WO2016181013A1 - Uso de oligosacáridos como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas y procedimiento de obtención - Google Patents

Uso de oligosacáridos como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas y procedimiento de obtención Download PDF

Info

Publication number
WO2016181013A1
WO2016181013A1 PCT/ES2016/070366 ES2016070366W WO2016181013A1 WO 2016181013 A1 WO2016181013 A1 WO 2016181013A1 ES 2016070366 W ES2016070366 W ES 2016070366W WO 2016181013 A1 WO2016181013 A1 WO 2016181013A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligosaccharides
chitin
plants
plant
obtaining
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2016/070366
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marta Berrocal Lobo
José Alfonso DOMÍNGUEZ NÚÑEZ
Inmaculada Aranaz Corral
Elisabeth A. Magel
Alexander Winkler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Hamburg
Universidad Politecnica de Madrid
Original Assignee
Universitaet Hamburg
Universidad Politecnica de Madrid
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Hamburg, Universidad Politecnica de Madrid filed Critical Universitaet Hamburg
Priority to US15/574,050 priority Critical patent/US20180297904A1/en
Publication of WO2016181013A1 publication Critical patent/WO2016181013A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05C—NITROGENOUS FERTILISERS
    • C05C11/00—Other nitrogenous fertilisers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to the use of acetylated oligosaccharides derived from chitin, in particular oligosaccharides between 1 and 6 monosaccharides in length and a 100% N-acetylglucosamine percentage as fertilizers.
  • the oligosaccharides can be used alone or mixed with other insoluble oligosaccharides or with fertilizers, either in solid form or in resuspension.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a plant fertilizer composed of a mixture of oligosaccharides of between 1 and 6 monosaccharides with an acetylation degree of 100% from chitin, which comprises heating and sonication.
  • Chitin is the second most abundant polysaccharide in nature, after cellulose, it is a biopolymer of high molecular weight, composed of glucose, rich in carbon and amino groups, which join forming N-acetylglucosamine and glucosamine in variable proportion, which gives it a high percentage of nitrogen and carbon in its composition.
  • glucosamine non-acetylated groups
  • chitosan approximately this occurs when the percentage of glucosamine is 60% or higher.
  • Chitosan as well as chitin, are used in laboratories and in crops as activators of the defense response in plants, as chitin, the main component of both the insect exoskeleton and spores of a high percentage of phytopathogenic fungi .
  • the effect that both chitosan and high molecular weight chitin produce in plants, activating at the molecular level, innate immunity and processes related to biotic stress is well known (Povero G et al. (201 1). Transcript profiling of chitosan -treated Arabidopsis seedlings. J Plant Res.
  • the kinase LYK5 is a major chitin receptor in Arabidopsis and forms a chitin-induced complex with related kinase CERK1. Elife Oct 23; 3. doi: 10.7554 / eLife.03766). It has been seen that this recognition activates a response in plants related to the stress caused by phytopathogens, a fact that has been found in various plant species such as rice, tomato, wheat, melon, soy or oak (Ebel, J. et al. ( 1994). Elicitors of plant defense responses. Int. Rev. Cytol. 148: 1-36; Shibuya, N. et al.
  • the present invention relates to obtaining a fertilizer composed of a mixture of acetylated chitin in a high percentage and partially digested, composed of small fragments which gives it an insoluble (and therefore non-contaminating) character and allows greater accessibility to its content in glucose and acetyl groups than the mentioned mixtures of chitin in its original polymeric state, avoiding the activation of stress in plants and the need by plants or other microorganisms or soil organisms to release chitinases for prior hydrolysis of this compound for absorption and digestion.
  • a large number of living organisms contain chitin in their structure (crustaceans, nematodes, insects, cephalopods, fungi, algae, etc.) and many microorganisms in the soil and the marine environment have chitinoclastic or chitinolytic capacity and use chitin as the main source of carbon and nitrogen for its growth.
  • chitinolytic microorganisms whether from the terrestrial or marine environment, belong mainly to the genera Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacter ⁇ a and Firmicutes; they are able to degrade the large polymers of chitin from the structures of other organisms (spore cover, shell of crustaceans, skeleton of insects, skeleton of cephalopods ...), transport small derivatives of chitin inside and use them as a source of carbon and nitrogen in its intermediate metabolism.
  • the molecular mechanism by which these organisms use chitin as a source of carbon and nitrogen is well known (LeCleir, GR et al. Chitinase Gene Sequences Retrieved from Environment-Specific Distributions.
  • chitin or chitosan in the form, exclusively, of high molecular weight polymer has two disadvantages for its use on plants, the first is mainly due to the fact that despite being degraded by microorganisms of the soil and the marine environment, As previously mentioned, these compounds are recognized by plants as potential components of fungal, nematode and insect walls, inducing a plant defense response associated with stress production with the consequent inhibition of vegetative growth. This stress response has been corroborated more recently, to a greater extent, by studying various genetic profiles obtained from the genome of plants treated with chitin in their original polymeric state, which is the exclusive form that has been used as a pesticide and fertilizer.
  • Chitin in nature appears associated with proteins, mineral salts and pigments that are eliminated during their extraction. 100% acetylated chitin is rare in nature being extracted from diatoms (Thalassiosira fluvialitis and Cytlotella cryptica). Chitosan is naturally only present in some fungi. Commercial chitosan samples are prepared from the chemical deacetylation of chitin from the shellfish exoskeleton. Deacetylation rarely occurs completely and therefore varying amounts of N-acetylglucosamine appear in the structure of the chitosan.
  • the process of chitin extraction and chemical preparation of chitosan from fungal mycelium or shellfish shell is well known, and includes several consecutive phases of washing and homogenization, demineralization with hydrochloric acid, deproteinization with sodium hydroxide, extraction with acetone and subsequent drying, the chitin deacetylation process to obtain chitosan also requires a second treatment with sodium hydroxide.
  • the method described in the present invention does not require the use of acids, since acetylated fragments are obtained from acetylated chitin in a high percentage, although the mixture obtained can be used to be subsequently deacetylated for other uses. That is why in the method of the present invention, it does not require the prior solubilization of chitin to obtain the fertilizer.
  • chitin comes from its natural origin and the source of production and its physicochemical properties may vary depending on the age of the individual, or their physiological state. This variability includes several parameters such as the relationship between acetylated and deacetylated units, their distribution along the chain, their crystalline structure and the length of the chains that compose it. Chitin in origin also varies according to the proportion of proteins, mineral salts and / or pigments or other compounds associated therewith and present in the individual at the time of extraction.
  • the chitin extracted from crustacean has an ⁇ -type crystalline structure while the isolated squid pen chitin has a ⁇ -type crystalline structure.
