WO2017026804A1 - 근육 손상 치료용 질소기반 저온 대기압 플라즈마 - Google Patents

근육 손상 치료용 질소기반 저온 대기압 플라즈마 Download PDF

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WO2017026804A1
WO2017026804A1 PCT/KR2016/008811 KR2016008811W WO2017026804A1 WO 2017026804 A1 WO2017026804 A1 WO 2017026804A1 KR 2016008811 W KR2016008811 W KR 2016008811W WO 2017026804 A1 WO2017026804 A1 WO 2017026804A1
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muscle
nitrogen
plasma
treatment
damaged
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PCT/KR2016/008811
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김철호
강성운
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아주대학교산학협력단
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    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/44—Applying ionised fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma for treating or promoting injured muscle, and a method for promoting and treating injured muscle using the same.
  • muscle supple injury is characterized by the destruction of the muscle-gun unit. Destruction of the muscle-gun unit can occur anywhere in the muscle.
  • Muscle tissue contains cells with the characteristics of stem cells called satellite cells, which are located between the plasma membrane and the basement membrane. These cells exist in a stationary state that is inactive under normal muscle conditions, and when muscle damage occurs, they proliferate and differentiate to help regenerate damaged muscles.
  • stem cell introduction method which is being studied for muscle tissue regeneration, has a limitation that cannot be easily applied to patients due to the surgical procedure. Therefore, there is a need for a therapeutic agent and treatment method for regenerating muscles and treating injuries by non-invasive methods.
  • the low temperature atmospheric plasma refers to a plasma in which the energy of the ions and electrons constituting the plasma is greater than the energy possessed by the ions, and is also referred to as a low temperature atmospheric pressure plasma.
  • low-temperature plasma is generated when the high-pressure electric discharge in the exhaust gas causes electrons generated by the discharge to collide with molecules of the exhaust gas to change the outer electron state of the gas molecules. , OH, COOH, CHO, etc.), excitation molecules, ions are charged positively or negatively to become an electrically neutral gas.
  • Plasma is classified into a high temperature thermal plasma having high electron, ion, and molecular temperature, and a low temperature plasma having only electron temperature.
  • the high temperature thermal plasma can be used to melt the material to obtain a high temperature
  • the low temperature plasma can be applied to materials or conditions that cannot be applied to high temperature because only the temperature of the electron is high, and the device has a simple advantage.
  • an object of the present invention is to provide a method for preparing a nitrogen-based cold atmospheric plasma for a new therapeutic agent and method for treating muscle damage and muscle damage related diseases without surgical operation.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating muscle injury-related diseases, including the nitrogen-based cold atmospheric plasma, and a method for treating or repairing damaged muscles.
  • the present invention comprises the steps of filling the nitrogen gas with a carrier gas; Applying a charged nitrogen gas at a frequency of 5-20 kHZ and a discharge initiation voltage of 5-10 kV to generate a nitrogen-based cold atmospheric plasma; It provides a method for producing a nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma for the treatment of damaged muscle or promoting the regeneration of damaged muscle comprising a.
  • the present invention provides a nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma for the treatment of damaged muscle or to promote the regeneration of the damaged muscle prepared by the above method.
  • the present invention provides a method for treating damaged muscle or promoting regeneration of damaged muscle including the nitrogen-based cold atmospheric plasma.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating muscle injury-related diseases, including the nitrogen-based cold atmospheric plasma.
  • the present invention comprises the steps of treating the damaged muscle or nitrogen-based cold atmospheric plasma for promoting regeneration of the damaged muscle to the muscle cells in vitro; It provides a method for promoting the movement, proliferation or differentiation of muscle cells comprising a.
  • the nitrogen-based cold atmospheric plasma of the present invention can effectively induce the activation of muscle cells, the movement of muscle cells to damaged areas, the proliferation of muscle cells and the differentiation of muscle cells during or without surgery. Therefore, it can be usefully used as a novel therapeutic agent and treatment method for muscle damage and muscle damage related diseases.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a system for producing a nitrogen gas-based low temperature atmospheric plasma.
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration of a plasma apparatus in which a shielding tube is connected to a plasma nozzle, and a plasma processing method using the plasma apparatus.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a spectrum analysis result of nitrogen-based plasma.
  • FIG. 4 is a view showing a result of confirming the temperature change according to the nitrogen-based plasma treatment distance.
  • Figure 5 is a diagram showing the injury site of the muscle damage animal model prepared to confirm the muscle damage treatment effect.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of visually confirming the cytotoxicity according to nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma treatment.
  • C untreated control group
  • G nitrogen gas treatment group alone
  • P30 30 seconds treatment group
  • P60 60 seconds treatment group
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of confirming the cytotoxicity according to nitrogen-based cold atmospheric plasma treatment in growth medium (GM) and differentiation medium (DM) using Live / Dead staining method (C: untreated control, G: nitrogen gas) Single treatment group, P30: 30 second treatment group, P60: 60 second treatment group).
  • GM growth medium
  • DM differentiation medium
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of confirming the neovascularization of the capillaries according to nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma treatment (C: untreated control group, G: nitrogen gas treatment group, P30: 30 seconds treatment group, P60: 60 seconds treatment group) .
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of calculating the degree of muscle tissue regeneration using a standard scoring system (C: untreated control group, G: nitrogen gas treatment group, P30: 30 seconds treatment group, P60: 60 seconds treatment group) ( ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001).
  • FIG. 10 is a diagram showing the results confirmed by immunohistochemical staining muscle tissue regeneration according to the treatment of nitrogen-based atmospheric pressure plasma (illustrated by arrow).
  • C untreated control group
  • G nitrogen gas treatment group alone
  • P30 30 seconds treatment group
  • P60 60 seconds treatment group
  • FIG. 11 is a diagram showing Western blot results for MyHC-3 expression (C: untreated control group, G: nitrogen gas treatment group, P30: 30 seconds treatment group, P60: 60 seconds treatment group).
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of confirming that the satellite cells of muscle are active after nitrogen-based cold atmospheric plasma treatment using immunohistochemical staining using Pax 7 and Ki-67 antibodies (C: untreated control, G: nitrogen gas alone) Treatment group, P30: 30 seconds treatment group, P60: 60 seconds treatment group).
  • Figure 16 Draining total cell number (a), Pax7 expression (b), Pax7, Ki-67 coexpression (c), Pax7 + / Ki-67 + expression (d) for Pax7 following nitrogen-based plasma treatment Figure is shown. (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, and ***, +++ P ⁇ 0.001.)
  • 19 is a diagram showing the effect of in vitro cell differentiation by nitrogen-based plasma treatment. *** P ⁇ 0.001.
  • Figure 22 shows the results of confirming the changes in the expression of Myogenin, myosin heavy chain (MHC), the muscle satellite cell differentiation markers in growth medium (GM) and differentiation medium (DM) according to nitrogen-based cold atmospheric plasma (NTP) treatment It is also.
  • MHC myosin heavy chain
  • GM growth medium
  • DM differentiation medium
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of confirming the increase in intracellular expression of myosin heavy chain (MHC) in differentiation medium (DM) following nitrogen-based cold atmospheric plasma (NTP) treatment.
  • MHC myosin heavy chain
  • DM differentiation medium
  • NTP nitrogen-based cold atmospheric plasma
  • the present invention comprises the steps of filling the nitrogen gas with a carrier gas; Applying a charged nitrogen gas at a frequency of 5-20 kHZ and a discharge initiation voltage of 5-10 kV to generate a nitrogen-based cold atmospheric plasma; It provides a method for producing a nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma for the treatment of damaged muscle or promoting the regeneration of damaged muscle comprising a.
  • the present invention provides a nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma for the treatment of damaged muscle or to promote the regeneration of the damaged muscle prepared by the above method.
  • Nitrogen-based cold atmospheric plasma of the present invention can effectively induce the activation of muscle cells, the movement of muscle cells to the damage site, the proliferation of muscle cells and the differentiation of muscle cells when treated to the damaged muscle area, muscle damage and muscle It can be usefully used for the treatment of injury-related diseases.
  • plasma refers to an ionized gas that satisfies Debye shielding. This, along with the three basic states of matter, gas, liquid, and solid, is considered to be another state and is expressed in the fourth state.
  • the neutral gas is phase-transferred into the plasma by an external voltage, and electrons and cations may be generated by excitation and ionization of the neutral gas, and radicals in which molecular gas is excited may exist.
  • the plasma generating apparatus can generate a nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma according to the object of the present invention, a known plasma generating apparatus can be used without limitation.
  • the plasma generating apparatus of the present invention may have an optical emission spectroscopy, an oscilloscope, a high voltage probe, an AC clamp current meter, a plasma jet apparatus, a UV and gas sensor, a carrier gas supply gas cylinder, and a diameter as an electrode. It can be configured as a disk-shaped structural electrode having 5-10 mm, thickness of 150-250 ⁇ m, and having 19 holes of 300-600 ⁇ m.
  • the ceramic spacer for the role of the insulating layer between the electrodes can be a configuration that may be an outer diameter of 5-20 mm, an inner diameter of 5-10 mm, thickness of 0.5-2 mm.
  • the present invention has been devised a configuration for checking the plasma discharge state of the application site to prevent the plasma leakage to the outside of the affected area for the application of the affected part of the plasma, plasma using a plasma device connected to the shielding tube to the plasma nozzle It was used for investigation.
  • the structure of such a plasma apparatus is shown in FIG.
