TWI815047B - 藉由使用TTFields活化STING途徑以降低癌細胞生存力的方法 - Google Patents
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Abstract
癌細胞（例如，神經膠母細胞瘤細胞）之生存力可藉由向該等癌細胞施加頻率介於100與500 kHz之間的交流電場約3至10天及向該等癌細胞投予查核點抑制劑來降低。
Description
本發明係關於藉由向癌細胞施加頻率在100至500kHz之間的交流電場並向癌細胞投予查核點抑制劑來降低癌細胞生存力。
本申請案主張2019年9月10日申請之美國臨時專利申請案第62/898,290號之權益，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
本文中引用之所有專利、專利申請案及公開案均全部以全文引用之方式併入本文中。
腫瘤治療場(Tumor Treating Fields；TTFields)為經由非侵入性施加低強度、中頻(例如，100-500kHz)交流電場遞送的有效抗贅生性治療模式。TTFields在極性微管上施加定向力且干擾有絲分裂紡錘體之正常組裝。對微管動力學之此類干擾引起異常紡錘體形成及後續有絲分裂阻滯或延遲。細胞可能在有絲分裂阻滯中時死亡或進展至細胞分裂，從而引起正常或異常非整倍體後代之形成。四倍體細胞之形成可能由於有絲分裂經由滑脫退出而發生或可能在不
當的細胞分裂期間發生。異常子細胞可能在後續分裂間期中死亡，可能經歷永久性遏止，或可能經由額外有絲分裂增殖，其中其將經受進一步TTFields攻擊。Giladi M等人Sci Rep.2015；5：18046。
在活體內情形中，可使用可穿戴式及可攜式裝置(Optune®)遞送TTFields療法。遞送系統包括電場產生器、4個黏性貼片(非侵入性、絕緣轉換器陣列)、可充電電池及一裝載箱。將轉換器陣列施加至皮膚且連接至裝置及電池。療法經設計以在整個白天及夜晚中儘可能長時間佩戴。
在臨床前環境中，可使用例如InovitroTM TTFields實驗室實驗台系統試管內施加TTFields。InovitroTM包括TTFields產生器及每板含有8個陶瓷盤的底板。將細胞塗覆在置放於各盤內部的蓋玻片上。在各盤中使用由高介電常數陶瓷絕緣的兩個垂直的轉換器陣列對施加TTFields。使各盤中TTFields之定向每1秒切換90°，由此覆蓋細胞分裂之不同定向軸。
最近，將免疫感測分子環狀GMP-AMP合酶(cGAS)-干擾素基因刺激蛋白(STING，由TMEM 173編碼)途徑鑑別為胞質DNA感測之重要組分且在調節細胞之免疫反應中起重要作用。Ghaffari等人，British Journal of Cancer，第119卷，第440-449頁(2018)；參見例如圖3。STING途徑之活化藉由對細胞中之異常(例如，存在細胞質雙股DNA(dsDNA))作出反應而介導免疫反應。
查核點蛋白質充當其可導引的免疫系統之抑制劑(例如，T細胞增殖及IL-2產生)。Azoury等人，Curr Cancer Drug Targets.2015；15(6)：452-62。藉由停止免疫反應，查核點蛋白質可能對癌症具有不利的影響。阻斷查核點蛋白質之功能可用於活化休眠T細胞以攻擊癌細胞。查核點抑制劑為抑制查核點蛋白質以便募集(recruit)免疫系統以攻擊癌細胞的癌症藥物。
因此，關注於使用查核點抑制劑作為癌症治療以阻斷查核點蛋白質之活性，從而使得能夠產生細胞介素且募集T細胞以攻擊癌細胞且為免疫療法
藥物開發的活躍領域。
需要用於活化免疫反應且增加並刺激對癌症治療，諸如查核點抑制劑之反應的方法。
本文中描述之方法藉由以介於100與500kHz之間的頻率向癌症施加交流電場3天且向癌細胞投予查核點抑制劑來降低癌細胞生存力。在3天內可連續地或間斷地向癌細胞施加交流電場。在另一態樣中，可在3天中之每一天，每天向癌細胞施加交流電場至少4個小時或在3天中之每一天，每天向癌細胞施加交流電場至少6個小時。
