WO2016178532A1 - 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 이용하여 목적 단백질을 세포질로 전달시키는 방법 - Google Patents

목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 이용하여 목적 단백질을 세포질로 전달시키는 방법 Download PDF

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WO2016178532A1
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protein
exosome
photospecific
exosomes
binding
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최철희
임남빈
허원도
류승욱
최호준
최경선
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한국과학기술원
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an exosome containing a target protein using a photospecific binding protein, and to a method for delivering a target protein to the cytoplasm using the exosome prepared by the method.
  • the human body is composed of about 200 trillion cells and maintains life by controlling physiological activity by the action of various proteins in the cells.
  • the cells are surrounded by a double membrane structured membrane composed of phospholipids, and the membrane prevents the entry of foreign substances into the cells.
  • Most protein therapeutics developed so far do not enter the cytoplasm through the cell membrane, and have a physiological effect by acting outside the cell or by receptors on the cell membrane to transmit signals into the cell.
  • the membrane transmembrane domain includes HIV-1 TAT, HSV VP22, Antp, dfTAT, Hph-1, and the like, and the fusion protein combining the target protein is produced in recombinant protein form and needs to be separated. , In this process, the protein refolding is not properly done, the activity is reduced, the protein is non-specific
  • Nanoparticles include Gold NP, Liposome NP, Magnet icNP, Polymeric NP, and the degradation of the conjugate of these and the protein of interest occurs mostly in the lysosomes in the cell: the target protein is degraded inside the lysosome and loses its activity. Discarded or cytosolic, it is difficult to separate the target protein and nanoparticles separately, and the toxicity of the nanoparticles can be a problem.
  • Exosomes refer to small vesicles of 50-200 nm size that are secreted out of cells with proteins, DNA, RNA, etc. for intercellular signaling. '
  • Exosomes were originally discovered in the process of leaving and removing hemoglobin in red blood cells by releasing and removing intracellular proteins at the last stage of maturation of red blood cells. These exosomes are separated directly from the plasma membrane in electron microscopic studies. Rather, it was observed to be released and secreted out of the cell, originating in a specific compartment within the cell called multiivesicular bodies MVBs. That is, when fusion occurs between the polycystic body and the plasma membrane, such vesicles are released into the extracellular environment, which is called axosome (Fig. 3).
  • exosomes are made of, but various kinds of immune cells and stem cells, including B-lymphocytes, T-lymphocytes, dendritic cells, megakaryocytes, macrophages, etc. Tumor cells are also known to produce and secrete exosomes in the living state.
  • Exosomes contain a variety of proteins, DNA, RNA, etc. in the cell. Substances contained in these exosomes and secreted out of the cell are re-introduced into other cells by fusion or endocytosis with the cell membrane, thereby serving as a communication between cells. In addition, the material contained in such exosomes secreted out of the cell can be used to diagnose specific diseases.
  • Exosome contains several kinds of microRNAs, the presence or absence of them
  • Axosomes also contain antigens. Meanwhile, in antigen presenting cells (ant igen present cel l, APC), antigenic peptides are loaded into MHCOnajor hi stocompat ibi li ty complex (IIC) class II molecules in intracellular compartments including polycystic bodies. The resulting axosomes also have antigen peptide MHC class II complexes.
  • exosomes can present antigenic peptides to CD4 + T lymphocytes as transporters of immunogens, thereby inducing immune responses such as proliferation of T lymphocytes.
  • exosomes are enriched with molecules capable of stimulating immune reactions, such as C-Class I and heat shock proteins (HSPs), which can be used to treat autoimmune di sease or tumors. It can be used for the purpose of immune augmentation or reduction.
  • C-Class I and heat shock proteins HSPs
  • exosomes containing the target protein therein can be used for the treatment of various diseases in vivo.
  • an exosome containing a protein or siRNA having an anticancer effect as a target protein can be prepared, and treated with cancer cells to be used for cancer treatment (FIG. 4).
  • Korean Laid-Open Patent No. 2004-0015508 discloses a method for preparing axosome comprising a specific antigen. By introducing a gene for a specific antigen into a cell line, a protein of the introduced gene is stably expressed in the cell line; a method of releasing out of a cell through an exosome and a method of using such an exosome as a vaccine are disclosed. .
  • the present inventors have conducted research to develop a method for more efficiently preparing axosomes containing a target protein.
  • the present inventors have expressed a fusion protein obtained by fusing an exosome-specific marker and a target protein in a cell that produces a large amount of axosome. , It was confirmed that the exosomes containing the target protein can be efficiently produced (Fig. 5).
  • the method is that the target protein is attached to the membrane of the exosomes, ° ° cells in which a large amount of exosomeol fusion protein fusion of each of the exosome-specific marker and each of the photospecific binding protein pairs to the target protein
  • these binding proteins are introduced into the exosomes by exosome-specific markers. It was confirmed that the fusion protein of the host binding protein can be isolated to effectively prepare the exosomes containing the target protein in the free state therein (FIG. 6).
  • Another object of the present invention is to provide a exosome gymnastics vector that can be used in the production of the exosomes.
  • Another object of the present invention is to use the exosomes in the cells ' , quality: the target protein
  • the present invention relates to a method for efficiently producing large amounts of exosomes containing the protein of interest.
  • exosome-specific markers CD9, CD63, CD81 or CD82
  • the exosome-specific markers have in common that they are four membrane-penetrating membrane proteins belonging to the tetraspanin family, when the target protein is bound to the membrane protein of the exosomes, the exosome-specific markers can be easily contained in the exosomes. Predicted.
  • the method for producing an exosome containing the target protein of the present invention is characterized by introducing and expressing a polynucleotide encoding a fusion protein in which an exosome-specific marker and a target protein are bound in an exosome-producing cell.
  • the target protein is fused with an exosome-specific marker embedded in the exosome membrane.
  • the target protein is bound to the membrane protein of the exosome and is not separated even after reaching the target cell.
  • a technique for producing an exosome containing the target protein therein Developed.
  • the photospecific binding proteins CIBN and CRY2 can be used. Specifically, the CIBN is expressed in a fused form with CD9, which is one of the marker proteins, and the CRY2 is in a fused form with a target protein.
  • the exosomes containing the target protein are produced in this way, if the blue light LED is no longer irradiated, CIBN-CRY2 binding is released, and the target protein is not bound to the exosomes cell membrane. Since it is included in, it can be prepared as a result of the exosomes containing the target protein (Figs. 5 to 10).
  • the exosomes thus prepared may exhibit completely different effects from the exosomes including the conventional target material.
  • Conventional exosomes were expressed in a form fused to an exosome-specific marker in order to capture the target protein inside the exosome, but the target protein was collected in the exosome, but attached to the mexosome membrane. because of it not being separated from the exo sommak, only when fused to a cell membrane of the exo somyi target cells, and wherein the desired protein can be delivered to the target cells, thus even after the convergence to a target cell, fused to a solution sosom film: exo because it exists in a form bound to cotton, wherein the target protein is very low hwakreul exhibit its effect in the target cell was boundaries hinge i.
  • the exosomes provided in the present invention are trapped inside the exosomes in a state in which the target protein is not bound to the membrane, when the exosomes are endocytosi s by target cells and enter the cytoplasm, they are attached to the exosomes membrane.
  • the target protein can be delivered to the cytoplasm of the target cell, and since the target protein can be freely moved within the cytoplasm of the target cell, the target protein can sufficiently exhibit the physiological activity in the target cytoplasm. There is this ( Figure 11).
  • the binding level of the target protein bound to the marker protein is changed according to the light intensity irradiated upon light irradiation, there is an advantage that the content of the target protein collected in the exosomes can be adjusted when the light intensity is adjusted. .
  • the method for producing an exosome comprising the protein of interest of the present invention is (a) a fusion protein in the form of binding an exosome-specific marker and a crab 1 photospecific binding protein to an exosome-producing cell (first fusion protein ), A polynucleotide encoding the nucleotide and a second photospecific binding protein capable of binding the first photospecific binding protein and a polynucleotide 3 ⁇ 4 encoding a fusion protein (second fusion protein) in a form in which the target protein is bound.
  • exosome refers to a small vesicle of plasma membrane structure that originates in a specific compartment in a cell called mult ivesicular bodies (MVBs) and is released or secreted out of the cell.
  • MVBs mult ivesicular bodies
  • the exosomes may serve as a carrier for transporting the target protein to the target cells or tissues of the target protein, including the target protein well therein, the target protein carried by the exosome is a target It can be used to treat a particular disease or diagnose a particular disease by acting on a cell or tissue.
  • the infant "exosome producing cell” of this invention means the cell which can produce the said exosome.
  • the exosome-producing cells are not particularly limited thereto, but as an example, B-lymphocytes, T-lymphocytes, dendritic cells, megakaryocytes, macrophages, stem cells, tumor cells, etc. Can be.
  • B-lymphocytes B-lymphocytes
  • T-lymphocytes dendritic cells
  • megakaryocytes megakaryocytes
  • macrophages stem cells
  • tumor cells etc.
  • HEK293T cells which are a kind of immortalized cell line (i ⁇ ortal i zed cel l ine), were used as the exosome-producing cells.
  • lixosome specific marker of the present invention means a protein abundantly present in the membrane of exosomes.
  • the exosome-specific marker is not particularly limited to, alternative paper (rule 26) As one example, it may be CD9, CD63, CD81, CD82, or the like.
  • CD9 was used as an exosome-specific marker.
  • CD9, CD63, CD81, and CD82 are four transmembrane proteins. When the target protein is bound to the membrane protein of the exosomes, the target protein is easily present inside the exosomes.
  • photospecific binding protein of the present invention is also referred to as a photoinduced heterodimer-forming protein or a photoinduced homodimer-forming protein.
  • a photoinduced heterodimer-forming protein When light of a specific wavelength is irradiated, it may bind to different proteins to form a heterodimer. It refers to a protein that can be combined with other proteins of the same type or to form a homodimer.
  • the photospecific binding protein is not particularly limited thereto, but as an example, it may be a photoinduced heterodimer-forming protein, and as another example, CIB (cryptochrome ⁇ interacting bas i c-he 1 i ⁇ -1 oop-he 1 ix protein, CIBN (N—terminal domain of CIB), PhyB (phytochrome B), PIF (phytochrome interacting factor), FKFKFlavinbinding, Kelch repeat, F ⁇ box 1), GIGANTEA, CRY or (chryptochrome) PHR (phyto lyase homolgous region).
  • CIB cryptoochrome ⁇ interacting bas i c-he 1 i ⁇ -1 oop-he 1 ix protein
  • CIBN N—terminal domain of CIB
  • PhyB phytochrome B
  • PIF phytochrome interacting factor
  • FKFKFlavinbinding Kelch repeat
  • F ⁇ box 1 GIGANTEA
  • the two light specific binding proteins there (the first optical-specific binding protein and the second optical-specific binding protein) is to be used can be ", the first light-specific binding protein is a CIB or In the case of CIBN, the second photospecific binding protein for fish may be CRY or PHR, and if the first photospecific binding protein is PhyB, the second photospecific binding protein for this may be PIF. And, if the U U-specific binding protein is GIGANTEA, the second photospecific binding protein for this may be FKF1.
  • CIBN was used as the first photospecific binding protein
  • CRY2 was used as the second photospecific binding protein
  • the wavelength of light used was set to 460 to 490 nm indicating blue light.
  • the light intensity was set to 20 to 50.
