WO2016147937A1 - 検出装置 - Google Patents

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WO2016147937A1
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light
metal film
excitation light
emitted
detection
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PCT/JP2016/057048
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野田　哲也
史生 長井
伸浩 山内
悠一 京極
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コニカミノルタ株式会社
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    • G01N2201/0806—Light rod

Definitions

  • the present invention relates to a detection apparatus that detects a target substance contained in a specimen.
  • SPFS surface plasmon resonance fluorescence analysis
  • Patent Documents 1 and 2 disclose a detection device using SPFS.
  • a detection chip having a prism made of a dielectric, a metal film formed on one surface of the prism, and a capturing body (for example, an antibody) fixed on the metal film is used.
  • the substance to be detected is captured by the capturing body (primary reaction).
  • the captured substance to be detected is further labeled with a fluorescent substance (secondary reaction).
  • a fluorescent substance secondary reaction
  • the metal film is irradiated with excitation light through the prism at an angle at which surface plasmon resonance occurs, localized field light can be generated on the surface of the metal film.
  • the fluorescent substance that labels the detection target substance captured on the metal film is selectively excited, and fluorescence is emitted from the fluorescent substance.
  • These detection devices detect this fluorescence and detect the presence or amount of the substance to be detected.
  • a high-sensitivity optical sensor such as a photomultiplier tube (PMT) or an avalanche photodiode (APD) is used in order to quantitatively detect weak fluorescence.
  • PMT photomultiplier tube
  • APD avalanche photodiode
  • excitation light is irradiated at an incident angle (hereinafter referred to as “resonance angle”) when the intensity of reflected light from a metal film is minimized.
  • incident angle hereinafter referred to as “resonance angle”
  • the detection device described in Patent Document 1 has room for improvement in detection sensitivity and detection accuracy.
  • excitation is performed at an incident angle (hereinafter referred to as “enhancement angle”) when the intensity of scattered light generated by surface plasmon resonance (hereinafter referred to as “plasmon scattered light”) becomes maximum. Irradiating light. Since the enhancement angle is closer to the incident angle when the fluorescence intensity is maximum than the resonance angle, the detection device described in Patent Document 2 has detection sensitivity and detection accuracy compared to the detection device described in Patent Document 1. Excellent in terms. However, since the detection device described in Patent Document 2 also detects plasmon scattered light using a light receiving sensor for detecting fluorescence, an excitation light cut filter (optical) is detected from the optical path of the light receiving optical system when determining the enhancement angle. There is a problem that the filter must be evacuated.
  • An object of the present invention is to provide a detection device capable of determining an enhancement angle at which plasmon scattered light is maximized without retracting the optical filter from the optical path of the light receiving optical system.
  • a detection device is provided with a detection chip including a prism made of a dielectric and a metal film disposed on one surface of the prism, By irradiating the metal film with excitation light through, the fluorescent substance that labels the substance to be detected existing on the metal film is excited by localized field light based on surface plasmon resonance, and emitted from the fluorescent substance.
  • a detection device for detecting the presence or amount of the substance to be detected by detecting fluorescence a holder for holding the detection chip, a light irradiation unit for emitting excitation light, and the metal via the prism
  • an angle adjustment unit for adjusting the incident angle of excitation light to the metal film, and when the light irradiation unit irradiates the metal film with excitation light
  • a light receiving sensor that detects light emitted from the detection chip, a light receiving optical system that guides the light emitted from the detection chip to the light receiving sensor, and is disposed in the light receiving optical system and has the same wavelength as the excitation light
  • the control unit detects the plasmon of the light receiving sensor.
  • the predetermined incident angle is determined based on the detection result of the scattered light, the angle adjusting unit is controlled to adjust the incident angle of the excitation light to the metal film to the predetermined incident angle, and the light receiving sensor.
  • the light irradiating unit is configured to perform the predetermined irradiation with respect to the metal film so that surface plasmon resonance occurs in the metal film. Fluorescence emitted from the fluorescent material is detected when the excitation light is irradiated at an incident angle of.
  • the present invention it is possible to determine the enhancement angle at which the plasmon scattered light is maximized without retracting the optical filter from the optical path of the light receiving optical system in the detection of the target substance using SPFS. Therefore, according to the present invention, it is possible to detect the presence or amount of a substance to be detected with high sensitivity, high accuracy, and high speed. In addition, according to the present invention, it is possible to reduce the size and cost of the detection device.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS apparatus according to the first embodiment.
  • 2A and 2B are conceptual graphs showing the detection accuracy of PMT and PD.
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS apparatus according to the first embodiment.
  • 4A to 4C are conceptual graphs for explaining the function of the excitation light cut filter in the SPFS apparatus according to Embodiment 1.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS apparatus according to the second embodiment.
  • a surface plasmon resonance fluorescence analyzer (hereinafter also referred to as “SPFS apparatus”) will be described as a representative example of the detection apparatus according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of the SPFS apparatus 100 according to the first embodiment.
  • the SPFS apparatus 100 includes an excitation light irradiation unit (light irradiation unit) 110 for irradiating the detection chip 10 with excitation light ⁇ , and light emitted from the detection chip 10 (plasmon scattered light ⁇ ). And a light receiving unit 120 for detecting the fluorescence ⁇ ), a control unit 130 for controlling them, a chip holder 140 for detachably holding the detection chip 10, and a liquid supply for supplying liquid to the detection chip 10. Unit (not shown).
  • the SPFS device 100 is used with the detection chip 10 mounted on the chip holder 140. Therefore, the detection chip 10 will be described first, and then each component of the SPFS device 100 will be described.
  • the detection chip 10 includes a prism 20 having an incident surface 21, a film formation surface 22 and an emission surface 23, a metal film 30 formed on the film formation surface 22, and a film formation surface 22 or And a flow path lid 40 disposed on the metal film 30.
  • the detection chip 10 is replaced for each detection.
  • the detection chip 10 is preferably a structure in which the length of each piece is several mm to several cm, but is a smaller structure or a larger structure not included in the category of “chip”. Also good.
  • the prism 20 is made of a dielectric that is transparent to the excitation light ⁇ .
  • the prism 20 has an incident surface 21, a film forming surface 22, and an exit surface 23.
  • the incident surface 21 causes the excitation light ⁇ from the excitation light irradiation unit 110 to enter the prism 20.
  • a metal film 30 is formed on the film formation surface 22.
  • the excitation light ⁇ incident on the inside of the prism 20 is reflected by the metal film 30. More specifically, the light is reflected at the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30.
  • the emission surface 23 emits the excitation light ⁇ reflected by the metal film 30 to the outside of the prism 20.
  • the shape of the prism 20 is not particularly limited.
  • the shape of the prism 20 is a column having a trapezoidal bottom surface.
  • the surface corresponding to one base of the trapezoid is the film formation surface 22, the surface corresponding to one leg is the incident surface 21, and the surface corresponding to the other leg is the emission surface 23.
  • the trapezoid serving as the bottom surface is preferably an isosceles trapezoid.
  • the entrance surface 21 and the exit surface 23 are symmetric, and the S wave component of the excitation light ⁇ is less likely to stay in the prism 20.
  • the incident surface 21 is formed so that the excitation light ⁇ does not return to the excitation light irradiation unit 110.
  • the angle of the incident surface 21 is set so that the excitation light ⁇ does not enter the incident surface 21 perpendicularly in the scanning range centered on the ideal enhancement angle.
  • the angle between the incident surface 21 and the film formation surface 22 and the angle between the film formation surface 22 and the emission surface 23 are both about 80 °.
  • Examples of the material of the prism 20 include resin and glass.
  • the material of the prism 20 is preferably a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and low birefringence and autofluorescence.
  • the metal film 30 is formed on the film formation surface 22 of the prism 20.
  • an interaction surface plasmon resonance
  • the material of the metal film 30 is not particularly limited as long as it is a metal that causes surface plasmon resonance.
  • Examples of the material of the metal film 30 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof.
  • the metal film 30 is a gold thin film.
  • the method for forming the metal film 30 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 30 include sputtering, vapor deposition, and plating.
  • the thickness of the metal film 30 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
  • a capturing body for capturing a substance to be detected is immobilized on the surface of the metal film 30 that does not face the prism 20. As a result, a detection region for selectively detecting the substance to be detected can be formed.
  • the type of capturing body is not particularly limited as long as it can capture the substance to be detected.
  • the capturing body is an antibody or a fragment thereof that can specifically bind to the substance to be detected.
  • the channel lid 40 is disposed on the surface of the metal film 30 that does not face the prism 20 with the channel 41 interposed therebetween.
  • the flow path cover 40 may be disposed on the film formation surface 22 with the flow path 41 interposed therebetween.
  • the channel lid 40 and the metal film 30 (and the prism 20) form a channel 41 through which a liquid such as a specimen, a fluorescent labeling solution, and a cleaning solution flows.
  • the capturing body is exposed in the flow path 41. Both ends of the channel 41 are connected to an inlet and an outlet (both not shown) formed on the upper surface of the channel lid 40, respectively.
  • the channel lid 40 is made of a material that is transparent to the light (plasmon scattered light ⁇ and fluorescence ⁇ ) emitted from the surface of the metal film 30 that does not face the prism 20 and the vicinity thereof.
  • An example of the material of the flow path lid 40 includes a resin. If these lights can be guided to the light receiving unit 120, a part of the channel lid 40 may be formed of an opaque material.
  • the channel lid 40 is bonded to the metal film 30 or the prism 20 by, for example, adhesion using a double-sided tape or an adhesive, laser welding, ultrasonic welding, or pressure bonding using a clamp member.
  • the excitation light ⁇ guided to the prism 20 enters the prism 20 from the incident surface 21.
  • the excitation light ⁇ incident on the prism 20 is incident on the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 so as to have a total reflection angle (an angle at which surface plasmon resonance occurs).
  • the reflected light from the interface is emitted from the emission surface 23 to the outside of the prism 20 (not shown).
  • plasmon scattered light ⁇ and fluorescence ⁇ are emitted from the metal film 30 and the vicinity thereof toward the light receiving unit 120.
