WO2017061816A1 - 쿠커비투릴[6]을 이용한 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법 - Google Patents

쿠커비투릴[6]을 이용한 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법 Download PDF

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WO2017061816A1
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amyloid
length
fiber
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fibers
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김준곤
최태수
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고려대학교 산학협력단
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    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
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    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01F—CHEMICAL FEATURES IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OF CARBON FILAMENTS
    • D01F4/00—Monocomponent artificial filaments or the like of proteins; Manufacture thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling the length of amyloid fibers using cucurbituril [6], and more particularly, to control the amyloid fiber by controlling the amyloid fibrosis process using cucurbituril [6] during the fiberization reaction of amyloid protein dissolved in formic acid solvent. It relates to a method of adjusting the length of the.
  • Amyloid fiber is a quaternary structure of protein, which is made through self-assembly of amyloid proteins. Amyloid proteins are arranged in the form of beta-platelets during self-assembly, resulting in long fibers.
  • Non-Patent Document 1 Such amyloid fibrosis is a typical phenomenon due to metastable properties of proteins (Non-Patent Document 1).
  • the basic structure of a protein is spontaneously formed from an unfolded polypeptide chain (Non Patent Literature 2), which suggests that the structure is thermodynamically stable in an isolated system of a single protein (Non Patent Literature 3).
  • Non Patent Literature 2 The basic structure of a protein is spontaneously formed from an unfolded polypeptide chain
  • Non Patent Literature 3 suggests that the structure is thermodynamically stable in an isolated system of a single protein
  • Non Patent Literature 3 Non Patent Literature 3
  • most of the amyloid proteins are converted into metastable states in the process of self-assembly of the proteins into amyloid fibers (Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 protein misfolding disease
  • Non-Patent Document 6 biological activity of the organism
  • amyloid fibers present on the outer wall of bacterial cells are used as a means of countering external invasion, and it is known that melanin pigments in mammals are fixed to the parts composed of amyloid fibers to function as pigments.
  • amyloid fibers As biomaterials with various functions has been greatly interested through their assembly structure studies (Non-Patent Documents 9 and 10), and recently, amyloid in nature
  • Non-Patent Documents 9 and 10 assembly structure studies
  • amyloid fiber As a rigid structure, many studies have been conducted to use amyloid fiber as a new kind of nanomaterial.
  • One of the advantages of amyloid fiber is that the strength of the fiber is very similar to that of the spider web, which is also similar to that of steel (cobweb 0.9-1.5 GPa, steel 0.6 -1.8 GPa, amyloid 0.2- 14 GPa).
  • Non-Patent Documents 11 and 12 the complexity of amyloid fibrosis due to the metastable and assembly heterogeneity of the protein hinders the strict control of the fibrosis.
  • one of the attempted methods to control the self-assembly of amyloid proteins is to use the owner-guest chemistry. Specifically, when a specific residue of the amyloid protein and a synthetic receptor cause owner-guest interaction with each other, the formation of amyloid fiber is suppressed.
  • beta-cyclodextrin derivatives and lysine-specific molecules have been studied. Synthetic receptors such as forceps, cucurbitur [6] reels, and cucurbitur [7] reels have been reported to interact with phenylalanine or lysine of amyloid proteins.
  • the main goal of these studies is to limit the establishment of therapeutic strategies for degenerative diseases by ultimately inhibiting the self-assembly of amyloid proteins.
  • amyloid fibers having various functions are currently synthesized and used, and as a result, it is expected that proteins forming each unit of the fiber will have an increasingly complex structure. As the protein structure becomes more complicated, the formation mechanism of amyloid fiber becomes more complicated, and thus, the shape or length of the fiber cannot be controlled, so that by-products or aggregates of undesired forms are more likely to be generated. Therefore, the development of a technique for controlling the form and length of amyloid fibers by controlling the fibrosis of amyloid is urgently required, but an efficient method has not been developed so far.
  • Non-Patent Document 1 P. Ciryam, R. Kundra, RI Morimoto, CM Dobson, M. Vendruscolo, Supersaturation is a major driving force for protein aggregation in neurodegenerative diseases. Trends Pharmacol. Sci. 36 , 72-77 (2015).
  • Non-Patent Document 2 CM Dobson, Protein folding and misfolding. Nature 426 , 884-890 (2003).
  • Non-Patent Document 3 FU Hartl, A. Bracher, M. Hayer-Hartl, Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature 475 , 324-332 (2011).
  • Non-Patent Document 4 FU Hartl, M. Hayer-Hartl, Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat. Struct . Mol . Biol . 16 , 574-581 (2009).
  • Non-Patent Document 5 F. Chiti, CM Dobson, Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75 , 333-366 (2006).
  • Non-Patent Document 6 DM Fowler, AV Koulov, WE Balch, JW Kelly, Functional amyloid-from bacteria to humans. Trends Biochem . Sci . 32 , 217-224 (2007).
  • Non-Patent Document 7 M. So, D. Hall, Y. Goto, Revisiting supersaturation as a factor determining amyloid fibrillation. Curr . Opin . Struct . Biol . 36 , 32-39 (2016).
  • Non-Patent Document 8 A Liquid-to-Solid Phase Transition of the ALS Protein FUS Accelerated by Disease Mutation. Cell 162 , 1066-1077 (2015).
  • Non-Patent Document 9 CM Rufo et al. , Short peptides self-assemble to produce catalytic amyloids. Nat. Chem. 6 , 303-309 (2014).
  • Non-Patent Document 10 M. Nishijima et al. , Supramolecular photochirogenesis with functional amyloid superstructures. Chem. Commun. 49 , 8916-8918 (2013).
  • Non-Patent Document 11 TPJ Knowles, MJ Buehler, Nanomechanics of functional and pathological amyloid materials. Nat. Nanotechnol . 6 , 469-479 (2011).
  • Non-Patent Document 12 G. Lee et al. , Self-assembled amyloid fibrils with controllable conformational heterogeneity. Sci. Rep. 5 , (2015).
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems of the prior art, in the present invention to provide a method for controlling the length of amyloid fibers by using the cucurbituril [6] during the fiberization reaction of amyloid protein dissolved in formic acid solvent do.
  • the present invention to solve the above problems,
  • a method for controlling the length of amyloid fibers characterized in that the mixing and stirring of cucurbituril [6] during the fibration reaction of amyloid protein dissolved in formic acid solvent.
  • the length of the amyloid fiber may be adjusted by adjusting the concentration of the formic acid solvent or the concentration of cucurbituril [6].
  • the concentration of the formic acid solvent may be 0.1 to 15% (v / v).
  • the concentration of the cucurbituril [6] may be 1 to 1000 times the amyloid protein concentration.
  • the stirring speed may be 100 to 500 rpm.
  • the cucurbituril [6] may selectively bind to a lysine (Lysine, Lys) residue of the amyloid protein.
  • the amyloid protein may be selected from the group consisting of insulin, lysozyme, amyloid beta 40, amyloid beta 42, amylin, human islet amyloid polypeptide.
  • the length of the amyloid fiber can be adjusted within the range of 10 nm to 10 ⁇ m.
  • the polydispersity index (PDI) of the amyloid fiber length may be 1.2 to 1.6.
  • the amyloid fiber can be controlled by adjusting the concentration of the cucurbituril [6], the formic acid solvent and the stirring speed when the amyloid fibrosis reaction of the amyloid protein is carried out, and providing the amyloid fiber having a uniform length and size.
  • the inherent functionality of the fibers can be optimized.
  • A) shows nucleation-growth polymerization process
  • B) shows structure of CB [6]
  • C) contains a single lysine (Lys) residue
  • INS insulin
  • FIG. 2 is a diagram showing the effects of agitation and CB [6] upon INS fiber formation.
  • A) is a TEM image of INS fibers formed in 5% (v / v) formic acid (FA) solution. The concentration of INS and CB [6] were respectively 50 ⁇ M and 5 mM.
  • B) shows the average length of the INS fibers of FIG. 2A.
  • FIG. 3 shows the length of INS fibers at various FA concentrations
  • A) is a TEM image of INS fibers at various concentrations of FA.
  • Ref is a representative image of INS fibers formed in the absence of CB [6]. The numbers listed in the image correspond to the fibers formed in the presence of CB [6] at each FA concentration. All fibers were prepared under the conditions of a concentration of 50 ⁇ M and 500 m ⁇ each stirring speed 200 rpm, INS and CB [6].
  • B) shows the average length of the fibers determined from the TEM image of FIG. 3A.
  • FIG. 4 is a diagram showing the phase transition of INS induced by CB [6],
  • A) shows the centrifugation process of the INS-CB [6] solution.
  • B) shows the change in concentration of INS with the concentration of CB [6] in 5% (v / v) FA solution.
  • C) shows the concentration of INS at various FA concentrations in the presence of 5 mM CB [6].
  • D) shows the coexistence between phase transition of INS and fiber assembly. Phase transition of INS by CB [6] controls the concentration of INS monomers in nucleation. The concentration of INS is 50 ⁇ .
  • FIG. 5 shows the mechanism of INS fibrosis controlled by CB [6], where A) shows a ThT analysis of the motion of INS fibrosis at various concentrations of CB [6]. The concentration of INS was 50 ⁇ . The CB [6] condition of 5 mM was excluded due to the turbidity of CB [6] in the solution. B) is a schematic of kinetic regulation mediated by CB [6] in nucleation-growth polymerization, and C) shows the correlation between the length of the fiber and the ratio of monomer: nucleus. As the amount of CB [6] decreases (left) or increases (right), the fiber length becomes shorter or longer, respectively.
  • FIG. 6 is a diagram showing the effect of mixing CB [6] with various amyloid-forming proteins.
  • A) is a TEM image of hIAPP, LYZ, A ⁇ 42, and A ⁇ 40 fibers.
  • the concentration of LYZ is 50 ⁇ M
  • the concentration of hIAPP, A ⁇ 42 and A ⁇ 40 is 10 ⁇ M.
  • FIG. 7A is a TEM image of INS fibers formed in 5% FA solution at various CB [6] concentrations.
  • B) is the average length of the INS fibers of A).
  • the concentration of the INS and 50 ⁇ M was stirring is 200 rpm.
  • FIG. 9A is an SEM image of INS fibers formed at various FA concentrations (%).
  • B) is the average length of the INS fibers of FIG. 9A. No fibers were observed at 0.1, 3, and 30% (v / v) FA conditions. All fibrosis proceeded without stirring and the concentration of INS was 50 ⁇ .
  • INS INS-CB [6].
  • the number inside the rectangle suggests a secondary bond of CB [6].
  • INS showed 4+ to 6+ charges.
  • INS-CB [6] complex peaks were detected with the same charge state.
  • a 1: 1 INS-CB [6] complex was observed as the main species, and a complex with CB [6] (INS-2CB [6]) was detected in small portions (FIG. 10).
  • Some interaction of INS with CB [6] has been shown to occur in the presence of positively charged residues of proteins ((N-terminus, histidine, and arginine).
  • INS and their B-chain fragment (INSB1) is 3.0 ⁇ 10 3 and 2.9 ⁇ 10 3 M, respectively exhibited the K a value similar to the first.
  • Lys was mutated to Ala in INSB2, resulting in a decrease of K a value of 1.0 ⁇ 10 3 M ⁇ 1 in INSB2.
  • FIG. 13A is an ESI-MS 2 spectrum of the INS-CB [6] complex. Asterisks indicate fragments complexed with CB [6].
  • B) shows MS 2 fragmentation pathway of INS-CB [6]. Bars with filled circles represent INS fragments complexed with CB [6], bars without filled circles represent only INS fragments.
