JP6740531B2 - 炎症及び過剰免疫を抑制する装置、並びに炎症及び過剰免疫を抑制するための方法 - Google Patents
炎症及び過剰免疫を抑制する装置、並びに炎症及び過剰免疫を抑制するための方法 Download PDFInfo
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Description
(1)(直流電流を所定の間隔で間歇的に印加することにより生じる)微弱なパルス電流を生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における炎症を抑制する装置であって、
電力供給手段と
電力の供給を受けて直流電流を所定の間隔で間欠的に印加するための電流制御手段と、
を備え、
該電流制御手段はパルス幅変調制御手段を含み、
該パルス幅変調制御手段は、パルス波が矩形波であり、そして、当該パルス波の1周期における立ち上がりのピーク値を示す時間(以下、「パルス持続時間」という)が0.1ミリ秒以上であり、当該ピーク値が1.0V以上20V以下(好ましくは、2.0V以上18V以下、より好ましくは3.0V以上、15V以下)であり、当該パルス波のDuty比が5.5%以上であるパルス波(パルス電流)を発生するように構成されていることを特徴とする装置。
(2)前記炎症が炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が、該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記(1)に記載の装置。
(3)前記炎症がIL−2、IL−6、TNF−α、INF−γのいずれか一以上の炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記(2)に記載の装置。
(4)前記炎症性サイトカインがIL−2である上記(3)に記載の装置。
(5)前記直流電流の間歇的な間隔が55ppsより大きくかつ前記パルス持続時間が1ミリ秒より大きい上記(1)〜(4)のいずれか一つに記載の装置。
(6)前記パルス持続時間が10ミリ秒以上である上記(5)に記載の装置。
(7)前記直流電流の間歇的な間隔が550ppsより大きくかつ前記パルス持続時間が0.1ミリ秒より大きい上記(1)〜(4)いずれか一つに記載の装置。
(8)前記直流電流の間歇的な間隔が5500pps以上である上記(7)に記載の装置。
(9)上記(1)〜(8)のいずれか一つに記載の装置を用いた治療装置。
(10)さらに、生体又は生体組織の異なる部位の表面に付着する導電性の1対のパッドを備え、
前記電流制御手段は、さらに前記1対のパッド間に間欠的に微弱な直流電流を生じさせるように構成されている、上記(1)〜(9)のいずれか一つに記載の装置。
(11)前記炎症が、全身性自己免疫疾患(関節性リウマチなど)、臓器特異性自己免疫疾患(乾癬、脱毛など)からなる群より選ばれる疾患に基づく上記(1)〜(10)のいずれか一つに記載の装置。
(12)全身性自己免疫疾患(関節性リウマチなど)、臓器特異性自己免疫疾患(乾癬、脱毛など)からなる群より選ばれる疾患に基づく炎症の治療のために用いられる上記(1)〜(10)のいずれか一つに記載の装置。
(13)免疫抑制剤が投与されている患者に使用される上記(1)〜(10)のいずれか一つに記載の装置。
[1](直流電流を所定の間隔で間歇的に印加することにより生じる)微弱なパルス電流を生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における炎症を抑制する方法であって、印加される入力電流のパルス波形が矩形波であり、当該パルス波の1周期における立ち上がりのピーク値を示す時間(以下、「パルス持続時間」という)が0.1ミリ秒以上であり、当該ピーク値が1.0V以上20V以下(好ましくは、2.0V以上18V以下、より好ましくは3.0V以上、15V以下)であり、当該パルス波(パルス電流)のDuty比が5.5%以上であることを特徴とする生体組織の炎症を抑制する方法。
[2]前記炎症が炎症性サイトカイン産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記[1]に記載の方法。
[3]前記炎症がIL−2、IL−6、TNF−α、INF−γのいずれか一以上の炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記[1]に記載の方法。
[4]前記炎症性サイトカインがIL−2である上記[3]に記載の方法。
[5]前記直流電流の間歇的な間隔が55ppsより大きくかつ前記パルス持続時間が1ミリ秒より大きい上記[1]〜[4]のいずれか一つに記載の方法。
[6]前記パルス持続時間が10ミリ秒以上である上記[5]に記載の方法。
[7]前記直流電流の間歇的な間隔が550ppsより大きくかつ前記パルス持続時間が0.1ミリ秒より大きい上記[1]〜[4]のいずれか一つに記載の方法。
[8]前記直流電流の間歇的な間隔が5500pps以上である上記[7]に記載の方法。
[9]前記炎症が、全身性自己免疫疾患(関節性リウマチなど)、臓器特異性自己免疫疾患(乾癬、脱毛など)からなる群より選ばれる疾患に基づく上記[1]〜[8]のいずれか一つに記載の方法。
[10]全身性自己免疫疾患(関節性リウマチなど)、臓器特異性自己免疫疾患(乾癬、脱毛など)からなる群より選ばれる疾患に基づく炎症の治療のための上記[1]〜[8]のいずれか一つに記載の方法。
[11]免疫抑制剤が投与されている患者の炎症の治療のための上記[1]〜[8]のいずれか一つに記載の方法。
