WO2016083708A1 - Anticorps monoclonal reconnaissant borrelia crocidurae et méthode de diagnostic in vitro d'une fièvre récurrente de borréliose - Google Patents

Anticorps monoclonal reconnaissant borrelia crocidurae et méthode de diagnostic in vitro d'une fièvre récurrente de borréliose Download PDF

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WO2016083708A1
WO2016083708A1 PCT/FR2015/053142 FR2015053142W WO2016083708A1 WO 2016083708 A1 WO2016083708 A1 WO 2016083708A1 FR 2015053142 W FR2015053142 W FR 2015053142W WO 2016083708 A1 WO2016083708 A1 WO 2016083708A1
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borrelia
crocidurae
monoclonal antibody
bacterium
neg neg
Prior art date
Application number
PCT/FR2015/053142
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Inventor
Michel Drancourt
Bernard La Scola
Rémi CHARREL
Didier Raoult
Aurélien FOTSO FOTSO
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Fondation Mediterranee Infection
Universite D'aix-Marseille
Assistance Publique - Hopitaux De Marseille
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale)
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
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    • C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/20—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody that recognizes Borrelia crocidurae and a method for in vitro diagnosis of recurrent borreliosis fever related to infection with Borrelia crocidurae or Borrelia duttonii.
  • relapsing fever is a neglected disease caused by spirochaete bacteria of the genus Borrelia, transmitted from a mammalian reservoir by arthropod vectors.
  • the Borrelia concerned include Borrelia crocidurae, Borrelia duttonii, Borrelia hispanica and Borrelia recurrentis.
  • These borrelia are transmitted by the ticks of the genus Ornithodoros except B. recurrentis which is transmitted by the lice [Elbir H, Abidached L, Pontarotti P, Yoosuf N, Drancourt M. African relapsing fever borreliae genomospecies revealed by comparative genomics. Front Public Health. 2014; 2:43].
  • a diagnostic test that can be used under the conditions of care in the endemic countries, that is to say a test giving a rapid response (less than 30 minutes), easily manipulated. without instrumentation.
  • the different test formats incorporating specific antibodies meet these criteria and it is therefore desirable to have antibodies specifically directed against Borrelia responsible for recurrent fevers in a geographical region in Africa in this invention.
  • lateral flow assays antibodies specifically directed against Borrelia responsible for recurrent fevers in a geographical region in Africa in this invention.
  • attempts have been made to produce monoclonal antibodies against B. crocidurae, which is the species prevalent in West Africa responsible for more than 95% of borreliosis fevers in West Africa. West and monoclonal antibodies against B.
  • duttonii which is the predominant species in East Africa responsible for more than 95% of borreliosis fever in East Africa, with a view to incorporating them into rapid diagnostic tests of recurrent B. crocidurae and B. duttonii fever, particularly at a point of care.
  • Another object of the present invention was to provide an antibody at a concentration in the hybridoma culture supernatant of at least 10 ⁇ g / ml, preferably at least 20 ⁇ g / ml on the one hand and secondly a highly reactive antibody, with said bacterium noticeably reactive at a dilution greater than 1/320 from an initial concentration produced by the hybridoma of at least 10 ⁇ g / mL, preferably at least 20 ⁇ g / mL.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody recognizing the bacterium Borrelia crocidurae directed against the protein flagellum or the VLP protein of the bacterium Borrelia crocidurae.
  • the said antibody directed against the flagellin protein is specific to the single bacterium Borrelia crocidurae and the said antibody directed against the VLP protein of the bacterium Borrelia crocidurae is also directed against the Borellia duttonii VLP protein and specific for the two bacteria Borrelia crocidurae and Borellia duttonii, ie not recognizing other bacteria.
  • Antibodies thus defined make it possible to specifically detect at least one of the two species of bacteria of the genus Borrelia responsible for the most frequent recurrent fevers in Africa, namely Borrelia crocidurae for West Africa and Borrelia duttonii for East Africa as explained below.
  • said monoclonal antibody is therefore specific for the single species Borrelia crocidurae. More particularly, the present invention provides a monoclonal antibody directed against the flagellin protein of Borrelia crocidurae specifically recognizing the single bacteria Borrelia crocidurae.
  • This flagellin protein is characterized by a sequence of 335 amino acids (encoded by the Gen Bank gene: GU357619.1) with a molecular weight of 35.6 kDa and an isoelectric point of 5.44.
  • IgG1-type P3A10 produced by the hybridoma deposited in the DSMZ collection under the registration number DSM ACC3255 on November 5, 2014.
  • said monoclonal antibody is specific for the two species Borrelia crocidurae and Borrelia duttonii. More particularly, the present invention provides an antibody against Borrelia crocidurae VLP protein and Borrelia duttonii VLP protein, but said antibody does not recognize other bacteria.
  • the Borrelia crocidurae Variable like protein (VLP) protein is characterized by a sequence of 340 amino acids (encoded by the GenBank gene: 12818170) with a molecular weight of 35.19 kDa and an isoelectric point of: 6.37; and the Borrelia duttonii Variable like protein (VLP) protein is characterized by a sequence of 340 amino acids (encoded by the GenBank gene: 6920221) of 35.25 kDa molecular weight and an isoelectric point of 5.86. These two protein sequences have many amino acid differences so that they have 33% sequence similarity for 99% coverage.
  • IgG2-type P6D9 produced by the hybridoma deposited in the DSMZ- collection under the registration number DSM ACC3256 on November 5, 2014.
  • the above hybridomas DSM ACC3255 and DSM ACC3256 have been deposited in the collection DSMZ- ("Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zel lkulturen” GmbH InhoffenstraBe 7 B 38124 Braunschweig, Germany ”) according to the Budapest Treaty; they are hybridomas of myeloma cells produced according to the previously described protocol [Kohler G, Mi lstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-7].
