WO2016129760A1 - Tnp(n2-(m-trifluorobenzyl), n6-(p-nitrobenzyl)purine)를 유효성분으로 함유하는 아세트아미노펜 유래 간 독성 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Tnp(n2-(m-trifluorobenzyl), n6-(p-nitrobenzyl)purine)를 유효성분으로 함유하는 아세트아미노펜 유래 간 독성 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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김세윤
한용만
김영란
이슬기
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Definitions

  • TNP (N2- (m-Tr if luorobenzy 1), N6- (-nitr Whyzy 1) ur i ne) 3 ⁇ 4 ⁇
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of liver toxicity, containing TNP (N2- (m-Tr if luorobenzy 1), N6- (pn it robenzyl) purine) or a salt acceptable by the pharmaceutical work as an active ingredient, and It relates to health functional food.
  • TNP N2- (m-Tr if luorobenzy 1), N6- (pn it robenzyl) purine
  • a salt acceptable by the pharmaceutical work as an active ingredient
  • TNP (N2- (m-Tr i ⁇ 1 iaor Plumbingzy 1), N6-()-ni : tr Anlagenzy 1-) ur ie) is a commercially available chemical and is known so far as inosyl pentakiphosphate. key, the better (pentakisphosphate inositol kinase) is a specific drug inhibition (J Biol Chem Apr 17, 2009 ; 284 (16):. 1057110582). TNP inhibits the biosynthesis of inositol pyrophosphate, which in turn lowers the level of polyphosphate in 5-inosine and increases the hepatic insulin signaling response. (Cell. 2010; 143 (6): 897910).
  • Acetaminophen developed in the United States in the 1950s and well known as Tylenol, is one of the world's most commonly used drugs for analgesic and antipyretic drugs (25 billion won in domestic annual sales of Tylenol), and its chemical name is N-acetyl. - ⁇ -aminophenol (N-acetyl_p-aminophenol), also called paracetamol (Dargan PI et al., Crit Care. 6 (2): 108-10. 2002). Acetaminophen is known to be administered orally up to 150 mg / kg body weight and up to 4 g / day in adults, and is classified as a safe over-the-counter drug without a doctor's prescription. However, acetaminophen can cause acute hepatic failure, liver necrosis, nephrotoxicity, and liver stiffness (1 iver cirrhosis) if overdose, causing severe death. It is a substance.
  • acetaminophen turns into a semi-ungotic substance that destroys cells by the action of some hepatic oxidase, which is usually not a problem because it is detoxified even when these substances are produced.
  • the body's detoxification material is altered, resulting in the destruction of liver cells.
  • a low concentration of acetaminophen is administered, it is combined with non-toxic glucononic acid and sulphate through biotransformation to remove toxicity and release into bile or plasma, 5- 10% Is metabolized by P450 (CYP), in particular CYP2E1 (Ray SD et al., J Pharmacol Exp Ther. 1996; 279: 1470-83).
  • acetaminophen is converted to N-acetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI) in the liver, and the converted metabolite is not toxic in combination with glutathione (Hazai E, et al. , Biochem Biophys Res Commun. 291 (4): 1089-1094. 2002).
  • NAPQI N-acetyl-p-benzoquinoneimine
  • gluconic acid and sulfate in the liver lose their ability to show nontoxicity, accumulating high semi-ungular NAPQI, causing fatal damage to the cell membrane, leading to death and incapacity of liver cells. Hepatotoxicity, eventually causing death (Webster PA et. Al., J Clin Pharmacol.
  • mice and hamsters are well known as liver damage models by acetaminophen administration, and similar phenomena have been reported in humans (Tee LB et a., Toxicol Appl Pharmacol. 83 (2): 294-314. 1986).
  • liver damage In addition, if you drink alcohol together, Toxic damage is more severe, and the US Food and Drug Administration (FDA) says that people who drink more than three drinks daily in 1998 can cause liver toxicity, so you should consult your doctor if you need to take this medicine. Mandatory notice.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • the liver is the main organ that controls the blood death of the human body and detoxifies the detoxification function. When the liver is damaged, it is very important to develop a drug that can protect the liver damage because it causes inflammatory reactions and various diseases in the human body. Accordingly, the present inventors have tried to find a substance that is effective in the prevention and treatment of liver damage.
  • An object of the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of liver toxicity containing TNP (N2- (m-Tri f luorobenzyl), N6- (p-ni trobenzyl) pur ine) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. It is to provide a composition.
  • the present invention is TNP (N2- (m-Tr if 1 uorobenzy 1), N6- ( ⁇ - ⁇ itr Anlagenzy 1) pur i ne) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • a pharmaceutical composition for preventing and treating liver toxicity is provided.
  • the present invention is TNP or its.
  • the present invention also provides a method for treating hepatotoxicity comprising administering a pharmaceutically effective ⁇ TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual suffering from hepatotoxic disease.
  • the present invention also provides a method for preventing hepatotoxicity comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also provides the use of TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use as a composition for preventing and treating liver toxicity.
  • the present invention also provides the use of TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use as a dietary supplement for preventing and improving liver toxicity.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating liver disease, which contains TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food for preventing and improving liver disease containing TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating liver disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual suffering from liver disease.
  • the present invention also provides a method for preventing liver disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention also provides the use of TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use as a composition for preventing and treating liver disease.
  • the present invention also provides the use of TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use as a dietary supplement for preventing and improving liver disease. [Favorable effect]
  • the present invention relates to a composition for the prevention and treatment of liver toxicity containing TNP (N2- (m-Tr if kiorobenzyl), N6-(-nitr Anlagenzy 1) pur i ne) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • TNP known as 5-anosi as an inhibitor of inosi tol pyrophosphate
  • GSH glutathione
  • JNK phosphorylated JNK
  • TNP N2- (m-Tr i f luorobenzyl), N6- (p-n i trobenzyl) pur ine).
  • FIG. 2 shows acetaminophen and hepatocytes differentiated from human embryonic stem cells.
  • Figure 3 is a graph showing the analysis of apoptosis according to acetaminophen and TNP treatment of mouse-derived hepatocytes.
  • Figure 4 is a graph showing the analysis of apoptosis according to acetaminophen and TNP treatment of the human liver cancer cell line (HepG2).
  • FIG. 5 is an enlarged view of the photograph of FIG. 4 by 200 times.
  • Figure 6 is a graph showing the analysis of the intracellular glutathione concentration according to acetaminophen and TNP treatment of mouse-derived hepatocytes.
  • Figure 7 is a diagram showing the analysis of JNK phosphorylation according to acetaminophen and TNP treatment of mouse-derived hepatocytes.
  • FIG. 8 is a diagram showing the analysis of JNK phosphorylation according to acetaminophen and TNP treatment of human liver cancer cell line.
  • FIG. 9 is a diagram showing the survival rate analysis of acetaminophen and TNP treatment in a mouse model.
  • FIG. 10 is a diagram showing histopathological analysis of several TNPs of acet 4-Menofene in 1 ⁇ of mouse hair.
  • FIG. 11 is a diagram showing blood analysis according to acetaminophen and TNP treatment in a mouse model.