  • the fragmentation pathway of the complexes represents the y-type fragment at the INS B-Chain C-terminus and the b-type fragment at the INS B-Chain N-terminus. Most of the C-terminal y-type fragments complexed with CB [6], while the N-terminal b-type fragments did not complex with CB [6].
  • C) is a Lys-selected fragment bound to CB [6] at m / z 549 (5) (SW Heo et al. , Host-Guest Chemistry in the Gas Phase: Selected Fragmentations of CB [6] -Peptide Complexes at Lysine Residues and Its Utility to Probe the Structures of Small Proteins.Anal.Chem . 83 , 7916-7923 (2011).).
  • 15 is a representative schematic of the supramolecular chain-growth polymerization.
  • Figure 16 is A) IR spectrum of untreated INS fiber, B) is IR spectrum of INS fiber after washing CB [6] and nonfibroma.
  • FIG. 17 shows the fiber length of INS under various CB [6] concentrations and various FA concentrations.
  • the concentration of INS was 50 ⁇ .
  • A) is the ESI-MS spectrum of hIAPP and hIAPP-CB [6]. hIAPP showed a 5+ charge state in 3+, and hIAPP-CB [6] complex showed the same charge state. The 1: 1 complex of hIAPP-CB [6] was the main species, and small amounts of (hIAPP-2CB [6]), more complex with CB [6], were detected.
  • B) is the ESI-MS spectrum of LYZ and LYZ-CB [6].
  • LYZ showed a 10+ charge at 8+, and the complex of LYZ-CB [6] showed the same charge.
  • the 1: 1 complex of LYZ-CB [6] was the main species, and small amounts of (LYZ-2CB [6]), more complex with CB [6], were detected.
  • C) and D) are ESI-MS spectra of A ⁇ peptides and A ⁇ -CB [6] complexes.
  • the ⁇ peptide showed 5+ charge states in 3+, and the ⁇ -CB [6] complex also showed the same charge state.
  • the 1: 1 complex of A [beta] -CB [6] was the main species and a small amount of (A [beta] -2CB [6]), more complex with CB [6], was detected.
  • 19A is the ESI-MS 2 spectrum of the hIAPP-CB [6] complex. Asterisks indicate fragments complexed with CB [6].
  • B) is the ESI-MS3 spectrum of the hIAPP-CB [6] complex. Asterisks indicate fragments complexed with CB [6].
  • C) is the MS 2 and MS 3 fragmentation pathway of the hIAPP-CB [6] complex. Bars with filled circles represent hIAPP fragments complexed with CB [6], bars without filled circles represent hIAPP fragments only.
  • D) is a Lys-selected fragment bound to CB [6] at m / z 549 (5). These results indicate that Lys is the most important binding region of CB [6] that binds to hIAPP peptide.
  • C is a Lys-selected fragment bound to CB [6] at m / z 549 (5). Lys-selected fragments of LYZ were obtained using the qTOF instrument (Synapt G2) because the molecular weight of LYZ was too large to exert collision energy in ion traps (LTQ velos). These results indicate that Lys is the most important binding region of CB [6] that binds to the LYZ peptide.
  • 21 is an ESI-MS 2 spectrum of the A ⁇ 42-CB [6] (A) and A ⁇ 40-CB [6] (B) complexes. Asterisks indicate fragments complexed with CB [6].
  • C) is the MS 2 fragmentation pathway of the A ⁇ 42-CB [6] complex and D) is the MS 2 fragmentation pathway of the A ⁇ 40-CB [6] complex. Bars with filled circles represent A ⁇ fragments complexed with CB [6] and bars without filled circles represent A ⁇ fragments only.
  • E) and F) are Lys-selected fragments at m / z 549. These results indicate that Lys16 and Lys28 are the most important binding regions of CB [6] that bind to ⁇ peptides.
  • a ⁇ 40 fibrosis 1: 100 ratio was excluded due to scattering of light by CB [6].
  • the A ⁇ 40 solution was incubated with stirring at 50 ° C. and 200 rpm.
  • the concentration of A ⁇ 40 was 10 ⁇ .
  • 24A is an SEM image of INS fibers formed under various temperatures without stirring.
  • B) is the average fiber length of the fibers formed in A).
  • the concentration of INS was 50 ⁇ .
  • 25 is a representative image measured from KLONK image measurements.
  • INS fibers were incubated under stirring conditions of 0.1% FA (v / v), 500 ⁇ M CB [6] and 200 rpm.
  • Raw data is on the left and processed data is on the right.
  • the present invention provides a method for controlling the length of amyloid fibers, characterized in that the mixing and stirring of cucurbituril [6] during the fibration reaction of amyloid protein dissolved in formic acid solvent.
  • the length of the amyloid fiber can be controlled by adjusting the concentration of the formic acid solvent or the concentration of cucurbituril [6].
  • the concentration of the formic acid solvent is preferably 0.1 to 15% (v / v).
  • the concentration of the cucurbituril [6] is preferably 1 to 1000 times the amyloid protein concentration.
  • the stirring speed is preferably 100 to 500 rpm.
  • the cucurbituril [6] when added to the fibrosis reaction of the amyloid protein, it may selectively bind to the lysine (Lysine, Lys) residue of the amyloid protein.
  • the amyloid protein may be selected from the group consisting of insulin, lysozyme, amyloid beta 40, amyloid beta 42, amylin, human islet amyloid polypeptide, but not necessarily limited thereto, so long as it forms amyloid fiber through a fibrosis reaction.
  • the length of the amyloid fiber can be freely adjusted within the range of 10 nm to 10 ⁇ m.
  • the polydispersity index (PDI) of the amyloid fiber length can be uniformly adjusted to the length of the amyloid fiber from 1.2 to 1.6.
  • Human recombinant insulin (incinc free), hen egg white lysozyme (LYZ), CB [6] hydrate and formic acid (FA) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
  • Human islet amyloid polypeptide (hIAPP) and amyloid-ß-1-40 peptide were purchased from Peptron (Daejon, Republic of Korea) and amyloid-ß-1-42 peptide was obtained from Anygen (Jangheung, Republic of Korea).
  • Protein stock solution was made of a 100 ⁇ M concentration dissolved in the FA solution, 0.1%, 50 mM CB [6 ] stock solution was prepared by dissolving in 50% FA solution.
  • the stock solution was transferred to 4 mL borosilicate glass bottles and finally diluted to a final volume of 1 mL. 5% (v / v) concentration of insulin and lysozyme, in order to prevent agglomeration prior to incubation in the FA solution in a concentration of 50 ⁇ M, and human amyloid - ⁇ island amyloid peptide was adjusted to 10 ⁇ M. All protein solutions were incubated at 50 ° C. for 4 days and stirring was performed at 200 rpm. Solid CB [6] above the solubility limit was fixed at the bottom of the 4 mL bottle because CB [6] had poorly soluble properties in aqueous solution. In addition, the effect of changing the temperature was tested without stirring, and it was confirmed that the temperature is not an important factor in improving the uniformity of the length generation of the fiber (Fig. 24).
  • Formvar / carbon coated copper grid 400-mesh was purchased from Electron Microscopy Science (Hatfield, PA, USA). Culture solution (5 ⁇ L) samples (Aliquots) was found for 3 minutes on a grid was removed with a micropipette tip. Finally, 1 w / w% uranyl acetate solution dissolved in water was captured on the grid for 1 minute. Treatment with 5% FA at a time for 5 seconds to remove CB [6] remaining in the grid. Treated grids were analyzed using a JEM-1011 transmission electron microscope (JEOL, Japan) and Tecnai G2 F30ST (FEI, USA).
  • the length and thickness of the fibers were measured using 'KLONK image measurement' software (Denmark).
  • the length and thickness of the fiber were defined as the distance and width between the ends of the fiber, respectively.
  • Fiber lengths of 500-2000 types and fiber thicknesses of 200 types were measured. Representative examples measured using KLONK are shown in FIG. 25.
  • the average length of the fibers is shown in Figures 3 and 17 below, the standard deviation of the average length was converted using the following formula.
  • ThT analysis was performed to obtain information about fibrosis movement. 1 mg / mL of ThT stock solution was prepared. Incubating the protein solution prior to fluorescence analysis of the sample 25 ⁇ L, ThT stock solution was mixed with 25 ⁇ L and 5% FA solution, 450 ⁇ L. The excitation wavelength of ThT was set to 452 nm and emission was scanned at 460-490 nm. Luminescence at 482 nm was used for fibrosis kinetic monitoring. Since the fluorescence intensity of ThT increases when complexed with CB [6], the baseline was corrected using a protein-free ThT-CB [6] solution. All data points were normalized using the height of the stationary phase.
  • ITC Isothermal titration calorimetry
  • ITC experiments were performed using the ITC calorimeter (Microcal, Worcestershire, UK) to obtain the equilibrium binding constant ( K a ) for the interaction of insulin with CB [6].
  • Insulin and CB [6] solutions were freshly prepared and degassed before measurement. Reference cells were filled with 50% FA and 100 ⁇ M of insulin solution dissolved in 50% (v / v) FA solution was loaded into ITC cells. 1 Mm of CB [6] solution was injected 30 times through an ITC syringe. The injection interval was 3 minutes. The ITC cell was stirred at 502 rpm and kept at 25 ° C. All data was processed using "single-set-of-sites" stored in Origin 7.0 of the VP-ITC calorimeter.
  • a protein solution with or without CB [6] was prepared, and the concentration of protein in the solution was measured.
  • the solution was mixed for 1 minute and then centrifuged at 18,000 ⁇ g, 4 ° C. for 15 minutes.
  • UV-visible spectra of the supernatant of the centrifuged solution were obtained using an HP5520 UV-Vis spectrophotometer (HP, Santa Clara, CA, USA).
  • the concentration of insulin was calculated using an extinction coefficient of 5960 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 at 280 nm.
  • the concentrations of human islet amyloid polypeptide and amyloid- ⁇ were calculated using an extinction coefficient of 1490 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 at 280 nm.
  • the concentration of lysozyme was calculated using an absorption coefficient of 37,970 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 at 280 nm.
  • Dual mass spectrometry (MS 2 ) using electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) and collision-induced dissociation (CID) is an LTQ velos dual ion trap mass spectrometer with an ESI source in cationic mode (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).
  • ESI variables were set as follows: Electrospray voltage: 3.5 kV; Capillary temperature: 150 ° C.
  • CID analysis of [LYZ-CB [6]] 9+ was measured using a Synapt G2 HDMS quadrupole time of flight (qTOF) instrument equipped with a traveling ion mobility mass spectrometer (TWIMS; Waters, Milford, Mass., USA).
  • ESI parameters were set as follows: electrospray voltage: 1.5 kV; capillary temperature: 80 ° C.
  • Infrared spectra were measured using a Nicolet iS10 spectrometer (Thermo Scientific, Waltham, Mass., USA). A total of 128 spectra for each sample were averaged into one spectrum to obtain a resolution of 4 cm ⁇ 1 .
  • the unwashed sample was cast directly onto the silicon wafer and dried in air for one day. Cleaned samples were loaded with Amicon 0.5 mL 100k centrifugal filters (Millipore, Billerica, Mass., USA) and then washed three times with 5% FA (v / v) before loading onto silicon wafers for excess CB [6]. And nonfibrous species were removed. All IR spectra were normalized using the highest peak intensity in the 1500-1900 cm ⁇ 1 range.