  • the above hybridomas produce said antibodies at the concentration of 30-40 ⁇ g / mL and these antibodies are reactive at dilutions of 640 for P3A10 and 1280 for P6D9.
  • the present invention also provides a method for in vitro or ex-vivo specific detection of a bacterium Borrelia crocidurae or Borrelia duttonii in which the presence of a said bacterium Borrelia crocidurae or Borrelia duttonii is detected in a biological sample of a human patient. or animal, preferably a blood sample in which at least one said monoclonal antibody recognizing the bacterium directed against the flagellin protein or the VLP protein of the bacterium Borrelia crocidurae according to the invention is used to detect a immunological reaction of an u bacterium and / or a fragment of said bacterium in said sample with an antibody according to the invention.
  • the present invention provides a method for in vitro or ex vivo specific detection of a bacteria Borrelia crocidurae or Borrelia duttonii in which the presence of a bacterium Borrelia crocidurae or Borrelia duttonii is detected in a biological sample.
  • a human or animal patient preferably a blood sample characterized in that an immmunological reaction of a said bacterium and / or a fragment of said bacterium in said sample is detected with an antibody chosen from:
  • a fragment of a bacterium comprising the antigen recognized by:
  • the antibody specific for the single species Borrelia crocidurae of IgG type I produced by the hybridoma deposited at DS Z under the accession number DS ACC3255, namely the intracellular protein flagellin which is characterized by a sequence of 335 acids amino acids (encoded by the GenBank gene: GU357619.1) with a molecular weight of 35.6 kDa and an isoelectric point of 5.44;
  • crocidurae characterized by a sequence of 340 amino acids (encoded by Gen Bank gene: 12818170) with a molecular weight of 35.19 kDa and an isoelectric point of: 6.37; and Borrelia duttonii Variable like protein (VLP) surface protein characterized by a sequence of 340 amino acids (encoded by the GenBank gene: 6920221) with a molecular weight of 35.25 kDa and an isoelectric point of 5.86.
  • VLP Borrelia duttonii Variable like protein
  • the presence of a said Borrelia crocidurae bacterium in a biological sample of a human or animal patient, preferably a blood sample, is specifically detected and at least one monoclonal antibody according to the present invention is used.
  • the presence of a said bacterium Borrelia duttonii is specifically detected in a said biological sample and at least two monoclonal antibodies according to the invention are used to detect an immunological reaction between a so-called bacterium of said sample and a said specific monoclonal antibody of the two species Borrelia crocidurae and Borrelia duttonii according to the invention and a lack of immunological reaction between a said bacterium of said sample and a said monoclonal antibody specific for the only species Borrelia crocidurae according to the l invention.
  • the steps are carried out in which: a) the sample is brought into contact with a solid support to which a first monoclonal antibody directed against the flagellin protein or the VLP protein of the bacteria Borrelia crocidurae has been attached, and b said solid support is brought into contact with a detection substance able to bind with a said first antibody or preferably with said bacterium.
  • step b) said solid support is brought into contact with a detection substance capable of binding a said bacterium which has reacted with a said first antibody attached to said solid support, preferably a detection antibody consisting of a second monoclonal antibody specific for at least Borrelia crocidurae or Borrelia duttonii different from said first monoclonal antibody.
  • a detection substance capable of binding a said bacterium which has reacted with a said first antibody attached to said solid support, preferably a detection antibody consisting of a second monoclonal antibody specific for at least Borrelia crocidurae or Borrelia duttonii different from said first monoclonal antibody.
  • Said solid support may be in particular a glass or plastic plate or a membrane of polyacrylamide gel or nitrocellulose.
  • the said biological sample may be a sample of blood or tissue or organ of a human or animal patient or a sample of an insect, preferably a tick likely to contain be infected with the said bacterium.
  • the said tissue may be in particular a sample of brain, faith or spleen prepared for histology or a pathological examination of anatomy.
  • the said sample of tissue or organ is fixed to formalin and included in a resin including paraffin and a slice is cut for analysis.
  • the tick sample may be haemolymph or a tick tissue prepared for histology or a pathological anatomy examination.
  • FIG. 1 represents the protein profile obtained by SDS-PAGE with silver nitrate staining of Borrelia sp. and immunoblots with the monoclonal antibodies P6D9 and P3A10. Standard molecular weight markers are shown on the left;
  • FIGS. 2A and 2B show immunofluorescence immunodetection results using an antibody specific for B. crocidurae P3A10 in uninfected guinea pig blood (FIG. 2A) and infected (FIG. 2B);
  • FIG. 3 shows a sandwich-like ELISA assay scheme with P3A10 as said first solid-supported reaction antibody and P6D9 as a biotinylated secondary detection antibody;
  • FIGS. 4A and 4B show Dot-blots against B. crocidurae using the antibody P3A10 (FIG. 4A) and P6D9 (FIG. 4B).
  • B. crocidurae, Achema strain, B. duttonii strain Ly and B. burgdorferi strain B31 were cultured at 32 ° C. in Barbour-Stoenner-Kelly-H medium (BSK-H) (Sigma, Saint-Quentin-Fallavier, France) supplemented with 10% heat-inactivated rabbit serum (Eurobio, Courtaboeuf, France).
  • BK-H Barbour-Stoenner-Kelly-H medium
  • mice For the production of the monoclonal antibodies, 6 week old BALB / C female mice were immunized by intraperitoneal inoculation of the purified B. crocidurae strain in the presence of aluminum hydroxide as adjuvant. The mice were stimulated three times at the 2 week interval, and 5 days after the last injection, the mice were euthanized and the spleen was removed. The spleen cells were fused with myeloma cells (cell line X63 Ag 8.653) and the fused cells were cultured in RPMI medium as previously described [Kohler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-7],
  • Culture supernatants had antibody concentrations of 30 ⁇ g / ml for P3A10 and 40 ⁇ g / ml for P6D9.