  • FIG. 12 is a diagram showing a JNK phosphorylation analysis according to acetaminophen and TNP treatment in a mouse model.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of liver toxicity containing TNP (N2- (m-Tr if luorobenzyl), N6— (p-ni t robenzyl) pur ine) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • TNP N2- (m-Tr if luorobenzyl), N6— (p-ni t robenzyl) pur ine
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the TNP preferably has a structure of Formula 1, but is not limited thereto.
  • the TNP inhibits acetaminophen-derived cell death, and in hepatocytes .
  • Glutathione increases (glutathione, GSH), and preferably inhibits the increase in the stress response caused by acetaminophen.
  • GSH glutthione
  • the present inventors confirmed the change according to TNP treatment of cell death induced by acetoaminophen in human embryonic stem cell-derived hepatocytes, mouse-derived hepatocytes, and human liver cancer cell lines (HepG2). It was confirmed that hepatic cell death induced by TNP treatment was significantly inhibited (see FIGS.
  • TNP known as an inhibitor of inosi tol pyrophosphate of the present invention inhibits apoptosis by acetaminophen in human embryonic stem cell-derived hepatocytes and mouse-derived hepatocytes and human liver cancer cell lines, It increased the concentration of reduced glutathione (GSH) in hepatocytes and confirmed that it inhibits phosphorylated JNK, an increased stress response by acetaminophen, and the same acetaminophen-induced hepatotoxicity in animal models.
  • GSH reduced glutathione
  • the present invention is not only the TNP represented by the formula (1), Pharmaceutically acceptable salts thereof, possible solvates, hydrates, d) It includes both miche, or stereoisomer thereof.
  • the TNP represented by Formula 1 of the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful.
  • Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid, aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes.
  • non-toxic organic acids such as dioates, aliphatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids.
  • These pharmaceutically toxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide and iodide fluoride.
  • the acid minor salts according to the present invention can be dissolved in conventional methods, for example, by dissolving the TNP represented by the formula (1) in an excess of aqueous acid solution, and dissolving the salts with a miscible organic solvent such as methane, hyehanol, acetone or It can be prepared by precipitation with acetonitrile. In addition, the mixture may be prepared by evaporating a solvent or excess acid to dry, or by suction filtration of the precipitated salt. Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving the compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the compound salt at cost, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt as the metal salt.
  • Corresponding silver salts are also obtained by reacting an alkali or alkaline earth metal salt with a suitable negative salt (eg silver nitrate). When formulating the composition, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used layering agents, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, patients, powders, granules, capsules, troches and the like, and such solid preparations contain at least one excipient such as starch in one or more TNPs represented by Formula 1 of the present invention.
  • a excipient such as starch in one or more TNPs represented by Formula 1 of the present invention.
  • Calcium carbonate It is prepared by mixing sucrose or lactose or gelatin.
  • lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions or syrups, and include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Sieves for parenteral administration include thermophilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like.
  • Non-aqueous solvents and suspending solvents may be used propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as etholeate.
  • w epsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol, gelatin and the like can be used as the base of the suppository.
  • the composition according to the invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the compound according to the present invention may vary depending on the age, sex and weight of the patient, generally between 0.01 mg and 100 mg, preferably 0.5 mg and 10 mg per kg of body weight daily or It can be administered every other day or divided into one to three times a day.
  • the severity of obesity, sex, weight and age The dosage may be increased or decreased depending on the above or the like, and the above dosage does not limit the scope of the present invention by any method.
  • the present invention provides a health functional food for preventing and improving liver toxicity containing TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the TNP preferably has a structure of Chemical Formula 1, but is not limited thereto.
  • the TNP inhibits acetoaminophen-derived cell death, increases glutathione (GSH) in hepatocytes, and preferably suppresses an increase in stress response caused by acetaminophen, but is not limited thereto.
  • GSH glutathione
  • TNP known as an inhibitor of inosi tol pyrophosphate of the present invention inhibits apoptosis caused by acetaminophen in human embryonic stem cell-derived hepatocytes, mouse-derived hepatocytes, and human hepatocarcinoma cell lines
  • Reduced glutathione increased the concentration of (glutathione, GSH) and confirmed that it inhibits phosphorylated JNK, an increased stress response by acetaminophen, and the same acetaminophen-induced hepatotoxicity in animal models.
  • GSH glutathione
  • TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be usefully used as a health functional food for the prevention and improvement of liver toxicity.
  • the TNP of the present invention may be prepared by various methods known in the food science or pharmaceutical fields, and may be used by itself or as a food acceptable carrier, excipient, diluent, and the like. It can be prepared in any food form that is compatible and orally available. Preferably in the form of beverages, pills, granules, tablets or capsules.
  • the health functional food of the present invention may further include ingredients that are commonly added during food production and are food acceptable.
  • ingredients that are commonly added during food production and are food acceptable.
  • citric acid liquid fructose
  • sugar sugar
  • glucose glucose
  • acetic acid it may further include one or more components in malic acid, juice, and the like.
  • the amount that can be included as an active ingredient of the health functional food according to the present invention can be appropriately selected according to the age, sex, weight, condition, symptoms of the disease of the person who wants to prevent and improve liver toxicity, preferably 1 day for adults It is good to include about 0.01 g to 10.0 g, and by ingesting a health functional food having such a content, the effect of preventing and improving liver toxicity can be obtained.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating liver disease, which contains TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food for preventing and improving liver disease containing TNP or a weakly acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the TNP preferably has a structure of Formula 1, but is not limited thereto.
  • the TNP inhibits acetaminophen-derived cell death, increases glutathione (GSH) in hepatocytes, and preferably inhibits an increase in stress response caused by ace Baminophen, but is not limited thereto.
  • GSH glutathione
  • the acetaminophen derived liver disease includes acute liver failure (fulminant hepat ic fai lure), liver necrosis (l iver necrosis), neurotoxin (nephrotoxici ty) and. . liver It is preferably any one selected from the group consisting of cirrhosis, but not limited thereto.
  • TNP known as an inhibitor of 5-inosine pyrophosphate of the present invention inhibits apoptosis by acetaminophen in human embryonic stem cell-derived hepatocytes, mouse-derived hepatocytes, and human hepatocarcinoma cell lines, and is reduced in hepatocytes.
  • Glutathione increased the concentration of (glutathione, GSH) and was found to inhibit phosphorylated JNK, an increased strain i response by acetaminophen, and to protect the same acetaminophen-induced hepatotoxicity in animal models.
  • the TNP or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing and treating liver disease, and as a dietary supplement.
  • the present invention will be described in detail by Examples and Experimental Examples.
  • hESC human embryonic stem cells
  • the hESC cell line was a CHA-hESC cell line and cultured for 3 days in a confluent dotok in a controlled wfl ⁇ (conditioned medium) in a feederfree system. After incubation, the hESC cells were treated with 50 ng / m £ activin MActivin A; Differentiation was induced by incubation for 5 days in RPMI-1640 (Hyc lone, USA) medium containing Peprotech Inc., USA. The differentiated cells contained 30 ng / mi fibroblast growth factor 4 (Peprotech) and 20 ng / mi bone morphogenetic protein 2 (BMP2; Peprotech).
  • HCM hepatocyte culture medium
  • HGF hepatocyte growth factor
  • Matured hepatocytes were obtained by inducing the maturation of hepatocytes while incubating for 5 days in hepatocyte culture medium to which R & D Systems Inc., USA) and 0.1 ⁇ M dexamethasone (Sigma-Aldrich, USA) were added.