「1」直流電流を所定の間隔で間歇的に印加することにより生じる微弱なパルス電流であって、所定の間隔で間歇的に生体又は生体組織に適用(又は与え又は印加)し、当該生体又は生体組織における炎症を抑制する電流であって、印加される該電流は、矩形波のパルス波形を有し、当該パルス波の1周期における立ち上がりのピーク値を示す時間(以下、「パルス持続時間」という)が0.1ミリ秒以上であり、当該ピーク値が1.0V以上20V以下(好ましくは、2.0V以上18V以下、より好ましくは3.0V以上、15V以下)であり、当該パルス波(パルス電流)のDuty比が5.5%以上であることを特徴とする微弱パルス直流電流。
「2」前記Duty比が50%以上である微弱パルス直流電流又はその使用
[3]前記炎症が炎症性サイトカイン産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が、該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記「1」又は[2]に記載の微弱パルス電流又はその使用。
「4」前記炎症がIL−2、IL−6、TNF−α、INF−γのいずれか一以上の炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が、該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく上記「3」に記載の微弱パルス電流又はその使用。
「5」前記炎症性サイトカインがIL−2である上記「4」に記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「6」前記生体又は組織に適用する間歇的な間隔が55ppsより大きくかつ前記パルス持続時間が1ミリ秒より大きい上記「1」〜「5」のいずれか一つに記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「7」前記パルス持続時間が10ミリ秒以上である上記「6」に記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「8」前記生体又は組織に適用する間歇的な間隔が550ppsより大きくかつ前記パルス持続時間が0.1ミリ秒より大きい上記「1」〜「5」のいずれか一つに記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「9」前記生体又は組織に適用する間歇的な間隔が5500pps以上である上記「8」に記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
「10」前記炎症が、全身性自己免疫疾患(関節性リウマチなど)、臓器特異性自己免疫疾患(乾癬、脱毛など)からなる群より選ばれる疾患に基づく上記「1」〜「9」のいずれか一つに記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
[11]全身性自己免疫疾患(関節性リウマチなど)、臓器特異性自己免疫疾患(乾癬、脱毛など)からなる群より選ばれる疾患に基づく炎症の治療のために用いられる上記[1]〜[9]のいずれか一つに記載の微弱パルス直流電流又はその使用。
1.実験装置モデル
培養細胞を用いた、インビトロ実験で用いる装置のモデル図を図2に示す。図中のMESは、低電圧パルス電流(MES)発生装置を示す。プラスチック培養皿の蓋に電極用の穴を開け、電極コードを通して電極を培養液に浸した。電極は、つちやゴム(株)社製の赤外線を発生する電磁波シールドゴムを用いた。側面をテープで覆い、37℃の恒温槽につけることで温度を一定に保った。処置時間は、通常、10分間とした。
ATCCより入手したヒト急性T細胞性白血病細胞株Jurkat細胞、ATCCより入手したマウスミクログリア細胞株BV2を用い、RPMI−1640(Wako)を基礎培養液として培養した。細胞は、3 ×106 cells/mLを超えない細胞数で、静置培養した。実験では無血清の培養液を用い、細胞死は、Trypan blue染色により確認した。
35 mmのプラスチック培養皿にJurkat細胞(或いは、BV2細胞)を3〜5×106 cells/dishの割合で播種し、実験を行った。MESを、37℃で、10分間で処置し、直後にT細胞活性化薬を処理し、37℃で3時間培養した後、全RNAの抽出をRNAiso plus(登録商標)(Takara)を用いて、製造元のプロトコールに従って行った。
培養細胞から抽出した全RNAを用いてRT−PCRを行った。RT反応にはPrimeScript(登録商標)RT reagent Kit (Perfect real time)(Takara)もしくはPrimeScript(登録商標)RT Master Mix (Perfect real time)(Takara)を、PCR反応にはSYBR(登録商標)Premix EX TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(Takara)を用いた。また、サンプル間のmRNAの発現量を比較するために、インターナルコントロールとしてβ−actinを用いた。方法は、製造元のプロトコールに従って行った。条件は、以下の通りである:逆転写反応(37℃:30分間,85℃:10秒間)、PCR反応(95℃:3分間,[95℃:10分間,60℃:1分間]x40cycles/増幅反応,65〜95℃:10秒間/融解反応)。プライマー(センス配列、アンチセンス配列)は、ヒトIL−2,ヒトINF−γ,ヒトIL−10,ヒトCCL−3,ヒトTRAF−1,β−アクチンを用いた。
3と同様の条件で培養した後、常法に従い、タンパク質を回収し、BCA法によりタンパク質定量を行い、各サンプルのタンパク質量を一定にした。
3と同様の条件で培養した後、常法に従い、核タンパク質を回収し、Bradford法によりタンパク質定量を行い,各サンプルのタンパク質量を一定にした.