  • PDI (RG Gilbert et al., Dispersity in polymer science (IUPAC Recommendations 2009) (vol 81, pg 351, 2009). Pure Appl. Chem. 81, 779-779 (2009).) Has a number average degree of polymerization (number average degree is the ratio of mass average degree of polymerization (L w ) to (L n ) (Equation 2).
  • the PDI value is 1 if the polymer is ideally monodisperse. PDI values are generally greater than 1 due to heterogeneous distribution of polymers.
  • Amyloid fibrosis generally follows the nucleation-growth polymerization model shown in FIG. 1A (M. So, D. Hall, Y. Goto, Revisiting supersaturation as a factor determining amyloid fibrillation. Curr . Opin . Struct . Biol . 36 , 32-39 (2016).). This mechanism suggests that fibrosis is initiated by nucleation of monomeric proteins, and then nuclear elongation is achieved by the addition of monomers for amyloid fiber formation.
  • the nucleus is formed in the initial stage of an assembly process having a high assembled state than in the nucleus is formed in the second half (Pinotsi D. et al., Direct Observation of Heterogeneous Amyloid Fibril Growth Kinetics via Two-Color Super-Resolution Microscopy. Nano Lett . 14, 339-345 (2014)), the distribution of fibers assembled also have a polydispersity (DH Zhao, JS Moore, Nucleation -elongation:.... A mechanism for cooperative supramolecular polymerization Org Biomol Chem 1, 3471-3491 ( 2003)). Therefore, inhibiting additional nucleation during elongation of the preformed nucleus may be one strategy for control of the fiber assembly.
  • the host-guest chemistry was used to demonstrate the motion control of amyloid self-assembly, which can control the length and low heterogeneity of amyloid fibers.
  • the main advantage of this approach is that it can predict the formation of protein-receptor complexes based on rational design of host-guest interactions (HH Lee et al. , Supramolecular Inhibition of Amyloid Fibrillation by Cucurbit [7]). uril. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 7461-7465 (2014)). For this reason, owner-guest interaction is a function of protein recognition (JM Chinai et al. , Molecular Recognition of Insulin by a Synthetic Receptor. J. Am. Chem .
  • Lysine-Specific Molecular Tweezers are Broad-Spectrum Inhibitors of Amyloid Assembly and Toxicity of Proteins J. Am. Chem. Soc. 133, has been widely applied to 16958-16969 (2011)).
  • Master-guest in the present invention by taking advantage of chemical bonding to a lysine residue of a protein 6 glycolate ruril repeating unit (Lagona, P. Mukhopadhyay, S. Chakrabarti , L. Isaacs, The cucurbit [n] uril family Angew. Chem . Int . Ed. 44 , 4844-4870 (2005)) provides a method of controlling amyloid fibrosis using a cucurbituril [6] (FIG.
  • the length of the formed fiber can be adjusted from several tens of nanometers to ten micrometers, and the polydispersity index (PDI) of about 1.2-1.6 can be used to uniformly form the length of the fiber. Can be.
  • PDI polydispersity index
  • Insulin fiber was produced using a solution of 50 ⁇ M insulin dissolved in formic acid (formic acid, FA) solution in 50 °C 5% (v / v ).
  • FA formic acid
  • TEM transmission electron microscopy
  • the fiber length (2.3 ⁇ 3.0 ⁇ m) of the INS is widely dispersed with a PDI index of approximately 2.8 (FIG. 2A and Table 1), which is characterized by Baited INS solution suggests that the formation of non-uniform INS fibers.
  • the INS solution was stirred at 200 rpm.
  • short fibers (53 ⁇ 31 nm) were obtained at a PDI index of 1.3 ( Figure 2A and Table 1). This suggests that the homogeneity of the fibers is improved when performing stirring, while the elongation of the fibers is reduced.
  • the fiber length was found to be approximately similar to 37-53 nm in 5% (v / v) FA solution, whereas in the presence of CB [6] the fiber length was several tens of nanometers as FA concentration decreased. (37 ⁇ 19 nm) increased to approximately 10 micrometers in size (8.5 ⁇ 4.8 ⁇ m) (FIG. 3B). In particular, PDI values were maintained in the range of 1.2-1.6 (Table 3). In conclusion, it can be seen that the low polydispersity index for the length of the fiber can be controlled by controlling the amount of CB [6] that exceeds the solubility limit in the solution with continuous stirring of the solution.
  • the present invention measured the concentration of INS dissolved in solution under various CB [6] concentrations and various concentrations of FA solution.
  • the obtained solution was centrifuged at 18,000 ⁇ g to remove impurities such as insoluble aggregates, and the concentration of dissolved INS present in the supernatant was measured by UV absorption at 280 nm after centrifugation.
  • concentration of INS decreases as the amount of CB [6] increases (Fig. 4B), whereas the concentration of FA (v / v) is constant when the amount of CB [6] is 5 mM.
  • the crystallization step of the small guest -CB [6] complex Similar to
  • the phase transition of INS can be induced by owner-guest interaction with CB [6], and it is expected that inversion from water solubility will also be possible.
  • a phase transition of INS occurs with fiber assembly (FIG. 4D) and can be seen to affect the concentration of INS monomer in solution during nucleation.
  • fiber assembly FIG. 4D
  • fiber elongation during stirring is limited due to the rapid consumption of monomers.
  • As the amount of CB [6] in the INS solution increased (FIG. 5A). The lag phase also increased.
  • the amount of CB [6] in the solution increased, the length of the fiber also increased, while low dispersion (PDI 1.3-1.5) by stirring was maintained (FIG. 7).
  • the fibrosis process is similar to supramolecular chain-growth polymerization in which the length of the chain is uniformly controlled according to the ratio of initiator and monomer (FIG. 15) (J. Kang et al. , A rational strategy for the realization of chain-growth supramolecular polymerization . Science 347, 646-651 (2015)).
  • CB [6] plays a role in inhibiting the nucleation process through the transfer of INS (FIG. 4D);
  • the active concentration of the water-soluble INS decreases during fiber assembly, the insoluble INS is dissociated from CB [6] for active fiber formation and redissolved in solution (P.
  • the redissolved INS acts as a monomer that interacts with the nucleus formed for elongation of the INS fiber.
  • Infrared measurements can support this conjecture from the fact that the fibers formed in the presence and absence of CB [6] exhibit similar absorption patterns (FIG. 16). However, when the insoluble state is expanded by excessive introduction of CB [6], the elongation of the fiber is limited.
  • k CB [6] ( ⁇ 10 0 -10 2 M -1 s - 1 ) is higher than k nu ( ⁇ 10 -2 M -1 s -1 ) value in INS fibrosis, K nu for the A ⁇ peptide was equal to k CB [6] ( ⁇ 100 M-1s-1 for A ⁇ 40,> 100 M-1s-1 for A ⁇ 42) ( 13, 36 ).
  • Fibrosis of hIAPP was approximately 100-fold slower than A ⁇ 40, and LYZ fibrosis was slower than fibrosis of other proteins (VN Uversky, AL Fink, Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded. Biochim . Biophys .
  • amyloid fibers of various amyloid forming proteins can be regulated through kinetic control of fiber assembly by the introduction of CB [6].
  • the phase transition of proteins can dynamically control the ratio of monomers to nucleus and thus control the length of the fibers similarly to the chain-growth polymerization scheme while maintaining low dispersion.
  • in vitro and in vivo amyloid fibers have only been characterized for amyloidosis inhibition, but biological functions or soft material applications require precise control of fiber assembly.
  • the present invention provides insight into the rational strategy of supramolecular control of amyloid fibers based on phase transfer of proteins by synthetic receptors. This approach can not only understand the protein self-assembly that occurs in biological systems, but can also be used to acquire functional amyloid fibers for material applications.
  • amyloid protein (insulin, lysozyme, amyloid beta 40, amyloid beta 42, amylin, human islet amyloid polypeptide) that causes amyloid fibrosis as in the present invention.
  • amyloid protein insulin, lysozyme, amyloid beta 40, amyloid beta 42, amylin, human islet amyloid polypeptide
  • the length of the amyloid fiber can be freely adjusted by adjusting the concentration of the formic acid solvent and the stirring rate, and it was confirmed that the amyloid fiber having a uniform shape and length distribution can be obtained.
  • the formation of amyloid fibers can be efficiently induced by inhibiting the formation of amorphous aggregates, which are by-products generated in the production of amyloid fibers.
  • the amyloid fiber can be controlled by adjusting the concentration of the cucurbituril [6], the formic acid solvent and the stirring speed when the amyloid fibrosis reaction of the amyloid protein is carried out, and providing the amyloid fiber having a uniform length and size.
  • the inherent functionality of the fibers can be optimized.

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Abstract

본 발명은 쿠커비투릴[6]을 이용한 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포름산 용매에 용해된 아밀로이드성 단백질의 섬유화 반응 시 쿠커비투릴[6]를 이용하여 아밀로이드 섬유화 과정을 제어함으로써 아밀로이드 섬유의 길이를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 아밀로이드성 단백질의 아밀로이드 섬유화 반응 수행시 쿠커비투릴[6], 포름산 용매의 농도 및 교반 속도 조절을 통해 아밀로이드 섬유의 길이를 조절할 수 있으며, 균일한 길이와 크기를 가진 아밀로이드 섬유를 제공함으로써 아밀로이드 섬유의 고유 기능성을 최적화할 수 있다. 또한, 아밀로이드 섬유의 생성과정에서 발생하는 부산물인 비정형 응집체의 형성을 억제함으로써 아밀로이드 섬유의 형성을 효율적으로 유도할 수 있다.

Description

쿠커비투릴[6]을 이용한 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법
본 발명은 쿠커비투릴[6]을 이용한 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포름산 용매에 용해된 아밀로이드성 단백질의 섬유화 반응 시 쿠커비투릴[6]를 이용하여 아밀로이드 섬유화 과정을 제어함으로써 아밀로이드 섬유의 길이를 조절하는 방법에 관한 것이다.
아밀로이드 섬유는 단백질의 사차구조로 이루어진 물질로서, 아밀로이드성 단백질들의 자가조립을 통해 만들어진다. 아밀로이드성 단백질들은 자가조립 과정에서 베타 평판 구조의 형태로 배열됨으로써 길다란 형태의 섬유를 만들게 된다.
이러한 아밀로이드 섬유화는 단백질의 준안정적(metastable) 특성에 기인하는 대표적인 현상이다(비특허문헌 1). 단백질의 기본적인 구조는 펼쳐진 폴리펩티드 체인으로부터 자발적으로 형성되며(비특허문헌 2), 이는 상기 구조가 단일 단백질의 고립된 시스템 내에서 열역학적으로 안정한 상태임을 암시한다(비특허문헌 3). 그러나, 단백질-단백질 상호작용의 존재하에서 아밀로이드성 단백질의 대부분은 단백질이 아밀로이드 섬유로 자가조립되는 과정에서 준안정 상태로 전환된다(비특허문헌 4). 이러한 섬유화 과정은 단백질 미스폴딩 질환(비특허문헌 5)과 생물의 생물학적 활성(비특허문헌 6)을 초래하는바 단백질의 준안정성과 아밀로이드 섬유화 사이의 상관관계에 대한 관심 및 관련 연구가 늘어나고 있다(비특허문헌 1, 7, 8).
