WO2017064440A1 - Dispositif optique de détection - Google Patents

Dispositif optique de détection Download PDF

Info

Publication number
WO2017064440A1
WO2017064440A1 PCT/FR2016/052664 FR2016052664W WO2017064440A1 WO 2017064440 A1 WO2017064440 A1 WO 2017064440A1 FR 2016052664 W FR2016052664 W FR 2016052664W WO 2017064440 A1 WO2017064440 A1 WO 2017064440A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
image
optical
backscattered
backscattered signal
Prior art date
Application number
PCT/FR2016/052664
Other languages
English (en)
Inventor
Vincent RODRIGUEZ
Thomas KUNTZEL
Frédéric ADAMIETZ
Brice KAUFFMANN
Original Assignee
Universite de Bordeaux
Institut Polytechnique De Bordeaux
Centre National De La Recherche Scientifique
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Bordeaux, Institut Polytechnique De Bordeaux, Centre National De La Recherche Scientifique, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale filed Critical Universite de Bordeaux
Publication of WO2017064440A1 publication Critical patent/WO2017064440A1/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/636—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited using an arrangement of pump beam and probe beam; using the measurement of optical non-linear properties
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/26—Stages; Adjusting means therefor

Definitions

  • the invention relates to the field of optical detection devices, in particular of second harmonic generation, in particular to optical devices for detecting crystals.
  • the invention more particularly relates to an optical device and its use for detecting the existence of non-centro-symmetric crystals in a sample of material comprising a molecule of biological interest, such as an organic molecule.
  • Crystallization of a targeted protein or nucleic acid fragment is a multiparametric process that is impossible to control a priori.
  • Crystallographs in the field of macromolecules are obliged to perform multiple experiments by varying the crystallizing agents and their concentration (typically salts), the pH of the solution or the concentration of the protein.
  • These mass sorting exercises can therefore quickly include thousands of test conditions. As the growth of a crystal depends on time, it is necessary to analyze all its conditions periodically, which quickly becomes time-consuming.
  • the detection of crystals can be based on the detection of edges as well as the contrast difference in white light.
  • amorphous precipitates or dried crystallization droplet skins may also have ridges and thus lead to false positives in white light.
  • Amorphous precipitates may also be likely to hide crystals leading to false negatives.
  • many other species are capable of giving crystals without being the macromolecule of interest (for example salts).
  • X-ray diffraction is the technique of choice for the determination of three-dimensional structures from single crystals and allows the identification of crystallized molecules.
  • this technique requires crystals of sufficient size to be mounted on a diffractometer goniometer. This technique is not suitable for the early detection of crystallization conditions among the many tests of a mass sorting.
  • An idea underlying the invention is to quickly and inexpensively probe a sample of material to detect the existence of non-centro-symmetric crystals.
  • the invention provides an optical device comprising:
  • a laser source capable of delivering a laser beam having an excitation wavelength
  • a sample holder adapted to receive a sample of material to be probed, an optical system arranged between the laser source and the sample holder and configured to project the laser beam onto the sample holder, and
  • a detection member adapted to detect a backscattered signal having a detection wavelength equal to half the excitation wavelength, in order to detect the existence of non-centro-symmetric crystals in the sample
  • optical system comprises:
  • a focusing device configured to generate a focus point of diameter greater than 10 ⁇ at the sample holder
  • a wavelength separation device adapted to be traversed by the laser beam having the excitation wavelength in the direction from the laser source to the sample support, and capable of spatially separating the backscattered signal exhibiting the detection wavelength of a backscattered signal having the excitation wavelength, the backscattered signals being from the sample carrier,
  • the detection member being arranged to receive the backscattered signal having the detection wavelength and separated from the backscattered signal having the excitation wavelength.
  • the optical device makes it possible to detect the presence of nonlinear crystals present in an area of about 300 ⁇ m 2 .
  • such an optical device may include one or more of the following features.
  • the optical device further comprises displacement means configured to generate a controlled relative displacement between the focusing point and the sample in a direction transverse to the direction of the laser beam.
  • the optical device can be used to scan a drop of a sample to detect if nonlinear crystals are present in the drop of the sample.
  • the sample of material is a sample of material which must be determined whether or not it contains protein crystals having no inversion center. These crystals are called non-centro-symmetric crystals, or nonlinear crystals.
  • the transverse direction is a first transverse direction
  • the displacement means are further configured to generate a controlled relative displacement between the focusing point and the sample holder in a second direction transverse to the direction of the laser beam.
  • the optical system comprises a mirror configured to reflect the laser beam having the excitation wavelength and the motor is a galvanometric system coupled to said mirror in order to move the focusing point in the transverse direction to the direction of the laser beam.
  • the galvanometric system is configured to produce a focus point displacement step of less than 100 ⁇ according to the first and / or second direction transverse to the direction of the laser beam, preferably less than 10 ⁇ .
  • the displacement means allow a fine sweep of the sample, with an accuracy of the order of 10 ⁇ .
  • the displacement means also allow a rough, step-by-step sweep of the sample.
  • the moving means further comprises a stepper motor to enable step-by-step scanning of the sample.
  • the stepper motor is configured to move the focusing point at the sample holder in a pitch greater than the diameter of the focusing point, preferably greater than 100 ⁇ .
  • the value of the pitch of the step-by-step sweep of the sample corresponds to the space between two wells of a Greiner plate.
  • the sample holder is a standard well or standard 384 well Greiner plate, carrying one drop in each well, i.e., for example, 96 or 384 material samples on the same plate. Sweeping through the stepper motor moves the sample carrier relative to the focus point to step-by-point the focus point on each well.
  • the step motor is configured to move the focus point at the sample holder with micron precision ready.
  • the laser source delivers a laser beam of average optical power less than 2W, preferably between 1W and 1, 2W.
  • the detection member comprises a photomultiplier. Thanks to these characteristics, the backscattered signal can be detected in order to detect the second harmonic generation in nonlinear crystals generated for example by crystallogenesis of protein macromolecules.
  • the detection unit is configured to integrate the received backscattered signal during an integration time greater than 1 ⁇ .
  • the displacement means are configured to move the focusing point at the sample support in successive steps periodically in a period greater than the integration time.
  • the optical device further comprises a memory configured to store spatial coordinates of the sample support or of the focusing point corresponding to each measurement acquisition, by the detection member, of the backscattered signal having the length detection wave.
  • the memory is synchronized with the sensing element so that the spatial coordinates of the sample carrier or focus point are automatically recorded at each detection. by the detection member, the backscattered signal having the detection wavelength.
  • the laser source is a pulsed laser source, preferably a femtosecond laser source.
  • the pulsed laser source produces pulses of duration between 50fs and 500fs.
  • the laser source is tunable excitation wavelength.
  • the excitation wavelength is greater than 280 nm, preferably greater than 400 nm.
  • One of the advantages of this excitation wavelength range is not to destroy the plastic, which makes it possible to detect the presence of nonlinear crystals in samples of materials placed in plastic plates.
  • One of the advantages of this exciting wavelength range is that it does not damage nonlinear crystals in formation.
  • ⁇ 1030 nm.
  • the optical device further comprises a filter in front of the detection member, the filter being able to cut parasitic optical signals having the excitation wavelength and to let the backscattered signal having the length detection wave.
  • the focusing point has a diameter greater than a few tens of micrometers. According to one embodiment, the diameter of the focusing point is greater than 20 ⁇ .
  • the invention provides an optical apparatus comprising the optical device as described above, and a system optical imaging device, the optical apparatus further comprising a sliding tube slidable between a first position and a second position,
  • the wavelength separation device of the optical device being arranged in the sliding tube so as to be traversed by the laser beam having the excitation wavelength in the direction from the laser source to the sample holder in the first position of the sliding tube,
  • optical imaging system comprising:
  • a light source capable of emitting a luminous flux
  • a semi-reflective device adapted to be traversed by the luminous flux in the direction of the reflecting device and to reflect a backscattered light flux from the sample holder to the camera
  • the reflective device being able to reflect the luminous flux in the direction of the focusing device, and to reflect a backscattered light flux from the sample holder to the semi-reflective device,
  • the camera being able to detect the backscattered light flux
  • the reflective device being arranged in the sliding tube at a position spaced from the wavelength separation device so as to reflect the backscattered light flux in the second position of the sliding tube,
  • the first position is a position of use of the optical device and the second position is a position of use of the optical imaging system.
  • the invention further provides a use of the device described above for detecting the existence of non-centrosymmetric crystals in the sample, comprising the steps of:
  • the sample of matter comprises at least one element selected from the list consisting of: any molecule of biological interest, optically active natural substances crystallized in second harmonic generation, crystallized natural substances exceeding enantiomeric, proteins and nucleic acid.
  • the use of the device may include one or more of the features below.
  • the use further comprises the steps of:
  • the use further comprises the steps of:
  • the backscattered signal After having delivered the laser beam by the laser source and after detecting by the detection member the backscattered signal having a length detection wavewidth equal to half of the excitation wavelength, superimpose the backscattered signal on the image in white light, in order to detect the location of non-centro-symmetric crystals in the sample as a contrast colours.
  • the white light image of the sample of material being a first image of a first section of the sample of matter, further comprising capturing and recording a second white-light image of the sample. of matter, the second image being an image of a second section of the material sample.
  • the first image is captured by adjusting the relative position between the sample carrier and the focusing point in a direction parallel to the direction of the luminous flux so as to project the focusing point onto the first cross-section.
  • the material sample and the second image is captured by adjusting the relative position between the sample holder and the focusing point in a direction parallel to the direction of the light flux so as to project the focus point to the second cut of the sample of material.
  • the use furthermore comprises:
  • the hyperfocal image is obtained by summing the net portions of more than two cut images of the sample of material, preferably 9 images of sections of the material sample.
  • Certain aspects of the invention start from the idea of providing an optical device for detecting crystals able to detect in-situ crystals, that is to say the non-linear crystals present in samples being crystallized.
  • FIG. 1 is a schematic representation of an optical detection device according to the invention.
  • FIG. 2 is a schematic representation of an apparatus comprising the optical detection device of FIG. 1 associated with an imaging system.
  • FIG. 3 is a schematic representation of the apparatus of FIG. 2 in a use position of the imaging system.
  • FIG. 4a is an image of a sample of material obtained in white light by the imaging system of FIG. 3;
  • FIG. 4b is an image resulting from a superposition of the image of FIG. 4a and the second harmonic detection by the optical detection device of FIG. 1;
  • FIGS. 5a, 5b and 6 are images resulting from white-light image superposition obtained by the imaging system of FIG. 3 and second-harmonic detection by the optical detection device of FIG. illustrate the effectiveness of second harmonic detection by the apparatus of Figure 2;
  • optical detection device 1 With reference to FIG. 1, an optical detection device 1 according to one embodiment of the invention will be described.
  • the laser 2 emits the laser beam 100 in a direction X.
  • a control module 3 of the optical power is arranged at the output of the laser 2.
  • the control module 3 can consist of a half wave plate and two contiguous polarizing prisms, for example a Glan Taylor.
  • the first mirror 4 and the second mirror 5 are arranged so that the angle of incidence of the laser beam 100 on each of they are approximately equal to ⁇ / 4 in the plane of Figure 1, so that the beam reflected by the second mirror is in the same direction as the incident beam on the first mirror 4.
  • These two mirrors can arrange the set consisting of the laser 2 and the control module 3 at a location chosen according to constraints of mechanical size, while allowing the arrival of the beam in the selected X direction.
  • the beam reflected by the second mirror 5 is oriented by successive reflections on galvanometric mirrors 6.
  • the galvanometric mirrors 6 are controlled by computer and used to direct the laser beam 100 precisely, to the nearest ten micron, and very quickly, according to a 60Hz frequency for small displacements and up to 1kHz for large displacements.