  • autofluorescence is emitted from the resin member (prism 20) constituting the detection chip 10 (not shown).
  • the SPFS device 100 includes the excitation light irradiation unit (light irradiation unit) 110, the light receiving unit 120, the control unit 130, and the chip holder (holder) 140.
  • the excitation light irradiation unit 110 includes a light source unit 111 that emits excitation light ⁇ , and an angle adjustment unit 112 that adjusts the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30.
  • the light source unit 111 has a light source of excitation light ⁇ , and emits excitation light ⁇ (single mode laser light) toward the incident surface 21 of the detection chip 10 held by the chip holder 140. More specifically, the light source unit 111 has only a P wave for the interface so that the excitation light ⁇ has a total reflection angle with respect to the interface (film formation surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 of the detection chip 10. Is emitted toward the incident surface 21.
  • the type of the light source is not particularly limited, but when using a light-sensitive sensor such as a photodiode (PD) as the light receiving sensor 125, the light source must be high power from the viewpoint of increasing the amount of light received by the light receiving sensor 125. Is preferred.
  • the light source is, for example, a laser diode (LD) that can irradiate the excitation light ⁇ so that the power on the irradiated surface on the metal film 30 is 1 mW / mm 2 or more. Thereby, fluorescence ⁇ having a stronger intensity can be released from the fluorescent substance that labels the substance to be detected.
  • LD laser diode
  • the wavelength of the excitation light ⁇ emitted from the LD is not particularly limited, but is preferably 650 to 670 nm, for example. This is because a high-power LD can be obtained at low cost.
  • Other examples of light source types include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources.
  • the excitation light ⁇ emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like.
  • the excitation light ⁇ emitted from the light source is converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like.
  • the excitation light ⁇ emitted from the light source is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
  • the light source unit 111 further includes a shaping optical system, an APC mechanism, and a temperature adjustment mechanism (all not shown).
  • the shaping optical system adjusts the beam diameter, contour shape, and the like of the excitation light ⁇ so that the shape of the irradiation spot at the interface (deposition surface 22) between the prism 20 and the metal film 30 becomes a predetermined circular shape.
  • the excitation light ⁇ emitted from the shaping optical system is applied to the prism 20 of the detection chip 10.
  • the shaping optical system includes, for example, a collimator, a bandpass filter (BPF), a linear polarization filter (LP), a half-wave plate, a slit, and a zoom unit.
  • the collimator collimates the excitation light ⁇ emitted from the light source.
  • the bandpass filter turns the excitation light ⁇ emitted from the light source into a narrow band light having only the center wavelength. This is because the excitation light ⁇ from the light source has a slight wavelength distribution width.
  • the linear polarization filter turns the excitation light ⁇ emitted from the light source into completely linearly polarized light.
  • the half-wave plate adjusts the polarization direction of the excitation light ⁇ so that the P-wave component light is incident on the metal film 30.
  • the slit and zoom means adjust the beam diameter, contour shape, and the like of the excitation light ⁇ so that the shape of the irradiation spot on the back surface of the metal film 30 is a circle of a predetermined size.
  • the APC mechanism controls the light source so that the output of the light source is constant. More specifically, the APC mechanism detects the amount of light branched from the excitation light ⁇ with a photodiode (not shown) or the like. The APC mechanism controls the input energy by a regression circuit, thereby controlling the output of the light source to be constant.
  • the temperature adjustment mechanism is, for example, a heater or a Peltier element.
  • the wavelength and energy of the light emitted from the light source may vary depending on the temperature. For this reason, the wavelength and energy of the light emitted from the light source are controlled to be constant by keeping the temperature of the light source constant by the temperature adjusting mechanism.
  • the angle adjustment unit 112 adjusts the incident angle of the excitation light ⁇ to the metal film 30 (deposition surface 22).
  • the angle adjustment unit 112 uses the optical axis of the excitation light ⁇ and the chip holder. Rotate relatively.
  • the angle adjustment unit 112 rotates the light source unit 111 around an axis orthogonal to the optical axis of the excitation light ⁇ . At this time, the position of the rotation axis is set so that the irradiation position on the metal film 30 (deposition surface 22) hardly moves even when the incident angle is scanned.
  • the light receiving unit 120 is disposed so as to face a surface of the metal film 30 of the detection chip 10 held by the chip holder 140 that does not face the prism 20. More specifically, a first lens 122, a second lens 124, and a light receiving sensor 125, which will be described later, pass through the irradiation spot of the excitation light ⁇ on the metal film 30 (deposition surface 22) and are straight lines perpendicular to the surface of the metal film 30.
  • the light receiving unit 120 is arranged so as to be positioned above. The light receiving unit 120 detects light (plasmon scattered light ⁇ , fluorescence ⁇ , and autofluorescence) emitted from the detection chip 10.
  • the light receiving unit 120 includes a light receiving optical system 121 including a first lens 122, an excitation light cut filter 123 and a second lens 124, and a light receiving sensor 125.
  • the light receiving optical system 121 guides the light emitted from the detection chip 10 to the light receiving sensor 125.
  • the first lens 122 and the second lens 124 constitute a conjugate optical system that is not easily affected by stray light.
  • the light traveling between the first lens 122 and the second lens 124 becomes substantially parallel light.
  • the first lens 122 and the second lens 124 image the light emitted from the detection chip 10 on the light receiving surface of the light receiving sensor 125. Further, as will be described later, the first lens 122 and the second lens 124 receive light (plasmon scattered light ⁇ , fluorescence ⁇ , and autofluorescence) emitted from the detection chip 10 together with the excitation light cut filter 123 as a light receiving sensor.
  • the light is condensed on 125 light receiving surfaces.
  • the excitation light cut filter (optical filter) 123 is disposed between the first lens 122 and the second lens 124.
  • the excitation light cut filter 123 blocks part (most) of light having the same wavelength as the excitation light ⁇ (plasmon scattered light ⁇ ).
  • the excitation light cut filter 123 transmits a part of the plasmon scattered light ⁇ and the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance in the light emitted from the detection chip 10.
  • the excitation light cut filter 123 further transmits at least part of the autofluorescence emitted from the detection chip 10.
  • the SPFS apparatus 100 can remove most of the plasmon scattered light ⁇ , which is a noise component at the time of fluorescence ⁇ detection, and can detect the detection target substance with high accuracy and can cut the excitation light. Without retracting the filter 123, the transmitted plasmon scattered light ⁇ can be detected by the light receiving sensor 125 to determine the enhancement angle. If such an effect can be exhibited, the transmittance of the plasmon scattered light ⁇ of the excitation light cut filter 123 is not particularly limited, but is preferably more than 0.005% and less than 1%.
  • the excitation light cut filter 123 transmits the plasmon scattered light ⁇ so that the amount of plasmon scattered light ⁇ with respect to the amount of autofluorescence emitted from the detection chip 10 is more than 0.5 times and less than 100 times. Is preferred.
  • Examples of the type of the excitation light cut filter 123 include a reflective filter in which a dielectric multilayer film is disposed on one side or both sides.
  • the dielectric multilayer film can be formed by alternately and repeatedly laminating a layer made of a high refractive index material and a layer made of a low refractive index material. At this time, a filter having desired transmission characteristics can be obtained by appropriately setting the thickness and number of each layer.
  • Examples of the high refractive index material include oxides such as Ti, Nb, Ta, and La (eg, TiO 2 , Nb 2 O 5 , Ta 2 O 5, etc.).
  • Examples of the low refractive index material include oxides such as Si and Al (for example, SiO 2 ).
  • the excitation light cut filter 123 can be manufactured.
  • the reflectance of light having the same wavelength as the excitation light ⁇ (for example, 660 nm) is 99% or more.
  • the reflectance of light (for example, 690 nm) having a wavelength 30 nm larger than the wavelength of the excitation light ⁇ is several percent or less.
  • excitation light cut filter 123 includes an absorption filter made of colored glass.
  • transmission near a cutoff wavelength a wavelength indicating a boundary between a wavelength band where the excitation light ⁇ is absorbed by the excitation light cut filter 123 and a wavelength band where the excitation light ⁇ is transmitted. It is difficult to raise the rate sharply. For this reason, the light shielding property of the excitation light ⁇ of the transmission filter is inferior to that of the reflection filter.
  • the excitation light cut filter 123 transmits a part of the plasmon scattered light ⁇ . For this reason, in the SPFS device 100 according to the present embodiment, an inexpensive colored glass filter can be used although the light shielding property is inferior.
  • the light receiving sensor 125 detects the light emitted from the detection chip 10.
  • examples of the type of the light receiving sensor 125 include a photomultiplier tube (PMT) and an avalanche photodiode (APD) having high sensitivity and SN ratio.
  • PMT photomultiplier tube
  • APD avalanche photodiode
  • a photodiode (PD) that is not highly sensitive may be used as the light receiving sensor 125. From the viewpoint of miniaturization and cost reduction of the SPFS device 100, it is preferable to use a PD.
  • the output value from the light receiving sensor 125 is proportional to the amount of received light, the light receiving sensitivity, and the amplification magnification.
  • 2A and 2B are conceptual graphs showing the detection accuracy of PMT and PD.
  • FIG. 2A is a conceptual graph showing the relationship between the output value from the light receiving sensor 125 and the standard deviation (variation) ⁇ of the detected value.
  • the range of the signal value S in FIG. 2B shows the range when the standard deviation ⁇ of PD is smaller than the standard deviation ⁇ of PMT in FIG. 2A. 2A and 2B, the broken line indicates the PMT, and the solid line indicates the PD.
  • the standard deviation ⁇ is small when the output value is small, but the standard deviation ⁇ increases as the output value increases. For this reason, the variation coefficient CV ( ⁇ / S) does not decrease so much even if the signal value S increases.
  • the standard deviation ⁇ is large in the region where the signal value S is very small, but the increase rate of the standard deviation ⁇ is small. As the value increases, it decreases dramatically. For this reason, if the signal value S from the light receiving sensor 125 is increased, more accurate measurement can be performed when the PD is used compared to when the PMT is used.
