KR101219624B1

KR101219624B1 - 조직 손상의 치료 또는 조직 재생 촉진용 약학조성물

Info

Publication number: KR101219624B1
Application number: KR1020100118582A
Authority: KR
Inventors: 정규식; 박진규; 기미란; 유상영; 이은미; 김아영; 한선영
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-26
Filing date: 2010-11-26
Publication date: 2013-01-08
Also published as: KR20120057032A

Abstract

본 발명은 조직 손상의 치료 또는 조직 재생 촉진용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 약학조성물은 신뢰성을 갖추고 안정성 측면에서뿐 아니라 손상 근육의 재생 시 과도한 섬유화의 억제 또는 손상 근섬유의 융합 또는 새로운 근섬유로의 분화를 조절하는 줄기 세포의 미세환경(Niche)을 형성케 하여, 우수한 조직 손상의 치료 또는 조직 재생 촉진 효과 있어 노화 및 근육 질환 치료에 크게 기여를 할 수 있다.

Description

조직 손상의 치료 또는 조직 재생 촉진용 약학조성물{Treating tissue damage or enhancing tissue repair, pharmaceutical composition}

본 발명은 조직 손상의 치료 또는 조직 재생 촉진용 약학조성물에 관한 것이다.

근육병은 유엔이 정한 “5대 중증 희귀 난치성 질환” 중 하나로 그중 Duchenne 근이영양증이 대표적으로 알려져 있으나, 현재까지 뚜렷한 치료법은 없는 상태이다. 이런 선천적 근육 질환을 포함한 노인성 및 물리 화학적 근육의 손상은 우리 신체의 상당부분을 차지하는 근육인 만큼 그 영향력은 실로 막대하다.

또한, 우리나라는 2015년께는 고령사회, 2025년에는 초고령 사회에 이를 것으로 전망되어 노인성 근육 질환이 향후 크게 증가할 것으로 예상된다. 이런 근육 질환을 치료하기 위해 최근 줄기세포를 이용한 치료법 연구가 활발히 진행중이다. 주로 근육위성세포(satellite cell)를 손상 근육에 주입하는 방법의 치료법 위주로 연구가 되고 있는 실정이다. 하지만 근육위성세포는 환자의 몸에서 채취가 쉽지 않을 뿐만 아니라 임상 적용시 충분한 양의 세포를 얻기도 힘들어 여러 난관에 부딪히고 있는 실정이다.

최근 이를 극복하기 위해 상대적으로 얻기 쉽고 수율이 좋은 지방줄기세포를 이용한 여러 질환의 치료법들이 모색중이고 근육질환에서도 지방줄기세포를 이용한 여러 치료법들이 개발중에 있다. 지방줄기세포는 근육조직과 동일한 중간엽 유래 줄기세포로 손상 근육에서의 근육 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 오고 있다(Journal of Cell Science.2006;119:2945-2952,Urology.2010;75:718-723).

하지만 지방줄기세포가 손상 근육 조직에서 형성되는 줄기세포 미세환경(niche)에 따라 목적세포 이외의 다른 세포로 분화할 가능성이 높아 줄기세포 미세환경(niche) 형성 요건이 중요한 관건이 되고 있다. 한 예로 지방줄기세포의 경우 골격근, 골조직, 연골조직, 평활근, 혈관내피세포 등의 중간엽 유래의 모든 조직으로 분화가 가능하다 (Stem Cells.2007;25:818-827).

한편, 안지오텐신 Ⅱ(Angiotensin Ⅱ)는 강력한 혈관 수축을 유발하는 인자로, rennin-angiotensin Ⅱ system을 통해 최근 여러 장기에서 섬유화 같은 만성 질환을 가진 환자의 혈장에서 높게 측정되는 것으로 보고되고 있고, renin-angiotensin Ⅱ system이 만성간질환의 기전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근 로살탄(losartan)은 대표적인 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker)로서 안지오텐신 Ⅱ가 작용하는 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체를 선택적으로 봉쇄시킴으로써 만성 질환에서 보호 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Nature Medicine. 2007;13(2):204-210). 또한 지방줄기세포가 손상된 근육 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기도 하다(Stem Cells. 2009;27:949-960, Journal of Cell Science. 2006;119:2945-2952).

이에 본 발명자들은 근육 열상 마우스 모델을 이용하여 이들의 재생 기전에서 지방줄기세포와 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker)의 병용투여의 효과 및 이들의 재생 기전을 규명하고, 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 손상 근육의 재생 시 과도한 섬유화의 억제 또는 손상 근섬유의 융합 또는 새로운 근섬유로의 분화를 조절하는 줄기 세포의 미세환경(Niche)을 형성하여 근육질환을 치료를 위한 약학조성물 및 상기 약학조성물을 포함하는 패키지를 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인명을 다루는 대상의 특별한 특수성으로 인해 제조의 어려움과 재현성을 극복하기 위한 것으로, 신뢰성을 갖추고 안정성 측면에서뿐 아니라 우수한 조직 손상의 치료 또는 조직 재생 촉진과 있는 근육질환 치료용 약학조성물 및 상기 약학조성물을 포함하는 패키지를 제공하고자 한다.