培養細胞から抽出したタンパク質をサンプルとして用いて、各サンプルのタンパク質量を一定にし、常法に従い、ウェスタンブロット法を行った。用いた一次抗体及び二次抗体を、以下に示す。
1次抗体:Rabbit anti-phospho-IκB-α (Ser32), Rabbit anti-IκB-α, Mouse anti-NF-κB p65, Mouse anti-NF-κB p50, Rabbit anti-NFAT1, Rabbit anti-phospho-AMPK-α
(Thr172), Rabbit anti-AMPK-α, Rabbit anti-phospho-JNK (Thr183/Tyr185), Rabbit anti-JNK, Rabbit anti-phospho-p38 (Thr180/Tyr182), Rabbit anti-p38, Rabbit anti-phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr185), Rabbit anti-ERK1/2 はCell signaling Technology, Inc から, Mouse Ubiquitinated protein はBIOMOL, Inc から, Goat anti-β-actin, Goat anti-γ-tubulin はSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, Inc からそれぞれ購入した。
二次抗体:Anti-rabbit IgG-HRP, Anti-mouse IgG-HRP, Anti-goat IgG-HRP は Jackson Immuno Research LABORATORIES, Inc からそれぞれ購入した。
35 mmのプラスチック培養皿にJurkat細胞を3×106 cells/dishの割合で播種し、実験を行った。MESを37℃、10分間で処置し、直後にT細胞活性化薬を処理し、37℃で24時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離(4℃,12,000rpm,10分間)を行った。その上清に1% v/v Protease inhibitor cocktailを加え、サンプルとした。ELISA法を用いて、サイトカインの産生を定量した。
(1)交流電流(MAES)と直流電流(MDES)の効果
微弱電流(mild electrical stress:MES)が免疫細胞に直接的に作用することで炎症性サイトカインの産生を抑制するかを検討した。T細胞が産生する主な炎症性サイトカインの一種であり、免疫抑制薬の標的分子にもされているIL−2に着目し、IL−2産生誘導薬としてPKCの活性化薬であるPMA(Phorbol 12−myristate 13−acetate)とカルシウムイオノフォアであるIonomycin(Io)を用いた。電流は、時間と共に周期的に大きさと向きが変化する交流電流(MAES)と時間により大きさが変化しても流れる方向(正負)が変化しない直流電流(MDES)の2種類に大別されるので、これらの電流条件の違いがIL−2の産生抑制効果に影響を及ぼすか否かを検討した。
直流電流の波形にはパルス直流電流(MPES)も存在するので、次いで、MPESが免疫細胞に直接的に作用することで炎症性サイトカイン産生を抑制するか否か検討した。パルス直流電流として、パルス持続時間0.1 msの矩形波を1秒間に55回与える(55 pps)条件(Duty比=0.55%)を用いた。MES以外は、上記と同じ条件で行い、IL−2 mRNAの発現量を比較した。結果を図4に示す。その結果、PMA/Ioにより誘導されたIL−2産生に対してMPES(0.1ms、55 pps)は有意な抑制効果を示さなかった。
次に、パルス持続時間の検討を行った。上記同様にしてIL−2 mRNAの発現量を比較した。但し、MESは、パルス持続時間 1 ms,10 msのMPES(6Vp−p,55pps)(それぞれ、Duty比=5.5%、55%)もしくはMDES(duration:∞)(Duty比=100%)を用いた。結果を図5に示す。その結果、パルス持続時間が長い(10 ms)条件において、PMA/Ioにより誘導されたIL−2産生に対するより顕著な抑制効果が認められた。
