WO2016159554A1 - 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물 - Google Patents

비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물 Download PDF

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    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages

Definitions

  • Non-reducing terminal unsaturated manneulic acid oligosaccharide and composition comprising the same as an active ingredient
  • the present invention relates to a non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide and a composition comprising the same as an active ingredient.
  • Metabolic syndrome refers to a type 2 diabetes caused by obesity and insulin resistance and a combination of various metabolic disorders. As metabolic syndrome is rapidly increasing due to aging population and high calorie diet, there is an urgent need to prevent the root cause and to develop medicines or food materials.
  • the representative seaweed polysaccharide algini c acid is contained 15-35% in brown algae such as kelp and seaweed, and ⁇ -D-mannuronic acid (M) and a— Two types of uronic acid (L-Gluronic acid (G)) of the urinary acid (uroni c acid) is characterized by the polyuronide (glycoside) of 1, 4 glycoside bonds in various ratios
  • L-Gluronic acid (G) Two types of uronic acid (L-Gluronic acid (G)) of the urinary acid (uroni c acid) is characterized by the polyuronide (glycoside) of 1, 4 glycoside bonds in various ratios
  • M0S mannuro— ol igosacchar ide
  • gluronic acid oligosaccharides guluro-ol igosacchar ide
  • AOS alginate ol igosacchar ide
  • Marine polysaccharides have been used for a long time in human life, and researches on physiological activities of marine cancer-derived anticancer, antioxidant, antihypertensive and antimicrobial substances have been actively conducted worldwide.
  • Alginic acid aid production around the world is about 100,000 tons, of which 3OT is used as a food additive, but if it is developed as a high value-added pharmaceutical ingredient, it can double its value.
  • 3OT is used as a food additive
  • anti-inflammatory, antioxidant, and antibacterial activity are reported according to the structural specificity.
  • the field of entrepreneurs is spreading widely.
  • the present inventors have sought to enhance their use in medicines and foods based on alginic acid oligosaccharides.
  • the present invention was completed by identifying an alginate-derived, non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharide having various physiological activities such as anti-obesity, anti-diabetic, intestinal microbial flora improvement and estrogen efficacy.
  • an object of the present invention is to provide a non-reducing terminal unsaturated unsaturated manneuronic oligosaccharide.
  • Another object of the present invention to provide a composition for improving, preventing or treating obesity.
  • Another object of the present invention to provide a composition for improving, preventing or treating diabetes.
  • Another object of the present invention to provide a probiotic for promoting enteric beneficial bacteria.
  • Another object of the present invention to provide a composition for improving, preventing or treating menopausal syndrome.
  • the present invention provides a polymanneuronic (po ly-mannuronate) substrate with a non-reducing endless unsaturated mannule having a molecular weight of 100-3000 Da or less degraded by al inate lyase.
  • a polymanneuronic (po ly-mannuronate) substrate with a non-reducing endless unsaturated mannule having a molecular weight of 100-3000 Da or less degraded by al inate lyase.
  • the inventors of the present invention provide pharmaceutical products and foods based on alginic acid oligosaccharides. Efforts have been made to promote their use. As a result, we have identified the alginate-derived non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharides of alginic acid which have various physiological activities such as anti-obesity, anti-diabetes, intestinal microbial flora improvement and estrogen efficacy.
  • non-reducing refers to the structure of oligosaccharides, including hemiacetals (a ring formation between C-1 and C-5) of anomenosaccharides, and hemimetals (ring formation between C-2 and C-5). In the cyclization reaction to produce a diastereoisomer where the positions of hydrogen atoms and hydroxyl groups attached to a carbon are changed).
  • saturated refers to a form in which a carbon chain having a hydrogen atom is unsaturated
  • saturated refers to a saturated form of a carbon chain having a hydrogen atom
  • the non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention refers to all manneuronic oligosaccharides having no anomer carbon and unsaturated carbon chains of hydrogen atoms.
  • the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharide has a structural formula of one example of the following (manneuronic oligosaccharide with three sugars bound):
  • the non-reducing terminal monounsaturated mononumeric acid oligosaccharide is 175 for 1 sugar, 351 for 2 sugars, 527 for 3 sugars, 704 for 4 sugars, 704 for 5 sugars, 880, 6 sugars 1056, 7 sugars Has a Z-average molecular weight (m / z) of 1232 (FIG. 2).
  • non-reducing terminal saturated manneuronic acid oligosaccharide refers to saturated manneuronic acid obtained by acid hydrolysis of polymanneuronic acid. Oligosaccharides.
  • the non-reducing terminal unsaturated unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention is prepared by decomposing by alginate lyase as a poly mannuronic acid (po ly- mannuronate) substrate.
  • the alginic acid lyase means an enzyme that degrades alginate (alginate) composed of polygukironate (polygukironate) and polymannuronate (polymannuronate).
  • the alginic acid lyase is AlyDWll (Republic of Korea Patent Registration 10-1277706) derived from the abdominal intestinal strain.
  • the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic acid sugar of the present invention is composed of one or more sugars.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharide comprises 1 to 10 manneuronic acid or gluronic acid. According to another embodiment of the invention, it comprises from 1 to 9 manneuronic acid or gluronic acid. According to another embodiment of the invention, it comprises 1 to 8 manneuronic acid or gluronic acid. According to certain embodiments of the invention, it comprises 1 to 7 manneuronic acids or gluronic acid.
  • the non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention has a small mass value of about 18, which is the mass value of water molecules, since water molecules are removed in comparison with the non-reducing terminal-type saturated manuronic acid oligosaccharides (Fig. 2).
  • the non-reducing terminal of the unsaturated manuronic acid oligosaccharide of the present invention consists of manneuronic acid and gluronic acid.
  • the ratio of manneuronic acid to gluronic acid of the non-reducing terminally unsaturated manuronic acid oligosaccharide is 1.2-5.0: 1.
  • 1.2-4.5 1.
  • 1.8-4.0 1.
  • it is 2.0-3.0: 1. That is, the non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention contains manneuronic acid 1.2-5.0, 1.2-4.5, 1.8-4.0 or 2.0-3.0 times more dominantly than gluronic acid (FIG. 4).
  • the non-reducing terminal unsaturated type It includes a composition for improving obesity, prevention or treatment containing manneuronic acid oligosaccharides as an active ingredient.
  • abnormality refers to a state in which fat tissue is accumulated in the body to the extent that it causes abnormalities in health.
  • the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharides of the present invention inhibit fat accumulation.
  • the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide oligosaccharide 20-60%, 25-50% or 30-40% inhibition of the accumulation of triglycerides, non-reducing terminal saturation Lonic acid is inhibited by 10-30%, 10-25% or 10-30%.
  • the non-reducing terminal unsaturated manneuronic acid oligosaccharides inhibit the accumulation of triglycerides by more than two times as compared to the non-reducing terminal-saturated manneuronic oligosaccharides.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid ligosaccharides control the intestinal microflora inducing obesity.
  • intestinal microflora or gut microflora refers to a complex community of microorganisms that grow in the digestive tract of the constituent animal.
  • the individual microorganisms that make up the intestinal microflora can also damage or benefit the host by the production or resolution of the intestinal microflora, which, when viewed as a whole, is involved in supporting vitamin supply, infection prevention and intestinal function (synthesis and absorption).
  • the composition of the flora is known to be closely related to the development of constipation and intestinal diseases (Mistuoka T. Bifidobacteria Microflora, 1 (1): 3, 1982).
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharides control the intestinal microflora by reducing the growth of enteric microbial strains.
  • the intestinal microbial strain is a strain selected from the group consisting of Roseburia ⁇ Roseburia sp.) And Lactobacillus ⁇ (Lactobacillus).
  • the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharides of the present invention inhibit the expression of genes associated with fat-differentiation leading to obesity.
  • the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide oligosaccharide is ap2 (adipocyte protein 2), C / EBP ⁇ (CAAT enhancer binding protein a) and PPAR ⁇ (Peroxi some Prol i ferator-Act ivated Inhibits the expression of Receptor ⁇ ).
  • the non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides inhibit the expression of aP2, C / EBP ⁇ and PPAR ⁇ by 15-35%, 50-70% and 30-50%, respectively. This effect is 1.5 to 7.0 times better compared to the non-reducing terminal, saturated manneuronic oligosaccharides.
  • the composition for improving, preventing or treating obesity of the present invention may be prepared as a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, a food composition for improving or preventing obesity, or a functional food composition.
  • the present invention provides a composition for improving, preventing or treating diabetes, including a non-reducing terminal unsaturated unsaturated manneuronic oligosaccharide as an active ingredient.
  • diabetes means a chronic disease characterized by a relative or absolute lack of insulin leading to glucose-intolerance.
  • diabetes includes all kinds of diabetes and includes, for example, type 1 diabetes, type 2 diabetes and hereditary diabetes.
  • Type 1 diabetes is insulin dependent diabetes, mainly caused by the destruction of ⁇ -cells.
  • Type 2 diabetes is insulin independent diabetes, caused by poor insulin secretion after a meal or by insulin resistance.
  • an unsaturated-type mannyu acid oligosaccharides of the non-reducing end is to facilitate the "absorbed (uptake) of glucose (glucose).
  • This effect of the present invention is the effect of only the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharides which do not appear in the non-reducing terminal saturation manneuronic oligosaccharides.
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharides promote sugar absorption through the AMPK (AMP-activated Proein Ki nase) pathway.
  • AMPK AMP-activated Proein Ki nase
  • the composition for improving, preventing or treating diabetes of the present invention is for preventing or It may be prepared as a therapeutic pharmaceutical composition, a food composition for improving or preventing diabetes, or a functional food composition.
  • the present invention provides a probiotic for promoting enteric beneficial bacteria comprising a non-reducing terminal unsaturated unsaturated manneuronic oligosaccharide as an active ingredient.