  • the marker protein may be fused together to confirm the expression and intracellular location of the C1 fusion protein to which the exosome-specific marker and the first photospecific binding protein are bound.
  • EGFP which is a fluorescent protein
  • CIBN and CD9 or GIGANTEA and CD9 are combined.
  • Target protein refers to a protein expressed in a fused form with the second photospecific binding protein to be included in the axosome.
  • the target protein is not particularly limited as it can be expressed in cells and transported through exosomes, but may be a protein for treating diseases, a disease: a diagnostic protein, and the like as an example.
  • a disease a diagnostic protein, and the like as an example.
  • mCherry which fluoresces, was used as the target protein in Examples of the present invention.
  • the term "culture" refers to a method of growing cells or microorganisms under suitable artificial conditions.
  • the transformant is cultured for 1 to 3 days, then replaced with a medium containing no fetal bovine serum and further cultured for 2 to 5 days.
  • the method of culturing the transformant may be performed using a method well known in the art.
  • the medium refers to a known medium used in animal cell culture, and is a group of commercially available serum free media, protein free media, and chemically defined indium. Can be selected from.
  • the serum-free medium is a medium from which the bovine serum components used for culturing animal cells are removed, and SFM4CH0 (HyClone), EX—Cel KJHR Biosci- ence, etc. are preferred, and insulin type growth factor K lnsul in l ike growth factor I, IGF-I), ethanol amine, Ferric chloride, and phosphatidylcholine may be added, but are not limited thereto.
  • the protein-free medium is an animal cell culture in which a serum-free component is removed from an animal-free protein, in particular, an animal cell culture in which a polymer protein having a molecular weight of lOkDa or more is removed 'is selected from ProCHO (Lonza) and PF-CHO (HyClone). It may be, but is not limited thereto.
  • the chemically defined medium is a medium for animal cell culture which is free of components of animal milk sfl, and all components of the medium have a known chemical structure.
  • CDM4CH0 HyClone
  • PowerCH02CD Li Technologies
  • CD-opt iCH0 Li Technologies
  • first fusion protein of the present invention means a fusion protein in a form in which the exosome-specific marker and the first photospecific binding protein are bound to each other.
  • the arrangement sequence of the exosome-specific marker and the first photospecific binding protein contained in the first fusion protein is the first fusion protein in the direction of the exosomes in the exosomes in the axosome-producing cells
  • the specific binding protein can be expressed so as to be located, it is not particularly limited thereto, but as an example, the C-terminus of the exosome-specific marker may be composed of the N-terminus of the first photospecific binding protein. Can be.
  • the exosome-specific marker and the system 1 photospecific binding protein constituting the first fusion protein may be directly connected to each other or may be linked through a linker.
  • the linker may use a peptide linker composed of amino acids, although not particularly limited thereto, as long as the first fusion protein can be expressed such that the first photospecific binding protein is located inwardly of the exosome in an exosome producing cell. It is possible to use a more flexible peptide linker.
  • the peptide linker may be expressed by linking the nucleic acid encoding the linker in frame between the nucleic acids encoding the respective domains in an operably linked expression vector.
  • second fusion protein of the present invention means a fusion protein in a form in which the second photospecific binding protein and the target protein are bound.
  • the sequence of the second photospecific binding protein and the target protein included in the second fusion protein, the first photospecific of the first fusion protein in the axosome-producing cells is not particularly limited thereto.
  • the C-terminus of the second photospecific binding protein is envisioned in the form of the N-terminus of the target protein. Can be.
  • the second photospecific binding protein and the target protein constituting the second fusion protein may be directly connected to each other, or may be linked through a linker.
  • the linker is a peptide consisting of amino acids, although not particularly limited thereto, as long as the second fusion protein can be located inside the exosome by binding to the nearly U photospecific binding protein site of the first fusion protein in axosome-producing cells.
  • Linkers may be used, and more preferably, a flexible peptide linker may be used.
  • the peptide linker may be expressed by linking the nucleic acid encoding the linker in frame between the nucleic acids encoding the respective domains in an operably linked expression vector.
  • the fusion protein may include a polypeptide having a sequence in which at least one amino acid residue is different from the amino acid sequence of the wild type of each domain included therein.
  • Amino acid exchanges in proteins and polypeptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art.
  • the most commonly occurring exchanges include the amino acid residues Ala / Ser, Val / I le, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Al a / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / I le, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
  • the protein may include a protein having increased structural stability or increased protein activity against heat, pH, etc., due to a mutation or modification on the amino acid sequence.
  • each domain constituting the fusion protein may be prepared by a chemical peptide synthesis method known in the art, or the gene encoding the domain may be amplified or known by PCR (polymerase chain react ion). After synthesis by the conventional method can be prepared by cloning the expression vector expression.
  • each of the fusion proteins can be expressed in the exosome-producing cells by introducing the hoolinucleotides encoding them into the exosome-producing cells, which is known to those skilled in the art as a method for introducing the polynucleotide into the exosome-producing cells. The method may be used, for example, a method of introducing using an expression vector may be used.
  • expression vector refers to a gene construct that is a recombinant vector capable of expressing a peptide of interest in a host cell of interest, and which includes essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • the expression vector is
  • Initiation codon, termination codon, promoters, comprising the expression control elements, such as the operator, the start codon and stop codon are generally the polypeptide: is considered to be part of a nucleotide sequence encoding, must be in the object when a genetic construct is administered It should be functional and be in frame with the coding sequence.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • operably l inked refers to a state in which a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest are functionally linked to perform a general function.
  • a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA may be operably linked to affect expression of the coding sequence.
  • Operative linkage with expression vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation can employ enzymes commonly known in the art.
  • the expression vector may include a signal sequence for the release of the fusion polypeptide to facilitate the separation of the protein from the cell culture.
  • Specific initiation signals may also be required for efficient translation of inserted nucleic acid sequences. These signals include ATG start codons and contiguous sequences.
  • an exogenous translational control signal must be provided that can include an ATG start codon.
  • exogenous translational, regulatory signals and initiation codons can be various natural and synthetic sources. Expression efficiency can be increased by the introduction of appropriate transcriptional or translation enhancing factors.
  • the expression vector may be expressed by binding a tag capable of confirming whether the target protein is inserted into the exosome to the target protein.
  • the target protein can be bound to the opposite site combined with the second photospecific binding protein.
  • a fluorescent protein such as a red fluorescent protein or a green fluorescent protein can be bound. Can be used as a tag to bind to the C-terminal region of the protein of interest.
  • This designed protein is expressed in exosome-producing cells, and the exosomes
  • the term "light” of the present invention means light irradiated to temporarily bind a first photospecific binding protein and a second photospecific binding protein expressed in exosome-producing cells.
  • the first photospecific binding protein is expressed in the form of a first fusion protein with an exosome-specific marker
  • the second photospecific binding protein together with the target protein is a second fusion protein.
  • the binding protein is combined to result in a temporary formation of a fusion protein complex having the shape of an exosome, a specific marker-first photospecific binding protein-second photospecific binding protein-target protein, wherein the exo
  • the exosome-specific markers allow the protein of interest to be linked to exosomes.
  • the target protein is present in the exosomes, and when the irradiation of light stops after the exosomes are produced, the first photospecific binding protein and the second photospecific binding protein 'is separated, and accordingly, The desired protein present in the exosomes is released to the outside in the form contained in the exosomes upon release of the exosomes.
  • the light is preferably irradiated intermittently rather than continuously irradiated so that the target protein can be introduced into the exosomes more effectively. That is, in the case of irradiating light intermittently, since the binding and separation of the crab 1 photospecific binding protein and the second photospecific binding protein are repeated, the probability of the target protein being introduced into the exosome can be improved. .
  • the wavelength of the light that induces the binding of the first photospecific binding protein and the second photospecific binding protein depends on the type of the first photospecific binding protein and the second photospecific binding protein, those skilled in the art As known to the present invention, the wavelength of light can be selected. That is, when CRY2 and CIBN are combined, light having a wavelength of 460 to 490 nm is irradiated, and when the light is not irradiated for 10 minutes or more, CRY2 and CIBN are dissociated from each other; When the PhyB and PIF are combined, the light having a wavelength of 650 nm is irradiated for 10 minutes. The light having the wavelength of 750 nm is irradiated for 5 minutes.
  • an immortal cell line that produces a large number of exosomes, the distribution of mCherry protein uniformly spread in the cytoplasm When exposed to blue light, it could be observed that the cell membrane, endosomes-like structures, etc. (Fig. 7). Similar results were observed when FKF1 and mCherry fusion proteins and GIGANTEA and CD9 fusion proteins were expressed in HEK293T cells (FIG. 12).
  • the CRY2 and mCherry protein of the present invention After introducing the expression vector of the fusion protein in the form of fusion protein and CIBN and CD9 protein into HEK293T, and comparing the target protein production in dexosome, the introduction efficiency was remarkably improved when the method of the present invention was used. This was confirmed to be high (FIG. 15).
  • a first expression vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein (a first fusion protein) in a form in which a exosome-specific marker and a first photospecific binding protein are bound; And (b) a mult icloning site into which a polynucleotide encoding a protein of interest can be introduced and the first
  • a vector for producing an exosome comprising a second expression vector comprising a polynucleotide encoding a second photospecific binding protein capable of binding to a photospecific binding protein.
  • the exosome preparation vector provided by the present invention the exosome specific marker, the first photospecific ' binding protein, the exosome producing cell and the second photospecific binding protein are the same as described above.
  • the term "transformed cell for exosome production" of the present invention encoding a fusion protein (low U fusion protein) of the form in which the exosome-specific marker and the first photospecific binding protein is bound to the exosome-producing cells Polynucleotide is introduced, and means: axosomal producing cells capable of expressing the first fusion protein.
  • the second expression vector includes a polynucleotide encoding the second photospecific binding protein, and may be configured to include a polyclonal region adjacent to the second expression vector.
  • the second photospecific binding protein and the target protein may be expressed in a fused form (second fusion protein).
  • the vector for producing exosomes provided in the present invention is not only the transformed cells and expression vector for producing exosomes, but also the introduction of the expression vector, culture of transformed cells for exosomes production, produced from transformed cells for exosomes production.
  • One or more other component compositions, solutions or devices suitable for isolating and purifying exosomes may be included.
  • it may further include a suitable buffer for the introduction of the expression vector, a medium and a container required for culturing the transformed cells for producing exosomes.
  • the present invention is prepared by the above method, to provide an axosome containing the target protein therein.
  • Exosome prepared by the above-described method includes a fusion protein (first fusion protein) in the form of a combination of the exosome-specific marker and the first photospecific binding protein in the plasma membrane constituting it, the inside of the exosome Since the second photospecific binding protein capable of binding to the first photospecific binding protein and a fusion protein (second fusion protein) in a form in which the target protein is bound are included, the exosomes are transferred to cells in the target tissue.
  • the second fusion protein contained within the axosome can be delivered to the cytoplasm in the target tissue through the fusion oligo of the plasma membrane.
  • Axosomes containing the target protein therein can be used for the treatment of various diseases in vivo.
  • the exosomes may be used for bio-friendly chemotherapy than conventional liposomes.
  • a proteinaceous high molecule for example, an antibody, etc.
  • the exosomes may be used for bio-friendly chemotherapy than conventional liposomes. Can be.
  • FIG. 1 is a diagram showing the cytoplasmic delivery of the target protein through the membrane transmembrane domain (PTD) and the recombinant protein of the target protein (Steven R. et al. Protein transduction: unrestricted del ivery into al 1 eel Is? Trends in Cell biology, 2000).
