ES2588210A1 - PRODUCTO BIOCIDA EXTRAIDO DE MATERIAL VEGETAL DE Lavandula Luiseri, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y USO DEL MISMO - Google Patents
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Abstract
Producto biocida extraído de material vegetal de Lavándula luiseri. Procedimiento de obtención y uso del mismo. La presente invención se refiere a un nuevo producto biocida obtenido a partir de material vegetal de la planta Lavándula luiseri que se caracteriza por comprender a un compuesto bioactivo de fórmula (I) y por presentar una importante actividad contra nematodos y/o malas hierbas, lo que lo convierte en una alternativa a los productos de síntesis para el tratamiento de factores bióticos que afectan al desarrollo de la vegetación. La invención también incluye el procedimiento de obtención y el uso del producto biocida, tanto directamente, como a través de una composición biocida que lo comprende.
Description
DESCRIPCIÓN
PRODUCTO BIOCIDA EXTRAIDO DE MATERIAL VEGETAL DE Lavandula Luiseri, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y USO DEL MISMO
La invención se sitúa dentro del campo de la agricultura, y más concretamente, en el sector de los biocidas que comprenden compuestos extraídos de plantas. Se propone un producto de extracción con actividad biocida que se aísla a partir de material vegetal de plantas de la especie Lavandula luisieri y que se caracteriza por comprender un nuevo compuesto de fórmula (I). La invención también tiene que ver con el procedimiento de obtención de dicho producto de extracción y con su uso para el control de factores bióticos perjudiciales para un cultivo, ya sea directamente o a través de una composición biocida que lo comprenda.
En los últimos años los tratamientos para el control de factores bióticos que afectan al correcto desarrollo de las especies vegetales se han basado en el uso de productos biocidas específicos obtenidos por síntesis química. Sin embargo, el coste de obtención de estos productos de síntesis, junto con los problemas medioambientales que su uso continuado han ocasionado, así como los problemas de resistencias, han propiciado un nuevo marco regulatorio que se materializa en la restricción del uso de estos productos químicos (ver por ejemplo el Reglamento europeo (CE) Nº 1107/2009) que limita drásticamente el número de materias activas y la disponibilidad de los productos fitosanitarios destinados al control de dichos factores.
Resulta pues necesaria, la búsqueda y desarrollo de nuevos compuestos bioactivos alternativos a los de síntesis química, que sean eficaces y menos tóxicos para el medio ambiente. Una posible fuente para la obtención de estos nuevos compuestos son las plantas, ya que tal y como recoge el estado de la técnica, comprenden una muy amplia y variable cantidad de compuestos volátiles bioactivos (CPVs).
Lavandula luisieri (Rozeira) Riv.-Mart. (Rivas-Martínez. Lazaroa 1979, 1, 110) es un pequeño arbusto aromático endémico de la Península Ibérica y común en las regiones semiáridas del sur de Portugal y el suroeste de España (Delgado et al . Plant G enet. Re sour. 2010, 8, 82-90). Pertenece a la sección Stoechas Ging. de la familia Lamiaceae (Rozeira. Linn. Brot. 1949, 28, 1-84) que incluye Lavandula stoechas L., Lavandula pedunculata (Mill.) Cav. y Lavandula viridis L'ella. (Upson y Andrews. Royal Botanic Gardens Kew (Ed.) The Genus Lavandula. Timber Press, Portland, Oregon, 2004, 107-248). Esta planta es característica del sintaxón Cisto-Lavanduletae, una clase que incluye comunidades de matorrales de los pisos termo a supra Mediterráneos, semiáridos, secos y subhúmedos secundarios, que producen compuestos aromáticos (Rivas-Martínez et al. Itinera Geobotanica 2002, 15, 5-432).
Se ha identificado una alta variabilidad inter-poblacional de CPVs presentes en aceites esenciales obtenidos a partir de material vegetal de Lavandula luisieri (ver por ejemplo Baldovini et al . Phytochemistry 2005, 66, 1651-1655; González-Coloma et al. Biochemical s ystematics and ecolo gy 2011, 39, 1-8; o Zuzarte et al . Food Ch emistry 2012, 135, 1505-1510). Dicha variabilidad se relaciona con las diferencias genéticas entre poblaciones de la misma especie, variabilidad que es todavía más acusada cuando se comparan compuestos presentes en distintas especies.
En cuanto a la bioactividad de los CPVs presentes en aceites esenciales u otros extractos obtenidos a partir de material vegetal de Lavandulas se ha identificado:
-actividad antifúngica del aceite esencial de Lavandula luis ieri (Zuzarte et al . Food Chemistry 2012, 135, 1505-1510); y
-actividad fitotóxica de extractos de tallo, hojas y flores de varias especies de Lavandula en el crecimiento de la raíz de Ray-grass anual (Lolium rigidu m, ARG), siendo especialmente destacable para el extracto de tallo y hojas de la especie Lavandula intermedia cv. Grosso con una inhibición del crecimiento de hasta el 94% (Haigh et al. Journal of Chemical Ecology 2009, 35, 1129-1136); o de aceites esenciales de Lavandula stoechas y Lavandula angustifolia frente a Amaranthus retro flexus y Portulaca olerac ea e n el c ultivo de tomate ( Argypoulos et al . Allelopathy Journal 2008, 22, 69-78).