  • Example-2 Cultivation of Mouse-Derived Hepatocytes
  • Mouse-derived hepatocyte culture was performed as follows using the collagenase perfusion method.
  • the filtrate was centrifuged at 100 X g for 3 minutes, and then the supernatant was discarded and the precipitated hepatocytes were suspended in HBSSCHanks' Balanced salt solution, WelGene) buffer and centrifuged.
  • the precipitated hepatocytes were centrifuged in Percol solution (Autoclaved percolKsigma), 10 X PBS, 1M HEPES PH7.4 for 10 minutes at 2400 rpm, and then the supernatant was discarded and the precipitated hepatocytes were HBSSCHanks' Balanced salt solution, WelGene. Suspended in buffer and centrifuged again at 100 X g.
  • Precipitated hepatocytes were suspended in a culture solution to obtain a cell suspension, and then adjusted to a concentration of hepatocytes of 1 X 10 cells / ml, and then transplanted into a culture vessel previously coated with gelatin.
  • Culture medium was 10% FBS, 10 nM dexa, 10 nM insulin, Containing penicillin / streptomycin (penicillin / streptomycin LOO g / ml)
  • DMEM medium (bic est) was used and cultured by supplying a mixed gas of C025> in a 37 0 C incubator maintained at a constant temperature and humidity.
  • HepG2 Human Human Cancer Cell Line
  • HepG2 cells which are human liver cancer cells, were divided into 6-well plates pre-coated with gelatin at a cell concentration of 1 ⁇ 10 cell / n and incubated for 24 hours for cell attachment.
  • the culture medium was a DMEM bovine added with 10% FBS, 10 nM dexa, 10 nM insulin, and penicillin / s: ⁇ ⁇ mycin a3 ⁇ 40 irl r, and C025% of the mixed gas in a 37 0 C incubator maintained at a constant temperature and humidity. Supplied and incubated.
  • hepatocytes were divided into 6-well plates at a concentration of 9 OT per well. 1000 mg / ⁇ DMEM—low glucose culture (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Wei gene No. 001-11) was replaced and incubated for 2 hours. Acetaminophen 25 mM single treatment group, acetaminophen 25 mM, TNP mixed group at a concentration of 100 ⁇
  • mice-derived hepatocytes were dispensed at a concentration of 100% per well in a 6-well plate, and cell viability results were obtained in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>.
  • all experimental values were expressed as mean ⁇ standard error (mean ⁇ SD), and statistical analysis was performed by Student's t-test, and the maximum significance limit was set to p ⁇ 0.05.
  • HepG2 human liver cancer cell line was dispensed at a concentration of 90% per well in a 6-well plate, and cell viability results were obtained in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>.
  • all experimental values were expressed as mean ⁇ standard error (mean ⁇ SD), and statistical analysis was performed by Student's t_test, and the maximum significance limit was set to p ⁇ 0.05.
  • mice-derived hepatocytes treated with acetaminophen and TNP were collected in the same manner as in ⁇ Experimental Example 2>, and then cell extracts were prepared for protein analysis, followed by SDS ⁇ PAGE analysis and Western blotting.
  • Cells were 10 mi SDS buffer solution (50 mM Tris-HCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.25% deoxycholic acid, 150) containing a protease inhibitor cocktai 1 (Complete Mini, Roche, Germany).
  • Electrophoretic proteins were transferred to Immobilon-P transfer membranes (Mill ipore Corporate, USA) using an electroblotting device, and the membrane was then replaced with 0.1% Tween-20 and 10%. After blocking for 1 hour in TBS (Tris-buffered saline) containing% formula, phosphorylated JNK Cell Signaling) and whole JNK Cell Signaling) antibodies were added and reacted overnight.
  • TBS Tris-buffered saline
  • HRP horseradish peroxidase
  • the protein bands were Western blotting luminol reagent (luminol) reagent) (Santa Cruz Biotechnology) Activity was analyzed using Image J software (version 1.37, NIH, USA).
  • TNP acetaminophen-induced hepatotoxicity
  • mice 500 mg / kg acetaminophen (Sigma) was dissolved in water and orally administered to mice using male C57BL / 6 mice aged 8 to 10 weeks, and then 10 mg / kg TNP (Caibiocham) to olive oil (Sigma). After dissolving, mice were injected intraperitoneally to analyze the survival rate. Statistical analysis was performed using Kaplan-Meier survival analysi s, and the maximum limit of significance was set to ⁇ .05.
  • TNP treatment confirmed the protective effect of the remarkable individual survival rate against acetaminophen-induced hepatotoxicity (Fig. 9).
  • livers were extracted 6 hours after TNP injection in male mice injected with acetaminophen and TNP to determine histopathological analysis, blood analysis (AST, ALT) and stress signaling activity (JNK). Analyzed. Hematological analysis of blood samples obtained by orbital blood collection of mice was performed by centrifugation at 13000 rpm for 10 minutes for analysis of AST and ALT (Idexx VetTest8008 chemi stry analyzer) with serum 100 ⁇ and extracted to analyze stress signaling activity.
  • IM tr is— cl (PH7.4), IM Nacl, 0.5M EDTA, NP-40, 10% sodium deoxycholate, 10% SDS), digested with homogenizer and centrifuged. after separation by collecting the supernatant were performed SDS-PAGE analysis, and Western blotting. Phosphorylated JNK and total JNK amount were measured by Western blotting in the same manner as in ⁇ Example 5>.
  • FIG. 10 histological analysis of liver tissue by acetaminophen treatment showed a very pathological phenotype of necrosis in the liver of mice treated with TNP (Fig. 10).
  • FIG. 11 it was confirmed that AST and ALT levels of hepatotoxicity serum were significantly reduced in mice treated with TNP (FIG. 11).
  • FIG. 12 stress reaction by acetaminophen treatment was shown. The increase of phosphorylation induced an increase in phosphorylated JNK signal, but it was confirmed that the phosphorylated JNK increase was significantly inhibited by TNP co-treatment (FIG. 12).

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Abstract

본 발명은 TNP(N2-(m-Trifluorobenzyl), N6-(p-nitrobenzyl)purine)를 유효성분으로 함유하는 아세트아미노펜 (Acetaminophen, AP) 유래 간 독성 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 5-이노시톨 파이로인산 (inositol pyrophosphate)의 저해제로 알려진 TNP가 인간 배아 줄기세포 유래 간세포, 생쥐 유래 간세포 및 인간 간암 세포주에서 아세트아미노펜에 의한 세포 사멸을 억제하고, 간세포 내 환원된 글루타치온 (glutathione, GSH)의 농도를 증가시켰으며, 아세트아미노펜에 의해 증가하는 스트레스 반응인 인산화된 JNK를 억제하는 것을 확인하고, 동물 모델에서 상기와 동일한 아세트아미노펜-유발성 간세포독성의 보호효과를 갖는 것을 확인함으로써, 상기 TNP를 아세트아미노펜에 의한 간 독성 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
TNP(N2-(m-Tr i f luorobenzy 1 ) , N6- ( -n i t r obenzy 1 ) ur i ne ) ¾■ 유효성분으로 함유하는 아세트아미노펜 유래 간 독성 예방 및 치료용 조성물
【기술분야】
본 발명은 TNP(N2-(m-Tr i f luorobenzy 1) , N6- (p-n it robenzyl) purine)또는 이의 약학작으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물， 및 건강기능식품에 관한 것이다.
