CN112368297B - 具有集成的基因可编程功能的基于淀粉样蛋白的基础构建材料 - Google Patents
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Abstract
一种材料制造方法，包括：(a)由包含稳定在液体溶剂中的淀粉样蛋白单体的可编程淀粉样蛋白材料(PAM)油墨制造结构；和(b)使所述结构与引发淀粉样蛋白单体聚合和结构稳定的试剂接触。
Description
简介
各种行业的研究人员不断寻求新的软材料，包括仿生材料，其提供功能灵活性并且可以使用标准制造技术将其制成有用的结构。在材料科学领域中受到相当多研究关注的一些流行的仿生和生物材料尤其包括肽、脂质、DNA、丝和噬菌体外壳蛋白，其各自都有自身的属性和局限。例如，肽、脂质和DNA可以用于可编程组装，但不适用于基于蛋白结构域的功能的基因工程。供选择地，丝和噬菌体外壳蛋白适合与多种制造技术如光刻、印刷和纺丝一起使用，并且原则上适合于基因工程功能。但是，应用受到了限制，并且由这些材料构建的结构通常无法提供强的长期稳定性，尤其是在苛刻条件下。
天然生物膜可以高度地抵御苛刻的环境条件，并且细菌生物膜为生物材料的探索提供了丰富的资源。组成这些膜的组分的关键功能属性之一是它们跨多个空间尺度自组装成复杂且有序的分层结构的固有能力。例如，Curli是一类由自组装的CsgA蛋白单体构建的高度聚集的分泌型细胞外细菌淀粉样蛋白纤维，并且参与表面定植和生物膜形成。Curli富含β折叠，非常牢固，可以帮助细菌粘附至各种表面并抵御环境损害。功能性淀粉样蛋白材料相对于噬菌体外壳功能性材料的理论优势在很大程度上源于形成其β折叠的氨基酸的特定化学组成。具体地，最终形成淀粉样蛋白聚合物的单体蛋白大量地富含丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酸，这些氨基酸易于形成复杂的氢键网络；已知这些氢网络是淀粉样蛋白生物膜高度抵御苛刻条件的主要来源。在这里，我们利用淀粉样蛋白单体的自组装能力来生成一类新的功能性生物材料，我们将其称为可编程淀粉样蛋白材料(PAM)。
发明概述
本发明提供包含可编程淀粉样蛋白材料(PAM)的组合物，以及相关的制造和使用方法。
在一个方面，本发明提供一种材料制造方法，所述方法包括：(a)由包含稳定在液体溶剂中的淀粉样蛋白单体的可编程淀粉样蛋白材料(PAM)油墨制造结构；和(b)使所述结构与引发淀粉样蛋白单体聚合和结构稳定(固化)的试剂接触。
在实施方案中：
-所述制造步骤包括微转移模塑、压花、旋涂、浸涂、静电纺丝、喷涂、刷涂、光刻、静电纺丝等。
-所述淀粉样蛋白单体是CsgA、FUS、TDP、TasA等。
-所述单体例如在(例如，CsgA的)C和/或N末端被一个或多个官能团官能化，所述官能团包括活性酶，异肽标签系统如Spy标签，细胞亲和标签如RGD，或其他功能性肽如抗菌肽，细胞增殖或分化，无机纳米颗粒的模板化生长。
-所述溶剂是极性溶剂，如HFIP、TFA等，其充当强氢键给体，并且通过氢键破坏来增溶淀粉样蛋白，但是作为弱的氢键受体起作用，并且不与淀粉样蛋白单体形成键，其中所述溶剂可以随时间推移溶解淀粉样蛋白结构并破坏β折叠结构。
-所述固化剂是醇，如甲醇、乙醇、异丙醇和PEG，H2O(包括缓冲液KPI、PBS、Tris)，其可以引发内在淀粉样蛋白组装但维持所产生的结构的原始形态。
