定常状態のＩＬ－２発現量に影響を与えなかった一方で、ＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生を有意に抑制した。この結果より、ＭＥＳがＴ細胞に直接的に作用することでＩＬ－２産生を抑制することが明らかになった。またその効果は直流電流においてのみ認められ、交流電流では認められなかった。
（２）ＭＰＥＳ（５５ ｐｐｓ）の効果
　直流電流の波形にはパルス直流電流（ＭＰＥＳ）も存在するので、次いで、ＭＰＥＳが免疫細胞に直接的に作用することで炎症性サイトカイン産生を抑制するか否か検討した。パルス直流電流として、パルス持続時間０．１ ｍｓの矩形波を１秒間に５５回与える（５５ ｐｐｓ）条件（Ｄｕｔｙ比＝０．５５％）を用いた。ＭＥＳ以外は、上記と同じ条件で行い、ＩＬ－２ ｍＲＮＡの発現量を比較した。結果を図４に示す。その結果、ＰＭＡ／Ｉｏにより誘導されたＩＬ－２産生に対してＭＰＥＳ（０．１ｍｓ、５５ ｐｐｓ）は有意な抑制効果を示さなかった。
（３）ＭＰＥＳ（パルス持続時間 １ ｍｓ，１０ ｍｓ）の効果
　次に、パルス持続時間の検討を行った。上記同様にしてＩＬ－２ ｍＲＮＡの発現量を比較した。但し、ＭＥＳは、パルス持続時間 １ ｍｓ，１０ ｍｓのＭＰＥＳ（６Ｖｐ－ｐ，５５ｐｐｓ）（それぞれ、Ｄｕｔｙ比＝５．５％、５５％）もしくはＭＤＥＳ（ｄｕｒａｔｉｏｎ：∞）（Ｄｕｔｙ比＝１００％）を用いた。結果を図５に示す。その結果、パルス持続時間が長い（１０ ｍｓ）条件において、ＰＭＡ／Ｉｏにより誘導されたＩＬ－２産生に対するより顕著な抑制効果が認められた。
（４）ＭＰＥＳ（パルス波数 ５５０ ｐｐｓ，５５００ ｐｐｓ）の効果
　次いで、１秒間あたりのパルス回数について検討した。上記同様にしてＩＬ－２ ｍＲＮＡの発現量を比較した。但し、ＭＥＳは、パルス波数 ５５０ ｐｐｓ，５５００ ｐｐｓのＭＰＥＳ（６ Ｖｐ－ｐ，０．１ｍｓ）（それぞれ、Ｄｕｔｙ比＝５．５％、５５％）、もしくはＭＤＥＳ（ｐｕｌｓｅ ｒａｔｅ：∞）（Ｄｕｔｙ比＝１００％）用いた。結果を図６に示す。その結果、１秒間あたりのパルス回数が多い（５５００ ｐｐｓ）条件において、ＰＭＡ／Ｉｏにより誘導されたＩＬ－２産生に対するより顕著な抑制効果が認められた。
（５）ＭＤＥＳ（電圧：３Ｖ，６Ｖ）の効果
　さらに、ＭＤＥＳによるＩＬ－２産生抑制効果に対する電圧の大きさの影響を検討した。上記同様にしてＩＬ－２ ｍＲＮＡの発現量を比較した。但し、３Ｖもしくは６Ｖ，３７℃，１０分間の条件でＭＤＥＳ処置を行った。結果を図７に示す。その結果、ＭＤＥＳによるＩＬ－２産生抑制効果は電圧依存的に認められた。また、予備的な検討ではあるが、９ＶのＭＤＥＳは６ＶのＭＤＥＳと同程度のＩＬ－２産生抑制効果を示した（データ示さず）。
（６）ＩＬ－２タンパク質産生抑制の効果
　ＭＤＥＳによるＩＬ－２産生抑制効果がタンパク質レベルでも認められるかを検討した。上記と同様にして細胞を培養し、２４時間培養後に細胞培養液を回収しＥＬＩＳＡ法を用いて細胞培養液中に分泌されたＩＬ－２タンパク質量を比較した。結果を図８に示す。その結果、ＭＤＥＳはＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生をタンパク質レベルでも抑制した。
実施例２：ＴＣＲ刺激誘導性ＩＬ－２産生に対するＭＥＳの効果
　一般的に生体内のＴ細胞は、抗原提示細胞によりＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びＣＤ２８が刺激されることで活性化する。そこで、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びＣＤ２８を刺激した際に誘導されるＩＬ－２産生に対してもＭＤＥＳが抑制効果を示すか検討した。刺激には、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体と１μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ２８抗体（ＣＤ３／ＣＤ２８）を用いた。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を３５ ｍｍ ｄｉｓｈに４×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で播種し、３Ｖもしくは６Ｖ，３７℃，１０分間の条件で、ＭＤＥＳ処置を行った。ＭＤＥＳ処置直後にＣＤ３／ＣＤ２８を処理し、３７℃で３時間培養後、全ＲＮＡを回収し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によりＩＬ－２ ｍＲＮＡの発現量を比較した。結果を図９に示す。その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激下でもＭＤＥＳはＩＬ－２産生を電圧依存的に抑制した。