【배경기술】
TNP ( N2- ( m-Tr i ί 1 iaor obenzy 1 )， N6-()-ni:tr obenzy 1 -) ur ie)는 상업적으로 판매가 가능한 화학물질로서 현재까지 알려진 바로는 이노시를 펜타키포스페이트 키'나아제 (inositol pentakisphosphate kinase) 특이적 저해약물이다 (J Biol Chem. Apr 17， 2009； 284(16)： 1057110582) . TNP는 5ᅳ이노시를 파이로인산 (inositol pyrophosphate)의 생합성을 억제함으로써， 세포 내 5-이노시를 다인산 (polyphosphate)의 수준을 낮출 뿐 아니라， 간세포의 인슐린 신호전달반웅을 증가시킨다는 효과가 보고되어 있다 (Cell. 2010； 143(6)： 897910) . 또한， 골수 유래 중간엽 줄기세포에 처뫼할 경우， 세포의 노화진행반웅을 감소시키는 효과도 알려져있다 (St em Cell Res Ther.2014 Mar 26 ;5(2) :33). 그러나， TNP 약물에 대한 급성 간 독성을 예방 또는 치료하는 효과는 아직 보고된 바 없다.
1950년대 미국에서 개발되어 타이레놀로 잘 알려진 아세트아미노펜 (Acetaminophen, AP)은 진통 및 해열제로 세계에서 가장 보편적으로 사용되는 약물의 일종 (타이레놀의 국내 1년 매출액 250억원)으로 그 화학명칭은 N-아세틸 -ρ-아미노페놀 (N-acetyl_p-aminophenol)이고， 파라세타몰 (paracetamol)이라고도 불린다 (Dargan PI et al. , Crit Care. 6(2) :108-10. 2002) . 아세트아미노펜은 체중 1 kg당 하루 150 mg까지， 성인의 경우 하루에 최고 4 g까지 경구 투여 가능하다고 알려져 있어， 의사의 처방이 없어도 구입할 수 있는 안전한 일반의약품으로 분류되어 있다. 그러나 아세트아미노펜은 과량복용하면 급성 간부전 (fulminant hepatic failure), 간 괴사 (liver necrosis)， 신경독소 (nephrotoxicity)， 간'경화 ( 1 iver cirrhosis)를 초래해 심할 경우 사망에 이르기도 하는 양면상을 가진 물질이다.
이러한 간 독성의 데카니즘 (mechanism)은 아세트아미노펜이 일부 간 산화효소의 작용을 받아 세포를 파괴하는 반웅성 물질로 변한다는 것으로 보통 이러한 물질이 생성되더라도 해독되가 때문에 문제되지 않지만 과량을 복용할 경우 체내 해독물질이 교갈되어 결과적으로 간세포를 파괴하게 된다. 구체적으로， 낮은 농도의 아세트아미노펜을 투약하면， 체내에서 생변이를 통해 비독성 글루코논산 (gfeicononic acid)과 황산염 (sul f ate)과 결합하여 독성을 제거해 담즙 또는 혈장으로 배출되고， 5- 10%는 P450(CYP), 특히 CYP2E1에 의해서 대사 된다 (Ray SDet. al. , J Pharmacol Exp Ther . 1996 ;279: 1470—83) . 즉 아세트아미노펜은 간에서 N-아세틸 -p-벤조퀴논이민 (N-acetyl-p-benzoquinoneimine, NAPQI)으로 전환되는데， 전환된 대사산물은 글루타치온과 결합하여 독성을 나타내지 않는다 (Hazai E, et al. , Biochem Biophys Res Commun. 291(4)： 1089-1094. 2002). 그러나 과량의 아세트아미노펜이 투약되면, 간에서 글루콘산과 황산염이 결합하여 비독성을 나타내는 능력이 상실되어 높은 반웅성 NAPQI가 축적되면서 세포막을 치명적으로 손상시켜 간세포의 사멸을 유도하고 회복할 수 없게 하여 간 독성을 유발하게 되고， 결국 생명체를 사망에 이르게 한다 (Webster PA et . al. , J Clin Pharmacol. 1996； 36： 397-402 ； Albano E et. al. , Mol Pharmacology. 1985；28：306-11 ； Kyle ME et . al. , Biochem Biophys Res Commun. 1987；149：889-94 ； Mahadevan SB et . al . , Arch Dis Child. 2006:91:598-603). 아세트아미노펜 투여에 의한 간 손상 모델로는 마우스와 햄스터가 잘 알려져 있고， 인체에서도 비슷한 현상이 보고되고 있다 (Tee LB et a., Toxicol Appl Pharmacol. 83(2) :294-314. 1986). 게다가 알코올을 함께 흡수할 경우 간 독성의 피해가 더욱 심각하게 나타나 미국식품의약청 (FDA)은 1998년에 매일 세 잔 이상 정기적으로 술을 마시는 사람은 간 독성이 유발될 수 있으니 이 약을 복용해야 할 경우 반드시 의사와 상의해야 한다는 사실을 의무적으로 알리도록 하였다. 최근에 이러한 아세트아미노펜의 간 독성을 제거 및 완화시킬 수 있는 약물을 발굴하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 간은 인체의 혈액데사를 주관하고 해독기능을 담슝하는 주요한 장기로 간이 손상되면， 염증반응과 동시에 인체에 각종 질환을 야기하기 때문에 간 손상을보호할 수 있는 약물의 개발은 대단히 중요하다. 이에， 본 발명자들은 간 손상의 예방 및 치료에 효과가 있는 물질을 찾고자 노력한 결과， 5-여노사를 파이로인산의 저해제로 알려진 TNP가 인간 배아 줄기세포 유래 간세포， 생쥐 유래 간세포 및 인간 간암 세포주에서 아세트아미노펜에 와한 세포 사멸을 억제하고， 간세포 내 환원된 글루타치온의 농도를 증가시켰으며， 아세트아미노펜에 의해 증가하는 스트레스 반웅인 인산화된 JNK를 억제하는 것을 확인하고， 동물 모델에서 상기와 동일한 아세트아미노펜-유발성 간세포독성의 보호효과를 갖는 것을 확인함으로써， 상기 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 간 독성 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 TNP(N2-(m-Tri f luorobenzyl ) , N6-(p-ni trobenzyl )pur ine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 TNP(N2-(m-Tr i f 1 uorobenzy 1 ) , N6- ( ρ-η i t r obenzy 1 ) pur i ne ) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한， 본 발명은 TNP 또는 이의 . 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 < 의 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 간 독성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 독성 치료방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 독성 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 간 독성 예방 및 치료용 조성물로 사용하기 위한 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 간 독성 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. - 아울러， 본 발명은 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 간 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 치료방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 간 질환 예방 및 치료용 조성물로 사용하기 위한 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 또한， 본 발명은 간 질환 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 TNP또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. [유리한 효과]
본 발명은 TNP(N2-(m-Tr i f kiorobenzyl ) , N6- ( -n i t r obenzy 1 ) pur i ne )또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로， 5-어노시를 파이로인산 ( inosi tol pyrophosphate)의 저해제로 알려진 TNP가 인간 배아 줄기세포 유래 간세포， 생쥐 유래 간세포 및 인간 간암 세포주에서 아세트아미노펜에 의한 세포 사멸을 억제하고， 간세포 내 환원된 글루타치온 (glutathione , GSH)의 농도를 증가시켰으며, 아세트아미노펜쎄 의해 증가하는 스트레스 반응인 인산화된 JNK를 억제하는 것을 확인하고， 동물 모델에서 상기와 동일한 아세트아미노펜-유발성 간세포독성의 보호효과를 갖는 것을 확인함으로써， 상기 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염올 간 독성 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 TNP(N2-(m-Tr i f luorobenzyl ) , N6- ( p-n i trobenzyl ) pur ine)의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 인간 배아 줄기세포로부터 분화된 간세포에 아세트아미노펜 및
TNP 처리에 따른 세포사멸을 분석한사진 및 이를 그래프로 나타낸 도이다. 도 3은 생쥐 유래 간세포의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 세포사멸을 분석한사진 및 이를 그래프로 나타낸 도이다.
