WO2017006965A1 - 血液分析方法及び血液検査キット - Google Patents

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WO2017006965A1
WO2017006965A1 PCT/JP2016/070010 JP2016070010W WO2017006965A1 WO 2017006965 A1 WO2017006965 A1 WO 2017006965A1 JP 2016070010 W JP2016070010 W JP 2016070010W WO 2017006965 A1 WO2017006965 A1 WO 2017006965A1
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blood
diluent
analysis method
sample
component
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PCT/JP2016/070010
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達也 石坂
中津川　晴康
進 大澤
晋哉 杉本
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富士フイルム株式会社
株式会社リージャー
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard

Definitions

  • the present invention relates to a blood analysis method and a blood test kit for analyzing a target component in a very small amount of blood sample.
  • a general qualified blood sample is collected by a doctor or other qualified person using a syringe to collect blood from the vein, and the subject is self-collected by inserting a blood collection needle into his / her finger or the like. There is blood sampling.
  • Blood collected by general blood collection is transported to a medical institution or inspection in a state of being sealed in a collection container, where it is inspected.
  • a test is performed after blood is separated into blood cells and plasma by a centrifuge at a medical institution or inspection institution.
  • the collected blood is separated into blood cells and plasma by a separation membrane and transported to the examination site in this separated state, where the examination is performed.
  • Patent Document 1 describes a method for examining a blood sample collected by self blood collection. Specifically, 1) Prepare a sample for quantification consisting of an unknown volume of a biological sample containing a component to be quantified collected without quantifying the volume and a fixed amount of an aqueous solution containing a fixed amount of an indicator substance.
  • Patent Document 2 the amount of a component to be analyzed in a sample is measured, and further, the amount of a standard component originally present in the sample other than the above is measured.
  • a quantitative analysis method is described in which the amount of a sample is determined from the known concentrations of the standard components, and the concentration of the analysis target component in the sample is determined from the sample amount and the analysis target component amount.
  • Patent Document 3 describes that a small amount of blood is collected from a human or animal using a blood dilution quantification instrument and is supplied as it is or after dilution to supply a constant amount to another device, container or reagent.
  • Patent Document 4 describes a method of quantifying the concentration of a component to be quantified in a biological sample using the absorbance of an indicator substance in an aqueous solution for dilution.
  • Patent Document 2 about 100 ⁇ L of whole blood of healthy subjects is dropped on a porous membrane, blood cells are separated and serum is developed, and then 150 ⁇ L of saline-isotonic PBS (Phosphate-buffered saline: pH 7.4) is added. The supernatant obtained by centrifuging the obtained liquid is analyzed as an analysis sample, but there is no description of blood collection of less than 100 ⁇ L.
  • saline-isotonic PBS Phosphate-buffered saline: pH 7.4
  • the measurement method described in Patent Document 4 is a measurement with a dilution factor of about 10 times.
  • the measurement value is repeatedly reproduced as in Patent Document 1. There is a problem that the performance is lowered.
  • An object of the present invention is to provide a blood analysis method having high reproducibility of measurement values in a blood sample of 50 ⁇ L or less, and a blood test kit for use in the blood analysis method.
  • the present inventors diluted a collected blood sample with a diluent, and determined the dilution ratio using the standard values of standard components that are constantly present in the blood.
  • the volume of the blood sample is 50 ⁇ L or less
  • the dilution factor of the plasma component in the blood sample is 14 times or more
  • the blood sample is constantly in the blood as a diluent.
  • the present invention has been completed by finding that the above problem can be solved by using a diluent that does not contain the above-described standard component. That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
  • the blood analysis method according to (1) comprising: Blood analysis wherein the volume of the blood sample is 50 ⁇ L or less, the dilution factor of the plasma component in the blood sample is 14 times or more, and the diluent is a diluent that does not contain a standard component that is constantly present in the blood Method.
  • the blood analysis method according to (1) comprising a step of recovering a plasma component-containing sample from the diluted blood sample after the step of diluting the collected blood sample with a diluent.
  • the blood analysis method according to (2) wherein the collecting step is a step using a separation membrane.
  • the blood analysis method according to (2) or (3) comprising a step of transporting the plasma component-containing sample after the step of recovering the plasma component-containing sample from the diluted blood sample.
  • the blood analysis method according to any one of (1) to (4) wherein the standard component that is constantly present in the blood is sodium ion or chloride ion.
  • the blood analysis method according to any one of (1) to (5), wherein the standard components that are constantly present in the blood are sodium ions or chloride ions and at least one standard component. .
  • the blood analysis method according to (6), wherein the at least one standard component is a standard component selected from total protein or albumin.
  • the blood analysis method according to (5), wherein the diluent is a diluent not containing sodium ions or chloride ions.
  • the blood analysis method according to (5), wherein the standard component that is constantly present in the blood is sodium ion.
  • an amino alcohol compound wherein the diluent is selected from the group consisting of 2-amino-2-methyl-1-propanol, 2-ethylaminoethanol, N-methyl-D-glucamine, diethanolamine, and triethanolamine; 2- [4- (2-hydroxyethyl-1-piperazinyl) ethanesulfonic acid), also referred to as HEPES, N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid, also referred to as TES, 3-morpholinopropane, also referred to as MOPS (1) to (11), which is a diluent containing a buffer selected from the group consisting of sulfonic acid and BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid)
  • a buffer selected from the group consisting of sulfonic acid and BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethan
  • the method according to any one of (1) to (12), further including a step of verifying an analysis of the concentration of the target component based on a dilution factor obtained using a standard value of a standard component different from the standard component The blood analysis method according to 1.
  • (14) For use in the blood analysis method according to any one of (1) to (13), including a diluent for diluting a blood sample and a container for containing the diluted blood sample Blood test kit.
  • the blood analysis method and the blood test kit of the present invention it is possible to perform analysis with high reproducibility of measured values even if the amount of blood sample is small.
  • FIG. 1 shows an example of the configuration of a container for accommodating a diluted blood sample.
  • Patent Document 2 a blood volume of about 100 ⁇ L is collected.
  • the wound on the skin such as a fingertip needs to be enlarged, and the patient is painful, Some people feel it as a strong pain. There is also a concern that hemostasis will be delayed because the wound is deep.
  • dilution is performed using magnesium ion having a central homeostasis value in blood of 0.9 mmol / L, 4.65 mmol / L calcium ion, and 7.5 g / 100 mL total protein. The magnification is measured.
  • the concentration of the homeostatic component in the diluent decreases, resulting in a measurement error that cannot be ignored when measuring the homeostatic component.
  • the measurement value of the dilution factor also includes an error, and the measurement reliability is impaired.
  • Patent Document 4 discloses a technique for improving the measurement accuracy by correcting the influence of milk using two wavelengths of light, but it is a measurement with a dilution factor of about 10 times.
  • the method of Patent Document 4 is effective for analysis with a diluted blood volume of 100 ⁇ L or less, but there are few components to be analyzed, information on many various components to be analyzed is obtained, and the state of organs and lifestyle habits are obtained. It cannot handle inspections for the purpose of prediction. In this case, when the dilution rate is further increased to sufficiently secure the diluted blood volume, the same problem as in Patent Document 1 is encountered.
  • the present invention has been studied in consideration of the above-mentioned problems.
  • the dilution rate is increased.
  • a sufficient amount of the diluent to be analyzed is secured, a dilution ratio with good reproducibility can be realized, and the target component can be analyzed with high accuracy.
  • the amount of blood to be collected is very small and the dilution factor is high, use a diluent that does not contain standard components that are permanently present in the blood as the diluent, and use the standard values for the standard components to determine the dilution factor. Being able to perform analysis with high reproducibility of measured values by determining is a completely unexpected effect that cannot be predicted from the prior art documents.
  • the blood analysis method of the present invention comprises: Diluting the collected blood sample with a diluent, Determining the dilution factor using standard values of standard components that are permanently present in the blood; Analyzing the concentration of the target component in the blood sample; A blood analysis method comprising: A method in which the volume of the blood sample is 50 ⁇ L or less, the dilution factor of the plasma component in the blood sample is 14 times or more, and the diluent is a diluent that does not contain the above-mentioned standard component that is constantly present in the blood. is there.
  • a blood sample is collected and the target component in the blood sample is analyzed.
  • the blood analysis method of the present invention may be performed by self-collection in which the subject himself collects blood, or may be performed in general blood collection in which a qualified person such as a doctor collects blood using a syringe. .
  • the patient himself / herself collects the blood that has come out of the skin by damaging a fingertip or the like using an instrument with a knife such as a lancet.
  • the volume of the blood sample used in the blood analysis method of the present invention (that is, the amount of blood collected) is 50 ⁇ L or less, preferably 40 ⁇ L or less, more preferably 30 ⁇ L or less, further preferably 20 ⁇ L or less, and the lower limit is not particularly limited.
  • the necessary blood volume for performing blood analysis is preferably 5 ⁇ L or more.
  • the target component can be analyzed with high measurement accuracy even when the amount of blood sample is very small.
  • the collected blood sample is diluted with a diluent.
  • a diluent When testing specific organs and specific diseases such as liver function, renal function, and metabolism as a blood test, obtain information on multiple components to be measured that are specific to the organ and the disease to determine the state of the organ, In order to predict habits and the like, generally, a plurality of target components are analyzed simultaneously. For example, in order to examine the state of the liver, generally, ALT (alanine transaminase), AST (aspartate aminotransferase), ⁇ -GTP ( ⁇ glutamyl transpeptidase), ALP (alkaline phosphatase), total bilirubin, The concentration in the blood of several or more components such as total protein and albumin is measured.
  • the amount of the diluent to be used is preferably 250 ⁇ L or more, more preferably 300 ⁇ L or more, even more preferably 350 ⁇ L or more, and 400 ⁇ L or more in order to measure a plurality of target components.