-所述接触(固化)步骤包括两步固化：在气相中与第一固化剂的第一接触，以及在液相中与第二固化剂的第二接触，其中所述第一和第二固化剂优选是相同的。对于具有非图案化结构的PAM涂层，在溶液中的一步固化通常就足够；但是，两步固化(蒸气然后溶液)是优选的，特别是对于PAM图案化结构。为了用其他试剂(例如ddH2O、KPI缓冲液或异丙醇)固化图案化结构，两步固化方法也是优选的；但是，与使用甲醇蒸气加上(coupled with)甲醇浸入的固化相比，该固化通常需要更长的时间，因为与甲醇相比，H2O和异丙醇的挥发性较小。
-所述结构选自：2D和3D阵列以及自支撑图案化多孔PAM片材(PPPS)等，包括不同的表面和界面(2D疏水或亲水表面、3D不规则界面、微流体装置、医学植入物表面等)，均匀的涂层或图案化结构、磁性片材，细胞片材等，并且所述片材可用于多种应用，例如量子点结合以及蛋白缀合和矿化。
-在所述接触步骤之后，所述结构在固化之后重新获得β折叠，并且在大范围的苛刻条件(高温，例如90℃)和低温(例如-80℃)，有机溶剂，大范围的pH＝2-12的溶液挑战(challenge)后保持超稳定，例如结构和/或功能稳定，并且在环境条件下具有长期稳定性。
-所述方法还包括用酶，例如用于CsgA和csgACBD的胰蛋白酶或蛋白酶K或用于几丁质的几丁质酶选择性地降解所述结构。
在各方面，本发明提供了通过主题的制造方法制备的可编程淀粉样蛋白材料(PAM)以及使用该材料和所制造的材料结构的方法。
本发明包括所列举的特定实施方案的所有组合，就如同每个组合已经被详尽地叙述一样。
发明具体实施方案描述
本文的实施方案和实施例仅以说明的方式而不是限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数以产生基本相似的结果。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且本领域技术人员在其教导下将联想到各种修改或改变，并且所述修改或改变将被包括在本申请的精神和范围和所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
用于分子PAM的模块化基因设计我们使用两种不同的收获方法来获得CsgA和功能化(R1-CsgA-R2)纳米纤维：从培养的生物膜直接收获分泌的纳米纤维，或传统的重组蛋白表达和纯化方法。我们发现结构域结合后，CsgA骨架仍然可以自组装成纳米纤维。
用于生物制造的PAM油墨(结构恢复确认)在水溶液中纯化后，形成淀粉样蛋白纳米纤维的CsgA蛋白立即开始自组装成纳米纤维结构。然而，我们的新的淀粉样蛋白材料要求我们找到阻止自组装纳米纤维直到CsgA单体原位地在其期望位置的方法。解决该问题的一种见解是，诸如六氟异丙醇(HFIP)的溶剂会破坏聚集的CsgA的二级结构(包括氢键)。因此，可以将收获的聚集的CsgA纳米纤维溶解在HFIP中，以制备可溶性CsgA单体的“油墨”。在尝试使用CsgA进行任何制造之前，我们先表征了这种材料暴露于甲醇之前和之后的形态和结构。来自AFM高度成像、圆二色性分析和ATR-FTIR的结果均表明HIFP暴露不会改变CsgA单体自组装成其典型纳米纤维结构的能力。接下来，我们确认暴露于甲醇确实会引发CsgA单体复性为CsgA-PAM纳米纤维。通过峰值力定量纳米机械(PFQNM)AFM和纳米压痕测量变性和复性的PAM两者的杨氏模量；复性的PAM几乎是变性的两倍。由于CsgA纳米纤维的分层结构(hierarchical structure)，复性的PAM的杨氏模量与天然牵引丝(0.1～12GPa)相当。
与多种生物制造工具整合的PAM HFIP油墨是真正的柔性物质，该物质可以想得到地用于任何适合于有机溶剂的制造方法(微转移模塑、压花、旋涂、浸涂、静电纺丝、喷涂、刷涂、光刻、静电纺丝等)。