  • IgG2bk IgG2ak IgGlk IgG2bk IgGlk IgGlk IgGlk IgG2bk IgGlk IgMk IgG2bk
  • Table 2 below lists Borrelia Strains and other organisms used for screening and monoclonal antibody specificity tests.
  • the pellet was resuspended in hydrated solution and the protein concentration was determined using the modified Bradford method [Kowalczewska M, Fenollar F, Villard C, Azza S, Roux M, Raoult D. An immunoproteomic approach for identification of clinical biomarkers of Whipple's disease. Proteomics Clin Appl. 2008; 2: 504-16].
  • the results showed that the P3A10 antibody is specific to B. crocidurae while the P6D9 antibody recognizes both B. crocidurae and B. duttonii and that neither of the two antibodies tested recognizes B. burgdorferi (Lyme group borrelia) ( Figure 1) and B. recurrentis.
  • Proteins were resolved by electrophoresis through the 10% SDS-polyacrylamide gel (Ettan TM DALT, GE Hea lthcare) at 5 W / gel for 30 minutes, followed by 17 W / gel for 4-5 h. After electrophoresis, the gels were stained with silver or transferred to a nitrocellulose membrane. Digital images were produced transmission scanning (Image Scanning, GE Healthcare). The Borrelia crocidurae proteins resolved by 2D gel electrophoresis were transferred to nitrocellulose membranes (Trans-blot Transfer Medium, pure Nitrocel lulose membrane 0.45 pm BioRad, Ville-d'Avray, France).
  • the membranes were then blocked in PBS supplemented with 0.2% Tween 20 and 5% dry fat-free milk (PBS-Tween-millilk) for 1.5 hours at room temperature before incubation with the sera. infected patients. A dilution of 1: 100 was used for Western Blot made with a combination of 5 sera (10 ⁇ L of each individual serum) of healthy blood donors. After incubation for 1 hour, the membranes were washed three times with PBS-TWEEN and revealed with IgG horseradish peroxidase-conjugated IgG immunoglobulin heavy chain specific antibodies (1: 5,000; ). Each mem bra treated with the secondary antibody was washed three times as previously indicated.
  • PBS-Tween-millilk dry fat-free milk
  • the labeled proteins were visualized (Figure 1) using a commercially available chemiluminescence kit (ECL TM Western blotting analysis system, GE Healthcare).
  • ECL chemiluminescence kit
  • the membranes were exposed to Hyperfilm TM ECL and subsequently developed using an automated thread processor (Hyperprocessor TM, GE Healthcare).
  • Protein spots were extracted from the gel and identified using MALDI-TOF mass spectrometry (Ultraflex II, Bruker Daltonics, Wissembourg, France). Mass spectra were calibrated using autolytic trypsin peptides.
  • Peptide mass fingerprints were used to identify proteins using the Mascot software. The results obtained were compared with all available sequences in public databases, including those for eukaryotes (http://www.matrixscience.com).
  • the P3A10 antibody recognizes the protein lagel line which is characterized in Borrelia crocidurae by a sequence of 335 amino acids (encoded by the GenBank gene: GU357619.1) with a molecular weight of 35.6 kDa and a isoelectric point of 5.44 whereas the P6D9 antibody recognizes the VLP protein characterized in Borrelia crocidurae by a sequence of 340 amino acids (encoded by the GenBank gene: 12818170) with a molecular weight of 35.19 kDa and an isoelectric point of: 6.37.
  • the inventors have shown that both P3A10 and P6D9 antibodies have the ability to detect B.
  • crocidurae bacteria in the blood of guinea pigs experimentally infected with this bacterium. Briefly, five female guinea pigs aged 7 weeks were inoculated intraperitoneally with 10 7 B. crocidurae or buffer (negative control). After euthanasia, the blood obtained by intracardiac puncture 5 days after inoculation, was tested by immunofluorescence incorporating antibody P6D9 or antibody P3A10 as described previously [Yu Y, owalczewska M, Decloquement P, Nappez C, La Scola B (2006) Production of monoclonal antibodies to Tropheryma whipplei and identification of recog nized epitopes by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry.
  • the inventors have sought to detect the bacterium B. crocidurae by an ELISA technique (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) which consists of fixing a first specific antibody according to the invention (2 ) on a solid support (1) which is the bottom of a well of a plate, to deposit the sample to be tested, then to reveal the antibody-bacterium B. crocidurae (3) reaction by a colorimetric reaction with an antibody secondary detectable detection detectable directly or indirectly, namely here a second specific antibody according to the invention biotinylated (4,4a) different from the first antibody.
  • an ELISA technique Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay
  • the inventors deposited at the bottom of the wells of a 96-well ELISA plate (TopYield microtiter module, VWR, Fontenay-sous-bois, France), 100 ⁇ l / well of a solution of anti-z? .
  • crocidurae titrating at 10 ⁇ g / m L antibody P3A10, antibody P6D9, or mixture of the two antibodies P3A10 + P6D9 after dilution in a carbonate buffer (0.05 M carbonate buffer, pH 9.6).
  • the ELISA plate was then sealed and incubated overnight at 4 ° C.
  • the plate was washed three times in succession with PBST and 100 ⁇ L of biotin-conjugated antibody (20 ⁇ g / mL) was added and incubated at room temperature for one hour in 3% PBST-BSA.
  • the plate was washed three times in a row with PBST.
  • Each of these two antibodies can therefore be used in an ELISA format test for the detection of B. crocidurae bacteria.
  • a volume of 100 ⁇ l of antibody titrating at 20 ⁇ g / ml (antibody P3A10 or antibody P6D9 or mixture of antibodies P3A10 + P6D9) is deposited directly on a nitrocellulose membrane (Trans-blot Transfer Medium, pure Nitrocellulose Membrane 0.45pm BioRad, Ville-d'Avray, France).
  • the membrane is incubated for one hour at room temperature and then dried in the open air.