  • the “ carrier gas” is a gas for producing a plasma that achieves the object of the present invention, and the plasma can be generated by supplying a high voltage current to such gas.
  • the carrier gas of the present invention is nitrogen gas.
  • the exposure conditions of the nitrogen-based cold atmospheric plasma for treating muscle damage may be adjusted according to the amount of plasma gas discharge, the type of carrier gas, the distance from the plasma source to the affected part, the number of plasma exposures, and the plasma exposure time.
  • the plasma generating apparatus of the present invention may use 5-10 kV, preferably 7-8 kV, as a discharge start voltage, and is 1-10 kV, preferably 2-5 kV, more preferably as a voltage that is stably discharged after the start of discharge. Can use a voltage of 3-4kV. Suitable frequencies for the plasma production of the present invention are 5-20 kHZ, preferably 10-20 kHZ, most preferably 15 kHZ.
  • Such a plasma generating apparatus generates a low temperature plasma (NTS) at atmospheric pressure.
  • NTS low temperature plasma
  • “Injured muscle” of the present invention may include damage to any muscle tissue. Muscle damage can result from physical trauma to muscle tissue, resulting from accidents, motor injuries, endocrine gland disorders, diseases, wounds or surgical operations.
  • the nitrogen-based cold atmospheric plasma of the present invention has a therapeutic effect on damaged muscles formed by one or more selected from the group consisting of activation of muscle cells, movement of muscle cells to damaged areas, growth of muscle cells and differentiation of muscle cells. .
  • the nitrogen-based cold atmospheric plasma of the present invention is useful for muscle repair and muscle damage treatment by promoting muscle damage recovery.
  • the method of the present invention is also useful for alleviating muscle spasms.
  • the nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma of the present invention causes direct muscle cell activation and muscle tissue regeneration promotion, unlike general muscle contraction strengthening, etc., and has a very good repair regeneration effect for repairing muscle tissue in a state where tissue is removed. Therefore, the nitrogen-based cold atmospheric plasma of the present invention can be effectively used for the treatment of patients with muscle damage and muscle damage-related diseases caused by muscle tissue, muscle cell death and the like.
  • Treatment of the present invention includes prophylactic, palliative and curative treatment.
  • the present invention comprises the steps of treating the damaged muscle prepared by the above production method or treating the damaged muscle with a nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma for promoting the regeneration of the damaged muscle; It provides a method of treating damaged muscles or promoting the regeneration of damaged muscles of an individual comprising a.
  • the subject is an individual in which muscle damage is caused by various causes such as an accident, an exercise injury, an endocrine gland disorder, a disease, a wound or a surgical operation, and the subject activates muscle cells by treating the nitrogen-based cold atmospheric plasma of the present invention,
  • the movement of muscle cells to the damaged area, the proliferation of muscle cells, and the differentiation of muscle cells are actively performed, so that muscle tissue can be regenerated and differentiated.
  • Exposure conditions of the nitrogen-based cold atmospheric plasma of the present invention can be controlled to treat muscle damage in the subject.
  • the nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma gas may be appropriately selected in an amount effective for treating muscle damage, but preferably 2 to 10 L / min, more preferably 3 to 6 L / min.
  • the distance from the plasma source to the affected area to be treated for muscle damage may be 0.3 to 10 cm, preferably 0.3 to 5 cm, and the nitrogen-based plasma of the present invention does not induce heat generation even when irradiated to the affected area.
  • the plasma can be irradiated from the area adjacent to the damaged area.
  • the treatment conditions of the nitrogen-based low temperature atmospheric plasma of the present invention is once to 10 times a day, preferably once to 5 times a day, 5 seconds to 300 seconds, preferably 10 seconds to 200 seconds, more preferably May be to treat the injured muscle area for 10 seconds to 120 seconds.
  • Nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma for treating and treating damaged muscle of the present invention is characterized by using nitrogen (N2) gas as a carrier gas, and when using nitrogen gas, cytotoxicity compared to plasma prepared with other carrier gases There is an advantage that can achieve the effects such as better muscle damage regeneration, accelerated neoplasia, muscle cell migration and differentiation without.
  • the nitrogen-based low temperature atmospheric plasma uses nitrogen gas as a carrier gas, and is manufactured under a starting voltage of 7-8 kV and a stable voltage of 3-4 kV, a frequency of 15 kHZ, and a 3-6 L / min plasma emission condition. And the emitted, the distance from the plasma generating source to the affected area to be treated muscle damage can be adjusted to 0.3 to 5cm can be treated. In addition, the plasma can be treated once a day for 10 seconds to 120 seconds, the treatment period can be appropriately adjusted according to the degree of muscle damage recovery.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating muscle injury-related diseases, including nitrogen-based cold atmospheric plasma.
  • the muscle injury-related diseases may be diseases caused by the death of muscle cells due to various causes, damage to muscle tissues, etc. as a generic term of diseases caused by damaged muscles, and by treatment with nitrogen-based low temperature atmospheric plasma of the present invention. Differentiation of muscle tissue is promoted, and muscle cells can be activated to include all relevant diseases in which muscle damage can be treated.
  • Representative muscle injury related diseases include, for example, ligament rupture, ligament injury, and rotator cuff injury.
  • the nitrogen-based cold atmospheric plasma of the present invention can be treated in combination with primary therapies such as treatment with chemotherapy or surgical surgery to induce a faster action of the primary therapy and potentiate its muscle damage repair action.
  • the nitrogen-based cold atmospheric plasma of the present invention may be used to enhance the effectiveness of the primary therapeutic agent used in chemotherapeutic therapy using drugs, or may be directly treated at sites requiring muscle repair without surgical surgery.
  • the present invention also provides a kit for treating muscle damage, comprising a device for producing a nitrogen-based cold atmospheric plasma.
  • the kit may be used for treating muscle damage through muscle repair, and is preferably a kit for treating nitrogen-based cold atmospheric plasma non-invasively directly to the muscle injury site. Since the kit of the present invention includes a device capable of generating a nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma when necessary, it can be applied to a site in need of treatment to easily treat muscle damage and muscle damage related diseases.
  • treatment of the present invention refers to direct irradiation of the generated nitrogen-based cold atmospheric plasma to a lesion site, a muscle injury site, and a site requiring muscle repair.
  • the kit may include a device for producing a nitrogen-based cold atmospheric plasma, and may include instructions describing how to use the same.
  • the present invention comprises the steps of treating the muscle muscle or the nitrogen-based cold atmospheric plasma for promoting the regeneration of the damaged muscle to the muscle cells; It provides a method for promoting the movement, proliferation or differentiation of muscle cells comprising a.
  • Treatment of the nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma can be performed both in vitro and in vivo, and can effectively promote the movement, proliferation or differentiation of muscle cells in an individual or isolated cells, and finally induce muscle regeneration.
  • the cells may be cultured in a growth medium or a differentiation medium, and more preferably in a growth medium.
  • the growth medium may include without limitation a medium known in the art having conditions for growing muscle cells.
  • Nitrogen (N 2 ) gas was used as a carrier gas to produce a low temperature atmospheric plasma as a uniform plasma for application in biological studies.
  • a system for the production of a nitrogen gas-based non-thermal atom plasma (NTP) based on nitrogen gas as a carrier gas is shown in FIG. 1.
  • a system for preparing a nitrogen gas-based low temperature atmospheric plasma of the present invention includes an optical emission spectroscopy, an oscilloscope, a high voltage probe, an AC clamp current meter, a plasma jet device, a UV and gas sensor, a carrier gas.
  • the supply gas cylinder is connected.
  • the electrode used for the nitrogen-based plasma of the present invention has a diameter of 8 mm and a thickness of 200 ⁇ m, and has a disk-shaped structure having 19 holes of 500 ⁇ m, and the ceramic spacer has an outer diameter of 11 mm, an inner diameter of 6 mm, and a thickness of 1 mm. It consists of a donut-shaped structure of which serves as an insulating layer between the two electrodes. It was confirmed that the discharge start voltage for discharging the plasma was 7-8 kV and the voltage at which the discharge was stably discharged after the start of the discharge was 3-4 kV. Suitable frequency for plasma production is 15 kHZ. In order to apply the affected part of the plasma, a configuration was devised to check the plasma discharge state of the applied part and to prevent the leakage of the plasma to the outside of the affected part. . The structure of such a plasma apparatus is shown in FIG.
  • Spectral analysis was performed on the generated nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma using an optical luminescence analyzer (SC2100, K-MAC, Korea), and non-contact IR-thermometry (Raytek, Santa Cruz, USA).
  • the gas discharge was 4 L / min.
  • FIG. 3 The spectral analysis results of the nitrogen-based plasma are shown in FIG. 3, and the temperature change when it is irradiated at a distance of 1 to 5 cm is shown in FIG. 4.
  • FIG. 4 various excited species were identified in the plasma jet, and as shown in FIG. 4, even when closely irradiated at a distance of 1 cm, the temperature did not rise above 37 ° C., similar to the body temperature. It was.
  • nitrogen-based low temperature atmospheric plasma prepared as described above was used in the following experiment.
  • Nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma prepared by controlled release of nitrogen introduced at a high pressure into the controller at a high pressure of 3 to 6 L / min using a hydraulic system was treated at the affected part or the test site.
  • the four damaged sites formed were classified into four treatment groups as shown in Table 1 below.
  • Differentiation medium refers to a medium formed to induce the proliferation of muscle cells proliferated in vitro, and was able to induce differentiation by controlling the amount of serum added.