  • the upper limit of the amount of the diluent is not particularly limited, but is generally preferably 1000 ⁇ L or less in order to realize a dilution rate effective for measurement.
  • the blood to be collected contains a plasma component and a blood cell component.
  • a plasma component obtained by removing the blood cell component from the blood and a diluent.
  • the blood cell component may be separated from the blood in advance and then mixed with the diluted solution, or the collected blood may be mixed with the diluted solution, and then the blood cell component may be separated using a separation membrane or the like.
  • dilution can be performed after performing a step of separating blood cells from blood collected by a patient and collecting plasma.
  • a plasma component-containing sample is a sample containing a plasma component and a diluent. In this case, the plasma component-containing sample collected as described above can be transported to, for example, an examination place.
  • the method for separating blood cells from blood and collecting plasma there is no particular limitation on the method for separating blood cells from blood and collecting plasma, and the method for separating blood cells from diluted blood and collecting a plasma component-containing sample.
  • the blood After blood collection with an anticoagulant blood collection tube, the blood may be separated into blood cell components and plasma components by centrifugation, or the blood components are passed through a separation membrane such as a filtration membrane by applying pressure to the blood components. May be captured by a separation membrane to separate blood cell components from blood.
  • an anticoagulant may be used.
  • the step of collecting the plasma component is preferably a step using a separation membrane.
  • a biological sample separation instrument or the like having means can be used.
  • the present invention it is preferable to collect blood with low invasiveness, and it is important to prepare a diluted blood solution from a very small amount of blood sample, and the plasma in the blood sample when the collected blood is diluted with the diluted solution It is required that the dilution ratio of the components is high.
  • the dilution rate here is the dilution rate of the plasma component obtained by removing the blood cell component from the blood component, and the dilution rate in the present invention is 14 times or more, preferably 17 times or more, more preferably 21 times or more, It is more preferably 25 times or more, particularly preferably 30 times or more, most preferably 40 times or more, and the upper limit is not particularly limited, but in order to enable high-accuracy measurement, it is generally preferably 100 times or less.
  • the reproducibility of the dilution factor measurement when diluted with a diluent is good even at a high magnification from 6 times or more, and the patient collects blood.
  • the dilution ratio of blood is preferably 8 times or more, more preferably 10 times or more, still more preferably 13 times or more, most preferably 18 times or more,
  • the upper limit is not particularly limited, but is generally preferably 50 times or less in order to enable highly accurate measurement.
  • the concentration of the plasma component in the blood before dilution is determined in advance.
  • the density change rate is very small, so that the measurement error is large and the reproducibility of the measurement deteriorates. Therefore, in the present invention, in order to increase the measurement accuracy, the dilution rate is determined using the standard values of standard components that are constantly present in blood.
  • the standard component that is constantly present in the blood is also referred to as an external standard substance.
  • Examples of standard components that are constantly present in blood include sodium ions, chloride ions, potassium ions, magnesium ions, calcium ions, total protein, and albumin.
  • the concentration of these standard components contained in the serum and plasma of the blood sample is such that the sodium ion concentration is 134 to 146 mmol / liter (average value: 142 mmol / liter), and the chloride ion concentration is 97 to 107 mmol / liter (average) Value: 102 mmol / liter), potassium ion concentration is 3.2 to 4.8 mmol / liter (average value: 4.0 mmol / liter), and magnesium ion concentration is 0.75 to 1.0 mmol / liter (average value: 0.9 mmol / liter), calcium ion concentration is 4.2 to 5.1 mmol / liter (average value: 4.65 mmol / liter), and total protein concentration is 6.7 to 8.3 g / 100 mL (average value: 7.5 g /
  • the present invention is intended to enable measurement of a target component when the amount of blood collected to relieve pain of a patient is very small.
  • a very small amount of blood is diluted with a diluent, It is necessary to accurately measure the concentration of “a standard component that is continually present in blood”.
  • the concentration of components originally present in the blood decreases in the diluted solution, and depending on the dilution rate, there is a possibility that a measurement error is included in the concentration measurement. Therefore, among these “standard components that are continually present in the blood”, when a very small amount of blood component is diluted at a high dilution ratio, the above-mentioned standard component can be detected with sufficient accuracy. It is preferable to measure standard components present at high concentrations.
  • sodium ions Na +
  • chloride ions Cl ⁇
  • the average value of sodium ions represents a standard value (the median value of the reference range), which is 142 mmol / liter, which accounts for 90% or more of the total cations in plasma.
  • the percentage of the plasma component in the blood of the patient who is a patient is about 55% in volume ratio, but varies depending on the change in the amount of salt intake of the subject, and also varies depending on the subject. . Therefore, in the present invention, the dilution rate is determined using the standard value of the standard component that is constantly present in the blood, and the concentration of the target component in the blood sample is analyzed using the determined dilution rate.
  • concentration X concentration of an external standard substance (for example, sodium ion) in a diluted solution of plasma and the known external standard substance (for example, sodium ion) in plasma are known.
  • the dilution factor can be determined by calculating the dilution factor (Y / X) of the plasma component in the blood sample from the concentration value (concentration Y; 142 mmol / liter in the case of sodium ion). Using this dilution factor, the measurement value (concentration Z) of the target component in the diluted plasma solution is measured, and this measurement value is multiplied by the dilution factor, so that the actual analysis target component contained in the blood sample is obtained. The density [Z ⁇ (Y / X)] can be measured.
  • the concentration analysis of the analysis target component in the blood is performed normally, two or more different components that are constantly present in the blood are used as standard components, and each is independently contained in the blood sample. It is preferable to determine the dilution rate of the plasma component of the blood and confirm that the values match.
  • the coincidence means that in two measured values (a, b), the ratio of their difference to their average value, that is,
  • Chloride ion measurement methods include an electrode method using an ion-selective electrode (Ion Selective Electrode: ISE), an enzyme method using an enzyme such as amylase, a silver nitrate titration method, and the like. A method to be used as appropriate can be selected in accordance with the above.
  • total protein or albumin As an example of standard components that are constantly present in plasma other than sodium ions and chloride ions, it is preferable to select from total protein or albumin, more preferably from total protein, There are known methods such as the Burette method, the ultraviolet absorption method, the Breadford method, the Raleigh method, the bicinchoninic acid (BCA) method, the fluorescence method, and the characteristics and sensitivity of the measurement sample and the sample amount.
  • BCA bicinchoninic acid
  • the sodium ion concentration and chloride ion concentration can be measured by, for example, flame photometry, glass electrode method, titration method, ion selective electrode method, enzyme activity method and the like.
  • to analyze the concentration of a target component in a blood sample is to determine the concentration of the target component (that is, to quantify the target component), or whether the concentration of the target component is equal to or higher than a predetermined reference value.
  • concentration of the target component that is, to quantify the target component
  • concentration of the target component is equal to or higher than a predetermined reference value.
  • the form of analysis is not particularly limited, including determining whether it is below a predetermined reference value, performing qualitative detection that includes a certain level of concentration, and the like.
  • a standard component that is constantly present in blood (hereinafter also referred to as a homeostatic substance) is measured after dilution with a diluent, and the dilution factor is determined as described above to determine the target component in the blood sample.
  • the concentration can be analyzed.
  • a diluent for diluting a blood sample is a diluent that does not contain “a standard component that is constantly present in blood” used to determine the dilution factor.
  • “does not contain” means “does not contain substantially”.
  • substantially free means that the homeostatic substance used when determining the dilution factor is not included at all, or even if it is included, the homeostatic substance in the diluted solution after the blood sample is diluted It means the case where it is contained at a very small concentration that does not affect the measurement of the above.
  • a diluent that does not substantially contain sodium ions or chloride ions is used as the diluent.
  • the diluting solution is pH 6.5 to pH 8.0, preferably pH 7.0 to pH 7.5, more preferably pH 7.3 to pH 7.4.
  • a buffer solution having a buffering action is preferable, and the diluent is preferably a buffer solution containing a buffer component that suppresses fluctuations in pH.
  • the types of buffer include acetate buffer (Na), phosphate buffer (Na), citrate buffer (Na), borate buffer (Na), tartrate buffer (Na), Tris (Tris (hydroxy Methyl) aminoethane) buffer (Cl), HEPES ([2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid]) buffer, phosphate buffered saline (Na), etc. are known ing.
  • phosphate buffers, Tris buffers, and HEPES buffers are representative examples of buffers around pH 7.0 to pH 8.0.
  • the phosphate buffer contains a sodium salt of phosphate
  • the Tris buffer has a dissociated pKa (Ka is an acid dissociation constant) of 8.08
  • the pH is around 7.0 to 8.0.
  • the pKa of HEPES sulfonic acid dissociation is 7.55, but in order to adjust the buffer solution with constant ionic strength, water is usually used. Since a mixture of sodium oxide, sodium chloride and HEPES is used, these are useful as a buffer having an action of keeping the pH constant, but sodium ions or chloride ions which are preferably used as an external standard substance Therefore, application to the present invention is not preferable.
  • a buffer solution that does not contain sodium ions or chloride ions.
  • the diluent used in the present invention is preferably selected from the group consisting of 2-amino-2-methyl-1-propanol (AMP), 2-ethylaminoethanol, N-methyl-D-glucamine, diethanolamine, and triethanolamine.
  • AMP 2-amino-2-methyl-1-propanol
  • 2-ethylaminoethanol N-methyl-D-glucamine
  • diethanolamine diethanolamine
  • triethanolamine triethanolamine.
  • 2- [4- (2-hydroxyethyl-1-piperazinyl]] also referred to as HEPES, which is a buffer with a Good's buffer (Good buffer) and a pKa of around 7.4.
