WO2016163757A1 - 항바이러스제-감수성/저항성 바이러스 검출 시스템 - Google Patents

항바이러스제-감수성/저항성 바이러스 검출 시스템 Download PDF

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WO2016163757A1
WO2016163757A1 PCT/KR2016/003610 KR2016003610W WO2016163757A1 WO 2016163757 A1 WO2016163757 A1 WO 2016163757A1 KR 2016003610 W KR2016003610 W KR 2016003610W WO 2016163757 A1 WO2016163757 A1 WO 2016163757A1
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WO
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oseltamivir
nanoparticles
formula
virus
derivatives
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임은경
정주연
허민희
정봉현
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Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
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Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/38—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms and carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Definitions

  • the present invention relates to an antiviral agent-sensitive / resistant virus detection system.
  • Influenza (flu) is a respiratory disease transmitted by the influenza virus through the respiratory system of humans and animals (birds, pigs, dogs, horses, etc.). Human influenza occurs in 10-20% of the world's population each year, and is highly contagious and tends to spread on a global scale every year. Symptoms of influenza include respiratory diseases such as high fever, headache, muscle pain, sore throat, sore throat, and cough, and in severe cases, death of the elderly, chronic disease holders, and the like.
  • influenza infections are suspected, they should be treated promptly to prevent the development of dangerous situations and to prevent further transmission to others.
  • oseltamivir phosphate Tamiflu
  • Methods for distinguishing viruses have been reported in a number of documents, for example Marin MJ et al. Discloses a method for distinguishing between human influenza virus and avian influenza virus.
  • no effective method has been developed to determine whether a patient suspected of influenza infection has been infected with oseltamivir resistant virus.
  • An object of the present invention is to provide a nanoparticle for detecting antiviral resistance virus.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting viruses exhibiting resistance to antiviral agents using the nanoparticles.
  • the present invention provides oseltamivir analogs represented by Formula 1 below.
  • n is an integer of 1 or more.
  • n may be an integer of 10 or less, for example n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, for example n is an integer of 5 or less, such as n May be 1, 2, 3, 4, 5.
  • the number of n is not limited thereto, and may be appropriately adjusted according to the nanoparticles.
  • R 1 may be a suitable functional group for binding to the nanoparticles, for example, thiol (SH), amine (amine, NH 2 ), hydroxyl (hydroxyl), carboxyl, Isothiocyanate, NHS ester, Aldehyde, Epoxide, Carbonate, HOBt ester, Glutaraldehyde, Imidazole carbamate Imidazole carbamate, maleimide, aziridine, vinylsulfone, aldehyde, hydrazine, phenyl azide, benzophenone, anthraquinone ), And diene group.
  • the functional group is not limited thereto, and any functional group capable of being introduced into the nanoparticle may be used.
  • Each functional group can be synthesized by known methods and can also be bonded to nanoparticles.
  • R 2 is H or C x H (2x + 1) , x may be an integer of 10 or less.
  • the x can be 1 and R 2 can be CH 3 , x can be 2 and R 2 can be C 2 H 5 , x can be 3 and R 2 can be C 3 H 7 , x is 4 and R 2 can be C 4 H 9 , x can be 5 and R 2 can be C 5 H 11 , x can be 6 and R 2 can be C 6 H 13 , x is 7 and R 2 is C 7 H May be 15 , x may be 8 and R 2 may be C 8 H 17 , x may be 9 and R 2 may be C 9 H 19 , x may be 10 and R 2 may be C 10 H 21 .
  • the oseltamivir analogues represented by Formula 1 may be oseltamivir-ethyleneglycol amide-Oseltamivir-EGamine-acids represented by Formula 2 or oseltamivir-described by Formula 3 Ethylene glycol amide-ester (Oseltamivir-EGamide-ester).
  • the present invention provides nanoparticles for detecting antiviral resistant virus.
  • an oseltamivir analogue represented by the following Chemical Formula 1 is bonded to the nanoparticles.
  • n is an integer of 1 or more.
  • n may be an integer of 10 or less, for example n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, for example n is an integer of 5 or less, such as n May be 1, 2, 3, 4, 5.
  • the number of n is not limited thereto, and may be appropriately adjusted according to the nanoparticles.
  • R 1 may be a suitable functional group for binding to the nanoparticles, for example, thiol (SH), amine (amine, NH 2 ), hydroxyl (hydroxyl), carboxyl, Isothiocyanate, NHS ester, Aldehyde, Epoxide, Carbonate, HOBt ester, Glutaraldehyde, Imidazole carbamate Imidazole carbamate, maleimide, aziridine, vinylsulfone, aldehyde, hydrazine, phenyl azide, benzophenone, anthraquinone ), And diene group.
  • the functional group is not limited thereto, and any functional group capable of being introduced into the nanoparticle may be used.
  • Each functional group can be synthesized by known methods and can also be bonded to nanoparticles.
  • R 2 is H or C x H (2x + 1) , x may be an integer of 10 or less.
  • the x can be 1 and R 2 can be CH 3 , x can be 2 and R 2 can be C 2 H 5 , x can be 3 and R 2 can be C 3 H 7 , x is 4 and R 2 can be C 4 H 9 , x can be 5 and R 2 can be C 5 H 11 , x can be 6 and R 2 can be C 6 H 13 , x is 7 and R 2 is C 7 H May be 15 , x may be 8 and R 2 may be C 8 H 17 , x may be 9 and R 2 may be C 9 H 19 , x may be 10 and R 2 may be C 10 H 21 .
  • Nanoparticles of the present invention may be any nanoparticles that can be identified by the naked eye or absorption / fluorescence equipment as particles having a diameter of 1 to 100 nanometers, for example, gold nanoparticles, silver nanoparticles, fluorescent nanoparticles, Fluorescent dyes;
  • the gold nanoparticles and silver nanoparticles refer to particles of various shapes (spherical, polygonal, etc.) having a diameter of 100 nanometers or less.
  • the fluorescent nanoparticles are nanoparticles of 100 nanometers or less, which exhibit fluorescence properties, and even if the same material is used, the fluorescence wavelength varies depending on the size of the particles, thereby obtaining fluorescence of various wavelengths.
  • fluorescent nanoparticles include various nanoparticles and quantum dot particles containing fluorescent dyes, and those composed of a shell of about 2-10 nm in size and mainly ZnS.