  • the membrane is then saturated with PBS supplemented with Tween20 at a final concentration of 0.2% and skimmed milk at a final concentration of 5% (PBS-Tween-millet k) for one hour at room temperature.
  • the membrane is then incubated in the presence of a suspension of Borrelia crocidurae produced by the hybridoma containing 20 ⁇ g of total protein / ml in saturation buffer in a volume of 100 ⁇ l for one hour at room temperature.
  • the negative control membranes are incubated under the same conditions with PBS buffer.
  • the membranes are then washed three times in PBS Tween20 at a final concentration of 0.2% and then incubated with 100 ⁇ l of biotin-labeled detection antibody described above at a concentration of 20 ⁇ g / ml, for one hour at room temperature in PBS Tween20 at a final concentration of 0.2% skimmed milk at a concentration of 5%; then washed three times as indicated above.
  • FIGS. 4A and 4B shows an absence of visible spot and therefore of fixation in the negative controls (on the right) and the presence of a visible spot (Bl and B2) testifying to the attachment of B. crocidurae bacteria by each of the two antibodies P3A10 (FIG. 4A) and antibody P6D9 (FIG. 4B).

Abstract

La présente invention concerne un anticorps monoclonal reconnaissant la bactérie Borrelia crocidurae dirigé contre la protéine flagelline ou la protéine VLP de la bactérie Borrelia crocidurae ainsi qu'une méthode de détection in vitro ou ex vivo d'une bactérie Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii dans un échantillon biologique.

Description

Anticorps monoclonal recon naissant Borrelia crocidurae et méthode de diagnostic in vitro d'une fièvre récurrente de borréliose
La présente invention concerne un anticorps monoclonal reconnaissant Borrelia crocidurae et une méthode de diagnostic in vitro d'une fièvre récurrente de borréliose liée à une infection par une bactérie Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii.
En Afrique, la fièvre récurrente est une pathologie négligée due à des bactéries spirochètes du genre Borrelia, transmises depuis un réservoir mammifère par des arthropodes vecteurs. Plus précisément, les borrélia concernées cultivées incluent Borrelia crocidurae, Borrelia duttonii, Borrelia hispanica et Borrelia recurrentis. Ces borrelia sont transmises par les tiques du genre Ornithodoros sauf B. recurrentis qui est transmise par les poux [Elbir H, Abi- ached L, Pontarotti P, Yoosuf N, Drancourt M . African relapsing fever borreliae genomospecies revealed by comparative genomics. Front Public Health . 2014; 2 :43] . Ces borrelia sont responsables de fièvres récurrentes dont les complications et la mortalité dépendent de l'espèce responsable de l'infection [Elbir H, Raoult D, Drancourt M . Relapsing fever borreliae in Africa. Am J Trop Med Hyg . 2013;89 : 288-92] . Il y a donc un intérêt à déterminer chez un patient présentant un tableau clinique compatible avec une fièvre récurrente, en zone d'endémie ou au retour d'une zone d'endémie, l'espèce de Borrelia responsable de l'infection . Actuellement, la détection de ces pathogènes dans les arthropodes vecteurs et les patients, se fait par des méthodes moléculaires basées sur la PCR exigeant beaucoup de ressou rces et des équipements spécifiques [Elbir H, Raoult D, Drancourt M . Relapsing fever borreliae in Africa . Am J Trop Med Hyg . 2013;89 : 288-92], en pl us de l'examen microscopique direct du sang qui est un test de laboratoire peu sensible et non spécifique de l'espèce de Borrelia. L'examen microscopique ne peut pas distinguer entre les espèces différentes de Borrelia et les méthodes moléculaires ne sont pas disponibles partout, étant principalement utilisées dans quelques centres de référence qui ne sont pas localisés dans les régions endémiques. Il est donc souhaita ble de développer des tests diagnostiques moi ns chers et plus faciles à mettre en œuvre pour la détection rapide des Borrelia responsables des fièvres récurrentes. Dans cette perspective, quelques anticorps ont été décrits pour Borrelia hermsii et Borrelia turcicatae, deux espèces de Borrelia restreintes à l'Amérique et qui ne sont pas retrouvées sur les autres continents.
Ainsi, l'espèce Borrelia burgdorferi, que l'on trouve en Europe et en Amérique, provoque des infections chroniques tandis que les différentes fièvres récurrentes en Amérique et en Afrique, sont des infections aiguës et qui relèvent de traitements différents là encore entre les différentes espèces de Borrelia.
Aucun anticorps n'a été rapporté pour être spécifique de l'une des espèces de Borrelia responsables de fièvre récurrente en Afrique notamment parmi Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii. Les manifestations cliniques des fièvres récurrentes à Borrelia sont souvent confondues avec les manifestations cliniques du pal udisme [Cutler S, Abdissa A, Trape J (2009) New concepts for the old challenge of African relapsing fever borreliosis. Clin icrobiol Infect 15:400-406] . Cependant, les fièvres récurrentes et le pal udisme n'ont en commun ni leur pronostic, ni leur traitement ni leur prévention . Il est donc souhaitable de disposer d'un test diagnostique permettant de réaliser dans le temps du soin, le diagnostic des fièvres récurrentes à Borrelia. Plus particulièrement, il est souhaitable de disposer d'un test diagnostique utilisable dans les conditions du soin dans les pays d'endémie, c'est-à-dire d'un test donnant une réponse rapide (moins de 30 minutes), facilement manipulable sans instrumentation . Les différents formats de tests incorporant des anticorps spécifique (« latéral flow assays ») répondent à ces critères et il est donc souhaitable de disposer d'anticorps dirigés spécifiquement contre les Borrelia responsables de fièvres récurrentes dans une région géographique, en Afrique dans cette invention . Selon la présente invention, on a cherché à produire des anticorps monoclonaux contre B. crocidurae , qui est l'espèce prévalente en Afrique de l'Ouest responsable de plus de 95% des fièvres de borréliose en Afrique de l'Ouest et des anticorps monoclonaux contre B. duttonii, qui est l'espèce prévalente en Afrique de l'Est responsable de pl us de 95% des fièvres de borréliose en Afrique de l 'Est, dans la perspective de leur incorporation dans des tests diagnostiques rapides de la fièvre récu rrente à B. crocidurae et B. duttonii, en particulier dans un point-de-soins.