通过微转移模塑的图案化PAM结构和在各种条件下的结构稳定性确认由于我们的设计强调图案化制造，因此我们最初集中在使用CsgA/HFIP油墨与聚二甲基硅氧烷(PDMS)压印组合的微转移模塑方法中，从而允许单体形式的CgsA的高精度沉积。在其沉积之后(这里以分层定义的微米甚至纳米级图案)，CsgA单体暴露于甲醇蒸气或溶液中，这再次触发了它们的原位自组装(“固化过程”)。我们首先将CsgA-PAM印刷成具有蜘蛛网图案(motif)的大规模(～1cm2)图案化阵列。暴露于甲醇后，印刷的CsgA-PAM的宽度为～1μm，其带有明显的纳米纤维束，这些束分层地组装成较大的微线(microthread)。对于未暴露于甲醇的对照印刷的CsgA，未观察到纳米纤维特征。X射线纤维衍射、拉曼光谱和AFM-IR分析均显示，尽管对照印刷的CsgA是无定形的，但是印刷的CsgA-PAM以β折叠结构出现。
给定的生物大分子构建材料的结构稳定性及其图案保真度都是众所周知的性能属性，该性能属性将影响其在制备图案化结构中的适用性，因此我们仔细表征了PAM在暴露于多种苛刻条件后的稳定性和形态。我们在二氧化硅基板上印刷并固化了CsgA-PAM的线性“测试线”，并将其暴露于高温(90℃)、低温(-80℃)、水溶液(pH＝2、12)和常见的有机溶剂(己烷、丙酮、氯仿、异丙醇和DMF)作为代表性的极端条件。我们还将测试线暴露在环境条件下6个月，以检查长期稳定性。
首先，将未挑战的复性CsgA-PAM与挑战的复性CsgA-PAM进行比较的ATR-FTIR分析显示，使用每种挑战条件对分子结构仅有可忽略的变化。接下来，我们对挑战后CsgA-PAM测试线的图案保真度进行了表征。AFM图像显示测试线保留了其原始的平行图案形态，并且通过测试线的高度的定量比较显示，在高温(90℃)、低温(-80℃)，水溶液(pH＝2、12)、己烷、丙酮和异丙醇后，仅有可忽略的变化；与未挑战的对照线相比，氯仿和DMF挑战使测试线的高度分别降低了19.7％和34.6％。这些结果证明了CsgA-PAM的超稳定性和图案保真度，以及相对于许多目前可用的生物大分子构建单元，如丝、噬菌体、肽和脂质的性能优势，这些生物大分子构建单元容易变性或在略微次优条件下溶解，使其图案在很短的时间内消失。
用于潜在应用的图案化PAM为了证明超稳定PAM材料的效用，我们还使用了PDMS压模，该压模已用于制备用作衍射光学元件(DOE)的纳米器件。通常用于制备DOE的其他光学衍射材料(例如，聚甲基丙烯酸甲酯和聚碳酸酯)在有机溶剂中不稳定。我们将CsgA-PAM在玻璃基板(2D和3D)上印刷成图案，并在苛刻条件，包括丙酮或pH 2的挑战下，对其处理24小时。这些CsgA-PAM纳米器件在照射时发射出特定的透射衍射图，包括例如点阵列和倒置的汉字“fú”。后来，我们照亮了这些的多层组合，并生成了倒置的字符重叠投影。这些DOE突出显示了PAM材料的高空间分辨率制造和在苛刻条件下的超稳定性是如何对困难应用表现出高度有吸引力的性能特征。
为了使PAM功能化，我们使用了基因工程改造的CsgA单体，其具有融合到其C-末端(CsgAHis)的多组氨酸标签。我们使用PAM油墨的微转移模塑在载玻片上制备三角形图案的阵列，并用甲醇蒸气固化CsgAHis-PAM。然后将图案化CsgAHis-PAM上的组氨酸与包封在次氮基三乙酸(NTA)中的量子点(QD)共价反应，并与Ni2+结合，形成可在488nm处激发时发出绿色荧光的阵列。我们还使用倒置的PMDS压模来制造微图案化的多孔膜，我们用绿色和红色发光的QD的1/1混合物与所述膜反应，并测试了它们各自的发光特性和集体发光特性。接下来，我们基于将CsgAHis-PAM图案化为平行线图案并使其与红色发光的QD进行反应，构建了原型场效应晶体管(FET)。推导了它们的典型输出和拟合传递性能。我们还使包覆有Ni-NTA的金纳米颗粒与我们的图案化的CsgAHis-PAM反应，以生成功能性有机/无机杂化图案化结构，该结构在生物纳米电子学中具有许多潜在应用。