  • the optical blank value B is larger than the signal value S as shown in FIG. 2B (S / B has become smaller), the increase rate of the PD coefficient of variation CV is smaller than that of the PMT coefficient of variation CV. For this reason, even if the optical blank value B becomes larger than the signal value S (S / B becomes smaller), the case where PD is used is more accurate than the case where PMT is used. You can make measurements.
  • the amplification magnification is set to 1000 times that when PMT is used.
  • the amount of excitation light ⁇ is set to 20 to 50 times that when PMT is used.
  • the size of the irradiation spot of the excitation light ⁇ on one surface of the metal film 30 is the same as the light receiving sensor 125 on the other surface of the metal film 30 (surface facing the first lens 122). It adjusts so that it may become smaller than the size of the detection area. By doing in this way, even if the irradiation spot is slightly displaced due to the error of each parameter of the prism 20, it is possible to prevent the irradiation spot from deviating from the detection region.
  • the control unit 130 centrally performs control of each driving unit, quantification of the amount of light received by the light receiving sensor 125, and the like.
  • the control unit 130 includes a light source control unit 131 that controls the light source unit 111, a light receiving sensor control unit 132 that controls the light receiving sensor 125, and a control processing unit 133.
  • the control processing unit 133 comprehensively controls the angle adjustment unit 112, the light source control unit 131, and the light receiving sensor control unit 132, and controls the operation of the entire SPFS apparatus 100.
  • the control unit 130 is, for example, a computer that executes software.
  • control unit 130 determines a predetermined incident angle (in the present embodiment, an enhancement angle) based on the detection result of the plasmon scattered light ⁇ by the light receiving sensor 125, and the angle
  • the adjusting unit 112 is controlled to adjust the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) during fluorescence detection.
  • the chip holder 140 holds the detection chip 10 at a predetermined position.
  • the detection chip 10 is irradiated with the excitation light ⁇ from the excitation light irradiation unit 110 while being held by the chip holder 140.
  • plasmon scattered light ⁇ having the same wavelength as the excitation light ⁇ , fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent material, and autofluorescence of the detection chip 10 are emitted upward from the surface of the metal film 30 not facing the prism 20 and its vicinity. Is done.
  • the excitation light ⁇ is reflected at the interface between the prism 20 and the metal film 30 and is emitted to the outside of the prism 20 (not shown).
  • FIG. 3 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the SPFS apparatus 100.
  • step S10 preparation for detection is performed (step S10).
  • the detection chip 10 is installed in the chip holder 140 of the SPFS device 100. Further, when a humectant is present in the flow channel 41 of the detection chip 10, the humectant is removed by washing the flow channel 41 so that the capturing body can appropriately capture the substance to be detected.
  • the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) is scanned to obtain an optimal incident angle.
  • the control processing unit 133 controls the light source unit 111 and the angle adjustment unit 112 to emit the excitation light ⁇ in the state where the fluorescent material is not present on the metal film 30 (film formation surface 22).
  • the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) is scanned while irradiating the predetermined position.
  • the control processing unit 133 controls the light receiving sensor control unit 132 so that the light receiving sensor 125 detects the light emitted from the detection chip 10 (plasmon scattered light ⁇ and autofluorescence of the detection chip 10).
  • the plasmon scattered light ⁇ emitted from the detection chip 10 is collimated by the first lens 122 and reaches the excitation light cut filter 123.
  • the excitation light cut filter 123 transmits a part of the plasmon scattered light ⁇ and the autofluorescence of the detection chip 10.
  • the light transmitted through the excitation light cut filter 123 is collected by the second lens 124 and detected by the light receiving sensor 125.
  • control processing unit 133 obtains data including the relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the intensity of the light emitted from the detection chip 10. Then, the control processing unit 133 analyzes the data by fitting such as quadratic approximation, and determines an incident angle (enhancement angle) that maximizes the detected light intensity (detection value).
  • the enhancement angle is basically determined by the material and shape of the prism 20, the thickness of the metal film 30, the refractive index of the liquid in the flow channel 41, etc. It varies slightly due to various factors such as the shape error of the prism 20. For this reason, it is preferable to determine the enhancement angle each time detection is performed. The enhancement angle is determined on the order of about 0.1 °.
  • the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) is set to the enhancement angle determined in step S20 (step S30). Specifically, the control processing unit 133 controls the angle adjustment unit 112 to adjust the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) to the enhancement angle. In the subsequent steps, the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 (deposition surface 22) remains the enhancement angle.
  • the control processing unit 133 controls the light source control unit 131 to cause the light source unit 111 to emit the excitation light ⁇ .
  • the control processing unit 133 controls the light receiving sensor control unit 132 so that the light receiving sensor 125 detects the light transmitted through the excitation light cut filter 123.
  • the measured value is transmitted to the control processing unit 133 and recorded as an optical blank value.
  • the substance to be detected in the sample is reacted with the capturing body (primary reaction; step S50). Specifically, the sample is injected into the flow channel 41 of the detection chip 10 on the liquid feeding unit side, and the sample and the capturing body are brought into contact with each other. When the substance to be detected is present in the specimen, at least a part of the substance to be detected is captured by the capturing body. Thereafter, the inside of the flow path 41 is washed with a buffer solution or the like to remove substances not captured by the capturing body.
  • the type of specimen is not particularly limited. Examples of the specimen include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, semen, and diluted solutions thereof.
  • the detected substance captured by the capturing body is labeled with a fluorescent substance (secondary reaction; step S60).
  • a fluorescent labeling solution is injected into the channel 41.
  • the fluorescent labeling solution is, for example, a buffer solution containing an antibody (secondary antibody) labeled with a fluorescent substance.
  • the fluorescent labeling liquid comes into contact with the substance to be detected, and the target substance is labeled with the fluorescent substance. Thereafter, the inside of the flow path 41 is washed with a buffer solution or the like to remove free fluorescent substances.
  • the control processing unit 133 controls the light source control unit 131 to cause the light source unit 111 to emit the excitation light ⁇ .
  • the control processing unit 133 controls the light receiving sensor control unit 132 so that the light receiving sensor 125 detects the fluorescence ⁇ emitted from the metal film (the metal film 30 and its vicinity).
  • the control processing unit 133 subtracts the optical blank value from the detection value, and calculates the fluorescence intensity that correlates with the amount of the substance to be detected. The fluorescence intensity is converted into the amount or concentration of the substance to be detected as necessary.
  • the presence or amount of the substance to be detected in the specimen can be detected with high accuracy without retracting the excitation light cut filter 123 from the optical path of the light receiving optical system 121.
  • the excitation light cut filter 123 used in the SPFS apparatus 100 according to the present embodiment and partially transmitting the plasmon scattered light ⁇ will be described.
  • the excitation light cut filter 123 is enhanced by measuring the plasmon scattered light ⁇ using a colored glass (transmittance of the plasmon scattered light ⁇ is approximately 0.08%) that partially transmits the plasmon scattered light ⁇ .
  • a corner is determined.
  • a high-performance bandpass filter BPF; the transmittance of plasmon scattered light ⁇ is 0.01% or less
  • BPF bandpass filter
  • FIG. 4A to 4C are conceptual graphs for explaining the function of the excitation light cut filter 123 in the SPFS apparatus 100 according to the present embodiment.
  • FIG. 4A shows the relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the amount of light received by the light receiving sensor 125 when a high-performance bandpass filter (BPF) that almost completely blocks the plasmon scattered light ⁇ is used as the excitation light cut filter.
  • BPF bandpass filter
  • FIG. 4B shows the relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the amount of light received by the light receiving sensor 125 when the excitation light cut filter is not used.
  • FIG. 4A shows the relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the amount of light received by the light receiving sensor 125 when the excitation light cut filter is not used.
  • 4C shows the relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the amount of light received by the light receiving sensor 125 when the excitation light cut filter 123 that partially transmits the plasmon scattered light ⁇ is used.
  • the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 30 is scanned in a state where no fluorescent substance is present on the metal film 30.
  • the alternate long and short dash line indicates the autofluorescence emitted from the detection chip 10
  • the broken line indicates the plasmon scattered light ⁇
  • the solid line indicates the sum of the autofluorescence and the plasmon scattered light ⁇ .
  • the excitation light cut filter when the excitation light cut filter is not used, the light reaching the light receiving sensor 125 includes plasmon scattered light ⁇ and autofluorescence.
  • the amount of the plasmon scattered light ⁇ is much larger than the autofluorescence.
  • the enhancement angle can be determined by detecting the incident angle of the excitation light ⁇ when the plasmon scattered light ⁇ is maximized.
  • the plasmon scattered light ⁇ of about 1000 times or more is detected as compared with the aspect using the excitation light cut filter that substantially completely blocks the plasmon scattered light ⁇ (see FIG. 4A).
  • the plasmon scattered light ⁇ becomes noise, which causes a decrease in the SN ratio.
  • the step of determining the enhancement angle (step S20) is excited from the optical path.
  • the step of detecting the plasmon scattered light ⁇ with the light cut filter retracted and detecting the fluorescence ⁇ (step S70) the fluorescence is cut in the state where the excitation light cut filter is inserted in the optical path to block the plasmon scattered light ⁇ . ⁇ was detected.
  • the excitation light cut filter 123 includes a part of the plasmon scattered light ⁇ , the autofluorescence, and the fluorescent material out of the light emitted from the detection chip 10.
  • the emitted fluorescence ⁇ can be transmitted.
  • the SPFS device 100 according to the present embodiment is a plasmon having an appropriate light amount that is necessary for measuring the enhancement angle and that does not interfere with the detection of the fluorescent ⁇ .
  • the scattered light ⁇ can reach the light receiving sensor 125. For this reason, in the SPFS device 100 according to the present embodiment, it is not necessary to retract the excitation light cut filter 123 from the optical path in the step of determining the enhancement angle (step S20).
  • the transmittance of the plasmon scattered light ⁇ of the excitation light cut filter 123 is preferably more than 0.005% and less than 1%. Further, the excitation light cut filter 123 transmits the plasmon scattered light ⁇ so that the amount of plasmon scattered light ⁇ with respect to the amount of autofluorescence emitted from the detection chip 10 is more than 0.5 times and less than 100 times. Is preferred.