  • Group II-VI or III-V compounds forming the quantum dots are, for example, CdSe, CdSe / ZnS, CdTe / CdS, CdTe / CdTe, ZnSe / ZnS, ZnTe / ZnSe, PbSe, PbS InAs, InP, InGaP, InGaP / It may be selected from the group consisting of ZnS and HgTe (in the form of a single core or core / shell).
  • Fluorescent dyes are for example fluorescent organic molecules (e.g., pyrene or derivatives thereof), cyanine, Cy series, Alexa Fluor series, BODIPY series, DY series, Rhodamine or derivatives thereof, Fluorescein or derivatives thereof, coumarin or derivatives thereof, Acridine homodimer or derivatives thereof, Acridine Orange or thereof Derivatives, 7-aminoactinomycin D (7-AAD) or derivatives thereof, actinomycin D or derivatives thereof, ACMA, 9-amino-6-chloro-2 -methoxyacridine or derivatives thereof, DAPI or derivatives thereof, dihydroethidium or derivatives thereof, ethidium bromide or derivatives thereof, ethidium homodimer-1 or EthD-1 this Derivatives, ethidium homodimer-2 (EthD-2) or derivatives thereof, ethidium monoazide or derivatives thereof, hexidium iodide or derivatives thereof
  • the nanoparticles of the present invention are oseltamivir-EGamine-acid represented by the formula (2) or oseltamivir-ethylene glycol amide-ester described by the formula (3). (Oseltamivir-EGamide-ester) can be combined nanoparticles.
  • the oseltamivir-ethyleneglycol amide-acid and oseltamivir-ethyleneglycol amide-ester are oseltamivir analogs, which are bound to the nanoparticles through two repeated polyethyleneglycol linkers and amine functional groups.
  • the nanoparticles may be gold nanoparticles, but are not limited thereto.
  • the position at which the polyethylene linker is bonded to oseltamivir is very important, because where it is attached depends on whether the reaction will occur properly.
  • Oseltamivir resistant influenza viruses are commonly known to have mutations in the H274Y site. Oseltamivir binds to influenza virus and kills the virus in a way that reduces neuraminidase (NA) activity. When mutations in the H274Y site occur, oseltamivir is difficult to bind to the virus.
  • NA neuraminidase
  • the oseltamivir analogs bound to the nanoparticles of the present invention do not bind to viruses that are resistant to oseltamivir due to mutations in the H274Y site and only to viruses that are susceptible to oseltamivir. Whether the nanoparticles of the present invention bind to the virus can be confirmed by visual comparison (colorimetric method) or by absorbance measurement. Therefore, the present invention can determine whether the virus infected by the subject is oseltamivir resistant virus in a very simple and convenient way.
  • the present invention provides a method for detecting oseltamivir resistant influenza virus using the nanoparticles.
  • the method of the present invention comprises the steps of: 1) contacting a sample isolated from a subject infected with influenza virus with nanoparticles bound to oseltamivir analogs of Formula 1; 2) determining that the influenza virus infected by the subject is an oseltamivir resistant virus when the same color as the color appearing when the nanoparticle is contacted with a sample free from influenza virus is present in the sample of step 1). do.
  • the comparison of step 2) may be performed by absorbance measurement or visual observation.
  • the "same color” means that the color can be regarded as substantially the same even if there are slight differences in chroma, brightness, and hue of reaction conditions, sample conditions, and the like. Means color.
  • the subject may be a human or other animal, such as a bird or a mammal.
  • the sample may be whole blood, serum, plasma, blood cells, endothelial cells, tissue biopsy, lymph, ascites fluid, interstitial fluid, bone marrow, cerebrospinal fluid (CSF), semen, saliva, mucus, sputum, sweat or urine.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • the present invention provides a kit for detecting oseltamivir resistant influenza virus comprising the nanoparticles.
  • the kit of the present invention may further include other items necessary for detection, and may further include instructions for use.
  • oseltamivir resistant influenza virus can be detected quickly and conveniently with the naked eye. Therefore, it can be useful to plan treatment of patients who are infected with influenza virus quickly.
  • TEM 1 is a view confirming the shape of the synthesized gold nanoparticles by an electron microscope (TEM).
  • UV-vis spectroscopy UV-vis spectroscopy
  • 3 to 5 confirm the extent to which each substance inhibits the neuraminidase activity of oseltamivir sensitive virus and oseltamivir resistant virus at the protein level.
  • 3 shows the degree to which oseltamivir phosphate inhibits the neuraminidase activity of oseltamivir-sensitive virus and oseltamivir resistant virus.
  • 3 shows the degree to which oseltamivir carboxylate inhibits the neuraminidase activity of oseltamivir-sensitive virus and oseltamivir resistant virus.
  • Figure 4 confirms the degree to which oseltamivir-ethylene glycol amide-acid inhibits the neuraminidase activity of oseltamivir-sensitive virus and oseltamivir resistant virus.
  • 5 confirms the degree to which oseltamivir-ethylene glycol amide-ester inhibits the neuraminidase activity of oseltamivir-sensitive virus and oseltamivir-resistant virus.
  • FIG. 6 to 8 confirm the extent to which each substance inhibits the neuraminidase activity of oseltamivir sensitive virus and oseltamivir resistant virus at the virus level.
  • Figure 6 confirms the extent to which oseltamivir phosphate inhibits the neuraminidase activity of oseltamivir sensitive virus and oseltamivir resistant virus.
  • Figure 7 confirms the degree to which oseltamivir-ethylene glycol amide-acid inhibits the neuraminidase activity of oseltamivir-sensitive virus and oseltamivir-resistant virus.
  • 8 confirms the degree to which oseltamivir-ethylene glycol amide-ester inhibits the neuraminidase activity of oseltamivir-sensitive virus and oseltamivir resistant virus.
  • Figure 9 is a schematic diagram showing the binding aspect of the nanoparticles of the present invention, oseltamivir-sensitive virus and oseltamivir resistant virus.
  • FIG. 10 is a graph (left side view) and color difference visually confirming absorbance when oxelamivir-ethylene glycol amide-acid-coupled gold nanoparticles are reacted with oseltamivir-sensitive virus and oseltamivir-resistant virus, respectively. It is a figure (the right figure).
  • Oseltamivir derivatives were synthesized according to the following scheme.
  • Triphenylphosphine (1.54 mg, 5.89 mmol) was added with stirring azide 5 (950 mg, 1.96 mmol) in THF / H 2 O (10: 1, v / v, 15 mL) solution.