  • Galvanometric mirrors are two mirrors, each attached to a galvanometric system. The first mirror serves to deflect the laser beam 100 in the X direction, the second mirror in a Y direction transverse to the X direction. Thus, by moving the mirrors adequately, it is possible to make the beam perform the desired trajectory in the X direction. XY plane.
  • the laser beam 100 is thus directed to a Z-axis collimator 7 consisting of a first movable lens 71 in a tube 73 and a second fixed lens 72 in the tube 73 to collimate the optical beam 100, ie that is, to obtain a non-diverging and Z-direction laser beam 100 at the output of the collimator 7.
  • the moving lens 71 is moved along the Z axis to adjust the focal length of the collimator.
  • the laser beam 100 at the collimator output passes through a dichroic mirror
  • the laser beam 100 leaves the dichroic mirror in the same direction Z as the direction it had at the entrance of the dichroic mirror. So, the laser beam is directed from the galvanometric mirrors towards an objective 8.
  • the objective 8 makes it possible to focus the laser beam 100 on a focusing point 18 on a plate 9.
  • the focusing point 18 is represented by a cross.
  • the plate 9 is a plane sample support in the XY plane.
  • the focal point has a diameter of 10 ⁇ .
  • the plate 9 is movable along the Z axis, as represented by the arrow 17, via a motor 10 to adjust the distance between the objective 8 and the plate 9. In fact, the plate 9 is intended to receive a sample of material 16.
  • the adjustment of the distance between the objective 8 and the plate 9 makes it possible to move the focusing point 18 of the laser beam 100 along the Z axis inside the material sample 16.
  • the adjustment of the direction of the laser beam 100 by the galvanometric mirrors 6 makes it possible to move the focusing point 18 of the laser beam 100 in the XY plane of the plate 9.
  • the sample of material 16 is a sample of material which must be determined whether or not it comprises non-linear crystals.
  • a backscattered signal of detection wavelength ⁇ / 2 is emitted by the non-linear crystals.
  • This phenomenon is a non-linear phenomenon called Second Harmonic Generation (SHG).
  • the laser 2 is a femtosecond laser source so that the optical peak power received by the material sample 16 at the focus point 18 is high enough to allow the detection of such a non-linear response.
  • the Second Harmonic signal is detectable only above a received power threshold.
  • the backscattered signal is scattered in all directions of space.
  • backscattered signal 200 the part of the backscattered signal which is scattered in the direction of the Z axis and in the direction from the plate 9 to the dichroic mirror 11.
  • the backscattered signal 200 is represented by dashed.
  • the dichroic mirror 11 is reflective for the detection wavelength ⁇ / 2.
  • the dichroic mirror 11 is arranged so that the angle of incidence of the backscattered signal 200 is ⁇ / 4. Thus, the backscattered signal 200 is reflected in the X direction.
  • the optical detection device 1 further comprises a cutting filter 12 and a bandpass filter 13 on the optical path in the X direction.
  • the cutting filter 12 is able to cut off any parasitic backscattered signal having the wavelength ⁇ .
  • the band-pass filter 13 is able to pass the optical signals having a wavelength in a range of ⁇ 0 nm of wavelengths centered on ⁇ / 2 in order to filter out any other parasitic signals and to let the backscattered signal 200.
  • the optical detection device 1 comprises a detector for detecting the incident backscattered signal 200.
  • This detector is a photomultiplier 14 capable of amplifying the backscattered signal 200 in order to detect it from a threshold optical power of a few pW.
  • the optical power received by the photomultiplier 14 depends on the power of the laser, the scanning speed, the amplification, and so on. Each positive response of the photomultiplier 14 optimally determines that the focusing point 18 has encountered a nonlinear crystal in the material sample 16.
  • the maximum speed of focusing point displacement by the galvanometric mirrors is dictated by the sampling frequency and the moving speeds of the mirrors. For example, this maximum speed is 100kHz.
  • the optical detection device 1 also comprises a memory, not shown, in which are stored the spatial coordinates of the focusing point 18 at each detection by the photomultiplier 14 of the presence of non-linear crystals.
  • An automatic system can be provided to automatically detect the exact positions of the motors of the galvanometer mirrors 6 and the motorized platform motor 10, in response to detection by the photomultiplier 14 of the presence of non-linear crystals.
  • This memory is synchronized with the photomultiplier 14 in order to associate with the detection of a signal at the detection wavelength of the spatial coordinates. By compiling this detection information and associated coordinates, it is possible to recreate an image of the sample.
  • the experimenter using the optical detection device 1 is therefore able, among other advantages, to optimally detect the presence of nonlinear crystals by conducting a rapid scan of the material sample 16. just move the focusing point 18 as previously described. Thus, it has the spatial coordinates of the presence of nonlinear crystals in the material sample 16.
  • the material sample 16 is a drop of stock solution and molecules of biological interest into which an experimenter has poured a crystallizing agent, in a certain proportion. This drop is placed in a Greiner plate well, for example a 96-well plate.
  • Molecules of biological interest are proteins, nucleic acids or all natural substances crystallized in enantiomeric excess.
  • the experimenter poured a crystallizing agent in other proportions, for example. It may also have varied other parameters than the proportion of crystallization agent.
  • the experimenter can perform a crystallization test battery on a single Greiner plate.
  • the motorized platform 10 further comprises stepping motors in both directions transverse to the laser beam. Thus, it allows the movement of the Greiner plate to place the focus point successively on each well of the plate. This step-by-step movement repeats the operations described above for each well on the Greiner plate.
  • the motorized platform 10 thus allows movements from one well to another via the stepping motors of the motorized stage 10.
  • the wells are positioned on lines and columns: the platform makes it possible to carry out displacements nxm respectively corresponding to the number of column and well line present on the plate.
  • This optical detection device 1 has the advantages of being relatively inexpensive and of allowing an efficient and rapid detection of the formation of non-linear crystals in the sample of material 16.
  • the resolution of the optical detection system is equal to the diameter of the point of focusing, greater than 10 ⁇ , and yet allows efficient detection of non-linear crystals.
  • Such a detection device makes it possible to identify rapidly by scanning a drop of sample material 16 if nonlinear crystals are formed, and therefore if the crystallization conditions tested by the experimenter lead to crystallization. These scans are carried out thanks to the galvanometric mirrors 6, inside each of the Greiner plate wells.
  • the motorized platform 10 makes it possible to quickly identify, by placing the focus point successively on each of the wells of the Greiner plate, in which well is a drop of sample material 16 in which a crystallization has succeeded.
  • this optical detection device 1 Another advantage of this optical detection device 1 is to allow early detection of the formation of non-linear crystals in the material sample 16, because of the simplicity of the optical detection device and the very short integration time The photomultiplier 14. Indeed, the optimization of the assembly (use of the strict necessary of the optics, reduction to the maximum of the optical path) makes the assembly very luminous. By associating with this assembly a pulse source we obtain a very effective device.
  • optical detection device 1 Another advantage of this optical detection device 1 is to be relatively low cost and compact. Indeed, the optical detection device 1 is freed from the use of polarizers since the symmetry of the crystal (and thus the origin of this or that detected signal) is not the first criterion studied, but the only presence of Non-linear crystals is the criterion studied. The raw backscattered signal is processed without any post-measurement processing being necessary. Indeed, the optical detection device 1 is, in a preferred embodiment, a Second Harmonic generation signal detector and not a complex nonlinear imaging system.
  • the dichroic mirror 11 and the filters 12 and 13 are arranged inside a tube 15.
  • this tube 15 is a sliding tube, as explained with reference to FIG. 2.
  • the mobility of the tube 15 is represented by the arrow 32, in the direction X.
  • the optical detection device 1 further comprises an imaging system 19, as shown in FIG. detection optics 1 comprises all the elements previously described, represented by the same reference numbers as in FIG. 1.
  • the imaging system 19 comprises a light source 20 capable of emitting white light, that is to say in the X direction.
  • the imaging system 19 also includes a camera 22 capable of recording images.
  • the imaging system 19 also comprises a semi-reflecting plate 21 arranged so as to let the white light emitted by the light source 20 in the X direction and in a first direction, and to reflect some of the white light received in the direction X and in the other direction, to the camera 22 to form images.
  • the optical detection device 1 further comprises a dielectric mirror 23 arranged in the sliding tube.
  • the tube 15 is in the same position as that shown in FIG. 1.
  • This position is a first position, which is a position of use of the optical detection device 1 as a non-linear crystal detector. .
  • the tube 15 can also take a second position because it is sliding. This second position is a position of use of the optical detection device 1 as an imaging system of the non-linear crystals detected.
  • FIG. 3 represents the optical detection device of FIG. 2, in which the tube 15 is in the second position.
  • the white light emitted by the light source 20 in the X direction is reflected by the dielectric mirror 23 in the direction Z towards the objective 8.
  • the lens 8 makes it possible to focus the white light on a focusing point 18 in the material sample 16.
  • the image of the focusing point 18 is made on the camera 22.
  • an experimenter records the spatial coordinates of the focus point 18 upon detection of nonlinear crystals by the use of the detection device 1 with the tube 15 in the first position. Then, the experimenter slides the tube 15 in the second position to make the white-light image of the non-linear crystals detected, for the same spatial coordinates.
  • the optical detection device 1 is particularly advantageous because it makes it possible to image for selected focusing points 18, and not to image the entire sample of material 16, which is much more expensive in terms of time and computing resources.
  • the method comprises the following steps:
  • the hyperfocal image is obtained by summing the net portions of several vertical sections of the sample of material;
  • the detection produces a second harmonic signal image.
  • a series of scans at different depths, typically spaced 30 ⁇ , in the sample material is performed to produce the second harmonic signal image;
  • FIGs 4 to 6 illustrate images obtained by the apparatus shown in Figures 1 to 3.
  • FIG. 4A shows a hyperfocal image obtained in white light from 9 sections of a sample of material 30 on a sample support 24.
  • Figure 4B on the right represents a superposition of the image of the second harmonic signal 25 on the hyperfocal image of Figure 4B.
  • the image of the second harmonic signal is obtained on a vertical scan of 9 vertical sections of the material sample 30.
  • Figures 5a and 5b show frequent cases where the only use of white light or second harmonic detection would not have made it possible to determine with certainty the presence or absence of nonlinear crystals as well as on their precise location because of the distortion of images from the complex medium.
  • Figures 5a and 5b respectively show two drops of crystallization in two different wells Greiner plate different: C4 and C5.
  • the two drops have the same precipitating agents and additives but different by the pH of the solution, 5.5 for the well C4 and 6.5 for the well C5.
  • the zones imaged in white light are subsequently imaged by the optical detection device 1.
  • the apparatus of the present invention makes it possible to carry out comparative analyzes which are of capital importance for crystallographers since they provide them with valuable information on the best crystallization conditions and allow enormous time savings on the crystallographs.
  • Figure 6 shows an example where the sample of material 30 is filled with precipitates 27 which drastically complicates the identification of nonlinear protein crystals which could be hidden by the precipitates 27.
  • the superposition of the image obtained in white light With the image obtained by second harmonic generation it is possible to precisely locate the nonlinear crystals formed in the sample.
  • areas having non-linear crystals appear in color contrast to the white light image on the material sample images.
  • areas with non-linear crystals are shown in FIGS. 5A, 5B and 6 by crosses surrounded by a circle.
  • lens used in the present description may refer to a single optical lens or a combination of lenses, or to any optical system having a suitable focal length.
  • the use of the verb "to include”, “to understand” or “to include” and its conjugated forms does not exclude the presence of other elements or steps other than those set out in a claim.
  • the use of the indefinite article “a” or “an” for an element or a step does not exclude, unless otherwise stated, the presence of a plurality of such elements or steps.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nonlinear Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Dispositif optique (1) pour détecter l'existence de cristaux non centro-symétriques dans un échantillon de matière comportant une molécule d'intérêt biologique comportant : une source laser (2) apte à délivrer un faisceau laser présentant une longueur d'onde d'excitation, un support d'échantillon (9) de matière à sonder, un système optique entre la source laser et le support d'échantillon, et un organe de détection (14) apte à détecter un signal rétrodiffusé présentant une longueur d'onde de détection égale à la moitié de la longueur d'onde d'excitation, dans lequel le système optique (1) comprend : un dispositif de focalisation (8), et un dispositif de séparation de longueur d'onde (11) apte à être traversé par le faisceau laser présentant la longueur d'onde d'excitation et à séparer spatialement le signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde de détection d'un signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde d'excitation, l'organe de détection (14) étant agencé pour recevoir le signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde de détection et séparé du signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde d'excitation.

