WO2016156648A1 - Producto biocida extraido de material vegetal de lavandula luiseri, procedimiento de obtención y uso del mismo - Google Patents

Producto biocida extraido de material vegetal de lavandula luiseri, procedimiento de obtención y uso del mismo Download PDF

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Azucena Gonzalez Coloma
Carmen Elisa Diaz Hernandez
Mª FE ANDRES YEVES
Luis Fernando JULIO TORRES
Alejandro Fernandez Barrero
Mª del Mar HERRADOR DEL PINO
Jesús BURILLO ALQUÉZAR
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Centro De Investigacion Y Tecnologia Agroalimentaria De Aragon
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Granada
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Centro De Investigacion Y Tecnologia Agroalimentaria De Aragon
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Granada
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
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    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom

Definitions

  • the invention is within the field of agriculture, and more specifically, in the field of biocides comprising compounds extracted from plants.
  • An extraction product with biocidal activity is proposed that is isolated from plant material of plants of the Lavandulaizisieri species and characterized by comprising a new compound of formula (I).
  • the invention also has to do with the method of obtaining said extraction product and with its use for the control of biotic factors harmful to a crop, either directly or through a biocidal composition comprising it.
  • Lavandula Luisieri Riv.-Mart. (Rivas-Mart ⁇ nez. Lazaroa 1979, 1, 110) is a small aromatic bush endemic to the Iberian Peninsula and common in the semi-arid regions of southern Portugal and southwest of Spain (Delgado et al. Plant Genet. Resour. 2010, 8, 82-90). It belongs to the Stoechas Ging section. from the Lamiaceae family (Rozeira. Linn. Brot. 1949, 28, 1-84) which includes Lavandula stoechas L, Lavandula pedunculata (Mili.) Cav. and Lavandula viridis L'ella. (Upson and Andrews.
  • the present invention relates in a first aspect to a plant material extraction product of the Lavandula vaseiri species with biocidal activity, characterized in that it comprises the compound of formula (I):
  • the extraction product may comprise at least one other compound that is chosen from the following:
  • the extraction product is selected from a hexane extract (Hx), an essential oil (EO), a hydrolate (WRO), or an organic fraction (EO0) and a hydrolate (WRI) obtained from the hydrolate (WRO).
  • Hx hexane extract
  • EO essential oil
  • WRO hydrolate
  • EO0 organic fraction
  • WRI hydrolate
  • the extraction product is the compound of general formula (I) itself.
  • the invention relates to the method of obtaining the extraction product comprising a step of extracting Lavandula vaseri plant material with at least one solvent until obtaining an extraction product comprising the compound of formula (I) or an isomer, or a salt or solvate thereof.
  • the process for obtaining the extraction product uses flowers and / or leaves as a plant material and at least one solvent is selected from an aqueous solvent or an organic solvent.
  • the method of obtaining comprises an additional step of isolating the compound of formula (I) from the extraction product of the previous stage.
  • the invention relates to a biocidal composition comprising the extraction product.
  • the invention relates to the use of the biocidal composition, the extraction product or at least one of the compounds of formula (II), (III), (IV), (V), (VII) and (IX) or an isomer, or a salt or solvate thereof, either in isolation or in combination, against at least one biotic factor that affects plant development.
  • the at least one biotic factor that affects the development of plants is selected from nematodes that are preferably root nodule forming nematodes and more preferably belong to the Meloidogine javanica and weed species belonging to the genus Lolium and more preferably they belong to the species Lolium perennial.
  • compound (I) and compound (10) refer to the same compound as they do compound (II) and compound (1); compound (III) and compound (2); compound (IV) and compound (3); compound (V) and compound (3a); compound (VI) and compound (4); compound (VII) and compound (5); compound (VIII) and compound (6); compound (IX) and compound (1 1); and compound (X) and compound (12).
  • the technical problem that the present invention solves is the search for new natural active ingredients with a high biocidal activity that are extracted from plant material and that can be used for the control of biotic factors that affect crops, and that constitute, an effective and environmentally friendly alternative to conventional biocidal products of chemical synthesis.
  • the present invention has its origin in an extraction product comprising the chemical compound of formula (I), which is extracted from plant material of plants of the Lavandulaizisieri species (see examples 1 to 4) and which shows an important activity phytocidal against Lactuca sativa and Lolium perennial and an important nematicidal activity against Meloidogyne javanica (see examples 5 and 6).
  • an extraction product of the invention characterized by comprising a compound of formula (I) and constituting the first aspect of this invention
  • extraction product any fraction, either liquid or solid, obtained directly after subjecting the plant material of Liziseri to an extraction using a suitable solvent, provided that it comprises at least the compound of formula (I).
  • extraction product any successive fraction obtained from the fraction directly obtained from Luciseri plant material, using subsequent fractionations, extractions or insulations and at least one suitable solvent, is also considered as extraction product, provided that said product comprises at least to the compound of formula (I).
  • the extraction product of the invention may comprise at least one other compound,
  • the term “extraction product” may refer to one or more fractions, or even the compound of formula (I), depending on the context.
  • the extraction product of the invention is selected from a hexane extract obtained after a hexane extraction from plant material of L.uciseri; an essential oil that is obtained after hydro-distillation with Clevenger apparatus or steam entrainment from L.iziseri plant material; a hydrolate obtained after hydrodestilation with Clevenger apparatus or steam entrainment from L.
  • the extraction product of the invention is selected from the hexane extract (Hx), the essential oil (EO), the hydrolate (WRO), the organic fraction (OE0), the hydrolate (WRI) or the fraction organic (OEI) (see Examples 1 to 4 and Figure 1).
  • the extraction product is the compound of formula (I) that is obtained after the application of chromatographic techniques, on any extraction product of the invention, such as (Hx), (EO) , (OE0), (OEI), (WRO) or (WRI).
  • Both the compound of formula (I) and the rest of the compounds that are included in the scope of the invention are isolated or extracted by methods perfectly known in the state of the art, such as, for example, liquid vacuum chromatography ( VLC), column chromatography (CC) using different solid phases (Silica Gel, Sephadex LH-20) and high performance liquid chromatography (HPLC), eluting with different polarity gradients using different combinations of organic solvents.
  • VLC liquid vacuum chromatography
  • CC column chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • all the compounds included in the scope of the invention can include isomers, depending on the presence of multiple bonds, including optical isomers or enantiomers, depending on the presence of chiral centers.
  • the individual isomers, enantiomers or diastereoisomers and mixtures thereof fall within the scope of the present invention, that is, the term isomer also refers to any mixture of isomers, such as diastereomers, racemic, etc., even to its optically active isomers or mixtures in different proportions thereof.
  • the individual enantiomers or diastereoisomers, as well as mixtures thereof, can be separated by conventional techniques.
  • the compounds included in the scope of the invention may be in crystalline form as free compounds or as solvates. Solvation methods are generally known within the art.
  • the invention in a second aspect, relates to a method of obtaining the extraction product, the invention, hereinafter method of obtaining the invention, which comprises a step of extracting Lavandula vaseri plant material with at least one solvent until obtaining a extraction product.
  • the process of the invention can use any plant material of Lavandulaiziseri comprising the compound of formula (I), preferably it is material belonging to the aerial part, and more preferably they are flowers and / or leaves.
  • the solvents that are used in the extraction step of the process of the invention can be any of those that are usually used in the state of the art to obtain volatile compounds, preferably they are organic and aqueous solvents.
  • organic solvents examples include dichloromethane, terbutyl ether, ethanol and hexane.
  • water is used as a solvent and as a method of extraction by steam or hydro-distillation with Clevenger apparatus.
  • an organic solvent is used, preferably hexane and Soxhlet extraction is preferred as the extraction method.
  • the extraction process of the invention is selected from a steam entrainment to obtain as an extraction product a hydrolate and / or an essential oil; a hydro-distillate with Clevenger apparatus to obtain as an extraction product a hydrolate and / or an essential oil; a hexane extraction to obtain as an extraction product a hexane extract; an extraction with dichloromethane from a hydrolate to obtain an organic fraction and / or a new hydrolate; and elution with methanol of the above hydrolate to give a new organic extract (see examples 1 to 4).
  • the process of the invention comprises an additional step for isolating the compound of formula (I) from the extraction product of the first stage of the process using chromatographic techniques.
  • the process of the invention obtains the compound of formula (I) when chromatographic techniques are applied on an extraction product, which is selected from (Hx), (EO), (OEO), (OEI), (WRO) and (WRI) (see Examples 1 to 4 and Figure 1).
  • Biocidal activity means the ability to control, through different mechanisms of action, at least one biotic factor, and preferably more than one, that is considered detrimental to the development of a crop. Said control comprises the prevention of the action or the direct destruction of said damaging factor.
  • biotic factor that affect the development of plants and that are included in the present invention are, but are not limited to, nematodes and weeds.
  • the nematodes included in the scope of this invention are root nodule forming nematodes (Meloidogyne sp).
  • An example of nodule-forming nematodes is the Meloidogine javanica, polyphagous species, with the capacity to parasitize more than 3,000 species of crop plants, including extensive, horticultural and fruit crops, seriously affecting production (Agrios. Plant Pathology, Fifih edition, Elsevier / Academic, Amsterdam 2005), and causing annual economic losses of billions of euros (Singh et al. EPO / EPPO Bulletin 2013, 43 (2), 334-374). "Weed” means any plant species that grows wild and with considerable vigor in an area cultivated or controlled by humans.
  • the invention relates to an effective biocidal composition against at least one biotic factor, and preferably more than one, which is considered detrimental to the development of a crop, hereinafter referred to as the biocidal composition of the invention, which comprises the product of extraction of the invention, or at least one compound selected from compounds (II), (III), (IV), (V), (VII) and (IX) or an isomer, salt or solvate thereof, either in isolation or in combination, hereinafter the biocidal composition of the invention.
  • the biocidal composition of the invention which comprises the product of extraction of the invention, or at least one compound selected from compounds (II), (III), (IV), (V), (VII) and (IX) or an isomer, salt or solvate thereof, either in isolation or in combination, hereinafter the biocidal composition of the invention.
  • the biocidal composition of the invention comprises an extraction product that is selected from the hexane extract (Hx), the essential oil (EO), the hydrolate (WRO), the organic fraction (OE0), the hydrolate (WRI) , the organic fraction (OEI) or the compound of formula (I) and more preferably the extraction product (WRO).
  • the biocidal composition of the invention can additionally comprise various vehicles and agents that facilitate its conservation, handling and application.
  • phytosanitary products solid vehicles, liquid vehicles, gaseous vehicles, etc. are usually used, and, if necessary, surfactants and auxiliary agents for the formulation of phytosanitary compositions such as, for example, an additive for formulating forms such as emulsifiable concentrates, wettable powders, flowable liquids (eg, water suspension, water emulsion, etc.), powders, aerosols, ULV and the like.
  • surfactants and auxiliary agents for the formulation of phytosanitary compositions such as, for example, an additive for formulating forms such as emulsifiable concentrates, wettable powders, flowable liquids (eg, water suspension, water emulsion, etc.), powders, aerosols, ULV and the like.
  • solid carriers examples include fine powders or clay granules (eg kaolin clay, diatomaceous earth, synthetic hydrated silicon oxide, bentonite, Fubasami clay, acid clay, etc.), talc, ceramics and other inorganic minerals (eg, sericite, quartz, sulfur, active carbon, calcium carbonate, hydrated silica, etc.), commercial fertilizers (eg, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea, ammonium chloride, etc.) and the like.
  • clay granules eg kaolin clay, diatomaceous earth, synthetic hydrated silicon oxide, bentonite, Fubasami clay, acid clay, etc.
  • talc ceramics and other inorganic minerals
  • ceramics and other inorganic minerals eg, sericite, quartz, sulfur, active carbon, calcium carbonate, hydrated silica, etc.
  • commercial fertilizers eg, ammonium sulfate, ammonium phosphat
  • liquid carriers examples include water, alcohols (eg, methanol, ethanol, etc.), ketones (eg, acetone, methyl ethyl ketone, etc.), aromatic hydrocarbons (eg, benzene, toluene , xylene, ethylbenzene, methylnaphthalene, etc.), aliphatic hydrocarbons (eg hexane, cyclohexane, kerosene, gas oil, etc.), esters (eg, ethyl acetate, butyl acetate, etc.), nitriles (eg, acetonitrile, isobutyronitrile , etc.), ethers (eg, diisopropyl ether, dioxane etc.), acid amides (eg, ⁇ , ⁇ -dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, etc.), halogenated hydrocarbons
  • alcohols eg,
  • gaseous vehicle examples include spray agent, including flon gas, butane gas, LPG (liquid petroleum gas), dimethyl ether, carbon dioxide gas and the like.