次いで、1秒間あたりのパルス回数について検討した。上記同様にしてIL−2 mRNAの発現量を比較した。但し、MESは、パルス波数 550 pps,5500 ppsのMPES(6 Vp−p,0.1ms)(それぞれ、Duty比=5.5%、55%)、もしくはMDES(pulse rate:∞)(Duty比=100%)用いた。結果を図6に示す。その結果、1秒間あたりのパルス回数が多い(5500 pps)条件において、PMA/Ioにより誘導されたIL−2産生に対するより顕著な抑制効果が認められた。
さらに、MDESによるIL−2産生抑制効果に対する電圧の大きさの影響を検討した。上記同様にしてIL−2 mRNAの発現量を比較した。但し、3Vもしくは6V,37℃,10分間の条件でMDES処置を行った。結果を図7に示す。その結果、MDESによるIL−2産生抑制効果は電圧依存的に認められた。また、予備的な検討ではあるが、9VのMDESは6VのMDESと同程度のIL−2産生抑制効果を示した(データ示さず)。
MDESによるIL−2産生抑制効果がタンパク質レベルでも認められるかを検討した。上記と同様にして細胞を培養し、24時間培養後に細胞培養液を回収しELISA法を用いて細胞培養液中に分泌されたIL−2タンパク質量を比較した。結果を図8に示す。その結果、MDESはPMA/Io誘導性IL−2産生をタンパク質レベルでも抑制した。
一般的に生体内のT細胞は、抗原提示細胞によりTCR/CD3複合体及びCD28が刺激されることで活性化する。そこで、TCR/CD3複合体及びCD28を刺激した際に誘導されるIL−2産生に対してもMDESが抑制効果を示すか検討した。刺激には、1μg/mlの抗ヒトCD3抗体と1μg/mlの抗ヒトCD28抗体(CD3/CD28)を用いた。
Jurkat細胞を35 mm dishに4×106 cells/dishの割合で播種し、3Vもしくは6V,37℃,10分間の条件で、MDES処置を行った。MDES処置直後にCD3/CD28を処理し、37℃で3時間培養後、全RNAを回収し、定量的RT−PCR法によりIL−2 mRNAの発現量を比較した。結果を図9に示す。その結果、CD3/CD28刺激下でもMDESはIL−2産生を電圧依存的に抑制した。
IL−2以外のT細胞活性化薬誘導性のサイトカイン、ケモカイン産生に対するMDESの抑制効果を検討した。Jurkat細胞を35 mm dishに4×106 cells/dishの割合で播種し、6V,37℃,10分間の条件で、MDES処置を行った。処置直後にPMA/IoもしくはCD3/CD28を処理し、37℃で3時間培養後、全RNAを回収し、定量的RT−PCR法により各mRNAの発現量を比較した。結果を図10に示す。その結果、MDESは、TNF−α,IFN−γ,TRAF1,CCL3などIL−2以外のサイトカインやケモカイン産生を、抑制もしくは抑制傾向にあることが示された。従って、MDESは、包括的に炎症性サイトカイン産生を抑制していることが示唆された。
現在臨床で使用されている免疫抑制薬にはCsAやFK506がある。これらの薬物はカルシニューリンを強力に阻害することで、IL−2の転写因子であるNFATの活性化を抑制する。そこで、MDESとこれらの免疫抑制薬の有用性を比較するため、IL−2産生抑制効果の程度を指標として検討を行った。それぞれの免疫抑制薬の濃度は、TCR刺激誘導性IL−2産生を効果的に抑制するが,定常状態、活性化状態のT細胞に対するアポトーシス誘導など細胞傷害性は認められない濃度域内(0.1μM〜1μM)とした。
HSが免疫細胞に直接的に作用することで炎症性サイトカインの産生を抑制するか検討した。Jurkat細胞を35 mm dishに3×106 cells/dishの割合で播種し、42℃,10分間の条件でHS処置を行った。HS処置直後にPMA/Ioを処理し、37℃で3時間培養後、全RNAを回収し、定量的RT−PCR法によりIL−2 mRNAの発現量を比較した。結果し図12に示す。その結果、HSはPMA/Io誘導性IL−2産生を抑制した。
コンカナバインAは、T細胞を活性化し、T細胞由来のIL−2,INF−γその他のサイトカインの産生を誘導する。コンカナバインAを投与したモデルでは、これらのサイトカインが肝臓や脾臓に蓄積し、炎症を引き起こす。