  • Probiotics for promoting enteric beneficial bacteria of the present invention enhance the growth of enteric beneficial bacteria.
  • the enteric beneficial bacteria Roseburia sp. Roseburia sp. ) And Lactobacillus sp. LactobacH lus sp. ) S—Intestinal beneficial bacteria selected from the group consisting of
  • probiotics refers to food supplements of live bacteria that contribute to health to the host organism.
  • the probiotic composition of the present invention may be prepared as a fermented milk product, but may also be prepared in the form of granules, powders and the like.
  • the method of administering the probiotic composition of the present invention is not particularly limited, it may be prepared by pill tablets or the like orally, or may be prepared in powder or granule form and added to food.
  • the composition of the present invention can be used by itself, for example, when used as a medicine, without formulating a powder of each component, but powders, granules, fine granules, tablets, dragees, capsules, tablets, enteric It can be formulated in the form of a coating agent or the like.
  • the diluent, excipients, binders, disintegrating agents and the like used in general pharmaceutical preparations can be used, and colorants, stabilizers, preservatives, lubricants and the like can be added.
  • the food composition of the present invention when used as a food, it can be used without formulating powder of each component as it is, but other plant fibers, oligosaccharides, grains, vitamins, etc. may be added, or a flavor, a coloring agent, a spice agent or the like may be used. It is also possible to form and process into a form suitable for ingestion. Moreover, as a food additive, it can also add and mix it with another foodstuff.
  • Probiotics for promoting enteric benefit bacteria of the present invention can be prepared as pharmaceutical compositions, food compositions or functional food compositions.
  • the present invention provides a composition for improving, preventing or treating menopausal syndrome, which comprises a non-reducing terminal saturated manneuronic oligosaccharide as an active ingredient.
  • menopausal syndrome is a kind of female endocrine syndrome, whether natural loss, surgical loss, or chemically induced loss of the overall gradual decrease in ovarian function resulting in reduced physiological and sexual function to It is a transitional period that is lost, and a process of menopause leads to menopause, which is a permanent cessation of physiology after ovarian functioning stops.
  • menopause acute symptoms may occur due to hormonal changes such as decreased estrogen production, elevated follicle stimulating hormone and luteinizing hormone.
  • the initial symptoms may include vascular motility symptoms such as febrile hot flashes and night sweats, and psychological symptoms such as anxiety, decreased concentration, and depression, and the genitourinary and epidermal symptoms that appear within the years of menopause, and osteoporosis and cardiovascular after years of menopause. And diseases such as cerebrovascular disease.
  • the menopausal syndrome is a syndrome selected from the group consisting of hot flashes, sweating, heart discomfort, sleep problems, depression, irritability, anxiety, physical fatigue mental fatigue, sexual problems, urination problems, vaginal dryness, joint discomfort and muscle discomfort It includes.
  • composition including the non-reducing terminally saturated manneuronic oligosaccharide of the present invention as an active ingredient increases the activity of estrogen.
  • the non-reducing terminally unsaturated manneuronic acid oligosaccharide is composed of the estrogen response element (ERE) -mediated subgenes via the estrogen receptor pathway that acts as an estrogen ligand and the estrogen related receptor alpha pathway that acts independently of the estrogen. Expression activates estrogens.
  • EEE estrogen response element
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharides induce the expression of ERE via the estrogen receptor ⁇ .
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharides express estrogen related receptor alpha to induce the expression of ERE. Due to the expression of the ERE, estrogen activity is increased through the expression of the lower estrogen gene.
  • the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharides increase the expression of pS2 (Presenilin 2), PR (Progesteron Receptor) and CTSD (E2-mediated Cathepsin D) mRNA.
  • the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide oligosaccharide is PGC-1 ⁇ (Peroxisome proliferator one activated receptor gamma coact ivator 1 one a), ERR a (Estrogen-related receptor a), GATA3 ( Trans-acting T-cell-specific transcription factor) and FOXAK Forkhead box protein Al) increase the expression of mRNA.
  • PGC-1 ⁇ Peroxisome proliferator one activated receptor gamma coact ivator 1 one a
  • ERR a Estrogen-related receptor a
  • GATA3 Trans-acting T-cell-specific transcription factor
  • FOXAK Forkhead box protein Al FOXAK Forkhead box protein Al
  • the GATA3 and F0XA1 are important factors for breast cell differentiation, and serve to inhibit differentiation into cancer cells or malignant tumors.
  • composition of the present invention further comprises 17 ⁇ -estradiol (17
  • the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharides have a synergic effect with 17 ⁇ -estradiol (173-estradiol).
  • composition of the present invention may be prepared as a pharmaceutical composition for preventing or treating menopausal syndrome, a food composition or functional food composition for improving or preventing menopausal syndrome.
  • compositions for improving, preventing or treating obesity can be prepared as a pharmaceutical composition.
  • compositions for improving, preventing or treating diabetes can be prepared as a pharmaceutical composition.
  • probiotics for promoting enteric beneficial bacteria can be prepared as a pharmaceutical composition.
  • the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the above-described non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides of the present invention; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharides described above.
  • the pharmaceutical composition comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the preparation, lactose, textose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxy benzozoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Including, but not limited to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and preferably applied by oral administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention will vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity of the patient. It may be prescribed. Typical dosages of the pharmaceutical compositions of the invention are in the range of 0.001 / g / kg-100 nig / kg on an adult basis.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oil or aqueous media, or may be in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or accelerators, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the term "comprising as an active ingredient” is meant to include an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the above-mentioned non-reducing terminal, unsaturated manneuronic oligosaccharides.
  • the upper limit of the amount of the above-described non-reducing terminally unsaturated manneuronic acid oligosaccharide contained in the composition of the present invention can be carried out by those skilled in the art within an appropriate range.
  • compositions for improving, preventing or treating obesity can be prepared as a food composition.
  • a composition comprising an active ingredient is prepared in the food composition, as the active ingredient hitting the unsaturated type mannyu acid of the non-reducing end as well as a sugar, typically in the manufacture of Food " Ingredients, such as proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavorings.
  • Examples of the above carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides, for example dextrin, cyclotextin and the like, and xylitol, sorbitol, erythritol.
  • As the flavoring agent natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the food composition of the present invention is prepared with a drink
  • in addition to the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide of the present invention citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, two-layer extract, jujube extract, licorice extract And the like can be further included.
  • composition of the present invention can be prepared as a functional food composition containing an active ingredient of the non-reducing terminal unsaturated unsaturated neuronic oligosaccharide of the present invention.
  • the composition of the present invention contains ingredients that are commonly added in food preparation, and include, for example, protein carbohydrates, fats, nutrients and seasonings.
  • ingredients that are commonly added in food preparation include, for example, protein carbohydrates, fats, nutrients and seasonings.
  • flavoring agents or natural carbohydrates may be included as additional ingredients.
  • natural carbohydrates include monosaccharides (eg, glucose, fructose, etc.); Disaccharides (eg maltose, sucrose and the like); oligosaccharide ; Polysaccharides (for example, dextrin, cyclodextrin, etc.); And sugar alcohols (e.g., Xili, Sorbi, Eritlet Dung).
  • sweetening agents natural flavoring agents (e.g., taumarin, stevia extract, etc.) and synthetic flavoring agents (e.g., saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharide of the present invention is an active ingredient of the conventionally known physiological activity of alginic acid, and exhibits anti-obesity, anti-diabetic, menopausal syndrome improvement and control of intestinal microflora. This effect is remarkably superior to the non-reducing terminal-type saturated manneuronic oligosaccharides, which indicates that the double bonds and unsaturated forms of the terminal sugars present in the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharides are important factors. .
  • the present invention provides a non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharide, a pharmaceutical composition for improving, preventing or treating obesity, diabetes and menopausal syndrome, and probiotics for promoting enteric beneficial bacteria, which include the same as an active ingredient.
  • the present invention provides a non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharide which is an active substance of alginic acid to provide its excellent anti-obesity, anti-diabetic, estrogen activity and intestinal microbial flora control effect.
  • FIG. 1 shows thin-film chromatography of non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides.
  • Figure 2 shows the results of mass spectrometry of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides and the non-reducing terminal saturated manneuronic oligosaccharides.
  • FIG. 3 shows a non-reducing end of unsaturated Mannuroi c olid sugar (USMOS) and a non-reducing end of saturated Mannuroi c ol id oligosaccharide.
  • SMOS igosaccharide
  • Figure 4 is a circular light of the sugar composition of the non-reducing terminal unsaturated unsaturated neuronic sugar (USM0S) and the non-reducing terminal saturated saturating manneuronic oligosaccharide (SM0S) The results confirmed by the dichroic spectroscopy (CD, ci rcul ar di chor i sm) method are shown.
  • USM0S non-reducing terminal unsaturated unsaturated neuronic sugar
  • S0S non-reducing terminal saturated saturating manneuronic oligosaccharide
  • 5A and 5B show the results of fat accumulation inhibition by the treatment of non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharides (USM0S) and the effect of inhibiting the expression of obesity-related genes, aP2, C / EBP ⁇ and PPAR y using real-time PCR. Indicates.
  • Figures 6a to 6c shows the results of the promotion of glucose uptake according to the non-reducing endless unsaturated manurenic acid oligosaccharide (USM0S) treatment and the expression amount of related proteins, p-PAK, P-Akt and p—AS160.
  • USM0S non-reducing endless unsaturated manurenic acid oligosaccharide
  • FIGS. 7A and 7B show the results of intestinal flora of obesity-induced rats following intraperitoneal administration of non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide (USM0S).
  • Figure 8 shows the results of PC Kpr inc ipal coordi nate analysis of the intestinal microbial flora of elderly mice following the ingestion of non-reducing endless unsaturated manurenic acid oligosaccharide (USM0S).