実施例３：炎症関連因子産生に対するＭＥＳの効果
　ＩＬ－２以外のＴ細胞活性化薬誘導性のサイトカイン、ケモカイン産生に対するＭＤＥＳの抑制効果を検討した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を３５ ｍｍ ｄｉｓｈに４×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で播種し、６Ｖ，３７℃，１０分間の条件で、ＭＤＥＳ処置を行った。処置直後にＰＭＡ／ＩｏもしくはＣＤ３／ＣＤ２８を処理し、３７℃で３時間培養後、全ＲＮＡを回収し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法により各ｍＲＮＡの発現量を比較した。結果を図１０に示す。その結果、ＭＤＥＳは、ＴＮＦ－α，ＩＦＮ－γ，ＴＲＡＦ１，ＣＣＬ３などＩＬ－２以外のサイトカインやケモカイン産生を、抑制もしくは抑制傾向にあることが示された。従って、ＭＤＥＳは、包括的に炎症性サイトカイン産生を抑制していることが示唆された。
実施例４：ＭＥＳと既存の免疫抑制薬との炎症性サイトカイン産生抑制効果の比較
　現在臨床で使用されている免疫抑制薬にはＣｓＡやＦＫ５０６がある。これらの薬物はカルシニューリンを強力に阻害することで、ＩＬ－２の転写因子であるＮＦＡＴの活性化を抑制する。そこで、ＭＤＥＳとこれらの免疫抑制薬の有用性を比較するため、ＩＬ－２産生抑制効果の程度を指標として検討を行った。それぞれの免疫抑制薬の濃度は、ＴＣＲ刺激誘導性ＩＬ－２産生を効果的に抑制するが，定常状態、活性化状態のＴ細胞に対するアポトーシス誘導など細胞傷害性は認められない濃度域内（０．１μＭ～１μＭ）とした。
　Ｊｕｒｋａｔ細胞を３５ ｍｍ ｄｉｓｈに４×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で播種し、１μＭのＦＫ５０６もしくは１μｇ／ｍＬ（≒０．８３μＭ）のＣｓＡを処理後３７℃で１時間培養、または、６Ｖ，３７℃，１０分間の条件でＭＤＥＳ処置を行った。その後、ＰＭＡ／Ｉｏを処理し、３７℃で３時間培養し、全ＲＮＡを回収し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によりＩＬ－２，ＴＮＦ－α，及びＩＦＮ－γの発現量を比較した。結果を図１１に示す。その結果、ＭＥＳは４時間処理した既存の免疫抑制薬と同程度のＩＬ－２、ＴＮＦ－α，及びＩＦＮ－γの産生抑制効果を示した。したがって、ＭＥＳは既存の免疫抑制薬と同等の有用性があることが示唆された。
実施例５：ＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生に対するＨＳ（Ｈｅａｔ　Ｓｈｏｃｋ）の効果
　ＨＳが免疫細胞に直接的に作用することで炎症性サイトカインの産生を抑制するか検討した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を３５ ｍｍ ｄｉｓｈに３×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で播種し、４２℃，１０分間の条件でＨＳ処置を行った。ＨＳ処置直後にＰＭＡ／Ｉｏを処理し、３７℃で３時間培養後、全ＲＮＡを回収し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によりＩＬ－２ ｍＲＮＡの発現量を比較した。結果し図１２に示す。その結果、ＨＳはＰＭＡ／Ｉｏ誘導性ＩＬ－２産生を抑制した。
比較例：コンカナバインＡ誘導の炎症マウスモデルを用いた試験
　コンカナバインＡは、Ｔ細胞を活性化し、Ｔ細胞由来のＩＬ－２，ＩＮＦ－γその他のサイトカインの産生を誘導する。コンカナバインＡを投与したモデルでは、これらのサイトカインが肝臓や脾臓に蓄積し、炎症を引き起こす。