  • a third ⁇ -type polymorphic form has been described although it is not clear whether it really exists or appears due to processing to obtain chitin.
  • ⁇ -Chitin has a more open structure that makes it more accessible to attack by reactive agents and enzymes and in its composition is associated with a higher percentage of proteins than form a.
  • Inorganic nitrogen compounds have been used since the early twentieth century in virtually all of the industrial fertilizers used to this day. The over-exploitation of agroforestry soil has led to the loss of the organic nitrogen content of the soils and this has led to the uncontrolled and disproportionate use of inorganic nitrogen as fertilizer and its accumulation until saturation, both in terrestrial ecosystems and in coastal areas and oceans
  • nitrification and denitrification include, among others, the increase in the emission of greenhouse gases, mainly nitric oxide in the form of gas, the acidification of cultivated soil and the eutrophication of ecosystems, with the consequent production of areas dead both forest and agricultural.
  • soil biodiversity as well as that of the marine environment diminish or even disappear, with agroforestry systems being the most affected.
  • high amounts of nutrients are removed from the natural nitrogen cycle, making natural regeneration of the environment impossible.
  • the present invention allows to obtain an organic fertilizer, non-polluting of the environment, due to its insoluble character, based on highly acetylated and low molecular weight biopolymers, by means of a simple and cheap protocol, from chitin and / or its derivatives.
  • the present invention provides the use of oligosaccharides composed of N-acetylglucosamine as plant growth stimulators in already germinated plants, where the percentage of N-acetylglucosamine in said oligosaccharides is 100% and where the length of said oligosaccharides is between 1 and 6 monosaccharides, hereinafter use of the invention.
  • the oligosaccharides have a length between 1 and 6 monosaccharides, so they do not generate the plant stress produced by high molecular weight polymers.
  • This oligosaccharide mixture can be combined with those of high weight or used without combining.
  • the oligosaccharides are insoluble, so they do not cause contamination of the environment since they do not suffer from leaching or evaporation, remaining in the soil until they are degraded or consumed.
  • the present invention also provides a method of obtaining oligosaccharides composed of N-acetylglucosamine as plant growth stimulators in already germinated plants, where the percentage of N-acetylglucosamine in said oligosaccharides is 100%, where the length of said oligosaccharides is between 1 and 6 monosaccharides and where the procedure comprises the following stages:
  • step (b) heat the composition resulting from step (a) at a temperature between 120 and 180 e C for a time between 20 and 40 minutes and allow to cool to room temperature and
  • step (c) sonicating the composition resulting from step (b) to a power between 50 and 60 Hz for a time between 5 and 120 minutes at a temperature between 20 and 25 and C, hereinafter method of the invention.
  • the chitin used in step (a) of the process of the invention can (preferably be) be homogenized with mortar and / or grinder, or industrial grinder until a homogeneous mixture with floury texture is obtained. Depending on the origin of chitin, prior deproteinization, demineralization, discoloration or other additional purification process that does not require solubilization may be necessary.
  • the chitin of step (a) can be derived from all types of materials of organic or industrial origin that contain chitin or chitosan and that have been modified to obtain acetylated chitin between 95% and 100%.
  • chitin must be acetylated between 95 and 100%. If the proportion of starting acetylated chitin is less than 50%, forming chitosan, the product finally obtained will be different from that obtained in the process of the invention, therefore in this case the chitin may also require a prior acetylation process or Another additional modification.
  • the chitin can be resuspended in a solution of distilled water with a "MiliQ" type purity level, which is preferably at a starting pH value of between 5-8.
  • the final pH value of the suspension will be that provided by the product in said suspension.
  • This pH value can be adjusted by adding a pH regulator. For example, it can be adjusted to a pH value of 5 to 6.
  • the pH value does not affect the product in that range, nor the activity detected in the final mixture.
  • the temperature during step (c) of the process of the invention should not exceed 25 e C. The modification of this temperature may affect the properties of the product.
  • step (c) of the process of the invention an Ultrasons-H type sonicator, an industrial sonicator or similar apparatus can be used preferably using the recommended power and temperature.
  • step (a) the chitin is resuspended at a concentration between 0.04 to 4 g / l.
  • step (c) the composition resulting from step (c) is subjected to a drying process.
  • composition resulting from step (c) may be dried by different methods, such as rotary evaporation, evaporation or high temperature drying for later use, without affecting the drying method to the final composition of the mixture. Drying allows both transport and storage of the mixture, as well as the direct treatment of the medium to be treated with the mixture directly in its solid state if required.
  • the product obtained by the process of the invention can be used in solid state or in resuspension in distilled water, as it has been obtained and since it is in sterile conditions, it can be stored without being contaminated, both at room temperature and in a refrigerator at 4 e C. It can also be resuspended in other liquids as long as they do not affect their physical chemical properties. It is advisable to store the product obtained by the process of the invention at a temperature between 4 e C to 25 e C, since this temperature range will not affect the properties of the product, either in resuspension or in solid state.
  • the product obtained can also be mixed in different proportions with chitins and chitosans of high and low molecular weight to obtain the desired effects, as well as with existing microorganisms, substances or market products, for a very diverse use, having to maintain their physical chemical properties if it is intended to obtain the effect described in the present invention.
  • the process of the invention allows obtaining a fertilizer that could be obtained from any of the above-mentioned chitins of various origin, including that chitin or chitosan from industrial use, provided that the starting compound was the one described herein invention. Therefore the procedure allows the recycling of chitin and its derivatives for later use as organic fertilizers.
  • the process of the invention allows obtaining biopolymers rich in organic nitrogen, insoluble and low molecular weight that can be directly metabolizable by chitinolytic microorganisms, providing them with a partially "digested” food source.
  • the presence of these biopolymers in the medium produces, as a consequence, the stimulation of plant growth, so that these biofertilizers, obtained by the process of the invention, are excellent restorators of the biomass of overexploited soils and degraded soils, such as, agricultural land over exploited, poor in nitrogen or disused, or forest soils burned or degraded by other causes.
  • the biofertilizers obtained with the process of the invention are biocomposites in a partially digested state; the organisms that use them as a source of carbon and nitrogen do not need to digest them by releasing chitinolytic enzymes, which allows them considerable energy savings. Additionally, they contain organic nitrogen, are obtained through a low-cost process and lastly, they are insoluble and therefore, they are not released into the atmosphere or dissolved in water, nor do they contain acidic substances that can alter the composition of the environment, in addition to be metabolized with high performance by and at the rate required by soil microorganisms. As mentioned, the product obtained by the process of the invention, being of low molecular weight is not recognized by plants as a component of the structure of the phytopathogen and therefore does not generate the stress response they produce, being this stress response generally associated with the inhibition of vegetative development.