  • the reaction vessel was heated at 70 ° C. for 12 hours and then the reaction solvent was removed.
  • the mixture was recrystallized in CH 2 Cl 2 / MeOH to give amine 6 (385 mg, 43%) as a white solid.
  • NA activity was measured using the NA-FluorTM Influenza Neurmaminidase Assay Kit (AB Applied biosystem, Prod No. 4457091).
  • Solution A was prepared by dissolving Na-flour (480 ⁇ L) in a working solution (5.52 mL) in the kit. To 2.9 mL of working solution was added 0.2 mL of wild type NA protein (Influenza H1N1 NA, Sino biological Inc.) (0.5 mg / mL) (solution B-wild). Mutant NA protein (influenza H1N1 NA (H274), Sino biological Inc.) was also prepared under the same conditions as solution B-wild (solution B-mutant). It was prepared by dissolving 19.3 mg of oseltamivir derivative in 2 mL of distilled water (solution C).
  • Solution A 50 ⁇ L of Solution A was added to each well of a 96 well plate, and 50 ⁇ L of Solution B-wild and Solution B-mutant, respectively.
  • Solution C was added to each well prepared at different concentrations by 50 ⁇ L (only distilled water was added in the comparison group). That is, solution A + solution B-wild (or solution B-mutant) + solution C is added to each well. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, 50 ⁇ L of Na-flour stop buffer solution was added to each well. Fluorescence was measured at Ex: 360 nm and Em: 450 nm to determine NA activity at the protein level. Higher NA activity means higher fluorescence intensity.
  • Oseltamivir phosphate is the main component of Tamiflu.
  • oseltamivir phosphate CAS Registry No. 204255-11-8
  • the NA activity of the wild type was very low, but the NA activity of the mutant was high. It can be seen that it is maintained (FIG. 3 left figure).
  • Oseltamivir carboxylates are well known oseltamivir analogs.
  • oseltamivir carboxylate CAS Registry No. 187227-45-8
  • oseltamivir carboxylate inhibited the NA activity of the wild type (Wild) in the entire range of the experimental concentration.
  • Wild wild type
  • Fig. 3 right When used in high concentration it was confirmed that also inhibits the NA activity of the mutation (Mutant) (Fig. 3 right).
  • the wild type NA and mutant NA proteins used in the experiments were susceptible and resistant to oseltamivir phosphate (Tamiflu) and oseltamivir carboxylate, thus confirming that they were suitable for the experiment.
  • NA activity was measured using the NA-FluorTM Influenza Neuraminidase Assay Kit (AB Applied biosystem, Prod No. 4457091).
  • Solution A was prepared by dissolving Na-fluor (480 ⁇ L) in a working solution (5.52 mL) in the kit.
  • Virus solutions were prepared to contain 100 or 1000 viruses each for each well.
  • the wild type (antiviral susceptible virus) is pandemic H1N1 virus (A / 04/2009 / California) (pandemic H1N1)
  • the mutant type (antiviral resistant virus) is Influenza A / Korea / 2785/2009 ( pandemic H1N1) was used. It was prepared by dissolving 19.3 mg of oseltamivir derivative in 2 mL of distilled water (solution C). 50 ⁇ L of Solution A was added to each well of a 96 well plate, and a virus sample solution was added to each well.
  • Solution C was added to each well prepared at different concentrations by 50 ⁇ L (only distilled water was added in the comparison group). That is, solution A + each virus solution (wild type or mutant) + solution C was added to each well. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, 50 ⁇ L of a Na-fluor stop buffer solution was added to each well. Fluorescence was measured at Ex: 360 nm and Em: 450 nm to determine NA activity at the protein level. Higher NA activity means higher fluorescence intensity.
  • Example 4 Development and efficacy evaluation of antiviral susceptibility / resistance virus detection system using oseltamivir-gold nanoparticles
  • the oseltamivir analogue-nanoparticle of the present invention binds only to oseltamivir-sensitive virus, color change occurs when the nanoparticle is added to the oseltamivir-resistant virus, and the naked eye can detect whether the virus is oseltamivir-sensitive. It becomes possible. (See schematic diagram of FIG. 9).
  • Each well of a 96 well plate was prepared containing 100 or 1000 viruses.
  • Wild type antiviral susceptibility virus
  • pandemic H1N1 virus A / 04/2009 / California
  • pandemic H1N1 mutant type
  • Influenza A / Korea / 2785/2009 pandemic H1N1
  • 100 ⁇ L of oseltamivir analogue-gold nanoparticles prepared in Example 1 was added to each prepared well, and then the absorbance was measured in the 400-750 nm range to detect antiviral susceptibility / resistive virus through color change.
  • the absorption wavelength was shifted compared to the resistant virus or the control group (untreated virus).
  • the control and mutant treatment groups showed red color, but the wild-type treatment group turned purple. It was confirmed (Fig. 10).

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Abstract

본 발명은 항바이러스제 저항성 바이러스 검출용 나노입자에 관한 것이다. 본 발명을 이용하면 육안으로 오셀타미비르(타미플루) 감수성/저항성 바이러스를 빠르고 편리하게 진단/검출할 수 있다. 따라서 신속하게 인플루엔자 바이러스에 감염된 환자의 치료 계획을 세우는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

항바이러스제-감수성/저항성 바이러스 검출 시스템
본 발명은 항바이러스제-감수성/저항성 바이러스 검출 시스템에 관한 것이다.
인플루엔자(influenza, 독감)는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)에 의해 사람 및 동물(조류, 돼지, 개, 말 등)의 호흡기를 통해 전파되는 호흡기성 질병이다. 사람 인플루엔자(Human influenza)의 경우 매년 전 세계 10-20% 인구에서 발생하며, 전염성이 높아 매년 세계적 규모로 유행하는 경향이 있다. 인플루엔자의 증상은 고열, 두통, 근육통, 인후의 염증, 통증, 기침 등의 호흡기질환을 수반하며 심한 경우 노약자, 만성질환보유자 등의 사망을 유발할 수 있다.