  • the concentration ratio of amino alcohol and Good's buffer solution is 1: 2 to 2: 1, preferably 1: 1.5 to 1.5: 1, more preferably 1: 1.
  • the concentration of the buffer is not limited, but the concentration of amino alcohol or Good's buffer is 0.1 to 1000 mmol / L, preferably 1 to 500 mmol / L, more preferably 10 to 100 mmol / L.
  • the buffer solution may contain a chelating agent, a surfactant, an antibacterial agent, a preservative, a coenzyme, a saccharide and the like for the purpose of keeping the analysis target component stable.
  • chelating agents include ethylenediaminetetraacetate (EDTA), citrate, and oxalate.
  • the surfactant include a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant.
  • the preservative include sodium azide and antibiotics.
  • the coenzyme include pyridoxal phosphate, magnesium, zinc and the like.
  • saccharide of the erythrocyte stabilizer examples include mannitol, dextrose, oligosaccharide and the like.
  • by adding antibiotics it is possible to suppress the growth of bacteria partially mixed from the finger surface at the time of hand blood collection, to suppress the degradation of the biological components by bacteria, and to stabilize the biological components.
  • the osmotic pressure of the buffer solution is equivalent to that of blood (285 mOsm / kg (mOsm / kg is 1 kg of water of the solution).
  • the osmotic pressure represents the number of milligrams of ions)) or more to prevent hemolysis of blood cells.
  • the osmotic pressure can be adjusted to be isotonic with salts, sugars, buffers or the like that do not affect the measurement of the target component and the measurement of the standard component that is constantly present in the blood.
  • the component to be analyzed in the present invention is not limited, and any substance contained in blood is targeted.
  • examples include biochemical test items in blood used for clinical diagnosis, markers for various diseases such as tumor markers and hepatitis markers, and include proteins, sugars, lipids, low molecular weight compounds, and the like.
  • the measurement includes not only the substance concentration but also the activity of substances having an activity such as an enzyme.
  • Each target component can be measured by a known method.
  • the blood test kit of the present invention is used in the blood analysis method of the present invention described above, including a diluent for diluting a blood sample and a container for containing the diluted blood sample.
  • a diluent for diluting a blood sample and a container for containing the diluted blood sample.
  • This is a blood test kit.
  • the material of the container is preferably a synthetic resin from the viewpoint of resistance to breakage, hygiene, and price.
  • polyethylene polypropylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polystyrene, polyvinyl acetate, polyurethane, polyethylene terephthalate, polylactic acid, acrylonitrile butadiene styrene resin (ABS resin), acrylonitrile styrene resin (AS resin), acrylic resin (PMMA) , Polycarbonate, silicone resin, silicone rubber and the like.
  • ABS resin acrylonitrile butadiene styrene resin
  • AS resin acrylonitrile styrene resin
  • PMMA acrylic resin
  • Polycarbonate silicone resin, silicone rubber and the like.
  • a diluting solution for diluting a blood sample a first containing device containing the diluting solution, and a separation for separating and collecting plasma from the blood sample diluted with the diluting solution
  • a device a holding device for holding the separating device, a second containing device for containing the collected plasma, a sealing device for maintaining the contained plasma in the second containing device, and damaging the skin
  • It is equipped with a needle that bleeds blood outside the skin, a lancet, an adhesive bandage or disinfecting member (for example, a non-woven fabric impregnated with isopropanol (70% by mass isopropanol) or ethanol), an instruction manual, etc. be able to.
  • the diluent described above in this specification can be used.
  • the first storage device and the second storage device may be used as a first storage device and a second storage device, or may be provided with separate devices.
  • the first storage device and the second storage device The instrument is preferably made of a transparent material.
  • transparent as used in the present invention is not limited as long as the observer can confirm the amount of liquid inside, and is a concept including translucency.
  • the separation instrument for separating plasma is preferably a separation membrane, and more preferably a filter having pores capable of separating blood cell components. It is preferable that the holding device for holding the separation device is a gasket.
  • the sealing device when the storage device is a tube-shaped device, a cap that can cover the opening, a cover having a spiral groove, or a rubber plug is used. can do.
  • the present invention makes it possible to realize a method capable of analyzing an analysis target component with a high measurement accuracy even with a small amount of blood of 50 ⁇ L or less, and allows a patient to accurately analyze even with a small blood sample of 50 ⁇ L or less.
  • the kit includes an instruction manual in which information indicating that measurement is possible is described.
  • a first storage device containing a diluent containing a blood sample diluted with the diluent
  • a holding device for holding the separation device for holding the separation device
  • a first device for containing the collected plasma are described, for example, in FIGS. 1 to 13 of Japanese Patent No. 3597827. Can be used.
  • FIG. 1 of Japanese Patent No. 3597827 is incorporated as FIG. 1 of the present application.
  • the blood separation instrument 1 includes a blood collection container 2 (first accommodation instrument in which a diluent is accommodated), a cylinder 3 (second accommodation instrument for accommodating the collected plasma) that can be inserted into the blood collection container 2, and
  • the cap piston 4 that can be attached to the cylindrical body 3 and a sealing lid 5 (sealing device) provided at the lower end of the cap piston 4, and before use, as shown in FIG.
  • the upper end opening is sealed with a cap 6 via a packing 7.
  • the container for storing the diluted blood sample in the present invention corresponds to the combination of the blood collection container 2 and the cylinder 3 in the configuration of FIG. That is, the container for storing the diluted blood sample may be one or a combination of two or more.
  • the blood collection container 2 is made of a transparent material and has a cylindrical shape.
  • a screw portion 8 is formed on the outer surface of the blood collection container 2 and an engaging portion 9 is projected on the inner surface.
  • an inverted conical bottom portion 10 is formed at the lower end portion of the blood collection container 2, and a cylindrical leg portion 11 is formed around the bottom portion 10.
  • the legs 11 have the same outer diameter as the sample cup used at the time of blood analysis and testing, and preferably, slit grooves 12 are formed in the vertical direction at positions opposite to the lower ends thereof. Further, as shown in FIG. 1, a required amount, for example, a diluted solution 13 of 500 mm 3 may be placed in the blood collection container 2 in advance.
  • the cylindrical body 3 is made of a transparent material and has a cylindrical shape, and an enlarged diameter portion 14 is formed at an upper end portion thereof.
  • the enlarged diameter portion 14 is connected to the main body portion 16 through a thin portion 15.
  • a reduced diameter portion 18 is formed at the lower end of the cylindrical body 3, and a locking projection 19 is formed on the inner surface of the reduced diameter portion 18.
  • the outer flange portion 20 (holding device) is formed at the lower end portion of the reduced diameter portion 18, the lower end opening portion of the outer flange portion 20 is covered with a filtration membrane 21 (separation device), and the filtration membrane 21 is in the blood. It allows passage of plasma and prevents passage of blood cells.
  • a silicon rubber cover 22 is attached to the outer periphery of the reduced diameter portion 18 (FIG. 1).
  • the cap piston 4 includes a substantially cylindrical knob 26 and a mandrel 27 that is concentric with the knob 26 and extends downward.
  • a cylindrical space 28 into which the enlarged diameter portion 14 of the cylindrical body 3 can be fitted is formed at the inner upper end portion of the knob portion 26, and the lower portion thereof is screwed and can be screwed into the screw.
  • the lower end portion 29 of the mandrel portion 27 is formed in a pin shape, and the sealing lid 5 is detachably provided on the lower end portion 29 (see FIG. 1).
  • the sealing lid 5 is made of silicon rubber.
  • the number of each element included in the blood test kit of the present invention is not particularly limited, and may be one each or two or more.
  • the blood test kit of the present invention comprises a diluent for diluting a blood sample, a container for containing the diluted blood sample, and optional elements described above in a storage container for storing them. It can be provided as a stored form.
  • composition of Diluent-1 Diluent-1 was prepared with the following composition.
  • osmotic pressure a value measured using OSMOATAT OM-6040 (manufactured by ARKRAY, Inc.) was displayed.
  • the unit of osmotic pressure is the osmotic pressure of 1 kg of solution water, and represents the number of millimoles of ions.
  • HEPES 50mmol / L 2-Amino-2-methyl-1-propanol (AMP) 50mmol / L D-mannitol 284 mmol / L Lithium chloride 1mmol / L EDTA-2K 0.8mmol / L PALP (pyridoxal phosphate) 0.05mmol / L Thiabendazole 0.0001 mass% Amikacin sulfate 0.0003 mass% Kanamycin sulfate 0.0005% by mass Meropenem trihydrate 0.0005% by mass Osmotic pressure 355mOsm / kg pH 7.4
  • the sodium ion concentration was measured for each diluted solution prepared in (1).
  • ⁇ -galactosidase was activated by sodium, and the measurement was performed by an enzyme activity method utilizing the proportional relationship between the sodium ion concentration in each diluted solution and ⁇ -galactosidase activity. Specifically, after diluting the diluted blood solution 5 times with purified water not containing sodium ions, 3 ⁇ L was weighed, 52 ⁇ L of the first reagent prepared as follows was added, and the mixture was heated at 37 ° C. for 5 minutes. did.
  • the lithium ion added to the diluted solution was measured by a chelate colorimetric method (halogenated polyphyrin chelate method: perfluoro-5,10,15,20-tetraphenyl-21H, 23H, -porphyrin). Specifically, after diluting the diluted blood solution 4.5 times with purified water not containing lithium ions, 5 ⁇ L was weighed and 55 ⁇ L of the third reagent prepared as follows was added. Warmed for minutes.
  • the change in absorbance per minute was determined by measuring the absorbance at a main wavelength of 545 nm and a sub wavelength of 596 nm using a JCA-BM6050 type biochemical automatic analyzer (manufactured by JEOL Ltd.). .
  • the concentration of lithium ions was measured from a calibration curve prepared in advance.