  • the method of application of the product can be very diverse, whether in suspension, in a solution of drip irrigation, spraying, ground injection, root immersion or dry application, whether or not compacted .
  • concentration of the product can vary according to the use, depending on the desired effect and the plant species, cell culture, microbiological, substrate, solution ... etc where the product is applied.
  • the product obtained by the process of the invention can be used as a biofertilizer on any type of substrate or known growth medium, as a source of carbon and nitrogen from various organisms as well as an industrial product for various pharmacological and chemical applications.
  • Figure 1 Maldi-tof analysis of the mixture obtained indicating the composition and molecular weight of the oligosaccharides thereof. The peaks obtained in the analysis, and the corresponding molecular weights (m / z) of the chitin-derived oligosaccharides obtained are indicated.
  • FIG. 3 The total carbon content of Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0) seedlings, treated with the product (CHL) and with the high molecular weight mixture (CHH), is shown after twenty days of growth in a medium. controlled under "in vitro" laboratory conditions, compared to untreated plants, grown under the same conditions.
  • FIG. 4 The increase in fresh weight of Arabidopsis thaliana plants, Columbia ecotype (Col-0), treated with the product (CHL) and with the high molecular weight mixture (CHH) and untreated after 20 days is shown. of growth, in a controlled environment under laboratory conditions "in vitro".
  • purified powder composed of Sigma # C9752 ultraphatic chitin (Sant Louis, MO, USA) was used, with a degree of acetylation of 95% (Lot N e : 107K7005V), derived from prawn shells, and composed of Poly (N-acetyl-D-glucosamine), Poly- (1 ⁇ 4) ⁇ - N-acetyl-D-glucosamine, of molecular formula C 8 Hi 5 N0 6 and weight molecular 221, 2078.
  • the starting material was homogenized in porcelain mortar until a mixture of floury texture was obtained and the powder was re-suspended in distilled water (Milipore, MiliQ water) in a dark and frosted glass canister, at a concentration of 100mg / l , a volume of 5 ml of each solution was prepared.
  • distilled water Milipore, MiliQ water
  • the solution was autoclaved for 20 minutes at 121 e C (P-Selecta autoclave).
  • the product was allowed to cool to room temperature, after which it was subjected to a sonication process at a power of 50 Hz in a water bath for 5 minutes at a temperature not exceeding 25 e C.
  • the product was stored at room temperature of no more than 25 e C or 4 e C if it was not used on the same day.
  • a Maldi-Tof analysis of the product obtained was performed. The results are presented in Table 1 and in Figure 1. Table 1 . Results of the Maldi-tof analysis.
  • the peaks obtained in the analysis are indicated, corresponding to the molecular weights (m / z) of the oligosaccharides derived from chitin, in the acetylated state (A), corresponding A2 to the dimer, A3 to the trimer, A4 to the tetramer, A5 to the pentamer and A6 to the chitin hexamer, indicating the intensity of each oligosaccharide in the mixture and the corresponding percentage of each within the mixture, according to its intensity.
  • Theoretical molecular weights are indicated, depending on the adduct formed with the Na + ion.
  • Example 2 Growth tests of Arabidopsis thaliana plants.
  • the product obtained in example 1 was applied, sterile and resuspended in water at a concentration of 50 mg / l and 100 mg / l (addition at a temperature below 65 e C) on a hot sterile liquid medium, containing Murashige & Skoog (No # 1 B-M0233, Duchefa Biochemie, NY, USA) which contains half of the Nitrogen supplied as standard To obtain adequate growth of these plants and bacteriological agar at a concentration of 9 g / l and 1% sucrose (weight / volume), the pH of the medium was adjusted to 5.75 with dilute hydrochloric acid. A volume of 30-40 ml of this medium was applied on square petri dishes until completely solidified.
  • the seeds inside the plates and covered with aluminum foil were stratified, in order to synchronize their germination for which they were subjected to a temperature of 4 e C in darkness for two days, after which, the Plates placed on vertical supports and germinated and grew, up to 21 days, in a controlled growth chamber in cycles of 23 e C for 16 hours of light and 20 e C for 8 hours of darkness, with a constant relative humidity of 60% and under a light intensity of between 100-150 mE / m 2 using fluorescent tubes of the Growlux® type as lighting. The values of the length of the main root of each plant were taken at different times. The increase of the fresh weight of the treated and untreated plants with the product as well as with the same mixture of the untreated product was estimated.
  • Example 3 Determination of the content of Nitrogen and Carbon in Arabidopsis thaliana plants.
  • the product obtained in example 1 was applied at a concentration of 50 and 100 mg / l, on the growth medium described in example 2 on the plates described in example 2. 300 seeds of Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia, were deposited. For each plate.
  • Said seeds were previously sterilized and stratified as indicated in example 2, after which the plates were placed vertically and germinated and grown, up to a maximum of 21 days, in a controlled growth chamber in cycles of 23 e C for 16 hours of light and 20 e C for 8 hours of darkness, with a constant relative humidity of 60% and under a light intensity of between 100-150 mE / m 2 using fluorescent tubes of the Growlux® type as lighting.
  • After different times of growth chosen tissue from each plate was made and allowed to dry in an oven and 65-70 C for at least 48 hours. The tissues were finely ground and homogenized. The concentration of N and C was determined using a mass analyzer (LECO CHN-600) according to the manufacturer's instructions. In each block (3 blocks), they were collected and grouped in a sample of 12 plants per treatment.
  • the total Nitrogen and Carbon content in the treated plants compared to the untreated ones was detected by detecting an increase of between 8 and up to 15% after the first 14 days of growth, in the plants supplemented with the product compared to those not supplemented. , this value could vary, depending on the molecular weight of the treatment mixture (CHL: Chitin mixture of low molecular weight obtained by the protocol described in example 1 or CHH: Commercial ultrapure chitin of high molecular weight, from shrimp shell High molecular weight Sigma # C9752 with 99% purity and at least 95% acetylation grade).
  • CHL Chitin mixture of low molecular weight obtained by the protocol described in example 1
  • CHH Commercial ultrapure chitin of high molecular weight, from shrimp shell High molecular weight Sigma # C9752 with 99% purity and at least 95% acetylation grade.
  • Example 4 Growth trials of Populus tr ⁇ cocarpa plants.
  • Each explant measured between three and four centimeters in length and contained a leaf.
  • the trees were transplanted to glass tubes 2.7 cm wide by 14cm high, containing the medium described in example 2. Growth parameters were monitored by measuring the main root and stem along different weeks, up to a maximum of three months, observing an increase in root growth of up to 8% in plants supplemented with the product with respect to the control plants not supplemented.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Abstract

