WO2017002929A1 - 植物の生長を促進する方法、植物生長促進物質を製造する方法及びこれらに利用されるタンパク質 - Google Patents

植物の生長を促進する方法、植物生長促進物質を製造する方法及びこれらに利用されるタンパク質 Download PDF

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amino acid
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protein
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正章 森川
ジョグ ラフール
京子 三輪
雅之 菅原
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Hokkaido University NUC
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Hokkaido University NUC
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting plant growth, a method for producing a plant growth promoting substance, and a protein used in these methods.
  • the duckweed plant (Lemnaceae) is a freshwater aquatic plant that inhabits almost the entire earth.
  • the use of duckweed plants, especially duckweed (Lemna minor, English name duckweed) in the industry has mainly been related to water purification of industrial wastewater using duckweed containing rhizosphere microorganisms (for example, Patent Document 1).
  • a technique using a duckweed family plant as a genetic recombination host for production of useful proteins has been developed (Patent Document 2 and Patent Document 3).
  • duckweed plants are extremely nutritious plants having about 60% starch and more than 15% protein per plant weight, and duckweed plants are used as biomass, especially biomass energy.
  • cultivation of duckweed plants using urban sewage, factory effluent, agricultural effluent, etc. combined with the conventionally known water purification capacity, can achieve energy-saving water purification and biomass production at the same time. And attractive.
  • P23 strain Acetobacter calcoaceticus P23 (hereinafter referred to as P23 strain) is PGPB, and that the polysaccharide secreted by P23 strain is a plant growth promoting compound (Plant Growing Compound, PGPC) Patent Document 1).
  • JP 2009-247279 A JP-T-2001-513325 Special table 2009-523431
  • the present invention aims at effective utilization of microorganisms having a function of promoting the growth of plants, particularly duckweed plants.
  • the present inventors found in the genome of the P23 strain a gene group related to biosynthesis of PGPC that promotes duckweed growth (referred to as a PGPC-related gene cluster), and completed the following inventions.
  • a method for promoting plant growth comprising a step of allowing a microorganism (except Acinetobacter calcoaceticus P23) capable of expressing at least one of the following genes 1) to 5) to coexist with a plant .
  • a microorganism except Acinetobacter calcoaceticus P23
  • a protein consisting of an amino acid sequence to which 1 to several amino acids are added the gene encoding a protein involved in biosynthesis of a plant growth promoting substance
  • a gene encoding a protein involved in biosynthesis of a promoter 5) A shown in SEQ ID NO: 5
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one to several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 have been deleted or substituted or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids of the amino acid sequence shown in No. 2 are deleted or substituted, or an amino acid sequence in which one to several amino acids are added to the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2.
  • a gene encoding a protein involved in biosynthesis of a promoter 5) A shown in SEQ ID NO: 5
  • a method for producing a plant growth promoting substance comprising a step of growing a microorganism (excluding Acinetobacter calcoaceticus P23) capable of expressing at least one of the following genes 1) to 5): 1) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one to several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 have been deleted or substituted or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 A protein consisting of an amino acid sequence to which 1 to several amino acids are added, the gene encoding a protein involved in biosynthesis of a plant growth promoting substance 2) a protein consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a sequence A protein comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids of the amino acid sequence shown in No.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one to several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 have been deleted or substituted or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids of the amino acid sequence shown in No. 2 are deleted or substituted, or an amino acid sequence in which one to several amino acids are added to the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2.
  • a gene encoding a protein involved in biosynthesis of a promoter 5) A shown in SEQ ID NO: 5
  • the method according to (6) or (7) comprising a step of growing a microorganism having all the genes of 1) to 5).
  • a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or shown in SEQ ID NO: 4 A protein comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted or substituted, or an amino acid sequence having one to several amino acids added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, Protein involved in biosynthesis of growth promoting substance 3) Tan consisting of amino acid sequence shown in SEQ ID NO:
  • new microorganisms other than the P23 strain having a PGPC-related gene can be used, and the efficiency of biomass production can be enhanced by promoting the growth of plants, particularly duckweed plants.
  • the range of microbial species that can promote plant growth can be expanded by producing recombinant microorganisms introduced with PGPC-related genes using genetic engineering techniques. Utilization of microorganisms suitable for plants expected to promote production or growth becomes possible.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of mcs-nov obtained by incorporating a PGPC / P23 gene cluster containing P23-2757 to 2761 into the pBBR-1 MCS-2 vector.
  • E. No recombination It is a graph which shows transition of the number of fronds of duckweed cultured for 10 days after attaching E. coli, ADP1 or P23 strain.
  • E. No recombination It is a graph which shows the chlorophyll content of the duckweed cultured for 10 days after attaching E. coli, ADP1 or P23 strain.
  • E. No recombination It is a graph which shows the number of fronds of a duckweed cultured for 10 days after attaching E.
  • FIG. 3 is a graph showing the number of leafy bodies, damp weight and root length of duckweed cultured for 10 days after attaching E. coli mcs-nov, ADP1 mcs-nov or ADP1 mcs2. It is a graph which shows transition of the number of leaf-like bodies of duckweed cultured for 10 days in a culture solution added with a polysaccharide derived from culture supernatant of P23 strain, ADP1 mcs-nov or ADP1 mcs2.
  • FIG. 3 is a graph showing the number of duckweed fronds, wet weight and root length cultured for 10 days in a culture solution to which a polysaccharide derived from culture supernatant of P23 strain, ADP1 mcs-nov or ADP1 mcs2 is added.
  • 6 is a graph showing the change in the number of leafy bodies of duckweed cultured for 10 days after adhering a recombinant bacterium (ADP1 mcs-nov3), ADP1 mcs-nov or ADP1 mcs2 introduced with P23-2759-2761.
  • FIG. 1 It is a graph which shows the number of foliar bodies, the wet weight, and the length of the duckweed cultured for 10 days after attaching ADP1 mcs-nov3, ADP1 mcs-nov or ADP1 mcs2. It is a graph which shows the transition of the number of fronds of duckweed cultured for 10 days in a culture solution to which a polysaccharide derived from culture supernatant of ADP1 mcs-nov3, ADP1 mcs-nov or ADP1 mcs2 is added.
  • FIG. 1 shows the number of foliar bodies, the wet weight, and the length of the duckweed cultured for 10 days after attaching ADP1 mcs-nov3, ADP1 mcs-nov or ADP1 mcs2. It is a graph which shows the transition of the number of fronds of duckweed cultured for 10 days in a culture solution to which a polysaccharide derived from culture supernatant
  • FIG. 3 is a graph showing the number, wet weight, and root length of duckweed cultured for 10 days in a culture solution to which polysaccharides derived from culture supernatant of ADP1 mcs-nov3, ADP1 mcs-nov or ADP1 mcs2 are added.
  • the first aspect of the present invention promotes plant growth, including the step of allowing a microorganism (except P23 strain) capable of expressing at least one of the following genes 1) to 5) to coexist with a plant: Regarding the method.
  • PGPC 2 a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or A protein comprising an amino acid sequence in which 1 to several amino acids of the amino acid sequence shown are deleted or substituted, or an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the P23 strain is a kind of PGPB having an action of promoting the growth of plants, particularly duckweed plants, and produces a polysaccharide (hereinafter referred to as PGPC / P23) containing glucose, galactose and N-acetylglucosamine as constituent components. .
  • the proteins consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 are proteins encoded by the five genes constituting the PGPC-related gene cluster involved in the biosynthesis of PGPC / P23 cloned from the P23 strain, It is a protein involved in PGPC biosynthesis.
  • a PGPC-related gene cluster involved in the biosynthesis of PGPC / P23 is referred to as a PGPC / P23 gene cluster.
  • the genome base sequence of the P23 strain containing the PGPC / P23 gene cluster is registered in the database DDBJ / EMBL / GenBank with the accession number BBQU01000012.