从最初的具有无机功能组分的CsgAHis-PAM应用继续向前，我们接下来生成了具有C末端融合的Spy标签肽或Snoop标签肽的CsgA单体(“CsgASpy标签”“CsgASnoop标签”是可以与其各自的SpyCatcher和SnoopCatcher结合伴侣自发形成异肽键的两个标签)。我们使用PMDS压模从CsgASpy标签-PAM和CsgASnoop标签-PAM制造微图案，然后将它们与mCherry-SpyCatcher融合蛋白和GFP-SnoopCatcher融合蛋白反应。用适当的激发能对这些材料进行测试成功地证明，带有肽组分的CsgA单体可以在其功能完整的情况下在PAM制造过程中的PAM油墨制备、印刷和固化步骤中保存下来。这些结果表明，PAM可以直接用于需要精确的生物分子反应性的应用中，或通过诸如异肽键肽伴侣的技术用于需要精确的生物分子反应性的应用中。
为了获得大规模的图案，我们采用了带有图案的商业防水贴纸作为掩模。用胶粘剂粘合的基材被新制备的CsgA单体覆盖。第二天，在NP或QD结合之后，在剥离贴纸之后，图案仅存在于未被贴纸覆盖的部分上。聚四氟乙烯(PTFE)具有硬改性的表面。涂覆CsgA后，PTFE的接触角从110°降低到77°，从疏水性降低到亲水性。在254nm紫外线照射下，量子点被激发并出现设计的图案。此外，我们在聚丙烯(PP)管和无纺织物上涂覆了CsgA。经过Au NP结合和金增强，织物形成导电网。聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是电子工业中的商业基材。CsgA也形成了涂层，并且金增强使图案作为电子电路中的导体起作用。CsgA图案化PET基材保持了固有的透明度和柔性，同时具有水下QD亲和力。
为了获得CsgA作为界面纳米材料的3D图案，我们采用了使用CsgA作为3D涂层的供选择的方法。为了实现该实施方案，我们采用了几种演示。用氧气等离子体处理直径为100μm且高度为50μm的PDMS微柱，然后用CsgA单体溶液覆盖过夜。洗涤并结合后，获得3D QDPMDS阵列。通过激光扫描共聚焦显微镜对3D形态进行成像。通过类似的方法，我们得到了荧光的10μm聚苯乙烯(PS)和SiO2微球，其中QD与CsgAhis标签补丁(patch)缀合。通过更改红色和绿色QD的混合比例，从100％：0、75％：25％、50％：50％、25％：75％到0：100％，在254nm紫外线灯下激发的CsgA-His标签修补的PTFE球上出现不同的颜色。在玻璃球和一半的3D打印立方模具上形成金纳米颗粒涂层。这些物体在金增强程序之后显示出良好的导电性。
自支撑图案化多孔PAM片材(PPPS)及其应用鉴于制造功能化PAM的能力，我们接下来展示了如何在物理空间中创造性地布置各种功能性PAM。迄今为止，可用于构建生物大分子图案的材料在很大程度上依赖于基材(例如，基于丝的光刻和基于噬菌体的超分子结构)。然而，在自然界中，这样的图案通常以大面积功能性独立式结构出现，例如细菌微隔室和硅藻细胞壁。当我们最初尝试通过使用水溶性聚乙烯醇(PVA)作为模塑图案下的牺牲层来制备独立式PAM结构时，我们发现CsgA-PAM显示与PVA的内聚力不足，在用水反复冲洗后无法维持自支撑微结构。我们对该问题的解决方案是合理设计自支撑基质，灵感来自头足动物的迷人的自然结构：鱿鱼嘴是一种柔软的生物材料(即非矿化的)，其具有由蛋白质-多糖分子界面引起的极具吸引力的机械性能(硬度和刚度)，其中具有所谓几丁质结合结构域(CBD)的蛋白充当单独的几丁质纳米原纤维之间的接头。