  • a proliferation medium a general cell proliferation medium in which muscle cells were proliferated in vitro was used, and more specifically, a medium in which 10% serum was added to DMEM medium was used. Cell death confirmation results are shown in FIG.
  • the nitrogen-based plasma of the present invention was confirmed to be a safe material that does not cause cytotoxicity.
  • tissues of all treatment groups were taken on the 7th and 14th day of the nitrogen-based plasma irradiation, respectively, and photographed, and image analysis was performed. Images were taken with a digital camera and checked and calculated using Metamorph_NX image software (Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA). The mean diameter of the 20 injury sites was 8.56 ⁇ 0.47 mm. To confirm the extent of muscle damage in rats, the removed tissue was stained, and the structure of the removed tissue was confirmed to include muscles with skin layers. In order to ensure that the treatment of the nitrogen-based plasma did not affect the untreated control, the untreated site was protected with a surgical cloth during the plasma treatment. The distance between the damaged part and the plasma nozzle was maintained at 0.4 cm and the space between the damaged part and the plasma irradiation apparatus was kept closed through the shielding film.
  • capillaries were formed on the repaired tissues of the experimental group treated with P60 for 7 days. After 14 days, capillary neovascularization was visually confirmed on the images in all experimental groups treated with nitrogen-based plasma. .
  • H & E staining hematoxylin & eosin staining
  • PSR Picro Sirius red
  • MT Masson's trichrome staining
  • H & E staining was used to observe the regeneration and cell state of muscle tissue removed by staining the nucleus and cytoplasm of all cells in the tissue
  • PSR staining was used to morphologically distinguish muscle tissue from surrounding tissue.
  • MT staining was performed to show the difference in color between surrounding tissue and muscle tissue, and to facilitate the observation of new muscle.
  • MT staining results of red staining of muscle cells are shown in FIG. 8.
  • muscle tissue corresponding to a score of 0.85 ⁇ 1.07 in the P30 group and 1.86 ⁇ 1.21 in the P60 group was regenerated after 14 days of treatment, and 0.14 ⁇ 0.38 of the untreated control group and 0.43 ⁇ 0.78 of the nitrogen gas treatment group alone. There was a statistically significant difference in comparison (P ** ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0001).
  • MyH-3 myosin heavy chain-3
  • MyH-3 may be a marker for identifying new muscle. Therefore, a certain tissue was secured in each group of the target animals, and the expression level of MyH-3 protein was compared by Western blot. On the 7th and 14th day of plasma treatment, the expression of MyH-3 was confirmed in the P60 group treated with plasma for 60 seconds, and its expression was confirmed by immunohistochemical staining.
  • FIG. 10 Immunohistochemical staining results are shown in FIG. 10. As shown in FIG. 10, in both P30 and P60 treatment groups, it was confirmed that MyHC-3 antibody was generated in the direction of a damaged muscle area, that is, a muscle removed area, at the distal end of normal muscle and developed brown color.
  • FIG. 11 Western blot results for MyHC-3 expression are shown in FIG. 11. As shown in FIG. 11, it was confirmed that the expression of MyHC-3 was significantly increased in the experimental group treated with nitrogen based plasma for 30 seconds (P30) and 60 seconds (P60) for 7 days and 14 days, respectively.
  • the tissue regenerated by the treatment of nitrogen-based plasma is muscle tissue, through which the nitrogen-based plasma was confirmed to induce rapid new muscle generation only 1 to 2 weeks treatment.
  • Example 4 Nitrogen based plasma Induction of muscle tissue and cell activity following treatment
  • muscle cells whose cell activity is stationary at the edge of the muscle bundle are converted to proliferable activated state when the muscles are damaged, move around the damaged muscles, and then proceed to regenerate the muscles by proliferating and differentiating. Therefore, we observed the source of the large amount of cells concentrated around the muscles lost by treatment with nitrogen-based plasma and the activity state of the cells.
  • Pax 7 and Ki-67 antibodies are expressed in proliferating cells. Immunohistochemical staining was performed.
  • Pax7 and Ki-67 were expressed at the same time, thereby confirming that the colonized cells in the damaged muscle and neonatal muscle are active states capable of proliferating as satellite cells of the muscle.
  • the total number of cells in the nitrogen-based plasma treated group was 1.2 times (P30), and 1.4 times (P60) of the control at day 7.
  • a is the total number of cells
  • b is Pax-7 expressed cells
  • c is the number of cells co-expressed Pax-7
  • Ki-67 is the number of cells co-expressed Pax-7 and Ki-67
  • d is a diagram showing the ratio of Pax-7 to coexpression.
  • the number of Pax-7 positive cells at day 7 in the P30 and P60 groups was 1.8 and 3.1 times higher than the control. Over time, cell counts were significantly lower in the group treated with nitrogen-based plasma.
  • muscle cells were dispensed to culture plates at a density of about 1.25 ⁇ 10 5 cells / cm 2 and grown to confluence.
  • Cell migration assays and cell proliferation assays are described in Chang, JW et al. It was carried out using the method described in.
  • Growth medium (GM) was used for extracellular proliferation and differentiation of human muscle cells.
  • the wound recovery site of the nitrogen-based plasma treatment group was 61.31 ⁇ 6.3, 1.5 times higher than that of the control group 42.27 ⁇ 4.13. Nitrogen-based plasma treated cells in the proliferation culture were confirmed to fill more empty space than the untreated group, and through this, it was confirmed that the wound recovery progressed more.
  • the number of initially divided cells was compared with the number of cells after crystal violet staining, and as a result, the number of cells in the nitrogen-based plasma treatment group was 2.17 ⁇ 0.01. It was confirmed that it is significantly higher than 1.79 ⁇ 0.02 of the control group.
  • nitrogen-based plasma moves muscle cells to the boundaries of damaged muscle tissue. Accordingly, whether the treatment of nitrogen-based plasma can induce cell differentiation following the movement and proliferation of muscle cells, MyoD expressed in muscle satellite cells, MyoD expressed in the muscle cell differentiation, and expressed at the end of differentiation Myogenin (Myo G) antibodies were used in growth and differentiation media. More specifically, primary normal human skeletal muscle myoblasts were purchased from Lonza and cultured to proliferate and differentiate. Undifferentiated cells of Clonetics Basal Medium and Bullet Kit medium were differentiated by media conversion to DMEM medium supplemented with 2% horse serum, 2 mmol / L glutamine and 50 U / mL streptomycin and penicillin. Cell differentiation capacity was assessed by expression of myogenic differentiation markers.
  • mRNAs and proteins known to be involved in muscle production were observed via Western blot and MHC staining.
  • the antibodies used in the western blot were as follows: myosin heavy chain (MHC) (R & D system, Minneapolis, USA), myogenin (Abcam, Cambridge, UK), creatine kinase M (Santa Cruz, California, USA) ), MET, p-p38, p38, p-AKT, AKT, and ⁇ -tubulin (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA).
  • PCR conditions were as follows: denaturation at 94 ° C.
  • FIG. 23 Immunofluorescence microscopy results are shown in FIG. 23. As shown in FIG. 23, it was confirmed that muscle tube formation was increased along with MHC expression upon treatment of nitrogen-based plasma by MHC staining. In addition, intracellular expression of myosin heavy chain was also high in the nitrogen-based plasma treatment group, confirming that the cells were fused. These results indicate that treatment of nitrogen-based plasma promotes the differentiation of muscle cells.
  • nitrogen-based plasma promotes muscle regeneration by non-invasive and non-contact biological stimulation, and induces the migration and proliferation of muscle cells in vivo and in vitro to form muscle fibers and thereby damage the muscles. It can be effectively recovered.
  • the nitrogen-based low-temperature atmospheric plasma of the present invention can activate muscle cells, move muscle cells to damaged areas, muscle cell proliferation, and muscle cell differentiation without surgery or during post-surgical treatment. Since it can be effectively induced, there is industrial applicability because it can be usefully used as a novel therapeutic agent and treatment method for muscle damage and muscle damage related diseases.

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Abstract

본 발명은 손상 근육의 치료 또는 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 제조방법, 이를 이용한 손상 근육 치료 및 재생 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 외과적 수술 없이, 또는 외과적 수술 후 처리과정에서 근육 세포의 활성화, 근육 세포의 손상부위로의 이동, 근육 세포의 증식 및 근육 세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으므로, 신규한 근육 손상 및 근육 손상 관련 질환 치료제 및 치료방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

근육 손상 치료용 질소기반 저온 대기압 플라즈마
본 발명은 손상 근육의 치료 또는 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 제조방법, 이를 이용한 손상 근육 치료 및 재생 촉진 방법에 관한 것이다.
일반적으로 근육에 가해지는 손상에는 타박상(멍), 열상, 국소빈혈 및 완전 파열과 같은 다양한 손상이 포함된다. 이러한 손상은 굉장한 동통을 유발하여, 손상을 입은 사람이 작업을 하거나, 정상적인 일상 활동조차 할 수 없도록 하여, 그를 무능력하게 만들 수 있다. 특히 골격근에 심각한 손상이 있는 경우, 신장-유도 손상이라고도 알려져 있는 좌상이 가장 흔하며, 좌상은 직업적으로 또는 스포츠 의학 전문가에 의해 처치되는 모든 손상의 30% 이상을 차지한다. 근육 좌상 손상은 근육-건 유닛의 파괴를 특징으로 한다. 근육-건 유닛의 파괴는 근육의 어느 부위에서나 발생할 수 있다.