  • Figure 9 shows the results of comparative analysis of the intestinal flora of the aged mice according to the non-reducing endless unsaturated manneulic acid oligosaccharide (USM0S) drinking intake in the phylum.
  • FIG. 10a and 10b show the mRNA expression levels of pS2, PR and CTSD following non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharide (USM0S) treatment.
  • FIG. 11 shows the mRNA expression levels of PGC- ⁇ , ERR a, GATA3 and F0XA1 following treatment with non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides (USM0S).
  • Figure 12 shows the mechanism of action of the non-reducing endless unsaturated manneuronic oligosaccharide (USM0S).
  • Figure 13 shows the various bioactive effects of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides (USM0S).
  • poly-mannuronate poly-mannuronate
  • HC1 100 m £ together with 1 g of sodium alginate (Wako, Osaka Japan) was heated at 100 ° C. for 2 hours.
  • the separated precipitate was dissolved in distilled water by centrifugation with 500 g of heated sodium alginate-HC1 solution for 5 minutes.
  • NaCl was added so that the precipitate dissolved in distilled water became 0.1 M, and then the pH was adjusted to 2.8-3.0 to separate the supernatant and the precipitate by centrifugation for 500 g ⁇ 5 minutes.
  • the precipitate and supernatant were separated and dried after alcohol precipitation to prepare the supernatant portion as poly M and the precipitate portion as poly G and used as a substrate for the preparation of manneuronic oligosaccharides using alginate degrading enzymes (Haug, A et al. study of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis.Ac t a Chem i ca Scand i nav i ca, 1966, 20 (1): 183-190. and Joo, DS et al .Preparation of oligosaccharides from alginic acid by enzymic hydrolysis. Korean Society of Food Science and Technology, 1996, 28 (1): 146-151).
  • a P MAL-c2x expression vector was expressed in February 2009 using a manoronic acid-degradable gene selected from an abdominal intestinal DNA metagenome library of abalone in Yeosu, Korea. After recombination in the clone, the cloned strain BL2KDE3) was used to produce a genetically transformed strain (Republic of Korea Patent Registration 10-1277706).
  • the precipitated cells were suspended in 10 mM phosphate buffer at pH 7.0 and then subjected to sonication to decompose the cell membrane and centrifugation at 9, 000 g for 15 minutes to separate the coenzyme. Was carried out.
  • the supernatant separated after centrifugation was used as coenzyme, polymanneuronic acid (poly- mannuronate (poly M)) was dissolved in 1 L of 10 mM phosphate buffer at pH 7.0 at 0.3% concentration and AgD03 was added at a final concentration of 1 mM.
  • Substrate digestion was performed for 48 hours at 45 ° C using a 2.5 L fermenter (KBT KB-250, Japan).
  • the resultant was filtered through an ultrafiltration membrane system (VivaFlow 50, Sartorius, Ag, Germany) to obtain an oligosaccharide mixture having a molecular weight of 3,000 Da or less, and freeze-dried to prepare an unsaturated manneuronic oligosaccharide of non-reducing end.
  • an ultrafiltration membrane system VivaFlow 50, Sartorius, Ag, Germany
  • Example 2 Composition and structural characterization of non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides
  • a non-reducing terminal-unsaturated manneuronic oligosaccharide mixture obtained after degradation of polymanneuronic acid using Aly 11 alginic acid degrading enzyme was prepared using an ultrafiltration membrane system (VivaFlow 50, Sartorius) with a molecular weight of 3000 Da or less. Fractions were obtained.
  • the prepared samples were purified using an ion exchange resin column (Hi trap DEAE Sepharose FF, GE Healthcare) and then lyophilized. The purified non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides were dissolved in water and then injected into the UPLC / MS system for constitutive sugar analysis.
  • Ultra Performance Liquid Chromatography setup was performed using an ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 1.0X100 mm, Waters) column and solvent A [15 mM Amy 1 amine for 12 minutes at 0.4 m £ / min. And 25 mM HFIP (Hexaf ioroisopropanol)] and solvent B (15 mM The linear gradient of Amyl amin and 25 mM HFIP in Acetoni trle) was adjusted. The eluate separated by C18-UPLC was analyzed by mass spectrometry (Quadrupole-Time of Flight, Q-TOF, Waters).
  • Q-TOF was analyzed in ESI negative mode, with capillary and sampling cone voltages of 3 kV and 40 V, desolvat ion flow rate 600 L / h, temperature 300 ° C, Source temperature was carried out at 120 ° C conditions.
  • TOF MS data were analyzed with a scan time of 0.5 seconds m / z 100-1300.
  • 2 ng / dl of leucine enkephal in (554.2619 Da in ESI negative mode) was used as the lock spray.
  • the mass spectrometric analysis of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides of the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide oligosaccharides are composed of 1 to 7 sugars, in particular the reported manneuronic oligosaccharide mass value As fewer than 18 peaks were observed, the water molecules were removed to form a non-reducing end of the unsaturated manneuronic oligosaccharide, resulting in a non-reducing end of Saturated Mannuroni c Acid Ol igosacchar ide. ; SM0S) prevails.
  • the results showing the ratio of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides (USM0S) and the non-reducing terminal saturated saturating manneuronic oligosaccharides (SM0S) are shown in FIG.
  • the unsaturated manuronic acid oligosaccharide of the non-reducing terminal has an average of two times more than the non-reducing terminal of the unsaturated manneuronic oligosaccharide than the non-reducing terminal of the saturated manuronic acid oligosaccharide.
  • the molecular weights of the saturated manneuronic oligosaccharides of the non-reducing terminal are as follows.
  • Dichroic dichroism using a circular dichroism spectroscopy (CD, J-715 spec tropol ar i meter, JASC0) to measure the ratio of manneuronic acid of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides Sex spectroscopic signals were measured.
  • the CD signal was measured in the 190-250 nra region using a cuvette of 1 cm at room temperature, the unsaturated manneuronic oligosaccharide of the non-reducing terminal was used at a concentration of 1 nig / to obtain a consistent CD signal.
  • 3T3-L1 adipocytes were cultured in DMEM medium to reach confluency with 0.5 mM IBMX (isobutylmethylxanthine, IBMX), 1 mM dexamethasone and 1 g / mi insulin (above MDI). After treatment for 2 days, differentiation was induced into adipocytes for 7 days by replacing at 48 hour intervals with DMEM + serum medium containing 1 g / m insulin. The non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides were treated with 0.2 mg / mi concentration when the medium was replaced. After 7 days, oil red 0 staining and RNA extraction were performed to suppress the fat accumulation and differentiation of adipocytes. The results are shown in FIG. 5.
  • the triglycerides were stained with an oil red 0 pigment, and the cells were observed with an optical microscope.
  • the non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides were treated with 0.2 mg / i of adipocytes compared to the control.
  • Oil red 0 staining strength is significantly weakened.
  • the pigment was extracted and quantified from triglycerides stained with oil red 0.
  • USM0S which formed a double bond at the non-reducing end, inhibited the accumulation of triglycerides by about 40% compared to the control group. Fat accumulation inhibitory effect compared to the control By inhibiting only 15%, double bond formation was found to be an important factor in the anti-obesity effect.
  • 3T3-L1 adipocytes were differentiated into adipocytes in the same manner to treat non-reducing unsaturated manneuronic oligosaccharides at a concentration of 0.2 mg / ml, followed by extraction of RA according to the GeneJET RNA Purification Kit method.
  • Differentiation-related genes C / EBPa (CAAT enhancer binding protein ⁇ ) and PPAR y (Peroxisome prol if erator-act ivated receptor) ⁇ expression inhibition results are shown in FIG.
  • L6 myocytes are cultured in DMEM medium containing 10% serum and then replaced with 2% serum medium to fully differentiate L6 cells.
  • Completely differentiated L6 muscle cell medium was serum-free with DMEM medium and treated with non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides at 0.2 mg / ml for 1 hour. The treated medium was removed and washed twice with pre-warmed 37 ° C. KRH-Ringer Hepes buffer to remove glucose present in the medium. [3H] -2-deoxyglucose was treated with 0.04 mM for 15 minutes, and then KRH buffer containing [3H] -2-deoxyglucose was quickly removed and ice-cold PBS was added. The reaction was stopped by doing so. Cell lysis was performed using a cell lysis buffer, and then radioactivity was measured using a scintillation counter to confirm the effect of increasing glucose transport capacity following alginate oligosaccharide treatment.
  • Older rats were purchased at 1 month old and 17 month old male C57BL / 6J from Korea Basic Science Institute.
  • the breeding environment is 20 ° C 2 ° C, relative humidity is 50 ⁇ 10%, and the contrast cycle is adjusted to 12 hours per day.
  • the experiment was conducted for a week, and the experimental group supplied 0.2 mg / kg of non-reducing terminally unsaturated manneuronic acid ligosaccharide to the water to be supplied. After completion of the experiment, collect the internal contents of the experimental animal, take 200 mg, and use pure DNA using the Fast DNA TM SPIN Kit for Soil kit.
  • the obesity rat intestinal flora administered non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharide, Roseburia sp. An anti-obesity indicator strain belonging to Gram-positive bacteria (Firmicutes). And Lactobacillus sp. Were increased by about 4% and 2%, respectively, compared to the control group (obesity-induced rat, high fat diet, HFD), and Clostridium sp belonging to Gram-negative bacteria (Bacteroidetes). . And Ruminococcus sp. It was confirmed that the strain was reduced by about 1% each.
  • the elderly rats that ingested non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides through PC0 analysis were similar to the intestinal flora of 1 month old rats and different from the intestinal flora of 17 month old rats. It was confirmed that there is. In addition, it was confirmed that the intestinal flora was similar to that of the one-month-old intake of the non-reducing endless unsaturated manneuronic acid oligosaccharide.