Por otra parte, no se han encontrado efectos significativos en cuanto a actividad nematicida al utilizar aceites esenciales de distintas especies del género Lavandalula, como por ejemplo Lavandula officinalis, Lavandula angustifolia, Lavandula intermedia o Lavandula hybrida contra
5 el nematodo del pino (Bursaphelenchus xylophilus) o nematodos formadores de nódulos de raíz (Meloidogyne spp.) ver Andrés et al. (Phytochemistry Reviews 2012, 11, 371-390); ni tampoco al utilizar aceites esenciales y volátiles de diversas especies como por ejemplo, Lavandula dentata, Lavandula luisieri, Lavandula stoechas o Lavandula viridiris contra el nematodo de la madera del pino ver Barbosa et al. (Journal of Nematology 2010, 42, 8-16).
10
La presente invención se relaciona en un primer aspecto con un producto de extracción de material vegetal de la especie Lavandula luis eiri con actividad biocida, caracterizado por que
15 comprende al compuesto de fórmula (I):
(I)
o un isómero, o una sal o un solvato del mismo.
20 Adicionalmente, el producto de extracción puede comprender al menos otro compuesto que se elige de entre los siguientes:
- 25
-
imagen5
- (II)
- (III) (IV) (V)
- 4
(X)
o un isómero, una sal o un solvato de los mismos.
10 En realizaciones particulares, el producto de extracción se selecciona de entre un extracto hexánico (Hx), un aceite esencial (EO), un hidrolato (WR0), o una fracción orgánica (EO0) y un hidrolato (WRI) obtenidos a partir del hidrolato (WR0).
15 En otra realización particular el producto de extracción es el propio compuesto de fórmula general (I).
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con el procedimiento de obtención del producto de extracción que comprende una etapa de extracción de material vegetal de 20 Lavandula lu iseri con al menos un solvente hasta obtener un producto de extracción que comprenda al compuesto de fórmula (I) o un isómero, o una sal o un solvato del mismo.
Preferentemente, el procedimiento de obtención del producto de extracción utiliza flores y/o hojas como material vegetal y al menos un solvente se selecciona de entre un solvente acuoso 25 o un solvente orgánico.
Alternativamente, el procedimiento de obtención comprende una etapa adicional de aislamiento del compuesto de fórmula (I) a partir del producto de extracción de la etapa anterior.
En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una composición biocida que comprende al producto de extracción.
En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con el uso de la composición biocida, del producto de extracción o de al menos uno de los compuestos de fórmula (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, o una sal o un solvato de los mismos, ya sea de forma aislada o en combinación, contra al menos un factor biótico que afecta al desarrollo de plantas.
Preferentemente el al menos un factor biótico que afecta al desarrollo de plantas, se selecciona de entre nematodos que preferentemente son nematodos formadores de nódulos de las raíces y más preferentemente pertenecen a la especie Meloidogine javanica y de malas hierbas que pertenecen al género Lolium y más preferentemente pertenecen a la especie Lolium perenne.
Para algunos de los compuestos incluidos en el ámbito del presente documento de memoria de invención, se utiliza indistintamente una doble nomenclatura, así, compuesto (I) y compuesto
(10) se refieren al mismo compuesto tal y como lo hacen compuesto (II) y compuesto (1); compuesto (III) y compuesto (2); compuesto (IV) y compuesto (3); compuesto (V) y compuesto (3a); compuesto (VI) y compuesto (4); compuesto (VII) y compuesto (5); compuesto (VIII) y compuesto (6); compuesto (IX) y compuesto (11); y compuesto (X) y compuesto (12).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema de obtención de distintos productos de extracción.
El problema técnico que resuelve la presente invención es la búsqueda de nuevos principios activos naturales con una alta actividad biocida que se extraigan de material vegetal y que puedan ser utilizados para el control de factores bióticos que afectan a cultivos, y que constituyan de esa forma, una alternativa efectiva y respetuosa con el medio ambiente con respecto a los productos biocidas convencionales de síntesis química.
La presente invención tiene su origen en un producto de extracción que comprende al compuesto químico de fórmula (I), que se extrae a partir de material vegetal de plantas de la especie Lavandula luisieri (ver ejemplos 1 a 4) y que muestra una importante actividad fitocida contra Lactuca s ativa y Loliu m p erenne y una importante actividad nematicida contra Meloidogyne javanica (ver ejemplos 5 y 6). Adicionalmente al efecto biocida del compuesto de fórmula (I), los inventores han descubierto que otros compuestos presentes en el producto de extracción (compuestos (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX)) también presentan actividad fitocida y/o nematicida y que cuando se combinan entre sí o con el compuesto de fórmula (I), pueden proporcionar un efecto sinérgico que se materializa en una mayor actividad biocida, que hace factible el uso del producto de extracción o incluso de los compuestos aislados para el tratamiento de factores bióticos perjudiciales para el correcto desarrollo de cultivos.