대표적인 예로서 아밀로이드성 단백질의 섬유화로 인한 자가조립 현상은 퇴행성 질환과 연관이 있으며, 예를 들어 이형 당뇨와 연관된 아밀린, 알츠하이머 병과 연관된 아밀로이드 베타, 파킨슨 병과 연관된 알파 시누클린 및 타우 단백질의 응집현상 등이 있다. 또한, 최근 연구에 의하면 아밀로이드 섬유가 질병에만 연관되지 않고 특정 생물체의 생체기능에 필요한 단단한 막의 역할을 하는 경우들이 보고되고 있다. 대표적인 예로써 박테리아 세포의 외벽에 존재하는 아밀로이드 섬유는 외부의 침입에 대항하는 수단으로 쓰이고 있으며 포유류의 멜라닌 색소가 아밀로이드 섬유로 구성된 부분에 고정되어 색소로서의 기능을 한다는 것이 알려져 있다.
이러한 섬유화 과정의 병리학적 및 생물학적 관련성 외에도, 그들의 조립구조 연구를 통해 다양한 기능을 가진 바이오소재로서의 아밀로이드 섬유의 잠재성이 큰 관심을 받고 있으며(비특허문헌 9, 10), 최근에는, 자연에서 아밀로이드 섬유가 견고한 구조체로써 쓰이는 점에 착안하여, 아밀로이드 섬유를 새로운 종류의 나노소재로써 사용하려는 연구들이 많이 진행되어 왔다. 아밀로이드 섬유의 장점 중 하나는 섬유의 강도가 거미줄의 강도와 매우 유사한 수준을 나타낸다는 것으로, 이는 또한 강철이 가지는 것과 유사한 수준에 해당한다(거미줄 0.9-1.5 GPa, 강철 0.6 -1.8 GPa, 아밀로이드 0.2-14 GPa).
이처럼 강도가 우수한 아밀로이드 물질의 골격을 얻기 위해서는 섬유 조립체의 조작이 매우 중요한바, 섬유 조립체를 조작하는 많은 시도가 이루어지고 있다(비특허문헌 11, 12). 그러나, 단백질의 준안정성 및 조립 이질성(assembly heterogeneity)으로 인한 아밀로이드 섬유화의 복잡성은 상기 섬유화의 엄격한 조절을 방해한다. 아밀로이드 섬유에 대한 이러한 연구들은 모두 섬유 조립체의 조절과 관련된 공통적인 문제를 가지는바, 아밀로이드 섬유화의 다음 과제는 아밀로이드 조립의 조절을 위한 합리적인 전략을 개발하는 것이 될 것이다.
한편, 아밀로이드성 단백질의 자가조립 현상을 조절하기 위해서 그동안 시도된 방법 중 하나는 주인-손님 화학을 이용하는 것이다. 구체적으로 아밀로이드성 단백질의 특정 잔기와 합성 수용체가 서로 주인-손님 상호작용을 일으키게 되면, 아밀로이드 섬유의 형성이 억제되는 방식을 이용하는 것인데, 현재까지 관련 연구로서, 베타-싸이클로덱스트린 유도체, 라이신 특이적인 분자집게, 쿠커비투[6]릴, 쿠커비투[7]릴 등의 합성 수용체가 아밀로이드성 단백질의 페닐알라닌이나 라이신과 상호작용하는 경우들이 보고되고 있다. 그러나 이들 연구의 주요 목표는 아밀로이드성 단백질들의 자가조립을 궁극적으로 억제하여 퇴행성 질환의 치료 전략 수립에 한정되어 있다.
앞에서 살펴본 바와 같이, 현재 다양한 기능을 가진 아밀로이드 섬유들이 합성되어 사용되고 있으며, 이로 인하여 앞으로는 섬유의 각 단위체를 이루는 단백질이 점점 복잡한 구조를 가지게 될 것으로 예상된다. 이처럼 단백질의 구조가 복잡해질수록 아밀로이드 섬유의 형성 메커니즘 또한 복잡해져 섬유의 형태나 길이를 조절할 수 없어 원하지 않는 형태의 부산물 또는 응집체가 생성될 가능성이 높다. 따라서, 아밀로이드의 섬유화를 제어하여 아밀로이드 섬유의 형태와 길이를 조절하는 기술에 대한 개발이 절실히 요구되고 있으나, 현재까지 이와 관련된 효율적인 방법은 개발되어 있지 않은 실정이다.
(비특허문헌 1) P. Ciryam, R. Kundra, R. I. Morimoto, C. M. Dobson, M. Vendruscolo, Supersaturation is a major driving force for protein aggregation in neurodegenerative diseases. Trends Pharmacol. Sci. 36, 72-77 (2015).
(비특허문헌 2) C. M. Dobson, Protein folding and misfolding. Nature 426, 884-890 (2003).
(비특허문헌 3) F. U. Hartl, A. Bracher, M. Hayer-Hartl, Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature 475, 324-332 (2011).
(비특허문헌 4) F. U. Hartl, M. Hayer-Hartl, Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat. Struct . Mol . Biol . 16, 574-581 (2009).
(비특허문헌 5) F. Chiti, C. M. Dobson, Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).
(비특허문헌 6) D. M. Fowler, A. V. Koulov, W. E. Balch, J. W. Kelly, Functional amyloid - from bacteria to humans. Trends Biochem . Sci . 32, 217-224 (2007).
(비특허문헌 7) M. So, D. Hall, Y. Goto, Revisiting supersaturation as a factor determining amyloid fibrillation. Curr . Opin . Struct . Biol . 36, 32-39 (2016).
(비특허문헌 8) A. Patel et al., A Liquid-to-Solid Phase Transition of the ALS Protein FUS Accelerated by Disease Mutation. Cell 162, 1066-1077 (2015).
(비특허문헌 9) C. M. Rufo et al., Short peptides self-assemble to produce catalytic amyloids. Nat. Chem. 6, 303-309 (2014).
(비특허문헌 10) M. Nishijima et al., Supramolecular photochirogenesis with functional amyloid superstructures. Chem. Commun. 49, 8916-8918 (2013).
(비특허문헌 11) T. P. J. Knowles, M. J. Buehler, Nanomechanics of functional and pathological amyloid materials. Nat. Nanotechnol . 6, 469-479 (2011).
(비특허문헌 12) G. Lee et al., Self-assembled amyloid fibrils with controllable conformational heterogeneity. Sci. Rep. 5, (2015).
본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명에서는 포름산 용매에 용해된 아밀로이드성 단백질의 섬유화 반응 시 쿠커비투릴[6]을 이용하여 아밀로이드 섬유의 길이를 조절하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
포름산 용매에 용해된 아밀로이드성 단백질의 섬유화 반응 시 쿠커비투릴[6]을 혼합 및 교반시키는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 포름산 용매의 농도 또는 쿠커비투릴[6]의 농도를 조절하여 아밀로이드 섬유의 길이를 조절할 수 있다.
이때, 상기 포름산 용매의 농도는 0.1 내지 15%(v/v)일 수 있다.
또한, 상기 쿠커비투릴[6]의 농도는 아밀로이드성 단백질 농도의 1 내지 1000배일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 교반 속도는 100 내지 500 rpm일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 쿠커비투릴[6]는 상기 아밀로이드성 단백질의 라이신(Lysine, Lys) 잔기에 선택적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 아밀로이드성 단백질은 인슐린, 리소자임, 아밀로이드 베타 40, 아밀로이드 베타 42, 아밀린, 인간 섬 아밀로이드 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 아밀로이드 섬유의 길이는 10 nm 내지 10 ㎛ 범위 내에서 조절될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 아밀로이드 섬유 길이의 다분산지수(Polydispersity index, PDI)는 1.2 내지 1.6일 수 있다.
본 발명에 따르면 아밀로이드성 단백질의 아밀로이드 섬유화 반응 수행시 쿠커비투릴[6], 포름산 용매의 농도 및 교반 속도 조절을 통해 아밀로이드 섬유의 길이를 조절할 수 있으며, 균일한 길이와 크기를 가진 아밀로이드 섬유를 제공함으로써 아밀로이드 섬유의 고유 기능성을 최적화할 수 있다. 또한, 아밀로이드 섬유의 생성과정에서 발생하는 부산물인 비정형 응집체의 형성을 억제함으로써 아밀로이드 섬유의 형성을 효율적으로 유도할 수 있다.
도 1은 아밀로이드 섬유화의 메커니즘을 나타낸 도면으로, A)는 핵생성-성장 중합 과정을 나타내고, B)는 CB[6]의 구조를 나타내며, C)는 단일 라이신(Lys) 잔기를 포함하는(빨간색으로 표시) 인슐린(INS)의 구조를 나타낸다.
도 2는 INS 섬유 형성시 교반과 CB[6]의 영향을 나타낸 도면으로, A)는 5%(v/v) 포름산(formic acid, FA) 용액에서 형성된 INS 섬유들의 TEM 이미지이다. INS 및 CB[6]의 농도는 각각 50 μM 및 5 mM이었다. B)는 도 2A의 INS 섬유들의 평균 길이를 나타낸다.
도 3은 다양한 FA 농도(%)에서의 INS 섬유의 길이를 나타낸 도면으로, A)는 다양한 농도의 FA에서의 INS 섬유의 TEM 이미지이다. Ref는 CB[6]의 부존재하에서 형성된 INS 섬유의 대표적인 이미지이다. 이미지 내에 기재된 숫자는 각 FA 농도에서 CB[6]의 존재하에 형성된 섬유들에 대응한다. 모든 섬유들은 교반 속도 200 rpm, INS 및 CB[6]의 농도 각각 50 μM 및 500 Μm의 조건하에서 제조되었다. B)는 도 3A의 TEM 이미지로부터 결정된 섬유의 평균 길이를 나타낸다.
도 4는 CB[6]에 의해 유도되는 INS의 상전이를 나타낸 도면으로, A)는 INS-CB[6] 용액의 원심분리 공정을 나타낸다. B)는 5%(v/v) FA 용액하에서 CB[6]의 농도에 따른 INS의 농도 변화를 나타낸다. C)는 5 mM 의 CB[6] 존재하에서 다양한 FA 농도(%)에 따른 INS의 농도를 나타낸다. D)는 INS의 상전이와 섬유 조립 사이의 공존을 나타낸다. CB[6]에 의한 INS의 상전이는 핵생성에서 INS 단량체의 농도를 제어한다. INS의 농도는 50 μM이다.
도 5는 CB[6]에 의해 제어되는 INS 섬유화의 메커니즘을 나타낸 도면으로, A)는 다양한 CB[6]의 농도에 따른 INS 섬유화의 운동에 대한 ThT 분석을 나타낸다. INS의 농도는 50 μM이었다. 용액에서 CB[6]의 탁도(turbidity) 로 인해 5 mM의 CB[6] 조건은 제외되었다. B)는 핵형성-성장 중합에서 CB[6]에 의해 매개되는 운동 조절의 개략도이고, C)는 섬유의 길이와 단량체:핵의 비율 간의 상관관계를 나타낸다. CB[6]의 양이 감소(왼쪽) 또는 증가(오른쪽)함에 따라 섬유길이는 각각 짧아지거나 길어진다.
도 6은 다양한 아밀로이드 형성 단백질에 CB[6] 혼합시 효과를 나타낸 도면으로, A)는 hIAPP, LYZ, Aβ42, 및 Aβ40 섬유들의 TEM 이미지이다. B)는 CB[6]에 의해 조절되는 아밀로이드 섬유의 길이를 나타낸다. LYZ의 농도는 50 μM, hIAPP, Aβ42 및Aβ40의 농도는 10 μM 이다.
도 7의 A)는 다양한 CB[6] 농도에서 5% FA 용액에서 형성된 INS 섬유의 TEM 이미지이다. B)는 A)의 INS 섬유의 평균 길이이다. INS의 농도는 50 μM이고 교반은 200 rpm이었다.