  • the enhancement angle maximum value of the amount of plasmon scattered light ⁇
  • the fluorescence ⁇ can be detected with high accuracy.
  • the enhancement angle is determined using a part of the plasmon scattered light ⁇ emitted from the detection chip 10 and transmitted through the excitation light cut filter 123. be able to.
  • the enhancement angle can be determined without retracting the excitation light cut filter 123 from the optical path of the light receiving optical system 121. Therefore, the SPFS apparatus 100 according to the present embodiment does not require a mechanism for switching the position of the excitation light cut filter 123 unlike the conventional SPFS apparatus (see Patent Document 2), and the detection apparatus can be reduced in size and cost. Can be realized.
  • the step of switching the position of the excitation light cut filter 123 is not necessary, so that the detection time can be shortened.
  • the primary reaction (step S50) and the secondary reaction (step S60) are continuously performed, and the detection chip 10 is inserted between the two steps from the liquid feeding unit side to the excitation light irradiation unit 110 and It is not moved to the light receiving unit 120 side. For this reason, the total time concerning detection can be shortened by the moving time of the detection chip 10. In addition, the measurement accuracy can be improved by keeping the primary reaction time, the secondary reaction time, and the interval time between the primary reaction and the secondary reaction constant.
  • the enhancement angle is determined (step S20), the incident angle is set to the enhancement angle (step S30), and the optical blank value is measured (step S40). Good.
  • the enhancement angle is determined in a state where the substance to be detected is captured by the capturing body. And measurement of optical blank values.
  • the enhancement angle can be determined and the optical blank value can be measured in a state closer to the step of measuring the fluorescence value (step S70)
  • the enhancement angle can be determined more accurately and the optical blank value can be more accurately determined. Therefore, measurement accuracy can be further improved.
  • an excitation light cut filter 123 for example, a colored glass filter
  • a PD having a detection sensitivity lower than that of the PMT
  • S / B ratio falls by transmitting a part of plasmon scattered light (beta).
  • the increase rate of the standard deviation ⁇ of the detected value is smaller even if the amount of received light is increased.
  • the variation coefficient CV ( ⁇ / S) becomes small, and even if the S / B ratio is lowered, an increase in the variation coefficient CV can be suppressed.
  • more accurate detection can be performed when PD is used compared to when PMT is used (see FIGS. 2A and 2B).
  • the SPFS apparatus 200 according to the second embodiment includes an excitation light irradiation unit 110, a light receiving unit 220, a control unit 130, and a chip holder 140.
  • the SPFS apparatus 200 according to the second embodiment is different from the SPFS apparatus 100 according to the first embodiment only in the configuration of the light receiving unit 220. Therefore, in the present embodiment, only the light receiving unit 220 will be described.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a configuration of the SPFS apparatus 200 according to the second embodiment.
  • the light receiving unit 220 includes a light receiving optical system 221 including a light guide member (light guide rod 226) and an excitation light cut filter 123, and a light receiving sensor 125.
  • the light receiving optical system 221 guides the light emitted from the detection chip 10 to the light receiving sensor 125.
  • the light guide rod 226 has translucency, and allows light (plasmon scattered light ⁇ , fluorescence ⁇ and autofluorescence) emitted from the detection chip 10 to be incident on the incident surface 227 located at one end and located at the other end. The light is emitted from the emission surface 228 and guided to the light receiving sensor 125.
  • the shape and material of the light guide rod 226 are not particularly limited as long as the light emitted from the detection chip 10 can be guided to the light receiving sensor 125.
  • the shape of the light guide rod 226 may be a cylindrical shape with a constant cross-sectional area from the incident surface 227 toward the output surface 228 in the cross section orthogonal to the axial direction of the light guide rod 226, or the cross-sectional area may be The taper shape may not be constant.
  • the shapes of the entrance surface 227 and the exit surface 228 may be a planar shape or a curved surface shape.
  • the light guide rod 226 has a cylindrical shape, and the incident surface 227 and the emission surface 228 have a planar shape. Examples of the material of the light guide rod 226 include transparent resin and transparent glass.
  • the refractive index of the light guide rod 226 is not particularly limited, but is preferably about 1.4 to 2.0.
  • the numerical aperture (NA) of the light guide rod 226 is preferably high. Thereby, a lot of light emitted from the detection chip 10 can be made incident.
  • a reflection film for preventing leakage of the fluorescent ⁇ incident on the incident surface 227 of the light guide rod 226 may be formed on the side surface of the light guide rod 226.
  • the reflective film is, for example, a vapor deposition film such as aluminum or gold.
  • the incident surface 227 of the light guide rod 226 is one end surface (bottom surface) of the cylinder, and is disposed to face the surface of the metal film 30.
  • the distance between the incident surface 227 of the light guide rod 226 and the detection area of the detection chip 10 is about 0.5 to 5.0 mm.
  • the diameter of the incident surface 227 of the light guide rod 226 is longer than the maximum length of the detection region. Thereby, the fluorescence ⁇ emitted from the detection region can be efficiently incident on the light guide rod 226.
  • the “maximum length of the detection region” refers to the length of the longest line segment among the line segments having two ends on the outer edge of the detection region. For example, when the detection area is circular, the maximum length of the detection area is a diameter. When the detection area is rectangular, the maximum length of the detection area is a diagonal length.
  • the emission surface 228 is the other end surface (bottom surface) of the cylinder, and is disposed so as to face the light receiving surface of the light receiving sensor 125 (or the excitation light cut filter 123 disposed in front thereof).
  • the distance between the emission surface 228 and the light receiving surface of the light receiving sensor 125 is about 0.5 to 5.0 mm.
  • the diameter of the exit surface 228 of the light guide rod 226 is preferably shorter than the maximum length of the light receiving surface of the light receiving sensor 125.
  • the “maximum length of the light receiving surface” means the length of the longest line segment among two line segments having both ends on the outer edge of the light receiving surface of the light receiving sensor 125.
  • the excitation light cut filter 123 may be disposed between the chip holder 140 and the incident surface 227 of the light guide rod 226, or is disposed between the emission surface 228 of the light guide rod 226 and the light receiving sensor 125. May be. In the present embodiment, the excitation light cut filter 123 is disposed between the light exit surface 228 of the light guide rod 226 and the light receiving sensor 125.
  • the excitation light cut filter 123 is cut when the light beam is incident at an incident angle larger than 0 ° than when the light beam is incident at an incident angle of 0 °.
  • the off wavelength changes to the short wavelength side.
  • the excitation light cut filter 123 can transmit a part of the incident light.
  • light emitted from the exit surface 228 of the light guide rod 226 enters the excitation light cut filter 123 at various incident angles.
  • the transmitted light quantity of the plasmon scattered light ⁇ is set by arbitrarily setting the cutoff wavelength of the excitation light cut filter 123 and the NA of the light guide rod, and by controlling the incident angle range to the excitation light cut filter 123, It can be easily set to an appropriate amount. For this reason, in the SPFS apparatus 200 according to the present embodiment, a high-performance BPF may be used as the excitation light cut filter 123.
  • the high performance BPF almost completely blocks the plasmon scattered light ⁇ having the same wavelength as that of the excitation light ⁇ , which is incident at an incident angle of 0 °, but by using the light guide rod 226, the incident is larger than 0 °. Light incident at the corners can be transmitted.
  • high-performance BPFs but also low-cost optical filters such as low-performance BPFs that have a poor light shielding rate against excitation light ⁇ incident at an incident angle of 0 °, and absorption side filters such as colored glass filters, etc. May be used.
  • the transmittance of the plasmon scattered light ⁇ can be easily controlled by controlling the content of the absorbing dye and the thickness of the filter.
  • the SPFS apparatus 200 transmits the excitation light cut filter 123 from the optical path of the light receiving optical system 221 by transmitting a part of the plasmon scattered light ⁇ .
  • the enhancement angle can be measured without retracting.
  • the SPFS device 200 by using the light guide rod 226, it is not necessary to configure a conjugate optical system as in the SPFS device 100 according to the first embodiment, so that further downsizing and cost reduction of the detection device can be achieved. Can be realized. Further, by using a PD as the light receiving sensor 125 and a colored glass filter as the excitation light cut filter 123, further downsizing and cost reduction can be realized.
  • the excitation light cut filter 123 may be integrated with the light guide rod 226.
  • the light guide rod 226 and the excitation light cut filter 123 may be integrated by forming a dielectric multilayer film on the entrance surface 227 or the exit surface 228 of the light guide rod 226, or the light guide rod 226 may be colored glass. You may form with the same material as a filter. Thereby, the SPFS apparatus 200 can be further downsized and simplified.
  • the detection apparatus can detect a substance to be detected with high reliability, and is useful for clinical examinations, for example.