  • a measurement reagent for lithium ions having the following composition was prepared.
  • Example 1 Measurement of ALT (Alanine Transaminase) and AST (Aspartate Aminotransferase) Immediately after blood was collected from a vein using a syringe in Reference Example 1, blood was squeezed from the fingertip of the same patient who collected the blood outside the skin of the fingertip.
  • ALT Alanine Transaminase
  • AST Aspartate Aminotransferase
  • the patient sucks blood using a sponge capable of absorbing about 20 ⁇ L to 40 ⁇ L of liquid, and soaks the sponge having absorbed blood in 360 ⁇ L of a diluent having the same composition as the diluent used in Reference Example 1,
  • the blood was sufficiently extracted from the sponge into the diluted solution and filtered through a filter to separate blood cell components, thereby obtaining a diluted solution of plasma components of the blood sample. Seal the diluted solution and transport it to another facility where inspection is possible. Then, remove the diluted solution and dilute in the same manner as the method for measuring the dilution factor using sodium ions in blood in Reference Example 1. When the magnification was measured, it was 22.3 times.
  • ALT and AST concentration of ALT and AST in the diluted sample was measured using a commercially available measurement kit (Transaminase CII-Test Wako: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The results were almost the same as the measured values of ALT and AST, which were analyzed based on the dilution rate measured using sodium ion concentration.
  • Example 2 In Example 1, the concentration of chloride ions was measured by the method described below using a diluted solution obtained by measuring the dilution rate of plasma components in a blood sample using sodium ions.
  • Chloride ions were measured using an ion selective electrode (ISE). A biological sample was passed between an ion selective electrode that selectively responds to chloride ions and a reference electrode, and the chloride ion concentration was calculated from the electromotive voltage generated between the electrodes.
  • ISE ion selective electrode

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Abstract

本発明の課題は、５０μＬ以下の血液検体において測定値の繰り返し再現性が高い血液分析方法、並びに上記血液分析方法において使用するための血液検査キットを提供することである。本発明によれば、採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程とを含む、血液分析方法であって、血液検体の容量が５０μＬ以下であり、血液検体中の血漿成分の希釈倍率が１４倍以上であり、希釈液が、血液中に恒常的に存在する標準成分を含有しない希釈液である、血液分析方法が提供される。

Description

血液分析方法及び血液検査キット
　本発明は、微量の血液検体中の対象成分を分析するための、血液分析方法及び血液検査キットに関する。
　一般に、採血には、医師等一定の有資格者が注射器を用いて静脈から血液を採取する一般採血と、検査対象者が、自分の手の指等に採血針を刺して血液を採取する自己採血とがある。
　一般採血により採取された血液は、採取容器に密閉された状態で医療機関又は検査機関に搬送され、そこで検査が行われている。血液を血球と血漿とに分離せずに搬送する場合には、医療機関又は検査機関にて遠心分離機により血液を血球と血漿とに分離した後に検査が行われる。また、検査対象者が行う自己採血では、採血後の血液は分離膜により血球と血漿とに分離され、この分離された状態で検査場所に輸送され、そこで検査が行われる。
　特許文献１には、自己採血により採取された血液検体の検査方法が記載されている。具体的には、１）容量を定量することなしに採取した定量すべき成分を含有する未知容量の生体試料と一定量の指示物質を含有する一定量の水性溶液とからなる定量用試料を調製する工程、２）一定量の指示物質を含有する一定量の水性溶液中の指示物質の濃度（Ｃ1）と定量用試料中の指示物質の濃度（Ｃ2）とから生体試料の希釈倍率（ａ）を求める工程、３）定量用試料中の定量すべき成分の濃度（Ｙ）を求める工程、４）上記２）で求めた生体試料希釈倍率（ａ）と上記３）で求めた定量用試料中の定量すべき物質の濃度（Ｙ）とから生体試料中の定量すべき成分を決定する工程を含む生体試料中の定量すべき成分の定量方法が記載されている。
　特許文献２には、検体中の分析対象成分量を測定し、さらに、これ以外の恒常的に検体中に元来存在する標準成分の量を測定し、この標準成分の量と、検体中での標準成分の既知濃度とから検体の量を決定し、この検体量と、分析対象成分量とから、検体中の分析対象成分の濃度を決定する定量分析法が記載されている。
　また、特許文献３には、血液希釈定量器具を用いてヒトや動物から微量血液を採取しそのまま又は希釈したのち一定量を他の機器や容器又は直接試薬に供給することが記載されている。さらに特許文献４には、希釈用水溶液中の指示物質の吸光度を利用して、生物学的試料中の定量すべき成分の濃度を定量する方法が記載されている。
　一方、血液検体を検査対象者が採取する際には、小型ナイフが具備されたランセットにて採取し、血液中の任意成分の濃度の定量に使用されているが、通常１００μＬ以上の血液検体を採取することが必要とされている。
特開２００３－１６１７２９号公報 特開２００１－３３０６０３号公報 特開２００９－１２２０８２号公報 特開２００９－１０９１９６号公報
　特許文献１に記載の方法においては、血液検体が微量である場合には、血液検体量に対する希釈液の割合を高くすることが必要になる。しかし、この場合、血液検体を希釈する前後での希釈液の体積変化率が非常に小さくなるため、内部標準物質の濃度の変化率が小さくなり、測定値の繰り返し再現性が低下するという問題がある。
　特許文献２には、健常者全血約１００μＬを多孔質膜に滴下し、血球を分離して血清を展開した後に、１５０μＬの生食等張ＰＢＳ（Phosphate-buffered saline: pH7.4)を添加して得た液を遠心分離して得られた上清を分析試料として分析しているが、１００μＬ未満の採血については記載されていない。
　特許文献３の方法では、１０μＬの血液量をマイクロピペットで正確に採取して分析しているが、採血に不慣れな患者が採取する場合には一定量を正確に採取することは難しく、誤差を含む採血で検査をした場合には測定値に誤差が含まれる結果となる。
　特許文献４に記載の測定方法は希釈倍率が１０倍程度の測定であり、希釈倍率をさらに高めて希釈血液量を十分に確保する場合には、特許文献１と同様に、測定値の繰り返し再現性が低下するという問題がある。
　上記の通り、微量の血液検体を使用する場合について測定値の繰り返し再現性が高い血液分析方法が望まれている。本発明は、５０μＬ以下の血液検体において測定値の繰り返し再現性が高い血液分析方法、並びに上記血液分析方法において使用するための血液検査キットを提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、採取された血液検体を希釈液で希釈し、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定し、血液検体中の対象成分の濃度を分析する血液分析方法において、血液検体の容量が５０μＬ以下であり、血液検体中の血漿成分の希釈倍率が１４倍以上であり、希釈液として血液中に恒常的に存在する上記標準成分を含有しない希釈液を使用するという構成によって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）　採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、
　血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、
　血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程と、
を含む、血液分析方法であって、
　血液検体の容量が５０μＬ以下であり、血液検体中の血漿成分の希釈倍率が１４倍以上であり、希釈液が、血液中に恒常的に存在する標準成分を含有しない希釈液である、血液分析方法。
（２）　採取された血液検体を希釈液で希釈する工程の後に、希釈した血液検体から血漿成分含有試料を回収する工程を含む、（１）に記載の血液分析方法。
（３）　回収する工程が、分離膜を用いる工程である、（２）に記載の血液分析方法。