  • spray agent including flon gas, butane gas, LPG (liquid petroleum gas), dimethyl ether, carbon dioxide gas and the like.
  • surfactant examples include alkyl sulfates, alkyl sulfonate salts, alkyl aryl sulfonates, alkyl aryl esters, polyoxyethylene compounds thereof, polyethylene glycol esters, polyhydric alcohol esters, derivatives of sugar alcohol and the like.
  • auxiliary agent for the formulation as fixing agent and dispersing agent examples include casein, gelatin, polysaccharides (eg, starch powder, gum arabic, cellulose derivative, alginic acid, etc.) , derivatives of lignin, bentonite, sugars, synthetic water-soluble polymers (eg, vinyl polyol, vinyl polypyrrolidone, acrylic polyacids, etc.) and the like.
  • stabilizers examples include PAP (isopropyl acid phosphate), BHT (2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol), BHA (mixture of 2-tert-butyl-4- methoxyphenol and 3-tert-butyl-4-methoxyphenol), vegetable oils, mineral oils, surfactants, fatty acids or esters thereof and the like.
  • the extraction product of the invention, the biocidal composition of the invention or the at least one of the compounds (II), (III), (IV), (V), (VII) and (IX) or an isomer, a salt or a solvate thereof, can be used in conjunction with at least one other ingredient additional asset
  • additional active ingredient are nematicides, insecticides, acaricides, fungicides, herbicides, plant growth regulators, synergists, fertilizers, soil conditioners and animal baits.
  • the invention relates to the use as a biocide, hereinafter use of the invention, for the control of at least one biotic factor, and preferably more than one, which affects the development of plants, of the extraction product of the invention, of the biocidal composition of the invention or of at least one of the compounds (II), (III), (IV), (V), (VII) and (IX) or an isomer, a salt or a solvate thereof, either in isolation or in combination.
  • a biocide hereinafter use of the invention, for the control of at least one biotic factor, and preferably more than one, which affects the development of plants, of the extraction product of the invention, of the biocidal composition of the invention or of at least one of the compounds (II), (III), (IV), (V), (VII) and (IX) or an isomer, a salt or a solvate thereof, either in isolation or in combination.
  • the biocidal activity against biotic factors can be determined by different types of bioassays (see examples 5 and 6). For example, in the case of nematodes, the percentage of infective juveniles (J2) dead at 72 hours after the application of the biocidal substance is used. In the case of weeds, the percentage of germination, root growth or growth of the aerial part is controlled after a seed germination test of 168 hours after application of the biocidal substance.
  • the biocidal activity of the extraction product is evidenced in its effect against a nematode, which is preferably a nodule-forming nematode of the roots and more preferably a nematode of the Meloidogine javanica species.
  • the nematode belongs to the Meloidogine javanica species
  • the extraction product is chosen from (WRO) and (WRI) and a 100% nematicidal activity is obtained.
  • the biodirected fractionation of (WRO) showed that the nematicidal agents were in the acidic aqueous fractions (WRI) or (WRII) that produced a high mortality of J2 up to 25% dilutions.
  • the lyophilization, neutralization or neutralization-lyophilization processes of (WRII) gave inactive extracts (WRIIL), (WRIIN) and (WRIINL) however the acidification of (WRIINL) gave an active extract suggesting that the active components regenerate when its salts are protonated.
  • the nematode belongs to the Meloidogine javanica species, the extraction product is the compound of formula (I) and a mortality of 87% is obtained.
  • the nematode belongs to the Meloidogine javanica species compound (IV) is used and a mortality of 59% is achieved.
  • the biocidal activity of the extraction product of the invention or of the compounds included in the scope of the invention is evident in the results against a weed that preferably belongs to the genus Lolium and which is more preferably the Lolium perennial species, when the extraction product is (WRO) or (WRI).
  • the weed is the perennial Lolium species
  • the extraction product is (WRO)
  • a reduction in seed germination is achieved after 168 hours of 100%.
  • the biocidal activity of the compounds included in the scope of the invention against weeds is especially evident against perennial Lolium for the compounds of general formula (I), (II), (III), (IV) and (VII) for parameters such as the reduction of the germination percentage, root growth or foliar growth, after 168 hours of germination of L. perennial seeds.
  • a synergistic effect of its mixture is produced, which is evident through the biocidal activity that is especially recorded. in an extraction product that is (EO) or (WRO).
  • the invention also relates to a method of controlling at least one biotic factor, and preferably more than one, which affects the correct development of a culture, which comprises the use of an effective dose of the biocidal composition of the invention, of the extraction product of the invention or of at least one of the compounds of general formula (II), (III), (IV), (V), (VII) and (IX) or an isomer, a salt or a solvate of them, either in isolation or in combination.
  • the at least one biotic factor against which the control method of the invention is effective is selected from nematodes and weeds.
  • the nematodes are root nodule-forming nematodes and even more preferably nematodes of the Meloidogine javanica species. Also preferably, weeds belong to the genus Lolium and more preferably the species Lolium perennial.
  • the "effective dose” may optionally increase or decrease depending on the type of formulation, the weather, the place and the method of application, the type of biotic factor that affects the plant and the degree of damage.
  • L.izisieri plants were grown on an experimental plot located in the Cari ⁇ ena Field Region, Aguaron (Zaragoza, Spain) and located at the following coordinates: latitude 41 ° 19 '13.33 "N; longitude 1 or 19'53.9"W; altitude 16 m.
  • the experimental design consisted of three random blocks with an area of 49.92 square meters each, with a separation of 2 meters between blocks. In each block 4 rows of 10 meters with 104 plants per line were established.
  • the planting frame was 1.20 x 0.40 m, which represented a useful area of 0.48 m 2 per plant.
  • the dried plant material obtained according to example 1 was subjected to the extraction procedures indicated below:
  • the hydrolate (WRO) obtained according to the extraction procedure (b) of Example 2 had 4.5 mg / ml of organic components and a pH 3.2.
  • DCM dichloromethane
  • 1000 ml of (WRO) were subjected to extraction (DCM, 800 ml x 3) obtaining 3.42 g (with a 34% yield) of an organic extract (OE0) and an aqueous residue (WRI) with 1.15 mg / ml of organic component and pH 3.1.
  • Essential oils (EO) and organic hydrolate extracts (OE0 and OEI) were analyzed by GC-MS using an Agilent 6890N gas chromatograph (Agilent Technologies, Palo Alto, California, USA) coupled to an Agilent 5973N mass detector - electron ionization, 70 eV- (Agilent Technologies, Palo Alto, California, USA) and equipped with capillary columns (Hewlett-Packard), specifically HP-1 id 25m x 0.2 mm (methyl silicone, 0.2 ⁇ film thickness) e Carbowax id 30 mx 0.25 mm (polyethylene glycol, 0.25 ⁇ film thickness).
  • the working conditions were: injector temperature 260 ° C; temperature of the transfer line connected to the mass spectrometer 280 ° C; column temperature 70 -190 ° C, 5 ° C min "1.
  • the mass spectrum The and retention data were used to identify different compounds by comparison with the standards or with values found in the Wiley Mass Spectral databases Datábase (2001) Quantitative data were obtained from the areas of ICT peaks without using response factors.
  • the analyzes were carried out by HPLC-MS on an HPLC LC-20AD apparatus coupled to an LCMS-2020 QP mass spectrometer using an electrospray ionization interface (ESI) and a Teknokroma column, Mediterranean Sea 18 (250 x 4.6 mm , 5 ⁇ particle size) with an ACE 3 C18 pre-column.
  • the compounds were eluted with methanol (MeOH): 0.1% acetic acid in milli-Q water with a 38: 100% gradient for 45 min, followed by 100% MeOH for 10 min and 100: 38% for 13 min, at a flow rate. 0.5 mL / min and 15 L / min nitrogen (drying gas for solvent evaporation).
  • Stock solutions of extracts (0.25 g / L), of compounds (1), (5), (8) and (9) isolated from PSP plant material and oleanolic acid (Sigma) (0.05 g / L ) were dissolved in MeOH for injection of samples (10 ⁇ ). All solvents used were HPLC-MS grade.
  • the NMR spectra ( 1 H and 13 C) were obtained with Varies Direct-Drive 500 ( 1 H 500 MHz / 13 C 125 MHz) spectrometers.
  • Varies Direct-Drive 500 1 H 500 MHz / 13 C 125 MHz
  • MS an Autospec-Q VG-Analytical (Fisons) mass spectrometer was used.
  • IR spectra a Mattson Model FTIR Satellite spectrometer was used.
  • the insoluble material was fractionated by chromatographic column on silica gel using mixtures of H: E: EtOAc increasing the polarity to obtain six fractions.
  • Fraction 6 (EtOAc, 154 mg) was methylated with TMSCHN 2 26 to obtain a crude product that was subjected to a chromatographic column on silica gel to obtain the methyl esters of ursolic acid (8a) (H: E, 50:50, 30 mg) and tormico (7a) (H: E, 20:80, 79 mg)
  • Ethanolic extract The fractionation of the ethanolic extract in a chromatographic column on silica gel using increasing mixtures in hexane polarity: f-butylmethylether (H: E) allowed to identify a mixture of polyphenols being the main compound rosmarinic acid (9) (H: E , 0: 100, 30 mg) (Kuhnt et al. Phytochemistry 1994, 36, 485-489.) Finally, a dry sample of the hydrolate (WRIINL) (110 mg) was chromatographed on a column of Si gel eluted with 100% AcOEt , thus obtaining the compound (11) (3 mg; 2.7%).
  • the Compound (1) Colorless syrup; [a] D -9.7 (c1, CH 2 CI 2 ). Its molecular formula was determined as Ci 0 H 16 O 2 by HRFABMS ([M + Na] + , m / z 191.1041). Its IR spectrum showed two absorption bands av max 3406 cm “1 and 1686 cm “ 1 due to the hydroxyl group and ketone ⁇ , ⁇ -unsaturated, respectively. The hydroxyl group corresponds to a primary alcohol deduced from the 1 H and 13 C NMR signals at ⁇ ⁇ 3.77 dd (5.7, 10.5) and 3.83 dd (8.9, 10.5), and 6 C 63.2, respectively.
  • the 1 H NMR spectrum (see Table 1) showed characteristic signals from four methyl groups ( ⁇ 1.94, 1.66, 1.25 and 1.02) and a methine group ( ⁇ 2.30 dd (5.7, 8.9)) coupled with oxygenated methylene.
  • the 13 C NMR spectrum (see Table 1) confirmed the presence of a double bond (6136.4 and 180.3) conjugated to a ketone group ( ⁇ 213.6) and also showed signals attributed to the presence of 4 methyl groups ( ⁇ 10.5, 14.5, 25.0 and 29.2), a methine group ( ⁇ 59.8), an oxygenated methylene ( ⁇ 63.2) and a quaternary carbon ( ⁇ 46.4).
  • These data are in accordance with a necrodane skeleton, such that the structure of compound (1) was assigned to 5- (hydroxymethyl) -2, 3,4,4-tetramethylcyclopent-2-enone.
  • the compound (1) was detected in the extraction products (EO), (OEO), (WRO) and (EtOH), while the compound (2) was found in (EO), (WRO), (OEO ) and (EtOH).
  • the 13 C-NMR data showed the presence of four methyl groups ( ⁇ 13.2, 15.3, 25.6 and 25.6), a tetrasubstituted double bond ( ⁇ 1 19.7 and 156.1), two carbonyl groups ( ⁇ 160.8 and 172.3 ) and a quaternary carbon atom ( ⁇ 44.5). Its two-dimensional NMR data, and the fragmentation pattern observed in its high-resolution mass spectrum that indicates the presence of an anhydride (see Table 1), allowed to identify compound (10) as 3,3,4,5- tetramethylpiran-2,6-dione.
  • the compound (10) was present in the extraction products (EO), (OEO), (OEI), (WR0) and (WRI).
  • Compound (12) The fractionation of the hexane extract (Hx) allowed the isolation of a new necrodane with a molecular formula Ci 0 H 14 O 2 . Its IR spectrum showed characteristic absorption bands of a hydroxyl group (3427 cm "1 ) and a carbonyl group (3427cnT 1 ). The hydroxyl group corresponds to a primary alcohol as shown in the 1 H and 13 C spectra. NMR, ⁇ ⁇ to 4.42 s (2H) and ⁇ 0 56.1 respectively.
  • compound (12) was present in the extraction products (EO), (EtOH), (OE0) and (WR0).
  • the compound (4) was present in the extraction products (EO) and (OE0), the compound (5) in the extraction products (EtOH), (OE0) and (WRII), the compound (6) in the extraction products (EO), (OE0) and the compounds (7) and (8) in the extraction product (EtOH).