我们生成了具有C末端融合的CBD的CsgA单体(“CsgACBD”)，并使用包含这些单体的PAM油墨和溶解的几丁质纤维的溶液来印刷图案化多孔PAM片材(PPPS)，所述片材显示出分层的纳米纤维结构。向CsgA单体中添加CBD显然可以起到向PPPS提供提高的结构完整性和提高的弹性的作用，因为CsgACBD-PAM/几丁质PPPS的杨氏模量高于CsgA-PAM/几丁质PPPS的杨氏模量。在分子水平上考虑这些结果，功能性CBD的疏水性和芳族氨基酸通过疏水和堆叠相互作用与几丁质纤维的糖环结合。此外，石英晶体微量天平(QCM)和硫黄素T分析表明，与CsgA-PAM相比，几丁质纳米纤维吸收更多的CsgACBD-PAM。
接下来，我们用在其N末端(Spy标签或Snoop标签)和C末端(CBD)均具有功能化特征的Spy标签CsgACBD和Snoop标签CsgACBD双融合单体制成PPPS。令人兴奋的是，在将这些物质与mCherry-SpyCatcher或GFP-SnoopCatcher结合伴侣反应以生成异肽键后，用适当的激发能测试这些材料成功地证明了特征为双功能融合部分的CsgA单体可用于制备多功能的可基因工程化的生物材料。回顾已知在硅藻细胞壁上发生的令人印象深刻的牢固而复杂的矿化材料的图案，我们用R5肽CsgACBD-PAM制备PPPS；包含这种材料的单体具有两个功能性融合部分：C末端CBD和来自梭形筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)的N末端SiO2成核肽(R5)。我们将这些PPPS暴露在四甲氧基硅烷的矿化前体溶液中，SEM和STEM-EDS方法均证实了成功的生物矿化。
病原性细菌如大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella)分泌的细胞外CsgA可以与宿主细胞上存在的聚合物(纤连蛋白)结合。我们通过在自支撑的CsgACBD-PAM/几丁质PPPS上生长人类胚胎肾细胞(WT，HEK 293T)证明了PAM的生物相容性。野生型和转基因HEK293T细胞均粘附在PPPS上，并且与在缺乏PPPS的容器中生长的细胞生长的一样好。我们的功能化材料和结构适用于广泛的应用，其利用PPPS的多孔性质，用于在细胞和溶液之间进行有效的物质转移(例如，细胞迁移和侵袭分析)以及用于需要在精确限定的物理空间中的细胞生长的应用中(例如，细胞/材料界面等)。
材料制造方法容易地应用于供选择的淀粉样蛋白、供选择的溶剂和供选择的固化剂。例如，使用FUS低复杂度(LC)结构域展示了使用供选择的淀粉样蛋白的材料制造，所述FUS低复杂度(LC)结构域是一种在RNA转录、加工和运输中起重要作用的RNA结合蛋白，并且在FUS的200个氨基酸的N末端区域富含四种氨基酸(甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸)，因此该FUC LC形成可逆的淀粉样蛋白结构。我们还展示了基因工程改造的低复杂度结构域mefp3-TDP的制造，所述低复杂度结构域mefp3-TDP是基于TDP的功能性融合淀粉样蛋白。可以使用与本文公开方案相同的方案来制备源自两种蛋白的两种图案化结构，例如，使用淀粉样蛋白/HFIP作为油墨微转移模塑，然后用甲醇(甲醇气氛+甲醇溶剂)固化。
另外，我们展示了溶解各种淀粉样蛋白结构的供选择的溶剂，包括三氟乙酸，并且使用类似的固化方案，淀粉样蛋白β结构可以被恢复为非图案化和图案化结构。
另外，我们展示了供选择的固化剂可用于固化淀粉样蛋白单体的β折叠结构。除甲醇外，低分子量聚乙二醇(PEG，400)、异丙醇、ddH2O和KPI缓冲液也可以充当固化剂。AFM高度图像证实了CsgA图案的纳米纤维特征。