Description

Dispositif optique de détection
Domaine technique
L'invention se rapporte au domaine des dispositifs optiques de détection, notamment de génération de second harmonique, en particulier aux dispositifs optiques de détection de cristaux.
L'invention concerne plus particulièrement un dispositif optique et son utilisation pour détecter l'existence de cristaux non centro-symétriques dans un échantillon de matière comportant une molécule d'intérêt biologique, telle qu'une molécule organique.
Arrière-plan technologique
La cristallisation d'une protéine ou d'un fragment d'acide nucléique ciblée est un processus multiparamétrique impossible à contrôler a priori. Les cristallographes dans le domaine des macromolécules sont dans l'obligation de réaliser de multiples expériences en faisant varier les agents cristallisants ainsi que leur concentration (typiquement des sels), le pH de la solution ou encore la concentration de la protéine. Ces exercices de tri de masse peuvent donc rapidement comporter des milliers de conditions d'essais. Comme la croissance d'un cristal dépend du temps, il est nécessaire d'analyser toutes ses conditions périodiquement, ce qui devient très vite chronophage.
La détection des cristaux peut être basée sur la détection d'arêtes ainsi que sur la différence de contraste en lumière blanche. Cependant, des précipités amorphes ou des peaux de gouttes de cristallisation asséchées peuvent également présenter des arêtes et ainsi conduire à de faux-positifs en lumière blanche. Des précipités amorphes peuvent aussi être susceptibles de cacher des cristaux conduisant à des faux-négatifs. Enfin, au cours de ces expériences de cristallisation de nombreuses autres espèces sont susceptibles de donner des cristaux sans pour autant être la macromolécule d'intérêt (par exemple les sels). La diffraction des rayons X est la technique de choix pour la détermination de structures tridimensionnelles à partir de monocristaux et permet l'identification des molécules cristallisées. Cependant cette technique nécessite des cristaux de taille suffisante pour être montés sur un goniomètre de diffractomètre. Cette technique n'est pas appropriée à la détection précoce de conditions de cristallisation parmi les nombreux essais d'un tri de masse.
Résumé
Une idée à la base de l'invention est de sonder rapidement et à bas coût un échantillon de matière afin de détecter l'existence de cristaux non centro- symétriques.
Selon un mode de réalisation, l'invention fournit un dispositif optique comportant :
une source laser apte à délivrer un faisceau laser présentant une longueur d'onde d'excitation,
un support d'échantillon apte à recevoir un échantillon de matière à sonder, un système optique agencé entre la source laser et le support d'échantillon et configuré pour projeter le faisceau laser sur le support d'échantillon, et
un organe de détection apte à détecter un signal rétrodiffusé présentant une longueur d'onde de détection égale à la moitié de la longueur d'onde d'excitation, afin de détecter l'existence de cristaux non centro-symétriques dans l'échantillon,
dans lequel le système optique comprend :
un dispositif de focalisation configuré pour générer un point de focalisation de diamètre supérieur à 10μιη au niveau du support d'échantillon, et
un dispositif de séparation de longueur d'onde apte à être traversé par le faisceau laser présentant la longueur d'onde d'excitation dans la direction allant de la source laser vers le support d'échantillon, et apte à séparer spatialement le signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde de détection d'un signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde d'excitation, les signaux rétrodiffusés étant en provenance du support d'échantillon,
l'organe de détection étant agencé pour recevoir le signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde de détection et séparé du signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde d'excitation.
Grâce à ces caractéristiques le dispositif optique permet de détecter la présence de cristaux non-linéaires présents dans une superficie d'environ 300μηη2. Selon des modes de réalisation, un tel dispositif optique peut comporter une ou plusieurs des caractéristiques suivantes.
Selon un mode de réalisation, le dispositif optique comporte en outre des moyens de déplacement configurés pour générer un déplacement relatif contrôlé entre le point de focalisation et l'échantillon selon une direction transversale à la direction du faisceau laser.
Grâce à ces caractéristiques, le dispositif optique peut être utilisé pour balayer une goutte d'un échantillon afin de détecter si des cristaux non-linéaires sont présents dans la goutte de l'échantillon. L'échantillon de matière est un échantillon de matière dont on doit déterminer s'il comporte ou non des cristaux de protéines ne présentant pas de centre d'inversion. Ces cristaux sont appelés cristaux non centro-symétriques, ou cristaux non linéaires.
Selon un mode de réalisation, la direction transversale est une première direction transversale, et les moyens de déplacement sont configurés en outre pour générer un déplacement relatif contrôlé entre le point de focalisation et le support d'échantillon selon une seconde direction transversale à la direction du faisceau laser.
Selon un mode de réalisation, le système optique comporte un miroir configuré pour réfléchir le faisceau laser présentant la longueur d'onde d'excitation et le moteur est un système galvanométrique accouplé audit miroir afin de déplacer le point de focalisation dans la direction transversale à la direction du faisceau laser.
De préférence, dans ce cas, le système galvanométrique est configuré pour produire un pas de déplacement du point de focalisation inférieure à 100μιη selon la première et/ou la seconde direction transversale à la direction du faisceau laser, de préférence inférieure à 10μιη.
Grâce à ses caractéristiques, les moyens de déplacement permettent un balayage fin de l'échantillon, avec une précision de l'ordre de 10μιη.
Selon un mode de réalisation, les moyens de déplacement permettent également un balayage grossier, pas-à-pas, de l'échantillon. Pour permettre le balayage grossier, selon un mode de réalisation, les moyens de déplacement comportent en outre un moteur pas-à-pas afin de permettre le balayage pas-à-pas de l'échantillon. Selon un mode de réalisation, le moteur pas-à-pas est configuré pour déplacer le point de focalisation au niveau du support d'échantillon selon un pas supérieur au diamètre du point de focalisation, de préférence supérieur à 100μιη.
Selon un mode de réalisation, la valeur du pas du balayage pas-à-pas de l'échantillon correspond à l'espace entre deux puits d'une plaque Greiner. Par exemple, le support d'échantillon est une plaque Greiner de 96 puits ou de 384 puits normalisée, portant une goutte dans chaque puit, c'est-à-dire par exemple 96 ou 384 échantillons de matières sur la même plaque. Le balayage grâce au moteur pas-à-pas permet de déplacer le support d'échantillon relativement au point de focalisation afin de placer pas-à-pas le point de focalisation sur chacun des puits.
Selon un mode de réalisation alternatif, le moteur pas-à-pas est configuré pour déplacer le point de focalisation au niveau du support d'échantillon avec une précision au micron prêt.
Selon un mode de réalisation, la source laser délivre un faisceau laser de puissance optique moyenne inférieure à 2W, de préférence entre 1W et 1 ,2W.
Selon un mode de réalisation, l'organe de détection comporte un photomultiplicateur. Grâce à ces caractéristiques, le signal rétrodiffusé peut être détecté afin de détecter la génération de second harmonique dans des cristaux non- linéaires générés par exemple par cristallogenèse de macromolécules de protéines.
Selon un mode de réalisation, l'organe de détection est configuré pour intégrer le signal rétrodiffusé reçu pendant un temps d'intégration supérieur à 1 με.
Selon un mode de réalisation, les moyens de déplacement sont configurés pour déplacer le point de focalisation au niveau du support d'échantillon par pas successifs périodiquement selon une période supérieure au temps d'intégration.
Selon un mode de réalisation, le dispositif optique comporte en outre une mémoire configurée pour stocker des coordonnées spatiales du support d'échantillon ou du point de focalisation correspondant à chaque acquisition de mesure, par l'organe de détection, du signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde de détection. Par exemple, la mémoire est synchronisée avec l'organe de détection de sorte à ce que les coordonnées spatiales du support d'échantillon ou du point de focalisation soient automatiquement enregistrées à chaque détection par l'organe de détection, du signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde de détection.
Selon un mode de réalisation, la source laser est une source laser impulsionnelle, de préférence une source laser femtoseconde.
Selon un mode de réalisation, la source laser impulsionnelle produit des impulsions de durée comprise entre 50fs et 500fs.
Ce dispositif peut être utilisé sur différentes longueur d'onde d'excitation en fonction des matériaux à sonder. Selon un mode de réalisation, la source laser est accordable en longueur d'onde d'excitation. Selon un mode de réalisation, la longueur d'onde d'excitation est supérieure à 280 nm, de préférence supérieure à 400nm. Un des avantages de cette plage de longueurs d'onde d'excitation est de ne pas détruire le plastique, ce qui permet de détecter la présence de cristaux non- linéaires dans des échantillons de matières posés dans des plaques en plastique. Un des avantages de cette plage de longueurs d'onde d'excitation est de ne pas endommager les cristaux non-linéaires en formation.
De nombreuses longueurs d'onde d'excitation sont disponibles pour permettre la génération de second harmonique dans des cristaux non-linéaires générés par exemple par cristallogenèse de macromolécules de protéines.
Dans un mode de réalisation, la source laser présente une longueur d'onde d'excitation A=1030nm. Un des avantages de cette source laser est d'être disponible à bas coût sur le marché.
Dans un mode de réalisation, la source laser présente une longueur d'onde d'excitation Â=800nm.