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a method for intracellular delivery of a target protein through endocytosis of a conjugate of nanoparticles and a target protein (Munish Chanana et al. Physicochemical properties of protein-coated gold nanopart icles in biological fluids and eel Is before and after proteolytic digestion.Angew.Chem.Int.Ed. 2013).
  • FIG. 3 is a diagram showing a process in which exosomes are released from cells and separated from intracellular multi vesicular bodies (MVBs) (Graca Raposo and Willem)
  • FIG. 4 is a diagram showing a process of treating cancer by delivering siRNA * in vivo through targeted exosomes (Alvarez-Ervi ti, L. et al. Del ivery of siRNA to the mouse brain by systemic inject ion of targeted exosomes Nature biotechnology 29, 341-345, 2011).
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the manufacturing process of opto-genetically designed protein transport exosomes (protein-carrying exosomes, EXPLORs) according to the present invention.
  • FIG. 6 is a view showing a process of separating the fusion protein of the target protein and photospecific binding protein in the exosomes when light irradiation of the EXPLORs according to the present invention is stopped.
  • FIG. 7 is a fluorescence photograph showing the intracellular location change of mCherry protein according to whether blue light is irradiated on transformants in which CIBN-EGFP-CD9 gene and mCherry-CRY2 gene are introduced into HEK293T cells.
  • EXPLORs 8 is a view showing an experimental process for obtaining EXPLORs according to the present invention.
  • 9 is an immunoblot analysis photograph showing the result of measuring the change in the content of the target protein (mCherry protein) collected in the exosomes according to the intensity of blue light.
  • FIG. 10 is an electron micrograph showing a result of confirming whether or not the target protein is introduced into the target cell after treating the exosome containing the target protein (mCherry) to the target cell (HT1080 cell), and the left side is treated with the exosome. Unmarked target cells and the right side show target cells treated with exosomes.
  • FIG 11 is a fluorescence photograph (a) showing the result of confirming whether the target protein is introduced into the target cell after treating the exosome containing the target protein (mCherry) to the target cell (HT1080 cells) and the exosome treatment Is a graph showing the result of comparing the percentage of dead cells induced by the (b).
  • FIG. 12 is a fluorescence photograph showing the intracellular location change of the mCherry protein according to whether blue light is irradiated in a transformant in which the GIGANTEA-EGFP-CD9 gene and mCherry-FKFlLOV are introduced into HEK293T cells.
  • XP HEK293T cells incorporating XPACK-Luci ferase-mCherry using XPACK (Systems Biosciences), a commercial vector made for exosome loading technology;
  • EXPL0R HEK293T cells incorporating Luci ferase-mCherry-CRY2 and CIBN-EGFP-CD9 according to the method of the present invention.
  • NEG exosomes produced in HEK293T cells treated with nothing
  • XP Exosome produced in HEK293T cells introduced with XPACK-Luci ferase-mCherry using XPACK (Systems Bioscences), a commercially available vector made for exosome loading technology;
  • EXPL0R Exosomes produced from HEK293T cells incorporating Luci ferase-mCherry—CRY2 and CIBN-EGFP-CD9 according to the present invention
  • Figure 15 is a diagram showing the loading efficiency (efef i c iency) of the target protein in the produced exosomes.
  • Figure 16 shows the efficiency of protein delivery to target cells (HeLa) using axosomes:
  • XP exosomes produced in HEK293T cells incorporating XPACK—Luc i ferase-mCherry using XPACK (Systems Biosciences), a commercial vector made for exosome loading technology;
  • EXPL0R exosomes produced in HEK293T cells incorporating Luc i ferase-mCherry-CRY2 and CIBN-EGFP-CD9 according to the present invention
  • FIG. 17 shows that Luci ferase-mCherry-CRY2 and CIBN-EGFP-CD9 are expressed at the same position in HEK293T cells.
  • PcDNA3 containing the CIBN-EGFP-CD9 gene in the absence of light PcDNA3 containing 1 (+) vector and mCherry-CRY2 gene. 1 (+) vector was introduced into HEK293T cells, exosome producing cells, incubated for 24 hours, then replaced with medium containing fetal bovine serum and further incubated for 48 hours. After the incubation was completed, blue light having a wavelength of 460 to 490 nm was irradiated, and the position of red fluorescence appeared in mCherry before and after irradiating the blue light was confirmed through confocal microscopy (FIG. 7).
  • FIG. 7 is a fluorescence photograph showing the intracellular location change of mCherry protein according to whether blue light is irradiated in transformants in which CIBN-EGFP-CD9 gene and mCherry-CRY2 gene are introduced into HEK293T cells.
  • the mCherry protein is evenly distributed in the cytoplasm before the blue light that causes the binding of the photospecific binding protein CIBN and CRY2 is irradiated, but the mCherry protein is concentrated on the membrane after the blue light is irradiated. It was found that this appeared.
  • the density of the mCherry protein was analyzed to be caused by the binding of CRY2 and CIBN, a photospecific binding protein.
  • PcDNA3 comprising the GIGANTEA-EGFP-CD9 gene.
  • PcDNA3 comprising 1 (+) vector and mCherry-FKFlLOV gene. Intracellular exosomes were identified using a 1 (+) vector and using the same method as in Example ⁇ 1-1>. (L0V in the FKF1L0V is
  • FKF1 protein ' indicates a domain that actually binds to other proteins by light, and thus FKF1 and FKF1L0V are used in the same manner as in Example ⁇ 1-1>.
  • the mCherry protein is evenly distributed in the cytoplasm before the blue light irradiating the photospecific binding protein GIGANTEA and FKF1 is irradiated, but after the blue light is irradiated, the mCherry protein is concentrated in the membrane. It was confirmed that the phenomenon appeared (Fig. 12). Therefore, similar to the result of ⁇ 1-1>, it was confirmed that the density of mCherry protein can be induced by the binding of GIGANTEA and FKF1 of the photospecific binding protein.
  • HEK293T cells which are exosome-producing cells, express expression vectors containing the CIBN-EGFP-CD9 gene and the mCherry_CRY2 gene, respectively, under LED lamps emitting light of 460 nm wavelength at an intensity of 0, 5, 20, 50, or 200, respectively. It was introduced into, cultured for 24 hours, then replaced with medium containing fetal bovine serum and further cultured for 48 hours. After the incubation was completed, the culture solution was separated and centrifuged (3000xg, 15 minutes) to obtain a supernatant from which cell debris was removed.
  • the obtained supernatant was mixed with 5 times the volume of the supernatant by adding ExoQui ck-TC Exosome Precipi tat ion Solut ion (System Biosciences, Mountain View, Cali fornia, USA) and centrifuged (1500xg, 30 minutes).
  • ExoQui ck-TC Exosome Precipi tat ion Solut ion System Biosciences, Mountain View, Cali fornia, USA
  • PBS PBS
  • the exosomes suspension was filtered through a 0.2 ⁇ ni filter using a syringe equipped with a 27-G needle A single sized xosome was obtained (FIG. 8).
  • Exosome Lysate was made using Lysi s buf fer, and the amount of mCherry protein contained in exosomes was compared by immunoblot analysis (FIG. 9).
  • FIG. 9 is an immunoblot analysis photograph showing the result of measuring the change in the content of the target protein (mCherry protein) collected in the exosomes according to the intensity of blue light. As shown in FIG. 9, when irradiated with blue light at an intensity of 20 to 50 ⁇ ⁇ ⁇ , it was confirmed that the content of the target protein (mCherry protein) collected in the exosome showed the maximum value. From the above results, by adjusting the intensity of light irradiated upon binding of the photospecific binding protein,
  • HEK293T cells which are axosome-producing cells, under LED lamps emitting light of 460 nm wavelength at an intensity of 50.
  • the exosomes were extracted by the 2-method. Then, the extracted exosomes in a concentration of 250 in ⁇ 080 cells
  • HT1080 cells were fixed by adding 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 4% PFA and 0.01% GA, and attached onto 10% gelatin gel. Cells attached on gelatin gel were excised for one day with liquid nitrogen, and slices cut to 45 nm thickness using cryoul tramicrotome at -120 ° C. Subsequently, the flakes were immunostained using anti-mCherry antibody and Protein A-gold, and the mCherry protein was observed through Tecnai G2 Spi rit Twin TEM (FIG. 10). .
  • FIG. 10 is an electron micrograph showing a result of confirming whether or not the target protein is introduced into the target cell after treating the exosome containing the target protein (mCherry) to the target cell (HT1080 cell), and the left side is treated with the exosome. Unmarked target cells and the right side show target cells treated with exosomes. As shown in FIG. 10, when the exosome of the present invention was treated to target cells, the target protein was confirmed to be delivered into the target cells.
  • mCherry target protein
  • FIG. 11 shows target cells (HT1080) containing exosomes containing the target protein (mCherry).
  • luciferase activity luci ferase act ivi ty
  • XPACK-Luci ferase-mCherry was introduced into HEK293T cells using XPACK (Systems Biosciences), a commercial vector made for axosome loading technology (XP), and Luci ferase-mCherry using the method of the present invention.
  • XPACK Systems Biosciences
  • XP a commercial vector made for axosome loading technology
  • Luci ferase-mCherry using the method of the present invention.
  • -CRY2 and CIBN-EGFP-CD9 were introduced into HEK293T cells (EXPLOR), and then intracellular luciferase activity was measured to compare the efficiency of the two methods. Luciferase activity was measured according to the manufacturer's instructions (Luci ferase Assay Reagent, Pr omega), and the standard curve of the resultant was drawn, and then the number of intracellular exosomes was quantitatively calculated.
  • Example ⁇ 5-1> After culturing the cells of Example ⁇ 5-1> for 72 hours and separating the exosomes (Exoquick-TC, Systems biosciences), the exosomes isolated through the existing method XP and the method of the present invention As a result of indirectly comparing the amount of the target protein through the measurement of luciferase activity, as shown in FIG. 15, it was confirmed that the method of the present invention was able to produce a significant amount of the exosomeol containing the target protein significantly higher than the conventional method. (FIG. 15).
  • the method of using the exosome of the present invention can deliver the target protein to the target cell more effectively than the conventional method.

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Abstract

본 발명은 목적 단백질을 포함하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법, 상기 엑소솜 제조에 사용될 수 있는 엑소솜 제조용 백터, 상기 방법으로 제조된 목적 단백질을 포함하는 엑소솜 및 제조된 엑소솜을 이용하여 목적 단백질을 세포질로 전달시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조방법을 이용하면, 목적 단백질을 포함하는 엑소솜을 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 상기 엑소솜을 이용한 질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
목적 단백질을 포함하는 액소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 이용하여 목적 단백질을 세포질로 전달시：키는 방법
【기술분야】
붙 발명은 광특이적 결합 단백질을 이용하여 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조방법， 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 이용하여 목적 단백질을 세포질로 전달시키는 방법에 관한 것이다.
【발명의 배경이 되는 기술】
인체는 대략 200여 종류 100조개의 세포로 이루어져 있고， 세포 내에서 다양한 단백질의 작용에 의해 생리 활성이 조절되어 생명을 유지하고 있다.
세포는, 인지질로 구성된 이중막 구조의 세포막으로 둘러 싸여져 있으며， 세포막은 이물질의 세포 내로의 유입을 막고 있다. 지금까지 개발된 단백질 치료제들 역시 대부분 세포막을 통과하여 세포질 내로 들어가지 못하고， 세포 외부에서 작용하거나 혹은 세포막에 있는 수용체 (receptor )에 작용하여 세포 내로 신호를 전달하는 방법으로 생리 효과를 나타내고 있다.