Selon la présente i nvention, on a aussi cherché à produire dans la perspective de leur incorporation dans des tests diag nostiques rapides de la fièvre récurrente à B. crocidurae et B. duttonii, en particulier dans un point- de-soins. Un autre but de la présente invention était de fournir un anticorps à une concentration dans le surnageant de culture de l'hybridome d'au moins 10 pg /ml_ de préférence au moins 20 pg /m L d'une part et d'autre part un anticorps fortement réactif, avec la dite bactérie nota mment réactif à une dilution supérieure à 1/320 à partir d'une concentration initiale produite par l'hybridome d'au moins 10 pg/mL, de préférence au moins 20 pg/mL. Ces titres en anticorps et réactivité sont nécessaires pour permettre de détecter des concentrations sanguines de bactéries de 10 pg/m L par les techniques d'immunodétection par luminescence sur membrane ou sur plaque par test ELISA du type sandwich com me il est requis en pratiq ue. Pour ce faire, la présente invention concerne un anticorps monoclonal reconnaissant la bactérie Borrelia crocidurae dirigée contre la protéine flagel 1 i ne ou la protéine VLP de la bactérie Borrelia crocidurae.
Plus précisément, le dit anticorps dirigé contre la protéine flagelline est spécifique de la seule bactérie Borrelia crocidurae et le dit anticorps dirigé contre la protéine VLP de la bactérie Borrelia crocidurae est aussi dirigé contre la protéine VLP de Borellia duttonii et spécifique des deux bactéries Borrelia crocidurae et Borellia duttonii, c'est à dire ne reconnaissant pas les autres bactéries.
Des anticorps ainsi définis permettent de détecter spécifiquement l'une au moins des deux espèces de bactéries du genre Borrelia responsables des fièvres récurrentes les plus fréquentes en Afrique, à savoir Borrelia crocidurae pour l'Afrique de l'Ouest et Borrelia duttonii our l'Afrique de l'Est comme explicité ci-après.
Dans une première variante, ledit anticorps monoclonal est donc spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae. Plus particulièrement, la présente invention fournit un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine flagelline de Borrelia crocidurae reconnaissant spécifiquement la seule bactérie Borrelia crocidurae.
Cette protéine flagelline est caractérisée par une séquence de 335 acides aminés (codée par le gène Gen Bank : GU357619.1) d'un poids moléculaire de 35,6 kDa et un point isoélectrique de 5.44.
Plus particulièrement encore, il s'agit d'un anticorps dénommé ci-après P3A10 de type IgGl produit par l'hybridome déposé à la collection DSMZ sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3255 le 5 novembre 2014.
Dans une deuxième variante, ledit anticorps monoclonal est spécifique des deux espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii. Plus particulièrement, la présente invention fournit un anticorps dirigé contre la protéine VLP ^Vanaole I i ke protein) de Borrelia crocidurae et contre la protéine VLP la bactérie Borrelia duttonii mais ledit anticorps ne reconnaissant pas les autres bactéries. La protéine Variable like protein (VLP) de Borrelia crocidurae est caractérisée pa r une séquence de 340 acides aminés (codée par le gène GenBank : 12818170) d'un poids moléculaire de 35, 19 kDa et un point isoélectrique de : 6.37 ; et la protéine Variable like protein (VLP) de Borrelia duttonii est ca ractérisée par une séquence de 340 acides aminés (codée pa r le gène GenBank : 6920221) d'un poids moléculaire de 35,25 kDa et un point isoélectrique de 5.86. Ces deux séquences protéïques présentent de nombreuses différences d'ordre des acides aminés de sorte qu'elles présentent 33% de similarité de séquence pour une couverture de 99%.
Plus particulièrement, il s'agît d'un anticorps dénom mé ci-après P6D9 de type IgG2 produit par l'hybridome déposé à la collection DSMZ- sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3256 le 5 novembre 2014. Les hybridomes ci-dessus DSM ACC3255 et DSM ACC3256 ont été déposés à la collection DSMZ-(« Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zel lkulturen » GmbH InhoffenstraBe 7 B 38124 Braunschweig, Al lemagne ») selon le traité de Budapest ; ce sont des hybridomes de cellules myélomateuses produits selon le protocole précédemment décrit [Kôhler G, Mi lstein C ( 1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefîned specificity. Nature 256 : 495-7] .
Les hybridomes ci-dessus produisent les dits anticorps à la concentration de 30-40 pg/mL et ces anticorps sont réactifs à des dilutions de 640 pour P3A10 et 1280 pour P6D9.
La présente invention fournit également une méthode de détection in vitro ou ex-vivo spécifique d'une bactérie Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii dans laquelle on détecte la présence d'une dite bactérie Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii dans un échantillon biologique d'un patient humain ou animal, de préférence un échantillon sanguin dans laquelle on utilise au moins un dit anticorps monoclonal reconnaissant la bactérie dirigée contre la protéine flagelline ou la protéine VLP de la bactérie Borrelia crocidurae selon l'invention pour détecter une réaction im munologique d'u ne dite bactérie et/ou un fragment de la dite bactérie dans ledit échantillon avec un anticorps selon l'invention .
Plus précisément, la présente invention fournit une méthode de détection in vitro ou ex-vivo spécifique d'u ne bactérie Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii dans laquel le on détecte la présence d'une dite bactérie Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii dans un échantillon biologique d'u n patient humain ou animal, de préférence un échantillon sanguin caractérisé en ce qu'on détecte une réaction im munologique d'une dite bactérie et/ou un fragment de la dite bactérie dans ledit échantillon avec un anticorps choisi parmi :
- un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine flagelline de Borrelia crocidurae et spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae, et - un anticorps monoclonal dirigé contre les protéines VLP de Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii et spécifique des deux espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii.