  • the base sequence of the cloned PGPC / P23 gene cluster (SEQ ID NO: 6) is as described above. This corresponds to the 102,725 to 107,026th base sequence registered with the accession number.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is presumed to be a kind of glycosyltransferase from its characteristic motif sequence.
  • the gene encoding this protein in the P23 strain is registered under the gene name P23_2757 and accession number GAM32233, and corresponds to a base sequence complementary to the 130th to 951th base sequences of SEQ ID NO: 6.
  • P23_2757 is arranged in the direction opposite to the transfer direction of P23_2758 and P23_2759.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a protein involved in the biosynthesis of PGPC / P23 in cooperation with other proteins.
  • the gene encoding this protein in the P23 strain is registered under the gene name P23_2758 and accession number GAM32234, and corresponds to the 1,461 to 1,673th base sequences of SEQ ID NO: 6.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is presumed to be a kind of mannosyl transferase from its characteristic motif sequence.
  • the gene encoding this protein in the P23 strain is registered under the gene name P23_2759 and accession number GAM32235, and corresponds to the 1709th to 2629th nucleotide sequences of SEQ ID NO: 6.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is presumed to be a kind of glycosyltransferase from its characteristic motif sequence.
  • the gene encoding this protein in the P23 strain is registered under the gene name P23_2760 and accession number GAM32236, and corresponds to the base sequence complementary to the 2,641 to 3,582nd base sequences of SEQ ID NO: 6.
  • P23_2760 is arranged in the direction opposite to the transfer direction of P23_2758 and P23_2759.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is presumed to be a kind of glycosyltransferase from its characteristic motif sequence.
  • the gene encoding this protein in the P23 strain is registered under the gene name P23_2761, accession number GAM32237, and corresponds to the base sequence complementary to the 3,624th to 4,262nd base sequences of SEQ ID NO: 6.
  • P23_2761 is arranged in the direction opposite to the transfer direction of P23_2758 and P23_2759.
  • Table 1 shows the results of homology search using NCBI BLAST for the above five genes constituting the PGPC / P23 gene cluster.
  • genes P23 — 2759 to 2761 enclosed in a frame have low sequence identity with known genes and are considered to be novel genes.
  • P23_2759-2761 is also not found on the genomic sequence of Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2 and Acinetobacter calcoaceticus LB'-3, which are similar species with phenolic resolution as does the P23 strain, Alternatively, it has been confirmed that the sequence identity is low.
  • the first aspect of the present invention is a microorganism excluding the P23 strain, and can express at least one of a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 5 or a gene encoding a protein equivalent thereto.
  • the “gene encoding the equivalent protein” is a gene encoding a protein substantially equivalent to each protein in relation to the protein consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5, and specifically Is as follows.
  • -It consists of an amino acid sequence in which 1 to several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 have been deleted or substituted, or an amino acid sequence in which 1 to several amino acids have been added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • -It consists of an amino acid sequence in which 1 to several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are deleted or substituted, or an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 consists of an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are deleted or substituted, or an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • -It consists of an amino acid sequence in which 1 to several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 are deleted or substituted, or an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • a gene encoding a protein that is involved in the biosynthesis of PGPC, particularly a protein having glycosyltransferase activity is a gene encoding a protein that is involved in the biosynthesis of PGPC, particularly a protein having glycosyltransferase activity. -Consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 have been deleted or substituted, or an amino acid sequence in which one to several amino acids have been added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5
  • a gene encoding a protein that is involved in the biosynthesis of PGPC, particularly a protein having glycosyltransferase activity is a gene encoding a protein that is involved in the biosynthesis of PGPC, particularly a protein having glycosyltransferase activity.
  • the microorganism is preferably a microorganism capable of expressing at least three of a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 5 or a gene encoding a protein equivalent thereto, and the amino acids of SEQ ID NOs: 1 to 5 More preferably, a microorganism that can express at least four of genes encoding a protein consisting of a sequence or a gene encoding a protein equivalent thereto, a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 5 or More preferred are microorganisms that can express all five of the genes encoding proteins equivalent to these.
  • PGPC / P23 produced by the P23 strain is a polysaccharide containing glucose, galactose and N-acetylglucosamine as constituent components. This polysaccharide is presumed to be biosynthesized due to the involvement of a protein consisting of each amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 5.
  • PGPC produced by a microorganism having such an equivalent gene is PGPC having at least a partial structure different from that of PGPC / P23, and can exhibit the same growth promoting effect on plants as PGPC / P23.
  • the coexistence of a microorganism with a plant means that the microorganism and the plant are present in the same medium, and the microorganism and the plant are in direct contact as long as the PGPC produced by the microorganism can contact the plant. I don't need that.
  • the presence of a microorganism and a plant separated by a filter having a pore size that allows PGPC to permeate but the microorganism itself cannot permeate is also included in the “coexisting microorganism with plant” in the present invention.
  • a specific example of “to make a microorganism coexist with a plant” is, for example, a method in which a plant root is immersed in a liquid in which the microorganism is suspended, for example, a culture liquid in which a microorganism is cultured or suspended, or the culture liquid of the microorganism is kneaded. For example, planting plants in appropriate soil.
  • the number of microorganisms may be 10 4 to 10 10 cells / mL, preferably 10 6 to 10 8 cells / mL.
  • PGPC PGPC produced by the microorganism
  • any part such as leaves, stems, and roots (including foliate) coexist with the microorganism.
  • a part having higher PGPC absorption capacity for example, a leaf or root of a plant coexist with the microorganism.
  • the microorganism that can be used in the first aspect of the present invention is homologous to the genome information of the microorganism using the base sequence of the entire PGPC / P23 gene cluster (SEQ ID NO: 6) or the base sequence of each gene constituting the query as a query.
  • a candidate microorganism is selected by in silico screening such as search or by a hybridization method for microbial genomic DNA using an appropriate nucleic acid molecule having the base sequence, and further, for example, using a culture solution in which the candidate microorganism is suspended. Can be selected by confirming that growth of duckweed is promoted.
  • the promotion of plant growth is achieved by comparing the present invention with respect to indicators of the degree of plant growth, such as the weight of individual plants and the number of leaves or leaf-like bodies, as compared with the case where plants are grown without using the microorganism according to the present invention. It can be confirmed by observing the difference that occurs when a plant is grown using such microorganisms, for example, an increase in the weight of a plant individual or an increase in the number of leaves.
  • a microorganism is added to a plant culture solution such as Hoagland medium floating with 10 to 20 duckweeds as an appropriate number of fronds and incubated at 28 ° C.
  • the plant to which the method of the first aspect of the present invention is applied is preferably an aquatic plant such as floating, water-extracting or submerged, particularly a duckweed plant.
  • duckweed plants include plants belonging to the genus Lemna, such as L. minor and L. L. disperma, L. L. ecuadoriensi, Drosophila, L. Japonica, L. japonica L. miniscula, L. L. obscura, L. L. perpusilla, L. L. tenera, L. trisulca, L. tenella. Plants of the genus Spirodella, such as L. turififera and L. valdiviana. Intel Media, S.I. Polylisa, S.M.
  • a second aspect of the present invention relates to a method for promoting plant growth, comprising a step of allowing a microorganism into which at least one of the following genes 1) to 5) is introduced so as to allow expression to coexist with a plant.
  • the “process for allowing microorganisms to coexist with plants” and the means for confirming the growth promoting action on plants in the second aspect of the present invention are as described in the first aspect of the present invention.
  • a microorganism into which at least one of a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 or a gene encoding a protein equivalent thereto is introduced so as to be expressed can be planted. Including the step of coexisting with.