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Abstract

　検出装置は、ホルダー、光照射部、角度調整部、受光センサー、受光光学系、光学フィルターおよび制御部を有する。受光光学系は検出チップから放出された光を受光センサーに導く。光学フィルターは受光光学系内に配置され、励起光と同じ波長の光であるプラズモン散乱光の一部を遮断し、検出チップから放出された光のうち、前記プラズモン散乱光の一部と、前記蛍光物質から放出された蛍光とを透過させる。受光センサーは検出チップから放出され、光学フィルターを透過したプラズモン散乱光の一部と、蛍光とを検出する。制御部はプラズモン散乱光の検出結果に基づいて、角度調整部を制御して、励起光の入射角を所定の入射角に調整する。

Description

検出装置
　本発明は、検体に含まれる被検出物質の検出を行う検出装置に関する。
　臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる検出装置が求められている。
　被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン共鳴蛍光分析法（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
　特許文献１、２には、ＳＰＦＳを利用する検出装置が開示されている。これらの検出装置では、誘電体からなるプリズムと、プリズムの一面上に形成された金属膜と、金属膜上に固定された捕捉体（例えば抗体）とを有する検出チップを使用する。金属膜上に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質が捕捉体により捕捉される（１次反応）。捕捉された被検出物質は、さらに蛍光物質で標識される（２次反応）。この状態で、表面プラズモン共鳴が生じる角度で、プリズムを介して金属膜に励起光を照射すると、金属膜表面上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から蛍光が放出される。これらの検出装置では、この蛍光を検出して、被検出物質の存在または量を検出する。
　このようなＳＰＦＳを利用する検出装置では、微弱な蛍光を定量的に検出するために、光電子増倍管（Photomultiplier Tube：ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（Avalanche photodiode：ＡＰＤ）などの高感度な光センサーを用いることが必要である。
特開平１０－３０７１４１号公報 国際公開第２０１２／０４２８０７号
　ＳＰＦＳを利用する検出装置では、検出感度および検出精度を十分に向上させるために、蛍光強度が最大となるように金属膜に対する励起光の入射角を設定する必要がある。
　特許文献１に記載の検出装置では、金属膜からの反射光の強度が最小となるときの入射角（以下、「共鳴角」という）で励起光を照射している。しかしながら、蛍光の強度が最大となるときの入射角と共鳴角とはわずかに異なるため、特許文献１に記載の検出装置には、検出感度および検出精度に改善の余地がある。
　一方、特許文献２に記載の検出装置では、表面プラズモン共鳴により発生する散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）の強度が最大となるときの入射角（以下、「増強角」という）で励起光を照射している。増強角は、共鳴角よりも蛍光の強度が最大となるときの入射角に近いため、特許文献２に記載の検出装置は、特許文献１に記載の検出装置に比べて検出感度および検出精度の点で優れている。しかしながら、特許文献２に記載の検出装置では、蛍光を検出するための受光センサーを用いてプラズモン散乱光も検出するため、増強角を決定する際に受光光学系の光路から励起光カットフィルター（光学フィルター）を退避させなければならないという問題がある。
　本発明の目的は、光学フィルターを受光光学系の光路から退避させることなく、プラズモン散乱光が最大となる増強角を決定することができる検出装置を提供することである。
　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出装置は、誘電体からなるプリズムと、前記プリズムの一面上に配置された金属膜とを有する検出チップが装着され、前記プリズムを介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質を表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、前記被検出物質の存在または量を検出する検出装置であって、前記検出チップを保持するホルダーと、励起光を出射する光照射部と、前記プリズムを介して前記金属膜に所定の入射角で励起光を照射するために、前記金属膜に対する励起光の入射角を調整する角度調整部と、前記光照射部が前記金属膜に対して励起光を照射したときに、前記検出チップから放出された光を検出する受光センサーと、前記検出チップから放出された光を前記受光センサーに導く受光光学系と、前記受光光学系内に配置され、前記励起光と同じ波長の光であるプラズモン散乱光の一部を遮断する光学フィルターと、前記角度調整部を制御する制御部と、を有し、前記光学フィルターは、前記検出チップから放出された光のうち、前記プラズモン散乱光の一部と、前記蛍光物質から放出された蛍光とを透過させ、前記受光センサーは、前記金属膜上に前記蛍光物質が存在しない状態で、前記光照射部が前記金属膜に対して励起光を照射したときに、前記検出チップから放出され、前記光学フィルターを透過した前記プラズモン散乱光の一部を検出し、前記制御部は、前記受光センサーの前記プラズモン散乱光の検出結果に基づいて、前記所定の入射角を決定し、前記角度調整部を制御して、前記金属膜に対する励起光の入射角を前記所定の入射角に調整し、前記受光センサーは、前記金属膜上に前記蛍光物質で標識された前記被検出物質が存在する状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記光照射部が前記金属膜に対して前記所定の入射角で励起光を照射したときに、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出する。
　本発明によれば、ＳＰＦＳを利用する被検出物質の検出において、光学フィルターを受光光学系の光路から退避させることなく、プラズモン散乱光が最大となる増強角を決定することができる。したがって、本発明によれば、高感度、高精度かつ高速に被検出物質の存在またはその量を検出することができる。また、本発明によれば、検出装置の小型化および低コスト化を実現することもできる。
図１は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。 図２Ａ、Ｂは、ＰＭＴおよびＰＤの検出精度を示す概念グラフである。 図３は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図４Ａ～Ｃは、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置における励起光カットフィルターの機能を説明するための概念グラフである。 図５は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
　［実施の形態１］
　（検出装置の構成）
　まず、本発明の実施の形態１に係る検出装置の代表例として、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（以下「ＳＰＦＳ装置」ともいう）について説明する。
　図１は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、検出チップ１０に励起光αを照射するための励起光照射ユニット（光照射部）１１０と、検出チップ１０から放出された光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）を検出するための受光ユニット１２０と、これらを制御する制御部１３０と、検出チップ１０を着脱可能に保持するためのチップホルダー１４０と、検出チップ１０に送液するための送液ユニット（不図示）とを有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１４０に検出チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、検出チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
　図１に示されるように、検出チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２上に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、検出チップ１０は、検出のたびに交換される。検出チップ１０は、好ましくは、各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
　プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２の上には、金属膜３０が形成される。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０で反射する。より具体的には、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０で反射した励起光αをプリズム２０の外部に出射させる。
　プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αが励起光源であるレーザーダイオードに戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまうからである。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。たとえば、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
　プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折および自家蛍光が小さい樹脂である。
　金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に形成されている。金属膜３０を設けることで、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。金属膜３０の素材は、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の素材の例には、金、銀、銅、アルミニウム、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内が好ましい。
　また、図１では図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。これにより、被検出物質を選択的に検出するための検出領域を形成することができる。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的に結合可能な抗体またはその断片である。
　流路蓋４０は、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面上に、流路４１を挟んで配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、流路４１を挟んで成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、検体や蛍光標識液、洗浄液などの液体が流れる流路４１を形成する。捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された注入口および排出口（いずれも図示省略）とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、流路４１内において、これらの液体は捕捉体に接触する。流路蓋４０は、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面およびその近傍から放出された光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）に対して透明な材料からなる。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。これらの光を受光ユニット１２０に導くことができれば、流路蓋４０の一部は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープまたは接着剤による接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
　図１に示されるように、プリズム２０へ導かれた励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）となるように入射する。界面からの反射光は、出射面２３からプリズム２０外に出射される（図示省略）。一方、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光αが界面に入射することで、金属膜３０およびその近傍から、プラズモン散乱光βおよび蛍光γが、受光ユニット１２０の方向へ出射される。また、検出チップ１０を構成する樹脂部材（プリズム２０）から、自家蛍光が放出される（図示省略）。
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット（光照射部）１１０、受光ユニット１２０、制御部１３０およびチップホルダー（ホルダー）１４０を有する。