본 발명의 약학조성물은 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker) 및 지방조직 유래 줄기세포를 유효성분을 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제는 로살탄(Losartan), 발살탄(Valsartan), 텔미살탄(Telmisartan), 일베살탄(Irbesartan) 및 올메살탄( Olmesartan) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 지방조직 유래 줄기세포는 지방조직에서 얻어지는 기저-혈액 세포 분획(Stromal Vascular Fraction, SVF) 또는 계대배양하여 수득되는 것으로, 보다 상세하게는 상기 지방조직 유래 줄기세포는 3회 이상 계대배양하여 수득되며, 보다 바람직하게는 3 내지 7회 계대배양하여 수득되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 약학조성물을 포함하는 패키지는 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker) 및 지방조직 유래 줄기세포를 동시 또는 순차 투여하여 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker) 및 지방조직 유래 줄기세포를 유효성분으로 하는 조직 손상의 치료 또는 조직 재생 촉진용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제는 로살탄(Losartan), 발살탄(Valsartan), 텔미살탄(Telmisartan), 일베살탄(Irbesartan) 및 올메살탄( Olmesartan) 중에서 선택되는 1종 이상인 것으로, 바람직하게는 로살탄을 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기 지방조직 유래 줄기세포는 지방조직에서 얻어지는 기저-혈액 세포 분획(Stromal Vascular Fraction, SVF) 또는 계대배양하여 수득되는 것으로, 상기 지방조직 유래 줄기세포는 3회 이상 계대배양하여 수득되며, 보다 바람직하게는 3 내지 7회 계대배양하여 수득되는 지방조직 유래 줄기세포를 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기 조직은 근육인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약학조성물은 손상 근육의 재생 시 과도한 섬유화의 억제 또는 손상 근섬유의 융합 또는 새로운 근섬유로의 분화를 조절하는 줄기 세포의 미세환경(Niche)을 형성하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 C57BL/6 WT 마우스를 이용하여 근육 열상모델을 유도하고 여기에 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포를 병용투여 시 손상 근육의 재생과 이들 주입된 지방조직 유래 줄기세포에 로살탄이 미치는 영향을 크레아틴 키나아제(creatine kinase, CK) 수치, 육안적 변화, 장딴지 근의 무게변화를 통해 확인한 결과, 근육 손상 지표인 크레아틴 키나아제 수치가 무처리 대조군과 비교해서 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군에서 가장 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 도 1을 참조한다.

또한, 육안적 변화 관찰에서는 근육 열상 유도에 의해 섬유소성 조직의 형성과 심한 위축 소견을 보이는 대조군의 장딴지 근에 비해서 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군에서 거의 정상에 가까운 근육 재생 수준을 확인할 수 있었으며, 장딴지 근의 무게 측정 결과에서는 근육 열상을 유도한 대조군의 장딴지 근에 비해 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군에서는 유의성 있게 그 무게가 증가하여 정상 장딴지근의 무게와 거의 유사한 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 도 2 및 도 3을 참조한다.

로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군에 대한 H&E 조직염색과 콜라겐 섬유 염색을 위한 Masson's trichrome 염색을 통한 병리조직학적 결과, 근육 열상을 유도한 대조군의 장딴지 근에서는 섬유화가 유발되고 골격근 섬유의 파괴 및 괴사 소견을 동반한 소견이 관찰되었으나 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군에서는 섬유화의 유의성 있는 감소와 재생되는 골격근 섬유의 현저한 증가가 관찰되었다. 도 4 및 도 5를 참조한다.

면역형광염색법을 통한 단백질의 발현 관찰한 결과, 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군은 전 그룹에서 근육 분화 및 재생 마커인 마이오제닌(myogenin), myoD, pax7의 발현이 가장 유의성 있게 높게 나타나, 로살탄 투여에 의해 지방조직 유래 줄기세포를 이용한 근육 손상에서 재생 및 근 섬유로의 분화가 촉진되는 것을 확인할 수 있었다. 도 6 내지 도 8을 참조한다.

면역블로팅을 통한 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군의 단백질의 발현을 확인한 결과, 상기 면역형광염색법에서와 유사하게 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군은 전 그룹에서 근육 분화 및 재생 마커인 마이오제닌(myogenin), myoD의 발현이 가장 유의성 있게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 도 9 내지 도 11을 참조한다.

RT-PCR에 의한 mRNA 발현의 분석 결과(도12-도16)에서도, 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군에서 마이오제닌(myogenin), myoD, pax7, myf5의 근육 재생 및 분화 관련 마커들이 유의성 있게 가장 높게 나타나는 것이 재차 확인되어 로살탄의 추가 공급은 지방조직 유래 줄기세포를 이용한 손상 근육에서 근육 재생을 촉진시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 도 12 내지 도 15를 참조한다.

EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포의 손상 근육에서의 동정에서는, 손상된 근섬유 및 재생되는 근섬유 사이로 EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포가 유주를 하여 손상 근섬유와 융합되거나 새로운 근섬유로 분화해 나가는 것을 형광현미경 촬영을 통해 확인하였다. 이는 지방조직 유래 줄기세포가 손상 근육에서 손상 부위 줄기세포 미세환경(niche)에 의해 손상 근섬유에 직접 융합되거나 혹은 새로운 근섬유로 분화되는 것을 확인할 수 있었고, 병용 투여되는 로살탄이 상기 과정들을 촉진케 하는 줄기세포 미세환경(niche) 형성에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다. 도 16을 참조한다.

상기 동물실험에서의 결과를 재검정하기 위한 지방조직 유래 줄기세포와 근육위성세포(satellite cell) 공생배양(co-culture)에서 로살탄의 효과를 관찰한 결과, 로살탄을 처리한 세포들에서는 근육대롱(myotube) 형성의 촉진, myoD 및 마이오제닌(myogenin)의 발현이 현저하게 증가하는 것이 관찰되었고, 이는 동물실험 결과와 동일하며 로살탄의 병용 투여가 지방조직 유래 줄기세포가 목적세포로의 분화를 촉진하는데 중요한 작용을 하는 것을 확인할 수 있었다. 도 17을 참조한다.