  • the microorganism is preferably a microorganism into which at least three of genes encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 or a gene encoding a protein equivalent thereto are introduced, shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 More preferably, a microorganism into which at least four of genes encoding a protein consisting of the amino acid sequence described above or a gene encoding a protein equivalent thereto is introduced, encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 More preferred are microorganisms into which all five of the genes or genes encoding proteins equivalent to these genes have been introduced.
  • a microorganism into which a nucleic acid comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 has been introduced.
  • the microorganism before recombination already has a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 and some of the genes encoding equivalent proteins, the other proteins A gene to be encoded may be selected and introduced.
  • one or a plurality of genes can be incorporated into one vector for introduction.
  • any of five vectors incorporating genes individually, a plurality of vectors incorporating a plurality of genes, and one vector incorporating all five genes can be used.
  • Introduction of a vector may be performed continuously for each vector, or may be performed simultaneously using a mixture of vectors.
  • the microorganism used in the second embodiment is preferably a highly safe microorganism that is known to be an appropriate host vector system that allows functional expression of a foreign gene.
  • microorganisms include non-pathogenic Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, PGPB such as Acinetobacter microorganisms, Pseudomonas putida, Pseudomonas microorganisms such as Serratia fotoncola, and Serratia gonticola.
  • PGPF such as Rhizoctonia solani, Fusarium microorganism, Penicillium microorganism.
  • Acinetobacter microorganisms that do not produce PGPC can also be used.
  • Particularly preferred microorganisms are non-pathogenic E. coli, Pseudomonas putida and Acinetobacter baili.
  • transcriptional regulatory region a nucleotide sequence that regulates
  • a known transcriptional regulatory region may be selected and used for each host microorganism, but it encodes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 or a protein equivalent thereto.
  • the transcriptional regulatory region unique to each gene may be used as it is.
  • An example of a nucleic acid containing a unique transcriptional regulatory region is a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • nucleic acid containing a unique transcriptional regulatory region is a nucleic acid consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the microorganism according to the second aspect of the present invention is a recombinant microorganism obtained by transforming the microorganism with a nucleic acid containing a base sequence encoding the gene or an expression vector incorporating the nucleic acid.
  • the expression vector is a vector that can transiently or stably express the gene in the host, and may be appropriately selected from, for example, a plasmid vector, a phage vector, a cosmid vector, etc. according to the host microorganism.
  • a broad range host expression vector such as pBBR-1 or MCS-2 can be used.
  • the third aspect of the present invention relates to a method for producing a PGPC, that is, a plant growth promoting substance, which comprises the step of growing the microorganism described in the first aspect (except for the P23 strain).
  • the 4th aspect of this invention is related with the manufacturing method of PGPC including the process of growing the recombinant microorganism demonstrated in the said 2nd aspect.
  • the microorganisms described in the first aspect are grown using an appropriate medium. This is a method for causing microorganisms to produce PGPC.
  • PGPC / P23 is salting out at a salt concentration of 50% by adding ammonium sulfate to the culture supernatant from which the microorganisms grown in a liquid medium have been removed, desalting after adding water to the precipitate, phenol Can be prepared by deproteinization by stirring extraction with the addition of sodium chloride, ethanol precipitation in which sodium chloride and about 1 to 5 times the amount of ethanol are added to the aqueous layer after extraction, and desalting after addition of water to the precipitate. . PGPC other than PGPC / P23 can also be prepared according to this method or this method.
  • the growth promoting action of PGPC on a plant is achieved by adding an appropriate amount of PGPC such as 5 to 20 ⁇ g / mL instead of the microorganism according to the method for confirming the growth promotion of the plant in the first embodiment. This can be confirmed.
  • PGPC prepared by the above method may be stored in a state of being suspended or dissolved in an appropriate amount of liquid, for example, water or a buffer, or may be stored by lyophilization.
  • the fifth aspect of the present invention relates to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 3 to 5 described in the second aspect and proteins equivalent thereto.
  • a nucleic acid encoding such a protein an expression vector that can express the nucleic acid, and a microorganism transformed with the nucleic acid or expression vector are also provided as the present invention.
  • the types of expression vectors or microorganisms are as described in the second aspect, and experimental operations such as nucleic acid preparation, recombination, and microorganism transformation are also performed as described in the second aspect of the present invention. This can be done using techniques widely used by those skilled in the art.
  • Example 1 Cloning of PGPC / P23 gene cluster and preparation of recombinant bacteria Based on the genome base sequence of the P23 strain registered in the database DDBJ / EMBL / GenBank with the accession number BBQU01000012, P23-2757 to 2761 Primer sets (Fnov and Rp23nov) consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 were prepared so that the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 containing 5 genes could be amplified.
  • Plasmid mcs-nov was transformed into E. coli by the calcium chloride method.
  • E. coli DH5 ⁇ strain is introduced and transformed into a recombinant bacterium E. coli having 5 genes P23-2757-2761.
  • E. coli mcs-nov was produced.
  • E.I. E. coli mcs-nov was cultured in LB medium to recover the plasmid from the cells. It was introduced into Baylyi ADP-1 to produce a recombinant bacterium ADP1 mcs-nov.
  • Baylyi ADP1 ADP1 mcs2 was also produced in the same manner.
  • Example 2 Evaluation of Plant Growth Promoting Activity of Recombinant Bacteria E. coli produced in Example 1 E. coli mcs-nov, ADP1 mcs-nov and ADP1 mcs2 recombinant bacteria, E. coli, ADP1 strain and P23 strain were evaluated for growth promoting activity against duckweed.
  • E. No recombination Evaluation of E. coli, ADP1 strain, and P23 strain 50 mL of Hoagland's medium was dispensed into a 100 mL culture flask, and 20 sterilized duckweed leaves that had been pre-cultured in Hoagland's medium were placed therein. E. No recombination E. coli, ADP1 strain, and P23 strain were inoculated to a final OD 0.3 (about 10 8 cells / mL), and then cultured for 3 days. The culture conditions are shown below. Thereafter, culture was performed under the same conditions unless otherwise specified. Plant culture medium: Hoglund medium (Table 2) Temperature: 28 ° C Relative humidity: 60-70% 16 hours light period (5000 lux) / 8 hours dark period
  • the plants were transferred to a tube containing 40 mL of a new Hoglund medium, and the non-adherent bacteria were washed away by inverting the tube twice. After performing this washing operation twice, one plant having two leaf-like bodies was transferred to a 100 mL culture flask in which 50 mL of Hogland medium was dispensed, and cultured for 10 days. During the culture period, the number of fronds was counted every two days, and the chlorophyll content, the wet weight of the plant and the root length were measured at the end of the test. Chlorophyll content was measured by Suzuki W et al., J Biosci Bioeng. 118 (1): 41-4.
  • FIGS. E The results are shown in FIGS. E.
  • the duckweed cultured with E. coli mcs-nov or ADP1 mcs-nov attached has more leaflets than the control cultured without attaching the bacteria and ADP1 mcs2 introduced with an empty vector.
  • the chlorophyll content and wet weight increased, and the tendency was particularly remarkable in ADP1 mcs-nov.
  • ADP1 mcs-nov an increase in root length was also observed. From these results, it was shown that the bacterium introduced with P23-2757 to 2761 has a plant growth promoting activity.
  • Example 3 Evaluation of plant growth-promoting activity of polysaccharides produced by recombinant bacteria
  • the P23 strain and ADP1 mcs2 and ADP1 mcs-nov prepared in Example 1 were prepared in the M9S medium shown in Table 3 at 30 ° C, 3 ° C.
  • the culture was performed with shaking at 120 rpm for 1 day to obtain 1.5 L of the culture supernatant.
  • 313 g of ammonium sulfate (50% saturation) was added to the culture supernatant, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then the precipitate was collected by centrifugation (8000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.).