  • the 1713-estradiol used in this study was purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA) and used in DMEM / F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium / F12), fetal bovine serum, Opt i -MEM medium and penicillin-streptomycin were purchased from Gibco (NY, USA).
  • PBS for WelGENECDaegu, Korea
  • cell counting kit for Dojindo Molecular Technologies (Tokyo, Japan)
  • bovine insulin for Cell Applications (San Diego, USA), FuGENE HD for PromegaCMadison , WI, USA).
  • MCF-7 cells were cultured at 37 ° C in DMEM / F12 medium containing 10% fetal bovine serum, penicillin-straptomycin (100 ⁇ ] / ml) and 1% bovine insulin to measure estrogen sensitizer activity ERE (estrogen response element)-luciferase activity and pS2, PR, CTSD, PGC-1 ⁇ , ERR, GATA3 and F0X01 expression was confirmed.
  • ERE estrogen response element
  • non-reducing terminal unsaturated manneuronic acid Oligosaccharide treatment increases the expression of peroxisome protein ferment-act ivated receptor c coact ivator-la (PGC-1 ⁇ ) and the transcription partner ERR ⁇ (estrogen related receptor ⁇ ), and acts in conjunction with the ERa pathway to bind GATA3 (GATA binding).
  • POC-1 ⁇ peroxisome protein ferment-act ivated receptor c coact ivator-la
  • ERR ⁇ estrogen related receptor ⁇
  • GATA3 GATA binding
  • F0X01 forkhead box protein Al
  • FIG. 12 The overall schematic of the anti-obesity, anti-diabetic and estrogen sensitivity enhancement mechanisms of the non-reducing terminal unsaturated manneuronic oligosaccharides is shown in FIG. 12.
  • the AMPK activation was carried out when the non-reducing terminal monounsaturated oligosaccharide treatment was performed.
  • Non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides increase mRNA expression of GATA3 and FOX via the ERa (estrogen receptor a) pathway and increase expression of ERR a and PGC-1 ci when treated with estrogen as an estrogen sensitizer.
  • the non-reducing terminal-type unsaturated manneuronic oligosaccharides were confirmed to have an estrogen sensitizer by activating ERE by the ERa pathway depending on PGC-la.
  • the non-reducing terminally unsaturated manneuronic oligosaccharides improve the intestinal flora in the body to increase anti-obesity indicator strains (Roseburia sp., Lactobacillus sp.) And reduce the obesity indicator strain (Clostridium sp. Ruminococcus sp.) It has been shown to have complex anti-obesity, anti-diabetic, intestinal flora improvement and estrogen sensitivity.

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Abstract

본 발명은 폴리만뉴론산(poly-mannuronate) 기질로 하여 알긴산 라이아제(alginate lyase)에 의해 분해된 분자량 100-3000 Da 이하의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당에 관한 것으로, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 및 이를 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨 및 갱년기 증후군의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스를 제공한다. 본 발명에 의하면, 본 발명의 항비만, 항당뇨, 에스트로겐 활성 및 장내 미생물 균총 조절 효과는 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당의 만뉴론산 올리고당과 비교하여 현저히 우수하다.

Description

[명세서】
【발명의 명칭】
비환원성 말단의 불포화형 만뉴른산 올리고당 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물
【기술 분야】
본 특허출원은 2015년 03월 27일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2015—0043404 호， 2016년 02월 02일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0014477 호， 대한민국 특허출원 제 10-2016-0014484 호 및 대한민국 특허출원 제 10—2016-0014492 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 및 이를 유효성분으로 포함하는조성물에 관한 것이다.
【배경 기술】
현대사회에는 비만 (2014년 기준， 0ECD 성인 18%가 비만) 및 당뇨 (2011년 기준， 6.9 ¾>가 당뇨병)에 의해 나타나는 복합적 대사증후군 (metabol i c syndrome)이 증가됨에 따라 기능성 식품 시장이 확대되고 있다.
대사증후군은 비만과 인슐린 저항성에 의해 발생되는 제 2형 당뇨병과 다양한 여러 대사이상이 복합적으로 발생하는 증후군을 지칭하는 말이다. 대사증후군은 인구의 고령화와 고열량의 식이습관 등에 의하여 급증함에 따라 사회적인 비용이 많이 요구됨으로서 근본적인 원인 예방 및 의약품 또는 식품 소재 개발이 시급한 실정이다.
인간의 장내 생태계는 출생과 동시에 미생물이 서식하기 시작하여 유익균과 유해균이 균형을 유지하며 장내 미생물 균총을 형성하고 인간과 공생하며 상호작용을 통해 인간의 건강에 직 ᅳ간접으로 영향을 미친다. 최근 미국 국립보건원 (NIH)은 '인간 미생물 군집 프로젝트' 를 통해 장내 미생물 균총과 질병과의 관계를 연구하여 미생물 균총의 블균형이 염증성 장질환 등의 발병에 중요한 원인을 제공함에 따라 장내 미생물 균총의 정상화의 중요성을 대두시켰다ᅳ1，2
2006년 과학저널 '네이처 ' 에 발표된 비만과 장내 세균의 연관성 논문에 따르면 마른 사람과 비만인 사람 사이 장내 세균 분포가 다르며, 쥐를 이용한 실험을 통해 비만 쥐에서는 퍼미테쿠스 (Fi rmi cutes)에 속하는 세균이 박테로이데트 (Bacteroidetes)에 속하는 세균보다 상대적으로 높은 구성비율을 보임을 확인하였다， 3 이 후 장내 미생물과 인체에 대한 연구가 다양한 영역에서 진행되고 있으며， 장내 미생물 균총 개선을 통한 비만 억제 및 질환 치료 등을 위하여 장내 미생물 균총 개선제 개발이 필요하다. 해양생물은 지구상 생물종의 약 80%에 해당하는 약 50만 종의 생물이 서식하고 있는 것으로 추정되나， 이 가운데 유용생물자원으로 개발되고 있는 것이 1% 미만으로 개발 잠재력이 매우 높다. 해조류 유래 기능성 소재로서 대표적인 해조 다당류 알긴산 (algini c acid)은 다시마, 미역등과 같은 갈조류에 15-35% 함유되어 있으며， β -D-만뉴론산 ( β -D-mannuronic acid ; M)과 a— L-글루론산 ( α -L-guluroni c acid; G)의 2종류의 우론산 (uroni c acid)이 각종 비율로 1 , 4 글리코시드 (glycoside) 결합을 한 폴리우로나이드 (polyuronide)의 특징을 갖는다. 알긴산 유래 올리고당은 구성당에 따라 만뉴론산 올리고당 (M0S , mannuro— ol igosacchar ide)과 글루론산 올리고당 (GOS , guluro-ol igosacchar ide) 및 만뉴론산 글루론산 흔합 올리고당 (AOS , alginate ol igosacchar ide)으로 나눌 수 있으며 또한 당 말단의 이중결합에 따라 구분할수 있다.
해양 유래 다당류는 오래전부터 인간생활에 이용되어 왔으며， 세계적으로 해양생물 유래의 항암， 항산화， 항고혈압 및 항균물질 등의 생리활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 전세계적으로 생산되는 알긴산 원조 생산량은 약 10만 톤으로 이중 3OT 가량이 식품첨가물로 이용되고 있으나 이를 고부가 의약품 원료로 개발 할 경우 그 가치를 배가 시킬 수 있다. 알긴산 유래 올리고당의 경우 구조적인 특정에 따라 고등식물의 뿌리 성장촉진, 비피도박테리움 에스피 (Bi f idobacter ium sp . ) 성장촉진, 항염증， 항산화, 항균 작용 등의 생물학적 활성이 보고되는 등 가시적인 연구 성과가 이루어짐에 따라 웅용분야가폭넓게 확산되고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. [발명의 내용]
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 알긴산 올리고당을 소재로 하는 의약품 및 식품으로의 이용을 증진시키고자 노력하였다. 그 결과， 항비만， 항당뇨, 장내 미생물 균총 개선 및 에스트로겐 효능과 같은 다양한 생리활성을 갖는 알긴산 유래 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 제공하는 데 있다 .
본 발명의 다른 목적은 비만 개선， 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 당뇨 개선， 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 갱년기 증후군 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다. . 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 폴리만뉴론산 (po ly- mannuronate) 기질로 하여 알긴산 라이아제 (al inate lyase)에 의해 분해된 분자량 100-3000 Da 이하의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 제공한다.
본 발명자들은 알긴산 올리고당을 소재로 하는 의약품 및 식품으로의 이용을 증진시키고자 노력하였다. 그 결과， 항비만， 항당뇨， 장내 미생물 균총 개선 및 에스트로겐 효능과 같은 다양한 생리활성을 갖는 알긴산 유래 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산올리고당을 규명하였다 .
본 명세서에서 용어 "비환원성" 은 올리고당의 구조에 있어서, 아노메단당류의 헤미아세탈 (C-1과 C-5 사이의 고리 형성)， 헤미케탈 (C-2와 C-5 사이의 고리 형성)을 생성하는 고리화 반웅에서 한 탄소에 붙은 수소원자와 수산화기의 위치가 바뀐 부분입체 이성질체가 생기는 현상) 탄소를 갖지 못한 성질을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "불포화형" 은 수소원자를 갖는 탄소사슬 (carbon chain)이 불포화된 형태를 의미하고， "포화형" 은 수소원자를 갖는 탄소사슬이 포화된 형태를 의미한다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 아노머 탄소를 갖지 못하고 수소원자의 탄소사슬이 불포화된 형태의 모든 만뉴론산 올리고당을 의미한다.