Las principales ventajas técnicas de los productos de extracción que se incluyen dentro del ámbito de la invención y de su uso para el control de factores bióticos que afectan a cultivos se enumeran a continuación:
-se obtienen de fuentes naturales, por procedimientos sencillos;
- -
- son singularmente efectivos contra nematodos, alcanzando en este caso una efectividad superior al 99% para los productos de extracción (WR0) y (WRI), o para el compuesto de fórmula (I) con un 87%, muy por encima por ejemplo, del producto Abamectina (AVICTA®) que presenta un valor de en torno al 35% en condiciones experimentales similares; y
- -
- son singularmente efectivos contra malas hierbas como el Lolium p erenne, alcanzando en este caso una efectividad sobre germinación superior al 99% en el caso de los productos de extracción (WR0) y (WRI) o para el compuesto de fórmula (I) con un 20% sobre germinación, 97% sobre crecimiento de raíz y 40% sobre crecimiento foliar, valores muy superiores a los obtenidos con un herbicida natural como la carvona (ver Ejemplo 5).
Los autores de la presente invención han identificado un producto de extracción de material vegetal de la especie Lavandula luiseiri que presenta actividad biocida, en adelante producto de extracción de la invención, que se caracteriza por comprender a un compuesto de fórmula (I) y que constituye el primer aspecto de esta invención,
(I)
o un isómero, una sal o un solvato del mismo.
Por “Lavandula lu iseri” se entiende un pequeño arbusto aromático endémico de la Península 10 Ibérica y común en las regiones semiáridas del sur de Portugal y el suroeste de España.
Por “producto de extracción” se entiende cualquier fracción, ya sea líquida o sólida, obtenida directamente tras someter al material vegetal de L. luiseri a una extracción utilizando un solvente adecuado, siempre que comprende al menos al compuesto de fórmula (I). Sin
15 embargo, también se considera como producto de extracción cualquier fracción sucesiva obtenida de la fracción directamente obtenida a partir de material vegetal de L. lu iseri, empleando fraccionamientos, extracciones o aislamientos posteriores y al menos un solvente adecuado, con la condición de que dicho producto comprenda al menos al compuesto de fórmula (I).
20 El producto de extracción de la invención puede comprender al menos otro compuesto, que preferentemente se selecciona de entre los siguientes:
(II) (III) (IV) (V)
(X)
o un isómero, una sal o un solvato de los mismos.
En el ámbito de la presente invención, el término “producto de extracción” puede hacer referencia a una o a varias fracciones, o incluso al compuesto de fórmula (I), dependiendo del contexto.
Preferentemente, el producto de extracción de la invención se selecciona de entre un extracto hexánico obtenido tras una extracción hexánica a partir de material vegetal de L. lu iseri; un aceite esencial que se obtiene tras hidrodestilado con aparato Clevenger o arrastre por vapor a partir de material vegetal de L. lui seri; un hidrolato que se obtiene tras hidrodestilado con aparato Clevenger o arrastre por vapor a partir de material vegetal de L. luiseri; una fracción orgánica y/o un nuevo hidrolato obtenido a través de una extracción con diclorometano (DCM) a partir del hidrolato anterior; o una nueva fracción orgánica obtenida a partir del hidrolato inmediatamente anterior tras elución con metanol (ver Figura 1).
En realizaciones particulares, el producto de extracción de la invención se selecciona de entre el extracto hexánico (Hx), el aceite esencial (EO), el hidrolato (WR0), la fracción orgánica (OE0), el hidrolato (WRI) o la fracción orgánica (OEI) (ver Ejemplos 1 a 4 y Figura 1).
Sucesivos fraccionamientos del producto de extracción hacen que pueda quedar constituido exclusivamente por el compuesto de fórmula (I). Así por ejemplo, en otra realización particular, el producto de extracción es el compuesto de fórmula (I) que se obtiene tras la aplicación de técnicas cromatográficas, sobre cualquier producto de extracción de la invención, como por ejemplo (Hx), (EO), (OE0), (OEI), (WR0) o (WRI).
Tanto el compuesto de fórmula (I) como el resto de compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención, se aíslan o se extraen a través de métodos perfectamente conocidas en el estado de la técnica, como por ejemplo, cromatografía líquida de vacío (VLC), cromatografía en columna (CC) empleando diferentes fases sólidas (Gel de Sílice, Sephadex LH-20) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), eluyéndose con distintos gradientes de polaridad mediante diferentes combinaciones de disolventes orgánicos.
De forma general, todos los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención, es decir, el término isómero también se refiere a cualquier mezcla de isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.
Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales y solvatos aceptables de todos los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención o de cualquier otro compuesto que es capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el presente documento.
Los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos. Los métodos de solvatación se conocen generalmente dentro de la técnica.