（４）　希釈した血液検体から血漿成分含有試料を回収する工程の後に、血漿成分含有試料を輸送する工程を含む、（２）又は（３）に記載の血液分析方法。
（５）　血液中に恒常的に存在する標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンである、（１）から（４）の何れかに記載の血液分析方法。
（６）　血液中に恒常的に存在する標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに少なくとも１種の標準成分とである、（１）から（５）のいずれかに記載の血液分析方法。
（７）　上記さらに少なくとも１種の標準成分が、総タンパク又はアルブミンから選択される標準成分である、（６）に記載の血液分析方法。
（８）　希釈液が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを含有しない希釈液である、（５）に記載の血液分析方法。
（９）　血液中に恒常的に存在する標準成分が、ナトリウムイオンである、（５）に記載の血液分析方法。
（１０）　希釈液が、ナトリウムイオンを含有しない希釈液である、（９）に記載の血液分析方法。
（１１）　希釈液が、pH6.5～pH8.0のpH域で緩衝作用を有する緩衝液である、（１）から（１０）の何れかに記載の血液分析方法。
（１２）　希釈液が、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPESとも称する2- [4- (2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジニル] エタンスルホン酸)、TESとも称するN-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸、MOPSとも称する3-モルホリノプロパンスルホン酸、及びBESとも称する（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸からなる群から選択される緩衝剤を含む希釈液である、（１）から（１１）の何れかに記載の血液分析方法。
（１３）  上記の標準成分とは異なる標準成分の標準値を用いて求めた希釈倍率から上記の対象成分の濃度の分析を検証する工程、を更に含む、（１）から（１２）の何れかに記載の血液分析方法。
（１４）　血液検体を希釈するための希釈液と、希釈された血液検体を収容するための容器とを含む、（１）から（１３）の何れかに記載の血液分析方法において使用するための血液検査キット。
　本発明の血液分析方法及び血液検査キットによれば、血液検体の量が少なくても　測定値の繰り返し再現性が高い分析を行うことができる。
図１は、希釈された血液検体を収容するための容器の構成の一例を示す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　血液検査を行う場合、採血針を被検者の静脈に挿入して血液を採取するか、指先などの皮膚に傷をつけて、皮膚外に流出した血液を採取する方法で血液を入手している。いずれの方法も皮膚に傷をつける侵襲的な行為であるため、患者の痛みを伴うものとなる。そのため、皮膚につける傷を小さくして侵襲性を極力抑え、患者の痛みを和らげる方法で採血して分析を行う方法が多くの患者から望まれている。その場合、傷を小さくすることで痛みは小さくなるが、採血量が微量となるため、検査可能な対象成分の種類が限られてしまうという弊害がある。特許文献１の検査方法にこのような態様を当てはめて、上記弊害を解決しようとする場合、採血量に対する希釈液量の割合を高くすることによって、血液を希釈した希釈液について、検査が必要な分析対象成分の全てを検査することを可能とするのに十分な量を確保することになる。しかし、採血量が少ない場合には血液を希釈する前後での希釈液の体積変化率が非常に小さくなり、内部標準物質として使用する物質の変化率も非常に小さくなるため、計量時の計量誤差や、測定時の測定誤差が相対的に大きくなり、測定精度の悪化や、繰り返し再現性の低下などにより検査の信頼性が損なわれる可能性がある。従って、測定値の再現性の高い検査のためには、血液検体の量をある程度確保する必要があり、被検者にある程度の痛みを伴う採血方法を行う必要があった。
　特許文献２では、約１００μＬの血液量を採取しているが、１００μＬの血液を患者が自分で採血をする場合、指先などの皮膚につける傷は大きくする必要があり、患者は痛みを伴い、人によっては強い痛みとして感じる場合もある。また、傷も深いので止血が遅くなる懸念もある。さらに特許文献２では、恒常性成分量として血液中の恒常性の中心値が０．９ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオン、４．６５ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオン、７．５ｇ／１００ｍＬの総タンパクを用いて希釈倍率を測定している。しかし、患者が採血をする血液量が少なくなると、希釈液中の恒常性成分の濃度が低くなり、恒常性成分を測定する際に無視できない測定誤差を含む結果となってしまう。その結果、希釈倍率の測定値にも誤差を含むことになり、測定の信頼性が損なわれる。
　特許文献３の方法では、１０μＬと少ない血液量をマイクロピペットで一定量を正確に採取して分析しているが、患者が採取する場合には、採血に不慣れな患者も多いため一定量を正確に常に採取することは難しい。患者が採取する場合には、繰り返し採血するため、多くの血液量を皮膚外に流出されることになるか、誤差を含む採血で検査をした場合に測定値に誤差が含まれる結果となってしまう。
　特許文献４には、２波長の光を利用して、乳ビの影響を補正して測定精度をあげる技術が開示されているが、希釈倍率が１０倍程度の測定である。特許文献４の方法は、希釈した血液量が１００μＬ以下の分析には有効であるが、分析対象成分が少なく、さまざまな多くの分析対象成分の情報を入手して、臓器の状態、生活習慣の予測などに使用する目的の検査には対応できない。この場合、希釈倍率をさらに高めて希釈血液量を十分に確保する場合には、特許文献１と同様の課題に直面する。
　本発明は、上記した問題点を考慮して検討されたものである。本発明の血液分析方法及び血液検査キットによれば、採血時の侵襲性を低減して患者の負担を和らげるために採取する血液量を微量とした場合であっても、希釈倍率を高くして分析すべき希釈液量を十分に確保した時の再現性良い希釈倍率を実現でき、対象成分の分析を精度よく行うことができる。採取する血液量が微量であり、希釈倍率が高い場合において、希釈液として血液中に恒常的に存在する標準成分を含有しない希釈液を使用し、上記標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定することによって測定値の繰り返し再現性が高い分析を行うことができることは、先行技術文献からは予想できない全く意外な効果である。
［１］血液分析方法
　本発明の血液分析方法は、
　採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、
血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、
血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程と、
を含む、血液分析方法であって、
　血液検体の容量が５０μＬ以下であり、血液検体中の血漿成分の希釈倍率が１４倍以上であり、希釈液が、血液中に恒常的に存在する上記標準成分を含有しない希釈液である方法である。
　本発明では、血液検体を採取して、血液検体中の対象成分を分析する。　本発明の血液分析方法は、対象者自身が血液を採取する自己採血で実施してもよいし、医師等の有資格者が注射器を使用して血液を採取する一般採血において実施してもよい。
　好ましい態様としては、患者本人が、ランセットなどのナイフ付の器具を用いて指先などを傷つけて皮膚外にでた血液を採取する。患者の負担を減らすために、侵襲性低く血液を採取することが好ましく血液を採取するときに無痛、あるいは、痛みが非常に少ない状態で採血できることが望ましく、その場合、傷の深さ、大きさは小さいことが望ましく、採取できる血液も非常に少なくなる。従って、本発明の血液分析方法で用いる血液検体の容量（即ち、採血量）は５０μＬ以下であり、４０μＬ以下が好ましく、３０μＬ以下がより好ましく、２０μＬ以下がさらに好ましく、下限は特に限定されないが一般的には血液分析を行うための必要な血液量として５μＬ以上であることが好ましい。本発明においては、血液検体が微量の場合でも、測定精度よく対象成分の分析を行うことが可能である。
　本発明では、採取された血液検体を希釈液で希釈する。
　血液検査として、肝機能、腎機能、メタボリズムなど、特定の臓器、特定の疾患を検査する場合には、臓器や疾患に特有の複数の測定対象成分の情報を入手して、臓器の状態、生活習慣の予測などを行うために、一般的には、複数の対象成分の分析が同時に行われる。たとえば、肝臓の状態を検査するためには、一般的には、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、γ―ＧＴＰ（γグルタミルトランスペプチダーゼ）、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、総ビリルビン、総タンパク、アルブミン等の数種類以上の成分の血液中の濃度が測定される。このように、複数の対象成分を一つの血液検体から測定するためには、再測定の可能性も考慮すると、希釈された血液の量がある程度必要となる。従って、採取した血液を希釈する希釈液としては、ある程度の量の希釈液を使用することが必要になる。採取した血液量にかかわらず、使用する希釈液の量は、複数の対象成分を測定するためには、２５０μＬ以上が好ましく、３００μＬ以上がより好ましく、３５０μＬ以上がさらに好ましく、４００μＬ以上であることが最も好ましく、希釈液の量の上限は特に限定されないが、測定に有効な希釈率を実現するため、一般的には１０００μＬ以下が好ましい。
　採取する血液には、血漿成分と血球成分が含まれるが、血漿成分中の対象成分の濃度を測定するために、血液から血球成分を除いた血漿成分と希釈液とを混合することが好ましい。あらかじめ血液から血球成分を分離した後に希釈液と混合してもよいし、採取した血液を希釈液で混合してから、分離膜などを用いて血球成分を分離してもよい。
　血液が希釈された状態で長時間放置される場合には、例えば、赤血球の溶血が起こると、血球内の濃度が高い物質や酵素などが血漿あるいは血清中に溶出し、検査結果に影響を与えたり、色調により対象成分を測定する場合にヘモグロビン成分が検査に影響を与える可能性がある。従って、本発明においては、患者が採取した血液から血球を分離して血漿を回収する工程を行ってから希釈を行うこともできる。また本発明においては、採取された血液検体を希釈液で希釈する工程の後に、希釈した血液検体から血漿成分含有試料を回収することが好ましい。血漿成分含有試料とは、血漿成分と希釈液とを含む試料である。この場合、上記で回収した血漿成分含有試料を、例えば検査場所まで輸送することができる。