인플루엔자 감염이 의심되면 신속하게 치료하여 위험한 상황이 초래되는 것을 막고 다른 사람들에게 추가적으로 전파되는 것을 방지해야 한다. 현재 인플루엔자 감염의 치료에는 오셀타미비르 포스페이트(타미플루)가 주로 이용되고 있는데, 근래에 오셀타미비르에 저항성을 나타내는 바이러스 변이주 발생이 증가하고 있다. 바이러스를 구별할 수 있는 방법에 대해서는 다수의 문헌에서 보고된 바 있는데, 예를 들어 Marin MJ et al.은 인간 인플루엔자 바이러스와 조류 인플루엔자 바이러스를 구별하는 방법에 대해 개시하고 있다. 그러나 인플루엔자 감염이 의심되는 환자가 오셀타미비르 저항성 바이러스에 감염되었는지 여부를 확인할 수 있는 효과적인 방법은 현재까지 개발된 바 없다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
Marin MJ et al. (Glyconanoparticles for the plasmonic detection and discrimination between human and avian influenza, Org Biomol Chem. 2013 Nov 7; 11(41):7101-7)
본 발명은 항바이러스제 저항성 바이러스 검출용 나노입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 나노입자를 이용하여 항바이러스제에 저항성을 나타내는 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 항바이러스제 저항성 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 기재되는 오셀타미비르 유사체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016003610-appb-I000001
상기 화학식 1에서, n은 1 이상의 정수이다. 바람직하게는 n은 10 이하의 정수일 수 있고, 예컨대 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 수 있고, 예를 들어 n은 5 이하의 정수, 예컨대 n은 1, 2, 3, 4, 5일 수 있다. 그러나 n의 수는 이에 제한되지 않으며, 나노입자에 따라 적절히 조정될 수 있다.
상기 화학식 1에서, R1은 나노입자에 결합하기에 적합한 작용기가 될 수 있으며, 예를 들어 티올(Thiol, SH), 아민(amine, NH2), 하이드록실(hydroxyl), 카복실(carboxyl), 이소티오시아네이트(Isothiocyanate), NHS 에스테르(NHS ester), 알데하이드(Aldehyde), 에폭사이드(Epoxide), 카보네이트(Carbonate), HOBt 에스테르(HOBt ester), 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde), 이미다졸 카바메이트(Imidazole carbamate), 말레이미드(Maleimide), 아지리딘(Aziridine), 비닐설폰(Vinylsulfone), 알데하이드(aldehyde), 하이드라진(hydrazine), 페닐 아자이드(phenyl azide), 벤조페논(benzophenone), 안트라퀴논(anthraquinone), 디엔(Diene) 기가 될 수 있다. 그러나 작용기는 이에 제한되지 않으며, 나노입자에 도입 가능한 어떠한 작용기라도 사용할 수 있다.
각 작용기는 공지의 방법에 의해 합성될 수 있고 또한 나노입자에 결합될 수 있다.
상기 화학식 1에서, R2는 H 또는 CxH(2x+1)이고, x는 10 이하의 정수일 수 있다. 예컨대 상기 x는 1이고 R2는 CH3일 수 있고, x는 2이고 R2는 C2H5일 수 있고, x는 3이고 R2는 C3H7일 수 있고, x는 4이고 R2는 C4H9일 수 있고, x는 5이고 R2는 C5H11일 수 있고, x는 6이고 R2는 C6H13일 수 있고, x는 7이고 R2는 C7H15일 수 있고, x는 8이고 R2는 C8H17일 수 있고, x는 9이고 R2는 C9H19일 수 있고, x는 10이고 R2는 C10H21일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 화학식 1로 기재되는 오셀타미비르 유사체는 화학식 2로 기재되는 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드(Oseltamivir-EGamine-acid) 또는 화학식 3으로 기재되는 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르(Oseltamivir-EGamide-ester)가 될 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2016003610-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2016003610-appb-I000003
본 발명은 항바이러스제 저항성 바이러스 검출용 나노입자를 제공한다.
본 발명의 나노입자는 하기 화학식 1로 기재되는 오셀타미비르 유사체가 나노입자에 결합된 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016003610-appb-I000004
상기 화학식 1에서, n은 1 이상의 정수이다. 바람직하게는 n은 10 이하의 정수일 수 있고, 예컨대 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 수 있고, 예를 들어 n은 5 이하의 정수, 예컨대 n은 1, 2, 3, 4, 5일 수 있다. 그러나 n의 수는 이에 제한되지 않으며, 나노입자에 따라 적절히 조정될 수 있다.
상기 화학식 1에서, R1은 나노입자에 결합하기에 적합한 작용기가 될 수 있으며, 예를 들어 티올(Thiol, SH), 아민(amine, NH2), 하이드록실(hydroxyl), 카복실(carboxyl), 이소티오시아네이트(Isothiocyanate), NHS 에스테르(NHS ester), 알데하이드(Aldehyde), 에폭사이드(Epoxide), 카보네이트(Carbonate), HOBt 에스테르(HOBt ester), 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde), 이미다졸 카바메이트(Imidazole carbamate), 말레이미드(Maleimide), 아지리딘(Aziridine), 비닐설폰(Vinylsulfone), 알데하이드(aldehyde), 하이드라진(hydrazine), 페닐 아자이드(phenyl azide), 벤조페논(benzophenone), 안트라퀴논(anthraquinone), 디엔(Diene) 기가 될 수 있다. 그러나 작용기는 이에 제한되지 않으며, 나노입자에 도입 가능한 어떠한 작용기라도 사용할 수 있다.
각 작용기는 공지의 방법에 의해 합성될 수 있고 또한 나노입자에 결합될 수 있다.
상기 화학식 1에서, R2는 H 또는 CxH(2x+1)이고, x는 10 이하의 정수일 수 있다. 예컨대 상기 x는 1이고 R2는 CH3일 수 있고, x는 2이고 R2는 C2H5일 수 있고, x는 3이고 R2는 C3H7일 수 있고, x는 4이고 R2는 C4H9일 수 있고, x는 5이고 R2는 C5H11일 수 있고, x는 6이고 R2는 C6H13일 수 있고, x는 7이고 R2는 C7H15일 수 있고, x는 8이고 R2는 C8H17일 수 있고, x는 9이고 R2는 C9H19일 수 있고, x는 10이고 R2는 C10H21일 수 있다.