如本文中所描述，將癌細胞(例如，神經膠母細胞瘤細胞)暴露於TTFields誘導STING途徑，從而引起促炎性細胞介素(例如，I型干擾素)之產生及細胞焦亡(pyroptosis)。在一個態樣中，用TTFields活化STING途徑類似於「接種」癌細胞，從而使得癌細胞尤其易受用抗癌藥(諸如查核點抑制劑)進行治療的影響。因此，將癌細胞連續地、間斷地或間歇地暴露於TTFields可使得癌細胞易受藉由誘導STING途徑，隨後用一或多種查核點抑制劑及/或其他腫瘤學藥物治療進行進一步治療的影響。
[圖1]示出TTFields可誘導暴露於TTFields的神經膠母細胞瘤(GBM)細胞(TTFields)相對於對照GBM細胞(對照組)中的細胞質微核(雙股DNA或dsDNA)之形成；[圖2]示出核片層蛋白B1結構在暴露於TTFields之後經破壞，從而使得將dsDNA釋放至LN827細胞中之細胞質中；
[圖3]示出由細胞質dsDNA誘導的生物化學途徑(促炎性(STING)及細胞焦亡途徑)之一實例；[圖4]示出cGAS及AIM2回應於暴露於TTFields而獨立地與微核共定位。
[圖5]提供來自圖4之結果的與微核共定位的AIM2/cGAS之百分比之圖表；[圖6]示出在U87及LN827細胞中在暴露於TTFields一天之後IRF3及p65之磷酸化；[圖7]示出TTFields誘導I型IFN反應及STING下游之促炎性細胞介素；[圖8]示出在GBM細胞(LN428人類細胞及KR158小鼠細胞)中STING係在藉由TTFields活化之後降解；[圖9]示出在GBM細胞(LN428人類細胞、KR158小鼠細胞及F98大鼠細胞)中STING係由dsDNA及TTFields治療誘導之發炎反應所需要的；[圖10]示出在KR158及F98 GBM細胞中自噬及dsDNA或TTFields協同地誘導STING依賴性促炎性反應；[圖11]示出在F98大鼠神經膠瘤模型中TTFields誘導之發炎性細胞介素產生係視STING及AIM2而定；[圖12]示出腫瘤大小係與回應於TTFields的發炎性細胞介素表現之倍數變化相互關聯；[圖13]提供例示性熱圖，其展示在F98大鼠神經膠瘤模型中，CD45細胞向GBM中之募集在缺乏STING及AIM2之GBM中較低；[圖14]提供例示性熱圖，其展示CD3(T細胞)募集在缺乏STING及AIM2之GBM中較低；
[圖15]提供例示性熱圖，其展示在缺乏STING及AIM2之GBM中，DC/巨噬細胞募集較低且MDSC募集較高；[圖16]提供圖17中之資料之定量結果；[圖17]示出在人類GBM細胞株LN308及LN827中由暴露於TTFields三天誘導之『鬼影(ghosting)』；[圖18]示出在暴露於TTFields的U87 GBM細胞中TTFields誘導膜損壞且減少GSDMD；[圖19]示出在人類白血病單核球細胞株THP-1巨噬細胞中TTFields誘導膜損壞且裂解GSDMD；[圖20]示出暴露於TTFields 24小時之THP1-GFP PMA預處理細胞；[圖21]示出不暴露於TTFields之THP1-GFP PMA預處理對照細胞；[圖22]示出在暴露於TTFields 1天及3天之後，TTFields誘導細胞焦亡依賴性凋亡蛋白酶-1活化；[圖23]示出在暴露於TTFields 1天及3天之後，TTFields誘導之凋亡蛋白酶-1活化及細胞焦亡與較低含量之全長IL-1 β及較高LDH釋放一致；[圖24]示出在TTFields治療已結束之後，TTFields誘導之STING/AIM2活化及發炎性細胞介素產生保持至少3天；[圖25]示出短脈衝TTF誘導之STING/AIM2活性係與腫瘤生長減少及募集至頸深引流淋巴結之DC(樹突狀細胞)增加相關；及[圖26]示出在不具有AIM2之經TTFields治療之細胞中偵測到凋亡蛋白酶1。
儘管有侵襲性化學放射療法，但神經膠母細胞瘤(GBM)為成年人中的最常見及最致命的惡性腦癌。最近批准了與佐劑替莫唑胺化學療法組合的腫瘤治療場(TTFields)以用於新診斷的GBM患者。TTFields之添加引起總存活率之顯著改善。TTFields為干擾有絲分裂巨分子組裝，從而使染色體分離、完整性及穩定性遭破壞的低強度交流電場。在許多患者中，通常在TTFields治療過程的早期觀測到瘤周水腫增加的短暫階段，隨後為客觀的放射攝影反應，從而表明TTFields的治療功效之主要組分可為免疫介導之過程。然而，此等觀測結果的潛在機制仍不明確。