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento de obtención del producto de extracción la invención, en adelante procedimiento de obtención de la invención, que comprende una etapa de extracción de material vegetal de Lavandula luiseri con al menos un solvente hasta obtener un producto de extracción.
El procedimiento de la invención puede utilizar cualquier material vegetal de Lavandula luiseri que comprende al compuesto de fórmula (I), preferentemente es material perteneciente a la parte aérea, y más preferentemente son flores y/o hojas.
Los solventes que se utilizan en la etapa de extracción del procedimiento de la invención pueden ser cualquiera de los que habitualmente se utilizan en el estado de la técnica para obtener compuestos volátiles, preferentemente son solventes orgánicos y acuosos.
Ejemplos de solventes orgánicos que se incluyen en el ámbito de la invención son diclorometano, éter terbutílico, etanol y hexano.
En una realización particular del procedimiento de la invención se utiliza agua como solvente y como método de extracción el arrastre por vapor o hidrodestilado con aparato Clevenger.
En otra realización particular del procedimiento de la invención se utiliza un solvente orgánico, preferentemente hexano y como método de extracción se prefiere la extracción Soxhlet.
Preferentemente el procedimiento de extracción de la invención se selecciona de entre una extracción por arrastre de vapor para obtener como producto de extracción un hidrolato y/o un aceite esencial; un hidrodestilado con aparato Clevenger para obtener como producto de extracción un hidrolato y/o un aceite esencial; una extracción hexánica para obtener como producto de extracción un extracto hexánico; una extracción con diclorometano a partir de un hidrolato para obtener una fracción orgánica y/o un nuevo hidrolato; y elución con metanol del anterior hidrolato para dar un nuevo extracto orgánico (ver ejemplos 1 a 4).
Alternativamente, el procedimiento de la invención comprende una etapa adicional para aislar el compuesto de fórmula (I) a partir del producto de extracción de la primera etapa del procedimiento utilizando técnicas cromatográficas.
En otra realización particular, el procedimiento de la invención obtiene el compuesto de fórmula
(I) cuando se aplican técnicas cromatográficas sobre un producto de extracción, que se selecciona de entre (Hx), (EO), (OE0), (OEI), (WR0) y (WRI) (ver Ejemplos 1 a 4 y Figura 1).
Por “actividad biocida” se entiende la capacidad de controlar, a través de diferentes mecanismos de acción, a al menos un factor biótico, y preferentemente a más de uno, que se considere perjudicial para el desarrollo de un cultivo. Dicho control comprende la prevención de la acción o la destrucción directa de dicho factor perjudicial. Ejemplos de factor biótico que afectan al desarrollo de las plantas y que se incluyen en la presente invención son aunque sin limitarse, nematodos y malas hierbas.
Preferentemente, los nematodos que se incluyen en el ámbito de esta invención, son nematodos formadores de nódulos de las raíces (Meloidogyne sp). Un ejemplo de nematodos formadores de nódulos es la especie Meloidogine javanica, polífaga, con capacidad de parasitar más de 3.000 especies de plantas de cultivo, que incluyen cultivos extensivos, hortícolas y frutales, afectando gravemente la producción (Agrios. Plant Pathology , Fifth edit ion, Elsevier/Academic, Amsterdam 2005), y causando pérdidas económicas anuales de miles de millones de euros (Singh et al. OEPP/EPPO Bulletin 2013, 43 (2), 334–374).
Por “mala hierba” se entiende cualquier especie vegetal que crece de forma silvestre y con considerable vigor, en una zona cultivada o controlada por el ser humano.
En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una composición biocida efectiva contra al menos un factor biótico, y preferentemente más de uno, que se considere perjudicial para el desarrollo de un cultivo, en adelante composición biocida de la invención, que comprende al producto de extracción de la invención, o a al menos un compuesto que se selecciona de entre los compuestos (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos, ya sea de forma aislada o en combinación, en adelante composición biocida de la invención.
Como el experto en el estado de la técnica sabrá, los compuestos químicos que se incluyen en este documento, deberían tener la misma funcionalidad con independencia de si su origen es natural o sintético, motivo por el cual dentro del alcance de esta invención se incluye el uso de todos ellos.
Preferentemente la composición biocida de la invención comprende a un producto de extracción que se selecciona de entre el extracto hexánico (Hx), el aceite esencial (EO), el hidrolato (WR0), la fracción orgánica (OE0), el hidrolato (WRI), la fracción orgánica (OEI) o el compuesto de fórmula (I) y más preferentemente el producto de extracción (WRO).
La composición biocida de la invención adicionalmente puede comprender diversos vehículos y agentes que faciliten su conservación, manejo y aplicación.
Como el experto en el estado de la técnica conocerá en la aplicación de fitosanitarios, habitualmente se utilizan vehículos sólidos, vehículos líquidos, vehículos gaseosos, etc., y, si es necesario, agentes tensioactivos y agentes auxiliares para la formulación de composiciones fitosanitarias como, por ejemplo, un aditivo para formular formas tales como concentrados emulsionables, polvos humectables, líquidos fluibles, (v.g., suspensión en agua, emulsión en agua, etc.), polvos, aerosoles, ULV y similares.