근육 조직은 위성세포라고 불리는 줄기세포의 특성을 지닌 세포를 포함하고 있으며, 원형질막과 기저막 사이에 존재한다. 이 세포는 정상적인 근육의 상태에서는 활성이 없는 정지 상태로 존재하며 근육 손상이 발생되었을 경우 증식, 분화상태로 전환되어 손상된 근육의 재생을 돕는다. 그러나 넓고 깊은 범위의 손상이 발생된 경우 세포의 이동 및 증식에 의한 자연발생적인 근육 재생은 한계가 있어, 이를 촉진하여 근육 손상을 치료하고 근육의 재생을 유도하기 위한 다양한 치료제, 치료방법에 관한 연구가 진행되고 있다. 그러나 근육 조직 재생 등을 위하여 연구되고 있는 줄기세포 도입 등의 방법은 수술 과정이 수반되어 환자들에게 쉽게 적용할 수 없는 한계점이 있다. 따라서 비침습적 방법에 의하여 근육을 재생하고 손상을 치료하기 위한 치료제 및 치료방법에 대한 필요성이 있다.
저온 대기압 플라즈마란, 플라즈마를 구성하는 이온과 전자 중 전자가 갖는 에너지가 이온이 소유한 에너지보다 큰 상태의 플라즈마를 말하며, 저온 상압 플라즈마라고도 한다. 즉, 저온 플라즈마란 배출가스 중에서 고압의 전기방전을 행하면 방전에 의해 발생된 전자가 배출가스의 분자와 충돌하여 가스분자의 외곽 전자상태가 변하게 되어 생성되는 것으로, 반응성이 풍부한 화학적 활성종인 라디칼(예컨대, OH, COOH, CHO 등), 여기분자, 이온이 양 또는 음으로 하전되어 전기적으로 중성상태의 가스가 되는 것을 말한다.
플라즈마는 전자, 이온, 분자의 온도가 모두 높은 고온 열플라즈마와 전자 온도만 높은 저온 플라즈마로 구분된다. 고온 열플라즈마는 고온을 얻을 수 있어 물질을 용융하는데 활용되고, 저온 플라즈마는 전자의 온도만 높기 때문에 고온을 적용할 수 없는 재료나 조건에 적용할 수 있고 장치가 간단한 장점이 있다.
이러한 플라즈마는 다양한 화학반응을 유기하므로 이를 활용하여 다양한 분야에 적용하기 위한 연구가 많이 이루어지고 있다. 그러나 아직까지 이를 이용하여 근육 조직의 손상 등을 치료하는 방법에 대해서는 알려져 있지 않다.
따라서 본 발명의 목적은 외과적 수술 없이 근육 손상 및 근육 손상 관련 질환을 치료할 수 있는 새로운 치료제 및 치료방법을 위하여, 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 손상 근육 치료 또는 손상 근육 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 포함하는 근육손상 관련 질환 치료용 약학적 조성물 및 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 이용하는 근육 세포의 이동, 증식 또는 분화 촉진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 캐리어 가스로 질소 가스를 충진하는 단계; 충진된 질소 가스에 5 내지 20kHZ 주파수 및 5 내지 10kV의 방전 개시 전압을 가하여 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 생성하는 단계; 를 포함하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 포함하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 포함하는 근육 손상 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 in vitro 에서 근육 세포에 처리하는 단계; 를 포함하는 근육 세포의 이동, 증식 또는 분화 촉진방법을 제공한다.
본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 외과적 수술 없이, 또는 외과적 수술 후 처리과정에서 근육 세포의 활성화, 근육 세포의 손상부위로의 이동, 근육 세포의 증식 및 근육 세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으므로, 근육 손상 및 근육 손상 관련 질환의 신규한 치료제 및 치료방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 질소가스기반 저온 대기압 플라즈마를 제조하기 위한 시스템을 나타낸 도이다.
도 2는 플라즈마 노즐에 차폐관을 연결시킨 플라즈마 장치 구성 및 이를 이용하여 플라즈마를 처리하는 모습을 나타낸 도이다.
도 3은 질소 기반 플라즈마의 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 질소기반 플라즈마 처리 거리에 따른 온도 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 근육 손상 치료 효과를 확인하기 위하여 제조된 근육 손상 동물 모델의 손상 부위를 나타낸 도이다.
도 6은 질소기반 저온 대기압 플라즈마 처리에 따른 세포 독성 여부를 육안적으로 확인한 결과를 나타낸 도이다. (C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군).
도 7은 Live/Dead 염색법을 이용하여 성장 배지(GM) 및 분화 배지(DM)에서 질소기반 저온대기압 플라즈마 처리에 따른 세포 독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군).
도 8은 질소기반 저온 대기압 플라즈마 처리에 따른 모세혈관의 신생을 확인한 결과를 나타낸 도이다(C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군).
도 9는 근육 조직 재생 정도를 표준 점수 체계를 이용하여 계산한 결과를 나타낸 도이다(C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군) (**P < 0.01, ***P < 0.001).
도 10은 질소기반 대기압 플라즈마의 처리에 따른 근육 조직 재생을 면역조직화학 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(화살표로 도시). (C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군).
도 11은 MyHC-3 발현에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도이다 (C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군).
도 12는 질소기반 저온 대기압 플라즈마 처리 후 근육 조직 주변에 다량의 세포가 밀집되어 있음을 HE 염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군). 스케일바 = 1000 μm.
도 13은 질소기반 저온 대기압 플라즈마 처리 후 신생근육으로 유추되는 조직의 발생을 PSR 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군). 스케일바 = 1000 μm.
도 14는 질소기반 저온 대기압 플라즈마 처리 후 정상 근육 조직과 같은 근육의 생성을 MT 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(화살표: 근섬유에 위치한 세포 클러스터 집단, 별표: 소구경 근육 섬유). 스케일바 = 100 μm
도 15는 Pax 7 및 Ki-67 항체를 사용한 면역조직화학염색을 통해 질소기반 저온 대기압 플라즈마 처리 후 근육의 위성세포가 활성 상태임을 확인한 결과를 나타낸 도이다(C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군).
도 16은 질소기반 플라즈마 처리에 따른 총 세포수 (a), Pax7 발현(b), Pax7, Ki-67 공동발현(c), Pax7 에 대한 Pax7+/Ki-67+의 발현(d)을 배수화하여 나타낸 도이다. (*P < 0.05, **P < 0.01, 및 ***,+++P < 0.001.)
도 17은 질소기반 저온 대기압 플라즈마 처리 후 세포의 이동 효과를 성장 배지(GM) 및 분화 배지(DM)에서 확인한 결과를 나타낸 도이다. ***P < 0.001. Scale bar = 1000 μm.
도 18은 질소기반 플라즈마 처리에 의한 세포 밀도 결과를 크리스탈 바이올렛 염색 및 정량화를 통해 나타낸 도이다. ***P < 0.001. Scale bar = 1000 μm.
도 19는 질소기반 플라즈마 처리에 따른 in vitro 세포 분화 효과를 나타낸 도이다. ***P < 0.001.
도 20은 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 처리에 따른 Pax 7과 Myo D 항체의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다(C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군). Scale bar = 200 μm.
도 21은 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 처리에 따른 Myo D와 Myo G 항체의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다(C: 미처리 대조군, G: 질소 가스 단독 처리군, P30: 30초 처리군, P60: 60초 처리군). Scale bar = 200 μm.
도 22는 질소기반 저온 대기압 플라즈마(NTP) 처리에 따른, 성장 배지(GM) 및 분화 배지(DM)에서의 근육 위성세포 분화 마커인 Myogenin, 미오신 중쇄(MHC)의 발현의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 질소기반 저온 대기압 플라즈마(NTP) 처리에 따른 미오신 중쇄(MHC)의 세포 내 발현 증가를 분화 배지(DM)에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 캐리어 가스로 질소 가스를 충진하는 단계; 충진된 질소 가스에 5 내지 20kHZ 주파수 및 5 내지 10kV의 방전 개시 전압을 가하여 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 생성하는 단계; 를 포함하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 제공한다.
본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 손상된 근육 부위에 처리 시, 근육 세포의 활성화, 근육 세포의 손상부위로의 이동, 근육 세포의 증식 및 근육 세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으므로, 근육 손상 및 근육 손상 관련 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 "플라즈마"는 디바이 차폐(Debye shielding)을 만족하는 이온화된 기체를 말한다. 이는 물질의 기본적인 세 가지 상태인 기체, 액체, 고체와 더불어 또 하나의 상태로 여겨지며 제4상태로 표현된다. 본 발명의 플라즈마는 외부 전압에 의해 중성기체가 플라즈마로 상전이하여 중성기체의 여기, 이온화에 의하여 전자 및 양이온이 발생할 수 있고, 분자가스가 여기된 라디칼이 존재할 수 있다.
상기 플라즈마 생성장치는 본 발명의 목적에 따른 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 생성할 수 있다면, 공지된 플라즈마 생성 장치를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 플라즈마 생성장치는 광학 발광 분석기(optical emission spectroscopy), 오실로스코프, 고전압 프로브, AC 클램프 전류 측정기, 플라즈마 젯트 장치, UV 및 가스 센서, 캐리어 가스 공급 가스 통을 구성으로 가질 수 있으며, 전극으로 직경 5-10 mm,　두께　150-250　μm　이며, 300-600　μm의 구멍이　19개 뚫려있는 원판형태의 구조 전극을 구성으로 할 수 있다. 전극 사이에서 절연층 역할을 하기 위한 세라믹 스페이서는 구성으로 할 수 있으며 이는 외경　5-20 mm, 내경　5-10 mm,　두께　0.5-2 mm일 수 있다.