如本文中所描述，TTFields活化之微核-dsDNA感測器複合物引起：i)誘導細胞焦亡性的細胞死亡，如藉由特定LDH釋放分析所量測，及經由AIM2募集之凋亡蛋白酶1及細胞焦亡特異性消皮素D(Gasdermin D)之裂解；及ii)活化STING途徑組分，包括I型干擾素(IFN)，及NFkB途徑下游之促炎性細胞介素。參見例如圖3。骨髓細胞或脾細胞與獲自阻斷基因表現GBM細胞之上清液的共培養實驗中AIM2或STING或兩者之GBM細胞特異性shRNA消耗能夠逆轉免疫細胞之誘導。
使用試管內TTFields系統以臨床上批准之200kHz頻率用TTFields處理GBM細胞株。在一個態樣中，由於TTFields誘導之染色體不穩定性，24小時TTFields處理之GBM細胞具有顯著更高比率的微核結構釋放至細胞質中(19.9%相較於4.3%，p=0.0032)。相較於未經處理細胞中不存在共定位，幾乎40%之此等微核與兩個上游dsDNA感測器(不存在黑素瘤2(AIM2)及干擾素(IFN)誘導蛋白環狀GMP-AMP合酶(cGAS))共定位。此等結果證實TTFields活化GBM細胞中之免疫系統。
本文中描述之態樣提供藉由以介於100與500kHz之間的頻率向
癌細胞施加交流電場3至10天且向癌細胞投予查核點抑制劑來降低癌細胞生存力之方法。在3至10天內可連續地或間斷地向癌細胞施加交流電場。在另一態樣中，可在3至10天中之每一天，每天向癌細胞施加交流電場至少4個小時或在3至10天中之每一天，每天向癌細胞施加交流電場至少6個小時。可視需要向癌細胞施加交流電場3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天。在另一態樣中，可向癌細胞施加交流電場3-5、3-6、3-7、3-8、3-9或3-15天。
術語「降低癌細胞生存力」係指縮短、限制癌細胞保持存活之能力或對其具有負面影響。舉例而言，降低癌細胞之生長或再生速率會降低其生存力。
術語「投予查核點抑制劑」係指由保健專家向患者或在保健專家之照護下或作為經批准臨床試驗之部分，經由如管理機構在產品標籤上批准的任何適合及公認的投予途徑(例如，口服、靜脈內、非經腸、局部用等)向患者提供查核點抑制劑。開處查核點抑制劑亦可「投予」查核點抑制劑。
術語「連續地」係指施加交流電場持續實質上恆定時段。即使以較短時段(例如，秒)中斷施加以便適當地安置裝備或短暫斷電，仍可進行交流電場之連續施加。
術語「間斷地」係指在週期性中斷或斷掉數秒、數分鐘、一小時或更長時間的情況下施加交流電場持續一段時間。在此態樣中，患者可施加交流電場持續一段時間(例如，1、2、3或4小時)，其中15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時的時段無需施加交流電場。在另一態樣中，患者可在睡覺時連續地且在蘇醒時間斷地施加交流場。在另一態樣中，除在進餐時間期間或在社交事件期間外，患者可連續地施加交流電場。
在另一態樣中，在3至10天中之每一天，每天向癌細胞施加交流電場至少4或6個小時。
在另一態樣中，向癌細胞施加交流電場3天，隨後3天時段不向癌細胞施加交流電場，隨後3天時段向癌細胞施加交流電場。
在另一態樣中，每週至少3天向癌細胞施加交流電場。
在另一態樣中，在3至10天之第一時段向癌細胞施加交流電場，隨後在第二時段不施加交流電場。在另一態樣中，第二時段至少與第一時段相同。
此態樣可顯著改良患者之舒適度及便利性，此係因為用於施加TTFields之裝置可在患者在家或在睡覺時在更適宜連續地佩戴裝置時的時段期間由患者佩戴。在患者不想受醫療裝置妨礙的時段期間(例如，上作、鍛煉、參與社交活動)患者不一定要繼續佩戴裝置。
因此，患者將接受所需TTFields治療，隨後服用例如查核點抑制劑之丸劑，而無需繼續在公共或社交環境中佩戴裝置。與治療的遵從性將與患者舒適度一起得到改良。先前尚未揭示或提出如本文中所描述在治療週期期間中中斷使用TTFields。