  • rosmarinic acid (9) was identified within a mixture of polyphenols as the main component (Kuhnt et al. Phytochemistry 1994, 36, 485-489.).
  • Compound (11) It was isolated from the hexane extract (Hx).
  • the 1 H NMR data of compound (1 1) showed three signals from three methyl groups a ( ⁇ 1, 24, 1, 29, and 1, 34), a methylene ( ⁇ 1, 96 (1 H ) and 1, 87 (1 H)), and four methines ( ⁇ 2.35 m, 3.87, 5.75 and 5.93), the first associated with a tertiary carbon atom, the second with an oxygenated carbon and the remaining two to a double bond.
  • compound (11) was present in the extraction products (OEI), (WRO), (WRI), (WRII) and (WRLII).
  • Table 3 is included that identifies the presence of the compounds (1) to (12) in the different extraction products.
  • Camphor (6) was the largest component of the extraction compounds (EO), (H) and (OE0), followed by 5-methylene-2,3,4,4-tetramethylcyclopenten-2-enone (4).
  • the extract (Hx) (GC-MS and LC-MS) also contained the compound (1), larger amounts of the compound (2) than the extraction product (EO) and cadinine (5).
  • the extraction product (EtOH) included tormentic (7) and ursolic (8) acids, compounds (2), (1) and rosmarinic acid (9).
  • Germination was monitored for 6 days and the length of the root and aerial part measured at the end of the experiment (25 plants randomly selected for each experiment and digitized with the ImageJ 1.43 application, http // rsb.info.nih.gov. / ij /). A non-parametric analysis of variance (ANOVA) was applied to root length data. Carvone (5 ⁇ g / ⁇ L) was included as a positive control.
  • Table 4 shows the phytotoxic activity of the different extraction products in herbaceous plant species.
  • L. sativa germination was seen especially significantly affected with (WRO), with (EtOH) and also with (WRII) during the different monitored times.
  • the (EO), (WRO) and (WRI) were especially effective.
  • germination was especially affected by the extraction products (Hx), (WRO), (WRI) and (OEI).
  • WRIIL and OEI the extraction products
  • the compounds (3a) and (10) were the ones that obtained the best results in terms of germination after 168 hours, although the compound (3a) was the most effective at the dose highest tested. Some compounds reduced germination at 24h (24-95% germination (2), (3), (5) and (9)). With respect to root growth the compounds (3a), (10) and (1 1) reduced root growth (38-20% reduction respectively).
  • rosmarinic acid (9) moderately reduced germination at 24 hours, although from that moment the effect disappeared.
  • Ursolic acid (8) was not phytotoxic.
  • the population of nematodes (Meloidogyne javanica) was kept in growth chambers on tomato plants (Lycopersicon esculentum var. Marmande) at 25 ° C and a relative humidity of 50%.
  • the tests were performed according to the methodology described for M. javanica (Andrés et al. Phytochem. Rev. 2012, 11, 371-390) using the biological phase of infective juveniles (J2).
  • the activity of the obtained extraction products and of the compounds with biocidal activity was quantified at a final concentration per well of 1.0 / 0.5 mg / ml, respectively.
  • Each treatment was repeated four times and the nematicidal activity was determined from the percentage of infectious juveniles killed after 72h. In cases where a mortality rate of> 99% was determined, dose-response experiments were performed.
  • Table 7 shows the nematicidal effects of the different extraction products in the nodule-forming nematode M. javanica. Hydrolate (WRO) had a high nematicidal activity while the extraction products (EO) and (EtOH) were not active.
  • WRO Hydrolate
  • EO extraction products
  • EtOH extraction products
  • the biodirected fractionation of (WRO) showed that the nematicidal agents were in the acidic aqueous fractions (WRI) and (WRII) that produced a high mortality of J2 up to 25% dilutions.
  • Table 8 shows the nematicidal effects of the isolated compounds in the nodule-forming nematode M. javanica.
  • Compounds (3) and (10) showed nematicidal activity (> 50% J2 mortality), although compound (10) was the most effective, inducing a J2 mortality rate of 88%.

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Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo producto biocida obtenido a partir de material vegetal de la planta Lavandula luiserique se caracteriza por comprender a un compuesto bioactivo de fórmula (I) y por presentar una importante actividad contra nematodos y/o malas hierbas, lo que lo convierte en una alternativa a los productos de síntesis para el tratamiento de factores bióticos que afectan al desarrollo de la vegetación. La invención también incluye el procedimiento de obtención y el uso del producto biocida, tantodirectamente, como a través de una composición biocida que lo comprende.

Description

PRODUCTO BIOCIDA EXTRAIDO DE MATERIAL VEGETAL DE Lavandula Luiseri, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y USO DEL MISMO
D E S C R I P C I Ó N
SECTOR DE LA INVENCION
La invención se sitúa dentro del campo de la agricultura, y más concretamente, en el sector de los biocidas que comprenden compuestos extraídos de plantas. Se propone un producto de extracción con actividad biocida que se aisla a partir de material vegetal de plantas de la especie Lavandula luisieri y que se caracteriza por comprender un nuevo compuesto de fórmula (I). La invención también tiene que ver con el procedimiento de obtención de dicho producto de extracción y con su uso para el control de factores bióticos perjudiciales para un cultivo, ya sea directamente o a través de una composición biocida que lo comprenda.
ESTADO DE LA TECNICA
En los últimos años los tratamientos para el control de factores bióticos que afectan al correcto desarrollo de las especies vegetales se han basado en el uso de productos biocidas específicos obtenidos por síntesis química. Sin embargo, el coste de obtención de estos productos de síntesis, junto con los problemas medioambientales que su uso continuado han ocasionado, así como los problemas de resistencias, han propiciado un nuevo marco regulatorio que se materializa en la restricción del uso de estos productos químicos (ver por ejemplo el Reglamento europeo (CE) N° 1 107/2009) que limita drásticamente el número de materias activas y la disponibilidad de los productos fitosanitarios destinados al control de dichos factores.
Resulta pues necesaria, la búsqueda y desarrollo de nuevos compuestos bioactivos alternativos a los de síntesis química, que sean eficaces y menos tóxicos para el medio ambiente. Una posible fuente para la obtención de estos nuevos compuestos son las plantas, ya que tal y como recoge el estado de la técnica, comprenden una muy amplia y variable cantidad de compuestos volátiles bioactivos (CPVs).
Lavandula luisieri (Rozeira) Riv.-Mart. (Rivas-Martínez. Lazaroa 1979, 1 , 110) es un pequeño arbusto aromático endémico de la Península Ibérica y común en las regiones semiáridas del sur de Portugal y el suroeste de España (Delgado et al. Plant Genet. Resour. 2010, 8, 82-90). Pertenece a la sección Stoechas Ging. de la familia Lamiaceae (Rozeira. Linn. Brot. 1949, 28, 1-84) que incluye Lavandula stoechas L, Lavandula pedunculata (Mili.) Cav. y Lavandula viridis L'ella. (Upson y Andrews. Royal Botanic Gardens Kew (Ed.) The Genus Lavandula. Timber Press, Portland, Oregon, 2004, 107-248). Esta planta es característica del sintaxón Cisto-Lavanduletae, una clase que incluye comunidades de matorrales de los pisos termo a supra Mediterráneos, semiáridos, secos y subhúmedos secundarios, que producen compuestos aromáticos (Rivas-Martínez et al. Itinera Geobotánica 2002, 15, 5-432). Se ha identificado una alta variabilidad inter-poblacional de CPVs presentes en aceites esenciales obtenidos a partir de material vegetal de Lavandula luisieri (Ver por ejemplo Baldovini et al. Phytochemistry 2005, 66, 1651-1655; González-Coloma et al. Biochemical systematics and ecology 2011 , 39, 1-8; o Zuzarte et al. Food Chemistry 2012, 135, 1505- 1510). Dicha variabilidad se relaciona con las diferencias genéticas entre poblaciones de la misma especie, variabilidad que es todavía más acusada cuando se comparan compuestos presentes en distintas especies.
En cuanto a la bioactividad de los CPVs presentes en aceites esenciales u otros extractos obtenidos a partir de material vegetal de Lavandulas se ha identificado:
-actividad antifúngica del aceite esencial de Lavandula luisieri (Zuzarte et al. Food Chemistry 2012, 135, 1505-1510); y
-actividad fitotóxica de extractos de tallo, hojas y flores de varias especies de Lavandula en el crecimiento de la raíz de Ray-grass anual (Lolium rigidum, ARG), siendo especialmente destacable para el extracto de tallo y hojas de la especie Lavandula intermedia cv. Grosso con una inhibición del crecimiento de hasta el 94% (Haigh et al. Journal of Chemical Ecology 2009, 35, 1 129-1 136); o de aceites esenciales de Lavandula stoechas y Lavandula angustifolia frente a Amaranthus retroflexus y Portulaca olerácea en el cultivo de tomate (Argypoulos et al. Allelopathy Journal 2008, 22, 69-78).
Por otra parte, no se han encontrado efectos significativos en cuanto a actividad nematicida al utilizar aceites esenciales de distintas especies del género Lavandalula, como por ejemplo Lavandula officinalis, Lavandula angustifolia, Lavandula intermedia o Lavandula hybrida contra el nematodo del pino (Bursaphelenchus xylophilus) o nematodos formadores de nodulos de raíz (Meloidogyne spp.) ver Andrés et al. (Phytochemistry Reviews 2012, 1 1 , 371-390); ni tampoco al utilizar aceites esenciales y volátiles de diversas especies como por ejemplo, Lavandula dentata, Lavandula luisieri, Lavandula stoechas o Lavandula viridiris contra el nematodo de la madera del pino ver Barbosa et al. (Journal of Nematology 2010, 42, 8-16).
EXPLICACION DE LA INVENCION
La presente invención se relaciona en un primer aspecto con un producto de extracción de material vegetal de la especie Lavandula luiseiri con actividad biocida, caracterizado por que comprende al compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000004_0001
(i)
isómero, o una sal o un solvato del mismo.
Adicionalmente, el producto de extracción puede comprender al menos otro compuesto que se elige de entre los siguientes:
Figure imgf000004_0002
(II) (III) (IV) (V)
Figure imgf000004_0003
(VI) (VII) (VIII) (IX)
Figure imgf000005_0001
(X) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos.
En realizaciones particulares, el producto de extracción se selecciona de entre un extracto hexánico (Hx), un aceite esencial (EO), un hidrolato (WRO), o una fracción orgánica (EO0) y un hidrolato (WRI) obtenidos a partir del hidrolato (WRO).
En otra realización particular el producto de extracción es el propio compuesto de fórmula general (I).
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con el procedimiento de obtención del producto de extracción que comprende una etapa de extracción de material vegetal de Lavandula luiseri con al menos un solvente hasta obtener un producto de extracción que comprenda al compuesto de fórmula (I) o un isómero, o una sal o un solvato del mismo.
Preferentemente, el procedimiento de obtención del producto de extracción utiliza flores y/o hojas como material vegetal y al menos un solvente se selecciona de entre un solvente acuoso o un solvente orgánico.
Alternativamente, el procedimiento de obtención comprende una etapa adicional de aislamiento del compuesto de fórmula (I) a partir del producto de extracción de la etapa anterior.
En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una composición biocida que comprende al producto de extracción. En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con el uso de la composición biocida, del producto de extracción o de al menos uno de los compuestos de fórmula (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, o una sal o un solvato de los mismos, ya sea de forma aislada o en combinación, contra al menos un factor biótico que afecta al desarrollo de plantas. Preferentemente el al menos un factor biótico que afecta al desarrollo de plantas, se selecciona de entre nematodos que preferentemente son nematodos formadores de nodulos de las raíces y más preferentemente pertenecen a la especie Meloidogine javanica y de malas hierbas que pertenecen al género Lolium y más preferentemente pertenecen a la especie Lolium perenne.
Para algunos de los compuestos incluidos en el ámbito del presente documento de memoria de invención, se utiliza indistintamente una doble nomenclatura, así, compuesto (I) y compuesto (10) se refieren al mismo compuesto tal y como lo hacen compuesto (II) y compuesto (1); compuesto (III) y compuesto (2); compuesto (IV) y compuesto (3); compuesto (V) y compuesto (3a); compuesto (VI) y compuesto (4); compuesto (VII) y compuesto (5); compuesto (VIII) y compuesto (6); compuesto (IX) y compuesto (1 1); y compuesto (X) y compuesto (12). BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema de obtención de distintos productos de extracción.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
El problema técnico que resuelve la presente invención es la búsqueda de nuevos principios activos naturales con una alta actividad biocida que se extraigan de material vegetal y que puedan ser utilizados para el control de factores bióticos que afectan a cultivos, y que constituyan de esa forma, una alternativa efectiva y respetuosa con el medio ambiente con respecto a los productos biocidas convencionales de síntesis química.