Selon un mode de réalisation, le dispositif optique comporte en outre un filtre devant l'organe de détection, le filtre étant apte à couper des signaux optiques parasites présentant la longueur d'onde d'excitation et de laisser passer le signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde de détection.
Selon un mode de réalisation, le point de focalisation présente un diamètre supérieur à quelques dizaines de micromètres. Selon un mode de réalisation, le diamètre du point de focalisation est supérieur à 20μηη.
Selon un mode de réalisation, l'invention fournit un appareil optique comprenant le dispositif optique tel que décrit précédemment, et un système d'imagerie optique, l'appareil optique comportant en outre un tube coulissant apte à coulisser entre une première position et une deuxième position,
le dispositif de séparation de longueur d'onde du dispositif optique étant agencé dans le tube coulissant de sorte à être traversé par le faisceau laser présentant la longueur d'onde d'excitation dans la direction allant de la source laser vers le support d'échantillon dans la première position du tube coulissant,
le système d'imagerie optique comportant :
une source lumineuse apte à émettre un flux lumineux,
une caméra,
un dispositif réfléchissant, et
un dispositif semi-réfléchissant apte à être traversé par le flux lumineux en direction du dispositif réfléchissant et à réfléchir un flux lumineux rétrodiffusé en provenance du support d'échantillon vers la caméra,
le dispositif réfléchissant étant apte à réfléchir le flux lumineux dans la direction du dispositif de focalisation, et à réfléchir un flux lumineux rétrodiffusé en provenance du support d'échantillon vers le dispositif semi-réfléchissant,
la caméra étant apte à détecter le flux lumineux rétrodiffusé,
le dispositif réfléchissant étant agencé dans le tube coulissant à une position espacée du dispositif de séparation de longueur d'onde de sorte à réfléchir le flux lumineux rétrodiffusé dans la seconde position du tube coulissant,
afin que la première position soit une position d'utilisation du dispositif optique et que la deuxième position soit une position d'utilisation du système d'imagerie optique.
Selon un mode de réalisation, l'invention fournit en outre une utilisation du dispositif décrit ci-dessus pour détecter l'existence de cristaux non centro- symétriques dans l'échantillon, comprenant les étapes consistant à :
• déposer un échantillon de matière à sonder sur le support d'échantillon,
• délivrer le faisceau laser, et
• détecter le signal rétrodiffusé. Selon un mode de réalisation, l'échantillon de matière comporte au moins un élément sélectionné dans la liste consistant en : toute molécule d'intérêt biologique, substances naturelles cristallisées optiquement actives en génération de second harmonique, substances naturelles cristallisées en excédant énantiomérique, protéines et acide nucléique.
Selon des modes de réalisation de l'invention, l'utilisation du dispositif peut comporter une ou plusieurs des caractéristiques ci-dessous.
Selon un mode de réalisation, l'utilisation comporte en outre les étapes consistant à:
· capturer une image en lumière blanche de l'échantillon de matière,
• enregistrer l'image en lumière blanche de l'échantillon de matière,
•après avoir détecté le signal rétrodiffusé, superposer le signal rétrodiffusé sur l'image en lumière blanche, afin de détecter la localisation de cristaux non centro-sy métriques dans l'échantillon en tant que contraste de couleurs.
Selon un mode de réalisation dans lequel la source lumineuse de l'appareil selon la revendication 15 est apte à émettre un flux lumineux en lumière blanche, l'utilisation comporte en outre les étapes consistant à:
•régler l'appareil optique dans la position d'utilisation du système d'imagerie optique,
«régler la position relative entre le support d'échantillon et le point de focalisation dans une direction parallèle à la direction du flux lumineux de sorte à projeter le point de focalisation sur une position de coupe de l'échantillon de matière,
•émettre le flux lumineux par la source lumineuse,
«détecter par la caméra le flux lumineux rétrodiffusé,
•enregistrer le flux lumineux rétrodiffusé détecté, le flux lumineux rétrodiffusé formant une image en lumière blanche de l'échantillon de matière,
•régler l'appareil optique dans la position d'utilisation du dispositif optique,
•après avoir délivré le faisceau laser par la source laser et après avoir détecté par l'organe de détection le signal rétrodiffusé présentant une longueur d'onde de détection égale à la moitié de la longueur d'onde d'excitation, superposer le signal rétrodiffusé sur l'image en lumière blanche, afin de détecter la localisation de cristaux non centro-symétriques dans l'échantillon en tant que contraste de couleurs..
Selon un mode de réalisation, l'image en lumière blanche de l'échantillon de matière étant une première image d'une première coupe de l'échantillon de matière, comportant en outre capturer et enregistrer une seconde image en lumière blanche de l'échantillon de matière, la seconde image étant une image d'une seconde coupe de l'échantillon de matière.
Selon un mode de réalisation, la première image est capturée en réglant la position relative entre le support d'échantillon et le point de focalisation dans une direction parallèle à la direction du flux lumineux de sorte à projeter le point de focalisation sur la première coupe de l'échantillon de matière, et la seconde image est capturée en réglant la position relative entre le support d'échantillon et le point de focalisation dans une direction parallèle à la direction du flux lumineux de sorte à projeter le point de focalisation sur la seconde coupe de l'échantillon de matière.
Selon un mode de réalisation, l'utilisation comporte en outre :
•détecter les parties nettes de la première image,
•détecter les parties nettes de la seconde image,
«sommer les parties nettes de la première et de la seconde image, de sorte à obtenir une image hyperfocale en lumière blanche de l'échantillon de matière,
•superposer le signal rétrodiffusé sur l'image hyperfocale en lumière blanche.
Selon un mode de réalisation, l'image hyperfocale est obtenue en sommant les parties nettes de plus de deux images de coupe de l'échantillon de matière, préférentiellement de 9 images de coupes de l'échantillon de matière.
Certains aspects de l'invention partent de l'idée de fournir un dispositif optique de détection de cristaux apte à détecter des cristaux in-situ, c'est-à-dire les cristaux non-linéaires présents dans des échantillons en cours de cristallisation.
Brève description des figures L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description suivante de plusieurs modes de réalisation particuliers de l'invention, donnés uniquement à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés.
« La figure 1 est une représentation schématique d'un dispositif optique de détection selon l'invention.
• La figure 2 est une représentation schématique d'un appareil comportant le dispositif optique de détection de la figure 1 associé à un système d'imagerie.
« La figure 3 est une représentation schématique de l'appareil de la figure 2 dans une position d'utilisation du système d'imagerie.
• La figure 4a est une image d'un échantillon de matière obtenue en lumière blanche par le système d'imagerie de la figure 3 ;
• La figure 4b est une image résultant d'une superposition de l'image de la figure 4a et de la détection de seconde harmonique par le dispositif optique de détection de la figure 1 ;
• Les figures 5a, 5b et 6 sont des images résultant de superposition d'image en lumière blanche obtenues par le système d'imagerie de la figure 3 et de détection de seconde harmonique par le dispositif optique de détection de la figure 1 , permettant d'illustrer l'efficacité de la détection de seconde harmonique par l'appareil de la figure 2 ;
Description détaillée de modes de réalisation
En référence à la figure 1 , un dispositif optique de détection 1 selon un mode de réalisation de l'invention va être décrit.
Le dispositif optique de détection 1 comporte un laser 2 puisé femtoseconde pour émettre un faisceau laser 100 présentant la longueur d'onde d'excitation A=1030nm, la puissance P=1W et produisant des impulsions de 200 fs. Le laser 2 émet le faisceau laser 100 dans une direction X. Afin de contrôler la puissance optique du faisceau laser 100, un module de contrôle 3 de la puissance optique est agencé en sortie du laser 2. Par exemple, le module de contrôle 3 peut consister en une lame demi-onde et deux prismes accolés polarisant, par exemple un Glan Taylor.
En sortie du module de contrôle 3, le faisceau laser 100 de puissance contrôlée est réfléchi par un premier miroir 4 qui est un miroir plan parfaitement réfléchissant pour la longueur d'onde d'excitation A=1030nm. Puis, le faisceau laser 100 est réfléchi à nouveau par un second miroir 5 similaire au premier miroir 4. Le premier miroir 4 et le second miroir 5 sont agencés de sorte à ce que l'angle d'incidence du faisceau laser 100 sur chacun d'eux soit environ égal à π/4 dans le plan de la figure 1 , afin que le faisceau réfléchi par le second miroir soit dans la même direction que le faisceau incident sur le premier miroir 4. Ces deux miroirs permettent d'agencer l'ensemble constitué du laser 2 et du module de contrôle 3 en un endroit choisi selon des contraintes d'encombrement mécanique, tout en permettant l'arrivée du faisceau selon la direction X choisie.
Le faisceau réfléchi par le second miroir 5 est orienté par réflexions successives sur des miroirs galvanométriques 6. Les miroirs galvanométriques 6 sont commandés par ordinateur et permettant de diriger le faisceau laser 100 précisément, à la dizaine de micron près, et très rapidement, selon une fréquence de 60Hz pour les petits déplacements et jusqu'à 1kHz pour les grands déplacements. Les miroirs galvanométriques sont au nombre de deux miroirs, chacun fixé à un système galvanométrique. Le premier miroir sert à dévier le faisceau laser 100 dans la direction X, le deuxième dans une direction Y transverse à la direction X. Ainsi, en déplaçant les miroirs de manière adéquate, il est possible de faire effectuer au faisceau la trajectoire voulue dans le plan XY.