在另一態樣中，以短脈衝向癌細胞施加交流電場。術語「短脈衝」係指向癌細胞施加之非連續交流電場，其中各脈衝具有例如小於5秒之期間。
癌細胞可選自由以下者組成之群：神經膠母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞、卵巢癌細胞、非小細胞肺癌(NSCLC)細胞及間皮瘤。在另一態樣中癌細胞為神經膠母細胞瘤細胞。
查核點抑制劑可選自例如由以下者組成之群：伊派利單抗(ipilimumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)及尼沃單抗(nivolumab)。
交流電場的頻率可介於180與220kHz之間。
在另一態樣中，向癌細胞投予查核點抑制劑之至少一部分在以介於100與500kHz之間的頻率向癌細胞施加交流電場3至10天停止之後進行。
另外的態樣提供藉由以介於100與500kHz之間的頻率向患有神經膠母細胞瘤的個體之頭部施加交流電場3天且向個體投予查核點抑制劑來治療神經膠母細胞瘤之方法。在3天內連續地或間斷地向個體施加交流電場。在另一態樣中，在3天中之每一天，每天向個體施加交流電場至少4個小時。查核點抑制劑可選自由以下者組成之群：伊派利單抗、派立珠單抗及尼沃單抗。交流電場的頻率可介於180與220kHz之間。
在另一態樣中，向個體投予查核點抑制劑之至少一部分在以介於100與500kHz之間的頻率向患有神經膠母細胞瘤的個體之頭部施加交流電場3至10天停止之後進行。
另外的態樣提供降低癌細胞生存力之方法，其包含以介於100與500kHz之間的頻率向癌細胞施加交流電場足以殺死約1-2%之癌細胞的時間；及向癌細胞投予查核點抑制劑。在一個態樣中，足以殺死約12%之癌細胞的時段為3、4、5、6、7、8、9或10天。
TTFields可誘導暴露於TTFields的細胞質微核GBM細胞之形成。圖1示出例示性實驗之結果，其中LN827細胞係經TTFields處理24小時且接著由4% PFA固定20min。將DAPI(4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚)(1：5000)染色劑在室溫下培育5分鐘以對核及微核進行染色。圖1(右側圖)示出具有微核之對照細胞(大約4%)相較於TTFields暴露之細胞(大約20%)的百分比。因此，TTFields誘導可誘導STING途徑的細胞質微核(dsDNA)之形成。
當小分子STING活化劑(例如，STING促效劑)為已知的且處於臨床開發中時(Ryan Cross,STING fever is sweeping through the cancer immunotherapy world.第96卷，第9 I期 第24-26頁，Chemical & Engineering News(2018年2月26日))，此等藥物可對患者具有顯著副作用。相比之下，TTFields幾乎無副作用且因此呈現安全及更舒適的小分子STING活化劑的替代例。
核片層蛋白B1結構在暴露於TTFields之後遭破壞，從而引起dsDNA釋放至LN827細胞之細胞質中。圖2示出經TTFields處理24小時、由4% PFA固定20min且由0.2% Triton/0.04% BSA阻斷1小時的LN827細胞中之其他核破壞。DAPI染色細胞展示在左側圖上(未經TTFields處理及如標記經處理)。中間圖展示當在4℃下將細胞與核片層蛋白B1抗體一起培育隔夜，隨後與螢光二級抗體一起培育1小時的結果(未經TTFields處理及如標記經處理)。右側圖展示合併影像(DAPI/核片層蛋白B1)。此等結果指示在誘導STING途徑的TTFields施加之後將dsDNA釋放至細胞質中。
圖3描繪藉由dsDNA誘導促炎性STING及細胞焦亡途徑。dsDNA可由異常有絲分裂誘導之微核產生。異常有絲分裂可例如藉由TTFields誘導。如所展示，TTFields亦可藉由破壞核片層蛋白B1結構從而導致dsDNA進入細胞質中及誘導如所示之STING途徑來降低核包膜完整性。