Plus particulièrement, on détecte un dît fragment de bactérie comprenant l'antigène reconnu par :
- soit l'anticorps spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae, de type IgG l produit par l'hybridome déposé à DS Z sous le numéro d'enregistrement DS ACC3255, à savoir la protéine intracellulaire flagelline qui se caractérise par une séquence de 335 acides aminés (codé par le gène GenBank : GU357619.1) d'un poids moléculaire de 35,6 kDa et un point isoélectrique de 5.44 ;
- soit l'anticorps spécifique des deux espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii, , de type IgG2 produit par l'hybridome déposé à DSMZ sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3256, à savoir la protéine de surface Variable like protein (VLP) de Borrelia crocidurae caractérisée par une séquence de 340 acides aminés (codé par le gène Gen Bank : 12818170) d'un poids moléculaire de 35, 19 kDa et un point isoélectrique de : 6.37 ; et la protéine de surface Variable like protein (VLP) de Borrelia duttonii caractérisée par une séquence de 340 acides aminés (codé par le gène GenBank : 6920221) d'un poids moléculaire de 35,25 kDa et un point isoélectrique de 5.86.
Dans un premier mode préféré de réalisation, on détecte spécifiquement la présence d'une dite bactérie Borrelia crocidurae dans un dît échantillon biologique d'un patient h umain ou animal, de préférence un échantillon sanguin et on utilise au moins un anticorps monoclonal selon l'invention pour détecter une réaction im munologique entre une dite bactérie du dit échantil lon avec un anticorps monoclonal spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae selon l'invention .
Dans un deuxième mode préféré de réalisation, on détecte spécifiquement la présence d'une dite bactérie Borrelia duttonii dans un dit échantillon biologique et on utilise au moins deux a nticorps monoclonaux selon l'invention pour détecter une réaction immunologique entre une dite bactérie du dit échantillon et un dit anticorps monoclonal spécifiq ue des deux espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii selon l'invention et une absence de réaction immunologique entre une dite bactérie du dît échantillon et un dit anticorps monoclonal spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae selon l'invention .
Plus particulièrement, on réalise les étapes dans lesquelles : a) on met en contact le dit échantillon avec un support solide sur lequel on a fixé un premier dît anticorps monoclonal dirigé contre la protéine flagelline ou la protéine VLP de la bactérie Borrelia crocidurae, et b) on met en contact le dit support solide avec une su bstance de détection apte à se lier avec un dit prem ier anticorps ou de préférence avec la dite bactérie.
De préférence, à l'étape b), on met en contact le dit support solide avec une substance de détection apte à se lier une dite bactérie ayant réagie avec un dît premier anticorps fixée audit support solide, de préférence un anticorps de détection consistant en un dit deuxième anticorps monoclonal spécifique d'au moins Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii différent dudit premier anticorps monoclonal .
Le dit support solide peut être notam ment une plaque de verre ou plastique ou une membrane de gel polyacrylamide ou de nitrocellulose.
Le dit échantillon biologique peut être un échantillon de sang ou de tissu ou organe d'un patient humain ou a nimal ou un échantil lon d'un insecte de préférence d'une tique susceptible de contenir être infecté par la dite bactérie. Le dit tissu peut être notamment u n échantil lon de cerveau, foi ou rate préparé pour l'histologie ou un examen d'anatomîe pathologique. En particulier, on fixe le dît échantillon de tissu ou organe au formol et on l'inclut dans une résine notamment de la paraffine et l'on en coupe une tranche pour analyse. L'échantillon de tique peut être de l 'hémolymphe ou un tissu de la tique préparé pour l'histologie ou un examen d'anatomie pathologique.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faîte de manière i llustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés sur lesquels :
- la figure 1 représente le profil de protéines obtenues par SDS-PAGE avec coloration au nitrate d'argent de Borrelia sp.et im munoblots avec les anticorps monoclonaux P6D9 et P3A10. Les marqueurs standards de poids moléculaire sont indiqués sur la gauche ;
- les figures 2A et 2B présentent les résultats d'imm unodétection par immunofluorescence utilisant un anticorps spécifique de B. crocidurae P3A10 dans le sang de cobaye non-infecté (figure 2 A) et infecté (figure 2B) ;
- Sur la figure 3, on montre un schéma de test ELISA du type sandwich avec P3A10 comme dit premier anticorps de réaction fixé sur support solide et P6D9 comme anticorps secondaire de détection biotinylé ; et
- les figures 4A et 4B présentent des Dot-blot contre B. crocidurae utilisant l'anticorps P3A10 (figure 4A) et P6D9 (figure 4B).
1) Production d'anticorps monoclonaux. B. crocidurae, souche Achema, B. duttonii souche Ly et B. burgdorferi souche B31 ont été cultivées à 32°C dans le milieu Barbour-Stoenner-Kelly-H (BSK-H) (Sigma, Sai nt-Quentin-Fallavier, la France) complété avec 10 % de sérum de lapin inactivé par la chaleur (Eurobio, Courtaboeuf, la France).