　励起光照射ユニット１１０は、励起光αを出射する光源ユニット１１１と、プリズム２０および金属膜３０の界面（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を調整する角度調整部１１２とを有する。
　光源ユニット１１１は、励起光αの光源を有し、チップホルダー１４０に保持された検出チップ１０の入射面２１に向けて励起光α（シングルモードレーザー光）を出射する。より具体的には、光源ユニット１１１は、検出チップ１０のプリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対して励起光αが全反射角度となるように、界面に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。
　光源の種類は、特に限定されないが、受光センサー１２５としてフォトダイオード（ＰＤ）などの高感度でない光検出器を使用する場合、受光センサー１２５の受光光量を増やす観点から、光源はハイパワーであることが好ましい。光源は、例えば、金属膜３０上の被照射面におけるパワーが１ｍＷ／ｍｍ２以上となるように励起光αを照射できるレーザーダイオード（ＬＤ）である。これにより、被検出物質を標識する蛍光物質からより強い強度の蛍光γを放出させることができる。また、ＬＤが出射する励起光αの波長は特に限定されないが、例えば、６５０～６７０ｎｍであることが好ましい。高出力のＬＤを安価に入手できるためである。光源の種類の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。
　また、光源から出射される励起光αがビームでない場合には、光源から出射される励起光αは、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される励起光αが単色光でない場合には、光源から出射される励起光αは、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される励起光αが直線偏光でない場合には、光源から出射される励起光αは、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
　また、光源ユニット１１１は、整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも図示省略）をさらに有する。
　整形光学系は、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が所定サイズの円形状となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。整形光学系から出射された励起光αは、検出チップ１０のプリズム２０に照射される。整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター（ＢＰＦ）、直線偏光フィルター（ＬＰ）、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。
　コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。
　バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。
　直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分の光が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
　ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
　温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
　角度調整部１１２は、金属膜３０（成膜面２２）への励起光αの入射角を調整する。角度調整部１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダーとを相対的に回転させる。本実施の形態では、角度調整部１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸を中心として回転させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０（成膜面２２）上での照射位置がほとんど移動しないように、回転軸の位置を設定する。たとえば、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
　受光ユニット１２０は、チップホルダー１４０に保持された検出チップ１０の金属膜３０のプリズム２０と対向しない面に対向するように配置されている。より具体的には、後述の第１レンズ１２２、第２レンズ１２４および受光センサー１２５が、金属膜３０（成膜面２２）における励起光αの照射スポットを通る、金属膜３０表面に垂直な直線上に位置するように、受光ユニット１２０は配置されている。受光ユニット１２０は、検出チップ１０から放出される光（プラズモン散乱光β、蛍光γおよび自家蛍光）を検出する。受光ユニット１２０は、第１レンズ１２２、励起光カットフィルター１２３および第２レンズ１２４を含む受光光学系１２１と、受光センサー１２５とを有する。受光光学系１２１は、検出チップ１０から放出された光を受光センサー１２５に導く。
　第１レンズ１２２および第２レンズ１２４は、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。第１レンズ１２２と第２レンズ１２４との間を進行する光は、略平行光となる。第１レンズ１２２および第２レンズ１２４は、検出チップ１０から放出される光を受光センサー１２５の受光面上に結像させる。また、この後説明するように、第１レンズ１２２および第２レンズ１２４は、励起光カットフィルター１２３と共に、検出チップ１０から出射される光（プラズモン散乱光β、蛍光γおよび自家蛍光）を受光センサー１２５の受光面に集光させる。
　励起光カットフィルター（光学フィルター）１２３は、第１レンズ１２２および第２レンズ１２４の間に配置されている。励起光カットフィルター１２３は、励起光αと同一の波長の光（プラズモン散乱光β）の一部（大部分）を遮断する。一方で、励起光カットフィルター１２３は、検出チップ１０から放出された光のうち、プラズモン散乱光βの一部と、蛍光物質から放出された蛍光γとを透過させる。本実施の形態では、励起光カットフィルター１２３は、検出チップ１０から放出された自家蛍光の少なくとも一部もさらに透過させる。詳細については後述するが、これにより、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光γ検出時におけるノイズ成分となるプラズモン散乱光βの大部分を除去して、被検出物質を高精度に検出でき、かつ励起光カットフィルター１２３を退避させることなく、透過されたプラズモン散乱光βを受光センサー１２５で検出して増強角を決定することができる。このような効果を発揮することができれば、励起光カットフィルター１２３のプラズモン散乱光βの透過率は、特に限定されないが、０．００５％超かつ１％未満であることが好ましい。また、励起光カットフィルター１２３は、検出チップ１０から放出される自家蛍光の光量に対するプラズモン散乱光βの光量が０．５倍超かつ１００倍未満となるように、プラズモン散乱光βを透過させることが好ましい。
　励起光カットフィルター１２３の種類の例には、片面または両面に誘電体多層膜が配置された反射型フィルターが含まれる。誘電体多層膜は、高屈折率材料からなる層と低屈折率材料からなる層とを交互に繰り返し積層することで形成されうる。このとき、各層の厚みや数などを適切に設定することで、所望の透過特性のフィルターを得ることができる。高屈折率材料の例には、ＴｉやＮｂ、Ｔａ、Ｌａなどの酸化物（例えば、ＴｉＯ２、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５など）が含まれる。低屈折率材料の例には、ＳｉやＡｌなどの酸化物（例えば、ＳｉＯ２など）が含まれる。たとえば、ガラス基板（ＢＫ７）の表面に、Ｎｂ２Ｏ５層（厚み約１００ｎｍ）とＳｉＯ２層（厚み約１００ｎｍ）とを交互に４０～５０層積層して誘電体多層膜（厚み４０００～５０００ｎｍ）を形成することで、励起光カットフィルター１２３を作製することができる。このようにして得られる励起光カットフィルター１２３では、フィルターへの主光線の入射角が０°の場合、励起光αの波長と同じ波長の光（例えば、６６０ｎｍ）の反射率は９９％以上であり、励起光αの波長より３０ｎｍ波長が大きい光（例えば、６９０ｎｍ）の反射率は数％以下である。
　励起光カットフィルター１２３の種類の他の例には、色ガラスからなる吸収型フィルターが含まれる。一般的に、吸収型フィルターの透過スペクトルにおいて、カットオフ波長（励起光カットフィルター１２３が励起光αを吸収する波長帯域と、励起光αを透過させる波長帯域との境界を示す波長）近傍の透過率をシャープに立ち上げることは難しい。このため、反射型フィルターと比較して、透過型フィルターの励起光αの遮光性は劣る。しかしながら、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、励起光カットフィルター１２３は、プラズモン散乱光βの一部を透過させる。このため、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、遮光性は劣るものの、安価な色ガラスフィルターを使用することができる。
　受光センサー１２５は、検出チップ１０から放出された光を検出する。たとえば、受光センサー１２５の種類の例には、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管（ＰＭＴ）およびアバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）が含まれる。ハイパワーの光源を使用する場合には、受光センサー１２５として、高感度でないフォトダイオード（ＰＤ）などを使用してもよい。ＳＰＦＳ装置１００の小型化および低コスト化の観点からは、ＰＤを使用することが好ましい。
　一般的に、受光センサー１２５からの出力値は、受光光量、受光感度および増幅倍率に比例する。図２Ａ、Ｂは、ＰＭＴおよびＰＤの検出精度を示す概念グラフである。図２Ａは、受光センサー１２５からの出力値と、検出値の標準偏差（ばらつき）σとの関係を示す概念グラフである。図２Ｂは、出力値からブランク値Ｂを減算したシグナル値Ｓ（Ｓ＝出力値－Ｂ：蛍光光量に相当）と光学ブランク値Ｂとの比（Ｓ／Ｂ比）と、変動係数ＣＶ（標準偏差σとシグナル値Ｓとの比（σ／Ｓ比））との関係を示す概念グラフである。図２Ｂにおけるシグナル値Ｓの範囲は、図２ＡにおいてＰＤの標準偏差σがＰＭＴの標準偏差σより小さくなるときの範囲について示している。また、図２Ａ、Ｂにおいて、破線はＰＭＴについて示し、実線はＰＤについて示す。
　図２Ａに示されるように、ＰＭＴのような高感度な受光センサーについては、出力値が小さいときには標準偏差σは小さいものの、出力値が大きくなるに伴い標準偏差σも大きくなる。このため、変動係数ＣＶ（σ／Ｓ）は、シグナル値Ｓが大きくなっても、それほど小さくならない。これに対し、ＰＤのような低感度な受光センサーについては、シグナル値Ｓが極めて小さい領域での標準偏差σは大きいが、標準偏差σの増加率が小さいため、変動係数ＣＶは、シグナル値Ｓが大きくなるほど飛躍的に小さくなる。このため、受光センサー１２５からのシグナル値Ｓを増やせば、ＰＭＴを使用した場合と比較して、ＰＤを使用した場合の方がより正確な測定をすることができる。
　また、図２ＡのＰＤの標準偏差σがＰＭＴの標準偏差σより小さい出力値を示す領域においては、図２Ｂに示されるように、シグナル値Ｓに対して光学ブランク値Ｂが大きくなった（Ｓ／Ｂが小さくなった）としても、ＰＭＴの変動係数ＣＶと比較してＰＤの変動係数ＣＶの増加率は小さい。このため、シグナル値Ｓに対して光学ブランク値Ｂが大きくなった（Ｓ／Ｂが小さくなった）としても、ＰＭＴを使用した場合と比較して、ＰＤを使用した場合の方がより正確な測定をすることができる。
　ＰＤの受光感度は、ＰＭＴと比較して、数万分の１（例えば、５万分の１）倍であるため、本実施の形態では、増幅倍率を、ＰＭＴを使用する場合の１０００倍とし、かつ励起光αの光量を、ＰＭＴを使用する場合の２０～５０倍としている。これにより、同一の検出チップ１０を使用して検出を行っても、ＰＭＴを使用した場合と、ＰＤを使用した場合とで同程度のシグナル値Ｓを得ることができる。このように、ＰＤの標準偏差σがＰＭＴの標準偏差σより小さくなるようにシグナル値Ｓ（出力値）を増やすことで、ＰＤを使用した場合に、ＰＭＴを使用するよりも高精度に検出を行うことができる。
　なお、金属膜３０の一方の面（プリズム２０と対向する面）における励起光αの照射スポットの大きさは、金属膜３０の他方の面（第１レンズ１２２と対向する面）における受光センサー１２５による検出領域の大きさよりも小さくなるように調整される。このようにすることで、プリズム２０の各パラメータの誤差により照射スポットがわずかに位置ずれした場合であっても、照射スポットが検出領域から外れることを防止できる。
　制御部１３０は、各駆動部の制御や、受光センサー１２５における受光量の定量化などを一元的に行う。本実施の形態では、制御部１３０は、光源ユニット１１１を制御する光源制御部１３１と、受光センサー１２５を制御する受光センサー制御部１３２と、制御処理部１３３とを有する。制御処理部１３３は、角度調整部１１２、光源制御部１３１および受光センサー制御部１３２を包括的に制御して、ＳＰＦＳ装置１００全体の動作を制御する。制御部１３０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。後述するように、制御部１３０（制御処理部１３３）は、受光センサー１２５によるプラズモン散乱光βの検出結果に基づいて、所定の入射角（本実施の形態では、増強角）を決定し、角度調整部１１２を制御して、蛍光検出時の金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を調整する。