cGAS(環狀GMP-AMP合酶)及AIM2回應於暴露於TTFields而獨立地與微核共定位。cGAS及AIM2為偵測細胞質dsDNA之存在的免疫感測器。在圖4中，LN827細胞經TTFields處理24小時、由4% PFA固定20min且由0.2% Triton/0.04% BSA(牛血清白蛋白)阻斷1小時。將Flag及cGAS抗體在4℃下培育隔夜，隨後與二級抗體一起培育1小時，且在室溫下DAPI染色5分鐘。
因此，cGAS及AIM2回應於TTFields各自獨立地與微核共定位，從而指示TTFields誘導細胞質dsDNA之存在、活化STING途徑。圖5定量在暴露於或不暴露於TTFields之情況下來自圖4之結果的cGAS、AIM2及微核之百分比。
在U87及LN827細胞中，IRF3及p65在暴露於TTFields一天之後經磷酸化。在圖6中，在U87及LN827細胞用TTFields處理24小時之後收集總蛋白質。藉由西方墨點法(western blot)量測STING途徑下游IRF3及p65之存在以及其經活化磷酸化形式。使用B-肌動蛋白作為內對照組。STING誘導之途徑(IRF3及
p65)在TTFields之後經活化，如由IRF3及p65之磷酸化形式之存在所展示。因此，藉由STING活化觸發IRF3或干擾素調節因子3及p65磷酸化。
TTFields誘導I型IFN反應及STING下游之促炎性細胞介素。術語「STING之下游」係指在活化STING途徑之後誘導的細胞介素。在此態樣中，TTFields誘導如本文中所描述之STING反應。
LN428細胞用/不用TTFields處理24小時(圖7)。萃取總RNA且轉化成cDNA。定量PCR係用以偵測IL1α、IL1β、IL6、IL8及ISG15、IFNα、IFNβ之轉錄水平。在蛋白質裂解緩衝液中收集總LN428蛋白質且測定細胞數目。藉由ELISA測定IFNβ之內源蛋白含量。藉由細胞數目使最終蛋白質含量標準化。
如圖7中所示，TTFields誘導LN428中之細胞介素，諸如干擾素b(IFNB)表現。特定言之，將LN428細胞暴露於TTFields 3天相比於對照組增加IFNB含量300倍且相比於暴露於TTFields 1天增加100倍。在此態樣中，施加TTFields約3天顯著地增加促炎性細胞介素之含量。
STING在GBM細胞中藉由TTFields活化之後經降解。在概述於圖8中之實驗中，在所指示時間點處收集LN428(人類)及KR158(小鼠)蛋白質。藉由西方墨點法測定STING、p65及磷酸化-p65蛋白質含量。B-肌動蛋白/GAPDH用作內對照組。如圖8中所示，STING蛋白質含量及磷酸化-p65含量在24小時的時段之TTFields治療期間降低。
STING係在人類GBM細胞(LN428人類細胞)中由dsDNA及TTFields治療誘導發炎反應所需要的。在概述於圖9中之實驗中，人類GBM細胞株LN428係由慢病毒-shScramble或shSTING穩定感染。將細胞單獨地用dsDNA或TTFields處理24小時。聚乙烯亞胺(PEI)用作轉染緩衝液以誘導dsDNA遷移至細胞質中。萃取總RNA且轉化成cDNA。定量PCR係用以偵測IL1α、IL1β、IL8、ISG15及STING之轉錄水平。
如圖9中所示，在LN428細胞中藉由dsDNA及TTFields兩者誘導STING途徑時，在不存在STING(shSTING)之情況下降低各種細胞介素RNA轉錄物之含量。
在KR158及F98 GBM細胞中，自噬及dsDNA或TTFields協同地誘導STING依賴性促炎性反應。在概述於圖10中之實驗中，小鼠GBM細胞株KR158及大鼠GBM細胞株F98係由慢病毒-shScramble或shSTING穩定感染。將細胞分離且用dsDNA或TTFields處理24小時。PEI用作轉染緩衝液以誘導dsDNA進入細胞質中。萃取總RNA且轉化成cDNA。定量PCR係用以偵測IL1α、IL6、ISG15、IFNβ及STING之轉錄水平。
在相關實驗中，將如上文所描述之細胞分離且在存在/不存在氯奎(自噬抑制劑)的情況下且用dsDNA或TTFields處理24小時。PEI用作轉染緩衝液以誘導dsDNA進入細胞質中。萃取總RNA且轉化成cDNA。定量PCR係用以偵測IL6、ISG15、IFNβ之轉錄水平。