  • the precipitate was suspended in 20 mL of MilliQ water and dialyzed against 3 L of MilliQ water. During dialysis, the water was changed at least 5 times. After dialysis, 20 mL of 90% phenol preheated to 65 ° C was added, and after vigorous stirring, maintained at 65 ° C for 15 minutes, cooled in an ice bath, and centrifuged (5000 rpm, 30 minutes, 10 ° C) to form a layer. Separated. The aqueous layer was collected, water previously heated to 65 ° C. was added to the remaining phenol layer and intermediate layer, and the above phenol extraction operation was performed again.
  • the results are shown in FIGS.
  • the ADP1 mcs-nov PS increased the number of duckweed fronds, wet weight and root length compared to the control and ADP1 mcs2 PS cultured without inoculation, and the strength of its activity was P23 It was equivalent to the stock PS. From this result, it was shown that the introduction of P23-2757 to 2761 induces the production of PGPC having the same activity as P23 PGPC.
  • Example 4 Production of Recombinant Bacteria Introduced with Three Genes P23-2759 to 2761
  • the region containing the three genes P23-2759 to 2761 was a base represented by SEQ ID NOs: 10 and 9.
  • a recombinant bacterium ADP1 mcs-nov3 was prepared by introducing into baylyi ADP-1.
  • the orientation of the 3 genes in the plasmid mcs-nov3 was the same as that of the plasmid mcs-nov.
  • Example 5 Evaluation of Plant Growth Promoting Activity of Recombinant Bacteria Containing 3 Genes P23-2759 to 2761
  • the plant growth promoting activity possessed by ADP1 mcs-nov3, ADP1 mcs-nov and ADP1 mcs2 is added to the Hoglund medium.
  • Example 2-2 except that the final concentration of IPTG was 0.02 mM.
  • the results are shown in FIGS.
  • the duckweed cultivated with ADP1 mcs-nov3 attached is not as good as when cultivated with ADP1 mcs-nov attached, but the control cultivated without attaching the fungus and ADP1 mcs2 introduced with the empty vector were attached.
  • the number of foliar bodies and the wet weight increased compared with the case where the cells were cultured. Also, plasmid mcs-nov3 was transformed into E. coli. A similar tendency was observed for recombinant bacteria obtained by introduction into E. coli. From this result, it was shown that the bacterium introduced with P23-2759 to 2761 also has plant growth promoting activity.
  • Example 6 Evaluation of Plant Growth Promoting Activity of Polysaccharides Produced by Recombinant Bacteria Having Three Genes P23-2759 to 2761 ADP1 mcs-nov3, ADP1 mcs-nov and ADP1 mcs2 were treated with kanamycin (final concentration 50 ⁇ g / mL). ) And IPTG (final concentration: 1 mM) in 300 mL of M9S medium at 30 ° C. for 3 days with shaking at 110 rpm, and culture supernatant was obtained by centrifugation and filtration.
  • This culture supernatant was subjected to ammonium sulfate precipitation (50% saturation), dialysis, lyophilization, and hot phenol extraction in order to obtain a polysaccharide extract (PS).
  • PS obtained from the culture supernatant of ADP1 mcs-nov was 2.5 mg
  • PS obtained from the culture supernatant of ADP1 mcs-nov3 was 2.3 mg
  • PS obtained from the culture supernatant of ADP1 mcs2 was 2.0 mg. It was.
  • the plant growth promoting activity of these PS was evaluated in the same manner as in Example 3.
  • the results are shown in FIGS.
  • the ADP1 mcs-nov PS the ADP1 mcs-nov3 PS has a higher number of leafy bodies, damp weight and root length than the control and ADP1 mcs2 PS cultured without inoculation. Increased. From this result, it was shown that the introduction of P23-2759 to 2761 induces the production of PGPC to the same extent as the introduction of P23-2757 to 2761.
  • the present invention can promote plant growth by utilizing a new microorganism other than the P23 strain having a PGPC-related gene, or a recombinant microorganism into which a PGPC-related gene has been introduced using a genetic engineering technique. Has industrial applicability in production.

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Abstract

【課題】　本発明は、植物、特にウキクサ科植物の生長を促進する機能を有する微生物の有効利用を目的とするものである。 【解決手段】　本発明は、配列番号１～５に示されるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス　Ｐ２３を除く）を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法を提供する。本発明によれば、ＰＧＰＣ関連遺伝子を有するＰ２３株以外の新たな微生物を利用することができ、植物特にウキクサ科植物の生長を促進させることでバイオマス生産の効率を高めることが可能となる。

Description

植物の生長を促進する方法、植物生長促進物質を製造する方法及びこれらに利用されるタンパク質
　本発明は、植物の生長を促進する方法、植物生長促進物質を製造する方法、及びこれらの方法において利用されるタンパク質に関する。
　ウキクサ科植物（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）は、地球のほぼ全域に生息する淡水性の水生植物である。これまで、ウキクサ科植物、特にコウキクサ（Ｌｅｍｎａ　ｍｉｎｏｒ、英語名ｄｕｃｋｗｅｅｄ）の産業への利用は、根圏微生物を含むコウキクサを用いた産業廃水の水質浄化に関連するものが主流であった（例えば、特許文献１）。また、有用タンパク質の生産のための遺伝子組換え宿主としてウキクサ科植物を利用する技術も開発されている（特許文献２及び特許文献３）。
　近年、ウキクサ科植物が植物体重量当たり６０％程のデンプンと１５％を越えるタンパク質を有する極めて栄養価の高い植物であることが認識されるようになり、ウキクサ科植物をバイオマス、特にバイオマスエネルギーとして活用することへの関心が高まっている。特に、従来知られている水質浄化能力と組み合わせた都市下水、工場廃水、農業廃水などを利用したウキクサ科植物の栽培は、省エネ型の水質浄化とバイオマス生産を同時に達成することが可能となる点で、魅力的である。
　水質浄化及びバイオマス生産へのいずれの利用においても、低コストでウキクサ科植物の生長速度を高める技術の開発は有益である。係る観点から、本発明者らはコウキクサの生長を促進する機能を有する根圏微生物（Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＰＧＰＢ）及びＰｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　Ｆｕｎｇｉ（ＰＧＰＦ））に注目して研究を行い、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）Ｐ２３（以下、Ｐ２３株と表す）がＰＧＰＢであること、及びＰ２３株の分泌する多糖が植物生長促進物質（Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ、ＰＧＰＣ）であることを見出している（非特許文献１）。