본 발명의 나노입자는 직경이 1~100 나노미터 단위인 입자로서 육안 또는 흡/형광 장비로 확인이 가능한 임의의 나노입자가 될 수 있으며, 예를 들어 금나노입자, 은나노입자, 형광 나노입자, 형광 염색약 등이 될 수 있다. 상기 금나노입자 및 은나노입자는 100 나노미터 이하의 직경을 가진 다양한 형태(구형, 다각형 등)의 입자를 말한다. 상기 형광 나노입자는 형광 특성을 보이는 100 나노미터 이하의 나노 입자로, 동일한 물질이라 하더라도 입자의 크기에 따라 형광파장이 달라져 다양한 파장대의 형광을 얻을 수 있다. 형광 나노입자의 예는 형광 염색약이 포함된 다양한 나노 입자 및 양자점 입자(Quantum dots)로, 약 2～10nm 크기의 중심(core)과 주로 ZnS 등으로 이루어진 껍질(shell)로 구성된 것을 들 수 있다. 상기 양자점을 이루는 Ⅱ-Ⅵ 또는 Ⅲ-Ⅴ족 화합물은 예를 들어 CdSe, CdSe/ZnS, CdTe/CdS, CdTe/CdTe, ZnSe/ZnS, ZnTe/ZnSe, PbSe, PbS InAs, InP, InGaP, InGaP/ZnS 및 HgTe로 구성된 군에서 선택될 수 있다(단일 코어(core) 또는 코어(core)/쉘(shell) 형태). 형광 염색약은 예를 들어 형광성을 보이는 유기 분자 (예, 파이렌 (Pyrene) 또는 이의 유도체), 시아닌(Cyanine, Cy) 시리즈, 알렉사플루오르(Alexa Fluor) 시리즈, 보디피 (BODIPY) 시리즈, DY 시리즈, 로다민 (rhodamine) 또는 이의 유도체, 플루오레신(Fluorescein) 또는 이의 유도체, 쿠마린 (coumarin) 또는 이의 유도체, 아크리딘 호모다이머 (Acridine homodimer) 또는 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 또는 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 또는 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 또는 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 또는 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 또는 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 또는 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 또는 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 또는 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 또는 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 또는 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 또는 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 또는 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 또는 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 또는 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 또는 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 또는 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI) 또는 이의 유도체, 칼세인(Calcein) 또는 이의 유도체, 오레건 그린(Oregon Green) 또는 이의 유도체, 마그네슘 그린(Magnesium Green) 또는 이의 유도체, 칼슘 그린(Calcium Green) 또는 이의 유도체, JOE 또는 이의 유도체, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine) 또는 이의 유도체, TRITC 또는 이의 유도체, TAMRA 또는 이의 유도체, 피로닌 Y(Pyronin Y) 또는 이의 유도체, 리싸민(Lissamine) 또는 이의 유도체, ROX 또는 이의 유도체, 칼슘크림선(Calcium Crimson) 또는 이의 유도체, 텍사스 레드(Texas Red) 또는 이의 유도체, 나일 레드(Nile Red) 또는 이의 유도체, 티아디카복시아닌(Thiadicarbocyanine) 또는 이의 유도체, 단실아마이드(dansylamide) 또는 이의 유도체, 캐스캐이드 블루 (cascade blue), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole), FITC, Cy3, Cy5, Cy5.5 Cy7 등)이 있다. 그러나 나노입자의 종류는 이에 제한되지 않는다. 각 나노입자는 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 본 발명의 나노입자는 화학식 2로 기재되는 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드(Oseltamivir-EGamine-acid) 또는 화학식 3으로 기재되는 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르(Oseltamivir-EGamide-ester)가 결합된 나노입자가 될 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2016003610-appb-I000005
[화학식 3]
Figure PCTKR2016003610-appb-I000006
상기 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드 및 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르는 오셀타미비르 유사체로서, 2회 반복되는 폴리에틸렌글리콜 링커와 아민 작용기를 통해 나노입자에 결합된 것이다. 상기 나노입자는 금나노입자가 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 나노입자에서 결합된 오셀타미비르 유사체에서, 오셀타미비르에 폴리에틸렌 링커가 결합된 위치가 매우 중요한데, 이는 어디에 결합되느냐에 따라 적절하게 반응이 일어날지 여부가 달라지기 때문이다.
오셀타미비르 저항성 인플루엔자 바이러스는 통상적으로 H274Y 부위에 돌연변이가 일어나는 것으로 알려져 있다. 오셀타미비르는 인플루엔자 바이러스에 결합하여 뉴라미니다제(neuraminidase, NA) 활성을 감소시키는 방식으로 바이러스를 사멸시키는데, H274Y 부위에 돌연변이가 일어나면 오셀타미비르가 바이러스에 결합하기가 어렵다.
본 발명의 나노입자에 결합된 오셀타미비르 유사체는 H274Y 부위에 돌연변이가 일어나 오셀타미비르에 저항성을 나타내는 바이러스에는 결합하지 않으며, 오셀타미비르에 감수성이 있는 바이러스에만 결합한다. 본 발명의 나노입자가 바이러스에 결합했는지 여부는 육안으로 또는 흡광도 측정을 통해 색상을 비교함으로써(비색법) 확인할 수 있다. 따라서 본 발명은 매우 간단하고 편리한 방법으로 대상체가 감염된 바이러스가 오셀타미비르 저항성 바이러스인지 여부를 확인할 수 있다.
본 발명은 상기 나노입자를 이용하여 오셀타미비르 저항성 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은, 1) 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상체로부터 분리된 시료를 화학식 1로 기재되는 오셀타미비르 유사체가 결합된 나노입자와 접촉시키는 단계; 2) 인플루엔자 바이러스가 존재하지 않는 시료에 상기 나노입자를 접촉시킨 경우에 나타나는 색상과 동일한 색상이 상기 1) 단계의 시료에서 나타나는 경우 대상체가 감염된 인플루엔자 바이러스가 오셀타미비르 저항성 바이러스라고 판단하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일 구현예로서, 상기 2) 단계의 비교는 흡광도 측정 또는 육안 관찰로 수행될 수 있다. 또한 상기 방법에 있어서, “동일한 색상”이라 함은 반응 조건, 시료의 상태 등에 채도(chroma), 명도(brightness), 색상(hue)에 있어 약간의 차이가 있더라도 실질적으로 동일하다고 볼 수 있는 정도의 색상을 의미한다.
상기 대상체는 인간 또는 그 밖의 동물, 예컨대 조류 또는 포유류가 될 수 있다.
상기 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 혈액 세포, 내피 세포, 조직 생검, 림프액, 복수액, 간질액, 골수, 뇌척수액 (CSF), 정액, 타액, 점액, 객담, 땀 또는 소변일 수 있다.