La presente invención tiene su origen en un producto de extracción que comprende al compuesto químico de fórmula (I), que se extrae a partir de material vegetal de plantas de la especie Lavandula luisieri (ver ejemplos 1 a 4) y que muestra una importante actividad fitocida contra Lactuca sativa y Lolium perenne y una importante actividad nematicida contra Meloidogyne javanica (ver ejemplos 5 y 6). Adicionalmente al efecto biocida del compuesto de fórmula (I), los inventores han descubierto que otros compuestos presentes en el producto de extracción (compuestos (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX)) también presentan actividad fitocida y/o nematicida y que cuando se combinan entre sí o con el compuesto de fórmula (I), pueden proporcionar un efecto sinérgico que se materializa en una mayor actividad biocida, que hace factible el uso del producto de extracción o incluso de los compuestos aislados para el tratamiento de factores bióticos perjudiciales para el correcto desarrollo de cultivos.
Las principales ventajas técnicas de los productos de extracción que se incluyen dentro del ámbito de la invención y de su uso para el control de factores bióticos que afectan a cultivos se enumeran a continuación:
- se obtienen de fuentes naturales, por procedimientos sencillos; - son singularmente efectivos contra nematodos, alcanzando en este caso una efectividad superior al 99% para los productos de extracción (WRO) y (WRI), o para el compuesto de fórmula (I) con un 87%, muy por encima por ejemplo, del producto Abamectina (AVICTA®) que presenta un valor de en torno al 35% en condiciones experimentales similares; y - son singularmente efectivos contra malas hierbas como el Lolium perenne, alcanzando en este caso una efectividad sobre germinación superior al 99% en el caso de los productos de extracción (WRO) y (WRI) o para el compuesto de fórmula (I) con un 20% sobre germinación, 97% sobre crecimiento de raíz y 40% sobre crecimiento foliar, valores muy superiores a los obtenidos con un herbicida natural como la carvona (ver Ejemplo 5).
Los autores de la presente invención han identificado un producto de extracción de material vegetal de la especie Lavandula luiseiri que presenta actividad biocida, en adelante producto de extracción de la invención, que se caracteriza por comprender a un compuesto de fórmula (I) y que constituye el primer aspecto de esta invención,
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(I)
o un isómero, una sal o un solvato del mismo.
Por "Lavandula luiserf' se entiende un pequeño arbusto aromático endémico de la Península Ibérica y común en las regiones semiáridas del sur de Portugal y el suroeste de España. Por "producto de extracción" se entiende cualquier fracción, ya sea líquida o sólida, obtenida directamente tras someter al material vegetal de L luiseri a una extracción utilizando un solvente adecuado, siempre que comprende al menos al compuesto de fórmula (I). Sin embargo, también se considera como producto de extracción cualquier fracción sucesiva obtenida de la fracción directamente obtenida a partir de material vegetal de L luiseri, empleando fraccionamientos, extracciones o aislamientos posteriores y al menos un solvente adecuado, con la condición de que dicho producto comprenda al menos al compuesto de fórmula (I). El producto de extracción de la invención puede comprender al menos otro compuesto,
Figure imgf000008_0001
(VI) (VII) (VIII) (IX)
Figure imgf000008_0002
(X) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos. En el ámbito de la presente invención, el término "producto de extracción" puede hacer referencia a una o a varias fracciones, o incluso al compuesto de fórmula (I), dependiendo del contexto. Preferentemente, el producto de extracción de la invención se selecciona de entre un extracto hexánico obtenido tras una extracción hexánica a partir de material vegetal de L. luiseri; un aceite esencial que se obtiene tras hidrodestilado con aparato Clevenger o arrastre por vapor a partir de material vegetal de L. luiseri; un hidrolato que se obtiene tras hidrodestilado con aparato Clevenger o arrastre por vapor a partir de material vegetal de L. luiseri; una fracción orgánica y/o un nuevo hidrolato obtenido a través de una extracción con diclorometano (DCM) a partir del hidrolato anterior; o una nueva fracción orgánica obtenida a partir del hidrolato inmediatamente anterior tras elución con metanol (ver Figura 1).
En realizaciones particulares, el producto de extracción de la invención se selecciona de entre el extracto hexánico (Hx), el aceite esencial (EO), el hidrolato (WRO), la fracción orgánica (OE0), el hidrolato (WRI) o la fracción orgánica (OEI) (ver Ejemplos 1 a 4 y Figura 1).
Sucesivos fraccionamientos del producto de extracción hacen que pueda quedar constituido exclusivamente por el compuesto de fórmula (I). Así por ejemplo, en otra realización particular, el producto de extracción es el compuesto de fórmula (I) que se obtiene tras la aplicación de técnicas cromatográficas, sobre cualquier producto de extracción de la invención, como por ejemplo (Hx), (EO), (OE0), (OEI), (WRO) o (WRI). Tanto el compuesto de fórmula (I) como el resto de compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención, se aislan o se extraen a través de métodos perfectamente conocidas en el estado de la técnica, como por ejemplo, cromatografía líquida de vacío (VLC), cromatografía en columna (CC) empleando diferentes fases sólidas (Gel de Sílice, Sephadex LH-20) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), eluyéndose con distintos gradientes de polaridad mediante diferentes combinaciones de disolventes orgánicos.
De forma general, todos los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención, es decir, el término isómero también se refiere a cualquier mezcla de isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiomeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.
Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales y solvatos aceptables de todos los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención o de cualquier otro compuesto que es capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el presente documento.
Los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos. Los métodos de solvatación se conocen generalmente dentro de la técnica.
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento de obtención del producto de extracción la invención, en adelante procedimiento de obtención de la invención, que comprende una etapa de extracción de material vegetal de Lavandula luiseri con al menos un solvente hasta obtener un producto de extracción.
El procedimiento de la invención puede utilizar cualquier material vegetal de Lavandula luiseri que comprende al compuesto de fórmula (I), preferentemente es material perteneciente a la parte aérea, y más preferentemente son flores y/o hojas. Los solventes que se utilizan en la etapa de extracción del procedimiento de la invención pueden ser cualquiera de los que habitualmente se utilizan en el estado de la técnica para obtener compuestos volátiles, preferentemente son solventes orgánicos y acuosos.
Ejemplos de solventes orgánicos que se incluyen en el ámbito de la invención son diclorometano, éter terbutílico, etanol y hexano.
En una realización particular del procedimiento de la invención se utiliza agua como solvente y como método de extracción el arrastre por vapor o hidrodestilado con aparato Clevenger. En otra realización particular del procedimiento de la invención se utiliza un solvente orgánico, preferentemente hexano y como método de extracción se prefiere la extracción Soxhlet. Preferentemente el procedimiento de extracción de la invención se selecciona de entre una extracción por arrastre de vapor para obtener como producto de extracción un hidrolato y/o un aceite esencial; un hidrodestilado con aparato Clevenger para obtener como producto de extracción un hidrolato y/o un aceite esencial; una extracción hexánica para obtener como producto de extracción un extracto hexánico; una extracción con diclorometano a partir de un hidrolato para obtener una fracción orgánica y/o un nuevo hidrolato; y elución con metanol del anterior hidrolato para dar un nuevo extracto orgánico (ver ejemplos 1 a 4).
Alternativamente, el procedimiento de la invención comprende una etapa adicional para aislar el compuesto de fórmula (I) a partir del producto de extracción de la primera etapa del procedimiento utilizando técnicas cromatográficas.
En otra realización particular, el procedimiento de la invención obtiene el compuesto de fórmula (I) cuando se aplican técnicas cromatográficas sobre un producto de extracción, que se selecciona de entre (Hx), (EO), (OEO), (OEI), (WRO) y (WRI) (ver Ejemplos 1 a 4 y Figura 1).
Por "actividad biocida" se entiende la capacidad de controlar, a través de diferentes mecanismos de acción, a al menos un factor biótico, y preferentemente a más de uno, que se considere perjudicial para el desarrollo de un cultivo. Dicho control comprende la prevención de la acción o la destrucción directa de dicho factor perjudicial. Ejemplos de factor biótico que afectan al desarrollo de las plantas y que se incluyen en la presente invención son aunque sin limitarse, nematodos y malas hierbas.
Preferentemente, los nematodos que se incluyen en el ámbito de esta invención, son nematodos formadores de nodulos de las raíces (Meloidogyne sp). Un ejemplo de nematodos formadores de nodulos es la especie Meloidogine javanica, polífaga, con capacidad de parasitar más de 3.000 especies de plantas de cultivo, que incluyen cultivos extensivos, hortícolas y frutales, afectando gravemente la producción (Agrios. Plant Pathology, Fifíh edition, Elsevier/Academic, Amsterdam 2005), y causando pérdidas económicas anuales de miles de millones de euros (Singh et al. OEPP/EPPO Bulletin 2013, 43 (2), 334-374). Por "mala hierba" se entiende cualquier especie vegetal que crece de forma silvestre y con considerable vigor en una zona cultivada o controlada por el ser humano. En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una composición biocida efectiva contra al menos un factor biótico, y preferentemente más de uno, que se considere perjudicial para el desarrollo de un cultivo, en adelante composición biocida de la invención, que comprende al producto de extracción de la invención, o a al menos un compuesto que se selecciona de entre los compuestos (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos, ya sea de forma aislada o en combinación, en adelante composición biocida de la invención.
Como el experto en el estado de la técnica sabrá, los compuestos químicos que se incluyen en este documento, deberían tener la misma funcionalidad con independencia de si su origen es natural o sintético, motivo por el cual dentro del alcance de esta invención se incluye el uso de todos ellos.
Preferentemente la composición biocida de la invención comprende a un producto de extracción que se selecciona de entre el extracto hexánico (Hx), el aceite esencial (EO), el hidrolato (WRO), la fracción orgánica (OE0), el hidrolato (WRI), la fracción orgánica (OEI) o el compuesto de fórmula (I) y más preferentemente el producto de extracción (WRO).
La composición biocida de la invención adicionalmente puede comprender diversos vehículos y agentes que faciliten su conservación, manejo y aplicación.
Como el experto en el estado de la técnica conocerá en la aplicación de fitosanitarios, habitualmente se utilizan vehículos sólidos, vehículos líquidos, vehículos gaseosos, etc., y, si es necesario, agentes tensioactivos y agentes auxiliares para la formulación de composiciones fitosanitarias como, por ejemplo, un aditivo para formular formas tales como concentrados emulsionables, polvos humectables, líquidos fluibles, (v.g., suspensión en agua, emulsión en agua, etc.), polvos, aerosoles, ULV y similares.
Ejemplos de vehículo sólido que se incluyen en el ámbito de la invención son polvos finos o gránulos de arcillas (v.g. arcilla de caolín, tierra de diatomeas, óxido de silicio hidratado sintético, bentonita, arcilla Fubasami, arcilla ácida, etc.), talcos, cerámicas y otros minerales inorgánicos (v.g., sericita, cuarzo, azufre, carbono activo, carbonato cálcico, sílice hidratada, etc.), fertilizantes comerciales (v.g., sulfato amónico, fosfato amónico, nitrato amónico, urea, cloruro amónico, etc.) y similares.
Ejemplos de vehículo líquido que se incluyen en el ámbito de la invención son agua, alcoholes (v.g., metanol, etanol, etc.), cetonas (v.g., acetona, metil etil cetona, etc.), hidrocarburos aromáticos (v.g, benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, metilnaftaleno, etc.), hidrocarburos alifáticos (v.g. hexano, ciclohexano, kerosina, gas oil, etc), ésteres (v.g., acetato de etilo, acetato de butilo, etc.), nitrilos (v.g, acetonitrilo, isobutironitrilo, etc.), éteres (v.g, éter diisopropílico, dioxano etc.), amidas de ácido (v.g, Ν,Ν-dimetilformamida, N,N- dimetilacetamida, etc.), hidrocarburos halogenados (v.g., dicloroetano, tricloroetano, tetracloruro de carbono, etc. ), sulfóxido de dimetilo, aceites vegetales (v. g., aceite de soja, aceite de semilla de algodón, etc.) y similares.
Ejemplos de vehículo gaseoso que se incluyen en el ámbito de la invención son agente de pulverizado, incluyendo gas flon, gas butano, LPG (gas de petróleo liquificado), éter dimetílico, gas de dióxido de carbono y similares.
Ejemplos de agente tensioactivo que se incluyen en el ámbito de la invención son sulfatos de alquilo, sales de sulfonato de alquilo, alquil aril sulfonatos, ésteres alquil arílicos, compuestos de polioxietileno de los mismos, ésteres polietilen glicólicos, ésteres de alcohol polihidroxílico, derivados de alcohol de azúcar y similares.