方法
1.质粒构建的详细程序
用适当的模板通过PCR扩增靶基因片段，然后在37℃下用限制性酶Nde I和Xho I(Fermentas Fast Digest)切割1小时。将制备的片段和用相同方法处理的切割质粒pET-22b混合，并与适量的Gibson组装预混液(NEB)在50℃下孵育1h，然后转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞(TransGen Biotech)中。然后将菌株涂抹在含有抗生素的LB培养基平板表面以选择目标菌株。所有的构建体均通过Genewiz进行序列验证。
2.蛋白质表达、纯化的详细程序
CsgA、CsgA-Spy标签、CsgA-snoop标签、CsgA-CBD、Spy标签-CsgA-CBD、Snoop标签-CsgA-CBD、R5-CsgA-CBD
将含有20mL LB的CsgA平板培养过夜。将另外的1升LB溶液添加到培养物中，然后使其生长至OD600 1.0。然后加入IPTG至终浓度为1mM，并在37℃下孵育60分钟。将培养物在4℃下以4000g离心10分钟。每5g沉淀在室温下用50ml GdnHCl(8M，300mM NaCl，50mM K2HPO4/KH2PO4，pH＝8)裂解12小时。以12,000×g收集裂解物的上清液30分钟，然后负载到His-Select Ni-NTA色谱柱上。用KPI(300mM NaCl，50mM K2HPO4/KH2PO4，pH＝8)缓冲液和20mM咪唑KPI缓冲液冲洗该柱，然后用300mM咪唑KPI缓冲液洗脱。
mCherry-Spycatcher和GFP-snoop catther的纯化
将携带表达mCherry-Spycatcher或GFP-snoopcatcher蛋白的质粒的细胞种子接种在5mL LB培养溶液中，并在37℃下培养过夜。然后将种子培养物添加到1升LB中生长，直到OD600达到0.6。然后将IPTG添加到培养物中，终浓度为0.5mM。细胞培养在16℃下再继续进行12小时。然后通过离心收集细胞沉淀，然后在冰上用溶菌酶缓冲液(20mg/mL)裂解30分钟。在细胞裂解过程中，以～60％的功率(开启10s，关闭30s)应用超声处理3次。其余纯化程序遵循与CsgA融合蛋白相同的方案。
3.油墨的制备
蛋白质油墨
将含有纯化的蛋白质单体的溶液静止孵育过夜。自组装的纳米纤维用ddH2O透析(3kDa，Yasen)72小时以去除盐分，然后冷冻干燥。然后将每3mg粉末溶解在1mL HFIP中直至完全溶解。使用前，将溶液用220nm PTFE过滤器(Millipore)过滤。由于HFIP是一种有毒的挥发性溶剂，因此所有程序均在通风橱中进行。
蛋白质/几丁质油墨
通过将蛋白质(2mg/ml)和几丁质纳米纤维(2mg/mL)溶解在HFIP中来制备蛋白质/几丁质复合油墨。几丁质纳米纤维油墨是按照先前公开的程序制备的。简言之，将β-几丁质粉末(Industrial Research Ltd-New Zealand)溶解于HFIP中一周以上，并偶尔搅拌。在使用之前，将溶液用220nm PTFE过滤器(Millipore)过滤。
4.通过微转移模塑方法的图案制造
PDMS模具的制备
通过在PS培养皿中将混合的预聚物和固化剂以10:1的比例浇铸在硅模具(蜘蛛图案的宽度和深度为1μm)上，然后将其放入70℃的烤箱中约4小时，接着真空脱气从而制备PDMS模具。固化后，用剃须刀片将PDMS切割成确定的形状。
基材清洗