본 발명의 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker) 및 지방조직 유래 줄기세포를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하여 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

또한, 바람직하게 본 발명의 약제학적 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약제학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용 약, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명은 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker) 및 지방조직 유래 줄기세포를 동시 또는 순차 투여하는 조직 손상의 치료 또는 조직 재생 촉진용 패키지를 제공한다.

본 발명의 상기 패키지는 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker) 또는 지방조직 유래 줄기세포가 동시에 투여 가능하도록 혼합되어 포장되어 있거나, 순차적으로 투여 가능하도록 개별 포장될 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 신뢰성을 갖추고 안정성 측면에서뿐 아니라 손상 근육의 재생 시 과도한 섬유화의 억제 또는 손상 근섬유의 융합 또는 새로운 근섬유로의 분화를 조절하는 줄기 세포의 미세환경(Niche)을 형성케 하여, 우수한 조직 손상의 치료 또는 조직 재생 촉진 효과 있어 근육 질환 치료에 크게 기여를 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 혈청 수준의 크레아틴 키나아제(creatine kinase, CK) 수치를 분석한 결과이고(모든 데이터는 mean±S.D. 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 로살탄 처리군, C: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, D: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 2는 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 손상된 정도를 육안으로 관찰한 결과이며,
(A: 대조군-오른쪽, B: 대조군-왼쪽, C: 로살탄 처리군, D: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, E: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 3은 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 무게를 측정한 결과이고(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군-오른쪽, B: 대조군-왼쪽, C: 로살탄 처리군, D: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, E: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 4는 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 섬유화의 병리조직학적 결과를 보여주는 것이며(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 로살탄 처리군, C: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, D: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 5는 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 재생되는 근섬유의 병리조직학적 결과를 보여주는 것이고(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 로살탄 처리군, C: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, D: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 6은 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 마이오제닌(myogenin) 발현의 면역형광염색 결과를 보여주는 것이며(배율은 ×200이다),
(A: 대조군, B: 로살탄 처리군, C: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, D: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 7은 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 myoD 발현의 면역형광염색 결과를 보여주는 것이고(배율은 ×200이다),
(A: 대조군, B: 로살탄 처리군, C: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, D: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 8은 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 pax7 발현의 면역형광염색 결과를 보여주는 것이며(배율은 ×200이다),
(A: 대조군, B: 로살탄 처리군, C: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, D: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 9는 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 마이오제닌(myogenin) 발현의 면역블로팅(immunoblotting) 결과를 보여주는 것이고(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 로살탄 처리군, C: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, D: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 10은 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 myoD 발현의 면역블로팅(immunoblotting) 결과를 보여주는 것이며(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 로살탄 처리군, C: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, D: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 11은 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근의 Wnt3a, b-catenin, p-Smad3 발현의 면역블로팅(immunoblotting) 결과를 보여주는 것이고(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 대조군-왼쪽, C: 로살탄 처리군, D: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, E: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 12는 RT-PCR을 통한 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근에서의 마이오제닌(myogenin) 발현을 확인한 결과이며(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 대조군-왼쪽, C: 로살탄 처리군, D: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, E: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 13은 RT-PCR을 통한 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근에서의 myoD 발현을 확인한 결과이고(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 대조군-왼쪽, C: 로살탄 처리군, D: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, E: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 14는 RT-PCR을 통한 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근에서의 pax7 발현을 확인한 결과이며(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 대조군-왼쪽, C: 로살탄 처리군, D: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, E: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 15는 RT-PCR을 통한 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 장딴지근에서의 myf15, desmin 발현을 확인한 결과이고(모든 데이터는 mean±S.D로 표시하였음(*P < 0.05, **P < 0.01)),
(A: 대조군, B: 대조군-왼쪽, C: 로살탄 처리군, D: 지방조직 유래 줄기세포 처리군, E: 로살탄＋지방조직 유래 줄기세포 처리군)
도 16은 장딴지근에서 본 발명의 약학 조성물 처리에 따른 지방조직 유래 줄기세포의 근육으로의 분화를 형광현미경으로 촬영한 사진이며(배율은 ×200, ×400이다),
도 17은 지방조직 유래 줄기세포와 근육위성세포의 공생배양에서 TGF-b 처리, 안지오테신 II 처리 및 로살탄 처리 시 myotube 형성(A)과 마이오제닌(myogenin) 및 myoD 발현(B)에 대한 결과를 보여주는 것이고(배율은 ×200 이다.)
도 18은 지방조직 유래 줄기세포와 근육위성세포의 공생배양에서 EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포가 Troponin I를 발현하면서 myotube로 형성되는 단계를 형광현미경으로 촬영한 사진이다(배율은 ×1000 이다).

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[ 실시예 ]

8주령, 수컷, Wild type C57BL/6 마우스가 실험에 사용되었고 각 대조군, 지방조직 유래 줄기세포 투여군, 로살탄 투여군, 지방조직 유래 줄기세포와 로살탄 병용투여군 4그룹으로 10 마리씩 구분하였다.

실험 전그룹의 마우스는 왼쪽 장딴지근 열상을 형성하고 지방조직 유래 줄기세포투여군과 병용 투여군 지방조직 유래 줄기세포를 5×10⁵개의 세포를 근육 손상부위에 주입하였고, 대조군과 로살탄 투여군에는 동량의 PBS를 주입하였다. 2주째 부검을 실시하여 근육 재생 정도를 육안 관찰을 실시한 후, 손상 근육의 재생정도를 조직병리학적으로 평가하기 위해 장딴지근을 채취하고 혈청을 채취하였다.