특히 본 발명에서는 플라즈마의 환부 적용을 위하여 적용부위의 플라즈마 방전 상태를 확인하고 환부의 외부로 플라즈마가 누수되는 것을 방지하기 위한 구성을 고안하였으며, 플라즈마 노즐에 차폐관을 연결시킨 플라즈마 장치를 이용하여 플라즈마 조사에 이용하였다. 이와 같은 플라즈마 장치의 구성을 도 2에 나타내었다.
상기 "캐리어 가스"는 본 발명의 목적을 달성하는 플라즈마의 제조를 위한 가스로, 이와 같은 가스에 고전압의 전류가 공급됨으로서 플라즈마가 생성될 수 있다. 본 발명의 캐리어 가스는 질소 가스이다.
본 발명에 있어서 근육 손상 치료를 위한 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 노출 조건은 플라즈마 가스 방출량, 캐리어 가스의 종류, 플라즈마 발생원으로부터 환부까지의 거리, 플라즈마 노출 횟수, 플라즈마 노출 시간에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 플라즈마 생성장치는 방전 개시 전압으로 5-10kV, 바람직하게는 7-8kV 을 이용할 수 있으며, 방전 개시 후 안정적으로 방전이 되는 전압으로 1-10kV, 바람직하게는 2-5kV, 더욱 바람직하게는 3-4kV의 전압을 이용할 수 있다. 본 발명의 플라즈마 제조를 위한 적정 주파수는 5-20kHZ, 바람직하게는 10-20kHZ, 가장 바람직하게는 15kHZ 이다.
이와 같은 플라즈마 생성장치는 대기압에서 저온의 플라즈마(NTS)를 발생시킨다.
본 발명의 "손상 근육"은 임의의 근조직의 손상을 포함할 수 있다. 근육 손상은 사고, 운동 부상, 내분비선 장애, 질환, 창상 또는 외과 수술로 인한, 근조직에 대한 육체적 트라우마로부터 발생할 수 있다.
본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 근육 세포의 활성화, 근육 세포의 손상부위로의 이동, 근육 세포의 증식 및 근육 세포의 분화로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의하여 이루어지는 손상 근육의 치료 효과를 갖는다.
따라서 본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 근육 손상 회복 촉진에 의한 근육 수복 및 근육 손상 치료에 유용하다. 본 발명의 방법은 근육 경련의 완화에도 유용하다. 특히 본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 일반적인 근육의 수축 강화 등과 달리 직접적인 근육 세포 활성화 및 근육 조직 재생 촉진을 유발하는 것이며, 조직이 제거된 상태에서 근육 조직을 수복해주는 수복 재생 효과가 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 근육 조직, 근육 세포 사멸 등에 의한 근육 손상 및 근육 손상 관련 질환을 갖는 환자의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 치료는 예방적, 완화적 및 치유적 치료가 포함된다.
또한 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조된 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 근육 손상 부위에 처리하는 단계; 를 포함하는 개체의 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진 방법을 제공한다.
상기 개체는 사고, 운동 부상, 내분비선 장애, 질환, 창상 또는 외과 수술과 같은 다양한 원인에 의한 근육 손상이 유발된 개체이며, 상기 개체에 본원 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 처리함으로써 근육 세포의 활성화, 근육 세포의 손상부위로의 이동, 근육 세포의 증식 및 근육 세포의 분화가 활발하게 일어나 근육 조직이 재생 및 분화될 수 있다.
상기 개체의 근육 손상 치료를 위해서 본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 노출 조건이 조절될 수 있다.
상기 질소 기반 저온 대기압 플라즈마 가스의 방출량은 근육 손상을 치료하는데 효과적인 양으로 적절하게 선택할 수 있으나 바람직하게는 2 내지 10L/분이며, 더욱 바람직하게는 3-6L/분으로 방출될 수 있다.
또한 본 발명에 있어서 플라즈마 발생원으로부터 근육 손상 치료 대상이 되는 환부까지의 거리는 0.3 내지 10cm, 바람직하게는 0.3 내지 5cm 일 수 있으며, 본원 발명의 질소기반 플라즈마는 환부에 조사하더라도 발열현상을 유도하지 않으므로 근육 손상 부위와 인접한 부위에서 플라즈마를 조사할 수 있는 장점이 있다.
또한 본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 처리 조건은 1일 1회 내지 10회, 바람직하게는 1일 1회 내지 5회로, 5초 내지 300초, 바람직하게는 10초 내지 200초, 더욱 바람직하게는 10초 내지 120초 동안 손상 근육 부위에 처리하는 것일 수 있다.
본원 발명의 손상 근육 치료용 및 손상 근육 재생용 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 캐리어 가스로 질소 (N2) 가스를 이용하는 것을 특징으로 하며, 질소가스를 이용하는 경우 다른 캐리어 가스로 제조되는 플라즈마와 비교하여 세포 독성없이도 더욱 우수한 근육 손상 재생, 신생 근육 발생 촉진, 근육 세포 이동 촉진 및 분화 등의 효과를 달성할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 바람직한 예로, 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 캐리어 가스로 질소가스를 이용하며, 7-8kV의 개시전압 및 3-4kV의 안정 전압, 15kHZ 의 주파수, 3-6L/분 플라즈마 방출 조건으로 제조 및 방출되고, 방출되는 플라즈마가 플라즈마 발생원으로부터 근육 손상 치료 대상이 되는 환부까지의 거리는 0.3 내지 5cm 로 조절되어 처리될 수 있다. 또한 플라즈마는 1일 1회 10초 내지 120초 동안 처리될 수 있으며, 치료 기간은 근육 손상 회복 정도에 따라 적절하게 조절할 수 있다.
또한 본 발명은 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 포함하는 근육 손상 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 근육손상 관련 질환은 손상 근육에 의해서 발생되는 질환의 총칭으로 다양한 원인에 기인한 근육 세포의 사멸, 근육 조직의 손상 등에 기인한 질환일 수 있으며, 본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 처리에 의하여 근육 조직의 분화가 촉진되고, 근육 세포가 활성화되어 근육 손상이 치료될 수 있는 모든 관련 질환을 제한없이 포함할 수 있다. 예컨대 대표적인 근육 손상 관련 질환은 인대 파열 및 인대 손상, 회전근개손상 등이 있다.
본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 일차적인 치료법, 예컨대 화학적 치료법 또는 외과적 수술에 의한 치료와 병합하여 처리됨으로써 일차적 치료법의 보다 빠른 작용을 유발하고 그의 근육 손상 회복 작용을 강력하게 할 수 있다. 따라서 본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마 는 약물을 이용하는 화학 치료요법에서, 일차적으로 사용되는 주 치료제의 효과를 증진시키기 위해 사용되거나, 외과적 수술없이 근육 수복이 필요한 부위에 직접 처리될 수 있다.
또한 본 발명은 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 제조하기 위한 장치를 포함하는 근육 손상 치료용 키트를 제공한다.
상기 키트는 근육 수복을 통해 근육 손상을 치료하기 위한 용도일 수 있으며, 근육 손상 부위에 비침습적으로 직접 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 처리하기 위한 용도의 키트인 것이 바람직하다. 본 발명의 키트는 필요 시 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 발생시킬 수 있는 장치를 포함하고 있으므로, 치료가 필요한 부위에 적용하여 근육 손상 및 근육 손상 관련 질환을 용이하게 치료할 수 있도록 한다.
본 발명의 용어 "처리"는 발생된 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 병변 부위, 근육 손상 부위, 근육의 수복이 필요한 부위에 직접 조사하는 것을 말한다.
상기 키트는 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 제조하기 위한 장치를 포함하고, 이를 이용하기 위한 사용방법이 기재된 지침서를 함께 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 근육 세포에 처리하는 단계; 를 포함하는 근육 세포의 이동, 증식 또는 분화 촉진방법을 제공한다.
상기 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 처리는 in vitro, in vivo에서 모두 이루어질 수 있고, 개체 내 또는 단리된 세포에서 근육 세포의 이동, 증식 또는 분화를 효과적으로 촉진하여 최종적으로 근육 재생을 유도할 수 있다.
상기 근육 세포가 체외로 분리되어 in vitro에서 존재하는 세포의 경우 성장 배지 또는 분화 배지에서 배양될 수 있으며 보다 바람직하게는 성장 배지에서 배양될 수 있다. 상기 성장 배지는 근육세포가 성장하기 위한 조건을 갖는 당업계에 알려진 배지를 제한 없이 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실험예 및 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 저온 대기압 플라즈마의 제조
생물학적 연구에 적용하기 위한 균일한 플라즈마로써 저온 대기압 플라즈마를 제조하기 위하여 캐리어 가스로 질소(N2) 가스를 이용하였다. 질소가스를 캐리어가스로 하는 질소가스기반 저온 대기압 플라즈마 (Non Thermal atomosheric Pressure plasma; NTP) 의 제조를 위한 시스템을 도 1에 도식화 하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 본원 발명의 질소 가스 기반 저온 대기압 플라즈마 제조를 위한 시스템에는 광학 발광 분석기(optical emission spectroscopy), 오실로스코프, 고전압 프로브, AC 클램프 전류 측정기, 플라즈마 젯트 장치, UV 및 가스 센서, 캐리어 가스 공급 가스통이 연결되어 있다. 보다 구체적으로 본원 발명의 질소 기반 플라즈마에 이용되는 전극은 직경 8mm,　두께　200μm　이며, 500μm의 구멍이　19개 뚫려있는 원판형태의 구조로 이루어져 있으며, 세라믹 스페이서는 외경　11mm,　내경　6 mm,　두께　1 mm의 도넛 모양의 구조로 이루어져 있고 이는 두 전극 사이에서 절연층 역할을 한다. 플라즈마를 방전하기 위한 방전 개시 전압은 7-8kV이며 방전 개시 후 안정적으로 방전이 되는 전압은 3-4kV인 것을 확인하였다. 플라즈마 제조를 위한 적정 주파수는 15kHZ 이다. 플라즈마의 환부 적용을 위하여 적용부위의 플라즈마 방전 상태를 확인하고 환부의 외부로 플라즈마가 누수되는 것을 방지하기 위한 구성을 고안하였으며, 플라즈마 노즐에 차폐관을 연결시킨 플라즈마 장치를 이용하여 플라즈마 조사에 이용하였다. 이와 같은 플라즈마 장치의 구성을 도 2에 나타내었다.