如圖10中所示，在KR158及F98細胞中藉由dsDNA及TTFields兩者誘導STING途徑時，在不存在STING(shSTING)之情況下降低各種細胞介素RNA轉錄物之含量。細胞介素轉錄物之含量藉由自噬誘導劑輔酶Q(CQ)進一步降低。
在F98大鼠神經膠瘤模型中，TTFields誘導之發炎性細胞介素產生係視STING及AIM2而定。在概述於圖11中之實驗中，大鼠GBM細胞株F98係由慢病毒-scramble對照組(WT)或STING及AIM2之雙阻斷基因表現(double knock down；DKD)穩定感染。使用立體定位系統將細胞注射至雄性費歇爾大鼠(Fischer rat)之大腦中。注射細胞後七天，向大鼠施加熱或TTFields額外7天。治療結束時，將大鼠處死，收集組織且進一步分析。定量PCR係用以偵測IL1α、IL1β、IL6、ISG15及IFNβ之轉錄水平。
如圖11中所示，STING及AIM2之雙阻斷基因表現(DKD)顯著地降低所指示細胞介素之含量。
腫瘤大小係與回應於TTFields的發炎性細胞介素表現中之倍數變化相互關聯。圖12示出在概述於圖11中之實驗中使用的大鼠大腦之影像。注射後第15天，各圖像下方展示來自圖11之定量PCR結果(亦即，各個別大鼠之MRI圖像之相對mRNA含量)。
圖13提供例示性熱圖，其展示在F98大鼠神經膠瘤模型中，CD45細胞向GBM中之募集在缺乏STING及AIM2之GBM中較低。在概述於圖13中之實驗中，大鼠GBM細胞株F98係由慢病毒-scramble對照組(WT)或STING及AIM2之雙阻斷基因表現(DKD)穩定編輯。使用立體定位系統將細胞注射至雄性費歇爾大鼠之大腦中。細胞注射後7天，向大鼠施加熱或TTFields額外7天。
治療結束時，將大鼠處死，收集組織且分裂以用於進一步分析。在本文中，將大塊腫瘤解離至單一細胞懸浮液中。多個流動抗體係用於對CD45進行染色。接著，在第二天在流式細胞測量術機器上固定且分析單一細胞懸浮液。
圖14提供例示性熱圖，其展示CD3(T細胞)募集在缺乏STING及AIM2之GBM中較低。圖14概述與圖13相同的實驗但使用針對CD3之抗體。
圖15提供例示性熱圖，其展示在缺乏STING及AIM2之GBM中，DC/巨噬細胞募集較低且MDSC募集較高。圖15概述與圖13相同的實驗，其中涉及偵測CD11b/c及MHC II(巨噬細胞)的抗體。
圖16提供來自圖15之流式細胞測量術結果的定量資料。
圖17示出在人類GBM細胞株LN308及LN827人類GBM細胞株中由暴露於TTFields三天誘導之『鬼影』。術語「鬼影」係指在免疫原性細胞死亡之後保留的細胞殘餘物之存在。在此等實驗中，LN308及LN827細胞用/不用
TTFields處理3天。在亮視野顯微鏡下獲取影像。影像展示在3天TTFields暴露之後免疫原性細胞死亡增加。
圖18示出在暴露於TTFields的U87 GBM細胞中，TTFields誘導膜損壞且減少GSDMD。在概述於圖18中之實驗中，將人類GBM細胞株U87在所指示條件下處理24小時。藉由細胞毒性分析來偵測釋放至細胞培養基中之乳酸去氫酶(LDH)。藉由慢病毒-GSDMD-Flag-N迫使U87細胞表現消皮素D(GSDMD)且用/不用TTFields處理。如所指示時間點收集總蛋白質。藉由西方墨點法使用flag抗體來測定過度表現之蛋白質GSDMD含量。使用B-肌動蛋白作為內對照組。如圖18中所示，暴露於TTFields殺死12%之細胞。
圖19示出在人類白血病單核球細胞株THP-1巨噬細胞中，TTFields誘導膜損壞且裂解GSDMD。在概述於圖19中之實驗中，將人類白血病單核球細胞株THP-1用150nM PMA處理劑處理24小時以刺激分化成巨噬細胞。在TTFields處理之第3天測試LDH釋放以檢查電場頻率範圍。藉由慢病毒-GSDMD-Flag-N迫使THP-1細胞表現GSDMD且用/不用TTFields處理。如所指示時間點收集總蛋白質。藉由西方墨點法使用flag抗體來測定過度表現之蛋白質GSDMD含量及其裂解之N-片段。使用B-肌動蛋白作為內對照組。陽性對照組展示為LPS處理6小時，隨後1小時ATP。