본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 오셀타미비르 저항성 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 기타 검출에 필요한 물품들을 더 포함할 수 있으며, 사용 지침(instruction)을 더 포함할 수 있다.
본 발명을 이용하면 오셀타미비르 저항성 인플루엔자 바이러스를 육안으로 빠르고 편리하게 검출할 수 있다. 따라서 신속하게 인플루엔자 바이러스에 감염된 환자의 치료 계획을 세우는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 합성된 금나노입자의 모양을 전자현미경(TEM)으로 확인한 도이다.
도 2는 합성된 금나노입자의 흡광도를 UV-비스 스펙트로스코피(UV-vis spectroscopy)로 확인한 도이다.
도 3 내지 5는 단백질 수준에서 각 물질이 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 억제하는 정도를 확인한 것이다. 도 3의 좌측 도는 오셀타미비르 포스페이트가 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 억제하는 정도를 확인한 것이다. 도 3의 우측 도는 오셀타미비르 카복실레이트가 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 억제하는 정도를 확인한 것이다. 도 4는 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드가 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 억제하는 정도를 확인한 것이다. 도 5는 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르가 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 억제하는 정도를 확인한 것이다.
도 6 내지 8은 바이러스 수준에서 각 물질이 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 억제하는 정도를 확인한 것이다. 도 6은 오셀타미비르 포스페이트가 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 억제하는 정도를 확인한 것이다. 도 7은 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드가 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 억제하는 정도를 확인한 것이다. 도 8은 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르가 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스의 뉴라미니다제 활성을 억제하는 정도를 확인한 것이다.
도 9는 본 발명의 나노입자와 오셀타미비르 감수성 바이러스 및 오셀타미비르 저항성 바이러스의 결합 양상을 나타낸 모식도이다.
도 10은 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드가 결합된 금나노입자를 오셀타미비르 감수성 바이러스와 오셀타미비르 저항성 바이러스와 각각 반응시켰을 때 흡광도를 확인한 그래프(좌측 도) 및 색상 차이를 육안으로 확인한 도(우측 도)이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
또한, 이하에서 언급된 시약 및 용매는 특별한 언급이 없는 한 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)　로부터 구입한 것이다.
실시예 1. 나노입자의 제조
1-1. 오셀타미비르 유도체 합성
오셀타미비르 유도체를 하기의 반응식에 따라 합성하였다.
[반응식]
Figure PCTKR2016003610-appb-I000007
구체적인 합성 방법은 하기와 같다.
2-(2-(2-chloroethoxy)ethoxy)acetic acid (2) 합성
실온에서 크로뮴(chromium)(VI) 옥사이드(oxide)(14.7 g, 164 mmol)의 1.5 M H2SO4(300 mL)용액을 교반하면서 알코올(alcohol) 1 (8.31 g, 49.2 mmol)의 아세톤(acetone)(300 mL) 용액을 천천히 적가하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 교반한 후 농축하여 유기 용매를 제거하고, 농축액을 CH2Cl2(3x50 mL)로 추출하고, 유기 층을 합쳐 무수 MgSO4로 건조한 후 농축했다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)(Hexanes:EtOAc = 1:1 ~ 1:2)를 이용하여 분리해서 연한 노란색 액체의 acid 2 (4.51 g, 50%)를 얻었다.
Oseltamivir-EGamide-chloride (4) 합성
실온에서 acid 2 (1.60 g, 8.78 mmol)의 CH2Cl2(30mL)용액을 교반하면서 오셀타미비르 포스페이트(3) (3.00 g, 7.31 mmol), 1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimide hydrochloride (2.80 g, 14.6 mmol), 1-hydroxybenzotriazole (1.97 g, 14.6 mmol)과 트리에틸아민(triethylamine)(2.03 ml, 14.6 mmol)을 가했다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 반응혼합물에 증류수를 가해서 반응을 종결했다. 혼합물을 CH2Cl2(3x30 mL)로 추출하고, 유기 층을 합쳐 무수 Na2SO4 건조, 여과한 후 농축했다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:MeOH = 20:1)를 이용하여 분리하여 노란색 액체의 chloride 4 (2.16 g, 62%)을 얻었다.
Oseltamivir-EGamide-azide (5) 합성
실온에서 chloride 4 (1.32 g, 2.77 mmol)의 DMF (15 mL) 용액을 교반하면서 소디움 아자이드(sodium azide)(540 mg, 8.31 mmol)을 가했다. 반응 용기를 70 ℃에서 24시간 동안 가열했다. 반응혼합물에 증류수를 가하여 반응을 종결했다. 혼합물을 EtOAc(3x20 mL)로 추출하고, 유기 층을 합쳐 무수 Na2SO4 건조, 여과한 후 농축했다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:MeOH = 20:1)를 이용하여 분리하여 노란색 액체의 azide 5 (950 mg, 71%)을 얻었다.
Oseltamivir-EGamide-ester (6) 합성
실온에서 azide 5 (950 mg, 1.96 mmol)의 THF/H2O (10:1, v/v, 15 mL)용액을 교반하면서 트리페닐포스핀(triphenylphosphine)(1.54 mg, 5.89 mmol)을 가했다. 반응 용기를 70 ℃에서 12시간 동안 가열한 후, 반응 용매를 제거했다. 농축액을 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH=20:1-7:1)를 이용하여 분리하여 노란색 액체의 혼합물을 얻었다. 혼합물을 CH2Cl2/MeOH에서 재결정하여 흰색 고체의 amine 6(화학식 3) (385 mg, 43%)을 얻었다.
Oseltamivir-EGamide-acid (7) 합성
실온에서 ester 6(화학식 3) (250 mg, 0.546 mmol)의 THF/H2O (4:1, v/v, 5 mL)용액을 교반하면서 1 M NaOH 수용액 (0.573 mL, 0.573 mmol)을 가했다. 반응 혼합물을 6시간 동안 교반한 후, 반응 용매를 제거했다. 농축액을 CH2Cl2/MeOH에서 재결정하여 흰색 고체의 acid 7(화학식 2) (113 mg, 46%)을 얻었다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2016003610-appb-I000008
[화학식 3]
Figure PCTKR2016003610-appb-I000009
1-2. 금나노입자 합성
100 mL의 증류수에 1 wt%의 HAuCl4 용액 (1 mL)를 넣고 95 oC에서 강렬하게 교반시켰다. 그 상태에서, 즉시 1 wt%의 소디움 시트레이트(Sodium citrate)(5 mL)를 천천히 주입하고, 30분간 같은 조건에서 반응시켰다. 합성된 금나노입자의 모양을 전자현미경(TEM)으로 (도 1), 흡광도를 UV-비스 스펙트로스코피로 각각 확인하였다(도 2).