将硅和玻璃基材浸入piranha(饱和H2SO4和30％H2O2水溶液，体积比为7:3)中并加热过夜，然后在丙酮的异丙醇溶液中分别超声清洗30分钟。对于ITO和Au(在二氧化硅上热蒸发)基材，它们分别在丙酮的异丙醇溶液中超声清洗30分钟。对于PS基材，将其在乙醇溶液中超声清洗30分钟。最后，所有基材均用ddH2O冲洗并用高压N2气干燥。
通过微转移模塑的图案化方法
将20μL制备的蛋白质油墨(3mg/mL)滴在干净的载玻片上，并且将预制造的PDMS压模轻轻地放置在蛋白质油墨之上并孵育1秒以允许完全扩散。用干净的镊子将PDMS移到目标基材并孵育15-30分钟。
复性方法
剥离PMDS后，将样品置于由温和的N2鼓泡的甲醇溶液上方至少一周，然后放置在甲醇溶液中过夜。
独立式图案制造
将PVA(5％)溶液滴在玻璃基材上并形成牺牲层。经过图案和复性处理后，牺牲层用ddH2O冲洗。
5.稳定性测试
蛋白质粉末样品的稳定性
进行FTIR光谱，以通过比较挑战之前和之后样品中的β折叠的特征峰，来确定在不同条件下结构的稳定性。
对于长期稳定性测试，将蛋白质纳米纤维粉末(在甲醇气氛中固化后)在柜中放置6个月(20℃，相对湿度60％)。对于极端温度测试，将粉末放置在烘箱(90℃)和冰箱(-80℃)中。对于在水性缓冲液或有机溶剂中的稳定性测试，将样品在装有液体的1mL离心管中放置24小时。在进行FTIR光谱表征之前，将样品冷冻干燥以完全除去液体。
图案化样品的稳定性
在不同的极端条件下挑战的图案化结构的稳定性是基于结构的形态和高度变化的，该结构基于AFM高度图像。为了进行长期稳定性测试，将硅基材上的图案放置在柜中6个月(20℃，相对湿度60％)。对于极端温度测试，将图案放置在烘箱(90℃)和冰箱(-80℃)中。为了测试水性缓冲液和有机溶剂，将图案在覆盖有液体的玻璃培养皿中放置24小时。在进行AFM高度图像表征之前，将图案用ddH2O洗涤并用高压N2气体干燥。
6.Ni-NTA包覆的QD和Au NP的组装方法
将玻璃基材(1cm2)上的PAM图案与200μL Au NP或QD(0.1mg/mL)溶液一起孵育30分钟，用ddH2O洗涤并用N2流干燥。QD和Au NP的合成和配体交换遵循先前出版物中的程序。
7.荧光蛋白与独立式图案化多孔PAM片材的缀合
用200μL荧光蛋白溶液(1mg/mL)覆盖玻璃基材(1cm2)上的图案化PAM 30分钟。然后将样品用ddH2O洗涤并用N2流干燥。
8.在独立式图案化多孔PAM片材上的SiO2的仿生矿化
将60μL TEOS(1M)和HCl(1mM)溶液添加到PAM片材上以进行仿生硅化，并在环境条件下孵育10分钟。反应后，将多孔PAM片材用ddH2O洗涤，并在通风橱中干燥过夜。
9.细胞实验
细胞培养
人胚胎肾细胞(HEK-293，ATCC)在37℃，5％CO2下在补充有10％(v/v)FBS(Gibco，NY，美国)和1％(v/v)青霉素/链霉素溶液(Biowest，法国)的DMEM(Gibco，NY，美国)中培养。
转染
用pSEAP2-对照(PSV40-SEAP-pA；SEAP，人胎盘分泌的碱性磷酸酶；Clontech)和pmCherry2-C1(PCMV-mCherry-pA；Addgene)转染细胞。简言之，24孔板的每个孔中接种的5×104个细胞在转染前18-20h与在无血清和无抗生素的DMEM中的含有0.3μg总DNA的50μL 3:1PEI:DNA混合物(w/w)(聚乙烯亚胺，MW 40,000；Polysciences，德国)孵育6h。
MTT分析
简言之，将5x104个HEK-293T细胞接种在24孔板的每个孔中，并在各种浓度的OA存在下培养72小时；然后将40μL MTT(5mg/ml的PBS溶液)添加到每个孔中，并在37℃下孵育4h，然后向每个孔中添加600μL DMSO，直到紫色的甲臜晶体完全溶解。使用酶标仪(BioTekInstruments,Inc.)在490nm下测量特征吸收。