도 4는 인간 간암 세포주 (HepG2)의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 세포사멸을 분석한사진 및 이를 그래프로 나타낸 도이다.
도 5는 도 4의 사진을 200배 확대하여 나타낸 도이다.
도 6은 생쥐 유래 간세포의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 세포 내 글루타치온 농도를 분석하여 그래프로 나타낸 도이다. 도 7은 생쥐 유래 간세포의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 JNK 인산화를 분석하여 나타낸 도이다.
도 8은 인간 간암 세포주의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 JNK 인산화를 분석하여 나타낸 도이다.
도 9는 생쥐모델에서의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 개체생존율 분석을 나타낸 도이다.
도 10은 생쥐모1 ί에서의 아세트 4머노펜 몇 TNP 처리에 따른 조직병리학적 분석을 나타낸 도이다.
도 11은 생쥐모델에서의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 혈액분석을 나타낸 도이다.
도 12는 생쥐모델에서의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 JNK 인산화 분석을 나타낸 도아다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 TNP(N2-(m-Tr i f luorobenzyl ) , N6—(p-ni t robenzyl ) pur ine)또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 TNP는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것아 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
[화학식 1]
Figure imgf000009_0001
상기 TNP는 아세트아미노펜 유래 세포 사멸을 억제하고， 간세포 내. 글루타치은 (glutathione , GSH)을 증가시키며， 아세트아미노펜에 의한 스트레스 반응 증가를 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 인간 배아 줄기세포 유래 간세포， 생쥐 유래 간세포 및 인간 간암 세포주 (HepG2)에서 아세토아미노펜에 의해 유도되는 세포 사멸의 TNP 처리에 따른 변화를 확인한 결과， 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간세포 사멸이 TNP 처리에 의해 유의적으로 저해되는 것을 확인하였고 (도 2 내지 도 5 참조)， TNP 처리에 따른 아세트아미노펜에 의한 간세포 대사능을 확인한 결과， 아세트아미노펜에 의한 간세포 내에 환원된 글루타치온의 감소효과가 TNP 처리에 의해 저해됨을 확인하였으며 (도 6 참조)， 생쥐 유래 간세포 및 인간 간암 세포주 (HepG2)에서 TNP 처리에 따른 아세트아미노펜 유래 간세포 스트레스 반웅조절 효과를 확인한 결과， 아세트아미노펜 처리에 의한 스트레스 반웅의 증가로 인산화된 JNK 신호의 증가를 유발하였으나， TNP 처리에 의하여 이러한 인산화된 JNK 증가가 유의하게 억제됨을 확인하였다 (도 7 내지 도 8 참조) . 또한， 생쥐모델에 아세트아미노펜을 투여하고, TNP를 주사한 결과， 개체생존율이 증가하며 (도 9참조)， 생쥐에서 적출한 간의 괴사 반웅이 감소하고 (도 10참조)， 간독성의 혈청지표인 AST, ALT수준이 현저히 감소하며 (도 11 참조)， 인산화된 JNK 증가가 유의하게 억제됨을 확인하였다 (도 12 참조) .
따라서， 본 발명의 5—이노시를 파이로인산 ( inos i tol pyrophosphate)의 저해제로 알려진 TNP가 인간 배아 줄기세포 유래 간세포ᅳ 생쥐 유래 간세포 및 인간 간암 세포주에서 아세트아미노펜에 의한 세포 사멸을 억제하고， 간세포 내 환원된 글루타치온 (glutathione , GSH)의 농도를 증가시켰으며， 아세트아미노펜에 의해 증가하는 스트레스 반웅인 인산화된 JNK를 억제하는 것을 확인하고， 동물 모델에서 상기와 동밀한 아세트아미노펜-유발성 간세포독성의 보호효과를 갖는 것을 확인함으로써， 상기 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 간 독성 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.. 본 발명은 화학식 1로 표시되는 TNP 뿐받 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염， 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물， 수화물， 라세미체, 또는 입체이성질체를 모두 포함한다. 본 발명의 화학식 1로 표시되는 TNP는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며， 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유뫼산 ( free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산， 질산， 인산， 황산， 브롬화수소산， 요드화수소산， 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트， 페닐-치환된 알카노에이트， 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트， 방 족 산류, 자방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트， 피로설페이트， 바이설페이트, 설파이트， 바이설파이트， 니트레이트 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트， 디하이드로겐 포스페이트 메타포스페이트， 피로포스페이트 클로라이드， 브로마이드, 아이오다이드 플루오라이드， 아세테이트， 프로피오네이트， 데카노에이트， 카프릴레이트 아크릴레이트， 포메이트， 이소부티레이트， 카프레이트， 헵타노에이트 프로피올레이트，옥살레이트， 말로네이트， 석시네이트， 수베레이트， 세바케이트 푸마레이트， 말리에이트, 부틴 -1 , 4-디오에이트, 핵산 -1，6-디오에이트， 벤조에이트， 클로로벤조에이트， 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트， 하이드록시벤조에이트, 메특시벤조에이트， 프탈레이트, 테레프탈레이트， 벤젠설포네이트， 를루엔설포네이트， 클로로벤젠설포네이트ᅳ 크실렌설포네이트， 페닐아세테이트， 페닐프로피오네미트， 페닐부티레이트， 시트레이트, 락테이트， 하이드록시부티레이트， 글리콜레이트， 말레이트， 타트레이트， 메탄설포네이트， 프로판설포네이트， 나프탈헨 -1-설포데이.트， 나프탈 ¾ 2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다. 본 발명에 따른 산 부자염은 통상의 방법， 예를 들면， 화학식 1로 표시되는 TNP를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고， 이 염을 수흔화성 유기 용매， 예를 들면 메탄을， 혜한올， 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한， 이 흔합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다. 또한， 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은， 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고， 비용해 화합물 염을 여과하고， 여액을 증발， 건조시켜 얻는다. 이때， 금속염으로는 나트륨， 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한， 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염 (예， 질산은)과 반웅시켜 얻는다. 상기 조성물을 제제화할 경우， 보통 사용하는 층진제， 증량제， 결합제， 습윤쎄， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자， 산제, 과립제， 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며， 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화학식 1로 표시되는 TNP에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 탄산칼슘， 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 ( lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한， 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 었다.