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 다음의 일 예 (3개의 당이 결합된 만뉴론산 올리고당)의 구조식 1올 갖는다:
[구조식 1]
Figure imgf000005_0001
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1 당인 경우에 175， 2 당인 경우에 351， 3 당인 경우에 527 , 4 당인 경우에 704， 5 당인 경우에 880， 6 당인 경우에 1056 , 7 당인 경우에 1232의 Z-평균 분자량 (m/z)을 갖는다 (도 2) .
또한， 본 명세성서 용어 "비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당" 은 폴리만뉴론산을 산 가수분해하여 얻은 포화형 만뉴론산 올리고당을 의미한다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 폴리만뉴론산 (po ly— mannuronate) 기질로 하여 알긴산 라이아제 (alginate lyase)에 의해 분해되어 제조된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알긴산 라이아제는 폴리굴루론산 (polygukironate) 및 폴리만뉴론산 (polymannuronate)로 구성된 알긴산 (alginate)를 분해하여 저분자화 하는 효소를 의미한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면， 상기 알긴산 라이아제는 전복 장내 균주 유래의 AlyDWll (대한민국 등록특허 10- 1277706)이다.
본 발명의 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 윷리고당은 하나 이상의 당으로 구성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1개 내지 10개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 1개 내지 9개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면， 1개 내지 8개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따른면， 1개 내지 7개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함한다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당과 비교하여 물 분자가 제거되어 물 분자의 질량값인 18 정도의 작은 질량값을 갖는다 (도 2) .
본 발명의 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 만뉴론산 및 글루론산으로 이루어져 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 만뉴론산:글루론산의 비율은 1.2-5.0 : 1이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 1.2-4.5 : 1이다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면， 1.8-4.0 : 1이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면， 2.0-3.0 : 1이다. 즉， 본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 만뉴론산을 글루론산보다 1.2-5.0， 1.2-4.5， 1.8-4.0 또는 2.0-3.0배 우세하게 포함한다 (도 4) . 본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 개선， 예방 또는 치료용 조성물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비만" 은 건강에 이상을 초래할 정도로 지방 조직이 체내에 과잉으로 축적된 상태를 의미한다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 지방 축적을 억제한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 중성지방의 축적에 대하여 20-60%, 25-50% 또는 30- 40% 저해하고, 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 을리고당은 10-30%， 10- 25% 또는 10-30% 저해한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당과 비교하여 중성지방의 축적을 2배 이상 저해한다.
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 을리고당은 비만을 유도하는 장내 미생물 균총을 조절한다.
본 명세서에서， 용어 "장내 미생물 균총 (intestinal microflora 또는 gut microflora)" 은 구성하는 동물의 소화관에서 생장하는 미생물 군락집단 (complex community)을 의미한다. 장내 미생물 균총을 구성하는 개개의 미생물은 물질생산 또는 분해능에 의해 숙주에게 피해 또는 이익을 주기도 하는데 장내 균총 전체적으로 볼 때는 비타민 공급, 감염방지 및 장 기능 (연동운동 및 흡수)을 돕는데 관여하고 있고 이로 인해 균총의 조성은 변비， 장 관련 질환 발생 등과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다 (Mistuoka T. Bifidobacteria Microflora, 1(1)： 3, 1982) .
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 장내 미생물 균주의 생장을 감소시켜 장내 미생물 균총을 조절한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 장내 미생물 균주는 로즈버리아 ^ Roseburia sp.) 및 락토바실러스 ^{Lactobacillus 로 구성된 군으로부터 선택되는 균주이다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 비만을 유도하는 지방-분화와 관련된 유전자의 발현을 억제한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 aP2(adipocyte protein 2) , C/EBP α (CAAT enhancer binding protein a ) 및 PPAR γ (Peroxi some Prol i ferator-Act ivated Receptor γ )의 발현을 억제한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 aP2 , C/EBP α 및 PPAR γ의 발현을 각각 15-35%, 50- 70% 및 30-50% 억제한다. 이러한 효과는 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당과 비교하여 1.5 내지 7.0배 우수하다.
본 발명의 비만 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 또다른 양태에 따르면， 본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 당뇨 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "당뇨" 는 포도당-비관용 ( intolerance)을 초래하는 인슐린의 상대적 또는 절대적 부족으로 특징되는 만성질환을 의미한다. 용어 당뇨는 모든 종류의 당뇨병을 포함하며， 예를 들어， 제 1형 당뇨， 제 2형 당뇨 및 유전성 당뇨를 포함한다. 제 1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨병으로서, β -세포의 파괴에 의해 주로 초래된다. 제 2형 당뇨는 인슐린 비의존성 당뇨병으로서， 식사 후 불층분한 인슐린 분비에 의해 초래되거나 또는 인슐린 내성에 의해 초래된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 글루코오스 (glucose)의'흡수 (uptake)를 촉진한다. 본 발명의 이러한 효과는 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당에서는 나타나지 않는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당만의 효과이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 AMPK(AMP-act ivated Proein Ki nase) 경로를 매개하여 당 흡수를 촉진한다.
본 발명의 당뇨 개선， 예방 또는 치료용 조성물은 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물， 당뇨 개선 또는 예방용 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에 따르면 , 본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스를 제공한다.
본 발명의 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스는 장내 유익균의 생장을 증진시킨다.
본 발명의 일 구현예에서， 상기 장내 유익균은 로즈버리아 종 Roseburia sp. ) 및 락토바실러스 종 LactobacH lus sp. ) S— 구성된 군으로부터 선택되는 장내 유익균이다.
본 명세서의 용어 "프로바이오틱스" 는 숙주 유기체에 의 건강에 도움을 주는 생균의 식품 보조물을 의미한다. 본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 발효유 제품으로 제조될 수도 있으나 과립, 분말 등의 형태로 제조될 수도 있다.
본 발명의 프로바이오틱스 조성물의 투여방법은 특별히 한정되지 않지만 환제 정제 등으로 제조하여 경구 투여할 수도 있고， 분말형 또는 과립형으로 제조하여 음식물에 첨가하여 투여할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 예를 들면, 의약품으로서 사용하는 경우의 제형은 각 성분의 분말을 제제화하지 않고 그 자체로 사용할 수 있지만， 산제, 과립제， 세립제， 정제， 당의정제， 캡슐제， 정제， 장용 피복제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 희석제로서는 일반의 의약품제제에 사용되는 부형제, 결합제， 붕괴제 등이 사용되고, 이외에 착색제， 안정화제， 보존제， 윤활제 등을 첨가할 수 있다. 본 발명의 음식용 조성물을 식품으로서 사용하는 경우는 이대로 각 성분의 분말을 제제화하지 않고 사용할 수 있지만， 다른 식물섬유， 올리고당， 곡물류， 비타민류 등을 첨가하거나， 또는 향미료， 착색제， 교미제 등을 첨가하여， 섭취하기에 적합한 형태로 형성 가공하는 것도 가능하다. 또한， 식품 첨가물로서， 다른 식품에 첨가 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스는 약제학적 조성물, 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다ᅳ 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 비환원성 말단의 블포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 갱년기 증후군 개선， 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "갱년기 증후군 " 은 여성 내분비 증후군와 일종으로 자연적 손실이든， 외과적 수술에 의한 손실이든 또는 화학적으로 유도된 손실이든 관계없이 난소 기능의 전반적이고 점진적인 감소가 일어나 생리적 기능 및 성기능이 감소 내지 소실되는 과도기를 말하며， 갱년기의 한 과정으로 난소 기능의 정지 후에 일어나는 생리의 영구적인 정지인 폐경이 오게 된다. 폐경기에는 에스트로겐 생성의 감소, 난포자극호르 및 황체화호르몬의 상승 등 호르몬의 변화에 따라 급만성 증상이 나타날 수 있다. 즉， 초기증상으로 열성흥조， 야간 발한 등의 혈관 운동성 증상과 불안감， 집중력 감퇴, 우을증 등의 심리적 증상이 나타날 수 있으며, 폐경 수년 내에 나타나는 비뇨생식계 및 표피증상이， 폐경 수년 후에는 골다공증, 심장혈관 및 뇌혈관등의 질환등이 있을수 있다.
상기 갱년기 증후군은 안면흥조， 발한, 심장 불편감， 수면 문제, 우울증， 과민성， 불안감， 신체적 피로 정신적 피로, 성적 문제， 배뇨 문제， 질 건조감, 관절 불편감 및 근육 불편감으로 구성된 군으로부터 선택되는 증후군을 포함한다.
본 발명의 비환원성 말단의 블포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 조성물은 에스트로겐의 활성을 증가시킨다 .
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 에스트로겐을 리간드로 작용하는 에스트로겐 수용체 경로 및 에스트로겐 비의존적으로 작용하는 에스트로겐 관련 수용체 알파 경로를 경유하여 에스트로겐 반응 요소 (estrogen response element ; ERE)-매개 하부 유전자의 발현을 통해 에스트로겐을 활성화시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 에스트로겐 수용체 α를 경유하여 ERE의 발현을 유도한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 에스트로겐 관련 수용체 알파를 발현시켜 ERE의 발현을 유도한다. 상기 ERE의 발현으로 인해 하부 에스트로겐 유전자의 발현을 통해 에스트로겐의 활성이 증가된다.
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 pS2(Presenilin 2)， PR(Progesteron Receptor) 및 CTSD(E2-mediated Cathepsin D) mRNA의 발현을 증가시킨다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 PGC-1 α (Peroxisome proliferator一 activated receptor gamma coact ivator 1一 a )， ERR a (Estrogen-related receptor a), GATA3(Trans~act ing T-cell-specif ic Transcription Factor) 및 FOXAKForkhead box protein Al) mRNA의 발현을 증가시킨다.
상기 GATA3 및 F0XA1는 유방 세포 분화에 중요한 인자이며， 암세포나 악성 종양으로의 분화를 억제하는 역할을 한다.
본 발명의 조성물은 17β-에스트라디올 (17|3-estradiol)을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 17β-에스트라디올 (173-estradiol)과 동반상승효과 (synergic effect)를 나타낸다.