特開２００９－２４７２７９号公報 特表２００１－５１３３２５号公報 特表２００９－５２３４３１号公報
Ｍ．Ｓｕｇａｗａｒａら、"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．Ｐ２３"、［ｏｎｌｉｎｅ］、平成２６年５月１９日、第１１４回米国微生物学会大会　発表番号Ｑ－１８５１［平成２７年６月１７日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｍｏｎｌｉｎｅｅｄｕｃａｔｉｏｎ．ｃｏｍ／ｐｈｐ／ａｓｍ２０１４ａｂｓｔｒａｃｔｓ／ｄａｔａ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ〉
　本発明は、植物、特にウキクサ科植物の生長を促進する機能を有する微生物の有効利用を目的とするものである。
　本発明者らは、ウキクサの生長を促進させるＰＧＰＣの生合成に関する遺伝子群（ＰＧＰＣ関連遺伝子クラスターと表す）をＰ２３株のゲノム中に見いだし、下記の各発明を完成させた。
（１）下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス　Ｐ２３を除く）を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法。
　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
（２）下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法。
　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
（３）前記１）～５）の遺伝子の少なくとも３つを有する微生物を植物と共存させる工程を含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記１）～５）の全ての遺伝子を有する微生物を植物と共存させる工程を含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）植物がウキクサ科植物である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス　Ｐ２３を除く）を増殖させる工程を含む、植物生長促進物質の製造方法。
　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
（７）下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を増殖させる工程を含む、植物生長促進物質の製造方法。
　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
（８）前記１）～５）の遺伝子の少なくとも３つを有する微生物を増殖させる工程を含む、（６）又は（７）に記載の方法。
（９）前記１）～５）の全ての遺伝子を有する微生物を増殖させる工程を含む、（６）又は（７）に記載の方法。
（１０）下記１）～３）のいずれかのタンパク質。
　１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
　２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
　３）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
（１１）（１０）に記載のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸。
（１２）（１１）に記載の核酸を発現可能に含むベクター。
（１３）（１１）に記載の核酸又は（１２）に記載のベクターで形質転換された微生物。
　本発明によれば、ＰＧＰＣ関連遺伝子を有するＰ２３株以外の新たな微生物を利用することができ、植物特にウキクサ科植物の生長を促進させることでバイオマス生産の効率を高めることができる。また、遺伝子工学的手法を用いてＰＧＰＣ関連遺伝子を導入した組換え微生物を作製することで、植物の生長を促進させることのできる微生物種の範囲を拡大することができる他、ＰＧＰＣの効率的な生産又は生長促進が期待される植物に合わせた微生物の利用が可能となる。
Ｐ２３－２７５７～２７６１を含むＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターをｐＢＢＲ－１　ＭＣＳ－２ベクターに組み込んで得られるｍｃｓ－ｎｏｖの模式図である。 組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１又はＰ２３株を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。 組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１又はＰ２３株を付着させた後に１０日間培養したコウキクサのクロロフィル含量を示すグラフである。 組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１又はＰ２３株を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。 Ｐ２３－２７５７～２７６１が導入された組換え菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　ｍｃｓ－ｎｏｖ、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ）又は空のベクターが導入された組換え菌（ＡＤＰ１　ｍｃｓ２）を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。 Ｅ．ｃｏｌｉ　ｍｃｓ－ｎｏｖ、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ又はＡＤＰ１　ｍｃｓ２を付着させた後に１０日間培養したコウキクサのクロロフィル含量を示すグラフである。 Ｅ．ｃｏｌｉ　ｍｃｓ－ｎｏｖ、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ又はＡＤＰ１　ｍｃｓ２を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。 Ｐ２３株、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ又はＡＤＰ１　ｍｃｓ２の培養上清由来多糖を添加した培養液で１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。 Ｐ２３株、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ又はＡＤＰ１　ｍｃｓ２の培養上清由来多糖を添加した培養液で１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。 Ｐ２３－２７５９～２７６１が導入された組換え菌（ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３）、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ又はＡＤＰ１　ｍｃｓ２を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。 ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ又はＡＤＰ１　ｍｃｓ２を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。 ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ又はＡＤＰ１　ｍｃｓ２の培養上清由来多糖を添加した培養液で１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。 ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ又はＡＤＰ１　ｍｃｓ２の培養上清由来多糖を添加した培養液で１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。
　本発明の第１の態様は、下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしＰ２３株を除く）を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法に関する。
　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　Ｐ２３株は、植物、特にウキクサ科植物の生長を促進する作用を有するＰＧＰＢの一種で、グルコース、ガラクトース及びＮ－アセチルグルコサミンを構成成分として含む多糖類（以下、ＰＧＰＣ／Ｐ２３と表す）を産生する。
　配列番号１～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Ｐ２３株からクローニングされた、ＰＧＰＣ／Ｐ２３の生合成に関与するＰＧＰＣ関連遺伝子クラスターを構成する５つの遺伝子にそれぞれコードされているタンパク質、すなわちＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質である。以下、ＰＧＰＣ／Ｐ２３の生合成に関与するＰＧＰＣ関連遺伝子クラスターをＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターと表す。ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターを含むＰ２３株のゲノム塩基配列はデータベースＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＢＱＵ０１００００１２で登録されており、クローニングされたＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターの塩基配列（配列番号６）は、上記アクセッション番号で登録されている塩基配列の１０２，７２５～１０７，０２６番目に相当する。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、その特徴的なモチーフ配列などから、グリコシルトランスフェラーゼの一種であると推察される。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７５７、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３３として登録されており、配列番号６の１３０～９５１番目の塩基配列に相補する塩基配列に相当する。Ｐ２３＿２７５７は、Ｐ２３＿２７５８及びＰ２３＿２７５９の転写方向とは逆向きに配置されている。
　配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は他のタンパク質と協同してＰＧＰＣ／Ｐ２３の生合成に関与しているタンパク質である。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７５８、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３４として登録されており、配列番号６の１，４６１～１，６７３番目の塩基配列に相当する。
　配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、その特徴的なモチーフ配列などから、マンノシルトランスフェラーゼの一種であると推察される。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７５９、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３５として登録されており、配列番号６の１，７０９～２，６２９番目の塩基配列に相当する。