상기 Wild type C57BL/6 마우스는 근육 재생에서 지방조직 유래 줄기세포를 이용한 치료시, 안지오텐신 II 1형 수용체에 대한 길항제(Losartan)를 병용 사용시 근육재생과 이들의 연관성을 관찰하기 위해 선택되었다.

상기 본 실험에 사용된 Wild type C57BL/6 마우스는 입수 후 동물실에서 약 7일간 검역 및 순화를 시켰으며, 순화기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 선발하여 시험에 사용하였다. Wild type C57BL/6 마우스는 모두 8주령으로 그룹 간 주령의 차이는 가급적 배제하였다.

상기 시험물질인 Losartan potassium은 흰색의 분말로 Merck & Co(USA)로부터 공급받아 시험에 사용하였다. 시험물질은 카본 필터를 통해 정화된 상수도수에 0.6g/L의 농도로 희석한 후, 식수(음수)로 전 시험기간 동안 자유공급하였다. 시약은 aceton(Katayama, Osaka, Japan), 3-aminopropyltriethoxysilane(Sigma, Texas, woodland, USA), 40% formaldehyde (Duksan, 경기도, 한국), NaH₂PO₄H₂O(Daejung, 인천, 한국), Na₂HPO₄(Duksan, 경기도, 한국), hematoxylin(HARLECO, Phennsylvenia, USA), acetic acid(Daejung, 인천, 한국), eosin Y(JUNSEI, Tokyo, Japan), ethanol(MERCK, Darmstadt, Germany), glacial acetic acid(MERCK, Darmstadt, Germany), aniline(국산화학, 동경, Japan), toluene(Duksan, 경기도, 한국), paraffin(Leica Histowax, Nussloch Gmbh, German)등을 사용하였다.

상기 지방조직 유래 줄기세포는 C57BL/6 마우스의 복강지방에서 추출하여 PBS로 세척 후 70% 에탄올로 10초간 소독하고 PBS가 담긴 dish에 다시 옮겨 불필요한 조직을 제거하였다. 지방 조직을 세밀하게 자른 후 콜라게네이즈 I(collagenase I)를 처리하여 37℃에서 30분간 효소 반응 시켜 조직이 분해되도록 방치하였다. 이후 FBS를 추가하여 효소반응을 중단시키고 세포 부유액을 새 튜브에 옮겨 원심분리과정을 거쳐 oil층을 제거하고 침전된 세포를 다시 부유시킨 후 교반 시켰다. 70 ㎛ nylon mesh filter로 거른 후 여과된 세포를 모아 다시 원심 분리한 후 상층액을 제거하고 PBS로 2-3번 세척한 후 세포를 배양하였다. 증식배지를 사용하여 배양하였으며 passage 3-7의 지방조직 유래 줄기세포를 본 실험에 사용하였다. 근육열상 직후 개체 당 5×10⁵개의 세포를 주입하였다.

근육열상모델은 Wild type C57BL/6 마우스의 왼쪽 장딴지 근(gastrocnemius muscle)을 노출시켜 직경 4 mm의 biopsy punch를 이용하여 일정 크기의 근육을 절제해내고 지혈 후 피부를 봉합하였다. 2주 후 전 개체에 대한 부검을 실시하여 장딴지 근을 채취하였다.

본 시험에 사용된 마우스의 경우에는 온도 22± 3℃, 상대습도 50± 10%, 조명시간 12시간(08:00 점등 내지 20:00 소등)으로 설정된 자동 온습도 조절 장치가 설치된 경북대학교 수의과대학 병리학교실의 동물실에서 순화 및 사육되었다. 사육 환경은 전 시험기간 동안 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 인정되지 않았다.

시험기간 중 동물실의 온, 습도는 자동온습도 조절장치에 의하여 조절되었으며, 환경조건은 정기적(3개월 1회)으로 측정되었다. 환경측정의 결과, 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 인정되지 않았다.

전 시험기간 동안 폴리카보네이트제 사육상자(240W×390L×175H mm)에 5마리 이하씩 수용하였다. 개체식별은 유성 매직펜을 이용한 미부표식법과 사육상자별 개체식별카드표시법을 이용하였다.

[ 시험예 1]

(1) 혈청 지표에 미치는 영향

상기 실시예의 방법으로 처리된 각 대조군, 지방조직 유래 줄기세포 투여군, 로살탄 투여군, 지방조직 유래 줄기세포와 로살탄 병용투여군의 마우스 왼쪽 장딴지근에 열상을 유도한 후, 근육 손상의 혈청 지표로 이용되는 크레아틴 키나아제(creatine kinase, CK) 수치를 관찰함으로써 시험 물질의 효능을 검정하였다. 혈액 시료를 원심분리(3000 g, 15분)를 통해서 혈청을 분리한 후 clinical chemistry 분석기(Konelab 20i)를 이용하여 측정하였다.

그 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 전 그룹에서 근육 열상 유도에 의해 크레아틴 키나아제 수치가 증가하였음을 관찰하였고, 대조군에 비해 지방조직 유래 줄기세포투여군, 로살탄 투여군, 지방조직 유래 줄기세포와 로살탄 병용투여군에서 크레아틴 키나아제 수치 레벨이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 특히, 지방조직 유래 줄기세포와 로살탄 병용투여군에서 가장 유의성있게 감소하는 결과를 확인할 수 있었다.

2) 육안적 변화 관찰

실험동물의 손상된 장딴지근의 육안적 관찰을 실시하여 각 처치 그룹에서의 차이를 관찰하였다.