본 발명의 조성물은 갱년기 증후군 예방 또는 치료용 약제학적 조성물， 갱년기 증후군 개선 또는 예방용 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 (a) 비만 개선， 예방 또는 치료용 조성물; (b) 당뇨 개선, 예방 또는 치료용 조성물; (c) 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스; 및 (d) 갱년기 증후군 개선， 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다 .
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스， 텍스트로스, 수크로스, 솔비를， 만니를, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘， 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀를로스, 폴리비닐피롤리돈， 셀를로스, 물, 시럽, 메틸 셀를로스， 메틸히드록시밴조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington 's Pharmaceutical Sciences ( 19th ed . , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령, 체중, 성， 병적 상태， 음식, 투여 시간, 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001 / g/kg - 100 nig/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제， 산제， 분말제， 과립제， 정제 또는 갑셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "유효성분으로 포함하는" 이란 상술한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 상술한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 ( a) 비만 개선， 예방 또는 치료용 조성물; (b) 당뇨 개선， 예방 또는 치료용 조성물; (C) 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스; 및 (d) 갱년기 증후군 개선， 예방 또는 치료용 조성물은 식품 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분 포함하는 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우， 유효성분으로서 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 을리고당 뿐 만 아니라， 식품 '제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며 , 예를 들어， 단백질, 탄수화물， 지방， 영양소， 조미제 및 향미제를 포함한다 . 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드， 예를 들어， 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스， 올리고당 등; 및 폴리사카라이드， 예를 들어 덱스트린， 사이클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리틀， 소르비를, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A , 글리시르히진 등] ) 및 합성 향미제 (사카린， 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대， 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 이외에 구연산， 액상과당, 설탕， 포도당, 초산, 사과산, 과즙， 두층 추출액， 대추 추출액， 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분 포함하는 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며， 예를 들어， 단백질 탄수화물， 지방， 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대， 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어ᅳ 천연 탄수화물은 모노사카라이드 (예컨대， 글루코오스, 프력토오스 등) ; 디사카라이드 (예컨대， 말토스 , 수크로오스 등) ; 올리고당 ; 폴리사카라이드 (예컨대， 덱스트린， 시클로덱스트린 등) ; 및 당알코올 (예컨대， 자일리를， 소르비를， 에리쓰리틀 둥)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제 (예컨대， 타우마린， 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제 (예컨대， 사카린， 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 본 발명의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 종래에 알려진 알긴산의 생리활성의 활성성분으로서 , 항비만， 항당뇨， 갱년기 증후군 개선 및 장내 미생물 균총의 조절 효과를 나타낸다. 이러한 효과는 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당과 비교하여 현저히 우수한 효과이며， 이에 상기 효과를 나타내는데 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당에서 나타나는 말단당의 이중결합 및 이의 불포화 형태가 중요한 요소임을 의미한다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당， 이를 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨 및 갱년기 증후군의 개선， 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스를 제공한다.
( b) 본 발명은 알긴산의 활성물질인 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 제조하여 이의 우수한 항비만, 항당뇨, 에스트로겐 활성 및 장내 미생물 균총 조절 효과를 제공한다.
(c) 이러한 효과는 종래의 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당의 형태를 나타내는 만뉴론산 올리고당과 비교하여 현저히 우수하다.
【도면의 간단한설명】
도 1은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 박막크로마토그래피 결과를 나타낸다.
도 2는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 및 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당의 질량분석 결과를 나타낸다.
도 3은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 (Non-reducing end of unsaturated Mannuroi c Acid Ol igosacchar ide; USMOS) 및 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당 (Non-reducing end of saturated Mannuroi c Ac i d Ol igosacchar ide ; SMOS)의 이중결합 비율을 나타낸다.
도 4는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 을리고당 (USM0S) 및 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당 (SM0S)의 당 구성을 원평광 이색성 분광 측정법 (CD, c i rcul ar di chor i sm) 방법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 (USM0S) 처리에 의한 지방축적 저해 결과 및 실 -시간 PCR올 이용한 비만 -관련 유전자， aP2 , C/EBP α 및 PPAR y의 발현 억제 효과를 나타낸다 .
도 6a 내지 6c는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴른산 올리고당 (USM0S) 처리에 따른 당흡수 촉진 결과 및 관련 단백질， p-PAK , P- Akt 및 p— AS160의 발현양을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 (USM0S) 복강투여에 따른 비만유도 랫트의 장내 균총 분석 결과를 나타낸다.
도 8는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴른산 올리고당 (USM0S)의 음용섭취에 따른 노령쥐의 장내 미생물 균총을 PC Kpr inc ipal coordi nate) 분석 결과를 나타낸다.
도 9은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴른산 올리고당 (USM0S) 음용섭취에 따른 노령쥐의 장내 균총 변화를 문 (phylum)에서 비교 분석한 결과를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 (USM0S) 처리에 따른 pS2 , PR 및 CTSD의 mRNA 발현양을 나타낸다. 도 11은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 (USM0S) 처리에 따른 PGC-Ι α , ERR a， GATA3 및 F0XA1의 mRNA 발현양을 나타낸다 .
도 12는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 (USM0S)의 작용기전을 나타낸다.
도 13은 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 (USM0S)의 다양한 생리활성 효과를 나타낸다.
【발명을 실시하기 위한구체적인 내용】
이하， 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 1: 알긴산올리고당의 제조
폴리만뉴론산 (poly-mannuronate; poly M)을 제조하기 위하여 알긴산 나트륨 1 g(Wako, Osaka Japan)과 함께 0.3 M HC1 100 m£을 넣고 100°C에서 2시간 동안 가열하였다. 가열된 알긴산 나트륨 -HC1용액올 500 g로 5 분 동안 원심 분리하여 분리된 침전물을 증류수에 용해시켰다. 증류수에 용해시킨 침전물이 0.1 M이 되도록 NaCl을 첨가한 후， pH를 2.8-3.0으로 조절하여 500 gᅳ 5분 동안 원심 분리로 상징액과 침전물을 분리하였다. 분리된 침전물과 상징액은 알코올 침전 후 건조하여 상징액 부분을 poly M으로， 침전물 부분을 poly G로 제조하여 알긴산 분해 효소를 활용한 만뉴론산 올리고당 제조를 위한 기질로 사용하였다 (Haug, A et al . A study of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis. Ac t aChem i caScand i nav i ca , 1966, 20(1)： 183-190. 및 Joo, D. S. et al . Preparation of oligosaccharides from alginic acid by enzymic hydrolysis . Korean Society of Food Science and Technology, 1996, 28(1)： 146-151) .
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 제조하기 위하여 2009년 2월 대한민국 여수 근해에서 서식하는 전복의 장내 DNA 메타지놈 라이브러리에서 선별된 만뉴론산 분해능이 우수한 0RF11에 해당되는 유전자를 PMAL-c2x 발현 백터에 재조합한 후 BL2KDE3) 균주에 클로닝을 실시하여 제작된 유전자 형질 전환 균주를 이용하였다 (대한민국 등록특허 10-1277706) .
40 L의 앰피실린 (ampicillin, 100 βg/ t)ύ} 첨가된 Luria- Bertani(LB)에 500 ιι 의 상기 유전자 형질 전환 균주를 접종하여 37°C에서 배양하고, 600 nm에서 흡광도가 0.4-0.5가 되었을 때， 배양액의 I PTG ( I s o r opy 1 - β -D- 1 h i oga 1 ac t opy r ano s i de ) 최종 농도가 0.3 mM이 되도톡 첨가한 후 12시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 15분 동안 9,000 g에서 원심 분리하여 세포를 침전시켰다. 침전된 세포를 pH 7.0의 10 mM 인산 완층액 (phosphate buffer)으로 부유 시킨 후세포막을 분해하기 위하여 초음파 분해 (sonication)를 실시하고 조효소를 분리해내기 위해 15분 동안 9， 000 g에서 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후 분리된 상층액을 조효소로 사용하였으며, 기질로서 폴리만뉴론산 (poly- mannuronate(poly M))을 0.3% 농도로 pH 7.0의 10 mM 인산 완충액 1L에 녹인 후 최종 농도가 1 mM이 되도톡 AgN03을 첨가하였다. 2.5 L 발효기 (KBT KB-250, Japan)를 이용하여 45°C에서 48시간 동안 기질 분해 반응을 진행하였다. 반웅 후 분자량 3,000 Da이하의 올리고당 흔합물을 얻기 위해 한외 여과막 시스템 (VivaFlow 50, Sartorius, Ag, Germany)으로 여과하여 이를 동결 건조 한 후 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 제조하였다.
올리고당의 생산 여부를 확인하기 위하여 박막크로마토그래피 (thin- layer chromatography)을 실시하였으며, 방법은 다음과 같다. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 0.1 / i 농도로 물에 용해 후, 실리카겔 플레이트 (Merck KGaA, Germany)에 3 f 스파팅을 실시하였다. 전개용매 (1-부탄올 ： 포름산 ： 물 = 4 ： 6 ： 1)을 이용하여 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 을리고당 크기별로 분리 후 황산을 가한 발색시약 (아니스알데하이드 0.5 m^, 아세트산 10 MeOH 85 mi, H2S04 5 을사용하여 올리고당의 존재를 확인하였다. 실시예 2: 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 구성 및 구조적 특징 분석
본 실험예에서는 Aly 11 알긴산 분해효소를 이용하여 폴리만뉴론산을 분해 후 확보된 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 흔합물을 한외여과막 시스템 (VivaFlow 50, Sartorius)을 이용하여 분자량 3000 Da 이하의 분획물을 확보하였다. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 구성당을 분석하기 위하여， 준비된 시료를 이온 교환 수지 컬럼 (Hi trap DEAE Sepharose FF, GE Healthcare)을 이용하여 정제한 후 동결건조 시켰다. 정제된 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 물에 용해 후 UPLC/MS 시스템에 주입함으로써 구성당 분석을 수행하였다.