1-3. 나노입자-오셀타미비르 유도체 결합
1-2에서 합성된 금나노입자 용액의 5 mL을 15000 rpm, 10분간 원심분리하여 과량의 소디움 시트레이트를 제거하였다. 상층액은 버리고, 1 mL의 증류수로 재 분산한 뒤, 15000 rpm, 10분간 원심분리하였다. 해당 과정을 2회 더 반복하였다. 마지막 단계에서 상층액은 버리고, 증류수에 분산된 오셀타미비르 유도체 (2 mg/mL) 1 mL를 첨가하였다. 그리고, 12시간 이상 볼텍싱(voltexing)하여, 오셀타미비르 유도체 (Oseltamivir-EGamide-acid) 가 금나노입자에 결합되도록 하였다.
실시예 2. 단백질 수준에서의 뉴라미니다제 활성 비교
이하 실시예 2에서 NA-FluorTM 인플루엔자 뉴라미니다제 어세이 키트(NA-FluorTM Influenza Neurmaminidase Assay Kit)(AB Applied biosystem, Prod No. 4457091)를 이용하여 뉴라미니다제(NA) 활성도를 측정하였다.
구체적으로, 키트 내의 작업용액(working solution)(5.52 mL)에 Na-flour (480 μL)를 녹여 용액 A를 준비하였다. 2.9 mL의 작업용액에 0.2 mL의 야생형(Wild) NA 단백질(인플루엔자 H1N1 NA, Sino biological Inc.) (0.5 mg/mL)를 첨가하였다(용액 B-wild). 돌연변이(Mutant) NA 단백질(인플루엔자 H1N1 NA (H274), Sino biological Inc.)도 용액 B-wild와 동일한 조건으로 준비하였다(용액 B-mutant). 2 mL의 증류수에 오셀타미비르 유도체 19.3 mg을 녹여 준비하였다(용액 C). 96 웰 플레이트의 각 웰에 용액 A를 50 μL 넣고, 각각 용액 B-wild와 용액 B-mutant를 50 μL 넣었다. 용액 C를 농도를 달리하여 준비된 웰에 50 μL 씩 첨가하였다(비교군에서는 증류수만 첨가). 즉, 각 웰 당 용액 A + 용액 B-wild (또는 용액 B-mutant)+ 용액 C를 넣은 것이다. 37℃에서 1시간 배양한 뒤, 각 웰에 Na-flour stop buffer 용액을 50 μL 씩 넣었다. Ex: 360 nm, Em: 450nm 으로 형광을 측정하여 단백질 수준에서의 NA 활성도를 측정하였다. NA 활성도가 높을수록 형광 강도가 높음을 의미한다.
2-1. 오셀타미비르 포스페이트
오셀타미비르 포스페이트는 타미플루의 주성분이다. 상기 방법으로 오셀타미비르 포스페이트(CAS 등록번호 204255-11-8)가 NA 활성에 미치는 영향을 확인하였을 때, 야생형(Wild)의 NA 활성이 매우 낮게 나타나나, 돌연변이(Mutant)의 NA 활성은 높게 유지됨을 알 수 있다 (도 3 좌측 도).
이는 H274Y 변이가 일어난 인플루엔자 바이러스가 오셀타미비르에 저항성을 보임을 확인 한 것이다.
2-2. 오셀타미비르 카복실레이트
오셀타미비르 카복실레이트는 잘 알려진 오셀타미비르 유사체이다. 상기 방법으로 오셀타미비르 카복실레이트(CAS 등록번호 187227-45-8)가 NA 활성에 미치는 영향을 확인하였을 때, 오셀타미비르 카복실레이트는 실험 농도 전 범위에서 야생형(Wild)의 NA활성을 억제하며, 고농도로 사용되었을 때에는 돌연변이(Mutant)의 NA 활성도 억제함을 확인하였다(도 3 우측 도).
이와 같이 실험에 사용한 야생형(Wild) NA와 돌연변이(Mutant) NA 단백질은 오셀타미비르 포스페이트(타미플루), 오셀타미비르 카복실레이트에 감수성과 저항성을 보였으므로, 해당 실험에 적당한 단백질임을 확인하였다.
2-3. 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드 (Oseltamivir EGamide-acid)
상기 방법으로 실시예 1에서 제조한 본 발명의 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드가 NA 활성에 미치는 영향을 확인하였을 때, 야생형(Wild)의 NA 활성은 낮게 나타나나, 돌연변이(Mutant)의 NA 활성은 높게 유지됨을 알 수 있다(도 4). 감수성이 있는 경우와 없는 경우의 차이가 분명하므로 본 발명의 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드는 오셀타미비르 감수성/저항성 바이러스 검출에 적절하다고 판단하였다.
2-4. 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르 (Oseltamivir-EGamide-ester)
상기 방법으로 실시예 1에서 제조한 본 발명의 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르가 NA 활성에 미치는 영향을 확인하였을 때, 야생형(Wild)의 NA 활성은 낮게 나타나나, 돌연변이(Mutant)의 NA 활성은 높게 유지됨을 알 수 있다(도 5). 감수성이 있는 경우와 없는 경우의 차이가 분명하므로 본 발명의 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르는 오셀타미비르 저항성 바이러스 바이러스 검출에 적절하다고 판단하였다.
실시예 3. 바이러스에서의 뉴라미니다제 활성 비교
이하 실시예 3에서 NA-FluorTM 인플루엔자 뉴라미니다제 어세이 키트 (AB Applied biosystem, Prod No. 4457091)를 이용하여 NA 활성도를 측정하였다.