　配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、その特徴的なモチーフ配列などから、グリコシルトランスフェラーゼの一種であると推察される。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７６０、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３６として登録されており、配列番号６の２，６４１～３，５８２番目の塩基配列に相補する塩基配列に相当する。Ｐ２３＿２７６０は、Ｐ２３＿２７５８及びＰ２３＿２７５９の転写方向とは逆向きに配置されている。
　配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、その特徴的なモチーフ配列などから、グリコシルトランスフェラーゼの一種であると推察される。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７６１、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３７として登録されており、配列番号６の３，６２４～４，２６２番目の塩基配列に相補する塩基配列に相当する。Ｐ２３＿２７６１は、Ｐ２３＿２７５８及びＰ２３＿２７５９の転写方向とは逆向きに配置されている。
　ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターを構成する上記５つの遺伝子について、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴで相同性検索を行った結果を表１に示す。表中、枠で囲われた遺伝子Ｐ２３＿２７５９～２７６１は既知遺伝子との配列同一性が低く、新規の遺伝子であると考えられる。Ｐ２３＿２７５９～２７６１はまた、Ｐ２３株と同様にフェノール分解能を持つ近縁種であるアシネトバクター・カルコアセティカスＰＨＥＡ－２及びアシネトバクター・カルコアセティカスＬＢ’－３のゲノム配列上には見出されない、又は配列同一性が低いことが確認されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の第１の態様は、Ｐ２３株を除く微生物であって、配列番号１～５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物を植物と共存させる工程を含む。
　上記「同等のタンパク質をコードする遺伝子」とは、配列番号１～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に関連して、各タンパク質と実質的に同等のタンパク質をコードする遺伝子であり、具体的には、次の通りである。
・配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質、特にグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
・配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質タンパク質をコードする遺伝子。
・配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質、特にマンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
・配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質、特にグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
・配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質、特にグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
　微生物は、配列番号１～５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも３つを発現可能に有する微生物が好ましく、配列番号１～５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも４つを発現可能に有する微生物がより好ましく、配列番号１～５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの５つ全てを発現可能に有する微生物がさらに好ましい。
　Ｐ２３株が産生するＰＧＰＣ／Ｐ２３は、グルコース、ガラクトース及びＮ－アセチルグルコサミンを構成成分として含む多糖類である。この多糖類は、配列番号１～５の各アミノ酸配列からなるタンパク質の関与により生合成されていると推察される。本発明の第１の態様においては、ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターを構成する各遺伝子と同一の遺伝子を有する微生物に限らず、上記タンパク質と同等のタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物も利用することができる。かかる同等の遺伝子を有する微生物が産生するＰＧＰＣは、ＰＧＰＣ／Ｐ２３とは少なくとも一部の構造が異なるＰＧＰＣであって、ＰＧＰＣ／Ｐ２３と同様の植物に対する生長促進作用を示すものであり得る。
　微生物を植物と共存させるとは、微生物と植物とを同じ媒体中に存在させることを意味し、微生物が産生するＰＧＰＣが植物に接触することができる限り、微生物と植物とが直接的に接触することを必要としない。例えば、ＰＧＰＣは透過できるが微生物自身は透過できない程度の孔経を持つフィルターで微生物と植物とを隔てて存在させることも、本発明における「微生物を植物と共存させる」に包含される。
　「微生物を植物と共存させる」の具体例は、例えば前記微生物が懸濁された液体例えば微生物を培養若しくは懸濁した培養液に植物の根を浸すこと、又は前記微生物の培養液を練り込んだ適当な土壌に植物を植えることなどが挙げられる。特に、微生物を培養又は懸濁した培養液に植物の根を浸すことが好ましく、微生物を懸濁した培養液に植物の根を浸して微生物を根に定着させた後に植物を生長させる、又はかかる培養液に植物の根を浸したまま植物を生長させることが特に好ましい。また、屋外で生息中の水生植物に対して本発明を適用する場合は、植物が生息している水に前記微生物の培養液を混合するなどしてもよい。微生物の数としては、１０４～１０１０細胞／ｍＬ、好ましくは１０６～１０８細胞／ｍＬとすればよい。
　微生物と共存させる植物の部位は、微生物が産生するＰＧＰＣを感知あるいは吸収することができる部位である限り制限はなく、葉、茎、根（葉状体を含む）などのいずれの部位を微生物と共存させてもよいが、よりＰＧＰＣ吸収能が高い部位、例えば植物の葉又は根を微生物と共存させることが好ましい。
　本発明の第１の態様において利用可能な微生物は、ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスター全体の塩基配列（配列番号６）若しくはこれを構成する各遺伝子の塩基配列をクエリーとした、微生物のゲノム情報に対する相同性検索などのインシリコスクリーニングによって、又は前記塩基配列を有する適当な核酸分子を用いた微生物ゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーション法などによって候補微生物を選択し、さらに例えば前記候補微生物を懸濁した培養液を用いてコウキクサを生長させて、コウキクサの生長が促進されることを確認することで、選択することができる。
　植物の生長促進は、植物個体の重量、葉又は葉状体の枚数などの植物の生長度合いの指標について、本発明にかかる微生物を利用せずに植物を生長させたときと比較して、本発明にかかる微生物を利用して植物を生長させたときに生ずる差、例えば植物個体の重量が増加する、葉の枚数が増加するなどを観察することによって確認することができる。具体例としては、適当数例えば葉状体数として１０～２０枚のコウキクサを浮かべたホーグランド（Ｈｏａｇｌａｎｄ）培地などの植物培養液に微生物を添加して２８℃で一日インキュベートした後に、葉状体２枚ずつを新しい植物培養液に移し、さらに１０日間ほど生長させた後に葉状体数を数え、微生物を添加しないコントロールにおける葉状体数との差を確認すればよい。
　本発明の第１の態様の方法が適用される植物としては、浮遊性、抽水性あるいは沈水性などの水生植物、特にウキクサ科植物が好ましい。ウキクサ科植物の例としては、アオウキクサ（Ｌｅｍｎａ）属植物例えばコウキクサ（Ｌ．ｍｉｎｏｒ）、Ｌ．ディスペルマ（Ｌ．ｄｉｓｐｅｒｍａ）、Ｌ．エクアドリエンシス（Ｌ．ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉ）、イボウキクサ、Ｌ．ジャポニカ（Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｌ．ミニスクラ（Ｌ．ｍｉｎｉｓｃｕｌａ）、Ｌ．オブスクラ（Ｌ．ｏｂｓｃｕｒａ）、Ｌ．ペルプシラ（Ｌ．ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）、Ｌ．テネラ（Ｌ．ｔｅｎｅｒａ）、ヒンジモ（Ｌ．ｔｒｉｓｕｌｃａ）、Ｌ．ツリオニフェラ（Ｌ．ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ）、チリウキクサ（Ｌ．ｖａｌｄｉｖｉａｎａ）など、スピロデラ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ）属植物例えばＳ．インテルメディア（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、Ｓ．ポリリザ、Ｓ．ポンクタタ（Ｓ．ｐｕｎｃｔａｔａ）、ミジンコウキクサ（Ｗｏｌｆｆｉａ）属植物例えばＷａ．アングスタ（Ｗａ．ａｎｇｕｓｔａ）、Ｗａ．アリザ（Ｗａ．ａｒｒｈｉｚａ）、Ｗａ．オーストラリナ（Ｗａ．ａｕｓｔｒａｌｉｎａ）、Ｗａ．ボレアリス（Ｗａ．ｂｏｒｅａｌｉｓ）、Ｗａ．ブラジリエンシス（Ｗａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｗａ．コロンビアナ（Ｗａ．ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ）、Ｗａ．エロンガタ（Ｗａ．ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｗａ．グロバサ（Ｗａ．ｇｌｏｂｏｓａ）、Ｗａ．ミクロスコピア（Ｗａ．ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａ）、Ｗａ．ネグレクタ（Ｗａ．ｎｅｇｌｅｃｔａ）、ウォルフィエラ（Ｗｏｌｆｉｅｌｌａ）属植物例えばＷｌ．カウダタ（Ｗｌ．ｃａｕｄａｔａ）、Ｗｌ．デンティクラタ（Ｗｌ．ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔａ）、Ｗｌ．グラディアタ（Ｗｌ．ｇｌａｄｉａｔａ）、Ｗｌ．ヒアリナ（Ｗｌ．ｈｙａｌｉｎａ）、Ｗｌ．リングラタ（Ｗｌ．ｌｉｎｇｕｌａｔａ）、Ｗｌ．レプンダ（Ｗｌ．ｒｅｐｕｎｄａ）、Ｗｌ．ロタンダ（Ｗｌ．ｒｏｔｕｎｄａ）、及びＷｌ．ネオトロピカ（Ｗｌ．ｎｅｏｔｒｏｐｉｃａ）及びランドルティア（Ｌａｎｄｏｌｔｉａ）属植物例えばＬ．ポンクタタ（Ｌ．ｐｕｎｃｔａｔａ）などを挙げることができる。
　本発明の第２の態様は、下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法に関する。
　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
　本発明の第２の態様における「微生物を植物と共存させる工程」及び植物に対する生長促進作用を確認する手段は、本発明の第１の態様において説明したとおりである。