전 실험동물의 왼쪽 장딴지근에 열상을 형성한 후 2주 뒤 피부 조직을 절개해서 근육을 노출시킨 후 육안적 변화를 관찰한 결과, 도 2에서도 확인할 수 있듯이 손상을 주지 않은 정상 오른쪽 장딴지 근에 비해 대조군의 왼쪽 장딴지 근에는 근육 열상에 의한 손상 부위가 확연히 관찰되고 그로 인한 근육 위축 소견까지 관찰되었다.

반면에 각 로살탄 투여 군과 지방조직 유래 줄기세포투여 군에서는 근 열상 부위 면적이 줄어들고 섬유소성 조직의 감소가 관찰되었다. 하지만 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포를 병용투여한 군에서는 근육 열상 부위가 거의 관찰되지 않을 뿐만 아니라 섬유소성 조직의 형성 또한 거의 형성되지 않음을 확인할 수 있었다.

3) 장딴지근의 무게 측정

각 그룹의 실험동물의 장딴지근을 분리한 후 그 무게를 측정하였다.

그 결과 도 3에서도 확인할 수 있듯이, 근육 열상 후 재생이 억제될수록 근육 조직의 실질은 적고 그 부분을 섬유소성 조직이 채워나감에 따라 열상을 형성한 장딴지 근은 그렇지 않은 오른쪽 정상 장딴지 근에 비해 그 무게가 유의성 있게 낮음을 알 수 있었다. 하지만 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포를 병용 투여한 군에서는 그 무게가 손상 대조군에 비해 유의성 있게 증가하는 것을 관찰할 수 있었고 또한, 이는 정상 오른쪽 장딴지근과 거의 유사한 수준인 것을 알 수 있었다. 로살탄을 투여한 군과 지방조직 유래 줄기세포 투여군에서는 유의성 있는 감소는 관찰되지 않았다.

4) 조직병리학적 관찰

근육 손상시 이들을 복구하기위한 지방조직 유래 줄기세포를 이용한 치료시 안지오텐신 II 1형 수용체의 길항제인 로살탄의 효과를 병리조직학적으로 검사하기 위해서 부검 시 채취된 근육 조직을 10%중성 포르말린을 이용하여 고정한 후 일반적인 조직 처리과정을 통해 파라핀 포매 후 4 ㎛의 두께로 조직절편을 한 후 건조시켜 Hematoxylin-eosin 염색 및 Masson's trichrome 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다. Hematoxylin-eosin 염색에서는 각 그룹에서 재생되는 근섬유의 수를 측정하였고 Masson's trichrome 염색에서는 각 그룹에서 섬유화 면적을 측정하였다.

H&E 조직염색과 콜라겐 섬유 염색을 위한 Masson's trichrome 염색을 통한 병리조직학적 결과에서는, 도 4 및 도 5에서도 확인할 수 있듯이 근육 열상을 유도한 대조군의 장딴지근에서는 섬유화가 유발되고 골격근 섬유의 파괴 및 괴사 소견을 동반한 소견이 관찰되었으나 로살탄 투여군 및 지방조직 유래 줄기세포 투여군에서는 섬유화 병변이 감소되고 재생되는 골격근 섬유들이 다소 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포병용 투여군에서는 섬유화의 유의성 있는 감소와 재생되는 골격근 섬유의 현저한 증가가 관찰되었다.

5) 면역형광염색법을 통한 면역조직화학적 관찰

포르말린에 고정한 후 제작된 파라핀 포매조직을 4 ㎛ 두께로 박절하여 탈파라핀시킨 후 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 3% H₂O₂에 30분간 처리하고 0.01M phosphate-buffered saline(PBS) 완충용액으로 세척한 다음, 조직의 항원발현을 증가시키기 위하여 0.01M citrate 완충용액으로 전자파로 고열처리하였다.

비특이적 반응을 억제하기 위하여 20 ㎍/㎖ 프로테이나제 K(Proteinase K)로 37℃에서 10분간 처리한 후 PBS 완충용액으로 세척 후 blocking을 1시간 반응시킨 후 일차항체인 Pax7(1:100, Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, USA), 마이오제닌(myogenin)(1:100, Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA), MyoD(1:100, Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA)을 각각 4℃에 Overnight 시킨 후 PBS 완충용액으로 5분간 3회 세척하고 TRITC-conjugated 이차항체를 60분간 반응시켰다. 완충용액으로 세척한 후 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dihydrochloride) (Molecular Probes, Leiden, the Netherlands)으로 10분간 반응시킨 후 형광 현미경을 통해 각 항체에 대한 양성 반응 정도를 관찰하였다.

마이오제닌(myogenin) 항체를 이용한 면역형광염색 결과에서는 도 6에서 확인할 수 있듯이, 대조군의 근육조직과 비교해서 로살탄 처리군과 지방조직 유래 줄기세포 처리군에서 마이오제닌의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포를 병용 투여한 군에서는 그 발현 정도가 월등히 증가하는 것이 관찰되었다. 한편 EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포는 손상된 골격근 조직으로 이동하여 근 섬유로 분화하는 것으로 관찰되었고 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포병용 투여군에서도 이들 EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포가 근섬유로 분화하는 것으로 관찰되었다.

MyoD 항체를 이용한 면역형광염색 결과에서는 도 7에서 확인할 수 있듯이, 대조군의 손상 근육조직과 비교해서 로살탄 처리군과 지방조직 유래 줄기세포 처리군에서 MyoD의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포를 병용 투여한 군에서는 그 발현 정도가 월등히 증가하는 것으로 관찰되었다. EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포는 손상된 골격근 조직으로 이동하여 근 섬유로 분화하는 것으로 관찰되었고 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포병용 투여군에서는 이들 EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포가 근섬유로 분화하는 것으로 관찰되었다.