Duty比が特定に数値以上のMPESが、コンカナバインA投与マウスモデルの脾臓及び肝臓における炎症性サイトカインの産生を抑制するかを検討した。BALB/cマウスを、4V/cm,20分間の条件でMPES(duration:0.1 ms;5500 pps)(Duty比=55%)処置した。その後、1mg/kgの量にてコンカナバインA(ConA)を静脈内投与し、マウスを再び同条件でMES処置した。MES処置の4時間後に、マウスの脾臓と肝臓から全RNAを抽出し、定量的RT−PCR法によりIL−2,IL−6,IFN−γ,及びTNF−αの発現量を比較した。ConAの対照としてPBSを用いた。結果を図14に示す(上段:脾臓;下段:肝臓)。その結果、MESはサイトカインの産生を抑制した。また、ConA投与の8時間後の脾臓及び肝臓の組織切片のH&E染色を行ったところ、MESは炎症の改善を示した(データ示さず)。これにより、MESは、ConA誘導の炎症を改善した。
BV2細胞を35 mm dishに5×106 cells/dishの割合で播種し、6V,37℃,10分間の条件で、MES処置を行った。MES処置は、MPES(6V、0.1 ms、55 pps又は5500 pps)(それぞれ、Duty比=0.55%又は55%)で行った。MES処置30分後に、LPS(100 ng/ml)で処理をし、37℃で4時間培養後、全RNAを回収し、定量的RT−PCR法によりIL−1β及びIL−6のmRNAの発現量を比較した。結果を図16に示す。MES5500 ppsは、炎症性サイトカイン産生を有意に抑制した。
201・・操作部
201・・電流制御部
203・・表示部
204・・パッド
205・・電極
Claims (12)
- 微弱なパルス電流を生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における炎症を抑制する装置であって、
電力供給手段と
電力の供給を受けて直流電流を所定の間隔で間欠的に印加するための電流制御手段と、
を備え、
該電流制御手段はパルス幅変調制御手段を含み、
該パルス幅変調制御手段は、パルス波が矩形波であり、そして、当該パルス波の1周期における立ち上がりのピーク値を示す時間(「パルス持続時間」)が0.1ミリ秒以上であり、当該ピーク値が1.0V以上20V以下であり、当該パルス波のDuty比が55%以上であるパルス波を発生するように構成されていることを特徴とする装置。 - 前記炎症が炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が、該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく請求項1に記載の装置。
- 前記炎症がIL−2、IL−6、TNF−α、INF−γのいずれか一以上の炎症性サイトカインの産生により生じる炎症であり、前記炎症抑制が該炎症性サイトカインの産生抑制に基づく請求項2に記載の装置。
- 前記炎症性サイトカインがIL−2である請求項3に記載の装置。
- 前記直流電流の間歇的な間隔が55pps以上でかつ前記パルス持続時間が10ミリ秒以上である請求項1〜4のいずれか一つに記載の装置。
- 前記直流電流の間歇的な間隔が550pps以上でかつ前記パルス持続時間が1ミリ秒以上である請求項1〜4のいずれか一つに記載の装置。
- 前記直流電流の間歇的な間隔が5500pps以上である請求項1〜4のいずれか一つに記載の装置。
- 請求項1〜8のいずれか一つに記載の装置を用いた治療装置。
- さらに、生体又は生体組織の異なる部位の表面に付着する導電性の1対のパッド
を備え、
前記電流制御手段は、さらに前記1対のパッド間に間欠的に微弱な直流電流を生じさせるように構成されている、請求項1〜9のいずれか一つに記載の装置。 - 前記炎症が、全身性自己免疫疾患又は臓器特異性自己免疫疾患より選ばれる疾患に基づく請求項1〜10のいずれか一つに記載の装置。
- 全身性自己免疫疾患又は臓器特異性自己免疫疾患より選ばれる疾患に基づく炎症の治療のために用いられる請求項1〜10のいずれか一つに記載の装置。
- 免疫抑制剤が投与されている患者に使用される請求項1〜10のいずれか一つに記載の装置。
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