Le faisceau laser 100 est donc dirigé vers un collimateur 7 suivant l'axe Z, consistant en une première lentille mobile 71 dans un tube 73 et une seconde lentille fixe 72 dans le tube 73 afin de collimater le faisceau optique 100, c'est-à-dire d'obtenir un faisceau laser 100 non divergeant et de direction Z en sortie du collimateur 7. La lentille mobile 71 est déplacée le long de l'axe Z afin de régler la distance focale du collimateur.
Le faisceau laser 100 en sortie du collimateur traverse un miroir dichroïque
11 transparent pour la longueur d'onde d'excitation λ.
Le faisceau laser 100 ressort du miroir dichroïque dans la même direction Z que la direction qu'il avait en entrée du miroir dichroïque. Ainsi, le faisceau laser est dirigé depuis les miroirs galvanométriques vers un objectif 8. L'objectif 8 permet de focaliser le faisceau laser 100 sur un point de focalisation 18 sur une platine 9. Le point de focalisation 18 est représenté par une croix. La platine 9 est un support d'échantillon plan, dans le plan XY. Le point de focalisation présente un diamètre de 10μηι.
La platine 9 est déplaçable selon l'axe Z, comme représenté par la flèche 17, par l'intermédiaire d'un moteur 10 afin de régler la distance entre l'objectif 8 et la platine 9. En effet, la platine 9 est destinée à recevoir un échantillon de matière 16.
Le réglage de la distance entre l'objectif 8 et la platine 9 permet de déplacer le point de focalisation 18 du faisceau laser 100 selon l'axe Z à l'intérieur de l'échantillon de matière 16.
Le réglage de la direction du faisceau laser 100 par les miroirs galvanométriques 6 permet de déplacer le point de focalisation 18 du faisceau laser 100 dans le plan XY de la platine 9.
L'échantillon de matière 16 est un échantillon de matière dont on doit déterminer s'il comporte ou non des cristaux non linéaires.
En cas de présence de tels cristaux non linéaires à l'endroit du point de focalisation 18, un signal rétrodiffusé de longueur d'onde de détection λ/2 est émis par les cristaux non linéaires. Ce phénomène est un phénomène non-linéaire appelé Génération de Second Harmonique (SHG en anglais). Le laser 2 est une source laser femtoseconde afin que la puissance crête optique reçue par l'échantillon de matière 16 au point de focalisation 18 soit suffisamment élevée pour permettre la détection d'une telle réponse non-linéaire. En effet, le signal de Second Harmonique n'est détectable qu'au-dessus d'un seuil de puissance reçu.
Le signal rétrodiffusé est diffusé dans toutes les directions de l'espace.
Dans la suite, nous appellerons « signal rétrodiffusé 200 » la partie du signal rétrodiffusé qui est diffusée dans la direction de l'axe Z et dans le sens allant de la platine 9 vers le miroir dichroïque 11. Le signal rétrodiffusé 200 est représenté par des pointillés.
Le miroir dichroïque 1 1 est réfléchissant pour la longueur d'onde de détection λ/2. Le miroir dichroïque 11 est agencé de sorte que l'angle d'incidence du signal rétrodiffusé 200 soit π/4. Ainsi, le signal rétrodiffusé 200 est réfléchi dans la direction X.
Le dispositif optique de détection 1 comporte en outre un filtre coupant 12 et un filtre passe-bande 13 sur le chemin optique dans la direction X. Le filtre coupant 12 est apte à couper un éventuel signal rétrodiffusé parasite présentant la longueur d'onde λ. Le filtre passe-bande 13 est apte à laisser passer les signaux optiques présentant une longueur d'onde dans une gamme de ± 0nm de longueurs d'ondes centrée sur λ/2 afin de filtrer d'éventuels autres signaux parasites et de laisser passer le signal rétrodiffusé 200.
Le dispositif optique de détection 1 comporte un détecteur afin de détecter le signal rétrodiffusé 200 incident. Ce détecteur est un photomultiplicateur 14 apte à amplifier le signal rétrodiffusé 200 afin de le détecter à partir d'une puissance optique seuil de quelques pW. La puissance optique reçue par le photomultiplicateur 14 dépend de la puissance du laser, de la vitesse de balayage, de l'amplification etc. Chaque réponse positive du photomultiplicateur 14 permet de déterminer de façon optimale que le point de focalisation 18 a rencontré un cristal non linéaire dans l'échantillon de matière 16.
La vitesse maximale du déplacement du point de focalisation par les miroirs galvanométriques est imposée par la fréquence d'échantillonnage et par les vitesses de déplacement des miroirs. Par exemple, cette vitesse maximale est de 100kHz.
Le dispositif optique de détection 1 comporte également une mémoire, non représentée, dans laquelle sont stockées les coordonnées spatiales du point de focalisation 18 à chaque détection par le photomultiplicateur 14 de la présence de cristaux non linéaires. Un système automatique peut être prévu pour détecter automatiquement les positions exactes des moteurs des miroirs galvanométriques 6 et du moteur de la plateforme motorisée 10, en réponse à la détection par le photomultiplicateur 14 de la présence de cristaux non linéaires. Cette mémoire est synchronisée avec le photomultiplicateur 14 afin d'associer à la détection d'un signal à la longueur d'onde de détection des coordonnées spatiales. En compilant ces informations de détection et de coordonnées associées, il est possible de recréer une image de l'échantillon. L'expérimentateur utilisant le dispositif optique de détection 1 est donc en mesure, parmi d'autres avantages, de détecter de façon optimale la présence de cristaux non linéaires en effectuant un balayage rapide de l'échantillon de matière 16. Pour cela, il lui suffit de déplacer le point de focalisation 18 comme décrit précédemment. Ainsi, il dispose des coordonnées spatiales de la présence de cristaux non-linéaires dans l'échantillon de matière 16.
Les étapes de mesures décrites ci-dessus s'appliquent à un échantillon de matière 16. Selon un mode de réalisation, l'échantillon de matière 16 est une goutte de solution mère et de molécules d'intérêt biologique dans laquelle un expérimentateur a versé un agent cristallisant, dans une certaine proportion. Cette goutte est placée dans un puit de plaque Greiner, par exemple une plaque de 96 puits. Les molécules d'intérêt biologique sont des protéines, des acides nucléiques ou toutes substances naturelles cristallisées en excédant énantiomérique.
Dans les autres puits de la plaque Greiner, l'expérimentateur a versé un agent de cristallisation dans d'autres proportions, par exemple. Il peut également avoir fait varier d'autres paramètres que la proportion d'agent de cristallisation. Ainsi, l'expérimentateur peut effectuer une batterie de test de cristallisation sur une unique plaque Greiner.
La plateforme motorisée 10 comporte en outre des moteurs de déplacements pas à pas dans les deux directions transversales au faisceau laser. Ainsi, elle permet le déplacement de la plaque Greiner afin de placer le point de focalisation successivement sur chaque puit de la plaque. Ce déplacement pas-à- pas permet de répéter les opérations décrites ci-dessus pour chaque puit de la plaque Greiner. La plateforme motorisée 10 permet ainsi des déplacements d'un puit à l'autre via les moteurs pas à pas de la platine motorisée 10. Sur une plaque Greiner, les puits sont positionnés sur des lignes et des colonnes : la plateforme permet d'effectuer des déplacements n x m correspondant respectivement au nombre de colonne et de ligne de puits présents sur la plaque.
Ce dispositif optique de détection 1 présente les avantages d'être relativement bas coût et de permettre une détection efficace et rapide de la formation de cristaux non-linéaires dans l'échantillon de matière 16. En effet, la résolution du système optique de détection est égale au diamètre du point de focalisation, supérieur à 10μιη, et permet toutefois une détection efficace des cristaux non-linéaires.
Ainsi, un tel dispositif de détection permet d'identifier rapidement par balayage d'une goutte d'échantillon de matière 16 si des cristaux non linéaires sont formés, et donc si les conditions de cristallisation testées par l'expérimentateur aboutissent bien à la cristallisation. Ces balayages sont réalisés grâce aux miroirs galvanométriques 6, à l'intérieur de chacun des puits de plaque Greiner.
De plus, la plateforme motorisée 10 permet d'identifier rapidement, en plaçant le point de focalisation successivement sur chacun des puits de la plaque Greiner, dans quel puit se trouve une goutte d'échantillon de matière 16 dans laquelle une cristallisation a abouti.
Un autre avantage de ce dispositif optique de détection 1 est de permettre une détection précoce de la formation des cristaux non-linéaires dans l'échantillon de matière 16, du fait de la simplicité du dispositif optique de détection et du temps d'intégration très court du photomultiplicateur 14. En effet, l'optimisation du montage (utilisation du strict nécessaire des optiques, réduction au maximum du trajet optique) rend le montage très lumineux. En associant à ce montage une source impulsionnelle on obtient un dispositif très efficace.
Un autre avantage de ce dispositif optique de détection 1 est d'être à bas coût relatif et compact. En effet, le dispositif optique de détection 1 s'affranchit de l'utilisation de polariseurs puisque la symétrie du cristal (et donc l'origine de tel ou tel signal détecté) n'est pas le premier critère étudié, mais la seule présence des cristaux non-linéaire est le critère étudié. Le signal rétrodiffusé brut est traité sans qu'aucun traitement post mesure ne soit nécessaire. -En effet, le dispositif optique de détection 1 est, dans un mode de réalisation préféré, un détecteur de signaux de génération de Second Harmonique et non un système d'imagerie non-linéaire complexe.
Le miroir dichroïque 11 et les filtres 12 et 13 sont agencés à l'intérieur d'un tube 15. Dans un mode de réalisation, ce tube 15 est un tube coulissant, comme expliqué en référence à la figure 2. La mobilité du tube 15 est représentée par la flèche 32, dans la direction X.
Dans ce mode de réalisation, le dispositif optique de détection 1 comporte en outre un système d'imagerie 19, comme représenté en figure 2. Le dispositif optique de détection 1 comporte tous les éléments précédemment décrits, représentés par les mêmes chiffres de référence que sur la figure 1. Le système d'imagerie 19 comporte une source lumineuse 20 apte à émettre de la lumière blanche, c'est-à-dire de spectre large, dans la direction X. Le système d'imagerie 19 comporte également une caméra 22 apte à enregistrer des images. Le système d'imagerie 19 comporte également une lame semi-réfléchissante 21 agencée de sorte à laisser passer la lumière blanche émise par la source lumineuse 20 dans la direction X et dans un premier sens, et à réfléchir une partie de la lumière blanche reçue dans la direction X et dans l'autre sens, vers la caméra 22 afin de former des images.