Ejemplos de agente auxiliar para la formulación como agente de fijación y agente de dispersión que se incluyen en el ámbito de la invención son caseína, gelatina, polisacáridos (v.g., polvo de almidón, goma arábiga, derivado de celulosa, ácido algínico, etc.), derivados de lignina, bentonita, azúcares, polímeros hidrosolubles sintéticos (v.g., polialcohol vinílico, polipirrolidona de vinilo, poliácidos acrílicos, etc.) y similares.
Ejemplos de estabilizantes que se incluyen en el ámbito de la invención son PAP (fosfato de ácido isopropílico), BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol), BHA (mezcla de 2-terc-butil-4- metoxifenol y 3-terc-butil-4-metoxifenol), aceites vegetales, aceites minerales, agentes tensioactivos, ácidos grasos o ésteres de los mismos y similares.
El producto de extracción de la invención, la composición biocida de la invención o el al menos uno de los compuestos (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos, se pueden utilizar conjuntamente con al menos otro ingrediente activo adicional. Ejemplos de ingrediente activo adicional son nematicidas, insecticidas, acaricidas, fungicidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la planta, sinérgicos, fertilizantes, acondicionadores del suelo y cebos para animales. En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con el uso como biocida, en adelante uso de la invención, para el control de al menos un factor biótico, y preferentemente más de uno, que afecta al desarrollo de las plantas, del producto de extracción de la invención, de la composición biocida de la invención o de al menos uno de los compuestos (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos, ya sea de forma aislada o en combinación.
En el ámbito de la invención, la actividad biocida contra los factores bióticos se puede determinar mediante diferentes tipos de bioensayos (ver ejemplos 5 y 6). Por ejemplo, en el caso de los nematodos se utiliza el porcentaje de juveniles infectivos (J2) muertos a las 72 horas posteriores tras la aplicación de la sustancia biocida. En el caso de las malas hierbas, se controla el porcentaje de germinación, el crecimiento de la raíz o el crecimiento de la parte aérea tras un ensayo de germinación de semillas de 168 horas tras aplicación de la sustancia biocida. La actividad biocida del producto de extracción queda de manifiesto en su efecto contra un nematodo, que preferentemente es un nemátodo formador de nodulos de las raíces y más preferentemente un nematodo de la especie Meloidogine javanica.
Así, en una realización particular del uso de la invención, el nematodo pertenece a la especie Meloidogine javanica, el producto de extracción se elige de entre (WRO) y (WRI) y se obtiene una actividad nematicida del 100%.
El fraccionamiento biodirigido del (WRO) demostró que los agentes nematicidas estaban en las fracciones acuosas ácidas (WRI) o (WRII) que producen una alta mortalidad de J2 hasta diluciones del 25%. Los procesos de liofilización, neutralización o neutralización-liofilización de (WRII) dieron extractos inactivos (WRIIL), (WRIIN) y (WRIINL) sin embargo la acidificación de (WRIINL) dio un extracto activo lo que sugiere que los componentes activos se regeneran cuando se protonan sus sales. En otra realización particular del uso de la invención, el nematodo pertenece a la especie Meloidogine javanica, el producto de extracción es el compuesto de fórmula (I) y se obtiene una mortalidad del 87%. En otra realización particular del uso de la invención, el nematodo pertenece a la especie Meloidogine javanica se utiliza el compuesto (IV) y se consigue una mortalidad del 59%.
Por otra parte, la actividad biocida del producto de extracción de la invención o de los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención, queda de manifiesto en los resultados contra una mala hierba que preferentemente pertenece al género Lolium y que más preferentemente es la especie Lolium perenne, cuando el producto de extracción es (WRO) o (WRI). Sin embargo, la actividad fitocida también queda de manifiesto en ensayos con Lactuca sativa (ver ejemplo 5). En otra realización particular del uso de la invención, la mala hierba es la especie Lolium perenne, el producto de extracción es (WRO), y se consigue una reducción de la germinación de semillas tras 168 horas del 100%.
La actividad biocida de los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención contra malas hierbas, resultan especialmente evidentes contra Lolium perenne para los compuestos de formula general (I), (II), (III), (IV) y (VII) para parámetros como la reducción del porcentaje de germinación, crecimiento radicular o crecimiento foliar, tras 168 horas de germinación de semillas de L. perenne. Con independencia de la potencia biocida del compuesto de fórmula (I) y del resto de compuestos que comprende el producto de extracción de la invención, se produce un efecto sinérgico de su mezcla que queda de manifiesto a través de la actividad biocida que se registra especialmente en un producto de extracción que es (EO) o (WRO). Finalmente la invención también se relaciona con un método de control de al menos un factor biótico, y preferentemente de más de uno, que afecta al correcto desarrollo de un cultivo, que comprende el uso de una dosis eficaz de la composición biocida de la invención, del producto de extracción de la invención o de al menos uno de los compuestos de fórmula general (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos, ya sea de forma aislada o en combinación. Preferentemente, el al menos un factor biótico contra el que es efectivo el método de control de la invención, se selecciona de entre nematodos y malas hierbas. Más preferentemente, los nematodos son nematodos formadores de nodulos de las raíces y todavía más preferentemente nematodos de la especie Meloidogine javanica. También preferentemente, las malas hierbas pertenecen al género Lolium y más preferentemente la especie Lolium perenne.
La "dosis eficaz" puede aumentar o disminuir opcionalmente según el tipo de formulación, la climatología, el lugar y el método de aplicación, el tipo de factor biótico que afecta a la planta y el grado de daño.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas. Para el experto en la materia, otros aspectos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION
Ejemplo 1. Recolección de material vegetal de Lavandula luiseri
Plantas de L. luisieri fueron cultivadas en una parcela experimental localizada en la Comarca del Campo de Cariñena, Aguaron (Zaragoza, España) y ubicada en las siguientes coordenadas: latitud 41° 19' 13.33" N; longitud 1o 19'53.9" W; altitud 16 m. El diseño experimental consistió en tres bloques al azar con una superficie de 49.92 metros cuadrados cada uno, con una separación de 2 metros entre bloques. En cada bloque se establecieron 4 filas de 10 metros con 104 plantas por línea. El marco de plantación fue de 1.20 x 0.40 m lo que supuso una superficie útil de 0.48 m2 por planta. La parcela experimental fue establecida en marzo de 2008 con plantas producidas por semillas recolectadas en Junio de 2007 a partir de una población salvaje parental (PSP) localizada en Pueblo Nuevo del Bullaque (Ciudad Real, España) ubicada en las coordenadas: latitud 39° 27' 41 " N; longitud 4° 24' 34" W; altitud 733 m) y que previamente se habían germinado en vivero. Una vez las plantas florecieron, material vegetal de la parte aérea consistente en flores y hojas fue recolectado y secado a la sombra a temperatura ambiente. Ejemplo 2. Productos de extracción
El material vegetal seco obtenido según el ejemplo 1 , se sometió a los procedimientos de extracción que se indican a continuación:
Hidrodestilado en un aparato tipo Clevenger de acuerdo con el método recomendado por la European Pharmacopoeia (6th edition, 2008), obteniéndose, por decantación, el aceite esencial (EO) con un 0.8% de rendimiento y su correspondiente hidrolato (WRO') (15 ml_);
Extracción por arrastre de vapor en la planta piloto de destilado de acero inoxidable equipada con una cámara de destilado de 100 Kg y un vaso de 500 L, utilizando un rango de presión de entre 0.5-1.0 bar, y obteniéndose, por decantación, el aceite esencial (PEO) y su correspondiente hidrolato (WRO); y
Extracción con n-hexano o etanol en un aparato Soxhlet y concentrado in vacuo, obteniéndose un extracto hexánico (Hx) o etanólico (EtOH) con un 2.1 % y un 12.5% de rendimiento, respectivamente. Adicionalmente y partiendo de flores secadas al aire y molidas de L luiseri (131g):
Extracción en un aparato Soxhlet, consistente en una extracción con Hexano durante 12 horas. Cuando el extracto hexánico (Hx) se dejó enfriar a temperatura ambiente se obtuvo un material insoluble (1.60 g) que fue filtrado y una solución hexánica a la que se añadió una solución NaOH 2N. La fase acuosa fue acidificada a pH 2 con HCI 2N y extraída con éter metil-terbutílico. Ambas fases orgánicas fueron lavadas con una solución salina, secadas con Na2S04 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo para obtener 687 mg y 724 mg de un extracto neutro (NHx) y un extracto ácido (AHx), respectivamente. Ejemplo 3. Fraccionamiento del hidrolato (WRO)
El hidrolato (WRO) obtenido según el procedimiento de extracción (b) del ejemplo 2 presentó 4.5 mg/ml de componentes orgánicos y un pH 3.2. Partiendo de dicho (WRO) se realización extracciones con diclorometano (DCM). 1000 mi de (WRO) fueron sometidos a extracción (DCM, 800 mi x 3) obteniendo 3.42 g (con un 34% rendimiento) de un extracto orgánico (OE0) y un residuo acuoso (WRI) con 1.15 mg/ml de componente orgánico y pH 3.1. A continuación 1000 mi de (WRI) fueron filtrados a través de un cartucho C18 (10 g) y eluídos con MeOH para dar 176 mg (con un 0.18% de rendimiento) de un segundo extracto orgánico (OEI) y un residuo acuoso (WRII) con 0.73 mg/ml y un pH 3.67. Adicionalmente 50 mi de (WRII) fueron neutralizados a pH 6.62 con NaOH 2N (WRIIN) y liofilizados obteniendo (WRIINL). 1 10 mg de una muestra seca de (WRIINL) se cromatografiaron sobre una columna de Si (40-63 μηι; 0: 2 cm, h: 30cm) usando 100% acetato como eluyente
Ejemplo 4. Compuestos comprendidos en el producto de extracción de L. luiseri
TECNICAS ANALÍTICAS UTILIZADAS
Aceites esenciales y fracciones derivadas del hidrolato
Los aceites esenciales (EO) y los extractos orgánicos del hidrolato (OE0 y OEI) fueron analizados por GC-MS usando un cromatógrafo de gases Agilent 6890N (Agilent Technologies, Palo Alto, California, USA) acoplado a un detector de masas Agilent 5973N - electrón ionization, 70 eV- (Agilent Technologies, Palo Alto, California, USA) y equipado con columnas capilares (Hewlett-Packard), concretamente id HP-1 de 25m x 0.2 mm (metil silicona, 0.2 μηι de espesor de película) e id Carbowax 30 m x 0.25 mm (polietilenglicol, 0.25 μηι de espesor de película). Las condiciones de trabajo fueron: temperatura del inyector 260 °C; temperatura de la línea de transferencia conectadas al espectrómetro de masa 280 °C; temperatura de la columna 70 -190 °C, 5 °C min"1. El espectro de masas El y los datos de retención fueron usados para identificar distintos compuestos por comparación con los patrones o con valores encontrados en las bases de datos Wiley Mass Spectral Datábase (2001). Los datos cuantitativos fueron obtenidos a partir de las áreas de los picos TIC sin utilizar factores de respuesta.
Extracto etanólico y fracciones derivadas del hidrolato
Los análisis se llevaron a cabo por HPLC-MS en un aparato LC-20AD HPLC acoplado a un espectrómetro de masas LCMS-2020 QP utilizando una interfaz de ionización por electrospray (ESI) y una columna Teknokroma, Mediterránea Sea18 (250 x 4.6 mm, 5 μηι tamaño de partícula) con una precolumna ACE 3 C18. Los compuestos fueron eluidos con metanol (MeOH):0.1 % ácido acético en agua milli-Q con un gradiente 38: 100% durante 45 min, seguido de 100% MeOH durante 10 min y 100:38% durante 13 min, a un flujo de 0.5 mL/min y 15 L/min de nitrógeno (gas de secado para la evaporación del disolvente). El potencial capilar del electrospray fue de +4.50kV y se empleó en modo positivo de Full Sean (m/z = 145-545) con un potencial de 1.30 kV y una temperatura capilar de 250 °C. Las soluciones stock de los extractos (0.25 g/ L), de los compuestos (1), (5), (8) y (9) aislados de material vegetal de la PSP y del ácido oleanolico (Sigma) (0.05 g/ L) se disolvieron en MeOH para la inyección de muestras (10 μί). Todos los disolventes usados fueron de grado HPLC-MS.
De forma general, los espectros NMR (1H y 13C) fueron obtenidos con espectrómetros Varían Direct-Drive 500 (1H 500 MHz/13C 125 MHz). Para alta resolución MS se utilizó un espectrómetro de masas Autospec-Q VG-Analytical (Fisons). Para los espectros IR se utilizó un espectrómetro Mattson Model Satélite FTIR.