圖20示出由GFP慢病毒標記且由150nM PMA預處理24小時之THP-1細胞。在24小時的時段之後，細胞暴露於TTFields 24小時，且每20分鐘捕獲時程影像。
圖21示出由GFP慢病毒標記且由150nM PMA預處理24小時之THP-1細胞。在24小時的時段之後，使細胞在正常培養條件中生長24小時，且每20分鐘捕獲時程影像。
如圖20及圖21中所示，相較於對照細胞(圖21)，用TTFields處理
引起較大免疫原性細胞死亡(圖20)。
圖22示出在暴露於TTFields 1天及3天之後，TTFields誘導細胞焦亡依賴性凋亡蛋白酶-1活化。在概述於圖22中之實驗中，用150nM PMA預處理THP-1細胞24小時。在24小時的時段之後，在使用及不使用TTFields之情況下處理細胞所指示時間點。凋亡蛋白酶-1活化偵測套組係用於標記具有經裂解凋亡蛋白酶-1形式之細胞。在流式細胞測量術機器上分析樣品。
圖23示出在暴露於TTFields 1天及3天之後，TTFields誘導之凋亡蛋白酶-1活化及細胞焦亡與較低含量之全長IL-1 β及較高之LDH釋放水平一致。在概述於圖23中之實驗中，用150nM PMA預處理THP-1細胞24小時。在24小時的時段之後，在使用及不使用TTFields之情況下處理細胞3天。使用尼日利亞菌素(Nigericin)12小時作為陽性對照組。凋亡蛋白酶-1活化偵測套組係用於標記具有經裂解凋亡蛋白酶-1形式之細胞。在流式細胞測量術機器上分析樣品。在第3天的相同時間點收集細胞培養基。藉由ELISA及細胞毒性分析來測定培養基中之IL1β及LDH含量。
圖24示出在TTFields治療已結束之後，TTFields誘導之STING/AIM2活化及發炎性細胞介素產生保持至少3天。如圖24中所示，由TTF誘導之發炎性細胞介素產生係視STING及AIM2而定且在短脈衝之TTF處理之後保持高於基線若干天。在概述於圖24中之實驗中，K-LUC細胞經空病毒或攜載靶向並抑制STING及AIM2之雙股shRNA之病毒轉導。接著將每盤30k此等細胞用TTFields處理3天，接著在TTF停止之後培養額外3天且收集以用於發炎性細胞介素測定(IL-6及ISG15)。如圖24中所示，在停止TTFields之後，升高的IL6及ISG15產生繼續至少3天(藍色條柱，EV)。
圖25示出短脈衝TTF誘導之STING/AIM2活性係與腫瘤生長減少及募集至頸深引流淋巴結之DC(樹突狀細胞)增加相關。在停止TTFields處理之
後，藉由TTFields經由STING/AIM2進行之此持久性發炎性活化使免疫系統活化。
在概述於圖25中之實驗中，K-LUC細胞經空病毒或表現靶向STING及AIM2之雙shRNA之病毒轉導，接著未經處理或用TTF處理3天。將3×105個此等K-LUC細胞原位植入至B6小鼠中。藉由luc BLI量測腫瘤生長。如中間圖所示，植入後兩週之後的腫瘤大小相較於雙阻斷基因表現(DKD)小鼠在空病毒(empty virus；EV)TTFields小鼠中大大減少。此等小鼠亦展現最高含量之DC細胞(例如，T細胞)(右側圖)。將頸深淋巴結視為來自大腦之抗原發生DC募集及致敏原生T細胞的地方。
因此，TTFields刺激免疫系統產生抗腫瘤免疫反應，類似於原位「疫苗接種」，其中將細胞預致敏(primed)以用於另外的癌症療法(例如，TTFields處理至少三天，隨後用查核點抑制劑處理)。
圖26示出在不具有AIM2之TTFields處理之細胞中未偵測到凋亡蛋白酶1。凋亡蛋白酶1緊接在AIM2-雙股DNA複合物之下游且為細胞焦亡之分子標誌。使用偵測凋亡蛋白酶1之裂解產物(活化)的市售套組偵測到凋亡蛋白酶1活化。在藍色曲線之第二FITC峰移位至僅在具有正常AIM2含量之經TTFields處理之細胞中呈現的右側時偵測到經活化凋亡蛋白酶1(EV(空病毒)相較於EV+TTFields)。然而，在不具有AIM2之經TTFields處理之細胞中未觀測到此類峰(AIM2 KD相較於AIM2 KD+TTFields)。因此，TTFields對細胞焦亡之影響至少部分地由AIM2介導。