　ＭＥＳが、コンカナバインＡ投与マウスモデルの脾臓及び肝臓における炎症性サイトカインの産生を抑制するかを検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２Ｖ／ｃｍ，１０分間の条件でＭＥＳ処置した。ＭＥＳ処置は、ＭＰＥＳ（０．１ｍｓ；５５ｐｐｓ）（Ｄｕｔｙ比＝０．５５％）及びＭＤＥＳ（ｄｕｒａｔｉｏｎ：∞）（Ｄｕｔｙ比＝１００％）の条件で行った。その後、５ｍｇ／ｋｇの量にてコンカナバインＡ（ＣｏｎＡ）を静脈内投与し、４時間後に、マウスの脾臓から全ＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によりＩＬ－２，及びＩＦＮ－γの発現量を比較した。ＣｏｎＡの対照としてＰＢＳを用いた。結果を図１３に示す。その結果、上記の条件のＭＥＳでは、サイトカインの産生を抑制しなかった。
実施例７：コンカナバインＡ誘導の炎症マウスモデルを用いた試験
　Ｄｕｔｙ比が特定に数値以上のＭＰＥＳが、コンカナバインＡ投与マウスモデルの脾臓及び肝臓における炎症性サイトカインの産生を抑制するかを検討した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、４Ｖ／ｃｍ，２０分間の条件でＭＰＥＳ（ｄｕｒａｔｉｏｎ：０．１ ｍｓ；５５００ ｐｐｓ）（Ｄｕｔｙ比＝５５％）処置した。その後、１ｍｇ／ｋｇの量にてコンカナバインＡ（ＣｏｎＡ）を静脈内投与し、マウスを再び同条件でＭＥＳ処置した。ＭＥＳ処置の４時間後に、マウスの脾臓と肝臓から全ＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によりＩＬ－２，ＩＬ－６，ＩＦＮ－γ，及びＴＮＦ－αの発現量を比較した。ＣｏｎＡの対照としてＰＢＳを用いた。結果を図１４に示す（上段：脾臓；下段：肝臓）。その結果、ＭＥＳはサイトカインの産生を抑制した。また、ＣｏｎＡ投与の８時間後の脾臓及び肝臓の組織切片のＨ＆Ｅ染色を行ったところ、ＭＥＳは炎症の改善を示した（データ示さず）。これにより、ＭＥＳは、ＣｏｎＡ誘導の炎症を改善した。
　次いで、コンカナバインＡ誘導の炎症マウスモデルを用いて、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）とＭＥＳのサイトカイン産生抑制効果を比較した。ＭＥＳ処置群は、上記と同様に、ＣｏｎＡの投与の前後にＭＥＳ処置を行った。ＣｓＡは、比較するＭＥＳ処置群のＭＥＳ処理の１５時間前と４０分前に、３．２５ｍｇ／ｋｇの量にて投与した。ＣｓＡ及びＣｏｎＡの対照として、それぞれ、ＫｏｌｌｉｐｈｏｒとＰＢＳを用いた。ＣｏｎＡ投与の４時間後に、マウスの脾臓から全ＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によりＩＬ－２，ＩＬ－６，ＩＦＮ－γ，及びＴＮＦ－αの発現量を比較した。結果を図１５に示す。その結果、ＭＥＳは、ＣｓＡと同様の抑制効果を示した。
実施例８：ＬＰＳ誘導性炎症性サイトカイン産生に対するＭＥＳの効果
　ＢＶ２細胞を３５ ｍｍ ｄｉｓｈに５×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの割合で播種し、６Ｖ，３７℃，１０分間の条件で、ＭＥＳ処置を行った。ＭＥＳ処置は、ＭＰＥＳ（６Ｖ、０．１ ｍｓ、５５ ｐｐｓ又は５５００ ｐｐｓ）（それぞれ、Ｄｕｔｙ比＝０．５５％又は５５％）で行った。ＭＥＳ処置３０分後に、ＬＰＳ（１００ ｎｇ／ｍｌ）で処理をし、３７℃で４時間培養後、全ＲＮＡを回収し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によりＩＬ－１β及びＩＬ－６のｍＲＮＡの発現量を比較した。結果を図１６に示す。ＭＥＳ５５００ ｐｐｓは、炎症性サイトカイン産生を有意に抑制した。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　本発明は、免疫作用に基づく炎症を抑制する新たな手段として有用である。本発明はまた、生体に安全である。本発明はさらには、既存の免疫抑制薬との併用が可能であり、既存の免疫抑制薬の使用量を少なくし、副作用の発生を抑制することができるので、既存の免疫抑制薬との併用療法として有用である。
１０１・・治療装置
２０１・・操作部
２０１・・電流制御部
２０３・・表示部
２０４・・パッド
２０５・・電極