FRACCIONAMIENTOS Y EXTRACCIONES
Extracto hexánico
El fraccionamiento del extracto hexánico neutro (NHx) en columna de Si-gel eluída con un gradiente de hexano:f-butilmetileter (H:E) resultó en el aislamiento del alcanfor o compuesto (6) (H:E, 80:20, 714 mg) (Barrero et al. J. Essent. 0/7 Res. 2005, 17, 166-168; Demarco Chem. Commun. 1969, 1418-1420), del compuesto (4) (H:E, 75:25, 103 mg), del compuesto (2) (H:E, 60:40, 148 mg) (Baldovini et al. Phytochemistry 2005, 66, 1651-1655), del compuesto (1) (H:E, 40:60, 86 mg) (Baldovini et al. Phytochemistry 2005, 66, 1651-1655) y del compuesto (5) (H:E, 40:60, 360 mg) (Staerk et al. J. Nat. Prod. 2004, 67, 799-805). El fraccionamiento del extracto hexánico en columna de Si-gel eluída con un gradiente de n- hexano:EtOAc (0-30% EtOAc) resultó en el aislamiento del compuesto (4) (n-hexano: EtOAc 90: 10, 80 mg, 2.6%), del compuesto (5) (n-hexano: AcOEt 70:30, 1 10 mg, 3.5%), del compuesto (10) (n-hexano: EtOAc 85: 15, 5 mg; 0.16%) y del compuesto (12) (n-hexano: EtOAc 60:40, 9 mg; 0.29%).
El extracto hexánico ácido (AHx) fue metilado con TMSCHN2 (Hasimoto et al. Chem. Pharm. Bull. 1981 , 29, 1475-1478) para obtener un producto crudo que fue purificado por columna cromatográfica sobre silica gel utilizando mezclas de H:E e incrementando la polaridad para obtener el compuesto (3a) (H:E, 95:5, 104 mg).
La fracción orgánica del extracto hexánico ácido fue purificada por cromatografía flash para dar 200 mg de un sólido blanco, el compuesto (3) y 20 mg del compuesto (10).
El material insoluble fue fraccionado por columna cromatográfica sobre silica gel utilizando mezclas de H:E:EtOAc incrementando la polaridad para obtener seis fracciones. La fracción 6 (EtOAc, 154 mg) fue metilada con TMSCHN2 26 para obtener un producto crudo que fue sometido a una columna cromatográfica sobre silica gel para obtener los metil esteres del ácido ursólico (8a) (H:E, 50:50, 30 mg) y torméntico (7a) (H:E, 20:80, 79 mg)
Extracto etanólico El fraccionamiento del extracto etanólico en una columna cromatográfica sobre silica gel usando mezclas crecientes en polaridad de hexano:f-butylmethylether (H:E) permitió identificar una mezcla de polifenoles siendo el principal compuesto el ácido rosmarínico (9) (H:E, 0: 100, 30 mg) (Kuhnt et al. Phytochemistry 1994, 36, 485-489.) Finalmente, una muestra seca del hidrolato (WRIINL) (110 mg) se cromatografió sobre una columna de Si gel eluída con 100% AcOEt, obteniendo de esta manera el compuesto (11) (3 mg; 2.7%).
CARACTERIZACIÓN Y UBICACIÓN DE LOS COMPUESTOS BIO ACTIVOS
Compuestos (1 ), (2), (3a), (10) y (12)
El fraccionamiento del extracto hexánico neutro (NHx) permitió el aislamiento de dos nuevos compuestos, los necrodanos (1) y (2).
El Compuesto (1 ). Jarabe incoloro; [a]D -9,7 (c1 , CH2CI2). Su fórmula molecular fue determinada como Ci0H16O2 por HRFABMS ([M+Na]+, m/z 191.1041). Su espectro IR mostró dos bandas de absorción a vmax 3406 cm"1 y 1686 cm"1 debido al grupo hidróxilo y a la ketona α,β-insaturada, respectivamente. El grupo hidróxilo corresponde a un alcohol primario deducido de las señales 1 H y 13C NMR a δΗ 3.77 dd (5.7, 10.5) y 3.83 dd (8.9, 10.5), y 6C 63.2, respectivamente. Además, el espectro 1 H NMR (ver Tabla 1) mostró señales características de cuatro grupos metilos (δ 1.94, 1.66, 1.25 y 1.02) y un grupo metino (δ 2.30 dd (5.7, 8.9)) acoplado con el metileno oxigenado. El espectro 13C NMR (ver Tabla 1) confirmó la presencia de un doble enlace (6136.4 y 180.3) conjugado con un grupo cetona (δ 213.6) y también mostró señales atribuidas a la presencia de 4 grupos metilos (δ 10.5, 14.5, 25.0 y 29.2), un grupo metino (δ 59.8), un metileno oxigenado (δ 63.2) y un carbono cuaternario (δ 46.4). Estos datos están de acuerdo con un esqueleto de necrodano, de tal forma que la estructura del compuesto (1) fue asignada a 5-(hidroximetil)-2, 3,4,4- tetrametilciclopent-2-enona.
5-(Hidroximetil)-2,3,4,4-tetrametilciclopent-2-enona (1 ). [a]D -9.7 (c 1 , CH2CI2); IR (film) vmax 3406, 2960, 2931 , 2875, 1686, 1465, 1378, 1330, 1240, 1041 cm"1 ; para datos 1 H NMR (CDCI3, 500 MHz) ver Tabla 1 ; para datos 13C NMR (CDCI3, 125 MHz) ver Tabla 1 ; HRFABMS m/z 191.1043 [M + Na]+ (calculado para Ci0H16O2, 191.1048).
El compuesto (2). Jarabe incoloro; [a]D -7.9 (c1 , CH2CI2) mostró una fórmula molecular Ci2H1803 establecida a través HRFABMS ([M+Na]+, m/z 233.1258. Su IR mostró bandas de absorción debidas a un grupo acetato (1734 cm"1), y una ketona α,β-insaturada (1668 cm"1). El espectro 1 H y 13C NMR (ver Tabla 1) indicó la presencia de una estructura de necrodano muy relacionada con la del compuesto (1), la principal diferencia entre el fuerte desapantallamiento de las señales H-7 ((Δδ = δ 2 - δ 1 = 0.70 y 0.41 ppm) y la presencia de señales correspondientes al grupo acetilo (δΗ 2.05 y δ0 21.1 y 171.0). Estos datos permitieron identificar el compuesto 2 como el acetato del 5-(hidroximetil)-2, 3,4,4- tetrametilciclopent-2-enona.
Tabla 1. Datos 1H y 13C NMR de los compuestos (1 ), (2), (12), (3a) y (10). Las constantes de acoplamiento, j, se representan entre paréntesis. La numeración de los carbonos de los compuestos (10), (12), (3a) coincide con la publicada por Baldovini et al. (Phytochemistry 2005, 66, 1651-1655).
Átomo 1 2 12 3a 10 (n°) 1 H 13C 1 H 13C 1 H 13C 1 H 13C 1 H 13C
1 213.6 205.7 196.0 7.12 s 145 160.8
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Acetato de 5-(hidroximetil)-2,3,4,4-tetrametilciclopent-2-enon (2). [a]D -7.9 (c 1 , CH2CI2); IR (film) vmax 2953, 2928, 2859, 1734, 1668, 1452, 1370, 1262, 1231 , 1093, 1017 cm"1 ; para datos 1 H NMR (CDCI3, 500 MHz) ver Tabla 1 ; para datos 13C NMR (CDCI3, 125 MHz) ver Tabla 1 ; HRFABMS m/z 233.12.58 [M + Na]+ (calculado para Ci2H1803, 233.1256).
Adicionalmente, el compuesto (1) fue detectado en los productos de extracción (EO), (OEO), (WRO) y (EtOH), mientras que el compuesto (2) se encontró en (EO), (WRO), (OEO) y (EtOH).
Compuesto 3a. Se aisló después del tratamiento con diazometano del extracto hexánico ácido. Su espectro de masas de alta resolución mostró un ión molecular a 180.1 144 m/z que estaba de acuerdo con la fórmula molecular Cn H1602. Las señales de sus espectros de 1 H y 13C RMN (ver Tabla 1) indicaron la presencia de una estructura con esqueleto necrodano similar al compuesto (3) (ácido 3,4,5,5-tetrametilciclopenta-1 ,3-dienocarboxílico; Baldovini et al. Phytochemistry 2005, 66, 1651-1655). La principal diferencia observada fue la aparición de una nueva señal característica de un grupo metoxilo (δ H 3.74 y δ C 50.7) que permitió asignar a este compuesto la estructura del correspondiente metil éster (3a): metil éster del ácido 3,4,5,5-tetrametil-ciclopenta-1 ,3-dienocarboxílico. Metil éster del ácido 3,4,5,5-tetrametil-ciclopenta-1 ,3-dienocarboxílico (3a). Para datos 1 H NMR (CDCI3, 500 MHz) ver Tabla 1 ; para datos 13C NMR (CDCI3, 125 MHz) ver Tabla 1 ; HREIMS m/z 180.1 144 [M]+ (calculado para Cn H1602, 180.1150). EIMS 70 eV m/z (reí. int.): 180 [M]+ (13), 165 (47), 157 (33), 137 (39), 125 (59), 107(38), 99(61), 91 (74), 71 (82).
Adicionalmente los compuestos 3 y 3a estuvieron presentes en el producto de extracción (EO).
Compuesto (10). Se aisló a partir del extracto hexánico (Hx). Su fórmula molecular se determinó como C9H1303 ([M+H]+169.0861) por espectometría de masas de alta resolución. El espectro IR presentó bandas de absorción a vmax. 1783, 1737, 1052 debido a un grupo CO-O-CO. En el espectro de 1 H-RMN (ver Tabla 1) se observaron señales de dos grupos metilos (δ 1.98 y 1.97) sobre un doble enlace acoplados entre sí, y la de un gem-dimetilo a δ 1.49 (s, 6H). Los datos de 13C-RMN (ver Tabla 1) mostraron la presencia de cuatro grupos metilos (δ 13.2, 15.3, 25.6 y 25.6), un doble enlace tetrasubstituido (δ 1 19.7 y 156.1), dos grupos carbonilos (δ 160.8 y 172.3) y un átomo de carbono cuaternario (δ 44.5). Sus datos bidimensionales de RMN, y el patrón de fragmentación observado en su espectro de masas de alta resolución que indica la presencia de un anhídrido (ver Tabla 1), permitió identificar el compuesto (10) como el 3,3,4,5-tetrametilpiran-2,6-diona.
3,3,4,5-Tetrametilpiran-2,6-diona (10). IR (film) vmax 2925,1783, 1737, 1380, 1334, 1234, 1 163, 1052 cm"1 ; para datos 1 H NMR (CDCI3, 500 MHz) ver Tabla 1 ; para datos 13C NMR (CDCI3, 125 MHz) ver Tabla 1 ; HREIMS m/z 169.0861 [M + H]+ (calculado para C9H1303, 169.0865). EIMS 70 eV m/z (reí. int.): 169 [M+1]+ (1 1), 124 (66), 123 (20), 109 (60), 96 (9), 81 (100), 79 (12), 53 (12).
Adicionalmente, el compuesto (10) estuvo presente en los productos de extracción (EO), (OEO), (OEI), (WR0) y (WRI). Compuesto (12). El fraccionamiento del extracto hexánico (Hx) permitió el aislamiento de un nuevo necrodano con una fórmula molecular Ci0H14O2. Su espectro de IR mostró bandas de absorciones características de un grupo hidroxilo (3427 cm"1) y de un grupo carbonilo (3427cnT1). El grupo hidroxilo corresponde a un alcohol primario como muestran las señales en sus espectros de 1 H y 13C RMN, a δΗ 4,42 s (2H) y δ0 56.1 , respectivamente. Otras señales observadas en su espectro de RMN de 1 H (ver Tabla 1) fueron la de un singulete a δ 1.25 (6H), debido a dos grupos metilo, un metilo sobre un doble enlace a δ 2.02 (3H), y la de dos grupos metilenos, uno de ellos oxigenado a δ 4.42 s (2H) y el otro de un enlace olefínico exocíclico a δ 5.34 s (1 H) y 6.04 s (1 H). Su espectro de 13C RMN (ver Tabla 1) confirmó la presencia de estos carbonos en un esqueleto necrodano y mostró además las señales de dos carbonos cuaternarios, uno de ellos correspondiente a un grupo carbonilo a 196.0 δ. El estudio de las correlaciones en los espectros bidimensionales de HMBC y NOESY permitió determinar la disposición espacial de cada sustituyente en el anillo e identificar el compuesto (12) como el 2-(hidroximetil)- 3,4,4-trimetil-5-metilenociclopent-2-enona.