발생된 질소 시반 저온 대기압 플라즈마에 대하여 광학발광 분석기(SC2100, K-MAC, 한국)를 이용하여 스펙트럼 분석을 수행하였으며, 다른 거리에서 발생되는 온도의 변화를 비접촉 IR-열측정기(Raytek, Santa Cruz, USA) 로 측정하였다. 가스 방출은 4L/분으로 하였다.
질소 기반 플라즈마의 스펙트럼 분석 결과를 도 3에 나타내었으며, 1 내지 5cm 거리에서 조사된 경우의 온도 변화를 도 4에 나타내었다. 도 3 에 나타낸 바와 같이 플라즈마 젯트에서 다양한 여기 종(excited species)가 확인되었으며, 도 4에 나타낸 바와 같이 1cm 거리에서 근접하게 조사하더라도 체온과 유사한 정도의 37℃ 를 초과하여 온도가 상승하지 않음을 확인하였다.
상기와 같이 제조된 질소기반 저온 대기압 플라즈마(이하, 질소기반 플라즈마)를 이하 실험에 사용하였다. 컨트롤러 유입부에 고압으로 유입되는 질소를 유압계를 이용하여 3 내지 6L/분이 되도록 조절 방출하여 제조된 질소 기반 저온 대기압 플라즈마를 환부 또는 실험 대상 부위에 처리하였다.
실험예 2. 근육 손상 동물 모델의 제조
제조된 질소기반 플라즈마가 근육 손상을 치료할 수 잇는지 여부를 확인하기 위하여 근육 손상 동물 모델을 제조하고 실험을 수행하였다. 모든 실험은 아주대학교 병원의 동물실험 윤리위원회의 규정에 따라 수행하였다. 동물들은 무균 환경에서 개별적으로 관리하였고 각각의 그룹은 처리 7 및 14일째에 랜덤하게 분석하였으며, 모든 동물들은 실험 기간 동안 장애없이 건강하게 유지되었다.
20마리의 8주령 Sprague Dawley (SD) 랫트 (코아택) 들을 틸레타민 (8.0 mg/kg; Virbac, Carros, France), 졸라제팜(zolazepam) (8.0 mg/kg; Virbac, Carros, France) 및 자일라진 하이드로클로라이드(xylazine hydrochloride) (1.5 mg/kg; Bayer, Ansan, Korea)를 이용하여 마취시켰다. 손상 부위 사이의 생물학적인 간섭을 피하기 위하여 손상 유도 부위는 서로 20mm 씩의 거리를 유지하도록 설정하였다. 모든 랫트의 피부 및 근육층 근육의 동일한 부위에서 손상 부위가 유도되도록 하기 위하여 랫트의 장골을 기준으로 간격 가로 및 세로 각 2cm씩의 정사각형 꼭지점을 설정하였다. 설정된 4개의 꼭지점에 0.8 cm 의 생물 시료 채취용 펀치를 사용하여 총 4곳의 근육을 떼어내어 근육의 손상을 유발하였다. 발생된 근육 손상 부위를 각각 동일한 위치의 4개의 군으로 분류하였으며, 이를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 형성된 4개의 손상 부위를 하기 표 1과 같이 총 4개의 처리 군으로 분류하였다.
군 처리
1군(C) 미처리 대조군
2군(G) 질소 가스 단독 처리군
3군(P30) 질소기반 플라즈마 30초 처리군
4군(P60) 질소기반 플라즈마 60초 처리군
2군에는 플라즈마 방전 없이 질소가스만 노즐을 통하여 방출히여 질소가스를 단독으로 30초 동안 처리하였다. 또한 도 2에 나타낸 플라즈마 조사 장치를 3군 및 4군 부위에 고정 시킨 후, 가스 압력을 10 으로 하여 실험예 1에서 제조된 질소기반 플라즈마를 각각 30초/1일 및 60초/1일로 하여, 7일 및 14일에 걸쳐 매일 처리하였다. 플라즈마 처리를 완료한 후 7일 또는 14일째에 각각 손상 부위와 주변 조직을 회수하였으며, 이를 이용하여 근육 손상 회복 여부를 확인하였다. 이하 30 초 처리군은 P30, 60초 처리군은 P60으로 한다.
실시예 1. 세포독성 여부 확인
치료목적에 사용하기 위하여 질소기반 플라즈마의 조사가 세포에서 독성을 유발하는지 여부를 확인하였다. 세포 독성 여부는 육안적 조직분석과 세포 생존 및 독성 분석을 통해 수행하였다. 육안적 조직 분석을 위하여 실험 종료 시점까지 지속적으로 모든 처리군의 조직상태를 관찰하여 염증 또는 이물 조직 발생여부를 확인하였다. 이와 같은 육안적 관찰 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 4개의 실험군 모두에서 육안으로 관찰되는 뚜렷한 염증 또는 이물 조직이 관찰되지 않았다.
또한 생체외의 분화 배지 및 성장 배지에서 근육 세포를 배양한 후 실험예 1의 질소기반 플라즈마를 처리하고 처리군과 비처리 대조군의 세포 상태를 Live/Dead 염색법을 이용하여 확인하였다. 분화 배지는 생체 외에서 증식된 근육 세포를 분화 가능한 상태로 유도하기 위하여 조성한 배지를 지칭함이며, 혈청(serum)의 첨가량을 조절하여 분화를 유도할 수 있도록 하였다. 증식 배지는 생체 외에서 근육 세포가 증식이 가능하도록 조성한 일반적인 세포 증식용 배지를 이용하였으며 보다 구체적으로 DMEM 배지에 10% 혈청을 첨가한 배지를 사용하였다. 세포 사멸 확인 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 질소기반 플라즈마를 조사한 근육 세포에서는 붉은 색으로 나타나는 사멸 세포가 관찰되지 않았으며, 모두 녹색의 형광을 띄는 살아있는 세포인 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 질소기반 플라즈마는 세포 독성을 유발하지 않는 안전한 물질임을 확인하였다.
실시예 2. 육안 관찰 및 조직염색을 통한 근육 손상 회복의 확인
질소기반 플라즈마 처리에 따른 근육 손상의 회복을 확인하기 위한 육안 관찰 및 조직 염색을 수행하였다.
먼저 질소기반 플라즈마 조사에 의해서 수복 재생된 조직을 육안적으로 관찰하기 위하여 질소기반 플라즈마 조사 7일 및 14일째에 각각 모든 처리군의 조직을 채취하여 사진촬영 후 이에 대한 이미지 분석을 시행하였다. 이미지는 디지털 카메라로 촬영하여 확인하였으며 Metamorph_NX image software (Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA) 를 이용하여 계산하였다. 20개의 손상 부위의 평균 지름은 8.56 ± 0.47 mm 였다. 랫트에서 근육 손상의 정도를 확인하기 위하여 제거된 조직을 염색하였고, 제거된 조직의 구조는 피부층을 갖는 근육을 포함하고 있음을 확인하였다. 질소기반 플라즈마의 처리가 미처리 대조군에 영향을 주지 않도록 하기 위하여, 플라즈마 처리 동안에는 수술천으로 미처리 부위를 보호하였다. 손상 부위와 플라즈마 노즐간의 거리는 0.4cm 를 유지하였으며 차폐막을 통해 손상된 부위와 플라즈마 조사 장치와의 공간을 막힌 상태로 유지하였다.
그 결과 P60으로 7일 동안 처리한 실험군의 수복된 조직상에 모세혈관이 신생된 것을 관찰하였으며, 14일 경과 후에는 질소기반 플라즈마를 처리한 모든 실험군에서 모세혈관의 신생이 이미지 상에서 육안적으로 확인되었다.
보다 구체적인 확인을 위하여 헤마토톡실린&에오신 (H&E) 염색법, Picro Sirius red (PSR) 염색법, Masson's trichrome(MT) 염색법을 이용하였다. H&E 염색법은 조직 내 모든 세포의 핵과 세포질을 염색하여 제거된 근육 조직의 재생 상태와 세포의 상태를 관찰하기 위해 사용하였고, PSR 염색법은 근육 조직을 주변 조직과 형태학적 구별하기 위한 목적으로 사용하였으며, MT 염색법은 주변 조직과 근육 조직의 발색차이를 보이며, 신생 근육의 관찰이 용이하게 하기 위하여 수행하였다. 근육 세포를 붉게 염색하는 MT 염색 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 질소기반 플라즈마를 처리한 P30 및 P60 처리군 모두에서 7일 처리 후에 근육이 소실된 부위가 수복되어 붉은색으로 염색된 것을 확인하였다. 붉은색으로 나타나는 부위는 근육 조직으로 손상되었던 근육 조직이 질소기반 플라즈마의 처리에 의하여 새로운 근육 조직이 생성된 것을 나타낸다. 질소기반 플라즈마를 14일 동안 처리한 실험군에서는 7일 처리와 비교하여 더욱 선명하고 넓은 범위의 근육 재생 부위가 확인되었다.