Ejemplos de vehículo sólido que se incluyen en el ámbito de la invención son polvos finos o gránulos de arcillas (v.g. arcilla de caolín, tierra de diatomeas, óxido de silicio hidratado sintético, bentonita, arcilla Fubasami, arcilla ácida, etc.), talcos, cerámicas y otros minerales inorgánicos (v.g., sericita, cuarzo, azufre, carbono activo, carbonato cálcico, sílice hidratada, etc.), fertilizantes comerciales (v.g., sulfato amónico, fosfato amónico, nitrato amónico, urea, cloruro amónico, etc.) y similares.
Ejemplos de vehículo líquido que se incluyen en el ámbito de la invención son agua, alcoholes (v.g., metanol, etanol, etc.), cetonas (v.g., acetona, metil etil cetona, etc.), hidrocarburos aromáticos (v.g, benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, metilnaftaleno, etc.), hidrocarburos alifáticos (v.g. hexano, ciclohexano, kerosina, gas oil, etc), ésteres (v.g., acetato de etilo, acetato de butilo, etc.), nitrilos (v.g, acetonitrilo, isobutironitrilo, etc.), éteres (v.g, éter diisopropílico, dioxano etc.), amidas de ácido (v.g, N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, etc.), hidrocarburos halogenados (v.g., dicloroetano, tricloroetano, tetracloruro de carbono, etc. ), sulfóxido de dimetilo, aceites vegetales (v. g., aceite de soja, aceite de semilla de algodón, etc.) y similares.
Ejemplos de vehículo gaseoso que se incluyen en el ámbito de la invención son agente de pulverizado, incluyendo gas flon, gas butano, LPG (gas de petróleo liquificado), éter dimetílico, gas de dióxido de carbono y similares.
Ejemplos de agente tensioactivo que se incluyen en el ámbito de la invención son sulfatos de alquilo, sales de sulfonato de alquilo, alquil aril sulfonatos, ésteres alquil arílicos, compuestos de polioxietileno de los mismos, ésteres polietilen glicólicos, ésteres de alcohol polihidroxílico, derivados de alcohol de azúcar y similares.
Ejemplos de agente auxiliar para la formulación como agente de fijación y agente de dispersión que se incluyen en el ámbito de la invención son caseína, gelatina, polisacáridos (v.g., polvo de almidón, goma arábiga, derivado de celulosa, ácido algínico, etc.), derivados de lignina, bentonita, azúcares, polímeros hidrosolubles sintéticos (v.g., polialcohol vinílico, polipirrolidona de vinilo, poliácidos acrílicos, etc.) y similares.
Ejemplos de estabilizantes que se incluyen en el ámbito de la invención son PAP (fosfato de ácido isopropílico), BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol), BHA (mezcla de 2-terc-butil-4metoxifenol y 3-terc-butil-4-metoxifenol), aceites vegetales, aceites minerales, agentes tensioactivos, ácidos grasos o ésteres de los mismos y similares.
El producto de extracción de la invención, la composición biocida de la invención o el al menos uno de los compuestos (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos, se pueden utilizar conjuntamente con al menos otro ingrediente activo adicional. Ejemplos de ingrediente activo adicional son nematicidas, insecticidas, acaricidas, fungicidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la planta, sinérgicos, fertilizantes, acondicionadores del suelo y cebos para animales.
En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con el uso como biocida, en adelante uso de la invención, para el control de al menos un factor biótico, y preferentemente más de uno, que afecta al desarrollo de las plantas, del producto de extracción de la invención, de la composición biocida de la invención o de al menos uno de los compuestos (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos, ya sea de forma aislada o en combinación.
En el ámbito de la invención, la actividad biocida contra los factores bióticos se puede determinar mediante diferentes tipos de bioensayos (ver ejemplos 5 y 6). Por ejemplo, en el caso de los nematodos se utiliza el porcentaje de juveniles infectivos (J2) muertos a las 72 horas posteriores tras la aplicación de la sustancia biocida. En el caso de las malas hierbas, se controla el porcentaje de germinación, el crecimiento de la raíz o el crecimiento de la parte aérea tras un ensayo de germinación de semillas de 168 horas tras aplicación de la sustancia biocida.
La actividad biocida del producto de extracción queda de manifiesto en su efecto contra un nematodo, que preferentemente es un nemátodo formador de nódulos de las raíces y más preferentemente un nematodo de la especie Meloidogine javanica.
Así, en una realización particular del uso de la invención, el nematodo pertenece a la especie Meloidogine javanica, el producto de extracción se elige de entre (WR0) y (WRI) y se obtiene una actividad nematicida del 100%.