초고성능 액체 크로마토그래피 (Ultra Performance Liquid Chromatography; UPLC, Waters) 설정은 ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 1.0X100 mm, Waters) 컬럼을 이용하였으며 0.4 m£/분에서 12분 동안 용매 A[15 mM Amy 1 amine 및 25 mM HFIP(Hexaf ioroisopropanol)]와 용매 B(15 mM Amyl amin 및 25 mM HFIP in Acetoni tr i le)의 선형 구배를 조절하였다. C18- UPLC로 분리되어 나온 용리액을 질량분석기 (Quadrupole-Time of Fl ight , Q- TOF, Waters)로 분석하였다. Q-TOF는 ESI 네거티브 모드에서 분석하였으며, 캐필러리 및 샘플링콘 (sampl ing cone)의 전압은 각각 3 kV 및 40 V， 탈용매 (desolvat ion)는 유속 600 L/h, 온도 300°C， 소스 온도는 120°C 조건에서 실시하였다. TOF MS 데이터는 스캔시간은 0.5 초 m/z 100-1300 범위에서 분석하였다. 분석의 정확도를 위해 모든 분석에 2 ng/ ᅳ의 류신 엔케팔린 ( leucine enkephal in, ESI 네거티브 모드에서 554.2619 Da)을 락스프레이 ( lock spray)로 사용하였다.
도 2에서 알 수 있듯이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 질량분석 결과 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1개 내지 7개의 당으로 구성되어 있으며， 특히 기 보고된 만뉴론산 올리고당 질량값 보다 18이 적은 피크들이 관찰됨에 따라 물 분자가 제거되어 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당이 형성되어 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 을리고당 (non-reducing end of Saturated Mannuroni c Acid Ol igosacchar ide ; SM0S)보다 우세하게 존재함을 알 수 있었다.
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 (USM0S)과 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당 (SM0S)의 비율을 나타낸 결과는 도 3에 제시되었다. 도 3과 같이 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당 보다 평균 2배 이상의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 단당들이 존재함을 확인하였다. 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당 분자량은 다음과 같다. 1당 (m/z 193)，당 (m/z 369)， 3당 (m/z 545) , 4당 (m/z 722)， 5당 (m/z 898) 6당 (m/z 1074)， 7당 (m/z 1250) .
상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 만뉴론산 비율을 측정하기 위하여 원평광 이색성 분광법 (Ci rcul ar Di chroi sm; CD, J- 715 spec tropol ar i meter , JASC0)을 이용하여 원평광 이색성 분광 신호를 측정하였다. 상기 CD 신호는 상온에서 1 cm의 큐벳을 이용하여 190-250 nra 영역에서 측정하였으며， 일관성 있는 CD 시그널을 얻기 위하여 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1 nig/ 농도로 사용하였다. 만뉴론산:글루론산 구성비를 알아보기 위하여 정점 (peak, 200 ran 흡광도 값)， 저점 (trough, 215 nm 흡광도 값)을 측정하여 만뉴른산과 글루론산의 비율을 계산하였으며， 계산식은 다음과 같다: (1) peak/ trough < 1， mannuroni c acid/guluronic acid =
2.0 (peak/ trough)
(2) peak/ trough > 1 , mannuroni c acid/guluronic acid = 27(peak/trough) + 40 도 4에서 알 수 있듯이， 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 을리고당은 만뉴론산 /글루론산 비율이 2.12(peak=6.66, trough=6.42)임을 확인하였다. 실시예 3: 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당에 의한 지방세포의 지방축적 억제
3T3-L1 지방전구세포를 DMEM 배지에 배양하여 컨플루언시 (conf luency)에 이르면 0.5 mM IBMX(isobutylmethylxanthine, IBMX), 1 mM 덱사메사손 (dexamethasone) 및 1 g/mi 인슐린 (이상 MDI)으로 2일 동안 처리 후 1 g/m 인슐린이 포함된 DMEM+혈청 배지로 48시간 간격으로 교체하여 7일 동안 지방세포로 분화를 유도하였다. 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 배지교체 시 0.2 mg/mi 농도로 함께 처리하였으며， 7일 후 지방세포의 지방 축적 및 분화 억제 정도를 오일 레드 0 염색 (Oil red 0 stain) 및 RNA추출을 하여 관찰하여 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 제시한 바와 같이， 중성지방을 오일 레드 0 색소로 염색한 후 광학현미경으로 세포를 관찰한 결과 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 0.2 mg/i 농도로 처리 시 대조구 대비 지방세포의 오일 레드 0 염색강도가 현저히 약화되었다. 나아가 오일 레드 0로 염색된 중성지방에서 색소를 추출하여 정량한 결과 비환원성 말단에 이중결합을 형성한 USM0S가 대조구 대비 중성지방 축적을 약 40 % 억제하였으며， 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당의 경우 지방축적 저해 효과가 대조구 대비 약 15% 정도만 저해함에 따라 이중결합 형성이 항비만 효과에 중요한 요소임을 확인하였다.
3T3-L1 지방전구세포를 동일한 방법으로 지방세포로 분화시켜 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 0.2 mg/ml 농도로 처리 후 GeneJET RNA 정제 키트 방법에 따라 R A 추출 후 지방 분화 지표인 aP2, 지방 분화 관련 유전자 C/EBPa(CAAT enhancer binding protein α ) 및 PPAR y (Peroxisome prol i f erator-act ivated receptor) γ 발현억제 결과를 도 4에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 처리시 대조구 대비 발현양이 aP2, C/EBP α 및 PPARy는 각각 25¾>, 60% 및 40% 억제됨을 확인하였다. 또한 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당 대비 항비만 효과가 우수함을 확인하였다. 실시예 4: 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산올리고당 당흡수 조절 확인
L6 근육세포를 10% 혈청이 함유된 DMEM 배지에 배양 후 2% 혈청 배지로 교체하며 L6 세포를 완전히 분화시킨다. 완전히 분화시킨 L6 근육 세포의 배지를 무혈청 DMEM 배지로 H환하여 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 0.2 mg/ml, 수준으로 1 시간동안 처리 후， 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당이 처리된 배지를 제거하고 미리 가온한 37 °C KRH 완충액 (Krebs-Ringer Hepes buffer)로 2회 세척하여 배지 내에 존재하는 포도당을 제거하였다. [3H]-2-데옥시글루코오스 ([3H]-2- deoxyglucose)를 0.04 mM 농도로 15분 처리한 후 [3H]-2- 데옥시글루코오스를 포함한 KRH 완충액을 신속히 제거하고 빙냉한 PBS를 가함으로써 반응을 정지시켰다. 세포 용해 완층액 (Cell lysis buffer)를 이용하여 세포를 파쇄한 후 섬광계수기 (scintillation counter)로 방사능성 (radioactivity)를 측정하여 알긴산 올리고당 처리에 따른 포도당 수송능 증가 효과를 확인하였다.
도 6에 제시한 바와 같이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 처리 시 양성대조구인 인슐린 (0.2 μΜ)과 비교하여 유사한 세포 내 당 흡수가 촉진됨올 확인하였다. 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당을 0.2 g/η 농도로 처리 시 당흡수가 일어나지 않음에 따라 당흡수 촉진에 비환원성 말단의 이중결합의 형성이 중요함을 확인하였으며， 당 흡수에 중요 단백질인 AMPK(AMP-activated protein kinase)의 억제제인 C.C( Compound C, 1 yM)와 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 동시 처리 시 당흡수가 억제됨에 따라 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당이 AMPK 경로를 통하여 당흡수를 촉진함을 확인하였다.
도 6에 제시한 바와 같이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 처리 시 당흡수 촉진과 관련한 수송체 발현에 영향을 주는 PAK, Akt 및 AS160의 인산화 증가를 알아보고자 농도별로 근육세포에 처리하여 단백질을 추출 후 웨스턴 블럿 방법을 통하여 확인한 결과 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. 따라서 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 을리고당은 당흡수 촉진을 위하여 AMPK 경로 및 PAK, Akt, AS160의 인산화를 촉진하여 당수송체 (GLUT4, glucose transporter 4)의 발현에도 영향을 줄 것으로 예상하였다. 실시예 5: 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 장내 균총 조절 효능 확인
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 장내 균총 개선 효능을 확인하기 위하여 비만 동물 모델인 랫트와 노령 동물 모델인 마우스를 이용하였다. 비만을 유도한 랫트는 생후 3주령의 수¾ SD 랫트를 ί주)중앙동물에서 구입하여 3일 동안 적응시킨 후 사육환경은 온도 20土 2°C, 상대습도는 50士 10¾>이며 명암주기는 1일 12시간으로 조절하여 10주 동안 고지방식이를 유도하여 실험군에는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 0.25 mg/kg 농도로 48시간 주기로 복강 투여를 실시하며 실험을 진행하였다. 노령 쥐는 생후 1개월령 및 17개월령 수컷 C57BL/6J을 한국기초과학지원연구원에서 구입하여 사육환경은 온도 20士 2°C, 상대습도는 50±10%이며 명암주기는 1일 12시간으로 조절하여 10주 동안 실험을 실시하였으며 실험군은 공급하는 물에 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 을리고당을 0.2 mg/kg 농도로 공급하였다. 실험 종료 후 실험동물의 내장 내용물을 수집 후 200 mg을 취하여 Fast DNA™SPIN Kit for Soil kit를 이용하여 DNA를 kit에 제시된 방법을 토대로 순수한 DNA를 확보하고， 추출한 DNA의 농도와 순도를 확인하기 위해서 나노드롭 (nanodrop)을 활용하여 측정한 후， 아가로스겔 전기영동을 통해 추출된 DNA 밴드 결과를 토대로 DNA 농도와 순도를 확인하였다. 분리된 DNA 내 세균의 16S rRNA 유전자 증폭을 위하여 세균에 특이적으로 결합하는 VI- V3 과가변영역 (hypervariable region)을 포함하는 27F 정방향 프라이머 (GAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 518R 역방향 프라이머 (WTTACCGCGGCTGCTGG)를 이용하여 94°C에서 5분 동안 초기 변성 (denaturation) 시키고， 94 °C에서 30초， 55°C에서 45초， 72°C에서 1분 30초로 30회 반복하여 증폭 PCR을 수행 후 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen, Germany)를 통해 정제한 PCR 산물은 GS Junior Titanium system (Roche, Germany) 염기서열분석기를 이용하여 파이로시퀀싱 (pyrosequencing)을 진행하였으며 파이로시퀀싱에 필요한 방법과 반웅들은 제조회사 (Roche)의 매뉴얼에 따라 (주)천연구소 (Chunlab, Korea)에서 수행하였다.