도 8은 INS 섬유의 평균 두께이다. 오차 범위 내에서 큰 변화는 관찰되지 않았다.
도 9의 A)는 다양한 FA 농도(%)에서 형성된 INS 섬유의 SEM이미지이다. B)는 도 9A의 INS 섬유의 평균 길이이다. 0.1, 3, 및 30%(v/v) FA 조건에서는 섬유가 관찰되지 않았다. 모든 섬유화는 교반 없이 진행하였으며 INS의 농도는 50 μM이었다.
도 10은 INS 용액의 Native-PAGE 결과이다. 별표는 INS에 결합된 CB[6] 유닛의 수를 암시한다. INS의 농도는 50 μM이었다
도 11은 INS 및 INS-CB[6]의 ESI-MS 스펙트럼이다. 사각형 내부의 숫자는 CB[6]의 2차 결합을 암시한다. INS는 4+ 내지 6+ 차지(charge)를 보여주었다. INS-CB[6] 복합체 피크는 동일한 차지 상태로 검출되었다. 1:1의 INS-CB[6] 복합체는 주요 종으로 관찰되었고, CB[6] (INS-2CB[6])와의 복합체는 작은 부분으로 검출되었다(도 10). INS와 CB[6]의 약간의 상호작용은 단백질((N-terminus, histidine, and arginine)의 양 전하 잔기의 존재시에 발생하는 것으로 나타났다.
도 12는 CB[6]의 A) INS, B) INSB1, and C) INSB2와의 ITC 측정 결과를 나타낸다. D)는 CB[6] with INS와 그들의 B-chain 단편이 결합된 CB[6]의 K a 값을 나타낸다. INS와 그들의 B-chain 단편(INSB1)은 각각 3.0×103 및 2.9×103 M- 1 로 유사한 K a 값을 나타내었다. INSB1에서 Lys의 효과를 시험하기 위해 INSB2에서 Lys는 Ala로 변이시켰고, 그 결과 INSB2에서 K a 값은 1.0×103 M-1로 감소하였다. 이러한 ITC 결과는 Lys가 INS와 CB[6] 사이의 상호작용에 매우 중요함을 나타낸다.
도 13의 A)는 INS-CB[6] 복합체의 ESI-MS2 스펙트럼이다. 별표는 CB[6]와 복합화된 단편을 나타낸다. B)는 INS-CB[6]의 MS2 단편화 경로를 나타낸다. 채워진 원을 가진 막대는 CB[6]와 복합화된 INS 단편을 나타내고, 채워진 원이 없는 막대는 INS 단편만을 나타낸다. 복합체의 단편화 경로는 INS B-Chain C-말단의 y-type 단편 및 INS B-Chain N-말단의 b-type 단편을 나타낸다. C-말단의 y-type 단편 대부분은 CB[6]와 복합체를 형성하였으나, N-말단의 b-type 단편은 CB[6]와 복합체를 형성하지 않았다. C)는 m/z 549(5)에서 CB[6]와 결합된 Lys-선택된 단편이다(S. W. Heo et al., Host-Guest Chemistry in the Gas Phase: Selected Fragmentations of CB[6]-Peptide Complexes at Lysine Residues and Its Utility to Probe the Structures of Small Proteins. Anal. Chem. 83, 7916-7923 (2011).).
도 14는 교반 존재 또는 부존재시 INS 섬유화의 운동에 대한 ThT 분석이다. INS의 농도는 50 μM이었다.
도 15는 초분자적 체인-성장 중합 과정(chain-growth polymerization)의 대표적인 개략도이다.
도 16은 A) 무처리된 INS 섬유의 IR 스펙트럼이고, B)는 CB[6] 및 비섬유종을 세척한 후의 INS 섬유의 IR 스펙트럼이다.
도 17은 다양한 CB[6] 농도 및 다양한 FA 농도(%)하에서의 INS의 섬유 길이를 나타낸다. INS의 농도는 50 μM이었다.
도 18은 CB[6]의 존재 또는 부존재시 단백질의 ESI-MS 스펙트럼이다. 사각형에 있는 숫자는 단백질의 결합된 CB[6] 유닛의 수를 암시한다. A)는 hIAPP 및 hIAPP-CB[6]의 ESI-MS 스펙트럼이다. hIAPP 는 3+ 에서 5+ 차지 상태를 보여주었고, hIAPP-CB[6] 복합체도 동일한 차지상태를 보여주었다. hIAPP-CB[6]의 1:1 복합체는 주요 종이었으며, CB[6]과 더 복합화된 (hIAPP-2CB[6])는 소량 검출되었다. B)는 LYZ 및 LYZ-CB[6]의 ESI-MS 스펙트럼이다. LYZ 는 8+ 에서 10+ 차지 상태를 보여주었고, LYZ-CB[6]의 복합체도 동일한 차지상태를 보여주었다. LYZ-CB[6]의 1:1 복합체는 주요 종이었으며, CB[6]과 더 복합화된 (LYZ-2CB[6])는 소량 검출되었다. C)와 D)는 Aβ 펩타이드 및 Aβ-CB[6] 복합체의 ESI-MS 스펙트럼이다. Aβ 펩타이드는 3+ 에서 5+ 차지 상태를 보여주었고, Aβ-CB[6] 복합체도 동일한 차지상태를 보여주었다. Aβ-CB[6]의 1:1 복합체는 주요 종이었으며, CB[6]과 더 복합화된 (Aβ-2CB[6])는 소량 검출되었다.
도 19의 A)는 hIAPP-CB[6] 복합체의 ESI-MS2 스펙트럼이다. 별표는 CB[6]와 복합화된 단편을 암시한다. B)는 hIAPP-CB[6] 복합체의 ESI-MS3 스펙트럼이다. 별표는 CB[6]와 복합화된 단편을 암시한다. C)는 hIAPP-CB[6] 복합체의 MS2 및 MS3 단편화 경로이다. 채워진 원을 가진 막대는 CB[6]와 복합화된 hIAPP 단편을 나타내고, 채워진 원이 없는 막대는 hIAPP 단편만을 나타낸다. D)는 m/z 549(5)에서 CB[6]와 결합된 Lys-선택된 단편이다. 이러한 결과는 Lys가 hIAPP 펩타이드에 결합하는 CB[6]의 가장 중요한 결합 영역임을 나타낸다.
도 20의 A)는 LYZ-CB[6] 복합체의 ESI-MS2 스펙트럼이다. 별표는 CB[6]와 복합화된 단편을 암시한다. B)는 LYZ-CB[6] 복합체의 MS2 단편화 경로이다. 채워진 원을 가진 막대는 CB[6]와 복합화된 LYZ 단편을 나타내고, 채워진 원이 없는 막대는 LYZ 단편만을 나타낸다. C)는 m/z 549(5)에서 CB[6]와 결합된 Lys-선택된 단편이다. LYZ의 분자량이 너무 커서 이온 트랩(LTQ velos)에서 충돌에너지를 발휘할 수 없기 때문에, LYZ의 Lys-선택된 단편은 qTOF instrument (Synapt G2)을 사용하여 획득하였다. 이러한 결과는 Lys가 LYZ 펩타이드에 결합하는 CB[6]의 가장 중요한 결합 영역임을 나타낸다.
도 21은 Aβ42-CB[6](A) 및 Aβ40-CB[6](B) 복합체의 ESI-MS2 스펙트럼이다. 별표는 CB[6]와 복합화된 단편을 암시한다. C)는 Aβ42-CB[6] 복합체의 MS2 단편화 경로이고, D)는 Aβ40-CB[6] 복합체의 MS2 단편화 경로이다. 채워진 원을 가진 막대는 CB[6]와 복합화된 Aβ 단편을 나타내고, 채워진 원이 없는 막대는 Aβ 단편만을 나타낸다. E) 및 F)는 m/z 549에서의 Lys-선택된 단편이다. 이러한 결과는 Lys16 및 Lys28이 Aβ 펩타이드에 결합하는 CB[6]의 가장 중요한 결합 영역임을 나타낸다.
도 22는 5% FA 상등액에서의 단백질 농도이다. CB[6] 농도는 5 mM이었다.
도 23은 Aβ40 섬유화의 ThT 분석이다. Aβ40:CB[6] = 1:100 비율은 CB[6]에 의한 빛의 산란으로 인해 제외하였다. Aβ40 용액은 50 ℃, 200 rpm으로 교반하면서 인큐베이팅 하였다. Aβ40 의 농도는 10 μM이었다.
도 24의 A)는 교반 없이 다양한 온도하에서 형성된 INS 섬유의 SEM 이미지이다. B)는 A)에서 형성된 섬유의 평균 섬유 길이이다. INS의 농도는 50 μM이었다.
도 25는 KLONK image measurements로부터 측정된 대표적인 이미지이다. 이러한 이미지에서 INS 섬유는 0.1% FA(v/v), CB[6] 500 μM 및 200 rpm의 교반 조건 하에서 인큐베이팅 되었다. 미가공 데이터는 왼쪽이고 가공된 데이터는 오른쪽이다.
본 발명은 포름산 용매에 용해된 아밀로이드성 단백질의 섬유화 반응 시 쿠커비투릴[6]을 혼합 및 교반시키는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법을 제공한다.
이때, 상기 포름산 용매의 농도 또는 쿠커비투릴[6]의 농도를 조절하여 아밀로이드 섬유의 길이를 조절할 수 있다.
상기 포름산 용매의 농도는 0.1 내지 15%(v/v)인 것이 바람직하다.
또한, 상기 쿠커비투릴[6]의 농도는 아밀로이드성 단백질 농도의 1 내지 1000배인 것이 바람직하다.
또한, 상기 교반 속도는 100 내지 500 rpm인 것이 바람직하다.
또한, 상기 쿠커비투릴[6]가 상기 아밀로이드성 단백질의 섬유화 반응에 투입되면 상기 아밀로이드성 단백질의 라이신(Lysine, Lys) 잔기에 선택적으로 결합할 수 있다.
상기 아밀로이드성 단백질은 섬유화 반응을 통해 아밀로이드 섬유를 형성하는 것이라면 반드시 이에 제한되는 것은 아니지만 인슐린, 리소자임, 아밀로이드 베타 40, 아밀로이드 베타 42, 아밀린, 인간 섬 아밀로이드 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 상기 아밀로이드 섬유의 길이는 10 nm 내지 10 ㎛ 범위 내에서 자유롭게 조절될 수 있다.
또한, 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 상기 아밀로이드 섬유 길이의 다분산지수(Polydispersity index, PDI)는 1.2 내지 1.6로 아밀로이드 섬유의 길이를 균일하게 조절할 수 있다.