도 8의 Pax7 항체를 이용한 면역형광염색 결과에서도 마이오제닌과 MyoD의 발현 양상과 비슷한 양상이 관찰되었다. 대조군의 손상 근육조직과 비교해서 로살탄 처리군에서는 유의성 있는 증가는 관찰되지 않았고, 지방조직 유래 줄기세포 처리군에서 MyoD의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포를 병용 투여한 군에서는 그 발현 정도가 월등히 증가하는 것으로 관찰되었다.

EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포는 역시 손상된 골격근 조직으로 이동하여 근 섬유로 분화하는 것으로 관찰되었고, 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포병용 투여군에서는 이들 EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포가 근섬유로 분화하는 것으로 관찰되었다.

[ 시험예 2]

1) 면역블로팅(Immunoblotting)에 의한 단백질 발현의 분석

상기 실시예의 방법으로 처리된 각 대조군, 지방조직 유래 줄기세포 투여군, 로살탄 투여군, 지방조직 유래 줄기세포와 로살탄 병용투여군의 마우스로부터 분리하여 -70℃에 보관된 간조직을 0.1 mM sodium orthovanadate(Na₃Vo₄)와 protease inhibitor cocktail tablet(Roche, Mannheim, Germany)을 용해시킨 RIPA buffer에 균질화시켰다. 균질화된 근육샘플을 4000 rpm 4℃에서 10분간 원심분리하여 지방을 제거 후 상층액을 취하였다. 상층액을 다시 14,000 rpm 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. Bradford Method를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 각 단백질 샘플을 80 ㎍/well로 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동 하였다.

면역블로팅을 위해 전기영동 된 겔 내의 단백질들을 PVDF membrane (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)에 전기이동(electro-transfer)시켰다. 3% Bovine serum albumin을 Tris-bufferd saline에 용해시킨 Blocking solution에 1시간 동안 blocking 과정 후에 Myogenin(1:500, Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA), MyoD(1:500, Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA) Wnt3a(1:500, Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA), β-catenin(1:500, Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA), p-Smad2/3(1:500, Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA)에 반응시켰고, 동일 양의 단백질이 로딩된 것을 확인하기 위해 β-Actin(1:500 Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA)에 반응시켰다. 0.5% Tween 200이 용해된 TBS 완충용액에 충분히 세척하고, 1차 항체에 대응하는 2차 항체를 1:1000 ~ 1:2000의 비율로 희석하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 TBS 완충용액으로 충분히 세척 후 특이적인 반응을 관찰하기 위해, Super Signal West Dura Extended Duration Substrate(PIERCE, IL ,USA)와 반응시키고 Medical X-ray 필름(Kodak, Tokyo, Japan)에 노출시켰다.

면역블로팅 결과에서도 면역조직화학염색 결과와 동일한 양상을 확인할 수 있었다. 마이오제닌(myogenin)의 발현의 경우 도 9에서도 확인할 수 있듯이, 대조군의 열상을 형성한 왼쪽 장딴지 근에서는 마이오제닌의 발현이 거의 관찰되지 않았고, 로살탄 투여군, 지방조직 유래 줄기세포 투여군에서는 유의성 있는 발현 증가가 관찰되었으며, 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군에서 그 증가치는 2배 이상 현저히 증가하는 것으로 관찰되었다.

MyoD 항체를 이용한 면역블로팅 결과 역시, 도 10에서 확인할 수 있듯이 면역조직화학염색의 결과와 유사한 결과가 나타났으며, MyoD의 발현 정도는 대조군>로살탄 투여군>지방조직 유래 줄기세포 투여군>로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군 순서로 관찰되어, 로살탄이 지방조직 유래 줄기세포를 이용한 치료에서 근육재생을 촉진시키는 것을 확인할 수 있었다.

Wnt-3a의 항체를 이용한 면역블로팅 결과, 도 11에서 확인할 수 있듯이 대조군 및 로살탄 투여군 보다 지방조직 유래 줄기세포를 투여한 그룹들에서 유의성 있게 증가한 발현량을 나타냈으며, 지방조직 유래 줄기세포 투여군과 로살탄 지방조직 유래 줄기세포 병용 투여군 간의 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다.

Wnt-3a의 하위신호인 β-catenin 항체를 이용하여 손상 근육에서 발현을 관찰한 결과 상기 Wnt-3a의 발현 양상과 유사하게 나타남을 알 수 있었다. Wnt-3a의 발현 양상과 비슷하게 지방조직 유래 줄기세포를 투여한 군들에서 그렇지 않은 군에 비해 발현양이 증가하는 경향이 관찰되었다.

p-Smad3 항체를 이용하여 손상 근육에서 발현을 관찰한 결과, p-Smad3의 발현 양상 역시 상기 Wnt-3a 및 β-catenin의 발현 양상과 유사하게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 지방조직 유래 줄기세포를 투여한 군들에서는 그 발현 양상이 대조군이나 로살탄 투여군에 비해 유의성 있게 증가하는 것을 관찰하였고, 지방조직 유래 줄기세포투여군 보다는 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여군에서 p-Smad3 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

2) RT - PCR 에 의한 mRNA 발현의 분석

전 시험그룹의 50 mg의 냉동 근육조직을 1 ml의 Trizol reagent(invitrogen, )에 균질화시키고, 얼음에 5분 동안 방치한다. 각 샘플에 100 ul의 클로르포럼(chlorform)을 첨가하고 상온에 다시 2분정도 방치하였다. 13000 rpm으로 15분 동안 4℃의 조건으로 원심분리한 후 상층액을 취해 250 ul의 아이소프로파놀(isopropanol)을 첨가해서 상온에 10분 동안 방치한다. 다시 13000 rpm으로 10분 4℃에서 원심분리를 한 후 상층액을 제거하고, 침전물을 취해서 500 ul의 에탄올을 첨가해서 세척한 후 13000 rpm 5분 동안 4℃로 원심분리한 후 상층액을 제거하여 침전물인 RNA를 추출하였다.