　本発明の第２の態様は、配列番号１～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を植物と共存させる工程を含む。
　微生物は、配列番号１～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも３つが導入された微生物が好ましく、配列番号１～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも４つが導入された微生物がより好ましく、配列番号１～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの５つ全てが導入された微生物がさらに好ましい。特に好ましくは、配列番号６に示される塩基配列からなる核酸が導入された微生物である。組み換える前の微生物が配列番号１～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子及びこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子の幾つかを既に有しているときは、それら以外のタンパク質をコードする遺伝子を選択して導入すればよい。
　複数の遺伝子を導入するときは、１のベクターに１又は複数の遺伝子を組み込んで導入することができる。例えば５つ全ての遺伝子を導入する場合、遺伝子を個別に組み込んだ５のベクター、複数の遺伝子を組み込んだ複数のベクター、５つ全ての遺伝子を組み込んだ１のベクターのいずれも用いることができる。ベクターの導入は、ベクター毎に連続して行ってもよく、ベクターの混合物を用いて同時に行ってもよい。
　第２の態様において利用される微生物は、外来遺伝子の機能的発現を可能にする適当な宿主ベクター系が知られており、かつ安全性の高い微生物であることが好ましい。そのような微生物としては、非病原性大腸菌、枯草菌、酵母、ＰＧＰＢ例えばアシネトバクター属微生物、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）などのシュードモナス属微生物、セラチア・ホンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）などのセラチア属微生物、又はＰＧＰＦ例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム属微生物又はペニシリウム属微生物などを挙げることができる。また、ＰＧＰＣを生産しないアシネトバクター属微生物、例えばアシネトバクター・ベイリ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ　ｂａｙｌｙｉ）なども利用可能である。特に好ましい微生物は非病原性大腸菌、シュードモナス・プチダ及びアシネトバクター・ベイリである。
　配列番号１～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子は、宿主となる微生物で発現可能な状態で導入されている限り、それぞれ異なるプロモーター配列その他の遺伝子の転写を調節する塩基配列（以下、転写調節領域と表す）の制御下にあるように導入されてもよく、又は複数の遺伝子が一種類の転写調節領域の支配下にあるように導入されてもよい。
　また、転写調節領域は、宿主となる微生物ごとに公知の転写調節領域を選択して使用してもよいが、配列番号１～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子をＰＧＰＢ又はＰＧＰＦからクローニングして利用するときは、それぞれに固有の転写調節領域をそのまま使用してもよい。固有の転写調節領域を含む核酸の例は、配列番号６に示される塩基配列からなる核酸である。同様に、配列番号３～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子をＰＧＰＢ又はＰＧＰＦからクローニングして利用するときは、それぞれに固有の転写調節領域をそのまま使用してもよい。固有の転写調節領域を含む核酸の例は、配列番号７に示される塩基配列からなる核酸である。
　本発明の第２の態様にかかる微生物は、前記遺伝子をコードする塩基配列を含む核酸又はこれを組み込んだ発現ベクターによって前記微生物を形質転換した、組換え微生物である。発現ベクターは宿主内で前記遺伝子を一過性又は安定的に発現させることができるベクターであり、宿主となる微生物に応じて、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどから適宜選択すればよい。また例えばｐＢＢＲ－１　ＭＣＳ－２などの広域宿主発現ベクターを利用することもできる。
　核酸の調製、組換え、微生物の形質転換などの実験的操作は、いずれも当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を用いて行うことができる。また、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従って行えばよい。
　本発明の第３の態様は、前記第１の態様で説明した微生物（ただしＰ２３株を除く）を増殖させる工程を含む、ＰＧＰＣすなわち植物生長促進物質の製造方法に関する。また、本発明の第４の態様は、前記第２の態様で説明した組換え微生物を増殖させる工程を含む、ＰＧＰＣの製造方法に関する。
　第３の態様及び第４の態様いずれの方法も、前記第１の態様で説明した微生物（ただしＰ２３株を除く）又は前記第２の態様で説明した組換え微生物を適当な培地を用いて増殖させることにより、微生物にＰＧＰＣを生産させる方法である。
　ＰＧＰＣ／Ｐ２３は、液体培地で増殖させた上記微生物の菌体を除去した培養上清に硫酸アンモニウム等を加えた塩濃度５０％での塩析、沈殿物に水を添加した後の脱塩、フェノールを添加した攪拌抽出による除タンパク質、抽出後の水層に塩化ナトリウム及び１～５倍量程度のエタノールを加えたエタノール沈殿、及び沈殿物に水を添加した後の脱塩によって調製することができる。ＰＧＰＣ／Ｐ２３以外のＰＧＰＣも、この方法又はこの方法に準じて調製することができる。また、ＰＧＰＣの植物に対する生長促進作用は、前記第１の態様において植物の生長促進を確認する方法に従い、微生物の代わりに適当量の例えば５～２０μｇ／ｍＬとなるような量のＰＧＰＣを添加することで確認することができる。
　上記方法で調製されたＰＧＰＣは、適当量の液体、例えば水若しくは緩衝液に懸濁若しくは溶解した状態で保存してもよく、又は凍結乾燥させて保存してもよい。
　本発明の第５の態様は、前記第２の態様において説明した配列番号３～５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びこれらと同等のタンパク質に関する。また、かかるタンパク質をコードする核酸、該核酸を発現可能に含む発現ベクター、該核酸又は発現ベクターで形質転換された微生物も本発明として提供される。発現ベクター又は微生物の種類は、前記第２の態様において説明したとおりであり、核酸の調製、組換え、微生物の形質転換などの実験的操作も、本発明の第２の態様で説明したとおりに当業者に広く利用されている手法を用いて行うことができる。
　以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
＜実施例１＞ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターのクローニング及び組換え菌の作製
　データベースＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＢＱＵ０１００００１２で登録されているＰ２３株のゲノム塩基配列を元に、Ｐ２３－２７５７～２７６１の５つの遺伝子を含む配列番号６に示される塩基配列を増幅できるように、配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセット（Ｆｎｏｖ及びＲｐ２３ｎｏｖ）を作製した。
　Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ　Ｐ２３の培養菌体から調製したゲノムＤＮＡに対して前記プライマーセット及びＫＯＤポリメラーゼを用いたＰＣＲを行い、約４．５ｋｂｐの増幅断片を得た。これを制限酵素ＳｍａＩで開環させた広域宿主ベクターｐＢＢＲ－１　ＭＣＳ－２（Ｋｏｖａｃｈ　ＭＥ　ら　Ｇｅｎｅ、１９９５年、第１６６巻、第１７５～１７６ページ）に組み込んで、Ｐ２３－２７５７～２７６１の５つの遺伝子を有するプラスミドｍｃｓ－ｎｏｖを作製した。このプラスミドのインサート部分について塩基配列解析を行い、図１に示す方向で５つの遺伝子が導入されていることを確認した。
　プラスミドｍｃｓ－ｎｏｖを塩化カルシウム法でＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α株に導入して形質転換させ、Ｐ２３－２７５７～２７６１の５つの遺伝子を有する組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ｍｃｓ－ｎｏｖを作製した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｍｃｓ－ｎｏｖをＬＢ培地で培養して菌体からプラスミドを回収し、これをＡ．ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ－１に導入して、組換え菌ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖを作製した。上記５遺伝子を持たない空のベクターｐＢＢＲ－１　ＭＣＳ－２を導入したＡ．ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１（ＡＤＰ１　ｍｃｓ２）も同様に作製した。
＜実施例２＞組換え菌の植物生長促進活性評価
　実施例１で作製したＥ．ｃｏｌｉ　ｍｃｓ－ｎｏｖ、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ及びＡＤＰ１　ｍｃｓ２の各組換え菌、並びに組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１株及びＰ２３株について、コウキクサに対する生長促進活性の評価を行った。
２－１．組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１株及びＰ２３株の評価
　１００ｍＬ容の培養フラスコにホーグランド培地５０ｍＬを分注し、これにホーグランド培地中で予め培養した滅菌コウキクサの葉状体２０枚を入れた。組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１株及びＰ２３株を最終ＯＤ＝０．３（約１０８細胞／ｍＬ）になるように接種した後、３日間培養した。培養条件を以下に示す。以降、特に指定がない限り、同じ条件で培養を行った。
植物培養液：ホーグランド培地（表２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 温度：２８℃
相対湿度：６０～７０％
１６時間の明期（５０００ルクス）／８時間の暗期
　培養終了後、４０ｍＬの新たなホーグランド培地を入れたチューブに植物を移し、チューブを２回反転させることにより非付着菌を洗浄除去した。この洗浄操作を２回行った後、２枚の葉状体を有する１個の植物体を、５０ｍＬのホーグランド培地を分注した１００ｍＬ容培養フラスコに移し、１０日間培養した。培養期間中は葉状体の数を２日毎に計数し、試験終了時にクロロフィル含量、植物の湿重量及び根の長さを測定した。クロロフィル含量の測定は、Ｓｕｚｕｋｉ　Ｗら、Ｊ　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｅｎｇ．１１８（１）：４１－４に記載の方法により行った。
　結果を図２～図４に示す。既に報告されているように、Ｐ２３株を付着させて培養したコウキクサは、菌を付着させずに培養したコントロール及びＥ．ｃｏｌｉ又はＡＤＰ１を付着させて培養した場合と比べて、葉状体の数、クロロフィル含量、湿重量が大きく増加した。なお、根に付着した菌数は、Ｐ２３株及びＡＤＰ１が約１０６ｃｆｕ／植物個体、Ｅ．ｃｏｌｉが約１０４ｃｆｕ／植物個体であった。