세포질에는 수 많은 단백질들이 존재하고， 이들은 서로 작용하여 생리활성을 조절하고 있는 바， 단백질 치료제를 직접 세포 안으로 즉， 세포질로 넣을 수 았다면， 세포의 활성을 좀 더 효과적으로 제어할 수 있을 것이다. 최근 목적 단백질을 세포막을 통과하여 세포 내로 직접 유입시키는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 세포막을 통과하는 템타이드인 세포막 통과 도메인 (Protein Transduct ion Domains , PTDs)과 목적 단백질의 재조합 단백질 (recombinant protein)을 만들어 투여하면， 세포막을 통과하여 세포질 내로 들어갈 수 있다 (도 1) . 세포막 통과 도메인 (PTD)에는 HIV-1 TAT, HSV VP22 , Antp , dfTAT, Hph-1 등이 있으며， 이들과 목적 단백질을 결합시킨 융합 단백질은 재조합 단백질 형태로 생산하고,' 분리하는 과정이 필요하며， 이 과정에 단백질의 재접힘 (refolding)이 제대로 되지 않아， 활성이 떨어지며， 단백질이 비특이적으로
1
대체용지 (규칙 제 26조) 전달되고， 생체 내에서는 면역 반응을 일으킬 위험이 크며， 비용이 많이 들고， 수율이 낮은 문제점이 있다.
다양한 나노 입자 (nanoparticle)와 결합된 목적 단백질은 식작용 (Endocytosis)에 의해 세포막을 통과하여 세포질로 들어 갈 수 있다 (도 2). 나노 입자에는 Gold NP, Liposome NP, Magnet icNP, Polymeric NP 등이 있으며 , 이들과 목적 단백질의 결합체의 분해는 세포 내에서 대부분 리소좀 (lysosome)에서 발생하여 ：목적 단백질이 리소좀 내부에서 분해되어 활성을 잃어버리거나 세포질 ^서 목적 단백질과 나노 입자가 따로 분리되기가 어렵고 나노 입자의 독성이 문제가 될 수 있다. 액소솜 (Exosome)은 세포 간 신호전달을 하기 위하여， 단백질， DNA, RNA 등을 가지고 세포 밖으로 분비되어지는 50 - 200 nm 크기의 막구조의 작은 소낭을 가리킨다. '
엑소솜은 원래 적혈구가 성숙되어지는 마지막 단계에서 세포 내 단백질을 배출하여 제거함으로써 적혈구 내에 헤모글로빈만 남기는 과정에서 발견된 것으로서, 이러한 엑소솜은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막 (plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라， 다낭체 (Mult ivesicular bodies MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출， 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉， 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면， 그러한 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데， 이것을 액소솜이라 부른다 (도 3).
이러한 엑소솜이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지는 확실히 밝혀진 바가 없으나, B-림프구， T-림프구, 수지상세포， 거대핵세포 (megakaryocyte), 대식세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 줄기세포 및 종양세포 등도 살아 있는 상태에서 액소솜을 생산하여 분비한다고 알려져 있다.
엑소솜에는 세포 내의 다양한 단백질， DNA, RNA 등이 포함되어 있다. 이러한 엑소솜에 포함되어 세포 밖으로 분비돠는 물질들은 세포막과의 융합 (fusion) 흑은 내포작용 (endocytosis)에 의해 다른 세포 내로 다시 유입되어 세포 간의 통신자로서의 역할을 하기도 한다. 또한， 이러한 엑소솜에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들을 분석하여 특정 질환의 진단에 이용될 수 있다.
엑소솜 내에는 여러 종류의 microRNA가 포함되어 있으몌 이것의 존재 유무
2
대체용지 (규칙 제 26조) 및 존재량을 검출하여 질병을 진단하는 방법에 대하여 알려져 있다 (KR 10-2010-0127768A 참조) . 특히 국제 공개 W02009-015357A에는 암 유래의 시료 (혈액， 타액， 눈물 등)에 존재하는 액소솜을 검출하여， mi croRNA의 변화량을 측정하여， 대조군에 비하여 증가 또는 감소할 경우 ：특정 질환과의 관련성을 예측하고， 진단하는 방법이 개시되어 있다. 특히, 특정 질환 (폐질환)을 갖는 환자로부터 얻은 엑소솜을 분석하여， 특정 mi croRNA와 폐질환과의 관련성에 대하여， 구체적으로 개시하고 있다. 또한， 폐질환 외에도 엑소솜에 포함된 단백질을 이용하여 신장질환을 진단할 수 있는 방법에 대하여도 연구되고 있는 실정이다.
또한, 액소솜에는 항원을 포함하기도 한다. 한편， 항원제시세포 (ant igen present ing cel l , APC)에서는 다낭체를 포함해 막구조를 가지는 세포 내 구획에서 항원 펩티드가 MHCOnajor hi stocompat ibi l i ty complex) 클래스 I I 분자에 선적되기 때문에 이로부터 기원되는 액소솜도 항원 펩티드 MHC 클래스 I I 컴플렉스를 가지고 있다. 따라서， 엑소솜은 면역원 ( immunogen)의 수송체로서 CD4+ T 림프구에 항원 펩티드를 제시할 수 있고， 그에 따라 T 림프구의 증식과；같은 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한， 엑소솜에는 丽 C 클래스 I， 열 충격 단백질 (HSPs ; heat -shock proteins) 등 면역 반웅을 자극시킬 수 있는 능력을 가진 분자들이 농축되어 있기 때문에 자가면역 질환 (autoimmune di sease)이나 종양 치료에 있어서 면역증강 또는 감소의 목적으로 이용될 수 있다.
또한， 상기 목적 단백질이 내부에 포함된 액소솜은， 생체 내에서 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어， 목적 단백질로서 항암 효과를 나타내는 단백질이나, siRNA를 포함하는 엑소솜을 제조하고， 이를 암세포에 처리하여 암치료에 사용할 수 있다 (도 4) .
이와 같이 목적 단백질을 포함하는 엑소솜은 질병의 치료에 사용될 수 있다. 이를 위해서는 목적 단백질을 포함하는 엑소솜을 효율적으로 만들 수 있어야 한다. 한국 공개 특허 제 2004-0015508에는 특정 항원을 포함하는 액소솜의 제조 방법이 기재되어 있다. 특정 항원에 대한 유전자를 세포주 내에 도입하여 도입된 유전자의 단백질이 세포주 내에서 안정하게 발현되어； 엑소솜을 통하여 세포 밖으로 방출되는 방법과 이러한 엑소솜을 백신 (vaccine)으로 사용하는 방법이 개시되어 있다.
그러나， 상기 엑소솜은 세포 내에서 자연적으 S ,,형성되기 때문에, 상기
3
대체용지 (규칙 제 26조) 엑소솜을 생성하는 세포에 목적 단백질을 코딩하는. 유전자를 도입한다 하여도, 발현된 단백질이 내부에 포함된 형태의 액소솜이 제조될 가능성이 매우 낮다는 문제점이 있다.
이에， 본 발명자들은 목적 단백질이 포함된 액소솜을 보다 효과적으로 제조하는 방법을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과， 엑소솜 특이 마커와 목적 단백질을 융합시킨 융합 단백질을 액소솜을 대량으로 만들어내는 세포에서 발현시킴으로써， 목적 단백질이 포함된 엑소솜을 효율적으로 제조할 수 있음을 확인하였다 (도 5) .
또한， 상기 방법은 목적 단백질이 엑소솜의 막에 부착되어 있는 바， °엑소솜 특이 마커와 목적 단백질 각각에 광특이적 결합 단백질 쌍의 각각을 융합시킨 융합 단백질을 엑소솜올 대량으로 만들어내는 세포에서 발현시키고， 빛을 조사하여 각각의 융합 단백질을 결합시키면， 이들 결합 단백질이 액소솜 특이 마커에 의해 엑소솜 내부로 유입되고， 유입된 후에 빛의 조사가 중단되면 엑소솜 내부에서 목적 단백질과 광특이적 결합 단백질의 융합 단백질이 분리되어 목적 단백질이 내부에 유리 ( free) 상태로 포함된 엑소솜을 효과적으로 제조할 수 있음을 확인하였다 (도 6) .
또한, 상기 목적 단백질이 내부에 포함된 엑소솜을 이용하여， 목적 단백질이 타겟 세포의 세포질에 전달되는 것을 확인함으로써， 세포질에서의 세포 내 신호 ( Intracel lular s ignal ing)를 효율적으로 조절하여 질병을 치료할 수 있는 방법을 제시하였다.
[발명의 상세한 설명]
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 엑소솜 특이 마커와 목적 단백질의 융합 단백질을 포함하는 액소솜의 대량 제조 방법을 제공하는 것이다. '
본 발명의 다른 목적은 광특이적 결합 단백질 쌍善 이용하여 엑소솜 막에서 분리된 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 대량 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 엑소솜의 제조에 사용될 수 있는 액소솜 체조용 백터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 엑소솜을 이용하여 세포',질로 ：목적 단백질을
4
대체용지 (규칙 제 26조) 유입시키는 방법에 관한 것이다.
【기술적 해결방법】
본 발명은 목적 단백질을 포함하는 엑소솜을 효율적으로 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 목적 단백질이 내부에 포함된 엑소솜을 보다 효과적으로 제조하는 방법을 개발하기 위하여 다양한 면구를 수행하던 중， 엑소솜 특이 마커 (CD9 , CD63 , CD81 또는 CD82)에 주목하게 되었다. 상기 엑소솜 특이 마커는 테트라스파닌 패밀리에 속하는 4회 막 관통형의 막 단백질이라는 공통점을 갖고 있으므로， 상기 엑소솜의 막단백질에 목적 단백질을 결합시킬 경우， 비교적 용이하게 엑소솜 내부에 포함될 수 있을 것으로 예측하였다.
이와 같이 엑소솜 막에 특이적으로 많이 존재하고 세포막을 관통하는 액소솜 특이 마커와 목적 단백질의 융합 단백질을 엑소솜을 대량으로 만드는 세포에서 발현시키면 목적 단백질이 포함된 엑소솜을 대량으로 만들 수 있다. '
구체적으로， 본 발명의 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법은 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜 특이 마커와 목적 단백질이 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 발현시키는 것을 특징으로 한다.
이 때 생성된 엑소솜에는 목적 단백질이 엑소솜막에 박혀 있는 액소솜 특이 마커와 융합되어 있다. 상기 목적 단백질은 상기 엑소솜의 막단백질에 결합되어 있는 상태로서， 표적세포에 도달한 후에도 분리되지 아니한다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여， 다양한 연구를 수행한 결과， 광특이적 결합 단백질을 사용하여， 일시적으로 목적 단백질을 상기 마커 단백질과 결합시켜서， 상기 목적 단백질이 내부에 포함된 엑소솜을 제조하는 기술을 개발하였다. 예를 들어， 광특이적 결합 단백질인 CIBN과 CRY2을 이용할 수 있는데， 구체적으로， 상기 CIBN은 상기 마커 단백질의 하나인 CD9과 융합된 형태로 발현되도록 하고， 상기 CRY2는 목적 단백질과 융합된 형태로 발현되도록 이들 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 엑소솜 생산 세포에 도입하였다. 상기 엑소솜 생산세포에서 발현된 CIBN-CD9 융합 단백질은 CD9으로 인하여 엑소촘에 포함되는데， 이때， 상기 세포에 푸른 빛 LED 조명을 조사하면, 대체용지 (규칙 제 26조) 상기 엑소솜 생산세포에서 발현된 목적단백질 -CRY2 융합 단백질의 CRY2 도메인이 CD9에 융합된 CIBN 도메인에 결합되므로， 목적단백질 -CRY2-CIBN-CD9 형태의 가역적으로 유도된 융합 단백질이 형성되고, 이와 같은 융합 단백질은 CD9으로 인하여 액소솜 내부에 포함된다. 이처럼 목적단백질이 내부에 포함된 엑소솜이 생산된 후， 상기 푸른 빛 LED 조명을 더 이상 조사하지 않으면， CIBN-CRY2 결합이 해제되어， 목적단백질이 엑소솜의 세포막에 결합되지 않은 상태로 엑소솜 내부에 포함되게 되므로， 결과적으로는 목적 단백질을 포함하는 액소솜을 제조할 수 있다 (도 5 내지 도 10) .