　チップホルダー１４０は、所定の位置で検出チップ１０を保持する。検出チップ１０は、チップホルダー１４０に保持された状態で、励起光照射ユニット１１０からの励起光αを照射される。このとき、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面およびその近傍からは、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光β、蛍光物質から放出された蛍光γおよび検出チップ１０の自家蛍光が上方に放出される。また、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面で反射して、プリズム２０の外部に出射される（図示省略）。
　（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
　次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作について説明する。図３は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。
　まず、検出の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１４０に検出チップ１０を設置する。また、検出チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
　次いで、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する（工程Ｓ２０）。具体的には、制御処理部１３３は、光源ユニット１１１および角度調整部１１２を制御して、金属膜３０上に蛍光物質が存在しない状態で、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査する。同時に、制御処理部１３３は、受光センサー１２５が検出チップ１０から放出された光（プラズモン散乱光βおよび検出チップ１０の自家蛍光）を検出するように、受光センサー制御部１３２を制御する。このとき、検出チップ１０から放出されたプラズモン散乱光βは、第１レンズ１２２によりコリメートされ、励起光カットフィルター１２３に到達する。励起光カットフィルター１２３は、プラズモン散乱光βの一部と、検出チップ１０の自家蛍光とを透過させる。励起光カットフィルター１２３を透過した光は、第２レンズ１２４で集光され、受光センサー１２５で検出される。これにより、制御処理部１３３は、励起光αの入射角と、検出チップ１０から放出された光の強度との関係を含むデータを得る。そして、制御処理部１３３は、データを２次近似などのフィッティングにより解析して、検出した光の強度（検出値）が最大となる入射角（増強角）を決定する。
　なお、増強角は、基本的には、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、検出を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０.１°程度のオーダーで決定される。
　次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、工程Ｓ２０で決定した増強角に設定する（工程Ｓ３０）。具体的には、制御処理部１３３は、角度調整部１１２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に調整する。以後の工程では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角は、増強角のままである。
　次いで、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、励起光カットフィルター１２３を透過した光（検出チップ１０の自家蛍光およびプラズモン散乱光β）の強度（光学ブランク値）を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御処理部１３３は、光源制御部１３１を制御して、光源ユニット１１１に励起光αを出射させる。同時に、制御処理部１３３は、受光センサー１２５が励起光カットフィルター１２３を透過した光を検出するように、受光センサー制御部１３２を制御する。測定値は、制御処理部１３３に送信され、光学ブランク値として記録される。
　次いで、検体中の被検出物質と捕捉体とを反応させる（１次反応；工程Ｓ５０）。具体的には、送液ユニット側において検出チップ１０の流路４１内に検体を注入して、検体と捕捉体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は捕捉体により捕捉される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。
　次いで、捕捉体に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ６０）。具体的には、流路４１内に蛍光標識液を注入する。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。蛍光標識液が流路４１に注入されると、蛍光標識液が被検出物質に接触し、被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。
　最後に、金属膜３０上に蛍光物質で標識された被検出物質が存在する状態で、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、検出チップ１０から放出される蛍光γを検出して、蛍光値を測定する（工程Ｓ７０）。具体的には、制御処理部１３３は、光源制御部１３１を制御して、光源ユニット１１１に励起光αを出射させる。同時に、制御処理部１３３は、受光センサー１２５が金属膜（金属膜３０およびその近傍）上から放出される蛍光γを検出するように、受光センサー制御部１３２を制御する。制御処理部１３３は、検出値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する。蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
　以上の手順により、励起光カットフィルター１２３を受光光学系１２１の光路から退避させることなく、検体中の被検出物質の存在またはその量を高精度に検出することができる。
　ここで、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００において使用される、プラズモン散乱光βを一部透過させる励起光カットフィルター１２３の機能について説明する。ここでは、励起光カットフィルター１２３としてプラズモン散乱光βを一部透過させる色ガラス（プラズモン散乱光βの透過率が約０．０８％）を使用してプラズモン散乱光βを測定することで、増強角を決定する場合について説明する。比較のために、励起光カットフィルターとしてプラズモン散乱光βをほぼ完全に遮断する高性能バンドパスフィルター（ＢＰＦ；プラズモン散乱光βの透過率が０．０１％以下）を使用した場合と、励起光カットフィルターを使用しない場合とについても説明する。
　図４Ａ～Ｃは、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００における励起光カットフィルター１２３の機能を説明するための概念グラフである。図４Ａは、励起光カットフィルターとしてプラズモン散乱光βをほぼ完全に遮断する高性能バンドパスフィルター（ＢＰＦ）を使用した場合における、励起光αの入射角と受光センサー１２５の受光光量との関係を示す。図４Ｂは、励起光カットフィルターを使用しない場合における、励起光αの入射角と受光センサー１２５の受光光量との関係を示す。図４Ｃは、プラズモン散乱光βを一部透過させる励起光カットフィルター１２３を使用した場合における、励起光αの入射角と受光センサー１２５の受光光量との関係を示す。いずれのグラフにおいても、金属膜３０上に蛍光物質が存在しない状態で、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査している。図４Ａ～Ｃにおいて、一点鎖線は、検出チップ１０から放出される自家蛍光を示し、破線はプラズモン散乱光βを示し、実線は自家蛍光およびプラズモン散乱光βの和を示す。
　図４Ａに示されるように、プラズモン散乱光βをほぼ完全に遮断する励起光カットフィルターを使用する場合、ほぼすべてのプラズモン散乱光βは遮断されるため、受光センサー１２５に到達する光は、主として、検出チップ１０から放出される自家蛍光からなる。プラズモン散乱光βの光量は、金属膜３０上で生じる表面プラズモン共鳴の影響により、励起光αの入射角に応じて大きく変化するのに対し（図４Ｂの破線参照）、自家蛍光の光量は、表面プラズモン共鳴による影響を受けない（図４Ａの一点鎖線参照）。このため、プラズモン散乱光βをほぼ完全に遮断する励起光カットフィルターを使用する場合、励起光αの入射角を変えても表面プラズモン共鳴に起因する受光センサー１２５の受光光量の変化を検出することができない（図４Ａの実線参照）。その結果、適切に増強角を決定することができない。
　一方、図４Ｂに示されるように、励起光カットフィルターを使用しない場合、受光センサー１２５に到達する光には、プラズモン散乱光βおよび自家蛍光が含まれる。このとき、プラズモン散乱光βは励起光カットフィルターで全く遮断されないため、プラズモン散乱光βの光量は、自家蛍光よりも圧倒的に多い。このため、プラズモン散乱光βが最大となるときの励起光αの入射角を検出することで、増強角を決定することができる。しかしながら、この態様では、プラズモン散乱光βをほぼ完全に遮断する励起光カットフィルターを使用する態様（図４Ａ参照）と比較して、約１０００倍以上のプラズモン散乱光βが検出される。これにより、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される微弱な蛍光γを検出する工程（工程Ｓ７０）では、このプラズモン散乱光βがノイズとなってしまい、ＳＮ比が低下する原因となる。
　したがって、プラズモン散乱光βをほぼ完全に遮断する励起光カットフィルターを有する従来のＳＰＦＳ装置では、高精度な検出を実現するために、増強角を決定する工程（工程Ｓ２０）では、光路上から励起光カットフィルターを退避させた状態でプラズモン散乱光βを検出し、蛍光γを検出する工程（工程Ｓ７０）では、光路上に励起光カットフィルターを挿入してプラズモン散乱光βを遮断した状態で蛍光γを検出していた。
　これに対して、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、励起光カットフィルター１２３は、検出チップ１０から放出された光のうち、プラズモン散乱光βの一部と、自家蛍光と、蛍光物質から放出された蛍光γとを透過させることができる。このため、図４Ｃに示されるように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、増強角を測定するために必要な光量であって、かつ蛍光γの検出に妨げとならない適切な光量のプラズモン散乱光βを受光センサー１２５に到達させることができる。このため、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、増強角を決定する工程（工程Ｓ２０）において、光路上から励起光カットフィルター１２３を退避させる必要がない。
　このとき、適切な光量のプラズモン散乱光βを透過させる観点から、励起光カットフィルター１２３のプラズモン散乱光βの透過率は、０．００５％超かつ１％未満であることが好ましい。また、励起光カットフィルター１２３は、検出チップ１０から放出される自家蛍光の光量に対するプラズモン散乱光βの光量が０．５倍超かつ１００倍未満となるように、プラズモン散乱光βを透過させることが好ましい。これにより、自家蛍光に対して十分に強いプラズモン散乱光βを受光することで、増強角（プラズモン散乱光βの光量の極大値）を決定することができるとともに、蛍光γの検出の妨げにならない程度にプラズモン散乱光βの透過光量を抑えることで、蛍光γを高精度に検出することができる。
　（効果）
　以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、検出チップ１０から放出され、励起光カットフィルター１２３を透過したプラズモン散乱光βの一部の光を利用して、増強角を決定することができる。このため、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、励起光カットフィルター１２３を受光光学系１２１の光路上から退避させることなく、増強角を決定することができる。したがって、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、従来のＳＰＦＳ装置（特許文献２参照）のように励起光カットフィルター１２３の位置を切替える機構が不要であり、検出装置の小型化および低コスト化を実現することができる。また、本実施の形態に係る検出装置では、励起光カットフィルター１２３の位置を切替える工程が不要であるため、検出時間を短縮化することができる。