报告基因分析
使用配备有LEICA数码相机(LEICADFC9000 GT)、20×物镜和Leica ApplicationSuite软件(LAS X)的LEICA显微镜(LEICA DMi8)可视化mCherry表达。使用基于pNpp的光吸收时间过程定量细胞培养上清液中SEAP的表达。简言之，将80μL热灭活的细胞培养物上清液(65℃，30min)添加到120μL底物溶液(100μL pH＝9.8的包含20mM高精氨酸、1mM MgCl2、21％二乙醇胺的2x SEAP分析缓冲液和20μL含120mM pNpp(对硝基苯基磷酸盐)的底物溶液)中，并使用酶标仪(BioTek Instruments,Inc.)用Gen5软件在405nm(37℃)下记录吸光度10分钟。
基因构建
Claims (16)
1.一种材料制造方法，包括：
(a)由包含稳定在液体溶剂中的淀粉样蛋白单体的可编程淀粉样蛋白材料油墨制造结构，其中所述溶剂是六氟异丙醇或三氟乙酸，所述淀粉样蛋白单体是CsgA；和
(b)使所述结构与引发淀粉样蛋白单体聚合和结构稳定的固化剂接触；
其中所述固化剂是甲醇，其可以引发内在淀粉样蛋白组装但维持所产生的结构的原始形态。
2.权利要求1所述的方法，其中所述制造步骤包括微转移模塑、压花、旋涂、浸涂、静电纺丝、喷涂、刷涂、光刻、静电纺丝。
3.权利要求1或2所述的方法，其中CsgA被一个或多个官能团官能化，所述官能团包括活性酶，异肽标签系统，细胞亲和标签，或抗菌肽，细胞增殖或分化功能性肽，无机纳米颗粒的模板化生长功能性肽。
4.权利要求3所述的方法，其中CsgA在C和/或N末端被一个或多个官能团官能化。
5.权利要求3所述的方法，其中所述异肽标签系统为Spy标签，所述细胞亲和标签为RGD。
6.权利要求1或2所述的方法，其中所述溶剂充当强氢键给体，并且通过氢键破坏来增溶淀粉样蛋白，但是作为弱的氢键受体起作用，并且不与淀粉样蛋白单体形成键，其中所述溶剂可以随时间推移溶解淀粉样蛋白结构并破坏β折叠结构。
7.权利要求1或2所述的方法，其中所述接触步骤包括两步固化：在气相中与第一固化剂的第一接触，以及在液相中与第二固化剂的第二接触。
8.权利要求7所述的方法，其中所述第一和第二固化剂是相同的。
9.权利要求1或2所述的方法，其中所述结构选自：2D和3D阵列以及自支撑图案化多孔PAM片材，包括不同的表面和界面，均匀的涂层或图案化结构。
10.权利要求9所述的方法，其中所述不同的表面和界面为2D疏水或亲水表面、3D不规则界面、微流体装置或医学植入物表面。
11.权利要求1或2所述的方法，其中在所述接触步骤之后，所述结构在固化之后重新获得β折叠，并且在大范围的苛刻条件挑战后保持超稳定，并且在环境条件下具有长期稳定性。
12.权利要求11所述的方法，其中所述苛刻条件为90℃的高温和-80℃的低温，有机溶剂或大范围的pH＝2-12的溶液。
13.权利要求11所述的方法，其中所述结构在大范围的苛刻条件挑战后保持结构和/或功能稳定。
14.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括用酶选择性地降解所述结构。
15.权利要求14所述的方法，其中所述酶为用于CsgA和csgACBD的胰蛋白酶或蛋白酶K或用于几丁质的几丁质酶。
16.一种通过权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的方法制备的制造的材料结构。
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