2-(Hidroximetil)-3,4,4-trimetil-5-metilenociclopent-2-enona (12): IR (film) vmax 3421 , 2962, 2928, 2870, 1694, 1684, 1652, 1634, 1456, 1385, 1242, 1036 cm"1para datos 1 H NMR (CDCI3, 500 MHz) ver Tabla 1 ; para datos 13C NMR (CDCI3, 125 MHz) ver Tabla 1 ; HREIMS m/z 166.0991 [M]+ (calculado para Ci0H14O2, 166.0994). ; EIMS 70 eV m/z (reí. int): 166 [M+] (76), 151 (100), 149 (21), 137 (30), 135 (29), 123 (54), 105 (26), 95 (35), 91 (27), 79 (25), 67 (37), 59 (16).
Adicionalmente, el compuesto (12) estuvo presente en los productos de extracción (EO), (EtOH), (OE0) y (WR0).
Compuestos (4), (5), (6), (7) y (8)
El fraccionamiento del extracto hexánico (Hx) y la comparación de los datos espectroscópicos con los disponibles en distintas publicaciones permitió la identificación de los compuestos (4) (Baldovini et al. Phytochemistry 2005, 66, 1651-1655), (5) (Staerk et al. J. Nat. Prod. 2004, 67, 799-805.), alcanfor (6) (Barrero et al. J. Essent. Oil Res. 2005, 17, 166-168) los ácidos triterpénicos tormentico (7) (Numata et al. Chem. Pharm. Bull. 1989, 37, 648-651.) y ursolico (8) (Numata et al. Chem. Pharm. Bull. 1989, 37, 648-651.; Seo et al. J. Am. Chem. Soc. 1981 , 103, 2075-2080.).
Adicionalmente, el compuesto (4) estuvo presente en los productos de extracción (EO) y (OE0), el compuesto (5) en los productos de extracción (EtOH), (OE0) y (WRII), el compuesto (6) en los productos de extracción (EO), (OE0) y los compuestos (7) y (8) en el producto de extracción (EtOH). Compuesto (9). A partir del extracto etanólico, el ácido rosmarínico (9) se identificó dentro una mezcla de polifenoles como el componente principal (Kuhnt et al. Phytochemistry 1994, 36, 485-489.). Compuesto (11 ). Se aisló a partir del extracto hexánico (Hx). Los datos 1 H RMN del compuesto (1 1) (ver Tabla 2) mostraron tres señales de tres grupos metilos a (δ 1 ,24, 1 ,29, y 1 ,34), un metileno (δ 1 ,96 (1 H) y 1 ,87 (1 H)), y cuatro metinos (δ 2,35 m, 3,87, 5,75 y 5,93), el primero asociado con un átomo de carbono terciario, el segundo a un carbono oxigenado y los dos restantes a un enlace doble. Sus datos 13C RMN (ver Tabla 2) confirmaron la presencia de un enlace doble sustituido (δ 129,5 y 133,5), dos metinos (δ 42,7 y 73,3) (uno oxigenado), tres grupos metilos (δ 24.1 , 26.9 y 28.3), un metileno (δ 27.4) y dos carbonos cuaternarios oxigenados (δ 69,8, 72,7). Por lo que se propuso la estructura del compuesto
(1 1) como: (11 ): [a]D = -15,7 (c0,28; CHCI3); para datos 1 H NMR (CDCI3, 500 MHz) ver Tabla 2; para datos 13C NMR (CDCI3, 125 MHz) ver Tabla 2; ESI m/z 209 [M + Na]+. EIMS 70 eV m/z (reí. int): 168 [M+-H20] (2), 153 (4), 135 (4), 1 10 (94), 109 (55), 107 (11), 95 (77), 91 (12), 81
(12) , 67 (20). Tabla 2. Datos espectroscópicos de 1H y 13C RMN del compuesto (11 ). Las constantes de acoplamiento, j, se representan entre paréntesis.
Átomo (n°) 1 H 13C COSY HMBC
1 3.87 dd (6.15, 2.68) 73.3 1 ,87 C-2, C-3, C-5, C-8
2 69.8
3 5.76 ddd (10.2 0, 2. 20, 1.1) 133.5 2,35 C-1 , C-5, C-8
4 5.93 dd (10.20, 2.68) 129.5 2,35, 5,75 C-2, C-5, C-6
5 2.35 m 42.7 1 ,96 C-3, C-4, C-6, C-7
6 β 1.96 dd (14.0, 8.04, 3.00)
27.4 C-1 , C-2, C-4, C-5
6 α 1.88 dt (14.0, 7.0,6.9)
7 72.7
8 1.34 s 24.1 C-1 , C-2, C-3
9 1.24 s 26.9 C-5, C-7, C-10
10 1.29 s 28.3 C-5, C-7, C-9 Adicionalmente, el compuesto (11) estuvo presente en los productos de extracción (OEI), (WRO), (WRI), (WRII) y (WRLII).
A modo de resumen se incluye la Tabla 3 que identifica la presencia de los compuestos (1) a (12) en los distintos productos de extracción.
El alcanfor (6) fue el mayor componente de los compuestos de extracción (EO), (H) y (OE0), seguido por el 5-metileno-2,3,4,4-tetrametilciclopenten-2-enona (4). El extracto (Hx) (GC-MS y LC-MS) también contuvo al compuesto (1), mayores cantidades del compuesto (2) que el producto de extracción (EO) y cadineno (5). El producto de extracción (EtOH) incluyó los ácidos tormentico (7) y ursolico (8), los compuesto (2), (1) y el ácido rosmarinico (9).
Tabla 3. Composición química de los productos de extracción de L. luisieri.
Nomenclatura de los productos de extracción según Ejemplos 2 y 3; GCMS: cromatografía de masas; LCMS: cromatografía líquida; tr: trazas
Figure imgf000027_0001
La especificidad de los productos de extracción que se incluyen dentro del ámbito de la invención se diferencian cualitativa y cuantitativamente de extractos de L. luiseri conocidos en el estado de la técnica. Así por ejemplo, estudios de extractos obtenidos con la misma población salvaje parental (Julio et al. Ind. Crops Prod. 2014, 58, 25-30) registraron para el aceite esencial mayores cantidades relativas de alcanfor (6) (74%), compuesto (4) (53%) y acetato del trans-a-necrodilo (8.2%) que el (EO) y el cadineno (5) como el componente mayoritario del extracto etanólico. También se han descrito para poblaciones salvajes de Toledo (González-Coloma et al. Biochem. Sys. Ecol. 2006, 34, 609-616.) y del oeste de la península ibérica cultivadas durante dos años (González-Coloma et al. Biochem. I Sys. Ecol. 2011 , 39, 1-8) ricas en alcanfor (6).
Ejemplo 5. Actividad fitotóxica
Los experimentos se realizaron con semillas de Lactuca sativa cv Teresa y Lolium perenne tal y como se describe en Martín et al. (Ind. Crop. Prod. 2011 , 34, 1615— 1621). Se utilizaron papeles de filtro de 2.5 cm de diámetro con 20 de muestra (10 μg/μL para extractos y 5 μς/μί para compuestos puros) y se colocaron en placas de 12 pocilios (Falcorí). Se añadieron 500 μΙ_ de H20 y 10 semillas en cada pocilio y cuatro replicas por muestra (Lactuca o Lolium previamente remojadas durante 12 h con agua destilada). Las placas cubiertas fueron colocadas en una cámara de crecimiento de plantas (22 °C ± 1 , 70% HR, 16:8 L:0). La germinación fue monitorizada durante 6 días y la longitud de la raíz y de la parte aérea medidas al final del experimento (25 plantas seleccionadas aleatoriamente por cada experimento y digitalizadas con la aplicación ImageJ 1.43, http//rsb.info.nih.gov./ij/). Un análisis no paramétrico de varianza (ANOVA) fue aplicado a los datos de longitud de las raíces. Como control positivo se incluyó carvona (5 μg/μL).
Los ensayos se realizaron tanto con los productos de extracción, como con los compuestos aislados en dichos productos y que se describen en los ejemplos anteriores.
Productos de extracción
La Tabla 4 muestra la actividad fitotóxica de los diferentes productos de extracción en especies de plantas herbáceas. Con respecto a L. sativa la germinación se vio afectada de forma especialmente significativa con (WRO), con el (EtOH) y también con el (WRII) durante los distintos tiempos monitorizados. Con respecto al crecimiento radicular el (EO), (WRO) y (WRI) fueron especialmente efectivos. Con respecto a la especie L. perenne la germinación se vio afectada especialmente por los productos de extracción (Hx), (WRO), (WRI) y (OEI). Con respecto al crecimiento de la parte aérea prácticamente todos los productos de extracción fueron efectivos (excepto WRIIL y OEI), siéndolo especialmente (WRO) y (WRI). Con respecto al crecimiento radicular también prácticamente todos los productos de extracción fueron efectivos con la excepción de (WRIIL) y (OEI), siéndolo especialmente (WRO) y (WRI).
Tabla 4. Efectos sobre los porcentajes de germinación, de crecimiento radicular y de crecimiento de la parte aérea en semillas de L. sativa y L. perenne 168 horas después de haber aplicado distintos productos de extracción de L. luiseri.
Nomenclatura de los productos de extracción según ejemplos 2 y 3; h: horas.
mg/
Lactuca sativa Lolium perenne
Product mL
os
de Crecimie
% Germinación (%C) Germinación (%C) Crecimiento (%C) Extraed nto (%C)
ón
Parte
24 h 48 h 168 h raíz 72 h 168 h raíz aérea
10
46.4 ± 92.3 ± 29.4 ± 50.0 + 68.7 ±
mg/ 100 ± 0.0 100 ± 0 59.6 ± 5.0 13.1 4.8 2.3* 18.1 7.0
mi
EO
5
26.47 ± 80.00 ± 100.00 ± 122.07 ± 64.29 ± 100.00 ± 87.09 ± 87.78 ± mg/
3.6 9.1 0.0 12.6 33.8 7.7 1 1 .1 1 1 .6 mi
10
2.6 ± 22.5 ± 99.4 ± 68.6 ±
mg/ 3.4 ± 3.5 80.7 ± 9.5
2.6 7.5 13.6 10.1
mi
EtOH
5
29.41 ± 75.00 ± 100.00 ± 104.26 ± 50.00 ± 103.33 ± 98.69 ± 103.00 ± mg/
10.4 6.5 0.0 9.8 1 1 .7 9.3 15.6 16.4 mi
10
30.6 ± 97.3 ± 146.1 ± 56.3 ± 83.9 ± 83.4 ± 85.5 ± mg/ 2.9 ± 2.9
7.4 1 1 .0 13.5 16.6 12.6 1 1 .4 18.3 mi
Hx
5
72.2 ± 105.4 ± 131 .2 ± 57.14 ± 106.67 ± 89.77 ± 103.42 ± mg/ 5.9 ± 3.4
15.1 9.0 7.3 19.6 6.8 15.5 17.4 mi
100 0.0 ± 0.0 ±
0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
% 0.0 0.0
WRO
0.0 ± 0.0 ±
50% 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
0.0 0.0 0.0 ± 12.5 ± 21 .0 ± 0.0 ±
25% 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
0.0 4.8 10.8 0.0
12.5 16.0 ± 54.3 ± 38.8 ±
61 .5 ± 8.7
% 6.6 12.7 6.9
6.25 8.0 ± 71 .4 ± 54.0 ±
64.8 ± 7.1
% 4.7 6.8 7.1
100 100.0 ± 100.0 ± 100.0 ± 16.9 ± 0.0 ± 36.4 ± 46.6 ± 36.3 ±
% 0.0 0.0 0.0 5.1 0.0 8.6 13.9 10.2
70.0 ± 87.5 ± 95.0 ± 96.1 ± 0.0 ± 76.5 ± 64.9 ±
WRI 50% 58.3 ± 9.2
9.1 7.5 5.0 8.9 0.0 10.9 10.4
72.5 ± 97.5 ± 100.0 ± 108.2 ± 33.3 ± 79.4 ± 68.9 ± 75.1 ±
25%
4.8 2.5 0.0 1 1 .3 24.0 1 1 .0 10.2 1 1 .1
100 35.9 ± 40.0 ± 45.0 ± 98.9 ± 0.0 ± 13.8 ± 26.7 ±
28.6 ± 8.5
% 12.2 12.9 9.6 8.6 0.0 5.7 7.2
58.3 ± 76.5 ± 74.5 ± 82.2 ±
WRII 50%
29.5 8.5 10.4 1 1 .5
41 .7 ± 76.5 ± 86.3 ± 86.0 ±
25%
16.9 12.8 1 1 .9 12.4
10
94.9 ± 92.5 ± 100.0 ± 121 .2 ± 88.9 ± 90.6 ± 36.3 ±
mg/ 38.9 ± 4.3 9.1 8.5 0.0 10.9 64.9 15.2 4.3
ml
5
50.0 ± 91 .2 ± 87.7 ± 138.4 ±
WRI IL mg/
18.0 12.8 1 1 .2 18.6 ml
2.5
66.7 ± 88.2 ± 106.2 ± 139.2 ± mg/
28.7 1 1 .8 10.3 16.2 ml
10
100.0 ± 122.4 ± 22.2 ± 93.8 ± 84.9 ± 90.9 ±
OE0 mg/
0.0 15.0 19.1 10.4 10.3 10.2 ml
10
92.5 ± 92.5 ± 97.5 ± 1 10.7 ± 95.2 ± 76.5 ± 103.0 ± 100.3 ±
OEI mg/
4.8 4.8 2.5 10.7 18.0 1 1 .6 14.0 15.4 ml
Compuestos aislados
Con respecto al comportamiento de L. sativa (ver Tabla 5) los compuestos (3a) y (10) fueron los que obtuvieron los mejores resultados en cuanto a germinación tras 168 horas, aunque fue el compuesto (3a) el más efectivo a la dosis más alta ensayada. Algunos compuestos redujeron la germinación a las 24h (24-95% de germinación (2), (3), (5) y (9)). Con respecto al crecimiento radicular los compuestos (3a), (10) y (1 1) redujeron el crecimiento de la raíz (38-20% de reducción respectivamente).