이같이 제조된 엑소솜은 종래의 표적 물질을 포함하는 엑소솜과는 전혀 다른 효과를 나타낼 수 있다. 종래의 액소솜은 목적 단백질을 엑소솜 내부에 포집시키기 위하여， 엑소솜 특이 마커에 융합시킨 형태로 발현시켰으므로， 상기 목적 단백질이 엑소솜 내부에 포집되기는 하였으나， 멕소솜막에 부착되어 있는 상태로 있으므로 엑소솜막으로부터 분리되지 못하므로, 상기 엑소솜이 표적 세포의 세포막에 융합되는 경우에만， 상기 목적 단백질이 표적 세포로 전달될 수 있고， 이처럼 표적 세포에 융합된 후에도， 액소솜막에 융합된 : 엑소솜에 결합된 형태로 존재하기 때문에， 상기 목적 단백질이 표적 세포내에서 그의 효과를 나타낼 확를이 매우 낮다는 힌ᅵ계가 있었다. 그러나， 본 발명에서 제공하는 액소솜은 엑소솜 내부에 목적 단백질이 막에 결합되지 않은 상태로 포집되어 있으므로， 상기 액소솜이 표적 세포에 의하여 endocytosi s되어 세포질로 들어갔을 때, 엑소솜막에 부착되어 있는 것이 아니므로 엑소솜이 분해되는 경우， 목적 단백질이 표적 세포의 세포질로 전달될 수 있으며， 표적 세포의 세포질 내에서 자유롭게 이동이 가능하므로， 목적 단백질이 표적 세포질에서 생리 활성을 층분히 나타낼 수 있다는 장점이 있다 (도 11) .
뿐만 아니라, 광조사시 조사되는 광의 세기에 따라서， 마커 단백질에 결합되는 목적 단백질의 결합수준이 변화되므로， 상기 광의 세기를 조절할 경우， 엑소솜내에 포집되는 목적 단백질의 함량을 조절할 수 있다는 장점이 있다.
따라서， 광특이적 결합 단백질을 사용하여 목적 단백질을 포함하는 엑소솜을제조하는 방법은 지금까지 전혀 알려져 있지 않으며， 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 구체적으로， 본 발명의 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조방법은 (a) 엑소솜 생산 세포에， 엑소솜 특이 마커와 게 1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 (제 1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제 2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 (제 2 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 ¾ 도입하는 단계; (b) 상기 액소솜 생산 세포에 상기 거 U 광특이적 결합 단백질과 상기 제 2 광특이적 결합 단백질의 결합을 유발할 수 있는 광을 조사하는 단계; 및 (c) 상기 엑소솜 생산 세포에서 액소솜이 생산된 다음， 상기 광의 조사를 중지하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 "액소솜 (exosome) "아란， 다낭체 (mul t ivesicular bodi es , MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출 또는 분비되는 원형질막 구조의 작은 소낭을 의미한다.
본 발명에 있어서， 상기 엑소솜은 목적 단백잘을 내부에 포함하여 목적 단백질의 표적 세포 또는 조직으로 목적 단백질을 운반하는 운반체로서 역할을 수행할 수 있는데, 상기 엑소솜에 의하여 운반된 목적 단백질은 표적 세포 또는 조직에 작용하여 특정 질환을 치료하거나 또는 특정 질환을 진단하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용아 "엑소솜 생산 세포"란， 상기 엑소솜을 생산할 수 있는 세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 엑소솜 생산 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나 한 가지 예로서, B-림프구, T- 림프구， 수지상세포， 거대핵세포 (megakaryocyte) , 대식세포， 줄기세포 및 종양 세포 등이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 상기 엑소솜 생산 세포로서 불멸화세포주 ( i匪 ortal i zed cel l l ine)의 일종인 HEK293T세포를 사용하였다.
본 발명의 용어 "액소솜 특이 마커"란， 엑소솜의 막에 풍부하게 존재하는 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서， 상기 엑소솜 특이 마커는 특별히 이에 제한되지 않으나， 대체용지 (규칙 제 26조) 한 가지 예로서， CD9, CD63, CD81 , CD82 등이 될 수 있다. 예를 들어， 본 발명의 실시예에서는 엑소솜 특이 마커로서 CD9을 사용하였다. CD9 , CD63 , CD81 , CD82는 4회 관통형 막단백질로써， . 액소솜의 막단백질에 목적 단백질을 결합시킬 경우 용이하게 목적 단백질을 엑소솜 내부에 존재하게 한다.
본 발명의 용어 "광특이적 결합 단백질"이란， 광유도 이형이합체 형성 단백질 또는 광유도 동형이합체 형성단백질이라고도 하는데， 특정 파장의 광이 조사될 경우， 서로 상이한 단백질과 결합하여 이형이합체를 형성할 수 있는 단백질 또는 서로 동일한 종류의 다른 단백질과 결합하여 동형이합체를 형성할 수 있는 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서， 상기 광특이적 결합 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나， 한 가지 예로서， 광유도 이형이합체 형성 단백질이 될 수 있고, 다른 예로서， CIB(cryptochromeᅳ interact ing bas i c-he 1 i χ- 1 oop-he 1 i x protein) , CIBN(N— terminal domain of CIB) , PhyB(phytochrome B) , PIF(phytochrome interact ing factor) , FKFKFlavinbinding, Kelch repeat , F一 box 1)， GIGANTEA, CRY(chryptochrome) PHR(phyto lyase homolgous region) 등이 될 수 있다.
특히， 이형이합체를 형성하는 경우， 두 가지 광특이적 결합 단백질 (제 1 광특이적 결합 단백질 및 제 2 광특이적 결합 단백질)이 사용될 '수 있는데， 상기 제 1 광특이적 결합 단백질이 CIB 또는 CIBN인 경우， 어에 대한 제 2 광특이적 결합 단백질은 CRY 또는 PHR이 될 수 있고, 상기 제 1 광특이적 결합 단백질이 PhyB인 경우， 이에 대한 제 2 광특이적 결합 단백질은 PIF가 될 수 있으며, 상기 거 U 광특이적 결합 단백질이 GIGANTEA인 경우， 이에 대한 제 2 광특이적 결합 단백질은 FKF1가 될 수 있다.
예를 들어， 본 발명의 실시예에서는 제 1 광특이적 결합 단백질로서 CIBN을사용하고， 제 2 광특이적 결합 단백질로서 CRY2를 사용하였으며, 사용된 빛의 파장은 청색광을 나타내는 460 내지 490nm로 설정하고, 상기 빛의 세기는 20 내지 50 로 설정하였다.
한편， 엑소솜 특이 마커와 제 1 광특이적 결합 단백질이 결합된 게 1 융합 단백질의 발현여부 및 세포 내 위치를 확인하기 위하예 마커 단백질을 함께 융합시킬 수도 있다. 예를 들어， 본 발명꾀 실시예에서는 CIBN과 CD9 , 또는 GIGANTEA와 CD9이 결합된 제 1 융합 단백질에 형광단백질인 EGFP가 삽입된 형태로
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대체용지 (규칙 제 26조) 발현시킴으로써， 상기 제 1 융합 단백질의 발현여부， 발현수준 및 세포 내 위치를 확인하고자 하였다. 본 발명의 용어 "목적 단백질"이란, 상기 액소솜의 내부에 포함되도록 상기 제 2 광특이적 결합 단백질과 융합된 형태로 발현되는 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서， 상기 목적 단백질은 세포.내에서 발현되어 엑소솜을 통해 운반될 수 있는 것으로서 특별히 제한되지 않으나， 한 가지 예로서 질환 치료용 단백질， 질환: 진단용 단백질 등이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 상기 목적 단백질로서 형광을 띄는 mCherry를 사용하였다. 본 발명의 용어 "배양''이란, 세포 혹은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.
본 발명에 있어서， 형질전환체를 1 내지 3일간 배양한 후， 소태아혈청이 포함되지 아니한 배지로 교체하고 2 내지 5일간 추가로 배양한다.
본 발명에 있어서， 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. '
상기 배지는 동물세포 배양 시 사용되는 공지된 배지를 의미하고， 시판중인 무혈청 배지 (serum free media) , 무단백 배지 (protein free media) 및 화학 정의 배지 (chemical ly def ined medi a) 등의 그룹 중에서 선택될 수 있다.
상기 무혈청 배지는 동물 세포를 배양하는데 사용되는 소혈청 성분이 제거된 배지로 SFM4CH0(HyClone) , EX— Cel KJHR Biosci ence) 등이 바람직하고， 인슐린형 성장인자 K lnsul in l ike growth factor I， IGF-I ) , 에탄을아민 (Ethanol amine)， 페릭 클로라이드 (Ferr i c chlor ide) , 및 포스파티딜콜린 (Phosphat idyl chol ine) 등이 첨가될 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 무단백 배지는 소혈청 성분이 제거된 무혈청 배지에서 동물 유래 단백질， 특히， 분자량 lOkDa 이상인 고분자 단백질이 제거된 동물세포 배양' 배지로써， ProCHO(Lonza) 및 PF-CHO(HyClone) 등이 선택될 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
상기 화학 정의 배지는 동물 유 sfl의 성분이 없고, 배지를 구성하는 모든 구성 성분이 공지된 화학적 구조를 가진 동물 세포 배양용 배지로써，
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대체용지 (규칙 제 26조) CDM4CH0(HyClone) , PowerCH02CD(Lonza) , 및 CD-opt iCH0(Li fe Technologies) 등0 선택 될 수 있으나， 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 용어 "제 1 융합 단백질"이란， 상기 엑소솜 특이 마커와 상기 제 1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서， 상기 제 1 융합 단백질에 포함된 액소솜 특이 마커와 제 1 광특이적 결합 단백질의 배열순서는 상기 제 1 융합 단백질이 액소솜 생산 세포에서 엑소솜의 내부방향으로 상기 제 1 광특이적 결합 단백질이 위치하도록 발현될 수 있는 한， 특별히 이에 제한되지 않으나， 한 가지 예로서 엑소솜 특이 마커의 C-말단에 제 1 광특이적 결합 단백질의 N-말단이 결합된 형태로 구성될 수 있다. 또한， 상가 제 1 융합 단백질을 구성하는 액소솜 특이 마커와 계 1 광특이적 결합 단백질은 상호 직접적으로 연결될 수도 있고， 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 제 1 융합 단백질이, 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜의 내부방향으로 상기 제 1 광특이적 결합 단백질이 위치하도록 발현될 수 았는 한， 특별히 이에 제한되지 않으나， 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 사용할 수 있고， 보다 바람직하게는 잘 구부러지는 ( f lexible) 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 상기 링커를 코딩하는 핵산을 각 도메인을 코딩하는 핵산 사이에 인프레임 ( in frame)으로 연결하여 발현백터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다. 본 발명의 용어 "제 2 융합 단백질"이란， 상기 제 2 광특이적 결합 단백질과 상기 목적 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질을 의미한다.