비경구 투여를 위한 체 :체에는 열균된 수용액， 비수성용쎄， 현탁용제， 유제， 동결건조제제， 좌제 등이 포함된다.
비수성용제ᅳ 현탁용제로는 프로필렌글리콜， 폴리에틸렌 글리콜， 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에될올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (w epsol ) , 마크로골， 트원 ( tween) 61， 카카오지， 라우린지， 글리세를， 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효'한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서， "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 /위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며， 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류， 중증도， 약물의 활성， 약물에 대한 민감도， 투여 시간， 투여 경로 및 배출 비율， 치료기간， 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며， 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며， 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로， 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이， 성별， 체중에 따라 달라질 수 있으며， 일반적으로는 체중 1 kg당 0. 1 mg내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로 비만의 중증도， 성별， 체중， 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한， 본 발명은 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 TNP는 상기 화학식 1의 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 TNP는 아세트아미노펜 유래 세포 사멸을 억제하고， 간세포 내 글루타치온 (glutathione , GSH)을 증가시키며, 아세트아미노펜에 의한 스트레스 반웅 증가를 억제하는 것이 바람직하나 어에 한정되지 않는다.
본 발명의 5-이노시를 파이로인산 ( inos i tol pyrophosphate)의 저해제로 알려진 TNP가 인간 배아 줄기세포 유래 간세포, 생쥐 유래 간세포 및 인간 간암 세포주에서 아세트아미노펜에 와한 세포 사멸을 억제하고， 간세포 내 환원된 글루타치은 (glutathione , GSH)의 농도를 증가시켰으며， 아세트아미노펜에 의해 증가하는 스트레스 반웅인 인산화된 JNK를 억제하는 것을 확인하고， 동물 모델에서 상기와 동알한 아세트아미노펜-유발성 간세포독성의 보호효과를 갖는 것을 확인함으로써， 상기 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 간 독성 예방 및 개선을 위한 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있다. ,
. - 본 발명의 TNP가 상기와 같은 간 독성 예방 및 개선을 위해 이용되기 위해서는， 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체， 부형제， 희석제 등과 흔합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료， 환， 과립， 정제 또는 캅셀 형태이다.
본 발명의 건강기능식품은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대， 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 TNP이외에 구연산， 액상과당, 설탕， 포도당, 초산， 사과산， 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 간 독성 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령， 성별， 체중, 상태， 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며， 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g내지 10.0 g 정도로 포함되는 것아 좋으며， 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 간 독성 예방 및 개선 효과를 얻을 수 있다.
또한， 본 발명은 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 아울러， 본 발명은 TNP 또는 이의 약황적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 TNP는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
[화학식 1]
Figure imgf000014_0001
상기 TNP는 아세트아미노펜 유래 세포 사멸을 억제하고， 간세포 내 글루타치온 (glutathione , GSH)을 증가시키며, 아세 B아미노펜에 의한 스 B레스 반응 증가를 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 아세트아미노펜 유래 간 질환은 급성 간부전 ( fulminant hepat ic fai lure) , 간 괴사 ( l iver necrosi s) , 신경독소 (nephrotoxici ty) 및.. 간 경화 (liver cirrhosis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 5-이노시를 파이로인산 (inositol pyrophosphate)의 저해제로 알려진 TNP가 인간 배아 줄기세포 유래 간세포， 생쥐 유래 간세포 및 인간 간암 세포주에서 아세트아미노펜에 의한 세포 사멸을 억제하고， 간세포 내 환원된 글루타치은 (glutathione, GSH)의 농도를 증가시켰으며, 아세트아미노펜에 의해 증가하는 스트레 i 반응인 인산화된 JNK를 억제하는 것을 확인하고, 동물 모델에서 상기와 동일한 아세트아미노펜-유발성 간세포독성의 보호효과를 갖는 것을 확안함으로써， 상기 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 간 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물， 및 건강기능식품로 유용하게 사용할 수 있다. 이하, 본 발명은 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>인간 배아줄기세포 (hESC) 유래 간세포의 배양
인간 배아 줄기세포 (hESC)로부터 내배엽과 같은 다른 분화적 계통 세포로의 분화 여부를 확인하기 위하여， 인간 배아 줄기세포로부터 내배엽인 간세포 (hepatocytes)로의 분화를 유도하였다 (Cai, J. et . al, (2007) Hepatol ogy 45(5)： 1229-1239).
구체적으로， hESC 세포주는 CHA-hESC 세포주로 지지세포가 없는 시스템 (feederrfree system)에서 조절된 wfl ^(conditioned medium)에 가득 차 (confluent)도톡 3일 동안 배양하였다. 배양 후， 상기 hESC세포를 50 ng/m£ 액티빈 MActivin A; Peprotech 사， 미국)를 포함하는 RPMI— 1640 (Hyc lone 사， 미국) 배지에서 5 일간 배양하여 분화를 유도하였다. 상기 분화된 세포는 30 ng/mi 섬유아세포 성장인자 4(fibroblast growth factor4; Peprotech사) 및 20 ng/mi 골 형성 단백질 2 (bone morphogenet ic protein 2， BMP2； Peprotech사)를 포함하는 간세포 배양 배지 (hepatocyte culture medium, HCM; Lonza 사， 미국)에서 5 일간 배양한 후， 20 ng/mi 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor, HGF; Peprotech 사)를 첨가한 간세포 배양 배지에서 5일 동안 추가로 배양하여 hESC로부터 간세포로 분화를 유도하였다. 상기 분화된 간세포는 10 ng/nrf 온코스태틴 M oncostatin M; R&D Systems 사， 미국) 및 0.1 μΜ 덱사메타손 (dexametasone; 시그마-알드리치 사， 미국)을 첨가한 간세포 배양 배지에서 5 일간 배양하면서 간세포의 성숙 (maturation)을 유도하여 성숙된 간세포를 수득하였다. <실시예 -2> 생쥐 유래 간세포의 배양
생쥐 유래 간세포 배양은 콜라게나아제 (coUagenase) 관류법을 이용하여 다음과 같이 실시하였다.