儘管已參考某些具體實例揭示本發明，但在不脫離本發明之領域及範疇的情況下對所描述具體實例的眾多修改、變更以及改變為可能的，如所附申請專利範圍中所定義。因此，意圖本發明不限於所描述具體實例，且可具有由以下申請專利範圍之語言以及其等效物定義之完整範疇。
Claims (26)
- 一種查核點抑制劑之用途，其係用於製造降低癌細胞生存力之醫藥品，其中所述醫藥品係與以介於100與500kHz之間的頻率向該等癌細胞施加3至10天的交流電場組合使用；且其中所述醫藥品係向該等癌細胞投予。
- 如請求項1之用途，其中在該3至10天連續地向該等癌細胞施加該等交流電場。
- 如請求項1之用途，其中在該3至10天間斷地向該等癌細胞施加該等交流電場。
- 如請求項1之用途，其中在該3至10天中之每一天，每天向該等癌細胞施加該等交流電場至少4個小時。
- 如請求項1之用途，其中在該3至10天中之每一天，每天向該等癌細胞施加該等交流電場至少6個小時。
- 如請求項1之用途，其中向該等癌細胞施加該等交流電場3天，隨後3天時段不向該等癌細胞施加該等交流電場，隨後3天時段向該等癌細胞施加該等交流電場。
- 如請求項1之用途，其中每週至少3天向該等癌細胞施加該等交流電場。
- 如請求項1之用途，其中在3至10天之第一時段向該等癌細胞施加該等交流電場，隨後在第二時段不施加該等交流電場。
- 如請求項8之用途，其中該第二時段至少與該第一時段相同。
- 如請求項1之用途，其中以短脈衝向該等癌細胞施加該等交流電場。
- 如請求項1之用途，其中該等癌細胞係選自由以下者組成之群： 神經膠母細胞瘤細胞、胰臟癌細胞、卵巢癌細胞、非小細胞肺癌(NSCLC)細胞及間皮瘤。
- 如請求項1之用途，其中該等癌細胞為神經膠母細胞瘤細胞。
- 如請求項1之用途，其中該查核點抑制劑係選自由以下者組成之群：伊派利單抗(ipilimumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)及尼沃單抗(nivolumab)。
- 如請求項1之用途，其中該等交流電場的頻率介於180與220kHz之間。
- 如請求項1之用途，其中向癌細胞投予該醫藥品之查核點抑制劑之至少一部分在以介於100與500kHz之間的頻率向癌細胞施加交流電場3至10天停止之後進行。
- 一種查核點抑制劑之用途，其係用於製造治療神經膠母細胞瘤之醫藥品，其中所述醫藥品係與以介於100與500kHz之間的頻率向患有神經膠母細胞瘤的個體之頭部施加3至10天的交流電場組合使用；且其中所述醫藥品係向該個體投予。
- 如請求項16之用途，其中在該3至10天連續地向該個體施加該等交流電場。
- 如請求項16之用途，其中在該3至10天間斷地向該個體施加該等交流電場。
- 如請求項16之用途，其中在該3天中之每一天，每天向該個體施加該等交流電場至少4個小時。
- 如請求項16之用途，其中該查核點抑制劑係選自由以下者組成之群：伊派利單抗、派立珠單抗及尼沃單抗。
- 如請求項16之用途，其中該等交流電場的頻率介於180與220kHz之間。
- 如請求項16之用途，其中向個體投予該醫藥品之查核點抑制劑之至少一部分在以介於100與500kHz之間的頻率向患有神經膠母細胞瘤的個體之頭部施加交流電場3至10天停止之後進行。
- 如請求項16之用途，其中向患有神經膠母細胞瘤的個體之頭部施加該等交流電場3天，隨後3天時段不向患有神經膠母細胞瘤的個體之頭部施加該等交流電場，隨後3天時段向患有神經膠母細胞瘤的個體之頭部施加該等交流電場。
- 如請求項16之用途，其中以短脈衝向患有神經膠母細胞瘤的個體之頭部施加該等交流電場。
- 如請求項16之用途，其中每週至少3天向患有神經膠母細胞瘤的個體之頭部施加該等交流電場。
- 一種查核點抑制劑之用途，其係用於製造降低癌細胞生存力之醫藥品，其包含：其中所述醫藥品係與以介於100與500kHz之間的頻率以足以殺死約1-2%之癌細胞的期間向該等癌細胞施加的交流電場組合使用；且其中所述醫藥品係向所述癌細胞投予。
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