２－２．組換え菌の評価
　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｍｃｓ－ｎｏｖ、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ及びＡＤＰ１　ｍｃｓ２が有する植物生長促進活性について、使用するホーグランド培地にカナマイシン（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＰＴＧ（終濃度０．５ｍＭ）を添加した以外は上記２－１．と同様の方法で評価した。
　結果を図５～図７に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ　ｍｃｓ－ｎｏｖ又はＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖを付着させて培養したコウキクサは、菌を付着させずに培養したコントロール及び空ベクターを導入したＡＤＰ１　ｍｃｓ２を付着させて培養した場合と比べて、葉状体の数、クロロフィル含量及び湿重量が増加し、その傾向はＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖにおいて特に顕著であった。ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖでは根の長さの増加も観察された。この結果から、Ｐ２３－２７５７～２７６１を導入された菌は、植物生長促進活性を有することが示された。
＜実施例３＞組換え菌により産生された多糖の植物生長促進活性評価
　Ｐ２３株並びに実施例１で作製したＡＤＰ１　ｍｃｓ２及びＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖを、表３に示すＭ９Ｓ培地中で、３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで振盪しながら培養し、１．５Ｌの培養上清を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　この培養上清に３１３ｇの硫酸アンモニウム（５０％飽和）を加え、４℃で一晩置いた後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により沈殿を回収した。沈殿を２０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に懸濁し、３ＬのＭｉｌｌｉＱ水に対して透析を行った。透析中、少なくとも５回水を交換した。透析後、予め６５℃に加温した９０％フェノール２０ｍＬを加え、激しく撹拌した後に６５℃で１５分間維持した後、氷浴中で冷却し、遠心分離（５０００ｒｐｍ、３０分間、１０℃）により層を分離した。水層を回収し、残ったフェノール層及び中間層に予め６５℃に加熱した水を加え、上記のフェノール抽出操作を再度行った。回収した水層を合わせ、１０分の１量の１Ｍ　ＮａＣｌ及び５倍量の冷エタノールを加えた後、遠心分離（７５００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により沈殿を回収した。沈殿を７０％エタノールで２回洗浄した後、ＭｉｌｌｉＱ水に懸濁し、ＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）により脱塩した。これを凍結乾燥して、多糖抽出物（ＰＳ）を得た。Ｐ２３株の培養上清から得たＰＳは６ｍｇ、ＡＤＰ１　ｍｃｓ２の培養上清から得たＰＳは１．５ｍｇ、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ培養上清から得たＰＳは２．０ｍｇであった。
　次いで、これらのＰＳの植物生長促進活性を評価した。評価は、菌を接種する代わりにＰＳを終濃度１０μｇ／ｍＬで添加した以外は、上記２－１．と同様の方法で実施した。
　結果を図８及び図９に示す。ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖのＰＳは、菌を接種せずに培養したコントロール及びＡＤＰ１　ｍｃｓ２のＰＳと比べて、コウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを増加させ、その活性の強さはＰ２３株のＰＳと同等であった。この結果から、Ｐ２３－２７５７～２７６１の導入により、Ｐ２３のＰＧＰＣと同等の活性を持つＰＧＰＣの産生が誘導されることが示された。
＜実施例４＞Ｐ２３－２７５９～２７６１の３遺伝子を導入した組換え菌の作製
　実施例１と同様に、Ｐ２３－２７５９～２７６１の３つの遺伝子を含む領域を配列番号１０及び９に示される塩基配列からなるプライマーセット（Ｆｐ２３ｎｏｖ及びＲｐ２３ｎｏｖ）を用いたＰＣＲで増幅し、制限酵素ＳｍａＩで開環させた広域宿主ベクターｐＢＢＲ－１　ＭＣＳ－２に組み込んで、プラスミドｍｃｓ－ｎｏｖ３を作製し、これをＡ．ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ－１に導入して、組換え菌ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３を作製した。プラスミドｍｃｓ－ｎｏｖ３中の前記３遺伝子の向きは、プラスミドｍｃｓ－ｎｏｖのそれと同じであった。
＜実施例５＞Ｐ２３－２７５９～２７６１の３遺伝子を有する組換え菌の植物生長促進活性評価
　ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ及びＡＤＰ１　ｍｃｓ２が有する植物生長促進活性について、ホーグランド培地に添加するＩＰＴＧの終濃度を０．０２ｍＭとした以外は実施例２の２－２．と同様の方法で評価した。結果を図１０及び図１１に示す。ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３を付着させて培養したコウキクサは、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖを付着させて培養した場合には及ばないものの、菌を付着させずに培養したコントロール及び空ベクターを導入したＡＤＰ１　ｍｃｓ２を付着させて培養した場合と比べて葉状体の数及び湿重量が増加した。また、プラスミドｍｃｓ－ｎｏｖ３をＥ．ｃｏｌｉに導入して得た組換え菌についても同様の傾向が認められた。この結果から、Ｐ２３－２７５９～２７６１を導入された菌もまた、植物生長促進活性を有することが示された。
＜実施例６＞Ｐ２３－２７５９～２７６１の３遺伝子を有する組換え菌により産生された多糖の植物生長促進活性評価
　ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ及びＡＤＰ１　ｍｃｓ２を、カナマイシン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）及びＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加した３００ｍＬのＭ９Ｓ培地中で、３０℃、３日間、１１０ｒｐｍで振盪しながら培養し、遠心分離及びろ過により培養上清を得た。この培養上清を硫酸アンモニウム沈殿（５０％飽和）、透析、凍結乾燥、熱フェノール抽出処理に順に供し、多糖抽出物（ＰＳ）を得た。個々の操作は実施例３と同様に行った。ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖの培養上清から得たＰＳは２．５ｍｇ、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３の培養上清から得たＰＳは２．３ｍｇ、ＡＤＰ１　ｍｃｓ２の培養上清から得たＰＳは２．０ｍｇであった。
　次いで、これらのＰＳの植物生長促進活性を実施例３と同様に評価した。結果を図１２及び図１３に示す。ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖ３のＰＳは、ＡＤＰ１　ｍｃｓ－ｎｏｖのＰＳと同じように、菌を接種せずに培養したコントロール及びＡＤＰ１　ｍｃｓ２のＰＳと比べてコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを増加させた。この結果から、Ｐ２３－２７５９～２７６１の導入によって、Ｐ２３－２７５７～２７６１の導入と同程度にＰＧＰＣの産生が誘導されることが示された。
　本発明は、ＰＧＰＣ関連遺伝子を有するＰ２３株以外の新たな微生物、又は遺伝子工学的手法を用いてＰＧＰＣ関連遺伝子を導入した組換え微生物を利用することで植物の生長を促進させることができ、バイオマス生産における産業上の利用可能性を有する。

Claims (13)

  1. 　下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス　Ｐ２３を除く）を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法。
    　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
  2. 　下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法。
    　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
  3. 　前記１）～５）の遺伝子の少なくとも３つを有する微生物を植物と共存させる工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記１）～５）の全ての遺伝子を有する微生物を植物と共存させる工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　植物がウキクサ科植物である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス　Ｐ２３を除く）を増殖させる工程を含む、植物生長促進物質の製造方法。
    　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
  7. 　下記の１）～５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を増殖させる工程を含む、植物生長促進物質の製造方法。
    　１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
    　５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
  8. 　前記１）～５）の遺伝子の少なくとも３つを有する微生物を増殖させる工程を含む、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 　前記１）～５）の全ての遺伝子を有する微生物を増殖させる工程を含む、請求項６又は７に記載の方法。
  10. 　下記１）～３）のいずれかのタンパク質。
    　１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
    　２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
    　３）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１～数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
  11. 　請求項１０に記載のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸。
  12. 　請求項１１に記載の核酸を発現可能に含むベクター。
  13. 　請求項１１に記載の核酸又は請求項１２に記載のベクターで形質転換された微生物。
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