상기 추출된 RNA에 500 ul의 DEPC water를 첨가해서 10분 동안 55℃에 방치시킨다. RT-PCR 반응을 위해 RT-PCR premix(Bioneer, Korea)를 사용하였으며, RT-PCR premix 매뉴얼에 따라 각 RNA 샘플 200 ng의 농도의 샘플과 하기의 프라이머를 사용하였다.

Myogenin(forward: 5'-CTACAGGCCTTGCTCAGCTC-3', reverse: 5'-ACGATGGACGTAAGGGAGTG-3'), MyoD(forward: 5'-TACAGTGGCGACTCAGATGC-3', reverse: 5'-CTGGGTTCCCTGTTCTGTGT-3'), Pax7(forward: 5'-GACTCCGGATGTGGAGAAAA-3' , reverse: 5'-TGTACTGTGCTGCCTCCATC-3'), Myf5 (forward: 5'-AACCAGAGACTCCCCAAGGT-3', reverse: 5'-AGCTGGACACGGAGCTTTTA-3'), Desmin(forward: 5'-AACCAGAGACTCCCCAAGGT-3', reverse: 5'-AGCTGGACACGGAGCTTTTA-3'), 를 섞어 RT-PCR반응시켰다.

각 mRNA에 대한 대조군(control)로서 GAPDH 프라이머(forward: 5'-ACTCACGGCAAATTCAACGG-3', reverse: 5'-ACCAGTGGATGCAGGGATGA-3')가 사용되었다.

마이오제닌(myogenin)의 프라이머를 이용하여 손상근육에서 마이오제닌 mRNA 발현 레벨을 측정한 결과, 도 12에서도 확인할 수 있듯이 면역블로팅에서 확인한 마이오제닌 단백질 발현 양상과 유사함을 확인할 수 있었다. 대조군의 열상을 형성한 근육에서는 정상 근육에 비해 유의성 있게 감소한 마이오제닌 mRNA 발현 레벨을 관찰하였다. 로살탄 투여군, 지방조직 유래 줄기세포 투여군, 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포의 병용투여군에서는 대조군에 비해 유의성 있게 증가한 마이오제닌 발현을 나타냈고, 이들 중 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포의 병용투여군에서 가장 유의성 있는 결과를 관찰할 수 있었다.

MyoD의 프라이머를 이용하여 손상근육에서 myoD mRNA 발현 레벨을 측정한 결과, 도 13에서도 확인할 수 있듯이 면역블로팅에서 확인한 마이오제닌 단백질 발현 양상과는 차이가 있는 결과로 대조군의 손상 근육에 비해서 로살탄 투여군, 지방조직 유래 줄기세포 투여군, 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포의 병용투여군에서 모두 증가하였다.

Pax7의 프라이머를 이용하여 손상근육에서 Pax7 mRNA 발현 레벨을 측정한 결과, 도 14에서도 확인할 수 있듯이 면역형광염색에서 확인한 Pax7 단백질 발현 양상과 유사한 결과로, 정상 우측 장딴지근과 비교해 열상을 형성한 모든 그룹에서 pax7의 발현은 증가하였으며, 이중에서 열상만을 유도한 대조군에 비해 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포의 병용투여군에서만 유의성 있는 증가를 나타내었다.

Myf5의 프라이머를 이용하여 손상근육에서 Myf5 mRNA 발현 레벨을 측정한 결과, 도 15에서도 확인할 수 있듯이 근육 열상만을 유도한 대조군과 비교해서 로살탄 투여군, 지방조직 유래 줄기세포투여군, 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포의 병용투여군에서 Myf5의 발현은 증가하였으며, 이들중에는 유의성 있는 차이는 나타나지 않았고, Desmin의 프라이머를 이용하여 손상근육에서 Desmin mRNA 발현 레벨을 측정한 결과 역시, 전 그룹에서 발현양이 거의 유사하여 유의성 있는 차이는 나타나지 않았다.

또한, 지방조직 유래 줄기세포를 손상 근육에 주입하기 전에 발현하고 있는 근육 분화관련 유전자의 발현을 확인하기 위해 지방조직 유래 줄기세포를 추출한 후 passage 3까지 계대 배양하여, mRNA를 분리한 후 RT-PCR를 실시하여 이들에서 발현되는 유전자를 확인하였다. 정상 골격근과 비교해 지방조직 유래 줄기세포에서는 myoD, myogenin, myf5의 발현은 관찰되지 않았다. 하지만 지방조직 유래 줄기세포에서 desmin은 발현하였으나 정상 근육에 비해 낮은 발현양을 나타내었다.

[ 시험예 3]

1) EGFP - labelled 지방조직 유래 줄기세포의 손상 근육에서의 동정

EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포의 손상 근육에서의 위치 및 분화 상태를 동정하기 위해 손상 근육을 냉동 절편을 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dihydrochloride) (Molecular Probes, Leiden, the Netherlands)으로 10분간 반응시킨 후, 형광 현미경 488 nm파장에서 EGFP positive 세포들을 관찰하였다.