도 7에 제시한 바와 같이， 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 투여한 비만 랫트 장내 균총의 경우 그람양성세균 (Firmicutes)에 속하는 항비만 지표균주인 Roseburia sp. 및 Lactobacillus sp.가 대조군 (비만 유도 랫트， 고지방식이, high fat diet; HFD) 대비 각각 약 4% 및 2% 증가 하여 균총의 변화가 일어났으며, 또한 그람음성세균 (Bacteroidetes)에 속하는 Clostridium sp. 및 Ruminococcus sp. 균주가 각각 약 1%씩 감소됨을 확인하였다.4,5
도 8에 제시한 바와 같이， PC0 분석을 통해 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 음용섭취한 노령쥐의 경우 1개월령의 쥐의 장내 균총과 유사하며 17개월령의 쥐의 장내 균총과는 차이가 있음을 확인하였다. 또한 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 섭취 1개월령과 유사한 장내 균총을 형성함을 확인하였다.
도 9에 제시한 바와 같이, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 음용섭취한 17개월령 노령쥐의 경우 대조구 (17개월령 마우스) 대비 그람음성세균 (Bacteroidetes)가 약 22% 증가하며， 상대적으로 그람양성세균 (Firmicutes) 균이 22% 감소하여 1개월령 쥐의 장내 균총과 유사하게 변화하였음올 확인하였다. 실시예 6: 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 에스트로겐 증감제 기능 확인
본 연구에서 사용된 1713-estradiol은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며ᅳ DMEM/F12(Dulbecco' s modified Eagle' s medium/F12), 우태아혈청 (Fetal bovine serum) , Opt i -MEM 배지 및 페니실린 -스트렙토마이신은 Gibco (NY, USA)에서 구입하였다. PBS는 WelGENECDaegu, Korea), 세포 계수 키트 (CCK-8)는 Dojindo Molecular Technologies (Tokyo , Japan) , R easy 소형 키트는 QIAGENCHiden, Germany) 소 인슐린은 Cell Applications (San Diego, USA), FuGENE HD는 PromegaCMadison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다.
MCF-7 세포는 10%의 우태아혈청, 페니실린-스트랩토마이신 (100 \]/ml) 및 1% 소 인슐린이 포함된 DMEM/F12 배지에서 37°C 온도에 배양하여 에스트로겐 증감제 활성을 측정하고자 ERE( estrogen response element )- 루시퍼레이즈 활성 및 pS2, PR, CTSD, PGC-1 α , ERR, GATA3 및 F0X01 발현양을 확인하였다.
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 0.1 mg/m£ 농도로 48시간 처리 후 ERE-루시퍼레이즈 활성을 확인하고자 pEGFP— C1-ER α， 3Χ ERE TATA luc 및 pRL-SV40을 FuGENE HD 시약을 이용하여 MCF-7 세포에 트랜스펙션 (transfection) 후 용해하여 루시퍼레이즈 분석을 실시하였으며 , GeneJET RNA 정제 키트 방법에 따라 RNA 추출 후 pS2, PR, CTSD, PGC-1 α-, ERR, GATA3 및 F0X01의 발현양을 실—시간 PCR로 확인하였다.
도 10에 제시한 바와 같이， 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 처리시 비환원성 말단의 포화형 만뉴론산 올리고당과 다르게 에스트로겐 시그널 하부 유전자인 pS2의 발현이 대조구 대비 약 5배 증가하였으며, 또한 에스트로겐 (E2, 1713-estradiol)과 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 병행 처리 시 에스트로겐 수용체 a (ERa . estrogen receptor a )에 의한 ERE 루시퍼레이즈 활성 및 pS2, PR의 발현이 증가하고, CTSD의 발현을 감소시켜 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 을리고당이 선택적으로 에스트로겐 수용체 a 하부 시그널의 유전자의 발현을 조절함을 확인하였다.
도 11에 제시한 바와 같이， 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 처리 시 PGC-1 α (peroxisome prol i ferator-act ivated receptor c coact ivator-la) 및 전사 파트너인 ERR α (estrogen related receptor α)의 발현을 증가시켜， ERa 경로와 함께 작용하여 GATA3(GATA binding protein 3)와 F0X01 (forkhead box protein Al)의 mRNA 발현을 증가시킴으로서 에스트로겐 증감제 효능을 갖는 것을 확인하였다. 실시예 7: 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 항비만, 항당뇨 및 에스트로겐 감수성 증대 기전 모식도
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당의 항비만, 항당뇨 및 에스트로겐 감수성 증진기전에 대한 전체적인 모식도를 도 12에 제시하였다. 도 12에 제시한 바와 같이， 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 처리에 따른 항비만， 항당뇨 및 에스트로겐 감수성 증대 기전을 종합한 결과, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당 처리시 AMPK 활성화를 통해 PGC-la의 발현이 증가 되고, PGC-l i의 전사 파트너인 ERRs( estrogen related receptor α , β , γ )를 활성화 시켜 지방산 β 산화를 촉진시킴으로서 항비만 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한 근육 내 ΑΜΡΚ는 지방산의 합성과 분해를 매개함으로서 지방산 β 산화 대사를 촉진하는 작용 및 PGC-1발현을 통해 미토콘드리아 관련 유전자들의 발현을 증가시키는 것으로 보고됨에 따라, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 ΑΜΡΚ 활성화를 통해 또한 PCG-la 발현을 증가시켜， 미토콘드리아의 유전자의 발현 및 수의 증가를 통해 인슐린 저항성을 개선하는 효능을 갖는 것으로 기대되었다.
비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 에스트로겐 증감제로서 에스트로겐과 함께 처리시 ERa (estrogen receptor a) 경로를 통해 GATA3 및 FOX이의 mRNA 발현을 증가시키고， ERR a 및 PGC-1 ci의 발현을 증가시킴에 따라， 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 PGC-la에 의존하는 ERa 경로에 의해 ERE를 활성화 시켜 에스트로겐 증감제의 기능을 갖는 것으로 확인하였다.
또한, 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 체내에서 장내 균총을 개선하여 항비만 지표 균주 (Roseburia sp. , Lactobacillus sp.)를 증가시키고 비만 지표균주 (Clostridium sp. Ruminococcus sp.)를 감소시켜 복합적인 항비만， 항당뇨， 장내 균총 개선 및 에스트로겐 감수성 증대 효능을 갖는 것으로 확인하였다.
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Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
폴리만뉴론산 (poly-mannuronate)을 기질로 하여 알긴산 라이아제 (alginate lyase)에 의해 분해된 분자량 100-3000 Da 이하의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 1 개 내지 10 개의 만뉴론산 또는 글루론산을 포함하는 것을 특징으로 하는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 만뉴론산:글루론산의 비율이 1.2-5.0:1 인 것을 특징으로 하는 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당.
【청구항 4】
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 비만 개선， 예방 또는 치료용 조성물.
【청구항 5】
제 4 항에 있어서， 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 장내 미생물 균주의 생장을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6]
제 5 항에 있어서, 상기 장내 미생물 균주는 로즈버리아 종 (Roseburia sp.) 및 락토바실러스 종 (Lactobaci 1 lus sp.)로 구성된 군으로부터 선택되는 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 7】
제 4 항에 있어서， 상기 비만 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물， 비만 개선 또는 예방용 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8】
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 당뇨 개선， 예방 또는 치료용조성물.
【청구항 9】
제 8 항에 있어서， 상기 비환원성 말단의 블포화형 만뉴론산 올리고당은 글루코오스 (glucose)의 흡수 (uptake)를 촉진함을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10】
제 8 항에 있어서， 상기 당뇨 개선， 예방 또는 치료용 조성물은 당뇨 예방 또는 치료용 약제학적 조성물， 당뇨 개선 또는 예방용 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 11]
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당을 유효성분으로 포함하는 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스.
【청구항 12】
제 9 항에 있어서， 상기 장내 유익균은 로즈버리아 종 (Rosebur i a sp . ) 및 락토바실러스 종 (Lactobaci l lus sp . )로 구성된 군으로부터 선택되는 장내 유익균인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스.
【청구항 13】 제 11 항에 있어서， 상기 장내 유익균 증진용 프로바이오틱스는 약제학적 조성물, 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스.
【청구항 14】
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 을리고당을 유효성분으로 포함하는 갱년기 증후군 개선， 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 15】
제 14 항에 있어서， 상기 조성물은 17β-에스트라디올 (17β- estradiol)을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 16】
제 11 항에 있어서, 상기 비환원성 말단의 불포화형 만뉴론산 올리고당은 17β-에스트라디올 (17p-estradiol)과 동반상승효과 (synergic effect)를 나타내는 것을 특징으로 하는조성물.
【청구항 17】
제 14 항에 있어서， 상기 갱년기 증후군 개선， 예방 또는 치료용 조성물은 갱년기 증후군 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 갱년기 증후군 개선 또는 예방용 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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