보다 객관적인 근육 조직 재생 정도를 검증하기 위하여, 염색된 조직을 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 4단계의 표준 점수 체계에 적용하여 점수화하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
Figure PCTKR2016008811-appb-T000001
도 9에 나타낸 바와 같이, 14일 처리 후의 P30 군에서는 0.85 ± 1.07, P60 군에서는 1.86 ± 1.21 점수에 해당하는 근육 조직이 재생되었으며, 미처리 대조군의 0.14 ± 0.38, 질소가스 단독 처리군 0.43 ± 0.78과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다 (P**<0.01, *** p≤0001).
이와 같은 결과를 통해, 질소기반 플라즈마의 처리가 손상 근육 부위에서 혈관의 신생 및 근육 조직의 재생을 촉진한다는 것을 알 수 있다.
실시예 3. 면역조직화학 분석을 통한 신생 근육 확인
신생 근육이 생성되면 세포와 조직에서 MyH-3 (myosin heavy chain-3)가 발현되는 것이 알려져 있으므로, MyH-3는 신생 근육 확인을 위한 마커가 될 수 있다. 따라서 대상 동물의 각 군에서 일정 조직을 확보하여 MyH-3 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 비교하였다. 플라즈마 처리 7일과 14일 째에 플라즈마를 60초간 처리한 P60 군에서 MyH-3의 발현을 확인하였으며, 이의 조직 발현 양상을 면역조직화학 염색을 통해 확인하였다.
면역조직화학 염색 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, P30 및 P60 처리군 모두에서 MyHC-3 항체가 정상 근육의 말단 부위에서 손상된 근육 부위, 즉 근육이 제거된 부위 방향으로 생성되어 갈색으로 발색되는 것을 확인하였다.
MyHC-3 발현에 대한 웨스턴 블랏 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11 에 나타낸 바와 같이, 7일 및 14일 동안 각각 30초(P30), 60초(P60) 간 질소기반 플라즈마를 처리한 실험군에서는 MyHC-3의 발현이 뚜렷하게 증가하는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해, 질소기반 플라즈마의 처리에 의하여 재생된 조직은 근육 조직이라는 것을 확인하였으며, 이를 통해 질소기반 플라즈마가 1 주 내지 2주 처리만으로도 빠른 신생 근육 생성을 유도함을 확인하였다.
실시예 4. 질소기반 플라즈마 처리에 따른 근육 조직 생성 및 세포 활성 유도
질소기반 플라즈마의 근육 세포 및 손산된 근육 조직에서의 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 각각의 그룹에 대하여 면역형광 염색 이미지를 얻고 이를 비교하였다. 이를 위하여 각 조직의 근육 세포의 활성을 H&E 염색법을 통해 확인하였다. 일반적으로 정상 근육은 근육 조직 내에서 세포가 근육 다발의 가장자리에 위치하는 반면 새롭게 형성된 근육 조직의 경우 이동된 세포의 근육 재생 작용에 의하여 근육 세포가 근육 다발의 중심부에 위치한다고 잘 알려져 있다. 따라서 질소기반 플라즈마의 처리에 의한 근육 세포들의 위치를 분석하였다. 또한 근육으로 유추되는 조직의 근육 여부를 객관적으로 관찰하는 목적에서 PSR (picro Sirius red) 과 MT 염색을 수행하였다. 정상 조직의 경우 PSR은 밝은 주황색으로 나타나고, MT 염색에서는 붉은 색으로 나타나며, 그 외 조직들은 진한 주황색과 푸른색으로 나타난다. 각각 염색법에 의한 염색 결과를 도 12 내지 14에 나타내었다.
도 12 내지 도 14에 나타낸 바와 같이, 7일과 14일 동안 질소기반 플라즈마를 60초 동안 처리한 P60 군에서 손상된 근육 조직 주변으로 다량의 세포가 밀집되어 있는 것이 확인되었다. 또한 소실된 근육조직과 경계를 이루는 정상 조직의 말단 부분에서 정상근육과 유사한 형태의 근육으로 유추되는 조직이 형성된 것을 확인하였으며, 반면 이 조직들의 세포는 정상 근육 세포와는 달리 중심부에 위치하고 있는 것이 관찰되었다 (도 12). 또한 질소기반 플라즈마 처리에 따라 신생근육으로 유추되는 조직은 타 주변 조직과 명확하게 PSR 염색에서 밝은 주황색으로 나타났으며, MT (Masson's trichrome) 염색에서는 붉은색으로 나타나 정상 근육 조직의 염색성과 유사성이 매우 높은 결과를 나타낸다는 것이 관찰되었다 (도 13 및 도 14). 도 14의 e, h에서 확인할 수 있는 바와 같이 P60 처리군의 14일째에는 손상된 근육 조직의 주변에서 신장된 형태의 뚜렷한 새롭게 형성된 근육섬유가 관찰되었다. 또한 도 14의 f, i에서 확인할 수 있는 바와 같이 손상된 근육 조직에서 소구경 근육 섬유(small-caliber myofibers)가 확인(별표)되었다. 도 14의 b, c, e에 나타낸 바와 같이 새롭게 생성된 근육 섬유상에서 중심에 위치한 근육핵(myo-nuclei) 이 관찰(화살표)되었으며, 이들은 a, d에서 확인되는 바와 같이 정상 근육섬유 상에 주변에 위치한 근육 핵과는 구별되었다.
이와 같은 결과를 통해 질소기반 플라즈마의 처리에 따라 소실된 근육 조직에서 관찰되는 조직 수복이 근육 조직의 재생에 의한 것이며, 이는 질소기반 플라즈마 처리에 따른 근육 세포의 활성화를 통해 이루어진다는 것을 알 수 있다.
실시예 5. 질소기반 플라즈마 처리에 따른 근육 세포의 활성상태 확인
일반적으로 근육 다발 가장자리에서 세포활성이 정지 상태인 근육 세포는 근육이 손상되었을 경우 증식 가능한 활성화 상태로 전환되어 손상된 근육 주변으로 이동한 후 증식과 분화를 진행하여 근육의 재생을 진행한다는 것이 알려져 있다. 따라서 질소기반 플라즈마의 처리에 따라 소실된 근육 주변으로 밀집되는 다량의 세포들의 근원과 세포의 활성 상태에 대한 관찰을 수행하였다.
H&E 염색법, PSR 염색법을 통해 관찰된 손상된 근육 주변의 군집세포의 근원과 상태를 확인하기 위하여 근육 내 정지상태와 활성화 상태의 위성세포에서 발현되는 Pax 7과 증식하는 세포에서 발현되는 Ki-67 항체를 사용하여 면역조직화학염색을 시행하였다.
질소기반 플라즈마를 7일 동안 각각 30초간 처리한 P30 실험군과 60초를 처리한 P60 실험군에서, 손상된 근육의 말단 및 근육이 재생된 부위에서의 Pax7과 Ki-67 항체 발현을 확인하였으며 이를 정량화하여 그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, Pax7과 Ki-67는 동시에 발현되었으며, 이를 통하여 손상된 근육과 신생 근육에서 군집된 세포는 근육의 위성세포로 현재 증식이 가능한 활성 상태인 것 확인하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 질소기반 플라즈마 처리된 군에서 총 세포의 수는 7일째에서 대조군의 1.2배 (P30), 및 1.4배 (P60)로 나타났다. 도 16의 a는 총 세포수, b는 Pax-7 발현된 세포, c는 Pax-7 및 Ki-67이 공동 발현된 세포 수, d는 공동발현에 대한 Pax-7의 비율을 나타낸 도이다. P30 및 P60 군에서 7일째에 Pax-7 양성 세포의 수는 대조군보다 1.8 및 3.1 배 높았다. 시간이 지나면서, 질소기반 플라즈마를 처리한 군에서 세포 계수는 뚜렷하게 낮아졌다. Ki-67 에 대한 양성염색 핵이 검출되었으며, 이는 7일째에 P 30 및 P60 처리군에서의 인접한 재생 근육섬유에서 증식 위성 세포 (satellite cells)로 나타났고, 14일째에는 거의 보이지 않았다. 면역염색의 정량적 분석은 Pax7 및 Ki-67 공동발현 위성세포가 질소기반 플라즈마 처리된 군인, P30 및 P60군에서 각각 대조군보다 2.0 및 3.6배가 높은 것을 나타내었다. 유사하게, 도 16의 d에서 나타낸 바와 같이 P30 및 P60 군에서 Pax 7 핵에 대한 Pax7+/Ki-67+은 7일째에 대조군과 비교하여 1.3 및 1.6배 높았다(P < 0.01 및 P < 0.001). 시간이 지남에 따라, P30 및 P60군에서의 핵 계수는 14일째에 뚜렷하게 감소하였다. 각 정량적 분석에서 대조군(c)과 질소가스 단독처리군(G) 사이에서는 뚜렷한 통계적 차이가 관찰되지 않았으나, P30 및 P60 처리군의 값은 총 세포수를 제외한 모든 정량적 분석에서 14일째에 뚜렷하게 감소하였다. 이러한 결과는 질소기반 플라즈마의 처리가 총 세포수, Pax7 발현 및 Pax7+/Ki-67+(증식 위성 세포) 공동발현을 증가시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 또한 위성 세포 마커로 잘 알려져 있는 Pax3과 관련하여 Pax3+/Ki67+ 이중 양성 세포의 수 역시 P30 및 P60 군에서 증가하였다.