관찰 결과, 도 16에서도 확인할 수 있듯이 EGFP-labelled 지방조직 유래 줄기세포는 손상된 근육 섬유 혹은 재생되는 근육 섬유의 변연부에서 융합해 들어가는 것을 관찰 할 수 있었으며, 이에 따라 EGFP-labelled 근육섬유 또한 관찰되었다. 따라서 이들 지방조직 유래 줄기세포가 근육 재생에 직접적으로 관여하는 것을 확인할 수 있었다.

[ 시험예 4]

1) 지방조직 유래 줄기세포와 근육위성세포 공생배양에서 로살탄의 효과

근육 열상 동물 모델에서 확인한 결과를 in vitro 실험에서 재검정을 위해 지방조직 유래 줄기세포와 근육위성세포(satellite cell)를 공생배양을 실시하였다.

실험동물에서 투여된 지방조직 유래 줄기세포와 동일한 환경을 조성하기 위해 지방조직 유래 줄기세포와 근육위성세포 공생배양을 실시하였으며, 그 비율은 지방조직 유래 줄기세포(5×10⁴):근육위성세포(1×10⁵) = 1:2 비율로 배양을 하였으며, 근육위성세포를 2일 동안 배양 후 지방조직 유래 줄기세포를 추가 배양하여 총 2주 동안 공생배양을 실시하였다. 2주 동안 사용한 배지는 근육분화배지에 배양하였다. 각 웰(well)을 대조군(control), TGF-b(5 ng/ul) 처리, 안지오텐신 Ⅱ(100 ) 처리, TGF-b＋로살탄(1 mM) 처리, 안지오텐신 Ⅱ＋로살탄 처리 순으로 처리를 하여 이들의 분화정도를 관찰하였다.

그 결과, 도 17에서 확인할 수 있듯이 1주까지는 근육위성세포의 분화가 진행되어 이들이 근육대롱(myotube)을 형성하는 것이 관찰되었고, 이들 중 대조군과 비교해서 TGF-b 및 안지오텐신 Ⅱ를 처리한 웰에서는 근육대롱 형성이 억제되는 것이 관찰되었고, 이와 대조적으로 로살탄을 처리한 웰에서는 오히려 근육대롱 형성이 증가하는 것을 관찰하였다. 공동배양을 추가적으로 실시해 2주 동안 배양한 웰에서 세포의 mRNA를 분리하여 근육분화에서 중요 마커인 myoD, 마이오제닌(myogenin) 발현을 관찰한 결과, 마이오제닌은 대조군 웰, TGF-b 처리 웰, 안지오텐신 Ⅱ 처리 웰에서는 그 발현이 아주 미약한 반면 로살탄을 처리한 웰들에서는 그 발현이 월등히 증가함을 알 수 있었고 myoD 역시, 마이오제닌과 유사한 양상으로 로살탄을 처리한 웰에서 그 발현양이 현저히 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

2) 지방조직 유래 줄기세포와 근육위성세포 공생배양에서 지방조직 유래 줄기세포의 근육으로 분화 확인

지방조직 유래 줄기세포와 근육위성세포를 공생배양 후 지방조직 유래 줄기세포의 근육대롱(myotube)로의 분화 확인을 위해 성숙 근섬유의 분화 마커인 Troponin I을 1차 항체로, 이에 대한 TRITC-conjugated 2차 항체로 하여 면역형광염색을 실시하였다. 각각 EGFP 발현 관찰을 위한 파장(488 nm)과 TRITC를 관찰하기 위한 파장(555 nm)에 형광 촬영을 실시하였다.

촬영 결과, 도 18에서도 확인할 수 있듯이 EGFP와 Troponin I을 동시에 발현하는 지방조직 유래 줄기세포를 관찰할 수 있었으며, 이들이 근육대롱으로 분화하고 근육대롱과 융합하는 것을 관찰할 수 있었다.

상기의 모든 실험 결과로부터, 로살탄을 포함한 모든 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker)는 근육 손상시 재생과정에서 발생하는 과도한 섬유화를 억제하며, 근섬유의 재생을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 손상된 근섬유의 복구를 위해 지방조직 유래 줄기세포를 주입 시 로살탄은 이들이 손상 근섬유에서 쉽게 융합 혹은 새로운 근 섬유로의 분화를 조절하는 줄기세포 미세환경(niche) 형성에 중요한 역할을 하는 것을 확인한 바, 근육 손상에서 로살탄과 지방조직 유래 줄기세포 병용투여를 통한 치료법의 개발 및 확립화는 근육 재생 의료기술 분야에서 필수적인 치료법이 될 수 있음을 확인하였다.

Claims

안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker) 및 지방조직 유래 줄기세포를 유효성분으로 하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제는 로살탄(Losartan), 발살탄(Valsartan), 텔미살탄(Telmisartan), 일베살탄(Irbesartan) 및 올메살탄( Olmesartan) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 지방조직 유래 줄기세포는 지방조직에서 얻어지는 기저-혈액 세포 분획(Stromal Vascular Fraction, SVF) 또는 계대배양하여 수득되는 것을 특징으로 하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 약학조성물.
제 3항에 있어서,
상기 지방조직 유래 줄기세포는 3회 이상 계대배양하여 수득되는 것을 특징으로 하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 약학조성물.
삭제
제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
상기 약학조성물은 손상 근육의 재생 시 과도한 섬유화의 억제 또는 손상 근섬유의 융합 또는 새로운 근섬유로의 분화를 조절하는 줄기 세포의 미세환경 (Niche)을 형성하는 것을 특징으로 하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 약학조성물.
안지오텐신 Ⅱ 타입 1 수용체 차단제(angiotensin Ⅱ type1 receptor blocker) 및 지방조직 유래 줄기세포를 동시 또는 순차 투여하는 손상 근육의 치료 또는 손상 근육의 재생 촉진용 패키지.