Uso de oligosacáridos como estimuladores del crecimiento vegetal de plantas ya germinadas y procedimiento de obtención. Uso de oligosacáridos compuestos de N- acetilglucosamina y glucosamina como estimuladores del crecimiento vegetal de plantas ya germinadas, donde el porcentaje de N-acetilglucosamina en dichos oligosacáridos es dichos oligosacáridos es del 100% y donde la longitud de dichos oligosacáridos es de entre 1 y 6 monosacáridos. Procedimiento de obtención de dichos oligosacáridos que comprende: (a) resuspender quitina con un porcentaje de N-acetilglucosamina entre un 85% y un 100% en agua, (b) calentar la composición resultante a una temperatura entre 120 y 180º C durante un tiempo entre 20 y 40 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente y (c) sonicar la composición resultante a una potencia entre 50 y 60 Hz durante un tiempo entre 5 y 120 minutos a una temperatura entre 20 y 25º C.

Description

USO DE OLIGOSACÁRIDOS COMO ESTIMULADORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL EN PLANTAS YA GERMINADAS Y PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN
DESCRIPCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al uso de oligosacáridos acetilados derivados de quitina, en concreto oligosacáridos de entre 1 y 6 monosacáridos de longitud y un porcentaje de N- acetilglucosamina del 100% como fertilizantes. Los oligosacáridos pueden utilizarse en solitario o mezclados con otros oligosacáridos insolubles o con fertilizantes, ya sea en estado sólido o en resuspensión. La presente invención también se refiere a un procedimiento de obtención de un fertilizante para plantas compuesto por una mezcla de oligosacáridos de entre 1 y 6 monosacáridos con un grado de acetilación del 100% a partir de quitina, que comprende calentamiento y sonicación.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La quitina es el segundo polisacárido más abundante en la naturaleza, después de la celulosa, es un biopolímero de alto peso molecular, compuesto por glucosa, rica en carbono y grupos amino, que se unen formando N-acetilglucosamina y glucosamina en proporción variable, lo que le confiere un alto porcentaje en nitrógeno y carbono en su composición. Cuando la cantidad de glucosamina (grupos no acetilados) es lo suficientemente elevada el polímero se hace soluble en medios ácidos acuosos y recibe el nombre de quitosano (aproximadamente esto ocurre cuando el porcentaje de glucosamina es del 60% o superior).
Entre las muy diversas alternativas que se han empleado hasta la fecha como fertilizantes se encuentra el uso de biopolímeros naturales derivados de quitina, solubles y de alto peso molecular, sin embargo su uso y comercialización como fertilizantes no se ha extendido quizá debido a sus conocidas propiedades como activadores de la defensa vegetal y por tanto activadores del estrés en las plantas. La activación del estrés en plantas viene comúnmente asociada a una inhibición del crecimiento vegetal y es por esto que ambos compuestos se han utilizado más comúnmente como plaguicidas y acompañantes de fertilizantes (Khoushab F et al. Chitin research revisited. Mar Drugs. June 28;8(7):1988- 2012; Ramírez M. A et al. (2010). Chitin and its derivatives as biopolymers with potential agricultural applications. Biotechnol. Api. Dec;27:4; Zhang J et al. (2010). Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol Plant. 3(5): 783-93). El quitosano, así como la quitina, son utilizados en laboratorio y en cultivos como activadores de la respuesta de defensa en las plantas, por ser la quitina, el componente principal tanto del exoesqueleto de insectos como de las esporas de un alto porcentaje de hongos fitopatógenos. El efecto que tanto el quitosano como la quitina de alto peso molecular, producen en plantas, activando a nivel molecular, la inmunidad innata y procesos relacionados con estrés biótico es bien conocido (Povero G et al. (201 1 ). Transcript profiling of chitosan-treated Arabidopsis seedlings. J Plant Res. 201 1 Sep;124(5):619-29; Zhang J. et al. (2010). Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol Plant. 3(5): 783- 93; Ramonell, K. M. et al. (2002). Microarray analysis of chitin elicitation in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant Pathology 3(5): 301 -31 1 ; Ramonell, K. et al. (2005). Chitin: An elicitor which induces genes implicated in Powdery Mildew Defense responses. Plant Phys. 138:2; Berrocal-Lobo M et al. (2010). ATL9, a RING Zinc Finger Protein with E3 Ubiquitin Ligase Activity Implicated in Chitin and NADPH Oxidase-Mediated Defense Responses. PLoS ONE 5(12): e14426.) Diversos estudios han determinado que los fragmentos de quitina de una longitud de 8 monómeros son reconocidos de forma específica y con mayor afinidad por receptores capaces de activar la respuesta inmune vegetal (Miya A et al. (2007). CERK1 , a LysM receptor kinase, is essential for chitin elicitor signaling in Arabidopsis. Proc Nati Acad Sci U S A. Dec 4;104(49):19613-8; Liu T et al. (2012). Chitin-induced dimerization activates a plant immune receptor. Science. Jun 1 ;336(6085):1 160-4. doi: 10.1 126/science.1218867; Akamatsu A et al. (2013). An OsCEBiP/OsCERK1 -OsRacGEF1 - OsRad module is an essential early component of chitin-induced rice immunity. Cell Host Microbe. Apr 17;13(4):465-76; Hayafune M et al. (2014). Chitin-induced activation of immune signaling by the rice receptor CEBiP relies on a unique sandwich-type dimerization. Proc Nati Acad Sci U S A. Jan 21 ;1 1 1 (3):E404-13; Cao Y et al. (2014). The kinase LYK5 is a major chitin receptor in Arabidopsis and forms a chitin-induced complex with related kinase CERK1 . Elife. Oct 23;3. doi: 10.7554/eLife.03766). Se ha visto que este reconocimiento activa una respuesta en las plantas relacionada con el estrés causado por fitopatógenos, hecho que se ha constatado en diversas especies vegetales como arroz, tomate, trigo, melón, soja o encina (Ebel, J. et al. (1994). Elicitors of plant defense responses. Int. Rev. Cytol. 148:1 -36; Shibuya, N. et al. (1996). Localization and binding characteristics of a high- affinity binding site for N-Acetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membrane from suspension-cultured rice cells suggest a role as a receptor for the elicitor signal at the cell surface. Plant Cell Physiol. 37:894-898; Stacey G et al. (1997) Chitin Recognition in rice and legumes. Plant Soil 194: 161 -169; Yamada, A. et al. (1993) Induction of phytoalexin formation in suspension-cultured rice cells by N-acetylchitooligosaccharides. Biosci. Biotech. Biochem. 57: 405-409; Félix, G. et al. (1993). Specific perception of subnanomolar concentrations of chitin fragments by tomato cells: Induction of extracellular alkalinization, changes in protein phosphorylation, and establishment of a refractory state. Plant J. 4:307- 316; Roby, D. et al. (1987). Chitin oligosaccharides as elicitors of chitinase activity in melon plants. Biochem. Biophys. Res. Commun. 143:885-892; Day, R. B. et al. (2001 ). Binding site for c itin oligosaccharides in the soybean plasma membrane. Plant Physiol. 126:1 162-1 173; Nishizawa, Y. et al. (1999). Regulation of the chitinase gene expression in suspension- cultured rice cells by N-acetylchitooligosaccharides: Differences in the signal transduction pathways leading to the activation of elicitor-responsive genes. Plant Mol. Biol. 39:907-914). Es por ello que tanto la quitina como el quitosano de alto peso molecular, han sido empleados mezclados o por separado incluso combinados, acompañando a otras sustancias como activadores de la defensa y el estrés en plantas.
La presente invención se refiere a la obtención de un fertilizante compuesto por una mezcla de quitina acetilada en un alto porcentaje y parcialmente digerida, compuesta por fragmentos pequeños lo que le concede un carácter insoluble (y por ello no contaminante) y permite una mayor accesibilidad a su contenido en glucosa y grupos acetilo que las mezclas citadas de quitina en su estado polimérico original, evitando la activación de estrés en la plantas y la necesidad por parte de las plantas o de otros microorganismos u organismos del suelo de liberar quitinasas para la hidrólisis previa de este compuesto para su absorción y digestión.