구체적으로， 10-12 주령의 수컷 C57BL/6J 생취에 에버틴을 복강 내로 주사하여 마취한 후 개복하였으며ᅳ 간문맥에 24 게이지 (gauge) 카테터 (catheter)를 삽관하여 관류 (Perfusion) 용액 (1.42 M Nacl, 0.067 M Kcl, 0.1 M HEPES PH 7.4， 0.05 M EGTA)으로 관류시키고 콜라게나아제 (Worthington, USA)로 구성된 소화용액을 순환 시켰다. 간세포가 소화된 후 간막을 벗겨 간세포가 유리되게 하였으며， 나일론 메시 (nylon mesh)를 사용하여 여과하였다. 여과액은 100 X g에서 3분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 침전된 간세포를 HBSSCHanks ' Balanced salt solution, WelGene) 완충용액에 현탁시켜 원심분리하였다. 침전된 간세포를 페르콜 (Percol) 용액 (Autoclaved percolKsigma), 10 X PBS, 1M HEPES PH7.4)에 2400 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 침전된 간세포를 HBSSCHanks' Balanced salt solution, WelGene) 완충용액에 현탁시켜 100 X g로 다시 원심분리하였다. 침전된 간세포를 배양액에 현탁시켜 세포 현탁액을 얻은 뒤， 간세포 농도가 1 X 10 cell/ml이 되도록 조절하여， 젤라틴 (gelatin)으로 미리 도포된 배양용기에 이식하였다. 배양액은 10% FBS, 10 nM dexa, 10 nM 인슐린 (insulin), 페니실린 /스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin lOO g/ml)을 포함하는
DMEM 배지 (bic est)를 사용하였으며 일정한 온도와 습도가 유지되는 370C 배양기에서 C025>의 흔합기체를 공급하여 배양하였다. <실시예 3>인간간암세포주 (HepG2)의 배양
인간 간암 세포인 HepG2 세포는 젤라틴으로 미리 도포된 6-웰 플레이트에 세포농도 1 X 10 cell/n 로 분주한 다음 세포부착을 위해 24시간 배양하였다. 배양액은 10% FBS, 10 nM dexa, 10 nM 인슐린， 페니실린 /스:^ ί마이신 a¾0 irl r 첨가한 DMEM쒜지 (biowest)로 일정한 온도와 습도가 유지되는 370C 배양기에서 C025%의 흔합기체를 공급하여 배양하였다.
<실험예 1> 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에서 TNP 처리에 따른 아세트아미노펜 유래 세포사멸 억제 확인
상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 배양한 인간 배아 줄기세포 유래 간세포에서 아세트아미노펜에 의해 유도되는 세포 사멸의 TNP 처리에 따른 변화를 확안하였다.
구체적으로， 인간 줄기세포로부터 분화 19일째 간세포를 6-웰 플레이트에 각 웰 당 9OT농도로 분주하였다. 1000 mg/ί DMEM—낮은 포도당 (low glucose) 배양액 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 제조사 Wei gene No. 001-11)을 사용하여 교체한 후 2시간 동안 배양하였다. 아세트아미노펜 25 mM 단독처리군과 아세트아미노펜 25 mM, TNP 100 μΜ의 농도로 흔합처리한군을
18시간 처리한 후 세포를 현미경으로 관찰하였다. 3회 이상 반복실험을 바탕으로 세포 생존율을 분석하였다. 세포 생존율 분석은 PBS 1 로 2차례에 걸쳐 세포배양액을 제거한 후，트립신 (Trypsin)/EDTA흔합액 (Invitrogen) 1 m£을 1분간 처리한 후， 피펫팅으로 세포를 수거하였다. 트립판 블루 와 수거한 세포를 함유하는 PBS 10 ≠를 흔합한 후 자동 세포 생존율 분석기
Countess( Invi trogen)를 이용하여 세포 생존율 결과를 얻었다. 본 발명의 통계처리는 모든 실험값의 평균 ±표준오차 (mean ± SD)로 표시했으며， 통계분석은 Student ' s t-test로 처리했으며， 유의성 최대 한계는 p<0.05로 정하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이， 아세트아미노펜에 의해 유발되는 간세포 사멸이 TNP 처리에 의하여 유의적으로 저해되는 것을 확인하였다 (도
2) . <실험예 2> 생쥐 유래 간세포에서 TNP 처리에 따른 아세트아미노펜 유래 세포사멸 억제 확인
상기 <실시예 .2>와 동일한 '방법으로 쎄양한 생쥐 유래 간세포에서 아세트아미노펜에 의해 유도되는 세포 사멸꾀 TNP 처리에 따른 변화를 확인하였다.
구체적으로， 생쥐 유래 간세포는 6-웰 플레이트에 각 웰 당 100% 농도로 분주한 후， 상기 <실험예 1〉과 동일한 방법으로 세포 생존율 결과를 얻었다. 본 발명의 통계처리는 모든 실험값은 평균 ±표준오차 (mean ± SD)로 표시했으며， 통계분석은 Student ' s t-test로 처리했으며， 유의성 최대 한계는 p<0.05로 정하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이， 아세트아마노펜에 의해 유발되는 간세포 사멸이 TNP 처리에 의하여 유의적으로 저해되는 것을 확인하였다 (도
3) .
<실험예 3> 인간 간암 세포주 (HepG2)에서 TNP 처리에 따른 아세트아미노펜 유래 세포사멸 억제 확인
상기 <실시예 3〉과 동일한 방법으로 배양한 인간 간암 세포주 (HepG2)에서 아세트아미노펜에 의해 유도되는 세포 사멸의 TNP 처리에 따른 변화를 확인하였다.
구체적으로, HepG2 인간 간암 세포주는 6—웰 플레이트에 각 웰 당 90% 농도로 분주한 후， 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 세포 생존율 결과를 얻었다. 본 발명의 통계처리는 모든 실험값은 평균 ±표준오차 (mean ± SD)로 표시했으며, 통계분석은 Student ' s t_test로 처리했으며, 유의성 최대 한계는 p<0.05로 정하였다.
그 결과 도 4 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, 아세트아미노펜에 의해 유발되는 간세포 사멸이 TNP 처리에 의하여 유의적으로 저해되는 것을 확인하였다 (도 4 내지 도 5) .
<실험예 .4> 생쥐 유래 간세포 서 rap 처리에 따른 아세트아미노펜 유래 세포 내 글루타치온 (glut hi one, GSE) 소 겨해 확인
TNP 처리에 따른 아세트아미노펜에 의한 간세포 대사능을 확인하였다. 구체적으로， 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 아세트아미노펜 및 TNP를 처리한 생쥐 유래 간세포를 이용하여 환원된 글루타치은 (reduced glutathione , GSH) 농도를 측정하였다. 환원된 글루타치온 측정은 GSHᅳ Glo Glutathione Assay 키트 (Promega)를 사용하였으며， Tr i star2 LB 942 플레이트 분석기를 활용하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이， TNP 단독처리에 의해 간세포 내에 환원된 글루타치온의 농도가 증가함을 확인하였고， 또한， 아세트아미노펜에 의한 간세포 내에 환원된 글루타치온의 감소효과가 TNP 처리에 의해 저해됨을 확인하였다 (도 6) .