본 발명에 있어서， 상기 제 2 융합 단백질에 포함된 제 2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질의 배열순서는， 상기 제 2 융합 단백질이 액소솜 생산 세포에서 상기 제 1 융합 단백질의 제 1 광특이적 결합 단백질 부위와 결합하여 엑소솜 내부에 위치할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나， 한 가지 예로서 제 2 광특이적 결합 단백질의 C-말단에 목적 단백질의 N-말단이 결합된 형태로 구상될 수 있다. 또한， 상기 제 2 융합 단백질을 구성하는 제 2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질은 상호 직접적으로 연결될 수도 있고， 링커를 통해 연결될 수도 있다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 상기 링커는 제 2 융합 단백질이 액소솜 생산 세포에서 상기 제 1 융합 단백질의 거 U 광특이적 결합 단백질 부위와 결합하여 엑소솜 내부에 위치할 수 있는 한， 특별히 이에 제한되지 않으나， 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 잘 구부러지는 ( f lexible) 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 상기 링커를 코딩하는 핵산을 각 도메인을 코딩하는 핵산 사이에 인프레임 ( in frame)으로 연결하여 발현백터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다. 아울러， 상기 각 융합 단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser , Val /I le , Asp/Glu , Thr/Ser , Ala/Gly, Al a/Thr , Ser/Asn, Ala/Val , Ser/Gly, Thy/Phe , Ala/Pro , Lys/Arg , Asp/Asn, Leu/I le , Leu/Val , Ala/Glu , Asp/Gly 간의 교환이다. 또한， 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열， pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
끝으로， 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 각 도메인의 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나， 상기 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain react ion) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현백터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다. 한편， 상기 각 융합 단백질은 이들을 코딩하는 훌리뉴클레오티드를 엑소솜 생산 세포에 도입함으로써， 상기 액소솜 생산 세포에서 발현될 수 있는데， 상기 폴리뉴클레오티드를 엑소솜 생산 세포에 도입하는 방법으로는 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있는데， 예를 들어， 발현백터를 사용하여 도입하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "발현백터"란， 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 백터로서， 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현백터는
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대체용지 (규칙 제 26조) 개시코돈, 종결코돈， 프로모터， 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데， 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로.폴리펩타이드를:암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며， 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임 ( in frame)에 있어야 한다. 백터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
본 발명의 용어 "작동가능하게 연결 (operably l inked) "이란， 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 ( funct ional l inkage)되어 있는 상태를 의미다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현백터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한， 상기 발현백터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는 ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역,조절 시그널들 및 개시코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다. - 본 발명의 바람직한 실시양태에 의하면， 상기 발현백터는 목적 단백질이 엑소솜의 내부에 삽입되었는지의 여부를 확인할 수 있는 태그를 상기 목적 단백질에 결합시켜서 발현시킬 수 있다. 상기 태그는 목적 단백질의 존재 여부를 확인하기 위한 것이므로, 목적 단백질이 제 2 광특이적 결합 단백질과 결합된 반대부위에 결합시킬 수 있는데 한 가지 예로서， 적색형광단백질， 녹색형광단백질 등의 형광단백질을 태그로 사용하여, 목적 단백질의 C-말단 부위에 결합시킬 수 있다.
이 같이 설계된 목적 단백질을 엑소솜 생산 세포에서 발현시키고， 엑소솜이
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대체용지 (규칙 제 26조) 생산된 후ᅳ 상기 형광단백질 태그가 액소솜에서 검출되는지의 여부를 확인함으로써， 상기 엑소솜이 목적 단백질을 포함하는지의 여부를 확인할 수 있다. 본 발명의 용어 "광 ( l ight ) "이란, 엑소솜 생산 세포에서 발현된 제 1 광특이적 결합 단백질과 제 2 광특아적 결합 단백질을 임시적으로 결합시키기 위하여 조사하는 빛을 의미한다.
상술한 바와 같이， 엑소솜 생산 세포 내에서 제 1 광특이적 결합 단백질은 액소솜 특이 마커와 함께 제 1 융합 단백질 형태로 발현되고， 제 2 광특이적 결합 단백질은 목적 단백질과 함께 제 2 융합 단백질 형태로 발현되는데， 상기 엑소솜 생산 세포에 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 제 2 광특이적 결합 단백질의 결합에 필요한 광을 조사하면， 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 제 2 광특이적 결합 단백질이 결합되어 결과작으로는， 엑소솜 ,특이 마커-제 1 광특이적 결합 단쌕질-제 2 광특이적 결합 단백질 -목적 단백질의 형상을 갖는 융합 단백질 복합체를 임시적으로 형성하는데， 상기 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜을 생산하면， 상기 액소솜 특이 마커로 인하여 목적 단백질이 엑소솜에 연결될 수 있다. 이 경우, 상기 목적 단백질은 엑소솜의 내부에 존재하며, 액소솜이 생산된 후에 광의 조사를 중지하면， 제 1 광특이적 결합 단백질과 제 2 광특이적 결합 단백질 '이 분리되고， 이에 따라， 엑소솜 내부에 존재하는 목적 단백질은 엑소솜의 방출시 엑소솜에 포함된 형태로 외부로 방출된다. 또한， 상기 광은 목적 단백질이 엑소솜의 내부로 보다 효과적으로 도입될 수 있도록, 지속적으로 조사하기보다는 간헐적으로 조사함이 바람직하다. 즉， 광을 간헐적으로 조사할 경우에는， 게 1 광특이적 결합 단백질과 제 2 광특이적 결합 단백질의 결합과 분리가 반복되기 때문에, 목적 단백질이 엑소솜 내부로 도입될 확률을 향상시킬 수 있다.
한편， 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 제 2 광특이적 결합 단백질의 결합을 유도하는 광의 파장은 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 제 2 광특이적 결합 단백질의 종류에 따라 달라지므로, 당업자에게 공지된 바에 따라， 광의 파장을 선택할 수 있다. 즉， CRY2와 CIBN을 결합시킬 경우에는 460 내지 490nm의 파장을 갖는 빛을 조사하고， 상기 빛을 10분 이상 조사하지 않을 경우에는 CRY2와 CIBN이 서로 해리되며; PhyB와 PIF를 결합시킬 경우에는 650nm의 파장을 갖는 빛을 10분 동안 조사하고， 750nm의 파장을 갖는 빛을 5분 동안 조사할 경우에는 PhyB와 PIF가
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대체용지 (규칙 제 26조) 서로 해리되며; FKF1과 GIGANTEA를 결합시킬 경우에는 460nm의 파장을 갖는 빛을 30분 동안 조사할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 CIBN과 CRY2의 결합을 유도하기 위하여 460 내지 490nm의 파장을 갖는 빛을 조사하였다.
본 발명의 실시예에 의하면， CRY2 및 mCherry의 융합 단백질과 CIB 및 CD9의 융합 단백질을 엑소솜을 많이 만들어내는 불멸세포주인 HEK293T 세포 내에서 발현한 결과, 세포질에 균일하게 퍼져있던 mCherry 단백질의 분포가 푸른 빛을 쬐어주었을 때 세포막， 엔도솜 유사 구조등의 막에 있는 것을 관찰할 수 있었다 (도 7 ) . 또한， FKF1 및 mCherry의 융합 단백질과 GIGANTEA 및 CD9의 융합 단백질을 HEK293T 세포에서 발현시켰을 때도 유사한 결과를 관찰할수 있었다 (도 12) . 또한, CRY2 및 mCherry의 융합 단백질과 CIBN 및 CD9의 융합 단백질을 HEK293T에 발현시키고， 푸른 빛의 세기를 조절한 결과， 20 내지 50 의 빛을 조사하였을 때， 엑소솜 내에 포집된 mCherry 단백질이 가장 높은 수준을 나타냄을 확인하였으며 (도 9)， 상기 세포에서 생산 분리된 엑소솜을 이종세포인 ΗΊΊ080 세포에 약 25C^g/m의 농도로 처리한 결과， Η Ί080 세포에 대하여 특별한 세포독성을 나타내지 않았고， 상기 Η Ί080 세포와 세포질로 mCherry 단백질이 전달됨을 확인하였다 (도 10) .
또한， 본 발명의 액소솜 내의 목적 단백질의 도입 효율 및 표적 세포로의 액소솜 전달 효율을 기존의 방법과 비교하기 위하여， 기존 방법으로 XPACK 백터를 이용하고， 본 발명의 CRY2 및 mCherry 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질과 CIBN 및 CD9 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질의 발현 백터를 HEK293T에 도입한 후， 덱소솜 내의 목적 단백잘 생산량을 비교한 결과， 본 발명의 방법을 사용하였을 경우 현저하게 도입 효율이 높음을 확인하였다 (도 15) . 또한， 엑소솜 생산 세포로부터 분리한 엑소솜을 표적 세포 (HeLa)에 처리하여， 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였을 때에도 본 발명의 방법으로 분리된 액소솜을 이용하였을 때, 표적 세포에서 목적 단백질의 발현이 가장 높음을 확인하였다 (도 16) . 본 발명은 다른 양태로서 (a) 액소솜 특이 마커와 제 1광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 (제 1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1 발현백터; 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있는 다클론 부위 (mul t icloning si te)와 상기 제 1
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대체용지 (규칙 제 26조) 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제 2 광특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 발현백터를 포함하는， 엑소솜 제조용 백터를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 엑소솜 제조용 벡터에 있어서， 엑소솜 특이 마커， 제 1 광특이 '적 결합 단백질， 엑소솜 생산 세포 및 제 2 광특이적 결합 단백질은 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 용어 "엑소솜 생산용 형질전환 세포"란，, 상기 엑소솜 생산 세포에 엑소솜 특이 마커와 제 1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 (저 U 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어，:상기 제 1 융합 단백질을 발현할 수 있는 액소솜 생산 세포를 의미한다. 본 발명에 있어서， 상기 제 2 발현백터는 상기 제 2 광특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함되어 있고， 이에 인접하여 다클론 부위를 포함하도특 구성될 수 있는데， 이처럼 구성된 제 2 발현백터의 상기 다클론 부위에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입될 경우， 상기 게 2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질이 융합된 형태 (제 2 융합 단백질)로 발현될 수 있다. 본 발명에서 제공하는 엑소솜 제조용 백터는 상기 엑소솜 생산용 형질전환 세포 및 발현백터뿐만 아니라， 상기 발현백터의 도입， 엑소솜 생산용 형질전환 세포의 배양， 상기 엑소솜 생산용 형질전환 세포로부터 생산된 엑소솜을 분리, 정제하는데 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물， 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 예를 들어， 상기 발현백터의 도입에 필요한 적절한 완충액， 상기 엑소솜 생산용 형질전환 세포의 배양에 필요한 배지 및 용기 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또 다른 양태로서 상기 방법으로 제조되어, 목적 단백질이 내부에 포함된 액소솜을 제공한다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 상술한 방법으로 제조된 엑소솜은 이를 구성하는 원형질 막에는 엑소솜 특이 마커와 제 1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 (제 1 융합 단백질)이 포함되어 있고， 액소솜의 내부에는 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제 2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 (제 2 융합 단백질)이 포함되어 있으므로， 상기 엑소솜을 목적 조직 내의 세포에 처리하면， 원형질 막의 융합올 통해， 액소솜 내부에 포함된 제 2 융합 단백질이 목적 조직 내의 세포질로 전달 될 수 있다. 상기 목적 단백질이 내부에 포함된 액소솜은 생체 내에서 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어， 목적 단백질로서 항암효과를 나타내는 단백질성 고 분자 (예를 들어， 항체 등)를 포함하는 엑소솜을 제조하고， 이를 암 세포에 처리하면， 종래의 리포좀 보다도 생체 친화적인 항암치료에 사용될 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명에서 제공하는 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조방법을 이용하면， 목적 단백질을 포함하는 액소솜을 높은 수율로 제조할 수 있으며， 또한， 목적 단백질이 엑소솜 막으로부터 분리되어 존재하므 s 상기 엑소솜을 이용한 질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다ᅳ
【도면의 간단한 설명】
도 1은 세포막 통과 도메인 (PTD)과 목적 단백질의 재조합 단백질을 통한 목적 단백질의 세포질 내 전달방법을 보여주는 그림이다 (Steven R. et al. Protein transduction: unrestricted del ivery into al 1 eel Is? Trends in Cell biology, 2000) . 도 2는 나노 입자와 목적 단백질을 결합시킨 결합체를 endocytosis를 통해 목적 단백질의 세포질 내 전달방법을 보여주는 그림이다 (Munish Chanana et al. Physicochemical properties of protein-coated gold nanopart icles in biological fluids and eel Is before and after proteolytic digestion. Angew. Chem. Int. Ed. 2013).