실시예 6. 질소기반 플라즈마 처리에 따른 근육 세포의 이동 및 증식 양상 확인
실제로 근육 세포가 질소기반 플라즈마의 처리에 의하여 이동하고 증식하는 여부를 면밀하게 관찰하기 위하여, 근육 세포를 약 1.25 × 105 cells/cm2 의 밀도로 배양 플레이트에 분주하고 컨플루언스까지 성장시켰다. 세포 이동 분석 및 세포 증식 분석은 Chang, J. W. et al. 에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다. 정량적 분석을 위하여 각 플레이트 (n=6)의 세포들을 각 시점에서 디지털 카메라로 촬영하였으며 촬영된 이미지상의 상처는 자동적으로 인식되고 Metamorph® NX image software 에 의해 측정하였다. 크리스탈 바이올렛 염색의 용출액은 540nm 스펙트럼에서 측정하였으며, 그 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다. 인간 근육 세포의 세포 외 증식 및 분화를 위해서 성장 배지 (GM) 을 사용하였다.
도 17 에 나타낸 바와 같이, in vitro 72시간, 성장배지 조건 하 세포 이동 분석에서, 질소 기반 플라즈마 처리군의 상처 회복 부위는 61.31 ± 6.3으로, 대조군의 42.27 ± 4.13 와 비교하여 1.5배나 높은 것으로 나타났다. 증식 배양액 상에서 질소기반 플라즈마가 처리된 세포는 미처리군에 비하여 빈 공간이 더 많이 채워지는 것을 확인하였으며 이를 통해 상처의 회복이 더 많이 진행되었음을 확인하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 질소기반 플라즈마의 세포 증식 효과를 확인하기 위하여, 초기 분주된 세포의 수를 크리스탈 바이올렛 염색 후의 세포수와 비교하였으며, 그 결과 질소기반 플라즈마 처리군의 세포수가 2.17 ± 0.01 로 대조군의 1.79 ± 0.02 보다 뚜렷하게 높은 것을 확인하였다.
또한 질소기반 플라즈마 처리가 근육 세포의 증식을 유발하는지를 확인하기 위한 BrdU 세포 증식 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이 질소 기반 플라즈마의 처리가 근육 세포의 증식을 촉진한다는 것을 확인하였다. 이러한 in vivo 및 in vitro 결과는 질소기반 플라즈마의 처리가 근육 세포의 증식 및 이동을 촉진한다는 것을 나타낸다.
실시예 7. 질소기반 플라즈마 처리에 따른 근육 세포의 분화 촉진
질소기반 플라즈마가 손상된 근육 조직의 경계로 근육 세포를 이동시키는 것을 확인하였다. 이에 따라 질소기반 플라즈마의 처리가 근육 세포의 이동 및 증식 촉진에 이어 세포의 분화까지 유도할 수 있는지 여부를 근육 위성세포에서 발현되는 Pax 7, 근육세포 분화 중기에 발현하는 MyoD, 분화말기에 발현하는 Myogenin (Myo G) 항체를 이용하여 성장 배지 및 분화 배지에서 확인하였다. 보다 구체적으로 일차 정상 인간 골격근 근육모 세포를 Lonza 에서 구입하였으며 이를 증식 및 분화하기 위해 배양하였다. Clonetics Basal Medium 및 Bullet Kit medium 의 비분화된 세포가 2% 말혈청, 2 mmol/L 글루타민 및 50 U/mL 스트렙토마이신 및 페니실린이 보충된 DMEM 배지로의 배지 전환에 의해 분화되었다. 세포 분화 능력은 myogenic 분화마커의 발현에 의하여 평가하였다. 질소기반 플라즈마 처리와 근육 세포 분화와의 관계를 시험하기 위하여, 근육 세포 분화의 주요 마커로 간주되는 Pax7/MyoD 및 MyoD/MyoG 의 공동발현을 관찰하였으며 웨스턴 블랏 및 면역조직화학 염색에 따른 결과를 도 20 및 도 21에 나타내었다.
도 20 및 도 21에 나타낸 바와 같이, 질소기반 플라즈마를 처리한 P60 군의 14일 후의 손상된 조직과 신생 근육의 경계 부분에서 Pax7과 Myo D가 노란색으로 동시에 발현되는 것이 관찰되었다. 또한 동일한 시기에 P60 실험군의 손상된 조직과 신생 근육의 경계 부분에서 후기 근육 조직 분화의 마커인 Myo D 와 Myo G 가 노란색으로 동시에 발현되는 것을 또한 확인하였다. 이러한 결과에 따라 질소기반 플라즈마의 처리가 손상된 근육 부위에서 근육 세포 이동 및 증식뿐만 아니라 분화를 촉진할 수 있음을 확인하였다.
세포 분화에 있어서 질소기반 플라즈마의 직접적인 역할을 확인하기 위하여, 근육 생성에 관여하는 것으로 알려진 mRNA 및 단백질의 발현 및 세포 표현형을 웨스턴 블랏 및 MHC 염색을 통해 관찰하였다. 웨스턴 블랏에 사용된 항체는 다음과 같다: MHC(myosin heavy chain) (R&D system, Minneapolis, USA), 미오게닌(myogenin) (Abcam, Cambridge, UK), 크레아틴 키나아제 M (Santa Cruz, California, USA), MET, p-p38, p38, p-AKT, AKT, 및 α-tubulin (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). PCR 조건은 다음과 같다: 94 ℃ 에서 3분간 변성, 94 ℃, 60.7 ℃, 및 72 ℃에서 30초, 35 사이클로 증폭, 72 ℃에서 5분간 최종 신장. 인간 미오제닌 프라이머 서열로는 다음과 같은 서열을 사용하였다: F, 5-AGC GCC CCC TCG TGT ATG-3; R, 5-TGT CCC CGG CAA CTT CAG C-3. 결과를 도 22 및 도 23에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 근육아세포를 DM에서 배양하고 질소기반 플라즈마를 처리 한 경우 세포들은 신장되고 다핵성 튜브를 형성하기 위하여 주변의 세포들과 융합되었으며, 미오게닌(myogenin), 미오신 중쇄(MHC), c-MET(HGFR), 크레아틴 키나아제 M 및 p38 은 질소 기반 플라즈마 처리군에서 높았고, 특히 근육 세포의 분화가 개시되었을 때 뚜렷하게 높았다. 이러한 결과를 토대로 질소기반 플라즈마가 유도하는 근육 분화의 매커니즘을 시험하였다. 미오신 중쇄 및 미오게닌 발현은 질소기반 플라즈마 처리된 세포에서 증가한 반면, MET 의 발현은 분화 배지 조건에서 변화하지 않았다. 밴드의 강도를 정량화 하였으며 이를 그래프로 나타낸 값을 함께 도시하였다. 웨스턴 블랏 결과 분화 배양액 상에 질소기반 플라즈마가 처리된 세포에서 근육 위성세포 분화 마커인 Myo D와 Myogenin의 발현이 비처리군에 비하여 높게 발현 된 것을 확인하였다
면역-형광 현미경 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, MHC 염색에 의해서 질소기반 플라즈마의 처리 시 MHC 발현과 함께 근육튜브의 형성이 증가되는 것을 확인하였다. 또한 미오신 중쇄의 세포 내 발현 역시 질소기반 플라즈마 처리군에서 높게 나타나 세포끼리 융합이 이루어진 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 질소기반 플라즈마의 처리가 근육 세포의 분화를 촉진한다는 것을 나타낸다.
상기와 같은 결과는 질소기반 플라즈마가 비-침습 및 비-접촉 생물학적 자극에 의해 근육의 재생을 촉진하고, 근육 세포의 in vivo 및 in vitro 상에서의 이동 및 증식을 유도하여 근섬유을 새롭게 형성하여 근육의 손상을 효과적으로 회복시킬 수 있음을 나타낸다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 외과적 수술 없이, 또는 외과적 수술 후 처리과정에서 근육 세포의 활성화, 근육 세포의 손상부위로의 이동, 근육 세포의 증식 및 근육 세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으므로, 근육 손상 및 근육 손상 관련 질환의 신규한 치료제 및 치료방법으로 유용하게 사용될 수 있기 때문에 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (11)

  1. 캐리어 가스로 질소 가스를 충진하는 단계;
    충진된 질소 가스에 5 내지 20kHZ 주파수 및 5 내지 10kV의 방전 개시 전압을 가하여 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 생성하는 단계; 를 포함하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생은 근육 세포의 활성화, 근육 세포의 손상부위로의 이동, 근육 세포의 증식 및 근육 세포의 분화로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의하여 이루어지는 것인, 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 손상 근육의 치료는 근육 수복인, 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 근육 손상 부위에 처리하는 단계; 를 포함하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 2 내지 10L/분으로 방출되는 것을 특징으로 하는, 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 0.3 내지 5cm 거리에서 근육 손상 부위에 처리되는 것을 특징으로 하는, 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 질소기반 저온 대기압 플라즈마는 1일 1회 10초 내지 120초 동안 처리되는 것을 특징으로 하는, 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조되는 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 포함하는 근육 손상 관련 질환 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 질소기반 저온 대기압 플라즈마를 in vitro 에서 근육 세포에 처리하는 단계; 를 포함하는 근육 세포의 이동, 증식 또는 분화 촉진방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 근육세포는 성장 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 근육 세포의 이동, 증식 또는 분화 촉진방법.
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