　血液から血球を分離して血漿を回収する方法、並びに希釈した血液から血球を分離して血漿成分含有試料を回収する方法は、特に制限はない。抗凝固剤入り採血管で採血した後に遠心分離を行って血液を血球成分と血漿成分に分離してもよいし、血液成分に圧力を加えて濾過膜などの分離膜を通過させて、血球成分を分離膜に捕捉させて血液から血球成分を分離してもよい。この場合、抗凝固剤を用いてもよい。血漿成分を回収する工程は、上記の中でも好ましくは、分離膜を用いる工程である。また、測定の精度を確保するために、血球成分を除いた血液の溶液部分と物理的に隔離することが好ましく、この場合、具体的には、特開２００３－２７０２３９号公報に記載の逆流防止手段を有する生体試料分離器具等を用いることができる。
　本発明では、侵襲性低く血液を採取することが好ましく、微量の血液検体から血液の希釈液を調製することが重要であり、採取した血液を希釈液で希釈する際における、血液検体中の血漿成分の希釈倍率が高いことが要求される。ここでいう希釈倍率とは、血液成分から血球成分を除去した血漿成分の希釈倍率であり、本発明における希釈倍率は、１４倍以上であり、１７倍以上が好ましく、２１倍以上がより好ましく、２５倍以上が更に好ましく、３０倍以上が特に好ましく、４０倍以上が最も好ましく、上限は特に限定されないが、高い精度の測定を可能にするために、一般的には１００倍以下が好ましい。実際の血液を希釈液で希釈する場合の血液の希釈倍率では、６倍以上からの高倍率でも、希釈液で希釈した場合の希釈倍率測定の繰り返し再現性が良好であり、患者が採血を行うときの痛みを少なくするためには採血量を少なくなるため、血液の希釈倍率としては、８倍以上が好ましく、１０倍以上がより好ましく、１３倍以上が更に好ましく、１８倍以上が最も好ましく、上限は特に限定されないが、高い精度の測定を可能にするために、一般的には５０倍以下が好ましい。
　上記のように、血漿成分の希釈倍率の高い希釈血漿の希釈後の対象成分について、希釈前の血液の血漿中に存在する濃度を正確に分析するためには、希釈液中にあらかじめ存在する物質の濃度の変化率から求める方法では、濃度の変化の割合が非常に小さくなるために測定誤差が大きく、また、測定の再現性が悪化する弊害がある。従って本発明では、測定精度を高めるために、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する。なお、血液中に恒常的に存在する標準成分のことは、外部標準物質とも称する。
　血液中に恒常的に存在する標準成分は、たとえば、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、総タンパク、及びアルブミン等が挙げられる。血液検体の血清及び血漿中に含まれるこれらの標準成分の濃度は、ナトリウムイオン濃度は、１３４～１４６ｍｍｏｌ／リットル（平均値：１４２ｍｍｏｌ／リットル）、塩化物イオン濃度は、９７～１０７ｍｍｏｌ／リットル（平均値：１０２ｍｍｏｌ／リットル）、カリウムイオン濃度は、３．２～４．８ｍｍｏｌ／リットル（平均値：４．０ｍｍｏｌ／リットル）、マグネシウムイオン濃度は、０．７５～１．０ｍｍｏｌ／リットル（平均値：０．９ｍｍｏｌ／リットル）、カルシウムイオン濃度は、４．２～５．１ｍｍｏｌ／リットル（平均値：４．６５ｍｍｏｌ／リットル）、総タンパク濃度は、６．７～８．３ｇ／１００ｍＬ（平均値：７．５ｇ／１００ｍＬ）、アルブミン濃度は、４．１～５．１ｇ／１００ｍＬ（平均値：４．６ｇ／１００ｍＬ）である。本発明では、患者の痛みを和らげるために採血する血液量が非常に少ない場合における対象成分の測定を可能にするためのものであり、微量の血液を希釈液で希釈した際に、希釈液中に存在する「血液中に恒常的に存在する標準成分」の濃度を精度よく測定する必要がある。希釈倍率が高くなると、もともと血液中に存在する成分の希釈液中の濃度が低下し、希釈倍率によっては濃度測定時に、測定誤差を含む可能性がある。従って、これらの「血液中に恒常的に存在する標準成分」の中で、微量な血液成分を希釈倍率高く希釈したときに、上記標準成分を十分に精度高く検出できるために、微量な血液中に高い濃度で存在する標準成分を測定することが好ましい。本発明では、血液検体中に恒常的に存在する成分の中でも高濃度に存在する、ナトリウムイオン（Ｎａ+）又は塩化物イオン（Ｃｌ-）を用いることが好ましい。本発明では、上記した血液中に恒常的に存在する標準成分の中でも血液中に存在する量が一番高いナトリウムイオンを測定することが最も好ましい。ナトリウムイオンは、平均値が標準値（基準範囲の中央値）を表し、その値は、１４２ｍｍｏｌ／リットルであり、血漿中の総陽イオンの９０％以上を占める。
　患者である被検者の血液中における血漿成分の占有率は、容積の比率で約５５％であるが、被検者の塩分摂取量の変化などで変動し、また被検者ごとにも異なる。そのため、本発明においては、血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定し、決定された希釈倍率を用いて血液検体中の対象成分の濃度を分析する。希釈倍率を決定する方法としては、血漿の希釈液中の外部標準物質（例えば、ナトリウムイオンなど）の測定値（濃度Ｘ）と、血漿中の上記外部標準物質（例えば、ナトリウムイオンなど）の既知濃度値（濃度Ｙ；ナトリウムイオンの場合には１４２ｍｍｏｌ／リットル）とから、血液検体中の血漿成分の希釈倍率（Ｙ／Ｘ）を算出することにより希釈倍率を求めることができる。この希釈倍率を用いて、血漿の希釈液中の対象成分の測定値（濃度Ｚ）を測定し、この測定値に希釈倍率を掛け合わせることにより、実際に血液検体中に含まれる分析対象成分の濃度［Ｚ×（Ｙ／Ｘ）］を測定することが可能となる。
　また、血液中の分析対象成分の濃度分析が正常に行われているか検証するために、血液中に恒常的に存在する異なる２つ以上の成分を標準成分として用いて、それぞれ独立に血液検体中の血漿成分の希釈倍率を求めて、その値が一致することを確認することが好ましい。一致するとは、２つの測定値（ａ，ｂ）において、それらの差のそれらの平均値に対する割合、すなわち｜ａ－ｂ｜／｛（ａ＋ｂ）／２｝×１００が、２０％以下であることであり、好ましくは１０％以下であることであり、より好ましくは５％以下であることである。好ましい一態様としては、ナトリウムイオン以外の血漿中に恒常的に存在する標準成分から求めた希釈倍率が、ナトリウムイオン濃度から求めた希釈倍率と一致することを確認することによって、血漿の希釈液中のナトリウムイオン濃度の測定値から求めた希釈倍率を用いて行った血液中の分析対象成分の濃度分析が正常に行われていることの検証が可能となる。塩化物イオンの測定法は、イオン選択電極を用いた電極法（Ｉｏｎ　Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ：ＩＳＥ）や、アミラーゼなどの酵素を用いる酵素法、硝酸銀滴定法などがあり、測定試料の特性や感度、試料量などに応じて適宜使用する方法を選択することができる。また、ナトリウムイオン及び塩化物イオン以外の血漿中に恒常的に存在する標準成分の例としては、総タンパク又はアルブミンから選択されることが好ましく、総タンパクから選択されることがより好ましく、総タンパクの測定法としては、ビューレット法や、紫外吸収法、ブレッドフォード法、ローリー法、ビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　Ａｃｉｄ：ＢＣＡ）法、蛍光法など公知の方法があり、測定試料の特性や感度、試料量などに応じて適宜使用する方法を選択することができる。
　ナトリウムイオン濃度及び塩化物イオン濃度は、例えば、炎光光度法、ガラス電極法、滴定法、イオン選択電極法、酵素活性法等により測定することができる。
　本発明において、血液検体中の対象成分の濃度を分析するとは、対象成分の濃度を決定すること（即ち、対象成分を定量すること）、又は対象成分の濃度が所定の基準値以上であるか所定の基準値以下であるかを決定すること、ある程度の濃度を含むことを検出する定性を行うこと、などを包含し、分析の形態は特に限定されない。
　本発明においては、血液中に恒常的に存在する標準成分（以下、恒常性物質とも言う）を希釈液で希釈後に測定し、上記した通り希釈倍率を決定して、血液検体中の対象成分の濃度を分析することができる。血液検体を希釈するための希釈液は、希釈倍率を求めるために使用する「血液中に恒常的に存在する標準成分」を含有しない希釈液である。本明細書において「含有しない」とは、「実質的に含有しない」ことを意味する。ここで、「実質的に含有しない」とは、希釈倍率を求める時に使用する恒常性物質をまったく含まないか、あるいは含まれていたとしても、血液検体を希釈した後の希釈液の恒常性物質の測定に影響を及ぼさない程度の極微量の濃度で含まれる場合を意味する。恒常性物質として、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを用いる場合には、希釈液としては、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを実質的に含有しない希釈液を使用する。
　本発明においては、患者が採血した血液検体を希釈した後、医療機関又は検査機関に輸送して対象成分の濃度を分析することができる。採血から分析までには長時間かかる可能性があることから、その間に、血液の希釈液中において対象成分が分解や変性することを防止することが好ましい。血液のｐＨは、健常者では通常ｐＨ７．３０～７．４０程度で一定に保たれている。従って、対象成分が分解や変性を防止するために、希釈液は、ｐＨ６．５～ｐＨ８．０、好ましくはｐＨ７．０～ｐＨ７．５、更に好ましくはｐＨ７．３～ｐＨ７．４のｐＨ域で緩衝作用を有する緩衝液であることが好ましく、希釈液は、ｐＨの変動を抑える緩衝成分を含有する緩衝液であることが好ましい。
　緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液（Ｎａ）、リン酸緩衝液（Ｎａ）、クエン酸緩衝液（Ｎａ）、ホウ酸緩衝液（Ｎａ）、酒石酸緩衝液（Ｎａ）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル)アミノエタン）緩衝液（Ｃｌ）、ＨＥＰＥＳ（[2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸]）緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（Ｎａ）等が知られている。これらの中でｐＨ７．０～ｐＨ８．０付近の緩衝液としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液が代表的なものである。しかしながら、リン酸緩衝液はリン酸のナトリウム塩が含まれていること、Ｔｒｉｓ緩衝液は、解離ｐＫａ（Ｋａは酸解離定数）は８．０８であるため、ｐＨ７．０～ｐＨ８．０付近で緩衝能を持たせるためには通常は塩酸と組み合わせて使用されること、ＨＥＰＥＳのスルホン酸の解離のｐＫａは７．５５であるが、イオン強度一定での緩衝溶液を調整するため、通常は水酸化ナトリウムと塩化ナトリウムとＨＥＰＥＳの混合物が用いられることから、これらはｐＨを一定に保つ作用を有する緩衝液としては有用であるが、外部標準物質として用いることが好ましい物質のナトリウムイオンあるいは塩化物イオンを含有するため、本発明への適用は好ましくない。