도 3은 액소솜이 세포 내 다낭체 (Multi vesicular bodies, MVBs)로부터 세포 밖으로 방출， 분리되어 발생되는 과정을 보여주는 그림이다 (GracaRaposo and Willem
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대체용지 (규칙 제 26조) Stoorvogel . Extracel lular vesi cles : Exosomes , mi crovesi cles , and fr iends . Cel l Biology 200(4) , 373-383 , 2013) .
도 4는 표적화된 엑소솜을 통해 siRNA* 생체 내 전달하껴 암을 치료하는 과정을 보여주는 그림이다 (Alvarez-Ervi t i , L. et al . Del ivery of siRNA to the mouse brain by systemic inject ion of targeted exosomes . Nature biotechnology 29 , 341-345, 2011) .
도 5는 본 발명에 따른 광유전자로 디자인된 단백질 운반 엑소솜 (Optogenet ical lyᅳ designed, protein-carrying exosomes , EXPLORs)의 제조 공정을 보여주는 개요도 이다.
도 6은 본 발명에 따른 EXPLORs의 광 조사가 중단되면 엑소솜 내부에서 목적 단백질과 광특이적 결합 단백질의 융합 단백질이 분리되는 과정을 보여주는 그림이다.
도 7은 CIBN-EGFP-CD9 유전자와 mCherry-CRY2 유전자가 HEK293T 세포에 도입된 형질전환체에서 청색광의 조사 여부에 따른 mCherry 단백질의 세포 내 위치변화를 나타내는 형광사진이다.
도 8은 본 발명에 따른 EXPLORs를 수득하는 실험 과정을 보여주는 그림이다. 도 9는 청색광의 세기에 따라， 엑소솜의 내부에 포집된 목적 단백질 (mCherry 단백질)의 함량변화를 측정한 결과를 나타내는 면역블럿 분석사진이다.
도 10은 목적 단백질 (mCherry)을 포함하는 엑소솜을 표적 세포 (HT1080 세포)에 처리한 후， 상기 표적 세포에 목적 단백질의 도입 여부를 확인한 결과를 나타내는 전자현미경 사진으로서， 좌측은 액소솜이 처리되지 않은 표적 세포를 나타내고 우측은 엑소솜이 처리된 표적 세포를 나타낸다.
도 11는 목적 단백질 (mCherry)을 포함하는 엑소솜을 표적 세포 (HT1080 세포)에 처리한 후， 상기 표적 세포에 목적 단백질의 도입 여부를 확인한 결과를 나타내는 형광사진 (a) 및 상기 엑소솜 처리에 의하여 유발된 사멸세포의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프 (b)이다.
도 12는 GIGANTEA-EGFP-CD9 유전자 및 mCherry-FKFlLOV가 HEK293T 세포에 도입된 형질전환체에서 청색광의 조사 여부에 따른 mCherry 단백질의 세포 내 위치변화를 나타내는 형광사진이다.
도 13은 형광이미징을 이용한 Luci ferase-mCherry 융합단백질의 발현 정도 (a)
17 ' 대체용지 (규칙 제 26조) 및 생산 세포에서의 루시퍼라제 활성 및 분자 개수를 확인한 도이다 (b) :
Control : 아무것도 처리하지 않은 HEK293T 세포;
OVER: Luc i f er ase-mCherry-CRY2 만을 도입한 HEK293T 세포;
XP : 엑소솜 탑재 기술을 위해 만들어진 상용 백터인 XPACK (Systems Bi osciences)을 이용하여 XPACK-Luci ferase-mCherry을 도입한 HEK293T 세포;
EXPL0R: 본 발명의 방법에 따른， Luci ferase-mCherry-CRY2와 CIBN-EGFP-CD9를 도입한 HEK293T 세포.
도 14는 생산된 엑소솜 내에서의 루시퍼라제 활성 측정 (a) 및 분자 개수 (b)를 확인한 도이다:
NEG : 아무것도 처리하지 않은 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
OVER: Luc i ferase-mCherry-CRY2를 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 액소솜;
XP : 액소솜 탑재 기술을 위해 만들어진 상용 ,백터인 XPACK (Systems Biosc i ences)을 이용하여 XPACK-Luci ferase-mCherry을 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
EXPL0R: 본 발명에 따른， Luci ferase-mCherry— CRY2와 CIBN-EGFP-CD9를 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜 ;
ON : 200 μ\ν의 청색광에서 72시간 배양하여 생산한 액소솜,
OFF : 빛이 없는 조건에서 72시간 배양하여 생산한 엑소솜.
도 15는 생산된 엑소솜 내의 목적 단백질의 도입 효율 ( loading ef f i c iency)을 나타낸 도이다.
도 16은 액소솜을 이용한 표적 세포 (HeLa)로의 목적 단백질 전달 효율을 나타낸 도이다:
Control : 아무것도 처리하지 않은 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
OVER: Luci ferase-mCherry-CRY2를 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
XP: 엑소솜 탑재 기술을 위해 만들어진 상용 백터인 XPACK (Systems Biosciences)을 이용하여 XPACK— Luc i ferase-mCherry을 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 액소솜;
EXPL0R: 본 발명에 따른， Luc i ferase-mCherry-CRY2와 CIBN-EGFP-CD9를 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
ON : 200 의 청색광에서 72시간 배양하여 생산한 엑소솜,
18
대체용지 (규칙 제 26조) OFF : 빛이 없는 조건에서 72시간 배양하여 생산한 엑소솜.
도 17은 세포 내에서 Luci ferase-mCherry-CRY2와 CIBN-EGFP-CD9가 HEK293T 세포내에서 같은 위치에 발현하고 있음을 확인한 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】 '
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 액소솜의 제조
<1-1> 액소솜의 제조를 위한 CIBN 및 CRY2의 결합 확인
빛이 없는 조건에서 CIBN-EGFP-CD9 유전자를 포함하는 pcDNA3. 1( + ) 백터와 mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 pcDNA3. 1(+) 백터를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고， 24시간 동안 배양한 다음, 소태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체하고 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후， 460 내지 490 nm의 파장을 갖는 청색광을 조사하고， 상기 청색광을 조사하기 전과 조사한 후의 mCherry에서 나타나는 적색 형광의 위치를 공초점 현미경을 통해 확인하였다 (도 7) .
도 7은 CIBN-EGFP-CD9 유전자와 mCherry-CRY2 유전자가 HEK293T 세포에 도입된 형질전환체에서 청색광의 조사여부에 따른 mCherry 단백질의 세포내 위치변화를 나타내는 형광사진이다. 도 7에서 보듯이， 광특이적 결합 단백질인 CIBN과 CRY2의 결합을 유발시키는 청색광이 조사되기 전에는 mCherry 단백질이 세포질에 고르게 분포하고 있으나， 상기 청색광이 조사된 후에는 mCherry 단백질이 막에 밀집되는 현상이 나타남을 알 수 있었다. 이러한 mCherry 단백질의 밀집은 광특이적 결합 단백질인 CIBN과 CRY2의 결합에 의하여 유발된 것으로 분석되었다.
<1-2> 액소솜의 제조를 위한 GIGANTEA및 FKF1의 결합 확인
GIGANTEA-EGFP-CD9 유전자를 포함하는 pcDNA3. 1( + ) 백터 및 mCherry-FKFlLOV 유전자를 포함하는 pcDNA3. 1(+) 백터를 사용하고， 상기 실시예 <1-1〉과 동일한 방법을 사용하여, 세포 내 엑소솜을 확인하였다. (상기 FKF1L0V에서 L0V는
19
대체용지 (규칙 제 26조) l ight -oxygen-vol t age domain의 약어로 FKF1 단백질에서' 실제로 빛에 의해 다른 단백질과 결합하는 도메안을 나타내며， 따라서 FKF1과 FKF1L0V는 같은 의미로 사용된 상기 실시예 <1-1>과 마찬가지로， 도 12에 나타난 바와 같이， 광특이적 결합 단백질인 GIGANTEA과 FKF1의 결합을 유발시키는 청색광이 조사되기 전에는 mCherry 단백질이 세포질에 고르게 분포하^ 있으나， 청색광이 조사된 후에는 mCherry 단백질이 막에 밀집되는 현상이 나타남을 확인하였다 (도 12) . 따라서， 상기 <1-1>의 결과와 유사하게， mCherry 단백질의 밀집이 광특이적 결합 단백질의 GIGANTEA 및 FKF1의 결합에 의해 유도될 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 2> 엑소솜 생산 및 액소솜 생산에 있어 빛의 세기가 미치는 효과
0 , 5， 20， 50 또는 200 의 세기로 460 nm 파장의 빛을 조사하는 LED 등 아래에서， 각각 CIBN-EGFP-CD9 유전자 및 mCherry_CRY2 유전자를 포함하는 각각의 발현백터를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고， 24시간 동안 배양한 다음， 소태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체하고 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후， 배양액을 분리하고, 이를 원심분리 (3000xg, 15분)하여 세포잔해물이 제거된 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액에 상기 상층액의 5배 부피의 ExoQui ck-TC Exosome Precipi tat ion Solut ion( System Biosciences , Mountain View, Cal i fornia , USA)를 가하여 흔합하고， 원심분리 ( 1500xg, 30분)하여 침전된 엑소솜을 수득하고， 상기 수득한 엑소솜에 PBS를 가하여 현탁시켜서 엑소솜 현탁액을 수득하였다ᅳ 상기 엑소솜 현탁액을 27-G 바늘이 장착된 주사기를 이용하여 0.2 ^ni 필터로 여과하여 단일 크기의 액소솜을 수득하였다 (도 8) . 그 후 Lysi s buf fer를 이용하여， Exosome Lysate를 만들고， 면역블럿 분석을 통하여， 엑소솜 안에 들어 있는 mCherry 단백질의 양을 비교하였다 (도 9) .