Claims (13)

  1. 　微弱なパルス電流を生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における炎症を抑制する装置であって、
    電力供給手段と
    電力の供給を受けて直流電流を所定の間隔で間欠的に印加するための電流制御手段と、
    を備え、
    該電流制御手段はパルス幅変調制御手段を含み、
    該パルス幅変調制御手段は、パルス波が矩形波であり、そして、当該パルス波の１周期における立ち上がりのピーク値を示す時間（「パルス持続時間」）が０．１ミリ秒以上であり、当該ピーク値が１．０Ｖ以上２０Ｖ以下であり、当該パルス波のＤｕｔｙ比が５．５％以上であるパルス波を発生するように構成されていることを特徴とする装置。
  2. 　前記炎症が炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が、該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく請求項１に記載の装置。
  3. 　前記炎症がＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－γのいずれか一以上の炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく請求項２に記載の装置。
  4. 　前記炎症性サイトカインがＩＬ－２である請求項３に記載の装置。
  5. 　前記直流電流の間歇的な間隔が５５ｐｐｓより大きくかつ前記パルス持続時間が１ミリ秒より大きい請求項１～４のいずれか一つに記載の装置。
  6. 　前記パルス持続時間が１０ミリ秒以上である請求項５に記載の装置。
  7. 　前記直流電流の間歇的な間隔が５５０ｐｐｓより大きくかつ前記パルス持続時間が０．１ミリ秒より大きい請求項１～４のいずれか一つに記載の装置。
  8. 　前記直流電流の間歇的な間隔が５５００ｐｐｓ以上である請求項７に記載の装置。
  9. 　請求項１～８のいずれか一つに記載の装置を用いた治療装置。
  10. 　さらに、生体又は生体組織の異なる部位の表面に付着する導電性の１対のパッド
    を備え、
    前記電流制御手段は、さらに前記１対のパッド間に間欠的に微弱な直流電流を生じさせるように構成されている、請求項１～９のいずれか一つに記載の装置。
  11. 　前記炎症が、全身性自己免疫疾患又は臓器特異性自己免疫疾患より選ばれる疾患に基づく請求項１～１０のいずれか一つに記載の装置。
  12. 　全身性自己免疫疾患又は臓器特異性自己免疫疾患より選ばれる疾患に基づく炎症の治療のために用いられる請求項１～１０のいずれか一つに記載の装置。
  13. 　免疫抑制剤が投与されている患者に使用される請求項１～１０のいずれか一つに記載の装置。
PCT/JP2016/080443 2015-10-14 2016-10-13 炎症及び過剰免疫を抑制する装置、並びに炎症及び過剰免疫を抑制するための方法 WO2017065239A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/768,253 US11135425B2 (en) 2015-10-14 2016-10-13 Device for suppressing inflammation and hyperimmunity, and method for suppressing inflammation and hyperimmunity
EP16855492.1A EP3363494B1 (en) 2015-10-14 2016-10-13 Device for suppressing inflammation and hyperimmunity, and method for suppressing inflammation and hyperimmunity
JP2017545471A JP6740531B2 (ja) 2015-10-14 2016-10-13 炎症及び過剰免疫を抑制する装置、並びに炎症及び過剰免疫を抑制するための方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-203033 2015-10-14
JP2015203033 2015-10-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017065239A1 true WO2017065239A1 (ja) 2017-04-20