이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
물질 및 방법
단백질 섬유(Protein fibril) 제조
인간 재조합 인슐린(zinc free), 암닭 알 흰자위 리소자임(hen egg white lysozyme, LYZ), CB[6] 수화물 및 포름산(formic acid, FA)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 인간 섬 아밀로이드 폴리펩타이드(Human islet amyloid polypeptide, hIAPP) 및 아밀로이드-ß-1-40 펩타이드는 Peptron (Daejon, Republic of Korea)에서 구매하였고, 아밀로이드-ß-1-42 펩타이드는 Anygen (Jangheung, Republic of Korea)에서 구매하였다. 단백질 스톡 용액은 0.1% FA 용액에서 용해된 100 μM 농도로 제조하였고, 50 mM CB[6] 스톡 용액은 50% FA 용액에서 용해시켜 제조하였다. 스톡 용액은 4 mL 의 붕규산염 유리 병에 옮긴 뒤 최종 1 mL 의 부피로 최종 희석하였다. 5%(v/v) FA 용액에서 인큐베이션 하기 전에 응집되는 것을 방지하기 위하여 인슐린과 리소자임의 농도는 50 μM, 아밀로이드-β 및 인간 섬 아밀로이드 펩타이드의 농도는 10 μM 으로 조정하였다. 모든 단백질 용액은 50 ℃ 에서 4일 동안 인큐베이팅 하였으며, 교반은 200 rpm에서 수행하였다. CB[6]가 수용액에서 난용성 성질을 가지기 때문에 용해도 한계 이상의 고체 CB[6]를 4 mL 병의 바닥에 정착시켰다. 또한, 교반없이 온도의 변화 효과를 테스트 하였으며, 이를 통해 섬유의 길이 생성의 균일성 향상에 온도는 중요한 요소가 아님을 확인하였다(도 24).
TEM 분석을 위한 샘플 처리
포름바(Formvar)/탄소 코팅된 구리 그리드(400-mesh)는 Electron Microscopy Science (Hatfield, PA, USA)에서 구매하였다. 배양액(5 μL)의 표본(Aliquots)이 그리드 상에서 3분 동안 발견되었으며, 마이크로피펫 팁을 이용하여 제거하였다. 최종적으로, 물 중에 용해된 1 w/w% 우라닐 아세테이트 용액이 그리드 상에서 1분 동안 포착되었다. 그리드에 잔존하는 CB[6] 제거를 위해 5초 동안 한번에 5% FA로 처리하였다. 처리된 그리드는 JEM-1011 transmission electron microscope (JEOL, Japan) 및 Tecnai G2 F30ST (FEI, USA)를 이용하여 분석하였다.
섬유 분석
섬유의 길이 및 두께는 ‘KLONK image measurement' 소프트웨어 (Denmark)를 이용하여 측정하였다. 섬유의 길이 및 두께는 각각 섬유의 종단 간 거리 및 폭으로 정의하였다. 500-2000 종류의 섬유 길이 및 200 종류의 섬유 두께를 측정하였다. KLONK를 이용하여 측정된 대표적인 예는 도 25에 도시되어 있다. 섬유의 평균 길이는 하기 도 3 및 도 17에 나타내었으며, 평균 길이의 표준 편차는 하기의 식을 사용하여 변환하였다.
[식 1]
△y=1/ln10·(△x/x)
티오플라핀 T (ThT) 분석
ThT 분석은 섬유화 운동에 관한 정보를 획득하기 위해 수행하였다. ThT 스톡 용액 1 mg/mL 를 제조하였다. 형광 분석 전에 인큐베이팅된 단백질 용액 표본 25 μL, ThT 스톡 용액 25 μL 및 5% FA 용액 450 μL를 혼합하였다. ThT 의 여기 파장은 452 nm으로 설정하고, 발광은 460-490 nm로 스캔되었다. 482 nm에서의 발광은 섬유화 운동 모니터링에 사용하였다. CB[6]와 복합체 형성시 ThT 의 형광 강도가 증가하기 때문에, 기준선은 단백질이 없는 ThT-CB[6] 용액을 사용하여 수정하였다. 모든 데이터 포인트는 고정상(stationary phase)의 높이를 이용하여 정규화하였다.
등온 적정 열량 측정(Isothermal titration calorimetry ,ITC)
인슐린과 CB[6]의 상호작용에 대한 평형 결합 상수(K a)를 얻기 위하여, ITC calorimeter (Microcal, Worcestershire, UK)를 이용하여 ITC 실험을 수행하였다. 인슐린과 CB[6] 용액은 측정 전에 새로 준비 및 탈기하였다. 기준 셀은 50% FA로 채우고, 50%(v/v) FA 용액에 용해된 인슐린 용액 100 μM은 ITC 셀에 로딩하였다. CB[6] 용액 1 Mm은 ITC 시린지를 통해 30회 주입하였다. 주입 간격은 3분이었다. ITC 셀을 502 rpm 에서 교반하고 25 ℃로 유지하였다. 모든 데이터는 VP-ITC calorimeter의 Origin 7.0에 저장되어 있는 "single-set-of-sites"를 이용하여 처리하였다.
UV-vis 분광법
CB[6] 첨가 또는 무첨가 단백질 용액을 준비하고, 용액의 단백질의 농도를 측정하였다. 용액을 1분 동안 혼합시킨 후, 18,000×g, 4 ℃에서 15분 동안 원심분리 하였다. 원심분리된 용액의 상등액의 UV-visible 스펙트럼을 HP5520 UV-Vis spectrophotometer (HP, Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 획득하였다. 인슐린의 농도는 280 nm에서 5,960 M-1cm-1의 흡광 계수를 이용하여 계산하였다. 인간 섬 아밀로이드 폴리펩타이드 및 아밀로이드-β의 농도는 280 nm에서 1,490 M-1cm-1의 흡광 계수를 이용하여 계산하였다. 리소자임의 농도는 280 nm에서 37,970 M-1cm-1의 흡광 계수를 이용하여 계산하였다.
전자분무이온화 질량분석(Electrospray ionization mass spectrometry)
전자분무이온화 질량 분석(ESI-MS) 및 충돌 유도 해리(CID)를 이용한 이중 질량 분석(MS2)은 양이온 모드에서 ESI 소스를 구비한 LTQ velos dual ion trap mass spectrometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. ESI 변수는 다음과 같이 설정하였다: 전자분무 전압: 3.5 kV; 모세관 온도 : 150 ℃. [LYZ-CB[6]]9+ 의 CID 분석은 주행 이온 이동도 질량 분석기((TWIMS; Waters, Milford, MA, USA)를 갖춘 Synapt G2 HDMS quadrupole time of flight (qTOF) 장비를 이용하여 측정하였다. ESI 변수는 다음과 같이 설정하였다: 전자분무 전압: 1.5 kV; 모세관 온도 : 80 ℃.
적외선 분광법(Infrared spectroscopy)
적외선 스펙트럼은 Nicolet iS10 spectrometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 샘플에 대한 총 128 개의 스펙트럼을 하나의 스펙트럼으로 평균화하여 4 cm-1의 해상도로 수득하였다. 세척하지 않은 샘플은 실리콘 웨이퍼 상에 직접 캐스팅하고, 하루 동안 공기중에서 건조시켰다. 세정된 샘플들은 Amicon 0.5 mL 100k centrifugal 필터(Millipore, Billerica, MA, USA)로 로딩하고 나서, 실리콘 웨이퍼상에 로딩하기 전에 5% FA(v/v)로 3회 세척하여 과량의 CB[6] 및 비섬유 종을 제거하였다. 모든 IR 스펙터럼은 1500-1900 cm-1 범위에서 가장 높은 피크 강도를 이용하여 정규화하였다.
다분산 지수(Polydispersity index, PDI)
PDI(R. G. Gilbert et al., Dispersity in polymer science (IUPAC Recommendations 2009) (vol 81, pg 351, 2009). Pure Appl . Chem . 81, 779-779 (2009).)는 수평균 중합도(number average degree of polymerization )(Ln)에 대한 질량평균 중합도(mass average degree of polymerization )(Lw)의 비율이다(하기 식 2). 폴리머가 이상적으로 단분산일 경우 PDI 값은 1이다. PDI 값은 폴리머의 이질적인 분포로 인하여 일반적으로 1보다 크다.
[식 2]
Figure PCTKR2016011246-appb-I000001
결과
아밀로이드 섬유화는 일반적으로 도 1A에 도시된 핵생성-성장 중합 모델을 따른다(M. So, D. Hall, Y. Goto, Revisiting supersaturation as a factor determining amyloid fibrillation. Curr . Opin . Struct . Biol . 36, 32-39 (2016).). 이러한 메커니즘은 섬유화가 모노머 단백질의 핵생성에 의해 시작되고 나서, 아밀로이드 섬유 형성을 위한 단량체 첨가의 의해 핵 신장(elongation)이 이루어짐을 암시한다. 신장 과정(k el = ~104-107 M-1s-1) 은 핵생성 과정(k nu = ~10-2-100 M-1s-1) 보다 빠르다(C. C. Lee, A. Nayak, A. Sethuraman, G. Belfort, G. J. McRae, A three-stage kinetic model of amyloid fibrillation. Biophys . J. 92, 3448-3458 (2007)). 핵 생성 속도가 느린 것은 준안정적인 단백질이 역학적으로 포획된 상태(trapped state)이기 때문이다(T. S. Choi, J. W. Lee, K. S. Jin, H. I. Kim, Amyloid Fibrillation of Insulin under Water-Limited Conditions. Biophys . J. 107, 1939-1949 (2014)). 대조적으로, 단량체 첨가에 의한 핵의 신장은 핵의 템플릿 구조로 인하여 훨씬 빠르다(S. Chimon et al., Evidence of fibril-like b-sheet structures in a neurotoxic amyloid intermediate of Alzheimer's b-amyloid. Nat. Struct . Mol . Biol . 14, 1157-1164 (2007)). 따라서, 조립 공정의 초기 단계에서 형성된 핵은 후반부에 형성된 핵에 비해 높은 조립 상태를 가지며(D. Pinotsi et al., Direct Observation of Heterogeneous Amyloid Fibril Growth Kinetics via Two-Color Super-Resolution Microscopy. Nano Lett . 14, 339-345 (2014)), 섬유 조립 상태의 분포 또한 다분산성을 가진다(D. H. Zhao, J. S. Moore, Nucleation-elongation: a mechanism for cooperative supramolecular polymerization. Org . Biomol . Chem . 1, 3471-3491 (2003)). 따라서 미리 형성된 핵의 신장 동안의 추가적인 핵 생성을 억제하는 것은 섬유 조립체의 제어를 위한 하나의 전략이 될 수 있다.
본 발명에서는 주인-손님 화학을 이용하여 아밀로이드 섬유의 길이와 낮은 이질성을 제어할 수 있은 아밀로이드 자가조립의 운동 제어를 입증하였다. 이러한 접근의 주요한 이점은 주인-손님 상호작용의 합리적인 디자인을 기반으로 단백질-수용체(protein-receptor)복합체의 형성을 예측할 수 있다는 것이다(H. H. Lee et al., Supramolecular Inhibition of Amyloid Fibrillation by Cucurbit[7]uril. Angew. Chem . Int . Ed. 53, 7461-7465 (2014)). 이러한 이유로, 주인-손님 상호작용은 단백질 인식(protein recognition)(J. M. Chinai et al., Molecular Recognition of Insulin by a Synthetic Receptor. J. Am. Chem . Soc . 133, 8810-8813 (2011)), 기능 조절(function regulation)(D. T. Dang, H. D. Nguyen, M. Merkx, L. Brunsveld, Supramolecular Control of Enzyme Activity through Cucurbit 8 uril-Mediated Dimerization. Angew . Chem . Int . Ed. 52, 2915-2919 (2013)), 단백질 조립(protein assembly)(Y. Bai, Q. Luo, J. Liu, Protein self-assembly via supramolecular strategies. Chem . Soc . Rev., (2016)) 및 아밀로이드 억제 amyloid inhibition(S. Sinha et al., Lysine-Specific Molecular Tweezers Are Broad-Spectrum Inhibitors of Assembly and Toxicity of Amyloid Proteins. J. Am. Chem . Soc . 133, 16958-16969 (2011)) 등에 널리 적용되고 있다. 주인-손님 화학의 이점을 활용하여 본 발명에서는 단백질의 라이신 잔기에 결합하여 6개의 글리코루릴 반복 단위(Lagona, P. Mukhopadhyay, S. Chakrabarti, L. Isaacs, The cucurbit[n]uril family. Angew . Chem . Int . Ed. 44, 4844-4870 (2005))로 구성된 거대 고리 분자인 쿠커비투릴[6](도 1B)을 이용하여 아밀로이드 섬유화를 제어하는 방법을 제공한다. 놀랍게도, 단백질과 CB[6]의 분자 상호 작용은 단백질을 수용성에서 불수용성 상태로의 전이를 유도한다. 이러한 과정은 핵 생성동안 단백질의 과도 안정성을 야기한다. 결과적으로, 본 발명에 따르면 형성되는 섬유의 길이를 수십 나노미터에서 십 마이으로미터 정도로 조절할 수 있으며, 1.2-1.6 정도의 낮은 다분산지수(polydispersity index, PDI)로 섬유의 길이를 균일하게 형성할 수 있다.