　また、本実施の形態では、１次反応（工程Ｓ５０）および２次反応（工程Ｓ６０）を連続して行い、両工程の間で検出チップ１０を、送液ユニット側から励起光照射ユニット１１０および受光ユニット１２０側に移動させていない。このため、検出チップ１０の移動時間分、検出にかかる合計時間を短縮することができる。また、１次反応時間と、２次反応時間と、１次反応および２次反応の間隔時間とを一定に保つことにより、測定精度を向上させることもできる。一方で、１次反応（工程Ｓ５０）を行った後に、増強角の決定（工程Ｓ２０）、入射角の増強角への設定（工程Ｓ３０）および光学ブランク値の測定（工程Ｓ４０）を行ってもよい。この場合、１次反応（工程Ｓ５０）と２次反応（工程Ｓ６０）との間に検出チップ１０を移動させる必要があるものの、捕捉体に被検出物質が捕捉された状態で増強角の決定、および光学ブランク値の測定をすることができる。その結果、蛍光値を測定する工程（工程Ｓ７０）に、より近い状態で増強角を決定し、かつ光学ブランク値を測定できるため、増強角をより正確に決定し、かつ光学ブランク値をより正確に測定することができ、測定精度をより向上させることができる。
　従来は、微少量の検体の濃度を正確に検出する観点から、シグナル値／ブランク値（Ｓ／Ｂ）比を高くするために、高性能ＢＰＦを用い、かつ励起光αをできるだけ除去するという方法や、微弱なシグナルを低ノイズで検出可能な高感度な受光センサー（例えばＰＭＴ）を用いるという手法などが用いられてきた。しかし、前述のとおり、この場合、励起光カットフィルター１２３を光路上から退避させなければならない。
　これに対し、本実施の形態では、プラズモン散乱光βの一部を透過させる励起光カットフィルター１２３（例えば、色ガラスフィルター）と、ＰＭＴより検出感度の低いＰＤを使用する。このため、プラズモン散乱光βの一部を透過させることで、Ｓ／Ｂ比は低下する。しかしながら、ＰＭＴを使用した場合と比較して、ＰＤを使用した場合には、受光光量が増加したとしても検出値の標準偏差σの増加率がより小さい。また、受光光量が大きいときは変動係数ＣＶ（σ／Ｓ）が小さくなり、Ｓ／Ｂ比が低下したとしても変動係数ＣＶの増大を抑えることができる。これらの結果として、ＰＭＴを使用した場合と比較して、ＰＤを使用した場合には、より高精度な検出を行うことができる（図２Ａ、Ｂ参照）。
　［実施の形態２］
　実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様に、励起光照射ユニット１１０、受光ユニット２２０、制御部１３０およびチップホルダー１４０を有する。実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００は、受光ユニット２２０の構成のみが実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、本実施の形態では、受光ユニット２２０についてのみ説明する。
　図５は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置２００の構成を示す模式図である。図５に示されるように、受光ユニット２２０は、導光部材（導光ロッド２２６）および励起光カットフィルター１２３を含む受光光学系２２１と、受光センサー１２５とを有する。受光光学系２２１は、検出チップ１０から放出された光を受光センサー１２５に導く。
　導光ロッド２２６は、透光性を有し、検出チップ１０から放出された光（プラズモン散乱光β、蛍光γおよび自家蛍光）を一端に位置する入射面２２７で入射させ、他端に位置する出射面２２８で出射させて受光センサー１２５に導く。
　導光ロッド２２６の形状および材料は、検出チップ１０から放出された光を受光センサー１２５に導くことができれば特に限定されない。導光ロッド２２６の形状は、導光ロッド２２６の軸方向に直交する断面において、入射面２２７から出射面２２８に向かってその断面積が一定である円柱形状であってもよいし、断面積が一定でないテーパー形状であってもよい。また、入射面２２７および出射面２２８の形状は、平面形状であってもよいし、曲面形状であってもよい。本実施の形態では、導光ロッド２２６は円柱形状であり、入射面２２７および出射面２２８の形状は、平面形状である。導光ロッド２２６の材料の例には、透明な樹脂および透明なガラスが含まれる。また、導光ロッド２２６の屈折率は、特に限定されないが、１．４～２．０程度であることが好ましい。
　導光ロッド２２６の開口数（ＮＡ）は、高いことが好ましい。これにより、検出チップ１０から放出された光を多く入射させることができる。
　また、導光ロッド２２６の側面には、導光ロッド２２６の入射面２２７で入射した蛍光γの漏洩を防止するための反射膜が形成されていてもよい。反射膜は、例えばアルミニウムや金などの蒸着膜である。
　導光ロッド２２６の入射面２２７は、円柱における一方の端面（底面）であり、金属膜３０の表面に対向して配置されている。導光ロッド２２６の入射面２２７と検出チップ１０の検出領域との間隔は、０．５～５．０ｍｍ程度である。導光ロッド２２６の入射面２２７の直径は、検出領域の最大長さより長い。これにより、検出領域から放出された蛍光γを効率的に導光ロッド２２６に入射させることができる。ここで「検出領域の最大長さ」とは、検出領域の外縁部上の２点を両端とする線分のうち最も長い線分の長さをいう。たとえば、検出領域が円形であった場合、検出領域の最大長さは直径である。また、検出領域が矩形であった場合、検出領域の最大長さは対角線の長さである。
　出射面２２８は、円柱における他方の端面（底面）であり、受光センサー１２５の受光面（またはその手前に配置された励起光カットフィルター１２３）に対向して配置されている。出射面２２８と受光センサー１２５の受光面との間隔は、０．５～５．０ｍｍ程度である。導光ロッド２２６の出射面２２８の直径は、受光センサー１２５の受光面の最大長さより短いことが好ましい。なお、「受光面の最大長さ」とは、受光センサー１２５の受光面の外縁部上の２点を両端とする線分のうち最も長い線分の長さを意味する。
　励起光カットフィルター１２３は、チップホルダー１４０と導光ロッド２２６の入射面２２７との間に配置されていてもよいし、導光ロッド２２６の出射面２２８と受光センサー１２５との間に配置されていてもよい。本実施の形態では、励起光カットフィルター１２３は、導光ロッド２２６の出射面２２８と受光センサー１２５との間に配置されている。
　励起光カットフィルター１２３の種類によっては、透過特性に入射角依存性を有するものがある。たとえば、誘電体多層膜からなる励起光カットフィルター１２３では、光線が入射角０°で入射する場合と比較して、光線が０°より大きい入射角で入射する場合に励起光カットフィルター１２３のカットオフ波長が短波長側に変化する。このため、様々な入射角で光線が励起光カットフィルター１２３に入射する場合、励起光カットフィルター１２３は、入射した一部の光を透過させることができる。本実施の形態では、導光ロッド２２６の出射面２２８から出射された光は、様々な入射角で励起光カットフィルター１２３に入射する。結果として、励起光カットフィルター１２３における光透過特性の入射角依存性を利用して、適切な量のプラズモン散乱光βを透過させることができる。このとき、プラズモン散乱光βの透過光量は、励起光カットフィルター１２３のカットオフ波長と導光ロッドのＮＡとを任意に設定し、励起光カットフィルター１２３への入射角度範囲を制御することで、容易に適切な量に設定することができる。このため、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置２００では、励起光カットフィルター１２３として、高性能ＢＰＦを使用してもよい。この場合、高性能ＢＰＦは入射角０°で入射する、励起光αの波長と同じ波長のプラズモン散乱光βをほぼ完全に遮断するが、導光ロッド２２６を使用することで０°より大きい入射角で入射する光線を透過させることができる。一方、高性能ＢＰＦだけでなく、入射角０°で入射する励起光αに対して遮光率が悪い低性能ＢＰＦや、色ガラスフィルターなどの吸収側フィルターなどのように、より安価な光学フィルターを使用してもよい。吸収型フィルターでは、吸収色素の含有量やフィルターの厚さを制御することで、容易にプラズモン散乱光βの透過率を制御することができる。
　（効果）
　本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置２００は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様に、プラズモン散乱光βの一部を透過させることで励起光カットフィルター１２３を受光光学系２２１の光路上から退避させることなく、増強角を測定することができる。また、ＳＰＦＳ装置２００では、導光ロッド２２６を使用することにより、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００のように共役光学系を構成する必要がないため、さらなる検出装置の小型化および低コスト化を実現することができる。また、受光センサー１２５としてＰＤを使用し、励起光カットフィルター１２３として色ガラスフィルターを使用することで、さらなる小型化および低コスト化を実現することができる。
　なお、上記実施の形態２では、導光ロッド２２６および励起光カットフィルター１２３が別体化されている場合について説明したが、励起光カットフィルター１２３は、導光ロッド２２６と一体化されていてもよい。たとえば、導光ロッド２２６の入射面２２７または出射面２２８に誘電体多層膜を形成することで、導光ロッド２２６および励起光カットフィルター１２３を一体化してもよいし、導光ロッド２２６を色ガラスフィルターと同じ材料で形成してもよい。これにより、ＳＰＦＳ装置２００をさらに小型化し、かつ簡素化することができる。
　本出願は、２０１５年３月１７日出願の特願２０１５－０５３４６７に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明に係る検出装置は、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
　１０　検出チップ
　２０　プリズム
　２１　（プリズムの）入射面
　２２　成膜面
　２３　（プリズムの）出射面
　３０　金属膜
　４０　流路蓋
　４１　流路
　１００、２００　ＳＰＦＳ装置
　１１０　励起光照射ユニット
　１１１　光源ユニット
　１１２　角度調整部
　１２０、２２０　受光ユニット
　１２１、２２１　受光光学系
　１２２　第１レンズ
　１２３　励起光カットフィルター
　１２４　第２レンズ
　１２５　受光センサー
　２２６　導光ロッド
　２２７　（導光ロッドの）入射面
　２２８　（導光ロッドの）出射面
　１３０　制御部
　１３１　光源制御部
　１３２　受光センサー制御部
　１３３　制御処理部
　１４０　チップホルダー
　α　励起光
　β　プラズモン散乱光
　γ　蛍光

Claims (7)

  1. 　誘電体からなるプリズムと、前記プリズムの一面上に配置された金属膜とを有する検出チップが装着され、前記プリズムを介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質を表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、前記被検出物質の存在または量を検出する検出装置であって、
    　前記検出チップを保持するホルダーと、
    　励起光を出射する光照射部と、
    　前記プリズムを介して前記金属膜に所定の入射角で励起光を照射するために、前記金属膜に対する励起光の入射角を調整する角度調整部と、
    　前記光照射部が前記金属膜に対して励起光を照射したときに、前記検出チップから放出された光を検出する受光センサーと、
    　前記検出チップから放出された光を前記受光センサーに導く受光光学系と、
    　前記受光光学系内に配置され、前記励起光と同じ波長の光であるプラズモン散乱光の一部を遮断する光学フィルターと、
    　前記角度調整部を制御する制御部と、
    　を有し、
    　前記光学フィルターは、前記検出チップから放出された光のうち、前記プラズモン散乱光の一部と、前記蛍光物質から放出された蛍光とを透過させ、
    　前記受光センサーは、前記金属膜上に前記蛍光物質が存在しない状態で、前記光照射部が前記金属膜に対して励起光を照射したときに、前記検出チップから放出され、前記光学フィルターを透過した前記プラズモン散乱光の一部を検出し、
    　前記制御部は、前記受光センサーの前記プラズモン散乱光の検出結果に基づいて、前記所定の入射角を決定し、前記角度調整部を制御して、前記金属膜に対する励起光の入射角を前記所定の入射角に調整し、
    　前記受光センサーは、前記金属膜上に前記蛍光物質で標識された前記被検出物質が存在する状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が発生するように、前記光照射部が前記金属膜に対して前記所定の入射角で励起光を照射したときに、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出する、
    　検出装置。
  2. 　前記検出チップから放出された光には、前記検出チップの自家蛍光がさらに含まれ、
    　前記光学フィルターは、前記自家蛍光の光量に対する前記プラズモン散乱光の光量が０．５倍超かつ１００倍未満となるように、前記プラズモン散乱光を透過させる、
    　請求項１に記載の検出装置。
  3. 　前記光学フィルターにおける前記プラズモン散乱光の透過率は、０．００５％超かつ１％未満である、請求項１または請求項２に記載の検出装置。
  4. 　前記受光光学系は、前記検出チップから放出された光を、一端に位置する入射面で入射させ、他端に位置する出射面で出射させる導光ロッドを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出装置。
  5. 　前記受光センサーは、フォトダイオードである、請求項１～４のいずれか一項に記載の検出装置。
  6. 　前記光照射部は、前記金属膜上の被照射面におけるパワーが１ｍＷ／ｍｍ２以上となるように励起光を照射する、請求項１～５のいずれか一項に記載の検出装置。
  7. 　前記光照射部が出射する励起光の波長は、６５０～６７０ｎｍである、請求項１～６のいずれか一項に記載の検出装置。
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