Pour la production des anticorps monoclonaux, des souris BALB/C femelles âgées de 6 semaines ont été immunisées par inoculation intra- péritonéale de la souche de B. crocidurae purifiée en présence d'hydroxyde d'al uminium comme adjuvant. Les souris ont été stim ulées trois fois à l'interval le de 2 semaines, et 5 jours après la dernière injection, les souris ont été euthanasiées et la rate a été prélevée. Les cellules de la rate ont été fusionnées avec des cellules de myélome (lignée cellulai re X63 Ag 8.653) et les cellules fusionnées ont été cultivées dans un milieu RPMI comme précédemment décrit [Kôhler G, Milstein C ( 1975) Continuous cultures of fused cel ls secreting antibody of predefined specificity. Nature 256 : 495-7] ,
Les surnageants de culture ont été examinés par immunofluorescence comme suit. B. crocidurae purifiée a été utilisée comme antigène, déposée sur des plaques en verre et fixée avec du méthanol pendant 10 min . Le surnageant de culture des hybridomes a été ensuite déposé sur la plaque et incubé pendant 30 minutes à 37°C. Les plaques sont ensuite lavées deux fois par un tampon phosphate (PBS) contenant 0.1% de Tween, pendant 5 minutes et avec l'eau déminéralisée pendant 5 minutes. Après le séchage, les anticorps de l'hybridome sont marqués avec un anticorps IgG de chèvre anti- immunoglobulines de souris marqué à FITC (Immunotech, Marseille, France) dilué à 1 :400 dans PBS. Après le lavage, les plaques en verre étaient séchées, montées avec du Fl uoprep (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France) et observées sous l umière UV en utilisant un microscope epifluorescent Leica 2500 DM (Leica, Saint Jorioz, France) à un g randissement de x 400. Les sérums de souris immunisées ont été utilisés com me des contrôles positifs et les sérums de souris non-exposées saines ont été utilisés com me des contrôles négatifs. Les cellules des hybridomes intéressants ont été multipliées et les isotypes des anticorps monoclonaux ont été déterminés avec un kit d'isotypage (Isostrip, Roche Diagnostique, Meylan, France) permettant le typage en IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA et IgM . Au total, nous avons obtenu 12 anticorps monoclonaux dont l'isotypage a montré des immunoglobulines G l, G2a, G2b et M ayant tous une chaîne légère kappa (Tableau 1).
Les surnageants de culture présentaient des concentrations en anticorps de 30pg/m L pour P3A10 et 40pg/mL pour P6D9.
2) La spécificité des anticorps monoclonaux a été ensuite confirmée immunofluorescence indirecte, par Western immunoblotting et par immunoblot bidimensionnel selon les méthodes précédemment décrites [Renesto P, Samson L, Ogata H, Azza S, Fourquet P, et al . (2006) Identification of two putative rickettsial adhesins by proteomic analysis. Res Microbiol 157 : 605-612] . Ainsi, 12 anticorps ont été testés par immunofluorescence indirecte contre B. crocidurae, B. duttonii, B. recurrentis, B. burgdorferi et 10 organismes responsables de fièvre en Afrique occidentale et retrouvés dans le sang des patients fébriles [Sokhna C, Mediannikov O, Fenollar F, Bassene H, Diatta G, et al. (2013) Point-of- Care Laboratory of Pathogen Diagnosis in Rural Sénégal. PLoS Negl Trop Dis 7(1); el999; D'Acremont V, Kîlowoko M, Kyungu E, Philipina S, Sangu W, et al (2014) Beyond Malaria-causes of fever in outpatient Tanzanian children. N Engl J Med 370: 809] à savoir Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Salmonella Paratyphi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bartonella quintana, Acetinobacter baumanii, Haemophilus influenza, Coxiella burnetii, Rickesttstia felis et Plasmodium falciparum.
Le Tableau 1 ci-après mentionne l'isotypage et tests de spécificité de 12 anticorps monoclonaux dirigés contre B. crocidurae par immunofluorescence indirecte. Pos = positif ; neg= négatif.
Tableau 1
Hybridome P4F7 P6G9 P10H6 P2E1 P3A10 P6D9 P2E9 P9B1 P6A1 P5A7 P7D7 P1D4
Isotype IgGlk IgGlk IgG2ak IgGlk IgG2bk IgGlk IgGlk IgGlk IgG2bk IgGlk IgM k IgG2bk
Titre 320 320 80 40 640 1280 320 160 80 40 320 160 pos pos pos pos pos pos pos pos
B. crocidurae pos pos pos pos pos pos pos pos neg
B. duttonii pos pos pos pos pos pos pos pos neg pos neg neg neg neg
B. recurrentis pos pos pos pos pos pos pos neg neg neg
B. burgdorferi neg neg pos pos neg pos pos neg
S. paratyphy neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
S. agalactiae neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
S.pneumonia neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
R. felis neg neg neg neg neg neg neg neg
P. falciparum neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
£ coli neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
C. burnetii
neg neg neg neg neg neg neg neg neg
B. quintana os neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
P. eroginosa
neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
H. influenzae
neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg
A. baumanii neg neg
Plus particulièrement, seulement deux anticorps ont présenté des titres plus élevés que les autres anticorps, avec des réactivîtés après dilution au 1/640 contre B. crocidurae pour l'anticorps P3A10 et 1/1280 pour P6D9) conformément au but requis selon la présente invention et ont été caractérisés pl us avant.
Le Tableau 2 suivant liste les Souches de Borrelia et autres organismes utilisés pour le dépistage et les tests de spécificité des anticorps monoclonaux.