Le dispositif optique de détection 1 comporte en outre un miroir diélectrique 23 agencé dans le tube 15 coulissant.
Comme représenté sur la figure 2, le tube 15 est dans la même position que celle représentée sur la figure 1. Cette position est une première position, qui est une position d'utilisation du dispositif optique de détection 1 comme détecteur de cristaux non-linéaires.
Le tube 15 peut également prendre une seconde position car il est coulissant. Cette seconde position est une position d'utilisation du dispositif optique de détection 1 comme système d'imagerie des cristaux non-linéaires détectés.
Cette autre position du tube 15 va être décrite en référence à la figure 3. La figure 3 représente le dispositif optique de détection de la figure 2, dans lequel le tube 15 est dans la seconde position.
Dans cette seconde position, la lumière blanche émise par la source lumineuse 20 dans la direction X est réfléchie par le miroir diélectrique 23 dans la direction Z vers l'objectif 8. LObjectif 8 permet de focaliser la lumière blanche sur un point de focalisation 18 dans l'échantillon de matière 16. Ainsi, l'image du point de focalisation 18 est faite sur la caméra 22.
Par exemple, un expérimentateur enregistre les coordonnées spatiales du point de focalisation 18 lors d'une détection de cristaux non linéaires, par l'utilisation du dispositif de détection 1 avec le tube 15 dans la première position. Puis, l'expérimentateur fait coulisser le tube 15 dans la seconde position afin de faire l'image en lumière blanche des cristaux non-linéaires détectés, pour les mêmes coordonnées spatiales.
Ainsi, le dispositif optique de détection 1 selon ce mode de réalisation est particulièrement avantageux car il permet de faire l'image pour des points de focalisation 18 choisis, et non de faire l'image sur tout l'échantillon de matière 16, ce qui est beaucoup plus coûteux en temps et en ressources calculatoires.
Un procédé décrivant une utilisation particulièrement avantageuse de l'appareil de la Figure 2 va à présent être décrit.
Le procédé comprend les étapes suivantes :
- prendre des images hyperfocales en lumière blanche d'un échantillon de telle que représentée sur la Figure 3. Avantageusement, l'image hyperfocale est obtenue en sommant les parties nettes de plusieurs coupes en verticale de l'échantillon de matière ;
- détecter l'existence de cristaux non linéaires dans l'échantillon de matière en utilisant l'appareil dans la position de détection, telle que représentée sur la Figure 1. La détection produit une image de signal de seconde harmonique. Avantageusement, une série de balayages à différentes profondeurs, classiquement espacées de 30μιη, dans l'échantillon de matière est réalisée afin de produire l'image de signal de seconde harmonique;
- superposer l'image de signal de seconde harmonique sur l'image hyperfocale obtenue en lumière blanche.
Quelques essais préliminaires ont permis de montrer que neuf coupes verticales de l'échantillon de matière semblaient être un excellent compromis entre résolution du balayage tridimensionnel et temps expérimental.
Les Figures 4 à 6 illustrent des images obtenues par l'appareil représenté sur les Figures 1 à 3.
La figure 4A représente une image hyperfocale obtenue en lumière blanche à partir de 9 coupes d'un échantillon de matière 30 sur un support d'échantillon 24. La figure 4B à droite représente une superposition de l'image du signal de seconde harmonique 25 sur l'image hyperfocale de la Figure 4B.
L'image du signal de seconde harmonique 25 est obtenu sur un balayage vertical de 9 coupes verticales de l'échantillon de matière 30.
Dans la mise en œuvre du procédé, les zones comportant des cristaux non linéaires apparaissent en contraste de couleur par rapport à l'image en lumière blanche sur les images d'échantillon de matière. Pour les besoins de l'illustration, les résultats d'analyses de seconde harmonique 25 sont représentés sur la Figure 4B par des hachures.
On note donc la présence d'un décalage 26 entre l'image de signal de seconde harmonique 25 issu du cristal et l'image en lumière blanche de ce même cristal. Ce décalage est vraisemblablement dû à une légère différence de point de focalisation entre le laser et la lumière blanche (aberration chromatique, etc..) provenant de l'échantillon de matière qui est assez systématiquement optiquement hétérogène.
Ainsi on constate qu'il est particulièrement avantageux de corréler l'image de signal de seconde harmonique 25 issu du cristal et l'image en lumière blanche de ce même cristal pour donner un diagnostic concluant sur les zones où se situent des cristaux de protéines formés dans la goutte.
Les Figures 5a et 5b présentent des cas fréquents où la seule utilisation de la lumière blanche ou de détection de seconde harmonique n'aurait pas permis de déterminer avec certitude la présence ou non de cristaux non linéaires ainsi que sur leur localisation précise en raison de la distorsion des images provenant du milieu complexe.
Les Figures 5a et 5b présentent respectivement deux gouttes de cristallisation dans deux puits différents de plaque Greiner différents : C4 et C5. Les deux gouttes possèdent les mêmes agents précipitants et additifs mais différent par le pH de la solution, 5.5 pour le puit C4 et 6.5 pour le puit C5.
A partir de l'obtention simple de l'image en lumière blanche, des zones d'intérêt semblent être formées dans les deux puits.
Les zones imagées en lumière blanche sont par la suite imagées par le dispositif optique de détection 1. La superposition des images obtenues en lumière blanche et par détection de signal de second harmonique, représentées sur les Figures 5A et 5B, permet de déterminer très clairement que les cristaux non linéaires se situent dans le puit C5 (figure 5b ; pH=6,5) et non dans le C4 (figure 5a, pH=5,5) qui ne comporte que des 5 précipités 27 et non des cristaux non linéaires.
L'appareil de la présente invention permet de mettre en œuvre des analyses comparatives qui revêtent une importance capitale pour les cristallographes puisqu'elles leur apportent de précieuses informations sur les meilleures conditions de cristallisation et permettent un gain de temps énorme sur
Figure imgf000020_0001
Ces tests montrent qu'il est particulièrement avantageux de corréler les images obtenues en lumières blanche avec la détection de signal de seconde harmonique pour localiser avec précision les cristaux de protéines.
La Figure 6 présente un exemple où l'échantillon de matière 30 est rempli5 de précipités 27 ce qui complique drastiquement l'identification des cristaux non linéaire de protéine qui pourraient être cachés par les précipités 27. La superposition de l'image obtenue en lumière blanche avec l'image obtenue par génération de second harmonique permet de localiser avec précision les cristaux non linéaire 25 formés dans l'échantillon.
0 Dans la mise en œuvre du procédé, les zones comportant des cristaux non linéaires apparaissent en contraste de couleur par rapport à l'image en lumière blanche sur les images d'échantillon de matière. Pour les besoins de l'illustration, les zones comportant des cristaux non linéaires sont représentées sur les figures 5A, 5B et 6 par des croix entourées d'un cercle.
5 Bien que l'invention ait été décrite en liaison avec plusieurs modes de réalisation particuliers, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention.
Le terme « lentille » utilisé dans la présente description peut faire référence0 à une lentille optique simple ou à une association de lentille, ou à un quelconque système optique ayant une distance focale adéquate. L'usage du verbe « comporter », « comprendre » ou « inclure » et de ses formes conjuguées n'exclut pas la présence d'autres éléments ou d'autres étapes que ceux énoncés dans une revendication. L'usage de l'article indéfini « un » ou « une » pour un élément ou une étape n'exclut pas, sauf mention contraire, la présence d'une pluralité de tels éléments ou étapes.
Dans les revendications, tout signe de référence entre parenthèses ne saurait être interprété comme une limitation de la revendication.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif optique (1) pour détecter l'existence de cristaux non centro-symétriques dans un échantillon de matière comportant une molécule d'intérêt biologique comportant :
une source laser (2) apte à délivrer un faisceau laser présentant une longueur d'onde d'excitation,
un support d'échantillon (9) apte à recevoir un échantillon de matière (16) à sonder,
un système optique agencé entre la source laser (2) et le support d'échantillon (9) et configuré pour projeter le faisceau laser (100) sur le support d'échantillon, et
un organe de détection (14) apte à détecter un signal rétrodiffusé présentant une longueur d'onde de détection égale à la moitié de la longueur d'onde d'excitation, afin de détecter l'existence de cristaux non centro-symétriques dans l'échantillon (16),
dans lequel le système optique comprend :
un dispositif de focalisation (8) configuré pour générer un point de focalisation (18) de diamètre supérieur à 10μιη au niveau du support d'échantillon, et
un dispositif de séparation (11) de longueur d'onde apte à être traversé par le faisceau laser présentant la longueur d'onde d'excitation dans la direction allant de la source laser (2) vers le support d'échantillon, et apte à séparer spatialement le signal rétrodiffusé (200) présentant la longueur d'onde de détection d'un signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde d'excitation, les signaux rétrodiffusés étant en provenance du support d'échantillon (9),
l'organe de détection (14) étant agencé pour recevoir le signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde de détection et séparé du signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde d'excitation.
2. Dispositif optique selon la revendication 1 , comportant en outre des moyens de déplacement (6) configurés pour générer un déplacement relatif contrôlé entre le point de focalisation et l'échantillon selon une direction transversale à la direction du faisceau laser.