CB[6]에 의한 낮은 다분산지수를 가지는 INS 섬유의 제어
본 발명에서는 우선 아밀로이드 섬유화에 대해 잘 정의된 모델 시스템인 인슐린 섬유의 형성에 대하여 조사하였다(도 1C). 인슐린 섬유는 50 ℃에서 5%(v/v)의 포름산(formic acid, FA) 용액에 녹아있는 50 μM 의 인슐린 용액을 이용하여 제조하였다. 또한 500-2000개의 섬유들의 평균 길이를 TEM(transmission electron microscopy)을 이용하여 측정하였으며, PDI value에 기초하여 섬유 길이의 이질성(heterogeneity)을 정량화하였다.
교반과 CB[6]의 부재 하에, INS의 섬유 길이(2.3±3.0 νm)는 PDI 지수가 대략 2.8로 광범위하게 분산되어 있으며(도 2A 및 표 1), 이는 정지조건(quiescent condition)하에서 인규베이팅된 INS 용액은 불균일한 INS 섬유들의 형성을 가져온다는 것을 암시한다. 다음으로, INS 용액을 200 rpm으로 교반하였다. CB[6]의 부재 하에, 짧은 섬유(53±31 nm)들이 PDI 지수 1.3 정도로 얻어졌다(도 2A 및 표 1). 이는 교반 수행시 섬유들의 균질성은 개선되는 반면 섬유의 신장은 작아진다는 것을 암시한다. CB[6]의 존재 하에서, CB[6]의 농도가 증가함에 따라 섬유의 길이도 함께 증가한다(도 2B, 표 1 및 도 7). 예를 들어, INS의 농도에 비해 CB[6]의 농도가 100 배 이상 증가하면(([CB[6]] = 5 Mm), 섬유의 길이는 낮은 다분산지수(PDI=1.3)를 유지하면서도 100배 이상(2.0±1.1 μm) 증가하였다. 섬유의 두께는 교반 및 CB[6]에 대하여 비의존적이었다(도 8). 이러한 결과는 교반과 CB[6]을 이용하여 낮은 이질성을 가지는 아밀로이드 섬유를 제조할 수 있음을 나타낸다. 또한, 섬유의 길이 증가는 5%(v/v) FA 용액에서의 CB[6]의 용해도 한계를 초과했을 때에 관찰됨을 확인하였다(CB[6] 용해도: 80 μM in 5% FA). 이러한 사실로부터 섬유 길이의 중요한 변화는 CB[6]의 용해도 제한을 초과하는 CB[6]의 양과 상관 관계가 있음을 추측할 수 있다.
Figure PCTKR2016011246-appb-T000001
수용액에서 FA 용액의 % 농도(v/v)가 증가함에 따라 CB[6]의 용해도가 증가한다는 사실을 통해(표 2, H. J. Buschmann, K. Jansen, C. Meschke, E. Schollmeyer, Thermodynamic data for complex formation between cucurbituril and alkali and alkaline earth cations in aqueous formic acid solution. J. Solution Chem . 27, 135-140 (1998)), 본 발명에서는 FA 용액의 농도 조절을 통해 낮은 분산지수를 유지하면서 아밀로이드 섬유의 조절 가능한 범위를 확장할 수 있는지에 대하여 실험하였다(도 3A). 다양한 FA 수용액 농도(%)하에서 INS 섬유의 모폴로지(morphologies)를 CB[6]의 존재 또는 부존재 하에서 관찰하였다. 용액에서 CB[6]의 양은 500 μM으로, 15%(v/v) FA 용액을 종래 보고된 각 FA 용액의 농도(%)(v/v)에서의 용해도 제한을 초과하였다(CB[6] 용해도: 20 μM in 0.1% FA, 80 μM in 5% FA, 550 μM in 15% FA). CB[6] 부존재하에서 섬유의 길이는 5%(v/v) FA 용액에서 거의 유사하게 37-53 nm으로 나타난 반면, CB[6] 존재 시 섬유의 길이는 FA 농도가 감소함에 따라 수십 나노미터(37±19 nm)에서 대략 10 마이크로미터 크기(8.5±4.8 νm)로 증가하였다(도 3B). 특히, PDI 값은 1.2-1.6의 범위에서 유지되었다(표 3). 결론적으로, 섬유의 길이에 대한 낮은 다분산지수는 용액의 연속적인 교반과 함께 용액에서의 용해도 제한을 초과하는 CB[6]의 양을 조절함으로써 제어할 수 있음을 알 수 있다.
Figure PCTKR2016011246-appb-T000002
Figure PCTKR2016011246-appb-T000003
CB[6]에 의한 INS의 불수용성 상태 유도
종래 보고를 통해 아밀로이드 형성 단백질과 합성 수용체간의 주인-손님 상호작용은 아밀로이드 섬유화의 억제를 유도하는 것으로 나타났다(S. Sinha et al., Lysine-Specific Molecular Tweezers Are Broad-Spectrum Inhibitors of Assembly and Toxicity of Amyloid Proteins. J. Am. Chem . Soc . 133, 16958-16969 (2011)). 나아가 본 발명에서는 CB[6] 과 INS 사이의 주인-손님 상호작용을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE) 및 전자분무이온화 질량분석법(ESI-MS)를 이용하여 확인하였다(도 10, 11). INS의 라이신과 CB[6]의 결합 또한 등온 적정 열량계(isothermal titration calorimetry, ITC)와 이중질량 분석법(tandem mass spectrometry, MS2)을 이용하여 확인하였다(도 12, 13)(S. W. Heo et al., Host-Guest Chemistry in the Gas Phase: Selected Fragmentations of CB[6]-Peptide Complexes at Lysine Residues and Its Utility to Probe the Structures of Small Proteins. Anal. Chem. 83, 7916-7923 (2011)). CB[6]와 INS 사이의 평형 결합 상수(K a,app ) 는 3.0×103 M-1로 종래 보고된 값과 유사하였다(M. V. Rekharsky et al., Sequence recognition and self-sorting of a dipeptide by cucurbit[6]uril and cucurbit[7]uril. Chem . Commun ., 2236-2238 (2008)). 라이신은 단백질 자가조립에 매우 중요한 역할을 하기 때문에(K. E. Marshall et al., Hydrophobic, Aromatic, and Electrostatic Interactions Play a Central Role in Amyloid Fibril Formation and Stability. Biochemistry 50, 2061-2071 (2011)), 본 발명에서는 LYS-CB[6] 복합체의 주인-손님 상호작용이 섬유의 길이 조절에 반영될 것으로 기대하였다. 그러나 전술한 바와 같이 섬유 길이의 점진적인 변화는 그들의 용해도 제한을 초과하는 CB[6]의 양에 의존적이었다. 이러한 관찰은 섬유의 길이 변화가 단순히 INS와 CB[6] 사이의 주인-손님 상호작용에 의해 설명될 수 없다는 것을 의미한다.
INS에 대한 CB[6]의 용해도 한계 이상의 농도의 효과를 관찰하기 위해, 본 발명에서는 다양한 CB[6]의 농도와 다양한 농도(%)의 FA 용액하에서 용액에 용해된 INS의 농도를 측정하였다. 수득한 용액은 불용성 응집체와 같은 불순물 제거를 위해 18,000×g에서 원심 분리하였으며, 원심분리 후 280 nm에서 UV absorption를 이용하여 상등액에 존재하는 용해된 INS의 농도를 측정하였다. 5%(v/v) FA 수용액에서는 CB[6]의 양이 증가할수록 INS의 농도가 감소하는 반면(도 4B), CB[6]의 양이 5 mM 로 일정한 경우에 FA의 농도(v/v)가 증가할수록 INS의 농도가 증가하였다(도 4C). 전반적으로 CB[6]의 양과 FA의 농도(v/v)를 조절하면, CB[6]가 용해도 한계를 초과할 경우에 INS가 수용성에서 불수용성으로의 상전이가 더욱 많이 일어남을 확인하였다. CB[6]에 의한 INS의 이러한 전이는 CB[6]가 주인-손님 복합체를 천천히 용액에 용해되어 열역학적으로 안정한 결정으로 재결정화되는 역학적으로 고립된 결정체로의 상전이를 유도하는(O. Danylyuk, V. P. Fedin, V. Sashuk, Kinetic trapping of the host-guest association intermediate and its transformation into a thermodynamic inclusion complex. Chem . Commun . 49, 1859-1861 (2013)), 작은 손님-CB[6] 복합체의 결정화 공정과 유사하다. 따라서 INS의 상전이는 CB[6]와의 주인-손님 상호작용에 의해 유도될 수 있고, 불용성에서 수용성으로의 역전이 또한 가능할 것으로 예상된다. 결국 INS의 상전이가 섬유 조립에 수반하여 발생하고(도 4D), 핵 생성 동안 용액에서의 INS 단량체의 농도에 영향을 미치는 것으로 볼 수 있다. 이에, INS의 상전이를 통한 INS 단량체의 농도를 조절하기 위해서는 CB[6]의 용해도 한계 이상의 양이 중요하다는 것을 알 수 있다.
CB[6]에 의한 섬유 자가조립의 운동 제어
도 2-4로부터 섬유화 동안의 교반 및 CB[6]에 의한 INS의 전이가 섬유의 길이 제어 및 낮은 분산성에 매우 중요하다는 가설을 세웠다. 이러한 가설을 입증하기 위해, 티오플라핀 T(ThT) assay(14) 이용하여 5%(v/v) FA에서 교반(도 14) 및 CB[6](도 5A)가 섬유화 운동에 미치는 효과를 모니터링하였다. 도 14는 INS 용액의 교반이 교반이 없는 대조군과 비교시 섬유화의 lag phase를 감소시킨다는 것을 의미한다. 교반을 통해 형성된 섬유는 교반 없이 형성된 섬유(2.3±3.0 μm, PDI = 2.8)에 비해 짧고 낮은 다분산지수(53±31 nm, PDI = 1.3)를 가지는데, 이는 교반에 의한 충돌이 핵 생성 속도를 전반적으로 향상시키고 따라서 핵의 빠른 생성 및 균일성을 유도한다는 것을 암시한다. 그러나 교반 동안의 섬유 신장은 단량체의 빠른 소비로 인해 제한된다. INS 용액에서 CB[6]의 양이 증가함에 따라(도 5A). lag phase 또한 증가하였다. 용액에서 CB[6]의 양이 증가할수록 섬유의 길이도 증가하는 반면, 교반에 의한 낮은 분산도(PDI 1.3-1.5)는 유지되었다(도 7). 이러한 결과에 기초하여 다음과 같은 결론을 도출할수 있다: 1) CB[6]의 용해도 제한을 초과한 양은 단량체의 핵 형성을 억제한다; 2) 핵 형성의 억제에 의해 단량체:핵의 높은 비율은 유지된다; 3) CB[6]에 의해 추가적인 핵 형성이 억제되는 반면 미리 형성된 핵은 길고 균일한 섬유로 신장된다(도 5B). 핵이 형성되는 동안 CB[6]의 용해도 제한을 초과하는 양은 형성되는 INS 섬유의 길이에 연관되는 단량체:핵의 비율을 결정한다(도 5C).