Family

ID=58517357

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/080443 WO2017065239A1 (ja) 2015-10-14 2016-10-13 炎症及び過剰免疫を抑制する装置、並びに炎症及び過剰免疫を抑制するための方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11135425B2 (ja)
EP (1) EP3363494B1 (ja)
JP (1) JP6740531B2 (ja)
WO (1) WO2017065239A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118454103A (zh) * 2018-04-19 2024-08-09 艾奧塔生物科技公司 用于调节脾神经活动的使用超声通信的植入物
CN112272575B (zh) 2018-04-19 2024-05-17 艾奧塔生物科技公司 使用用于神经感测和刺激的超声通信的植入物
PT3843830T (pt) 2018-08-29 2024-06-21 Iota Biosciences Inc Dispositivo implantável de neuromodulação de ciclo fechado
BR112022007324A2 (pt) * 2019-10-17 2022-07-05 Iota Biosciences Inc Dispositivos ou métodos para modular atividade de sistema imunológico em um paciente com câncer ou tratar câncer

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08131560A (ja) * 1994-11-08 1996-05-28 Poritoronikusu:Kk 抗アレルギー性皮接治療器
US6535767B1 (en) * 2001-08-21 2003-03-18 James W. Kronberg Apparatus and method for bioelectric stimulation, healing acceleration and pain relief
WO2003080179A1 (fr) * 2002-03-27 2003-10-02 Nippon Sigmax Co., Ltd. Dispositif de regulation de cytokines, dispositif de traitement et procede de traitement
JP2008525102A (ja) * 2004-12-27 2008-07-17 ノース ショア−ロング アイランド ジューウィッシュ リサーチ インスティテュート 電気的な迷走神経刺激による炎症性障害の処置

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140046407A1 (en) 2001-08-31 2014-02-13 Bio Control Medical (B.C.M.) Ltd. Nerve stimulation techniques
US7689277B2 (en) * 2002-03-22 2010-03-30 Leptos Biomedical, Inc. Neural stimulation for treatment of metabolic syndrome and type 2 diabetes
US20050075702A1 (en) * 2003-10-01 2005-04-07 Medtronic, Inc. Device and method for inhibiting release of pro-inflammatory mediator
US8868177B2 (en) * 2009-03-20 2014-10-21 ElectroCore, LLC Non-invasive treatment of neurodegenerative diseases
JP5148254B2 (ja) * 2007-11-28 2013-02-20 つちやゴム株式会社 生体組織正常化装置、及び、治療装置
US8233987B2 (en) * 2009-09-10 2012-07-31 Respicardia, Inc. Respiratory rectification
WO2011155089A1 (ja) * 2010-06-07 2011-12-15 国立大学法人電気通信大学 電気刺激装置及び電気刺激方法
CN103534922B (zh) * 2011-03-31 2016-09-21 株式会社特瑞君思半导体 电动机驱动用逆变器
WO2013172935A2 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Hui Tang Intra-oral balance device based on palatal stimulation
WO2014083203A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Hitops Gmbh New modus operandi of pulsed radio frequency
US20190224481A1 (en) * 2013-08-27 2019-07-25 Halo Neuro, Inc. Method and system for providing electrical stimulation to a user