Un alto número de organismos vivos contienen quitina en su estructura (crustáceos, nematodos, insectos, cefalópodos, hongos, algas, etc.) y muchos microorganismos del suelo y del medio marino poseen capacidad quitinoclástica ó quitinolítica y utilizan la quitina como fuente principal de carbono y nitrógeno para su crecimiento. Estos microorganismos quitinolíticos, ya procedan del medio terrestre o marino pertenecen principalmente a los géneros Proteobactería, Bacteroidetes, Actinobactería y Firmicutes; son capaces de degradar los grandes polímeros de quitina procedentes de las estructuras de otros organismos (cubierta de esporas, caparazón de crustáceos, esqueleto de insectos, esqueleto de cefalópodos...), transportar los pequeños derivados de quitina al interior y utilizarlos como fuente de carbono y nitrógeno en su metabolismo intermedio. El mecanismo molecular por el que estos organismos utilizan la quitina como fuente de carbono y nitrógeno es bien conocido (LeCleir, G. R. et al. Chitinase Gene Sequences Retrieved from Environment-Specific Distributions. 2004, 70(12):6977. DOI:Appl. Environ. Microbiol. 10.1 128/AEM.70.12.6977-6983.2004). Por otro lado, el posible mecanismo de utilización de estos biopolímeros de quitina por parte de las plantas es desconocido a nivel molecular, aunque se conocen receptores específicos de los mismos, así como de transportadores de amonio o de glucosa, que son los componentes principales de dichos biopolímeros. Es bien conocido que las plantas reconocen la quitina de alto peso molecular y liberan enzimas quitinasas que producen su degradación evitando el crecimiento del patógeno atacante, los fragmentos resultantes sirven de alimento a la microflora del suelo.
La utilización de quitina o quitosano, en forma, exclusivamente, de polímero de alto peso molecular tiene dos desventajas para su uso sobre las plantas, la primera es principalmente debido a que a pesar de ser degradada por los microorganismos del suelo y del medio marino, tal y como se ha citado previamente, estos compuestos son reconocidos por las plantas como potenciales componentes de las paredes de hongos, nematodos e insectos induciendo una respuesta de defensa vegetal asociada a la producción de estrés con la consecuente inhibición del crecimiento vegetativo. Esta respuesta a estrés se ha corroborado más recientemente, en mayor extensión, mediante el estudio de diversos perfiles genéticos obtenidos del genoma de plantas tratadas con quitina en su estado polimérico original, que es la forma exclusiva que ha sido utilizada como plaguicida y fertilizante. En estos casos se ha visto que grupos o clusters de genes están induciendo una activación de respuesta de defensa relacionada con el estrés biótico y la presencia de hongos (Ramonell, K. M. et al. (2002). Microarray analysis of chitin elicitation in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant Pathology 3(5): 301 -31 1 ; Berrocal-Lobo M et al. (2010). ATL9, a RING Zinc Finger Protein with E3 Ubiquitin Ligase Activity Implicated in Chitin and NADPH Oxidase-Mediated Defense Responses. PLoS ONE 5(12): e14426).
Debido a estos datos cabe esperar que la actividad beneficiosa de estos biopolímeros, de alto peso molecular, haya sido más bien atribuida al efecto positivo que producían sobre el desarrollo de la biomasa de los microorganismos quitinolíticos del suelo, más que al efecto directo que pudieran producir en las plantas tratadas.
La segunda desventaja de los compuestos de alto peso molecular es que el derivado más común, el quitosano, al ser desacetilado es soluble en ácidos y se administra diluido en dichos ácidos, con la consiguiente contaminación que produce tanto por lixiviación como por evaporación, este polímero también es bien conocido por su efecto activador del estrés en las plantas (Povero G et al. (201 1 ). Transcript profiling of chitosan-treated Arabidopsis seedlings. J Plant Res. 201 1 Sep;124(5):619-29).
La quitina en la naturaleza, aparece asociada a proteínas, sales minerales y pigmentos que son eliminadas durante su extracción. La quitina 100% acetilada es poco frecuente en la naturaleza siendo extraída de diatomeas {Thalassiosira fluvialitis y Cytlotella cryptica). El quitosano de forma natural sólo está presente en algunos hongos. Las muestras de quitosano comercial se preparan a partir de la desacetilación química de la quitina a partir del exoesqueleto de crustáceos. La desacetilación rara vez se produce de forma completa y por ello en la estructura del quitosano aparecen cantidades variables de N- acetilglucosamina. El proceso de extracción de quitina y de preparación química de quitosano a partir de micelio de hongos o de caparazón de crustáceos es bien conocido, e incluye varias fases consecutivas de lavado y homogeneizado, demineralización con ácido clorhídrico, desproteinización con hidróxido sódico, extracción con acetona y posterior secado, el proceso de desacetilación de la quitina para la obtención de quitosano requiere además, de un segundo tratamiento con hidróxido sódico. El método descrito en la presente invención no precisa del uso de ácidos, dado que se obtienen fragmentos acetilados a partir de quitina acetilada en un alto porcentaje, aunque la mezcla obtenida puede servir para ser desacetilada con posterioridad para otros usos. Es por ello que en el método de la presente invención, tampoco requiere de la solubilización previa de la quitina para la obtención del fertilizante.
La variabilidad de la quitina proviene de su origen natural y de la fuente de obtención y sus propiedades fisicoquímicas pueden variar dependiendo de la edad del individuo, o su estado fisiológico. Esta variabilidad incluye varios parámetros como la relación entre unidades acetiladas y desacetiladas, su distribución a lo largo de la cadena, su estructura cristalina y la longitud de las cadenas que la componen. La quitina en origen también varía según la proporción de proteínas, sales minerales y/o pigmentos u otros compuestos asociados a la misma y presentes en el individuo en el momento de la extracción.
La quitina extraída de crustáceo presenta una estructura cristalina tipo α mientras que la quitina aislada de pluma de calamar presenta una estructura cristalina tipo β. Se ha descrito una tercera forma polimórfica tipo γ aunque no está claro si existe realmente o aparece debido al procesado para obtener la quitina. La β-quitina presenta una estructura más abierta que la hace más accesible al ataque de agentes reactivos y enzimas y en su composición se asocia con un mayor porcentaje de proteínas que la forma a. Los compuestos de nitrógeno inorgánico se han utilizado desde principios del siglo XX en prácticamente la totalidad de los fertilizantes industriales utilizados hasta nuestros días. La sobre-explotación del suelo agroforestal ha llevado a la pérdida del contenido de nitrógeno orgánico de los suelos y esto ha llevado al uso incontrolado y desproporcionado del nitrógeno inorgánico como fertilizante y a su acumulación hasta la saturación, tanto en ecosistemas terrestres como en zonas costeras y océanos.
Debido, principalmente, a la solubilidad de estos compuestos, tan sólo un tercio del nitrógeno aportado por los fertilizantes inorgánicos es asimilado por los cultivos, el resto es liberado a la atmósfera y al agua de escorrentía. Los principales efectos producidos por la nitrificación y denitrificación incluyen, entre otros, el incremento en la emisión de gases invernadero, principalmente óxido nítrico en forma de gas, la acidificación del suelo de cultivo y la eutrofizacion de los ecosistemas, con la consiguiente producción de áreas muertas tanto forestales como agrícolas. Dentro de estos cambios y bajo estas condiciones, la biodiversidad del suelo así como la del medio marino disminuyen o incluso desaparecen, siendo los sistemas agroforestales los más afectados. Como resultado de la sobreexplotación agrícola altas cantidades de nutrientes son removidas del ciclo natural del nitrógeno provocando que la regeneración natural del medio resulte imposible.
En la actualidad los altos niveles de contaminación por nitrógeno y la sobre-explotación de suelo agroforestal son tan altos que se hace necesaria la búsqueda urgente de nuevas alternativas a los fertilizantes de nitrógeno inorgánico actuales. En esta línea, la presente invención permite la obtención de un fertilizante orgánico, no contaminante del medio, debido a su carácter insoluble, basado en biopolímeros altamente acetilados y de bajo peso molecular, mediante un protocolo sencillo y barato, a partir de quitina y/o sus derivados.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona el uso de oligosacáridos compuestos de N- acetilglucosamina como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas, donde el porcentaje de N-acetilglucosamina en dichos oligosacáridos es del 100% y donde la longitud de dichos oligosacáridos es entre 1 y 6 monosacáridos, en adelante uso de la invención. Los oligosacáridos tienen una longitud entre 1 y 6 monosacáridos, por lo que no generan el estrés vegetal producido por los polímeros de alto peso molecular. Esta mezcla de oligosacáridos puede combinarse con los de alto peso o usarse sin combinar. Los oligosacáridos tienen carácter insoluble, por lo que no producen contaminación del medio ya que no sufren lixiviación o evaporación, permaneciendo en el suelo hasta que son degradados o consumidos.
La presente invención también proporciona un procedimiento de obtención de oligosacáridos compuestos de N-acetilglucosamina como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas, donde el porcentaje de N-acetilglucosamina en dichos oligosacáridos es del 100%, donde la longitud de dichos oligosacáridos es entre 1 y 6 monosacáridos y donde el procedimiento comprende las siguientes etapas:
(a) resuspender quitina (previamente homogeneizada) con un porcentaje de N- acetilglucosamina entre un 95% y un 100% en agua,
(b) calentar la composición resultante de la etapa (a) a una temperatura entre 120 y 180eC durante un tiempo entre 20 y 40 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente y
(c) sonicar la composición resultante de la etapa (b) a una potencia entre 50 y 60 Hz durante un tiempo entre 5 y 120 minutos a una temperatura entre 20 y 25eC, en adelante procedimiento de la invención.
La quitina utilizada en la etapa (a) del procedimiento de la invención se (debe preferentemente) puede homogeneizar con mortero y/o molinillo, o moledora industrial hasta la obtención de una mezcla homogénea con textura harinosa. Dependiendo del origen de la quitina, puede ser necesario una desproteinización previa, desmineralización, decoloración u otro proceso de purificación adicional que no requiere de su solubilizacion. La quitina de la etapa (a) puede proceder de todo tipo de materiales de origen orgánico o industrial que contengan quitina o quitosano y que hayan sido modificados hasta obtener quitina acetilada entre un 95% y un 100%.
Para asegurar la obtención de una mezcla enriquecida con oligosacáridos de bajo peso molecular que no sean solubles, la quitina debe estar acetilada entre un 95 y un 100%. Si la proporción de quitina acetilada de partida es inferior al 50%, formando quitosano, el producto obtenido finalmente será distinto al obtenido en el procedimiento de la invención, por tanto en este caso la quitina puede requerir también de un proceso previo de acetilación o de otra modificación adicional. En la etapa (a) del procedimiento de la invención, la quitina se puede resuspender en una solución de agua destilada con un nivel de pureza tipo "MiliQ", que se encuentre a un valor de pH de partida de entre 5-8 preferentemente. El valor final de pH de la suspensión será el proporcionado por el producto en dicha suspensión. Este valor de pH podrá ajustarse añadiendo un regulador de pH. Por ejemplo, se puede ajustar a un valor de pH de 5 a 6. El valor de pH no afecta al producto en ese intervalo, ni a la actividad detectada de la mezcla final. La temperatura durante la etapa (c) del procedimiento de la invención no debe superar los 25eC. La modificación de esta temperatura puede afectar a las propiedades del producto.
En la etapa (c) del procedimiento de la invención, se puede utilizar preferentemente un sonicador de tipo Ultrasons-H, un sonicador industrial o aparato similar utilizando la potencia y temperatura recomendadas.
Otra realización es el procedimiento de la invención, donde en la etapa (a) la quitina se resuspende a una concentración entre 0,04 a 4 g/l. Otra realización es el procedimiento de la invención, donde la composición resultante de la etapa (c) se somete a un proceso de secado.
La composición resultante de la etapa (c) podrá secarse por diferentes métodos, como roto- evaporación, evaporación o secado a alta temperatura para su posterior uso, no afectando el método de secado a la composición final de la mezcla. El secado permite tanto el transporte como el almacenamiento de la mezcla, así como el tratamiento directo del medio a tratar con la mezcla directamente en su estado sólido si se requiere.
El producto obtenido por el procedimiento de la invención podrá utilizarse en estado sólido o en resuspensión en agua destilada, tal y como ha sido obtenido y dado que se encuentra en condiciones estériles, podrá ser almacenado sin sufrir contaminaciones, tanto a temperatura ambiente como en frigorífico a 4eC. También podrá resuspenderse en otros líquidos siempre que éstos no afecten a sus propiedades químico físicas. Es recomendable almacenar el producto obtenido por el procedimiento de la invención a una temperatura entre 4eC a 25eC, dado que este intervalo de temperaturas no afectará a las propiedades del producto, ya sea en resuspensión o en estado sólido. El producto obtenido también puede mezclarse en distintas proporciones con quitinas y quitosanos de alto y bajo peso molecular para obtener los efectos deseados, así como con microorganismos, sustancias o productos del mercado ya existentes, para un uso muy diverso, debiendo mantener sus propiedades químico físicas si se pretende obtener el efecto descrito en la presente invención.
El procedimiento de la invención permite la obtención de un fertilizante que podría ser obtenido a partir de cualquiera de las quitinas de diverso origen anteriormente citadas, incluida aquella quitina o quitosano procedentes de uso industrial, siempre que el compuesto de partida fuera el descrito en la presente invención. Por tanto el procedimiento permite el reciclaje de quitina y sus derivados para su uso posterior como fertilizantes orgánicos.
El procedimiento de la invención permite la obtención de biopolímeros ricos en nitrógeno orgánico, insolubles y de bajo peso molecular que pueden ser directamente metabolizables por parte de los microorganismos quitinolíticos, proporcionándoles una fuente de alimento parcialmente "digerida". La presencia de estos biopolímeros en el medio produce, como consecuencia, la estimulación del crecimiento vegetal, por lo que estos biofertilizantes, obtenidos mediante el procedimiento de la invención, son excelentes restauradores de la biomasa de suelos sobreexplotados y suelos degradados, como por ejemplo, terrenos agrícolas sobre explotados, pobres en nitrógeno o en desuso, o suelos forestales quemados o degradados por otras causas.
Los biofertilizantes obtenidos con el procedimiento de la invención son biocompuestos en un estado parcialmente digerido; los organismos que los utilizan como fuente de carbono y nitrógeno no requieren digerirlos mediante la liberación de enzimas quitinolíticas, lo que les permite un considerable ahorro energético. Adicionalmente contienen nitrógeno orgánico, se obtienen mediante un proceso de bajo coste y por último, son insolubles y por tanto, no se liberan a la atmósfera o se disuelven en el agua, tampoco contienen sustancias ácidas que puedan alterar la composición del entorno, además de ser metabolizados con alto rendimiento por y al ritmo que lo requieran los microorganismos del suelo. Tal y como se ha mencionado, el producto obtenido por el procedimiento de la invención, al ser de bajo peso molecular no es reconocido por las plantas como componente de la estructura del fitopatógeno y por tanto no genera la respuesta a estrés que producen éstos, estando esta respuesta a estrés asociada generalmente a la inhibición del desarrollo vegetativo.
Dada la gran versatilidad en sus posibles usos el método de aplicación del producto puede ser muy diverso, ya sea en suspensión, en una solución de riego por goteo, pulverización, inyección en tierra, inmersión radicular o aplicado en seco, ya sea o no compactado. La concentración del producto puede variar según el uso, dependiendo del efecto deseado y de la especie vegetal, cultivo celular, microbiológico, sustrato, solución...etc donde el producto sea aplicado.
El producto obtenido por el procedimiento de la invención puede utilizarse como biofertilizante sobre cualquier tipo de sustrato o medio de crecimiento conocido, como fuente de carbono y nitrógeno de diversos organismos así como producto industrial para diversas aplicaciones farmacológicas y químicas.
Resulta posible la combinación del producto obtenido por el procedimiento de la invención con otros compuestos y fertilizantes orgánicos o inorgánicos de uso corriente y de alto contenido en nitrógeno, carbono o potasio como son el guano procedente de aves, murciélagos... etc u otras formas de administración de urea, la harina de peces, la harina de cuernos o huesos, la sangre de productos cárnicos, la harina de plumas, el estiércol de distinto origen, la alfalfa, los lodos de depuradora, el serrín, el compost procedente de gusanos y/o bacterias, los extractos de algas marinas, la paja... etc.
Recientemente se han publicado patentes sobre la preparación de materiales basados en quitina y quitosano con el objeto de producir bioplásticos (Fernandez J G et al. (2014). Man ufactu ring of Large-Scale Functional Objects Using Biodegradable Chitosan. Bioplastic Macromol. Mater. Eng. 2014, 299, 932-938; WO2013131079A1 ). Cualquiera de estos objetos podrían ser reciclados y usados como fertilizantes mediante el procedimiento de la invención después de someter el producto a un tratamiento de reacetilación en caso de que fuera necesario. Cualquier material derivado de quitina y/o quitosano empleado por diversas industrias como la alimentaria (materiales de empaquetamiento, bolsas....), biomédica (cápsulas, pildoras, membranas ...) u otras, podría ser reciclado análogamente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 . Análisis mediante Maldi-tof de la mezcla obtenida indicando la composición y el peso molecular de los oligosacáridos de la misma. Se indican los picos obtenidos en el análisis, y los correspondientes pesos moleculares (m/z) de los oligosacáridos derivados de la quitina obtenidos.