Tabla 5. Efectos sobre los porcentajes de germinación y crecimiento radicular en semillas de L. sativa 168 horas después de haber aplicado distintos compuestos químicos presentes en los productos de extracción de L. luiseri. %C: porcentaje de crecimiento respecto al control; h: horas. Concentración Lactuca sativa
Germinación (%C)
Compuesto μ9/αϋ500 Crecimiento de la raíz (%C)
24 h 168 h
100 84.4 ±5.3 100.0 ±0.0 94.3 ±7.2
1
50 115.6 ±8.4 100.0 ±0.0 102.2 ±7.5
100 65.6 ±6.9 100.0 ±0.0 88.9 ±7.6
2
50 87.5 ± 15.9 100.0 ±0.0 101.7 ± 8.7
100 24.3 ±9.3 100.0 ±0.0 108.4 ±8.2
3 50 37.8 ±9.6 100.0 ±0.0 104.9 ± 10.4
25 78.4 ± 10.1 100.0 ±0.0 99.7 ±7.0
100 0.0 ±0.0 67.5 ±6.3 97.8 ± 15.1
3a
50 0.0 ±0.0 102.6 ±6.0 81.3 ±9.5
4 100 86.7 ±9.3 100 ±0.0 124.6 ± 9.6
100 0.0 ±0.0 92.5 ±2.5 61.6 ±3.9
10 50 5.0 ±2.9 95.0 ±2.9 74.4 ± 5.2
25 0.0 ±0.0 100.0 ±6.1 56.9 ±6.0
100 87.5 ±5.1 92.5 ±4.8 77.1 ±3.7
11
50 96.9 ±7.9 100 ±0.0 91.4 ±4.5
12 100 117.6 ± 8.9 108.1 ±8.8 123.2 ±7.9
100 3.3 ±3.3 100 ±0.0 151.9 ± 13.8
5
50 9.4 ±6.0 100.0 ±6.1 144.8 ± 16.2
6 100 100.0 ±0.0 100.0 ±0.0 116.3 ± 8.7
8 100 100.0 ±0.0 100.0 ±0.0 107.0 ±3.1
9 100 45.5 ±7.7 100.0 ±0.0 143.9 ±8.2
Carvona 100 27.3 ± 13.5 100.0 ±0.0 95.3 ±5.4
Con respecto a otros compuestos conocidos identificados en los productos de extracción, el ácido rosmarinico (9) redujo moderadamente la germinación a las 24 horas, aunque a partir de ese momento el efecto desapareció. Por su parte el ácido ursólico (8) no fue fitotóxico.
En general el efecto fitotóxico de los distintos compuestos sobre L perenne fue más apreciable (ver Tabla 6). De este modo la germinación se redujo especialmente tras 168 horas con el compuesto (2), pero también con algunas dosis de los compuestos (1), (10), (4) y (5). Con respecto al crecimiento radicular fue especialmente importante el efecto fitotóxico de los compuestos (1), (2), (3), (10), (12) y (5). Con respecto al crecimiento de las hojas los compuestos (1), (2), (3), (10) y (5) son los que obtuvieron los mejores resultados.
Tabla 6. Efectos sobre los porcentajes de germinación, de crecimiento radicular y de crecimiento de la parte aérea en semillas de L. perenne 168 horas después
Figure imgf000032_0001
de haber aplicado distintos compuestos químicos presentes en los productos de extracción de L. luiseri. %C: porcentaje de crecimiento respecto al control; h: horas. Un producto natural como la carvona utilizado de forma habitual como fitotóxico, presentó en las mismas condiciones de estudio resultados mucho más discretos que los obtenidos con los productos de extracción o con algunos de los compuestos identificados en los mismos.
Aunque los compuestos aislados presentaron actividad fitotóxica, la comparación de sus resultados con los de los productos de extracción que los comprenden indica un efecto sinérgico de los mismos al estar combinados en los productos de extracción (EO), (EtOH) y (WRO). Adicionalmente, los nuevos necrodanos descritos presentaron una actividad fitotóxica que nunca se ha descrito en este tipo de compuestos.
Ejemplo 6. Actividad nematicida
La población de nemátodos (Meloidogyne javanica) se mantuvo en cámaras de crecimiento sobre plantas de tomate (Lycopersicon esculentum var. Marmande) a 25 °C y una humedad relativa del 50%. Los ensayos se realizaron según la metodología descrita para M. javanica (Andrés et al. Phytochem. Rev. 2012, 11 , 371-390) utilizando la fase biológica de juveniles infectivos (J2). La actividad de los productos de extracción obtenidos y de los compuestos con actividad biocida se cuantificó a una concentración final por pocilio de 1.0/ 0.5 mg/ml, respectivamente. Cada tratamiento se repitió cuatro veces y la actividad nematicida se determinó a partir del porcentaje de juveniles infectivos muertos después de 72h. En los casos en los que se determinó una tasa de mortalidad > 99% se realizaron experimentos de dosis-respuesta. Productos de extracción
La Tabla 7 muestra los efectos nematicidas de los diferentes productos de extracción en el nematodo formador de nodulos M. javanica. El hidrolato (WRO) presentó una elevada actividad nematicida mientras que los productos de extracción (EO) y (EtOH) no fueron activos. El fraccionamiento biodirigido del (WRO) demostró que los agentes nematicidas estaban en las fracciones acuosas ácidas (WRI) y (WRII) que produjeron una alta mortalidad de J2 hasta diluciones del 25%. Los procesos de liofilización, neutralización o neutralización-liofilización de WRII dieron productos de extracción inactivos (WRIIL, WRIIN y WRIINL) sin embargo la acidificación de (WRIINL) dio un extracto activo lo que sugiere que los componentes activos se regeneran cuando se protonan sus sales.
Tabla 7. Porcentaje de juveniles infectivos (J2) muertos de Meloidogine javanica 72 horas posteriores tras la aplicación de productos de extracción de L. luiseri. aLos datos se presentan corregidos de acuerdo a la fórmula de Sheider-Orelli's. Nomenclatura de los productos de extracción según ejemplos 2 y 3.
Concentración Actividad Nematicida
Extracto PH
mg/mL % Mortalidad J2 a
EO 1.0 mg/ml 8.99 ± 1.02
EtOH 1.0 mg/ml 17.33 ± 2.23
Hx 1.0 mg/ml 2.84 ± 1.29
100% 100 ± 0
50% 53.5 ± 26.9
WRO 3.2 25% 48.9 ± 3.9
12.5% 2.2 ± 0.6
6.25% 3.1 ± 0.7
100% 100 ± 0.0
50% 93 ± 1.2
WRI 3.2 25% 91.3 ± 1.3
12.5% 48.3 ± 3.9
6.25% 3.6 ± 1.7
100% 100 ± 0.0
50% 95.7 ± 0.3
WRII 3.67 25% 94 ± 1.7
12.5% 32.6 ± 3.8
6.25% 2.8 ± 1.3
100% 100 ± 0.0
50% 88.8 ± 4.0
WRIINL 3.68 25% 55.6 ± 2.7
12.5% 2.3 ± 0.7
6.25% 0.72 ± 0.4
OE0 1.0 mg/ml 7.4 ± 1.4
OEI 1.0 mg/ml 6.5 ± 0.9 Compuestos aislados
En la Tabla 8 se muestran los efectos nematicidas de los compuestos aislados en el nematodo formador de nodulos M. javanica. Los compuestos (3) y (10) presentaron actividad nematicida (> 50% de mortalidad de J2), aunque el compuesto (10) fue el más efectivo induciendo una tasa de mortalidad de J2 del 88%.
Tabla 8. Porcentaje de juveniles infectivos (J2) muertos de Meloidogine javanica 72 horas posteriores tras la aplicación de varios compuestos comprendidos en los productos de extracción de L. luiseri: aLos datos se presentan corregidos de acuerdo a la fórmula de Sheider-Orelli's. bDosis a la que muere el 90% de la población (J2).
Figure imgf000035_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Producto de extracción de material vegetal de la especie Lavandula luiseiri actividad biocida, caracterizado por que comprende al compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000036_0001
(I)
o un isómero, o una sal o un solvato del mismo.
2.- Producto de extracción según la reivindicación 1, caracterizado por que adicionalmente comprende al menos otro compuesto que se elige de entre los siguientes:
Figure imgf000036_0002
(II) (III) (IV) (V)
Figure imgf000036_0003
(VI) (VII) (VIII) (IX)
Figure imgf000037_0001
(X) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos.
3.- Producto de extracción según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que se selecciona de entre un extracto hexánico, un aceite esencial, un hidrolato o fracciones derivadas del hidrolato.
4.- Producto de extracción según la reivindicación 3, caracterizado por que selecciona de entre el extracto hexánico (Hx), el aceite esencial (EO), el hidrolato (WRO), la fracción orgánica (OE0), el hidrolato (WRI) o la fracción orgánica (OEI).
5. - Producto de extracción según la reivindicación 1 , caracterizado por que es el compuesto de fórmula general (I) tal y como se define en la reivindicación 1 , o un isómero, o una sal o un solvato del mismo.
6. - Procedimiento de obtención del producto de extracción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende una etapa de extracción de material vegetal de Lavandula luiseri con al menos un solvente hasta obtener un producto de extracción.
7. - Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por que el material vegetal son flores y/o hojas y el al menos un solvente se selecciona de entre un solvente acuoso y/o un solvente orgánico.
8. - Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por el al menos un solvente es agua, el método de extracción es hidrodestilado con aparato Clevenger o arrastre de vapor, y se obtiene como producto de extracción un aceite esencial, un hidrolato o fracciones derivadas del hidrolato.
9.- Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que el al menos un solvente es hexano, el método de extracción se lleva a cabo por el método Soxhiet, y se obtiene como producto de extracción una fracción hexánica.
10.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por que alternativamente comprende una etapa adicional de aislamiento del compuesto de fórmula (I) a partir del producto de extracción de la primera etapa del procedimiento.
1 1.- Composición biocida caracterizada por que comprende el producto de extracción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o a al menos un compuesto que se selecciona de entre los compuestos II, III, IV, V, VI I y IX o un isómero, o una sal o un solvato de los mismos, tal y como se definen en la reivindicación 2, ya sea de forma aislada o en combinación.
12- Uso de la composición biocida según la reivindicación 1 1 , de un producto de extracción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de al menos uno de los compuesto de fórmula general II, III, IV, V, VII y IX o un isómero, o una sal o un solvato de los mismos, tal y como se describen en la reivindicación 2, ya sea de forma aislada o en combinación, contra al menos un factor biótico que afecta al desarrollo de plantas.
13.- Uso según la reivindicación 12, caracterizado por que al menos un factor biótico que afecta al desarrollo de plantas, se selecciona de entre nematodos y malas hierbas.
14.- Uso según la reivindicación 13, caracterizado por que el nematodo es un nematodo formador de nodulos de las raíces y por que las malas hierbas pertenecen al género Lolium.
15. - Uso según la reivindicación 14, caracterizado por que el nematodo formador de nodulos de las raíces es de la especie Meloidogine javanica y por que las malas hierbas pertenecen a la especie Lolium perenne.
16. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado por que el producto de extracción es (WR0) y es activo contra nematodos y malas hierbas.
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