El fraccionamiento biodirigido del (WR0) demostró que los agentes nematicidas estaban en las fracciones acuosas ácidas (WRI) o (WRII) que producen una alta mortalidad de J2 hasta diluciones del 25%. Los procesos de liofilización, neutralización o neutralización-liofilización de (WRII) dieron extractos inactivos (WRIIL), (WRIIN) y (WRIINL) sin embargo la acidificación de (WRIINL) dio un extracto activo lo que sugiere que los componentes activos se regeneran cuando se protonan sus sales.
En otra realización particular del uso de la invención, el nematodo pertenece a la especie Meloidogine javanica, el producto de extracción es el compuesto de fórmula (I) y se obtiene una mortalidad del 87%.
En otra realización particular del uso de la invención, el nematodo pertenece a la especie Meloidogine javanica se utiliza el compuesto (IV) y se consigue una mortalidad del 59%.
Por otra parte, la actividad biocida del producto de extracción de la invención o de los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención, queda de manifiesto en los resultados contra una mala hierba que preferentemente pertenece al género Lolium y que más preferentemente es la especie Lolium perenne, cuando el producto de extracción es (WR0) o (WRI). Sin embargo, la actividad fitocida también queda de manifiesto en ensayos con Lactuca sativa (ver ejemplo 5).
En otra realización particular del uso de la invención, la mala hierba es la especie Lolium perenne, el producto de extracción es (WR0), y se consigue una reducción de la germinación de semillas tras 168 horas del 100%.
La actividad biocida de los compuestos que se incluyen en el ámbito de la invención contra malas hierbas, resultan especialmente evidentes contra Lolium peren ne para los compuestos de formula general (I), (II), (III), (IV) y (VII) para parámetros como la reducción del porcentaje de germinación, crecimiento radicular o crecimiento foliar, tras 168 horas de germinación de semillas de L. perenne.
Con independencia de la potencia biocida del compuesto de fórmula (I) y del resto de compuestos que comprende el producto de extracción de la invención, se produce un efecto sinérgico de su mezcla que queda de manifiesto a través de la actividad biocida que se registra especialmente en un producto de extracción que es (EO) o (WR0).
Finalmente la invención también se relaciona con un método de control de al menos un factor biótico, y preferentemente de más de uno, que afecta al correcto desarrollo de un cultivo, que comprende el uso de una dosis eficaz de la composición biocida de la invención, del producto de extracción de la invención o de al menos uno de los compuestos de fórmula general (II), (III), (IV), (V), (VII) y (IX) o un isómero, una sal o un solvato de los mismos, ya sea de forma aislada
o en combinación.
Preferentemente, el al menos un factor biótico contra el que es efectivo el método de control de la invención, se selecciona de entre nematodos y malas hierbas. Más preferentemente, los nematodos son nematodos formadores de nódulos de las raíces y todavía más preferentemente nematodos de la especie Meloidogine javanica. También preferentemente, las malas hierbas pertenecen al género Lolium y más preferentemente la especie Lolium perenne.
La “dosis eficaz” puede aumentar o disminuir opcionalmente según el tipo de formulación, la climatología, el lugar y el método de aplicación, el tipo de factor biótico que afecta a la planta y el grado de daño.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas. Para el experto en la materia, otros aspectos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION
Plantas de L. luisieri fueron cultivadas en una parcela experimental localizada en la Comarca del Campo de Cariñena, Aguarón (Zaragoza, España) y ubicada en las siguientes coordenadas: latitud 41º 19’ 13.33’’ N; longitud 1º 19’53.9’’ W; altitud 16 m. El diseño experimental consistió en tres bloques al azar con una superficie de 49.92 metros cuadrados cada uno, con una separación de 2 metros entre bloques. En cada bloque se establecieron 4 filas de 10 metros con 104 plantas por línea. El marco de plantación fue de 1.20 x 0.40 m lo que supuso una superficie útil de 0.48 m2 por planta. La parcela experimental fue establecida en marzo de 2008 con plantas producidas por semillas recolectadas en Junio de 2007 a partir de una población salvaje parental (PSP) localizada en Pueblo Nuevo del Bullaque (Ciudad Real, España) ubicada en las coordenadas: latitud 39° 27' 41'' N; longitud 4° 24' 34'' W; altitud 733 m) y que previamente se habían germinado en vivero. Una vez las plantas florecieron, material vegetal de la parte aérea consistente en flores y hojas fue recolectado y secado a la sombra a temperatura ambiente.
Ejemplo 2. Productos de extracción
El material vegetal seco obtenido según el ejemplo 1, se sometió a los procedimientos de extracción que se indican a continuación:
Hidrodestilado en un aparato tipo Clevenger de acuerdo con el método recomendado por la European Pharmacopoeia (6th edition, 2008), obteniéndose, por decantación, el aceite esencial (EO) con un 0.8% de rendimiento y su correspondiente hidrolato (WR0’) (15 mL);
Extracción por arrastre de vapor en la planta piloto de destilado de acero inoxidable equipada con una cámara de destilado de 100 Kg y un vaso de 500 L, utilizando un rango de presión de entre 0.5-1.0 bar, y obteniéndose, por decantación, el aceite esencial (PEO) y su correspondiente hidrolato (WR0); y
Extracción con n-hexano o etanol en un aparato Soxhlet y concentrado in vacuo, obteniéndose un extracto hexánico (Hx) o etanólico (EtOH) con un 2.1% y un 12.5% de rendimiento, respectivamente.