Figura 2. Se muestra el incremento en el contenido de nitrógeno total de plantas de Arabidopsis thaliana crecidas en medio pobre de nitrógeno, tratadas el producto (CHL) y con la mezcla de alto peso molecular (CHH) tras diez días del tratamiento, comparadas con los controles sin tratar.
Figura 3. Se muestra el contenido de carbono total de plántulas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Col-0), tratadas con el producto (CHL) y con la mezcla de alto peso molecular (CHH), tras veinte días de crecimiento en un medio controlado en condiciones de laboratorio "in vitro", comparado con las plantas sin tratar, crecidas en las mismas condiciones.
Figura 4. Se muestra el incremento en el peso fresco de plantas de Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia (Col-0), tratadas con el producto (CHL) y con la mezcla de alto peso molecular (CHH) y sin tratar después de 20 días de crecimiento, en un medio controlado en condiciones de laboratorio "in vitro".
MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE Ejemplo 1 . Obtención de una composición que comprende oligosacáridos conforme al procedimiento de la invención
Como material de partida se utilizó polvo purificado compuesto por quitina ultrapura de Sigma#C9752 (Sant Louis, MO, USA), con un grado de acetilación del 95% (Lote Ne: 107K7005V), derivada de cáscaras de gambas, y compuesta por Poli(N-acetil-D- glucosamina), Poli-(1→4)^-N-acetil-D-glucosamina, de fórmula molecular C8Hi5N06 y peso molecular 221 ,2078. Se homogeneizó el material de partida en mortero de porcelana hasta la obtención de una mezcla de textura harinosa y se re-suspendió el polvo en agua destilada (Milipore, agua MiliQ) en un bote de cristal esmerilado y oscuro, a una concentración 100mg/l, se preparó un volumen de 5 mi de cada solución.
Se autoclavo la solución durante 20 minutos a 121 eC (autoclave P-Selecta). Se dejó enfriar el producto a temperatura ambiente, tras lo cual se sometió a un proceso de sonicación a una potencia de 50 Hz en baño de agua durante 5 minutos a temperatura no superior a 25eC.
El producto se almacenó a temperatura ambiente de no más de 25eC o a 4eC si no se utilizaba el mismo día. Se realizó un análisis Maldi-Tof del producto obtenido. Los resultados se presentan en la Tabla 1 y en la Figura 1 . Tabla 1 . Resultados del análisis Maldi-tof. Se indican los picos obtenidos en el análisis, correspondientes a los pesos moleculares (m/z) de los oligosacáridos derivados de la quitina, en estado acetilado (A), correspondiendo A2 al dímero, A3 al trímero, A4 al tetrámero, A5 al pentámero y A6 al hexámero de quitina, indicando la intensidad de cada oligosacárido en la mezcla y el porcentaje correspondiente de cada uno dentro de la mezcla, según su intensidad. Se indican los pesos moleculares teóricos, en función del aducto formado con el ión Na+.
Figure imgf000013_0001
Ejemplo 2. Ensayos de crecimiento de plantas de Arabidopsis thaliana.
Se aplicó el producto obtenido en el ejemplo 1 , estéril y resuspendido en agua a una concentración de 50 mg/l y 100 mg/l (adición a una temperatura menor de 65eC) sobre un medio líquido estéril en caliente, conteniendo Murashige&Skoog (No. #1 B-M0233, Duchefa Biochemie, NY, USA) el cual contiene la mitad del Nitrógeno suministrado de forma estándar para obtener un crecimiento adecuado de estas plantas y Agar bacteriológico a una concentración de 9 g/l y 1 % de Sacarosa (peso/volumen), el pH del medio se ajustó a 5,75 con ácido clorhídrico diluido. Se aplicó un volumen de entre 30-40 mi de este medio sobre placas petri® cuadradas hasta su completa solidificación. Sobre el medio se colocaron 120 semillas de Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia, por cada placa, colocadas en tres líneas de 40 semillas cada una. Dichas semillas fueron previamente esterilizadas mediante un tratamiento de 20 minutos con una solución conteniendo Tween® 20 e hipoclorito sódico, tras lo cual se limpiaron con agua destilada estéril tres veces. Una vez estériles, las semillas dentro de las placas y tapadas con papel de aluminio, fueron estratificadas, con el objeto de sincronizar su germinación para lo cual fueron sometidas a una temperatura de 4eC en oscuridad durante dos días, tras lo cual, las placas de colocaron en soportes verticales y se germinaron y crecieron, hasta 21 días, en cámara de crecimiento controlado en ciclos de 23eC durante 16 horas de luz y 20eC durante 8 horas de oscuridad, con una humedad relativa constante de 60% y bajo una intensidad de luz de entre 100-150 mE/m2 utilizando como iluminación tubos fluorescentes de tipo Growlux®. Se tomaron a diferentes tiempos los valores de la longitud de la raíz principal de cada planta. Se estimó el incremento del peso fresco de las plantas tratadas y no tratadas con el producto así como con la misma mezcla del producto sin tratar. Se estimó un incremento en el crecimiento de la raíz principal de las plantas tratadas que oscilaba entre el 5 y el 25% respecto a las plantas control dependiendo del experimento y la variabilidad vegetal (Figura 4). También se observó un incremento en el desarrollo de raíces laterales en las plantas control, no tratadas con el producto, respecto a las plantas tratadas, síntoma que suele ir asociado a la falta de nutrientes del medio y no fue observado en las plantas tratadas con el producto, debe destacarse que el medio sin producto contiene la mitad de nitrógeno utilizado habitualmente y que esta respuesta de estrés no fue observada en las plantas tratadas con el producto.
Ejemplo 3. Determinación del contenido de Nitrógeno y Carbono en plantas Arabidopsis thaliana. Se aplicó el producto obtenido en el ejemplo 1 a una concentración de 50 y 100 mg/l, sobre el medio de crecimiento descrito en el ejemplo 2 en las placas descritas en el ejemplo 2. Se depositaron 300 semillas de Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia, por cada placa. Dichas semillas fueron esterilizadas previamente y estratificadas tal y como se ha indicado en el ejemplo 2, tras lo cual, las placas de colocaron en vertical y se germinaron y crecieron, hasta un máximo de 21 días, en cámara de crecimiento controlado en ciclos de 23eC durante 16 horas de luz y 20eC durante 8 horas de oscuridad, con una humedad relativa constante de 60% y bajo una intensidad de luz de entre 100-150 mE/m2 utilizando como iluminación tubos fluorescentes de tipo Growlux®. Tras los diferentes tiempos de crecimiento elegidos se tomó el tejido de cada placa y se dejó secar en un horno entre 65-70eC durante al menos 48 horas. Los tejidos fueron finamente molidos y homogeneizados. La concentración de N y C se determinó usando un analizador de masas (LECO CHN-600) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En cada bloque (3 cuadras), fueron recogidos y agrupados en una muestra de 12 plantas por tratamiento.
Se comparó el contenido de Nitrógeno y Carbono total en las plantas tratadas respecto a las no tratadas detectando un incremento de entre un 8 y hasta un 15% tras los primeros 14 días de crecimiento, en las plantas suplementadas con el producto respecto a las no suplementadas, este valor pudo variar, dependiendo del peso molecular de la mezcla del tratamiento (CHL: Mezcla de quitina de bajo peso molecular obtenida mediante el protocolo descrito en el ejemplo 1 o CHH: Quitina ultrapura comercial de alto peso molecular, procedente de cáscara de gamba de alto peso molecular Sigma#C9752 con un 99% de pureza y al menos un 95% de grado de acetilación).
Tras 20 días de crecimiento no se observaron diferencias ni en el contenido de nitrógeno ni en el de carbono en las plantas suplementadas, determinándose que en el intervalo de concentraciones utilizadas y bajo esas condiciones, las plantas han consumido prácticamente todo el producto que han podido captar en el medio de crecimiento.
Ejemplo 4. Ensayos de crecimiento de plantas de Populus trícocarpa. Se transfirieron explantos de Populus trícocarpa crecidos durante 45 días en un medio estándar, no suplementado, al medio utilizado utilizando en el ejemplo 1 suplementado con el producto obtenido en el ejemplo 1 tal y como se ha descrito en el ejemplo 2. Cada explanto medía entre tres y cuatro centímetros de longitud y contenía una hoja. Los árboles fueron trasplantados a tubos de cristal de 2,7 cm de ancho por 14cm de alto, conteniendo el medio descrito en el ejemplo 2. Se realizó un seguimiento de los parámetros de crecimiento midiendo la raíz principal y el tallo a lo largo de distintas semanas, hasta un máximo de tres meses, observándose un incremento del crecimiento radicular de hasta un 8% en plantas suplementadas con el producto respecto a las plantas control no suplementadas.