<실험예 5> 생쥐 유래 간세포에서 TOP 처리에 따른 아세트아미노펜 유래 JNK 인산화증가 억제 확인
TNP 처리에 따른 아세트아미노펜 유래 간세포 스트레스 반웅조절 효과를 확인하였다. ' 구체적으로， 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 아세트아미노펜 및 TNP를 처리한 생쥐 유래 간세포를 수거한 후， 단백질 분석을 위하여 세포 추출액을 준비한 후 SDSᅳ PAGE 분석 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 세포는 단백잘분해효소 칵테일 (protease inhibitor cocktai 1 ) (Complete Mini , Roche , 독일)을 포함하는 10 mi SDS완충용액 (50 mM Tris-HCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.25% deoxychol ic acid, 150 mM NaCI , 1 mM ethylene-diamine tetra acetic acid, 1 mM NaF, 0.1% sodium dodecyl sulfate, )1 7.4)으¾ 용해하였고， 20분 동안 얼음에 놓아둔 후， 40C에서 13，000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액의 단백질 농도를 확인한 뒤 &i:0" ad .Laboratories, 미국)， SDS-PAGE( SDS-po 1 yacry 1 am i de gel electrophoresis)를 위해 50 의 단백질을 로딩 (loading)하였다. 전기영동한 단백질을 일렉트로블랏팅 (electroblott ing) 장치를 이용하여 Immobilon-P transfer 멤브레언 (Mill ipore Corporate, 미국)으로 이동시킨 뒤，상기 멤브레인은 0.1%트왼 -20(Tween-20)및 10%분유를 포함하는 TBS(Tris-buffered saline)에 넣어 1시간 동안 블로킹 (blocking)한 후, 인산화된 JNK Cell Signaling사) 및 전체 JNK. Cell Signaling사) 항체를 넣고 밤새 반웅시켰다. 그리고나서, 멤브레인은 0.1% 트원 -20을 포함하는 TBS로 20분씩 3번 세척하고， HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 넣고 1시간 동안 반웅시킨 후， 0.1% 트원 -20을 포함하는 TBS로 20분씩 3번 세척하였다. 단백질 밴드는 웨스턴 블랏팅 루미놀 시약 (luminol reagent) (Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 시각화하였다. 활성도는 Image J 소프트웨어 (version 1.37, NIH, 미국)를 이용하여 분석하몄다.
그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이， 아세트아미노펜 처리에 의한 스트레스 반웅의 증가로 인산화된 JNK신호의 증가를 유발하였으나， TNP처리에 의하여 인산화된 JNK 증가가 유의하게 억제됨을 확인하였다 (도 7).
<실험예 6> 인간 간암 세포주 (HepG2)에서 TNP 처리에 따른 아세트아미노펜 유래 JNK 인산화증가 억제 확인 TNP 처리에 따른 아세트아미노펜 유래 간세포 스트레스 반웅조절 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 3>과 동일한 방법으로 아세트아미노펜 및 TNP를 처리한 HepG2인간 간암 세포주를 수거한 후， 단백질 분석을 위하여 세포 추출액을 준비한 후 상기 <실험예 5>와 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이， 아세트아꾀노펜 처리에 의한 스트레스 반웅의 증가로 인산화된 JNK신호의 증가를 유발하였으나 , TNP처리에 의하여 인산화된 JNK 증가가 유의하게 억제됨을 확인하였다 (도 8) .
<실시예 7 생쥐모델에서의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 개체생존율 분석
TNP에 의한 아세트아미노펜-유발성 간독성 예방 효과를 동물 실험을 통해 확인하였다.
구체적으로, 8 내지 10주령의 수컷 C57BL/6 생쥐를 이용하여 500 nig/ kg 아세트아미노펜 (Sigma)을 물에 녹여 생쥐에 경구 투여한 후 10 mg/kg TNP(Caibiocham)를 올리브오일 (Sigma)에 녹인 후 생쥐 복강 내 주사하여 개체생존율을 분석하였다. 통계분석은 Kaplan-Meier survival analysi s로 분석하였으며， 유의성 최대 한계는 ρθ.05로 정하였다.
그 결과， 도 9에 나타난 바와 같이, TNP 처리에 꾀하여 아세트아미노펜ᅳ유발성 간독성에 대한 현저한 개체생존율의 보호효과를 확인하였다 (도 9) .
<실시예 8> 생쥐모델에서의 아세트아미노펜 및 TNP 처리에 따른 간독성 분석
상기 <실시예 7>의 동물 모델에서 TNP 처리에 의한 아세트아미노펜-유발성 간독성 예방 효과를 조직， 혈액 및 JNK 인산화 활성을 분석하여 확인하였다. 구체적으로， 아세트아미노펜 및 TNP가 주입된 <실시예 7>의 수컷 생쥐에서 TNP 주사 후 6시간 후 간을 적출하여 조직병리학적 분석， 혈액분석 (AST, ALT) 및 스트레스 신호전달 활성 (JNK)을 분석하였다. 혈액분석은 생쥐의 안와채혈로 수득한 혈액 샘플을 13000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻어진 혈청 100 ^으로 AST, ALT를 분석 ( Idexx VetTest8008 chemi stry analyzer)하였으며， 스트레스 신호전달 활성을 분석하기 위해, 적출한 간 조직을 RIPA배지 ( IM tr i s— cl (PH7.4) , IM Nacl , 0.5M EDTA, NP-40 , 10% sodium deoxycholate , 10% SDS)에 넣고， 호모게나이저로 분해한 다음, 원심분리 후 상등액을 수거하여 SDS-PAGE 분석' 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 인산화된 JNK 및 전체 JNK 양 측정은 상기 <실시예 5〉와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
그 결과， 도 10에 나타낸 바와 같이， 아세트아미노펜 처리에 의한 간조직의 조직학적 분석에서 TNP를 함께 처라한 생쥐의 간에서 괴사반움이 매우 경미한 병리학적 표현형을 보였다 (도 10) . 또한, 도 11에 나타낸 바와 같이 간독성의 혈청지표인 AST, ALT수준이 TNP를 함께 처리한 생쥐에서 현저히 감소된 것을 확인하였으며 (도 11)， 도 12에 나타낸 바와 같이 , 아세트아미노펜 처리에 의한 스트레스 반웅의 증가는 인산화 JNK 신호의 증가를 유발하였으나， TNP 공동처리에 의하여 인산화 JNK 증가가 유의하게 억제됨을 확인하였다 (도 12) .
이로써， 동물 모델을 활용한 간조직 분석에서도 아세트아미노펜에 의해 유도되는 간독성에 대하여 TNP약물에 의한 간독성 보호효과를 나타냄을 확인하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
TNP(N2-(m-Tr i f luorobenzyl ) , N6- ( -n i t r obenzy 1 ) pur i ne ) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 TNP는 하기 화학식 1로 기재되는 화합물인 것올 특징으로 하는 간 득성 예방 및 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
Figure imgf000023_0001
【청구항 3]
제 1항에 있어서， 상기 TNP는 아세트아미노펜 (Acetaminophen, AP) 유래 세포 사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 간 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 TNP는 간세포 내 글루타치온 (glutathione， GSH)을 증가시키는 것을 특징으로 하는 간 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 TNP는 아세트아미노펜에 의한 스트레스 반웅 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 간 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 6】
TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 및 개선용 건강기능식품.
【청구항 7】
약학적으로 유효한 양의 INP 또는 이의 '약'학적으로 허용자능한 염을 간
^성 질환에 걸린 개체에 투여하는단계를 포함하는 간독성 치료방법 .
【청구항 8】
약학적으로 유효한 양의 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 독성 예방방법 .
【청구항 9】
간 독성 예방 및 치료용 조성물로 사용하기 위한 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
【청구항 10】
간 독성 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
【청구항 111
TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함
질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 간 질환은 급성 간부전 (fulminant hepatic failure), 간 괴사 (liver necrosis) , 신경독소 (nephrotoxicity) ' 및 간 경화 (liver cirrhosis)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것올 특징으로 하는 간 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 13】
TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
[청구항 14】
약학적으로 유효한 양띄 TNP :또는 이의 약학적으로 허용가능한 ^을 간 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 치료방법.
【청구항 15】
약학적으로 유효한 양의 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환 예방방법.
【청구항 16】
간 질환 예방 및 치료용 조성물로 사용하기 위한 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
【청구항 17】
간 질환 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 TNP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
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