　本発明で用いる希釈液としては、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを含有しない緩衝液を用いることが好ましい。本発明で用いる希釈液は好ましくは、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール（ＡＭＰ）、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノアルコール化合物、並びにＧｏｏｄ'ｓ緩衝液（グッドバッファー）でｐＫａが７．４付近の緩衝剤であるHEPESとも称する2- [4- (2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジニル] エタンスルホン酸) （ｐＫａ＝７．５５）、TESとも称するN-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．５０）、MOPSとも称する3-モルホリノプロパンスルホン酸（ｐＫａ＝７．２０）、及びBESとも称する（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸（ｐＫａ＝７．１５）からなる群から選択される緩衝剤を含む希釈液である。上記の中でも、２－アミノー２－メチル－１－プロパノール（ＡＭＰ）とHEPES、TES、MOPS又はＢＥＳとの組み合わせが好ましく、さらに、２－アミノー２－メチル－１－プロパノール（ＡＭＰ）とHEPESとの組み合わせが最も好ましい。
　上記緩衝液を調製するためには、アミノアルコールとＧｏｏｄ‘ｓ緩衝液を１：２～２：１、好ましくは１：１．５～１．５：１、更に好ましくは１：１の濃度比で混合すればよい。緩衝液の濃度は限定されないが、アミノアルコールまたはＧｏｏｄ‘ｓ緩衝液の濃度は、０．１～１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、１～５００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１０～１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
　緩衝液中には、分析対象成分を安定に保つことを目的にキレート剤、界面活性剤、抗菌剤、防腐剤、補酵素、糖類等が含有されていてもよい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩、シュウ酸塩等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン界面活性剤が挙げられる。防腐剤としては、たとえば、アジ化ナトリウムや抗生物質等が挙げられる。補酵素としては、ピリドキサールリン酸、マグネシウム、亜鉛等が挙げられる。赤血球安定化剤の糖類としては、マンニトール、デキストロース、オリゴ糖等が挙げられる。特に、抗生物質の添加により、手指採血時に手指表面から一部混入する細菌の増殖を抑えることができ、細菌による生体成分の分解を抑制し、生体成分の安定化を図ることができる。
　血液検体に全血を使用する場合には、希釈した血液中の血球成分をフィルター濾過する必要から、緩衝液の浸透圧を血液と同等（２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ（ｍＯｓｍ／ｋｇは、溶液の水１ｋｇが持つ浸透圧で、イオンのミリモル数をあらわす））またはそれ以上とすることにより血球の溶血を防止することができる。浸透圧は、対象成分の測定、および血液中に恒常的に存在する標準成分の測定に影響しない塩類、糖類又は緩衝剤等により、等張に調整することができる。
　本発明における分析の対象成分は限定されず、血液中に含まれるあらゆる物質が対象となる。例えば臨床診断に用いられる血液中の生化学検査項目、腫瘍マーカーや肝炎のマーカー等各種疾患のマーカー等が挙げられ、タンパク質、糖、脂質、低分子化合物等が挙げられる。また、測定は物質濃度だけでなく、酵素等の活性を有する物質の活性も対象となる。各対象成分の測定は、公知の方法で行うことができる。
［２］血液検査キット
　本発明の血液検査キットは、血液検体を希釈するための希釈液と、希釈された血液検体を収容するための容器とを含む、上記した本発明の血液分析方法において使用するための血液検査キットである。
　容器の材料は、破損しにくさ、衛生面、価格等の観点から、合成樹脂であることが好ましい。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂（ABS樹脂）、アクリロニトリルスチレン樹脂（AS樹脂）、アクリル樹脂 (PMMA)、ポリカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンゴム等が挙げられる。
　本発明の血液検査キットの一例としては、血液検体を希釈するための希釈液、希釈液が収容された第一の収容器具、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具、皮膚に傷をつけて血液を皮膚外に染み出させる針や、ランセット、傷に貼る絆創膏又は消毒部材（例えば、イソプロパノール（７０質量％イソプロパノールなど）又はエタノールなどを含浸させた不織布）、取扱説明書、等を備えることができる。
　血液検体を希釈するための希釈液としては、本明細書中上記した希釈液を使用することができる。
　第一の収容器具、及び第二の収容器具は、１つの器具を第一の収容器具及び第二の収容器具として兼用してもよいし、別々の器具を備える態様であってもよい。収容器具内にある血液を希釈した希釈液を、患者、あるいは、希釈倍率の測定や分析対象成分の分析を行う測定者に確認可能とするために、第一の収容器具、及び第二の収容器具は、透明な素材でできていることが好ましい。なお、本発明で言う透明とは、観測者が内部の液量を確認できる程度に透明であればよく、半透明などを含む概念である。
　血漿を分離するための分離器具としては、分離膜である態様が好ましく、血球成分を分離可能な細孔を有するフィルタがより好ましい。分離器具を保持する保持器具は、ガスケットである態様が好ましい。また、封止器具としては、収容器具が筒状の形状をした器具などの場合には、開口に蓋をすることが可能なキャップや、螺旋状の溝を有する蓋、あるいはゴム栓などを使用することができる。
　本発明は、微量の血液である５０μＬ以下の採血量であっても、測定精度よく分析対象成分を分析できる方法を実現可能とするものであり、患者に、５０μＬ以下の少ない採血量でも精度よく測定することが可能であるとの情報が記載された取り扱い説明書を含むキットであることが好ましい。
　希釈液が収容された第一の収容器具、希釈液で希釈された血液検体から血漿を分離回収するための分離器具、分離器具を保持するための保持器具、回収した血漿を収容するための第二の収容器具、及び収容した血漿を第二の収容器具内に維持するための封止器具についての具体的な構成例としては、例えば、特許第３５９７８２７号公報の図１から図１３に記載された器具を使用することができる。特許第３５９７８２７号公報の図１を、本願の図１として援用する。
　血液分離器具１は採血容器２（希釈液が収容された第一の収容器具）と、採血容器２に嵌挿可能な筒体３（回収した血漿を収容するための第二の収容器具）と、筒体３に冠着可能なキャップピストン４と、キャップピストン４の下端に設けられた密閉蓋５（封止器具）とを備え、使用前は、図１に示すように、採血容器２の上端開口部はキャップ６によりパッキン７を介して密閉されている。本発明における希釈された血液検体を収容するための容器は、図１の構成においては、採血容器２と筒体３の組み合わせに対応する。即ち、希釈された血液検体を収容するための容器は１個でも２個以上の組み合わせでもよい。
　採血容器２は透明な材質製で円筒状を成し、その上端部には、外面に螺子部８が形成され、内面に係止部９が突設されている。また、採血容器２の下端部には、逆円錐状の底部１０が形成され、底部１０の周囲に円筒状の脚部１１が形成されている。脚部１１は、血液の分析検査時に使用するサンプルカップと同一外径を有しており、好ましくは、その下端の対向する位置にそれぞれ鉛直方向にスリット溝１２が形成されている。さらに、採血容器２内には、図１に示されているように、所要量、例えば、５００ｍｍ3の希釈液１３が予め入れられていてもよい。
　筒体３は透明な材質製で円筒状を成し、その上端部には拡径部１４が形成されている。拡径部１４は薄肉部１５を介して本体部１６と接続されている。筒体３の下端部には、縮径部１８が形成され、縮径部１８の内面には係止突起部１９が形成されている。さらに、縮径部１８の下端部には外鍔部２０（保持器具）が形成され、外鍔部２０の下端開口部は濾過膜２１（分離器具）により覆われ、濾過膜２１は血液中の血漿の通過を許容し、血球の通過を阻止するようになっている。
　縮径部１８の外周にはシリコンゴム製のカバー２２が装着されている（図１）。
　キャップピストン４は、略円筒状の摘み部２６と、摘み部２６と同心で下方に延びる心棒部２７とで構成されている。摘み部２６の内側上端部には筒体３の拡径部１４が嵌合可能な円筒状の空間２８が形成され、また、その下方は螺刻され、螺子に螺合可能となっている。心棒部２７はその下端部２９がピン状に形成され、下端部２９に密閉蓋５が着脱可能に設けられている（図１参照）。密閉蓋５はシリコンゴム製である。
　上記した器具による血液分離方法の詳細は、特許第３５９７８２７号公報の段落番号００２３～００２６並びに図１２及び図１３に記載されており、その内容は本明細書に引用される。
　本発明の血液検査キットに含まれる各々の要素の個数は特に限定されず、各々１個でもよいし、２個以上の複数でもよい。
　本発明の血液検査キットは、血液検体を希釈するための希釈液と、希釈された血液検体を収容するための容器と、さらに所望により上記した任意の要素とを、これらを収納する収納容器に収納した形態として提供することができる。
　以下の実施例により本発明を説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（参考例１）
１．微量血液検体を希釈した希釈液の調製
　ボランティアの患者から、インフォームドコンセントを行った後に静脈から注射器で採取した７ｍLの血液を採血管に得た。この採血した血液から、８０μＬ、６０μＬ、４０μＬ、３０μＬ、２０μＬをそれぞれ１０回ずつマイクロピペットで正確に秤量し、下記の通り調製した希釈液－１の３６０μＬにそれぞれ混合した。得られた混合物をフィルターを通過させることにより血球成分を分離して、希釈血漿を得た。得られた希釈血漿を試料として、生化学自動分析装置を用いて、生体成分の各濃度を測定した。
（希釈液－１の組成）
　希釈液－１を以下の組成で調製した。浸透圧は、ＯＳＭＯＡＴＡＴ　ＯＭ－６０４０（アークレイ（株）社製）を用いて測定した値を表示した。浸透圧の単位は、溶液の水１ｋｇが持つ浸透圧で、イオンのミリモル数をあらわす。
　　HEPES ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　２－アミノー２－メチル－１－プロパノール（ＡＭＰ）　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　D-マンニトール　２８４ｍｍｏｌ／Ｌ
　　塩化リチウム　　１ｍｍｏｌ／Ｌ
　　ＥＤＴＡ－２Ｋ　０．８ｍｍｏｌ／Ｌ
　　ＰＡＬＰ（ピリドキサールリン酸）　０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ
　　チアベンダゾール　０．０００１質量％
　　アミカシン硫酸塩　０．０００３質量％
　　硫酸カナマイシン　０．０００５質量％
　　メロペネム三水和物　０．０００５質量％
　　浸透圧　　３５５ｍＯｓｍ／ｋｇ
　　ｐＨ　　７．４
２．ナトリウムイオン濃度の測定
　１．で調製したそれぞれの希釈液について、ナトリウムイオン濃度の測定を行った。測定には、β－ガラクトシダーゼがナトリウムで活性化することを利用し、それぞれの希釈液中のナトリウムイオン濃度とβ－ガラクトシダーゼ活性が比例関係にあることを利用した酵素活性法により測定した。具体的には、血液の希釈液をナトリウムイオンを含まない精製水で５倍希釈した後、３μＬを秤量し、下記のように調製した第一試薬５２μＬを加えて、３７℃で５分間加温した。この混合物に、下記のように調製した第二試薬を２６μＬ加え、１分間の吸光度の変化をJCA-BM6050型生化学自動分析装置（日本電子（株）社製）を用いて主波長４１０nm、副波長６５８nmで吸光度を測定することにより求めた。あらかじめ作成した検量線から、ナトリウムイオン濃度を測定した。
（ナトリウムイオン測定試薬の調製）
　以下の組成のナトリウムイオン測定試薬を調製した。
　第一試薬
　　HPEPS・LiOH（ｐH８．０）　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　　Ｄ－マンニトール　６０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　Ｎ－アセチルシステイン　３０ｍｍｏｌ／Ｌ
　　硫酸マグネシウム　　１．５２ｍｍｏｌ／Ｌ
　　β－ガラクトシダーゼ １．１ｋＵ／Ｌ
　　Ｔｒｉｔｏｎ(登録商標)Ｘ－１００　０．０５質量％
　第二試薬
　　HPEPS・LiOH（ｐH８．０）　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　　ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド　１５ｍｍｏｌ／Ｌ
　上記のように求めた希釈液中のナトリウムイオン濃度（Ｘ）と、血液の血漿中のナトリウムイオン濃度の標準値（Ｙ）とからそれぞれの希釈液の希釈倍率（Ｙ／Ｘ）を求め、採血した血液（８０μＬ、６０μＬ、４０μＬ、３０μＬ、２０μＬ）のそれぞれについて１０本ずつ作製した試料の希釈倍率の平均値と希釈倍率の変動係数であるＣＶ（coefficient of variation）（％）を求めた。結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（希釈液中のリチウムイオンの測定）
　希釈液に添加したリチウムイオンの測定は、キレート比色法（ハロゲン化ポリフィリンキレート法：パーフルオロ-5,10,15,20-テトラフェニル-21H,23H,-ポリフィリン）により行った。具体的には、血液の希釈液を、リチウムイオンを含まない精製水で４．５倍に希釈した後、５μＬを秤量し下記のように調製した第三試薬５５μＬを加えて、３７℃で１０分間加温した。この混合物について、１分間の吸光度の変化を、JCA-BM6050型生化学自動分析装置（日本電子（株）社製）を用いて、主波長５４５nm、副波長５９６nmで吸光度を測定することにより求めた。あらかじめ作成した検量線から、リチウムイオンの濃度を測定した。
（リチウムイオン用測定試薬の調製）
　以下の組成のリチウムイオン用測定試薬を調製した。
　第三試薬
　　パーフルオロ-5,10,15,20-テトラフェニル-21H,23H,-ポリフィリン　０．０５質量％
　　ジメチルスルホキシド　　５質量％
　　トリエタノールアミン　　２質量％
　　ポリエチレングリコール－ｔ－オクチルフェニルエーテル　　２質量％
　　ドデシル硫酸ナトリウム　　２質量％
　上記のように求めた血液検体を希釈した希釈後の希釈液中のリチウムイオン濃度（Ａ）と、血液を希釈する前の希釈液中のリチウムイオン濃度（Ｂ）とからそれぞれの希釈液の希釈倍率［Ｂ／（Ｂ－Ａ）］を求め、採血した血液（８０μＬ、６０μＬ、４０μＬ、３０μＬ、２０μＬ）のそれぞれについて１０本ずつ作製した試料の希釈倍率の平均値と希釈倍率の変動係数であるＣＶ（％）を求めた。結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１および表２の結果から、希釈液中に存在する標準物質を用いて希釈倍率を測定する場合には、採血量が４０μＬ以下で、希釈倍率が１４倍以上であると、繰り返し再現性のばらつきが大きくなるが、血液中に存在する恒常性のある成分であるナトリウムイオンを標準物質に用いた場合には、採血量８０μＬで希釈倍率９．１倍から、採血量２０μＬで希釈倍率３３．７倍においても、希釈倍率の測定値の繰り返し再現性は非常に良好であることがわかる。
（実施例１）
１．ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の測定
　参考例１で注射器を用いて静脈から採血した直後に、採血した同じ患者の指先からランセットを用いて血液を指先の皮膚外ににじませた後に、２０μＬ～４０μＬ程度の液体を吸収できるスポンジを用いて血液を患者に吸い取ってもらい、参考例１で使用した希釈液と同じ組成の希釈液３６０μＬ中に血液を吸収したスポンジを浸し、十分にスポンジから血液を希釈液中に抽出し、フィルターで濾過して血球成分を分離し、血液検体の血漿成分の希釈液を得た。希釈液を密閉して、検査が可能な別の施設へと搬送し、その後、希釈液を取り出して、参考例１の血液中のナトリウムイオンを用いた希釈倍率の測定方法と同様にして、希釈倍率を測定したところ、２２．３倍の希釈倍率であった。このことから、採血量は３０μＬ弱であることがわかった。この希釈検体中のＡＬＴ、ＡＳＴの濃度を、市販の測定キット（トランスアミナーゼＣII－テストワコー：和光純薬工業（株）社製）を用いて測定したところ、参考例１の採血量３０μＬでのサンプルでナトリウムイオン濃度を用いて測定した希釈倍率を基にして分析した、ＡＬＴ、ＡＳＴの測定値と、ほぼ一致した結果が得られた。
（実施例２）
　実施例１において、ナトリウムイオンを用いた血液検体中の血漿成分の希釈倍率の測定を行った希釈液を用いて、下記に示す方法により、塩化物イオンの濃度を測定した。
（希釈液中の塩化物イオン濃度の測定）
　イオン選択電極（ＩＳＥ）を用いて塩化物イオンの測定を行った。塩化物イオンに選択的に応答するイオン選択電極と参照電極間に生体試料を流し、両電極間に生じた起電圧より塩化物イオン濃度を算出した。
　血漿の希釈液中のナトリウムイオン濃度の測定から求めた血液検体中の血漿成分の希釈倍率に対して、希釈液中の塩化物イオン濃度の測定値と、血液中に恒常的に存在する塩化物イオン濃度の平均値１０２ｍｍｏｌ／Ｌとから求めた希釈倍率が、同じ値であるとの結果が得られた。これにより、実施例１のナトリウムイオン濃度から求めた希釈倍率の測定が正常に行われていることがわかり、測定の検証が可能であることが分かった。
１　血液分離器具
２　採血容器
３　筒体
４　キャップピストン
５　密閉蓋
６　キャップ
７　パッキン
８　螺子部
９　係止部
１０　底部
１１　脚部
１２　スリット溝
１３　希釈液
１４　拡径部
１５　薄肉部
１６　本体部
１８　縮径部
１９　係止突起部
２０　外鍔部
２１　濾過膜
２２　カバー
２６　摘み部
２７　心棒部
２８　空間
２９　下端部
３１　段差部
３３　上端部
３４　頂部

Claims (14)

  1. 　採取された血液検体を希釈液で希釈する工程と、
    　血液中に恒常的に存在する標準成分の標準値を用いて希釈倍率を決定する工程と、
    　血液検体中の対象成分の濃度を分析する工程と、
    を含む、血液分析方法であって、
    　前記血液検体の容量が５０μＬ以下であり、前記血液検体中の血漿成分の希釈倍率が１４倍以上であり、前記希釈液が、血液中に恒常的に存在する前記標準成分を含有しない希釈液である、血液分析方法。
  2. 　前記採取された血液検体を希釈液で希釈する工程の後に、希釈した血液検体から血漿成分含有試料を回収する工程を含む、請求項１に記載の血液分析方法。
  3. 　前記回収する工程が、分離膜を用いる工程である、請求項２に記載の血液分析方法。
  4. 　前記希釈した血液検体から血漿成分含有試料を回収する工程の後に、前記血漿成分含有試料を輸送する工程を含む、請求項２又は３に記載の血液分析方法。
  5. 　血液中に恒常的に存在する前記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンである、請求項１から４の何れか一項に記載の血液分析方法。
  6. 血液中に恒常的に存在する前記標準成分が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンと、さらに少なくとも１種の標準成分とである、請求項１から５のいずれか１項に記載の血液分析方法。
  7. 前記さらに少なくとも１種の標準成分が、総タンパク又はアルブミンから選択される標準成分である、請求項６に記載の血液分析方法。
  8. 　前記希釈液が、ナトリウムイオン又は塩化物イオンを含有しない希釈液である、請求項５に記載の血液分析方法。
  9. 　血液中に恒常的に存在する前記標準成分が、ナトリウムイオンである、請求項５に記載の血液分析方法。
  10. 　前記希釈液が、ナトリウムイオンを含有しない希釈液である、請求項９に記載の血液分析方法。
  11. 　前記希釈液が、pH6.5～pH8.0のpH域で緩衝作用を有する緩衝液である、請求項１から１０の何れか一項に記載の血液分析方法。
  12. 　前記希釈液が、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、2-エチルアミノエタノール、N-メチル-D-グルカミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンからなる群から選択されるアミノアルコール化合物、並びにHEPESとも称する2- [4- (2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジニル] エタンスルホン酸)、TESとも称するN-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸、MOPSとも称する3-モルホリノプロパンスルホン酸、及びBESとも称する（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸からなる群から選択される緩衝剤を含む希釈液である、請求項１から１１の何れか一項に記載の血液分析方法。
  13. 　前記標準成分とは異なる標準成分の標準値を用いて求めた希釈倍率から前記対象成分の濃度の分析を検証する工程、を更に含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の血液分析方法。
  14. 　血液検体を希釈するための希釈液と、希釈された血液検体を収容するための容器とを含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の血液分析方法において使用するための血液検査キット。
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