도 9는 청색광의 세기에 따라， 엑소솜의 내부에 포집된 목적 단백질 (mCherry 단백질)의 함량변화를 측정한 결과를 나타내는 면역블럿 분석사진이다. 도 9에서 보듯이， 20 내지 50 μ\ν의 세기로 청색광을 조사할 경우， 엑소솜내에 포집된 목적 단백질 (mCherry 단백질)의 함량이 최대값을 나타냄을 확인하였다. 상기 결과로부터, 광특이적 결합 단백질의 결합시에 조사하는 빛의 세기를 조절함으로써，
20
대체용지 (규칙 제 26조) 액소솜 내부에 포집되는 목적 단백질의 함량을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3> 액소솜의 처리효과
50 의 세기로 460 nm 파장의 빛을 조사하는 LED 등 아래에서， 각각 CIBN-EGFP-CD9 유전자 및 mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 각각의 발현백터를 액소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고， 실시예 2의- 방법으로 엑소솜을 추출하였다. 이어， 상기 추출된 엑소솜을 ΗΊΊ080 세포에 250 의 농도로
24시간 동안 처리하였다. 그런 다음， 상기 HT1080 세포에 4% PFA와 0.01% GA를 포함하는 0. 1 M 인산염완충액 (pH 7.4)을 가하여 고정시키고， 10% 젤라탄 젤 위에 부착하였다. 젤라틴 젤 위에 부착된 세포는 액체질소를 이용해 하루 동안 넁각시켰으며, -120 °C에서 cryoul tramicrotome을 이용하여 45nm 두께로 절단된 박편을 수득하였다. 이어, 상기 박편에 항 -mCherry 항체와 Protein A-gold를 이용하여 면역염색하고， Tecnai G2 Spi r i t Twin TEM을 통하여 mCherry 단백질을 관찰하였다 (도 10) . .
도 10은 목적 단백질 (mCherry)을 포함하는 엑소솜을 표적 세포 (HT1080 세포)에 처리한 후， 상기 표적 세포에 목적 단백질의 도입 여부를 확인한 결과를 나타내는 전자현미경 사진으로서， 좌측은 액소솜이 처리되지 않은 표적 세포를 나타내고 우측은 엑소솜이 처리된 표적 세포를 나타낸다. 도 10에서 보듯이， 본 발명의 엑소솜을 표적 세포에 처리한 경우， 목적 단백질이 표적 세포 내로 전달됨을 확인하였다.
<실시예 4>목적 단백질이 포함된 액소솜의 분석
50 의 세기로 460 nm 파장의 빛을 조사하는 LED 등 아래에서， 각각 CIBN-EGFP-CD9 유전자 및 mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 각각의 발현백터를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고, 실시예 2의 방법으로 엑소솜을 추출하였다. 이어， 상기 추출된 엑소솜을 ΗΊΊ080 세포에 250 /^의 농도로 24시간 동안 처라하였다. 그런 다음， 형광 현미경을 통하여， mCherry 단백질의 붉은 형광을 확인하고, LDH cel l death assay를 통해 엑소솜을 처리한 세포와 처리하지 않읔 세포의 죽은 세포와 비율을 비교하였다 (도 11) .
도 11은 목적 단백질 (mCherry)을 포함하는 엑소솜을 표적 세포 (HT1080
21
대체용지 (규칙 제 26조) 세포)에 처리한 후, 상기 표적 세포에 목적 단백질의 도입여부를 확인한 결과를 나타내는 형광사진 (a) 및 상기 엑소솜 처리에 의하여 유발된 사멸세포의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프 (b)이다. 도 11에서 보듯이， 엑소솜의 처리에 의하여 세포사멸이 유발되지 않음을 확인하였다.
<실시예 5> 액소솜 생산및 생산된 액소솜내 목적 단백질의 도입 효율비교 <5-1> 액소솜 생산효율확인
본 발명의 엑소솜 생산 및 생산된 액소솜 내의 목적 단백질의 도입 정도를 기존의 방법과 비교하고자 엑소솜 생산 세포에서 목적 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 루시퍼라제 활성 ( luci ferase act ivi ty) 측정 실험올 수행하였다.
기존의 방법으로는 액소솜 탑재 기술을 위해 만들어진 상용 백터인 XPACK (Systems Biosciences)을 이용하여 XPACK-Luci ferase-mCherry를 HEK293T 세포에 도입하였고 (XP) , 본 발명의 방법을 이용하여 Luci ferase-mCherry-CRY2와 CIBN-EGFP-CD9를 HEK293T 세포에 도입하였으며 (EXPLOR)， 그 후 세포 내 루시퍼라제 활성을 측정하여 상기 두 방법의 효율을 비교하였다. 루시퍼라제 활성은 제조사의 지침을 따라 측정하였으며 (Luci ferase Assay Reagent , Pr omega) , 결과 값의 표준 곡선을 그린다음， 이를 통해 세포 내 엑소솜의 개수를 정량적으로 계산하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명의 광특이적 결합 단백질인 CIBN 및 CRY2를 이용한 방법이 기존의 방법인 XP 보다 현저하게 엑소솜으로의 도입 효을이 높음을 확인하였다 (도 14) .
<5-2>생산된 액소솜내에서 목적 단백질의 발현 확인
상기 실시예 <5-1〉의 세포를 72시간 배양하고， 엑소솜을 분리 (Exoquick-TC , Systems biosciences)한 후, 기존의 방법인 XP 및 본 발명의 방법을 통해 분리된 엑소솜에 포함된 목적 단백질의 양을 루시퍼라제 활성 측정을 통해 간접적으로 비교한 결과， 도 15에 나타난 바와 같이， 본 발명의 방법은 기존의 방법 보다 현저하게 많은 양의 목적 단백질이 포함된 엑소솜올 생산할 수 있음을 확인하였다 (도 15) .
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대체용지 (규칙 제 26조) <5-3>목적 단백질의 도입 효율 비교
상기 실시예 <5— 1〉 및 <5-2>의 루시퍼라제 활성 측정값을 이용하예 하기 수학식 1로 목적 단백질의 도입 효율 (E)을 계산하였다.
[수학식 1]
_ 산된엑소송내：의 Λ|:ί¾ Β¾활성축정 엑소송생산세 에서의루시퍼라제 m축정 ¾
도 15에 나타난 바와 같이， 본 발명의 CRY2및 CIBN의 결합을 이용하여 생산된 엑소솜이 다른 비교군과 비교하여， 4배 내지 120배 효율이 높음을 확인하였다 (도 15) .
<실시예 6>표적 세포로의 액소솜 전달 효율 비교
목적 단백질이 도입된 엑소솜을 표적 세포에 처리하였을 때의 효율을 비교하고자， HeLa 세포에 5 x 109 개의 액소솜을 24시간 동안 처리하고 세포에서 발현되는 형광 세기를 측정한 결과， 도 16에 나타난 바와 같이， 본 발명의 엑소솜 (EXPLOR)의 형광 세기가 현저하게 높음을 확인하였다 (도 16) .
따라서， 본 발명의 엑소솜 이용 방법은 기존의 방법 보다 효과적으로 목적 단백질을 표적 세포로 전달할 수 있음을 알 수 있다.
23
대체용지 (규칙 제 26조)

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
a) 엑소솜 생산 세포에， 액소솜 특이 마커와 목적 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 형질전환된 세포를 얻는 단계; 및 '
b) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질이 엑소솜막에 부착된 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법 .
【청구항 2】
제 1항을 포함하되， 목적 단백질이 엑소솜막에서 분리되어 액소솜 내부에 존재하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
【청구항 3】 '
제 1항 또는 제 2항에 있어서， 상기 엑소솜 생산 세포는 B-림프구， T- 림프구, 수지상세포, 거대핵세포 (megakaryocyte) , 대식세포， 줄기세포 및 종양 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포인 것을 특징으로 하는 액소솜을 대량으로 제조하는 .방법 .
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 엑소솜 특이 마커는 CD9 , CD63 , CD81 또는 CD82인 것을 특징으로 하는 액소솜을 대량으로 제조하는 방법.
【청구항 5】
a) 엑소솜 생산 세포에， 액소솜 특이 마커와 제 1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 (제 1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제 2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 (제 2 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계;
b) 상기 엑소솜 생산 세포에 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 상기 제 2 광특이적 결합 단백질의 결합을 유발할 수 있는 광을 조사하는 단계; 및
24
대체용지 (규칙 제 26조) C ) 상기 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜이 생산된 다음， 상기 광의 조사를 중지하는 단계를 포함하는， 목적 단백질을 포함하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법 .
[청구항 6】
제 5항에 있어서， 상기 제 1 광특이적 결합 단백질은 CIB(cryptochrome-interact ing basichel ixᅳ loop—he l.ix protein) , CIBN(N-terminal domain of CIB) , PhyB ( hy t ochr ome B) , PIF(phytochrome interact ing factor ) , FKFKFlavinbinding, Kelch repeat , Fbox 1) , GIGANTEA, CRY(chryp to chrome) 및 PHRCphytolyase homolgous region)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
【청구항 7】
제 5항에 있어서， 상기 제 1 광특이적 결합 단백질이 CIB 또는 CIBN인 경우， 상기 제 2 광특이적 결합 단백질은 CRY 또는 PHR이며， 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 제 2 광특이적 결합 단백질의 결합은 460 내지 490 nm의 파장을 갖는 빛을 조사하여 수행되는 것을 특징으로 하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
【청구항 8】
제 5항에 있어서， 상기 제 1 광특이적 결합 단백 ¾이 PhyB인 경우， 상기 제 2 광특이적 결합 단백질은 PIF이며, 상기 제 1 광특이적 결합 단백질과 제 2 광특이적 결합 단백질의 결합은 600 내지 650 nm의 파장을 갖는 빛을 조사하여 수행되는 것을 특징으로 하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
[청구항 9】
제 5항에 있어서， 상기 제 1 광특이적 결합 단백질이 GIGANTEA인 경우， 상기 제 2 광특이적 결합 단백질은 F F1이며, 상기 게 1 광특이적 결합 단백잘과 제 2 광특이적 결합 단백질의 결합은 460 내지 490 nm의 파장을 갖는 빛을 조사하여 수행되는 것을 특징으로 하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
【청구항 10】
25
대체용지 (규칙 제 26조) 제 1항， 제 2항 또는 제 5항의 방법에 의해 제조된 엑소솜을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포질로 단백질 약물을 전달하는 방법.
【청구항 11】
제 1항, 제 2항 또는 제 5항의 방법에 의해 제조된 엑소솜을 유효성분으로 포함하는 단백질 약물의 세포질 전달용 약학적 조성물.
【청구항 12】
(a) 엑소솜 특이 마커와 제 1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질 (제 1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1 발현백터;
(b) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있는 다클론 부위와 상기 게 1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제 2 광특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 발현백터를 포함하는， 엑소솜 제조용 백터.
【청구항 13】
제 12항에 있어서， 상기 제 2 발현백터는 상기 제 2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질이 융합된 형태의 융합 단백질 (제 2 융합 단백질)을 엑소솜 생산 세포에서 발현시키는 것인 액소솜 제조용 백터.
[청구항 14】
제 1항， 제 2항 또는 제 5항 중 어느 한 항의 방법을사용하여 제조된， 목적 단백질이 내부에 포함된 엑소솜.
26
대체용지 (규칙 제 26조)
PCT/KR2016/004750 2015-05-04 2016-05-04 목적 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 이용하여 목적 단백질을 세포질로 전달시키는 방법 WO2016178532A1 (ko)

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