Adicionalmente y partiendo de flores secadas al aire y molidas de L. luiseri (131g):
Extracción en un aparato Soxhlet, consistente en una extracción con Hexano durante 12 horas. Cuando el extracto hexánico (Hx) se dejó enfriar a temperatura ambiente se obtuvo un material insoluble (1.60 g) que fue filtrado y una solución hexánica a la que se añadió una solución NaOH 2N. La fase acuosa fue acidificada a pH 2 con HCl 2N y extraída con éter metilterbutílico. Ambas fases orgánicas fueron lavadas con una solución salina, secadas con Na2SO4 anhidro, filtradas y concentradas in vacuo para obtener 687 mg y 724 mg de un extracto neutro (NHx) y un extracto ácido (AHx), respectivamente.
Ejemplo 3. Fraccionamiento del hidrolato (WRO)
El hidrolato (WR0) obtenido según el procedimiento de extracción (b) del ejemplo 2 presentó 4.5 mg/ml de componentes orgánicos y un pH 3.2. Partiendo de dicho (WR0) se realización extracciones con diclorometano (DCM).
1000 ml de (WR0) fueron sometidos a extracción (DCM, 800 ml x 3) obteniendo 3.42 g (con un 34% rendimiento) de un extracto orgánico (OE0) y un residuo acuoso (WRI) con 1.15 mg/ml de componente orgánico y pH 3.1.
A continuación 1000 ml de (WRI) fueron filtrados a través de un cartucho C18 (10 g) y eluídos con MeOH para dar 176 mg (con un 0.18% de rendimiento) de un segundo extracto orgánico (OEI) y un residuo acuoso (WRII) con 0.73 mg/ml y un pH 3.67. Adicionalmente 50 ml de (WRII) fueron neutralizados a pH 6.62 con NaOH 2N (WRIIN) y liofilizados obteniendo (WRIINL). 110 mg de una muestra seca de (WRIINL) se cromatografiaron sobre una columna de Si (40-63 µm; Ø: 2 cm, h: 30cm) usando 100% acetato como eluyente
Ejemplo 4. Compuestos comprendidos en el producto de extracción de L. luiseri
TECNICAS ANALÍTICAS UTILIZADAS
Aceites esenciales y fracciones derivadas del hidrolato
Los aceites esenciales (EO) y los extractos orgánicos del hidrolato (OE0 y OEI) fueron analizados por GC-MS usando un cromatógrafo de gases Agilent 6890N (Agilent Technologies, Palo Alto, California, USA) acoplado a un detector de masas Agilent 5973N -electron ionization, 70 eV- (Agilent Techn ologies, Palo Alto, California, USA) y equipado con columnas capilares (Hewlett-Packard), concretamente id HP-1 de 25m x 0.2 mm (metil silicona, 0.2 µm de espesor de película) e id Carbowax 30 m x 0.25 mm (polietilenglicol, 0.25 µm de espesor de película). Las condiciones de trabajo fueron: temperatura del inyector 260 ºC; temperatura de la línea de transferencia conectadas al espectrómetro de masa 280 ºC; temperatura de la columna 70 -190 ºC, 5 ºC min-1. El espectro de masas EI y los datos de retención fueron usados para identificar distintos compuestos por comparación con los patrones o con valores encontrados en las bases de datos Wiley Mass Spec tral D atabase (2001). Los datos cuantitativos fueron obtenidos a partir de las áreas de los picos TIC sin utilizar factores de respuesta.
Los análisis se llevaron a cabo por HPLC-MS en un aparato LC-20AD HPLC acoplado a un espectrómetro de masas LCMS-2020 QP utilizando una interfaz de ionización por electrospray (ESI) y una columna Teknokroma, Mediterranea Sea 18 (250 x 4.6 mm, 5 µm tamaño de partícula) con una precolumna ACE 3 C18. Los compuestos fueron eluidos con metanol (MeOH):0.1% ácido acético en agua milli-Q con un gradiente 38:100% durante 45 min, seguido de 100% MeOH durante 10 min y 100:38% durante 13 min, a un flujo de 0.5 mL/min y 15 L/min de nitrógeno (gas de secado para la evaporación del disolvente). El potencial capilar del electrospray fue de +4.50kV y se empleó en modo positivo de Full Scan (m/z = 145-545) con un potencial de 1.30 kV y una temperatura capilar de 250 ºC. Las soluciones stock de los extractos
(0.25 μg/μL), de los compuestos (1), (5), (8) y (9) aislados de material vegetal de la PSP y del ácido oleanolico (Sigma) (0.05 μg/μL) se disolvieron en MeOH para la inyección de muestras (10 μL). Todos los disolventes usados fueron de grado HPLC-MS.