3. Dispositif optique selon la revendication 2, dans lequel les moyens de déplacement sont configurés en outre pour générer un déplacement relatif contrôlé (6) entre le point de focalisation et le support d'échantillon selon une seconde direction transversale à la direction du faisceau laser.
4. Dispositif optique selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le support d'échantillon est une plaque Greiner, le dispositif comportant en outre un moteur pas-à-pas configuré pour générer un déplacement relatif contrôlé entre le point de focalisation et l'échantillon selon une première et une seconde directions transversales à la direction du faisceau laser, afin de permettre de déplacer le support d'échantillon relativement au point de focalisation afin de placer pas-à-pas le point de focalisation sur chacun des puits de la plaque Greiner.
5. Dispositif optique selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le système optique comporte un miroir configuré pour réfléchir le faisceau laser présentant la longueur d'onde d'excitation et dans lequel le système de déplacement est un système galvanométrique accouplé audit miroir afin de déplacer le point de focalisation dans la direction transversale à la direction du faisceau laser.
6. Dispositif optique selon la revendication 2 à 5, dans lequel les moyens de déplacement (6) comportent en outre un système galvanométrique afin de permettre un balayage précis et rapide de l'échantillon.
7. Dispositif optique selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel le moteur pas-à-pas est configuré pour déplacer le point de focalisation (18) au niveau du support d'échantillon selon un pas supérieur au diamètre du point de focalisation.
8. Dispositif optique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel la source laser délivre un faisceau laser de puissance optique moyenne inférieure à 2W.
9. Dispositif optique (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'organe de détection comporte un photomultiplicateur.
10. Dispositif optique (1) selon Tune quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel l'organe de détection est configuré pour intégrer le signal rétrodiffusé reçu pendant un temps d'intégration supérieur à 1 \is.
1 1. Dispositif optique (1) selon la revendication 10, dans lequel les moyens de déplacement (6) sont configurés pour déplacer le point de focalisation
(18) au niveau du support d'échantillon par pas successifs périodiquement selon une période supérieure au temps d'intégration.
12. Dispositif optique selon l'une quelconque des revendications 1 à
1 1 , comportant en outre une mémoire configurée pour stocker des coordonnées spatiales du support d'échantillon ou du point de focalisation correspondant à chaque acquisition de mesure, par l'organe de détection, du signal rétrodiffusé présentant la longueur d'onde de détection.
13. Dispositif optique selon l'une quelconque des revendications 1 à
12, dans lequel la source laser (2) est une source laser impulsionnelle, de préférence une source laser femtoseconde.
14. Dispositif optique (1 ) selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, comportant en outre un filtre (12) devant l'organe de détection, le filtre étant apte à couper des signaux optiques parasites présentant la longueur d'onde d'excitation et de laisser passer le signal rétrodiffusé (200) présentant la longueur d'onde de détection.
15. Appareil optique comprenant le dispositif optique selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, et un système d'imagerie optique, l'appareil optique comportant en outre un tube coulissant (15) apte à coulisser entre une première position et une deuxième position,
le dispositif de séparation (1 1 ) de longueur d'onde du dispositif optique (1 ) étant agencé dans le tube coulissant (15) de sorte à être traversé par le faisceau laser présentant la longueur d'onde d'excitation dans la direction allant de la source laser (2) vers le support d'échantillon (9) dans la première position du tube coulissant, le système d'imagerie optique comportant :
une source lumineuse apte à émettre un flux lumineux,
une caméra, un dispositif réfléchissant (23), et
un dispositif semi-réfléchissant (21) apte à être traversé par le flux lumineux en direction du dispositif réfléchissant (23) et à réfléchir un flux lumineux rétrodiffusé en provenance du support d'échantillon (9) vers la caméra (22),
le dispositif réfléchissant (23) étant apte à réfléchir le flux lumineux dans la direction du dispositif de focalisation (8), et à réfléchir un flux lumineux rétrodiffusé en provenance du support d'échantillon (9) vers le dispositif semi-réfléchissant (21), la caméra étant apte à détecter le flux lumineux rétrodiffusé,
le dispositif réfléchissant (23) étant agencé dans le tube coulissant (15) à une position espacée du dispositif de séparation de longueur d'onde de sorte à réfléchir le flux lumineux rétrodiffusé dans la seconde position du tube coulissant (15),
afin que la première position soit une position d'utilisation du dispositif optique et que la deuxième position soit une position d'utilisation du système d'imagerie optique.
16. Utilisation du dispositif (1) selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou de l'appareil selon la revendication 15, pour détecter l'existence de cristaux non centro-sy métriques dans l'échantillon (16), comprenant les étapes consistant à :
• déposer un échantillon de matière (16) à sonder sur le support d'échantillon (9),
• délivrer le faisceau laser (100), et
• détecter le signal rétrodiffusé (200).
17. Utilisation selon la revendication 16 pour détecter l'existence de cristaux non centro-symétriques dans l'échantillon (16), dans lequel l'échantillon de matière comporte au moins un élément sélectionné dans la liste consistant en : toute molécule d'intérêt biologique, substances naturelles cristallisées optiquement actives en génération de second harmonique, substances naturelles cristallisées en excédant énantiomérique, protéines et acide nucléique.
18. Utilisation selon la revendication 16 ou 17, comprenant en outre les étapes consistant à:
• capturer une image en lumière blanche de l'échantillon de matière (16), enregistrer l'image en lumière blanche de l'échantillon de matière (16), après avoir détecté le signal rétrodiffusé (25), superposer le signal rétrodiffusé (25) sur l'image en lumière blanche, afin de détecter la localisation de cristaux non centro-symétriques dans l'échantillon en tant que contraste de couleurs.
19. Utilisation selon la revendication 16 dans laquelle l'appareil optique est selon la revendication 15, la source lumineuse étant apte à émettre un flux lumineux en lumière blanche, l'utilisation comprenant les étapes consistant à:
régler l'appareil optique dans la position d'utilisation du système d'imagerie optique,
régler la position relative entre le support d'échantillon et le point de focalisation dans une direction parallèle à la direction du flux lumineux de sorte à projeter le point de focalisation (18) sur une position de coupe de l'échantillon de matière (16),
émettre le flux lumineux par la source lumineuse,
détecter par la caméra le flux lumineux rétrodiffusé,
enregistrer le flux lumineux rétrodiffusé détecté, le flux lumineux rétrodiffusé formant une image en lumière blanche de l'échantillon de matière (16), régler l'appareil optique dans la position d'utilisation du dispositif (1) optique, après avoir délivré le faisceau laser par la source laser et après avoir détecté par l'organe de détection le signal rétrodiffusé (25) présentant une longueur d'onde de détection égale à la moitié de la longueur d'onde d'excitation, superposer le signal rétrodiffusé (25) sur l'image en lumière blanche, afin de détecter la localisation de cristaux non centro-symétriques dans l'échantillon en tant que contraste de couleurs.
20. Utilisation selon la revendication 18 ou 19, l'image en lumière blanche de l'échantillon de matière (16) étant une première image d'une première coupe de l'échantillon de matière (16), comportant en outre les étapes consistant à capturer et enregistrer une seconde image en lumière blanche de l'échantillon de matière (16), la seconde image étant une image d'une seconde coupe de l'échantillon de matière (16), l'utilisation comportant en outre les étapes consistant à :
• détecter les parties nettes de la première image,
• détecter les parties nettes de la seconde image,
• sommer les parties nettes de la première et de la seconde image, de sorte à obtenir une image hyperfocale en lumière blanche (30) de l'échantillon de matière (16),
• superposer le signal rétrodiffusé (25) sur l'image hyperfocale en lumière blanche (30).
21. Utilisation selon la revendication 20 prise en combinaison de la revendication 19, dans laquelle la première image est capturée en réglant la position relative entre le support d'échantillon (9) et le point de focalisation dans une direction parallèle à la direction du flux lumineux de sorte à projeter le point de focalisation (18) sur la première coupe de l'échantillon de matière (16), et la seconde image est capturée en réglant la position relative entre le support d'échantillon (9) et le point de focalisation (18) dans une direction parallèle à la direction du flux lumineux de sorte à projeter le point de focalisation (18) sur la seconde coupe de l'échantillon de matière (16), l'utilisation comportant en outre :
• détecter les parties nettes de la première image,
• détecter les parties nettes de la seconde image,
• sommer les parties nettes de la première et de la seconde image, de sorte à obtenir une image hyperfocale en lumière blanche (30) de l'échantillon de matière (16), superposer le signal rétrodiffusé (25) sur l'image hyperfocale en lumière blanche (30).
22. Utilisation de l'appareil optique selon la revendication 20 ou 21 , dans laquelle l'image hyperfocale est obtenue en sommant les parties nettes de plus de deux images de coupe de l'échantillon de matière (16), préférentiellement de neuf images de coupes de l'échantillon de matière (16).
PCT/FR2016/052664 2015-10-16 2016-10-14 Dispositif optique de détection WO2017064440A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1559912 2015-10-16
FR1559912A FR3042595A1 (fr) 2015-10-16 2015-10-16 Dispositif optique de detection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017064440A1 true WO2017064440A1 (fr) 2017-04-20