구체적으로, Kit 내의 작업용액(working solution)(5.52 mL)에 Na-fluor (480 μL)를 녹여 용액 A를 준비하였다. 바이러스 용액은 각 웰 당 각각 100개, 또는 1000개의 바이러스가 들어 있도록 준비하였다. 야생형(Wild type)(항 바이러스제 감수성 바이러스)은 판데믹 H1N1 바이러스(A/04/2009/California) (pandemic H1N1), 돌연변이(Mutant type)(항 바이러스제 저항성 바이러스)은 Influenza A/Korea/2785/2009 (pandemic H1N1)를 사용하였다. 2 mL의 증류수에 오셀타미비르 유도체 19.3 mg을 녹여 준비하였다(용액 C). 96 웰 플레이트의 각 웰에 용액 A를 50 μL 넣고, 각각 바이러스 시료 용액을 넣었다. 용액 C를 농도를 달리하여 준비된 웰 에 50 μL 씩 첨가하였다(비교군에서는 증류수만 첨가). 즉, 각 웰 당 용액 A+각 바이러스 용액(야생형 또는 돌연변이)+용액 C를 넣었다. 37℃에서 1시간 배양한 뒤, 각 웰에 Na-fluor 정지 완충액(stop buffer) 용액을 50μL 씩 넣었다. Ex: 360 nm, Em: 450 nm 으로 형광을 측정하여 단백질 수준에서의 NA 활성도를 측정하였다. NA 활성도가 높을수록 형광 강도(intensity)가 높음을 의미한다.
3-1. 오셀타미비르 포스페이트
상기 방법으로 오셀타미비르 포스페이트가 NA 활성에 미치는 영향을 확인하였을 때, 야생형(Wild)의 NA 활성이 매우 낮게 나타나나, 돌연변이(Mutant)의 NA 활성은 높게 유지됨을 알 수 있다 (도 6).
3-2. 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드 (Oseltamivir-EGamide-acid)
상기 방법으로 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드가 NA 활성에 미치는 영향을 확인하였을 때, 오셀타미비르 포스페이트와 마찬가지로 야생형(Wild)의 NA 활성이 매우 낮게 나타나나, 돌연변이(Mutant)의 NA 활성은 높게 유지됨을 알 수 있다 (도 7).
3-3. 오셀타미비르 에틸렌글리콜 아마이드-에스테르 (Oseltamivir-EGamide-ester)
상기 방법으로 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르가 NA 활성에 미치는 영향을 확인하였을 때, 오셀타미비르 포스페이트와 마찬가지로 야생형(Wild)의 NA 활성이 매우 낮게 나타나나, 돌연변이(Mutant)의 NA 활성은 높게 유지됨을 알 수 있다 (도 8).
상기 결과를 통하여 오셀타미비르 유사체 중 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에시드와 오셀타미비르-에틸렌글리콜 아마이드-에스테르가 오셀타미비르 포스페이트에 감수성이 있는 바이러스의 NA 활성을 감소시키는 역할을 함을 확인하였다.
실시예 4. 오셀타미비르-금나노입자를 이용한 항바이러스제 감수성/저항성 바이러스 검출 시스템 개발 및 효능 평가
본 발명의 오셀타미비르 유사체-나노입자는 오셀타미비르 감수성 바이러스에만 결합하므로 상기 나노입자를 오셀타미비르 저항성 바이러스에 가했을 경우와 색상 변화가 발생하여, 육안으로 바이러스의 오셀타미비르 감수성 여부를 검출할 수 있게 된다. (도 9의 모식도 참조).
96 웰 플레이트의 각 웰 당 바이러스가 100개, 또는 1000개의 바이러스가 들어 있도록 준비하였다. 야생형(Wild type)(항 바이러스제 감수성 바이러스)은 판데믹 H1N1 바이러스(pandemic H1N1 virus)(A/04/2009/California) (pandemic H1N1), 돌연변이(mutant type)(항 바이러스제 저항성 바이러스)는 Influenza A/Korea/2785/2009 (pandemic H1N1)을 사용하였다. 준비된 각 웰 당 실시예 1에서 제조한 오셀타미비르 유사체-금나노입자 100 μL을 첨가한 뒤, 흡광도를 400-750 nm 범위에서 측정하여 항바이러스제 감수성/ 저항성 바이러스를 색변화를 통하여 검출 하였다. 감수성 바이러스의 경우 저항성 바이러스 또는 대조군 (바이러스 미처리) 에 비하여 흡광 파장이 이동하는 것을 확인하였으며, 또한 대조군과 돌연변이(Mutant) 처리 군은 붉은색을 보이나, 야생형(Wild) 처리 군은 보라색으로 변함을 육안으로 확인하였다(도 10).

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1로 기재되는 오셀타미비르 유사체가 결합된, 오셀타미비르 저항성 인플루엔자 바이러스 검출용 나노입자.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016003610-appb-I000010
    상기 화학식 1에서, n은 10 이하의 정수이고,
    R1은 SH 또는 NH2이고,
    R2는 H 또는 CxH(2x+1)이고, x는 10 이하의 정수일 수 있다.
  2. 화학식 2로 기재되는 오셀타미비르 에틸렌글리콜 아마이드 에시드(Oseltamivir EGamide-acid) 또는 화학식 3으로 기재되는 오셀타미비르 에틸렌글리콜 아마이드-에스테르(Oseltamivir EGamide-ester)가 결합된, 오셀타미비르 저항성 인플루엔자 바이러스 검출용 나노입자.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2016003610-appb-I000011
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2016003610-appb-I000012
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 나노입자는 금나노입자, 은나노입자, 또는 형광 나노입자인 나노입자.
  4. 1) 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상체로부터 분리된 시료를 화학식 1로 기재되는 오셀타미비르 유사체가 결합된 나노입자와 접촉시키는 단계;
    2) 인플루엔자 바이러스가 존재하지 않는 시료에 화학식 1로 기재되는 오셀타미비르 유사체가 결합된 나노입자를 접촉시킨 경우에 나타나는 색상과, 상기 1) 단계에서 나노입자와 접촉시킨 시료에서 나타나는 색상을 비교하는 단계; 및
    3) 상기 2) 단계에서 양 색상이 동일하게 나타나는 경우, 상기 대상체가 감염된 인플루엔자 바이러스가 오셀타미비르 저항성 바이러스라고 판단하는 단계를 포함하는, 오셀타미비르 저항성 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016003610-appb-I000013
    상기 화학식 1에서, n은 10 이하의 정수이고,
    R1은 SH 또는 NH2이고,
    R2는 H 또는 CxH(2x+1)이고, x는 10 이하의 정수일 수 있다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 2) 단계의 비교는 흡광도 측정 또는 육안 관찰로 수행되는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항의 나노입자를 포함하는 오셀타미비르 저항성 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.
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