섬유화 과정은 체인의 길이가 개시제와 단량체의 비율에 따라 균일하게 제어되는 초분자적 연쇄-성장 중합(supramolecular chain-growth polymerization)과 유사하다(도 15)(J. Kang et al., A rational strategy for the realization of chain-growth supramolecular polymerization. Science 347, 646-651 (2015)). 그러나 CB[6]의 역할은 중합 과정을 촉진하는 개시제와는 상반된다. CB[6]는 INS의 전이를 통해 핵 생성 공정을 억제하는 역할을 수행한다(도 4D); 또한, 섬유 조립시 수용성 상태의 INS의 활성 농도가 감소할 때, 불용성 상태의 INS는 활발한 섬유 형성을 위해 CB[6]로부터 해리되어 용액에 재용해된다(P. Narayan et al., The extracellular chaperone clusterin sequesters oligomeric forms of the amyloid-beta(1-40) peptide. Nat. Struct . Mol . Biol . 19, 79-U97 (2012)). 따라서, 재용해된 INS는 INS 섬유의 신장을 위해 형성된 핵과 상호작용하는 단량체 역할을 수행한다. 적외선 측정을 통해 CB[6] 존재 및 부존재 시 형성된 섬유가 유사한 흡수 패턴을 보이는 것으로부터 이러한 추측을 지지할 수 있다(도 16). 그러나 CB[6]의 과도한 도입에 의해 불용성 상태가 확장될 경우 섬유의 신장은 제한된다. 다양한 농도(%)의 FA 용액에서 CB[6] 농도에 따른 INS 섬유들을 검사할 때, 0.1 및 1%(v/v) FA 용액에서 CB[6]의 농도가 5 mM인 경우 섬유의 길이는 CB[6]의 농도가 500 μM 인 경우와 비교하여볼 때, 확장되지 않았다(도 17). 이러한 결과는 만약 INS의 큰 부분이 CB[6]의 과량에 의해 수용성에서 불용성으로 전환될 경우(도 4), CB[6]는 섬유 신장 동안 INS의 단백질-단백질 상호작용을 방해한다는 것을 암시한다. 따라서, 수용성과 불용성 상태의 전의 사이에 존재하는 준안정 상태는 핵 형성과 신장 사이의 균형에 중요한 것임을 알 수 있다.
CB[6]에 의한 다양한 아밀로이드성 단백질의 섬유 길이 조절
다양한 아밀로이드 형성 단백질을 이용하여 CB[6]의 섬유 길이 조절의 일반적인 적용가능성을 조사하였다(도 6A). CB[6]의 부존재 및 교반 하에서 인간 섬 아밀로이드 폴리펩타이드(human islet amyloid polypeptide (hIAPP)를 사용할 경우 짧은 섬유가 형성된 반면(35±15 nm, PDI = 1.2), 교반 없이 (hIAPP)를 인큐베이팅 할 경우에는 아밀로이드 섬유의 혼합물 및 구형 응집체가 관찰되었다. CB[6]의 부존재 및 교반 하에서 암닭 알 흰자위 리소자임(Hen egg white lysozyme , LYZ)을 인큐베이팅할 경우에는 작은 무정형의 응집체가 형성되었으나, 교반의 부재 하에서는 응집체가 관찰되지 않았다. CB[6] 첨가 시에는 단백질:CB[6]의 비율이 증가함에 따라 hIAPP 및 LYZ 섬유의 길이도 증가하였다(PDI: 1.2-1.5, 도 6B, 표 4). 이러한 결과는 낮은 이질성을 가진 hIAPP 및 LYZ 섬유의 길이는 교반 및 CB[6]를 이용하여 제어할 수 있음을 암시한다. hIAPP의 대조군으로부터 획득한 혼합물은 낮은 이질성을 가진 원하는 섬유를 형성하는 것으로 개선되었다. CB[6] 및 교반 하에서 형성된 LYZ 섬유의 PDI 값은 그들의 대조군에 맞먹지 않았으나, 그들은 이전에 연구된 다른 섬유들에 비해서는 낮았다(P. Arosio, M. Beeg, L. Nicoud, M. Morbidelli, Time evolution of amyloid fibril length distribution described by a population balance model. Chem . Eng . Sci . 78, 21-32 (2012), T. Doussineau et al., Mass Determination of Entire Amyloid Fibrils by Using Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 2340-2344 (2016)).
Amyloid-β 1-42 및 1-40 (Aβ42 및 Aβ40) 또한 단백질:CB[6] = 1:0의 비율로 교반과 함께 배양하였으며, 각각 2.3±1.7 μm and 3.1±2.2 μm의 섬유 길이와, 1.6 및 1.5의 PDI가 측정되었다(도 6A, 표 4). 교반 존재 하에서도 섬유의 길이 및 PDI 수치는 유사하게 관찰되었다(1.7±1.3 μm, PDI = 1.6 (Aβ42), 2.0±2.3 μm, PDI = 2.3 (Aβ40)). CB[6]의 양 증가는 Aβ 섬유 길이의 감소를 가져오고 PDI 값은 1.5-2.1의 범위로 유지되었다(도 6B, 표 4). Aβ42 및 Aβ40의 섬유 길이는 hIAPP 및 LYZ 섬유와는 반대일뿐만 아니라 더 높은 분산도를 가졌다.
Figure PCTKR2016011246-appb-T000004
이러한 4 종류의 단백질의 섬유화의 차이점을 증명하기 위하여 CB[6]와 단백질의 라이신(Lys) 간의 상호작용을 ESI-MS (도 18) 및 MS2 (도 19-21)을 이용하여 확인하였다. 또한, CB[6]에 의한 단백질의 상전이도 확인하였다(도 22). 이러한 결과들은 CB[6]와의 상호작용들이 4 종류의 단백질들에서 공통적으로 나타나기 때문에 섬유화의 차이는 그들의 본질적 특성에 기인하는 것임을 암시한다. 따라서, 단백질의 핵 형성 속도(k nu) 와 CB[6]의 1차 아민과의 복합화 속도(k CB [6])를 비교하였다. k CB [6] (~100-102 M-1s- 1)는 INS 섬유화에서의 k nu (~10 -2 M -1 s -1 ) 값보다 높은 반면, Aβ 펩타이드에 대한 knu는 kCB[6] 는 동일한 정도였다(~100 M-1s-1 for Aβ40, > 100 M-1s-1 for Aβ42) (13, 36). hIAPP 의 섬유화는 Aβ40 보다 대략 100배 이상 느렸고, LYZ 섬유화는 다른 단백질의 섬유화에 비해 느리게 발생하였다(V. N. Uversky, A. L. Fink, Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded. Biochim . Biophys . Acta , Proteins Proteomics 1698, 131-153 (2004)). Aβ40 섬유화의 ThT 분석은 다른 단백질과는 대조적으로 Aβ 펩타이드의 핵 형성은 Aβ 펩타이드의 조립보다 Aβ-CB[6] 복합체 형성이 느리기 때문에 그들의 원래 경로를 통해 진행되므로, CB[6]가 Aβ40의 핵형성을 중단시킬 수 없다는 것을 암시한다(도 23). 그러나 CB[6]의 양이 증가할 경우 Aβ의 단백질-단백질 상호작용은 섬유 신장동안 CB[6]에 의해 중단되었다. 따라서, CB[6] 존재하에서 PDI 값은 개선되지 않지만 Aβ 섬유의 길이는 감소하였다.
요약하면, 본 발명에서는 CB[6]의 도입에 의한 섬유 조립의 운동 제어를 통해 다양한 아밀로이드 형성 단백질의 아밀로이드 섬유를 조절할 수 있다. 단백질의 상전이는 단량체와 핵의 비율을 역학적으로 조절하고 따라서 낮은 분산도를 유지하면서 섬유의 길이를 연쇄-성장 중합 방식과 유사하게 조절할 수 있다. 지금까지 생체 외 및 생체 내에서 아밀로이드 섬유들은 아밀로이드증 억제에 대하여만 특징되어 왔지만, 생물학적 기능이나 소프트 물질 응용에는 정확한 섬유 조립의 제어가 요구되었다. 본 발명에서는 합성 수용체에 의한 단백질의 상 전이에 기초한 아밀로이드 섬유의 초분자적 제어의 합리적인 전략에 대한 통찰력을 제공한다. 이러한 접근법은 생물 시스템에서 일어나는 단백질 자가 조립을 이해할 수 있을 뿐만 아니라 재료 응용을 위한 기능성 아밀로이드 섬유 취득에 이용될 수 있다.
결론적으로, 본 발명에서와 같이 아밀로이드 섬유화를 일으키는 아밀로이드성 단백질(인슐린, 리소자임, 아밀로이드 베타 40, 아밀로이드 베타 42, 아밀린, 인간 섬 아밀로이드 폴리펩타이드)이 포함되어 있는 용액에 쿠커비투[6]릴을 첨가하였을 때 섬유화 반응의 결과물이 달라지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 종래 아밀로이드 섬유화 방법과 달리 본 발명에 따르면 포름산 용매의 농도 및 교반 속도 조절을 통해 아밀로이드 섬유의 길이를 자유롭게 조절할 수 있으며, 균일한 형태 및 길이 분포를 가지는 아밀로이드 섬유를 얻을 수 있음을 확인하였다. 또한 아밀로이드 섬유의 생성과정에서 발생하는 부산물인 비정형 응집체의 형성을 억제함으로써 아밀로이드 섬유의 형성을 효율적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면 아밀로이드성 단백질의 아밀로이드 섬유화 반응 수행시 쿠커비투릴[6], 포름산 용매의 농도 및 교반 속도 조절을 통해 아밀로이드 섬유의 길이를 조절할 수 있으며, 균일한 길이와 크기를 가진 아밀로이드 섬유를 제공함으로써 아밀로이드 섬유의 고유 기능성을 최적화할 수 있다.

Claims (9)

  1. 포름산 용매에 용해된 아밀로이드성 단백질의 섬유화 반응 시 쿠커비투릴[6]을 혼합 및 교반시키는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포름산 용매의 농도 또는 쿠커비투릴[6]의 농도를 조절하여 아밀로이드 섬유의 길이를 조절하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 포름산 용매의 농도는 0.1 내지 15%(v/v)인 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 쿠커비투릴[6]의 농도는 아밀로이드성 단백질 농도의 1 내지 1000배인 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 교반 속도는 100 내지 500 rpm인 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 쿠커비투릴[6]는 상기 아밀로이드성 단백질의 라이신(Lysine, Lys) 잔기에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 아밀로이드성 단백질은 인슐린, 리소자임, 아밀로이드 베타 40, 아밀로이드 베타 42, 아밀린, 인간 섬 아밀로이드 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 아밀로이드 섬유의 길이는 10 nm 내지 10 ㎛ 범위 내에서 조절되는 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 아밀로이드 섬유 길이의 다분산지수(Polydispersity index, PDI)는 1.2 내지 1.6인 것을 특징으로 하는 아밀로이드 섬유의 길이 조절 방법.
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