Family

ID=55135334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2016/052664 WO2017064440A1 (fr) 2015-10-16 2016-10-14 Dispositif optique de détection

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3042595A1 (fr)
WO (1) WO2017064440A1 (fr)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1684107A2 (fr) * 2005-01-21 2006-07-26 Olympus Corporation Procédé d'examen et outil d'aide à l'examen
US20090166570A1 (en) * 2007-12-26 2009-07-02 Olympus Corporation Biological-specimen observation apparatus
WO2014012848A1 (fr) * 2012-07-17 2014-01-23 École Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Dispositif et procédé de mesure et d'imagerie de rayonnement diffusé à génération de seconde harmonique
US20140363883A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-11 BellBrook Labs Device for cell culture and direct imaging
US20150292981A1 (en) * 2012-10-22 2015-10-15 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Shg imaging technique for assessing hybrid eo polymer/silicon photonic integrated circuits

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1684107A2 (fr) * 2005-01-21 2006-07-26 Olympus Corporation Procédé d'examen et outil d'aide à l'examen
US20090166570A1 (en) * 2007-12-26 2009-07-02 Olympus Corporation Biological-specimen observation apparatus
WO2014012848A1 (fr) * 2012-07-17 2014-01-23 École Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Dispositif et procédé de mesure et d'imagerie de rayonnement diffusé à génération de seconde harmonique
US20150292981A1 (en) * 2012-10-22 2015-10-15 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Shg imaging technique for assessing hybrid eo polymer/silicon photonic integrated circuits
US20140363883A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-11 BellBrook Labs Device for cell culture and direct imaging

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARLOS MACIAS-ROMERO ET AL: "High throughput second harmonic imaging for label-free biological applications", OPTICS EXPRESS, vol. 22, no. 25, 8 December 2014 (2014-12-08), pages 31102, XP055284477, DOI: 10.1364/OE.22.031102 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR3042595A1 (fr) 2017-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1740974B1 (fr) Procede et systeme de mesure de vitesse du flux sanguin
EP3465153B1 (fr) Dispositif et procede d'acquisition d'une particule presente dans un echantillon
EP3132237B9 (fr) Appareil et procédé de microscopie à balayage de faisceau optique
EP2394194B1 (fr) Procede et dispositif d'acquisition de signaux en microscopie laser a balayage
EP2795390B1 (fr) Microscopie optique non-linéaire quantitative utilisant un faisceau mis en forme
EP3241014B1 (fr) Système d'analyse d'un échantillon transparent avec contrôle de position, et procédé associé
EP3704471B1 (fr) Appareil et procede de microscopie a fluorescence a super-resolution et de mesure de temps de vie de fluorescence
CN104020153A (zh) 一种拉曼光谱检测系统和检测方法
FR3013129A1 (fr) Dispositif et methode de mise au point tridimensionnelle pour microscope
FR2808888A1 (fr) Dispositif d'observation sequentielle d'echantillons et procedes l'utilisant
EP2649431B1 (fr) Systeme et procede d'imagerie multitechniques pour l'analyse chimique, biologique ou biochiimique d'un echantillon.
FR2768814A1 (fr) Procede et dispositif optiques d'analyse de surface d'onde
EP3918292A1 (fr) Dispositifs d'analyse de front d'onde et systemes d'imagerie microscopique comprenant de tels dispositifs d'analyse
EP0997729A1 (fr) Dispositif de détermination de la concentration d'une substance mélangée à un fluorophore et procédé de mise en oeuvre de ce dispositif
JP2004361087A (ja) 生体分子解析装置
WO2017064440A1 (fr) Dispositif optique de détection
EP3724725A1 (fr) Procede de calibration d'un dispositif d'analyse et dispositif associe
WO2022122981A1 (fr) Microscope confocal avec réallocation de photons
EP3237889B1 (fr) Spectrofluorimètre à leds pour l'analyse d'un objet et procédé d'analyse correspondant
FR2981452A1 (fr) Dispositif de determination du comportement mecanique local d'une eprouvette de materiau
FR3048514A1 (fr) Microscopie optique non-lineaire quantitative
WO2016008952A1 (fr) Systeme de trajectographie automatique pour microscope optique base sur une camera rapide intelligente
WO2023194263A1 (fr) Procédés d'imagerie microscopique de fluorescence et dispositifs de correction de front d'onde pour la mise en œuvre de tels procédés
WO2011086290A1 (fr) Procede et systeme d'analyse moleculaire a commutation de mesures d'imagerie et de spectroscopie

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16793965

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16793965

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1