De forma general, los espectros NMR (1H y 13C) fueron obtenidos con espectrómetros Varian Direct-Drive 500 (1H 500 MHz/13C 125 MHz). Para alta resolución MS se utilizó un espectrómetro de masas Autospec-Q VG-Analytical (Fisons). Para los espectros IR se utilizó un espectrómetro Mattson Model Satelite FTIR.
FRACCIONAMIENTOS Y EXTRACCIONES
El fraccionamiento del extracto hexánico neutro (NHx) en columna de Si-gel eluída con un gradiente de hexano:t-butilmetileter (H:E) resultó en el aislamiento del alcanfor o compuesto (6) (H:E, 80:20, 714 mg) (Barrero et al. J. Es sent. Oil Res. 2005, 17, 166-168; Demarco Chem. Commun. 1969, 1418-1420), del compuesto (4) (H:E, 75:25, 103 mg), del compuesto (2) (H:E, 60:40, 148 mg) (Baldovini et al. Phytochemistry 2005, 66, 1651-1655), del compuesto (1) (H:E, 40:60, 86 mg) (Baldovini et al. Phytochemistry 2005, 66, 1651-1655) y del compuesto (5) (H:E, 40:60, 360 mg) (Staerk et al. J. Nat. Prod . 2004, 67, 799-805). El fraccionamiento del extracto hexánico en columna de Si-gel eluída con un gradiente de n-hexano:EtOAc (0-30% EtOAc) resultó en el aislamiento del compuesto (4) (n-hexano: EtOAc 90:10, 80 mg, 2.6%), del
Claims (14)
-
imagen1 REIVINDICACIONES1.- Producto de extracción de material vegetal de la especie Lavandula luise iri con actividad biocida, caracterizado por que comprende al compuesto de fórmula (I):imagen2 (I)o un isómero, o una sal o un solvato del mismo.10 2.- Producto de extracción según la reivindicación 1, caracterizado por que adicionalmente comprende al menos otro compuesto que se elige de entre los siguientes:imagen3 imagen4 imagen5 imagen6 15 (II) (III) (IV) (V)imagen7 38imagen8 imagen9 (X)o un isómero, una sal o un solvato de los mismos. - 3.- Producto de extracción según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que se selecciona de entre un extracto hexánico, un aceite esencial, un hidrolato o fracciones derivadas del hidrolato.
- 4.- Producto de extracción según la reivindicación 3, caracterizado por que selecciona de entre el extracto hexánico (Hx), el aceite esencial (EO), el hidrolato (WR0), la fracción orgánica (OE0), el hidrolato (WRI) o la fracción orgánica (OEI).
- 5.- Producto de extracción según la reivindicación 1, caracterizado por que es el compuesto de fórmula general (I) tal y como se define en la reivindicación 1, o un isómero, o una sal o un solvato del mismo.
- 6.- Procedimiento de obtención del producto de extracción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende una etapa de extracción de material vegetal de Lavandula luiseri con al menos un solvente hasta obtener un producto de extracción.
- 7.- Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por que el material vegetal son flores y/o hojas y el al menos un solvente se selecciona de entre un solvente acuoso y/o un solvente orgánico.
- 8.- Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por el al menos un solvente es agua, el método de extracción es hidrodestilado con aparato Clevenger o arrastre de vapor, y se obtiene como producto de extracción un aceite esencial, un hidrolato o fracciones derivadas del hidrolato.39
imagen10 - 9.- Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que el al menos un solvente es hexano, el método de extracción se lleva a cabo por el método Soxhlet, y se obtiene como producto de extracción una fracción hexánica.
- 10.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por que alternativamente comprende una etapa adicional de aislamiento del compuesto de fórmula (I) a partir del producto de extracción de la primera etapa del procedimiento.
- 11.- Composición biocida caracterizada por que comprende el producto de extracción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o a al menos un compuesto que se selecciona de entre los compuestos II, III, IV, V, VII y IX o un isómero, o una sal o un solvato de los mismos, tal y como se definen en la reivindicación 2, ya sea de forma aislada o en combinación.12- Uso de la composición biocida según la reivindicación 11, de un producto de extracción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de al menos uno de los compuesto de fórmula general II, III, IV, V, VII y IX o un isómero, o una sal o un solvato de los mismos, tal y como se describen en la reivindicación 2, ya sea de forma aislada o en combinación, contra al menos un factor biótico que afecta al desarrollo de plantas.
- 13.- Uso según la reivindicación 12, caracterizado por que al menos un factor biótico que afecta al desarrollo de plantas, se selecciona de entre nematodos y malas hierbas.
- 14.- Uso según la reivindicación 13, caracterizado por que el nematodo es un nematodo formador de nódulos de las raíces y por que las malas hierbas pertenecen al género Lolium.
- 15.- Uso según la reivindicación 14, caracterizado por que el nematodo formador de nódulos de las raíces es de la especie Meloidogine javanica y por que las malas hierbas pertenecen a la especie Lolium perenne.
- 16.- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado por que el producto de extracción es (WR0) y es activo contra nematodos y malas hierbas.40
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