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08131560A (ja) * 1994-11-08 1996-05-28 Poritoronikusu:Kk 抗アレルギー性皮接治療器
US6535767B1 (en) * 2001-08-21 2003-03-18 James W. Kronberg Apparatus and method for bioelectric stimulation, healing acceleration and pain relief
WO2003080179A1 (fr) * 2002-03-27 2003-10-02 Nippon Sigmax Co., Ltd. Dispositif de regulation de cytokines, dispositif de traitement et procede de traitement
JP2008525102A (ja) * 2004-12-27 2008-07-17 ノース ショア−ロング アイランド ジューウィッシュ リサーチ インスティテュート 電気的な迷走神経刺激による炎症性障害の処置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RYOSUKE FUKUDA ET AL.: "Mild Electrical Stimulation at 0.1-ms Pulse Width Induces p53 Protein Phosphorylation and G2 Arrest in Human Epithelial Cells", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 288, 18 April 2013 (2013-04-18), pages 16117 - 16126, XP002727608 *
See also references of EP3363494A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190022384A1 (en) 2019-01-24
JPWO2017065239A1 (ja) 2018-08-09
JP6740531B2 (ja) 2020-08-19
EP3363494A4 (en) 2019-07-24
EP3363494B1 (en) 2021-08-04
EP3363494A1 (en) 2018-08-22
US11135425B2 (en) 2021-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210069503A1 (en) Methods for Reducing Viability of Cancer Cells by Activation of the STING Pathway with TTFields
Liebetanz et al. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats
Dang et al. Autophagy regulates the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis
Kovacic et al. Electromagnetic fields: mechanism, cell signaling, other bioprocesses, toxicity, radicals, antioxidants and beneficial effects
WO2017065239A1 (ja) 炎症及び過剰免疫を抑制する装置、並びに炎症及び過剰免疫を抑制するための方法
Liebetanz et al. Anticonvulsant effects of transcranial direct‐current stimulation (tDCS) in the rat cortical ramp model of focal epilepsy
Jurna et al. Central effect of the non-steroid anti-inflammatory agents, indometacin, ibuprofen, and diclofenac, determined in C fibre-evoked activity in single neurones of the rat thalamus
Zhu et al. Mitochondrial regulation and white adipose tissue homeostasis
Vo et al. Down-regulation of histamine-induced endothelial cell activation as potential anti-atherosclerotic activity of peptides from Spirulina maxima
Ross et al. The regenerative effects of electromagnetic field on spinal cord injury
Morotomi-Yano et al. Nanosecond pulsed electric fields act as a novel cellular stress that induces translational suppression accompanied by eIF2α phosphorylation and 4E-BP1 dephosphorylation
Mair et al. Memory enhancement with event-related stimulation of the rostral intralaminar thalamic nuclei
Schabrun et al. New insight into the time-course of motor and sensory system changes in pain
Babona-Pilipos et al. Biphasic monopolar electrical stimulation induces rapid and directed galvanotaxis in adult subependymal neural precursors
Zhang et al. Anticonvulsant effect of unilateral anterior thalamic high frequency electrical stimulation on amygdala-kindled seizures in rat
Krueger et al. Effects of low-intensity electrical stimulation and adipose derived stem cells transplantation on the time-domain analysis-based electromyographic signals in dogs with SCI
Namvar et al. The antiepileptogenic effect of low-frequency stimulation on perforant path kindling involves changes in regulators of G-protein signaling in rat
Nojima et al. Combination of static magnetic fields and peripheral nerve stimulation can alter focal cortical excitability
Qi et al. Low‐Intensity Ultrasound Causes Direct Excitation of Auditory Cortical Neurons
Tafreshi et al. Inactive GSK3β is disturbed in the spinal cord during experimental autoimmune encephalomyelitis, but rescued by stem cell therapy
Arsenault et al. A novel combinational approach of microstimulation and bioluminescence imaging to study the mechanisms of action of cerebral electrical stimulation in mice
Bi et al. Regulation of skeletal myogenesis in C2C12 cells through modulation of Pax7, MyoD, and myogenin via different low-frequency electromagnetic field energies
Scarponi et al. Low‐Frequency Low‐Intensity Ultrasounds Do Not Influence the Survival and Immune Functions of Cultured Keratinocytes and Dendritic Cells
Meynial-Denis Sarcopenia: Molecular, Cellular, and Nutritional Aspects
TWI815047B (zh) 藉由使用TTFields活化STING途徑以降低癌細胞生存力的方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16855492

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017545471

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2016855492

Country of ref document: EP