Claims

Uso de oligosacáridos compuestos de N-acetilglucosamina como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas, caracterizado por que el porcentaje de N- acetilglucosamina en dichos oligosacáridos es del 100% y por que la longitud de dichos oligosacáridos es de entre 1 y 6 monosacáridos.
Procedimiento de obtención de oligosacáridos compuestos de N-acetilglucosamina como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas, caracterizado por que el porcentaje de N-acetilglucosamina en dichos oligosacáridos es del 100%, por que la longitud de dichos oligosacáridos es entre 1 y 6 monosacáridos y por que el procedimiento comprende las siguientes etapas:
(a) resuspender quitina con un porcentaje de N-acetilglucosamina entre un 95% y un 100% en agua,
(b) calentar la composición resultante de la etapa (a) a una temperatura entre 120 y 180eC durante un tiempo entre 20 y 40 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente y
(c) sonicar la composición resultante de la etapa (b) a una potencia entre 50 y 60 Hz durante un tiempo entre 5 y 120 minutos a una temperatura entre 20 y 25eC.
Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que en la etapa (a) la quitina se resuspende a una concentración entre 0,04 a 4 g/l.
Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado por que la composición resultante de la etapa (c) se somete a un proceso de secado.
PCT/ES2016/070366 2015-05-14 2016-05-13 Uso de oligosacáridos como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas y procedimiento de obtención Ceased WO2016181013A1 (es)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/574,050 US20180297904A1 (en) 2015-05-14 2016-05-13 Oligosaccharides as stimulators of plant growth in already germinated plants and method for obtaining said oligosaccharides

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201530657A ES2541080B2 (es) 2015-05-14 2015-05-14 Uso de oligosacáridos como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas y procedimiento de obtención
ESP201530657 2015-05-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016181013A1 true WO2016181013A1 (es) 2016-11-17

Family

ID=53525010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2016/070366 Ceased WO2016181013A1 (es) 2015-05-14 2016-05-13 Uso de oligosacáridos como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas y procedimiento de obtención

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20180297904A1 (es)
ES (1) ES2541080B2 (es)
WO (1) WO2016181013A1 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241121A (zh) * 2019-05-21 2019-09-17 南京农业大学 大豆E3泛素连接酶GmNLA1编码基因的应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112018072235B1 (pt) 2016-04-29 2023-01-17 Innovation Hammer Llc Método para intensificar o crescimento respiratório de um organismo fotossintético que compreende aplicar uma formulação de compósito de glicano
WO2018042311A1 (en) * 2016-08-29 2018-03-08 Swasti Agro & Bioproducts Pvt Ltd. Chitosan derivative formulations for plant growth, and building disease resistance

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6333310A (ja) * 1986-07-29 1988-02-13 Ihara Chem Ind Co Ltd 植物生長促進剤
JPH07258007A (ja) * 1994-03-23 1995-10-09 Nippon Steel Corp 糖類誘導体を有効成分とする植物病害防除剤
US20110114472A1 (en) * 2009-11-17 2011-05-19 Ho-Shing Wu Process for producing glucosamine and acetyl glucosamine by microwave technique

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03198702A (ja) * 1989-12-27 1991-08-29 Lion Corp 種子発芽促進方法
JPH06333310A (ja) * 1993-05-19 1994-12-02 Hitachi Electron Eng Co Ltd 磁気ディスクの逸脱防止機能付きスピンドル

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6333310A (ja) * 1986-07-29 1988-02-13 Ihara Chem Ind Co Ltd 植物生長促進剤
JPH07258007A (ja) * 1994-03-23 1995-10-09 Nippon Steel Corp 糖類誘導体を有効成分とする植物病害防除剤
US20110114472A1 (en) * 2009-11-17 2011-05-19 Ho-Shing Wu Process for producing glucosamine and acetyl glucosamine by microwave technique

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110241121A (zh) * 2019-05-21 2019-09-17 南京农业大学 大豆E3泛素连接酶GmNLA1编码基因的应用
CN110241121B (zh) * 2019-05-21 2022-03-29 南京农业大学 大豆E3泛素连接酶GmNLA1编码基因的应用

Also Published As

Publication number Publication date
ES2541080A1 (es) 2015-07-15
US20180297904A1 (en) 2018-10-18
ES2541080B2 (es) 2016-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Castro et al. Is chitosan a new panacea? Areas of application
Kumari et al. Ascophyllum nodosum (L.) Le Jolis, a pivotal biostimulant toward sustainable agriculture: A comprehensive review
Badawy et al. A biopolymer chitosan and its derivatives as promising antimicrobial agents against plant pathogens and their applications in crop protection
Aquinas et al. Progress in bioproduction, characterization and applications of pullulan: A review
Deming et al. The role of exopolysaccharides in microbial adaptation to cold habitats
Tajdini et al. Production, physiochemical and antimicrobial properties of fungal chitosan from Rhizomucor miehei and Mucor racemosus
ES3045964T3 (en) Composition and method for improving plant growth
Brigham Chitin and chitosan: sustainable, medically relevant biomaterials
Dennis et al. Effect of biological control antagonists adsorbed on chitosan immobilized silica nanocomposite on Ralstonia solanacearum and growth of tomato seedlings
ES2541080B2 (es) Uso de oligosacáridos como estimuladores del crecimiento vegetal en plantas ya germinadas y procedimiento de obtención
Das et al. Chitosan biopolymer nanocomposites for agriculture applications
CN105237282A (zh) 一种用于香蕉的新型环保富硒生物有机肥
CN103931614B (zh) 一种植物病原细菌杀/抑菌剂及其应用
Zhou et al. Molecular mechanism of nanochitin whisker elicits plant resistance against Phytophthora and the receptors in plants
Sreelakshmi et al. Chitosan and its derivatives for agriculture applications: a review
Kumar et al. Chitin and chitosan: the defense booster in agricultural field
CN105566510B (zh) 一种葡寡糖及其制备方法和应用
Al-Hasan Hamdan et al. Extraction, characterization and bioactivity of chitosan from farms shrimps of Basra province by chemical method
Mayegowda et al. Marine microbial biopolymers and their applications
Razak et al. Biotechnological production of fungal biopolymers chitin and chitosan: their potential biomedical and industrial applications
US20200221708A1 (en) Regulator for increasing plant beta-glucan content
CN107200790B (zh) 一种壳寡糖衍生物及其制备方法和应用
CN104585242A (zh) 一种人工湿地植物促生长剂
KR101639655B1 (ko) 미네랄과 키토산을 포함하는 원적외선 작물 생육용 비료 및 그의 제조방법
Abdel-Aziz et al. Role of nutrient in microbial developments and microbial metabolic diversity

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16792245

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15574050

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16792245

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1