Species Strain Source
Borrelia crocidurae Achema Ornithodoros sonrai, Mauritanie
Borrelia duttonii Ly Ornithodoros moubata, Marseille,
France
Borrelia recurrentis Al Pediculus humanus, Marseille, France
Borrelia burgdorferi B31 Ixodes scapularis, ATCC 35210
Salmonella paratyphy DK336 Blood culture, Dakar, Sénégal
Streptococcus agalactiae DK003 Vagina, Dakar, Sénégal
Streptococcus pneumoniae 8CV Soil, Marseille, France
Rickettsia felis URRWXCal(2)(T) Flea, Marseille, France
Plasmodium falciparum Blood, Dakar, Sénégal
Escherichia coli DK031 Urine, Dakar, Sénégal
Coxellia burnetii RSA 493 Infective endocarditis, Marseille, France
Bartonella quintana URBQ TF14 Trench Fever, Marseille, France Pseudomonas aeruginosa DK 069 Cathéter, Dakar, France
Haemophilus influenza DK 102 Pus, Dakar, Sénégal
Acinetobacter baumannii DK 007 Pus, Dakar, Sénégal
3) Pour confirmer la réactivité et la spécificité de ces deux anticorps dans le genre Borrelia, les inventeurs ont réalisé des tests en immunoblotting par im munodétection sur membrane, les bactéries {B. crocidurae, B. duttonii et B. burgdorferi) purifiées ont été lysées par sonication da ns une sol ution réhydratée (urée, 7 M ; thiourée, 2 M ; 4 % w/v de CHAPS) et ont centrifugées ( 10,000 x g, 20 minutes, 4°C) pour enlever des débris bactériens cellulaires et les bactéries intactes. L'extrait de protéines cellulaires a été précipité en utilisant le kit de nettoyage 2D PlusOne (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Royaume-Uni) . Le culot a été re-suspendu en solution hydratée et la concentration en protéines a été déterminée utilisant la méthode de Bradford modifiée [Kowalczewska M, Fenollar F, Villard C, Azza S, Roux M, Raoult D. An immunoproteomic approach for identification of clinical biomarkers of Whipple's disease. Proteomics Clin Appl . 2008; 2: 504- 16] . Les résultats ont montré que l'anticorps P3A10 est spécifique à B. crocidurae tandis que l'anticorps P6D9 reconnaît à la fois B. crocidurae et B. duttonii et que aucun des deux anticorps testés ne reconnaît B. burgdorferi (borrelia du groupe Lyme) (figure 1) et B. recurrentis.
Afin de caractériser les protéines antigéniques contre lesquel les ces deux anticorps sont dirigés, les inventeurs ont utilisé une technique d'immunoblotting sur gel bi-dimensionnel . Toutes les immuno-électro- focalisations à pH 3-10 (Im mobiline DryStrips, GE Healthcare, Aulnay sous- bois, France) ont été réalisées avec 30 μ G de protéines solubilisées et les étapes d'électrophorèse 2D ont été réalisées comme décrites précédemment [Renesto P, Samson L, Ogata H, Azza S, Fourquet P, et a l . (2006) Identification of two putative rickettsial adhesins by proteomic analysis. Res Microbiol 157 : 605-612] . Les protéines ont été résolues par l'électrophorèse à travers le gel à SDS-polyacryla mide 10 % ( EttanTM DALT, GE Hea lthcare) à 5 W/gel pendant 30 minutes, suivie par 17 W/gel pour 4-5 h . Après l'électrophorèse, les gels ont été colorés à l 'argent ou ont été transférés sur une membrane de nitrocellulose. Des images numériques ont été produites par balayage de transmission (Image Sca n ner, GE Healthcare) . Les protéines de Borrelia crocidurae résolues par l'électrophorèse de gel 2D ont été transférés su r des membranes nitrocellulose (Trans-blot Transfer Médium, pure Nitrocel lulose Membrane 0.45 pm BioRad, Ville-d'Avray, France). Les mem branes ont été ensuite bloquées dans PBS additionné de 0,2 % Tween 20 et 5% de lait sec sans matières grasses (PBS-Tween-mil k) pendant 1,5 h à température ambiante avant l'i ncubation avec les sérums de patients infectés. On a utilisé une dilution de 1 : 100 pou r le Western Blot réalisé avec une association de 5 sérums (10 μ L de chaque sérum individuel) de donneurs de sang sains. Après 1 h d'incubation les membra nes ont été lavées trois fois avec PBS-TWEEN et révélées avec des anticorps secondaires de détection spécifiques de la chaîne lourde des immunoglobulines de type IgG conjugués à la peroxydase de raifort IgG ( 1 : 5,000; GE Healthcare) . Chaque mem bra ne traitée avec l'anticorps secondaire a été lavée trois fois comme indiqué précédemment. Les protéines marquées ont été visualisées (figure 1) en utilisant un kit de chemol uminescence com mercialisé (ECL™ Western blotting Analysis System, GE Healthcare) . Ensuite, les membranes ont été exposées à Hyperfilm ™ ECL et développées par la suite utilisant u n processeur de fil m automatisé (Hyperprocesseur ™, GE Healthcare) . Les spots protéi nes ont été extraits du gel et identifiés utilisant par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Ultraflex II, Bruker Daltonics, Wissembourg, France). Les spectres de masses ont été cali brés en utilisant les peptides autolytiques de trypsine. Les empreintes de masse peptidique ont été utilisées pour identifier les protéines en utilisant le logiciel de Mascotte. On a comparé les résultats obtenus avec toutes les séquences disponibles dans des bases de données publiques, y com pris ceux pour les eucaryotes (http ://www.matrixscience .com). Les résultats révèlent que l'anticorps P3A10 reconnaît la protéine f lagel line qui se caractérise chez Borrelia crocidurae par une séquence de 335 acides aminés (codé par le gène GenBank : GU357619.1) d'un poids moléculaire de 35,6 kDa et un point isoélectrique de 5.44 alors que l'anticorps P6D9 reconnaît la protéine VLP caractérisée chez Borrelia crocidurae par une séquence de 340 acides aminés (codé par le gène GenBank : 12818170) d'un poids moléculaire de 35, 19 kDa et un point isoélectrique de : 6.37. Les inventeurs ont montré que les 2 anticorps P3A10 et P6D9 avaient la capacité à détecter la bactérie B. crocidurae dans le sang de cobayes expéri mentalement infectés avec cette bactérie. Brièvement, cinq cobayes femel les âgées de 7 semaines ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec 107 B. crocidurae ou du tampon (contrôle négatif). Après euthanasie, le sang obtenu par ponction intracardiaq ue 5 jours après l'inoculation, a été testé par immunofluorescence incorporant l'anticorps P6D9 ou l'anticorps P3A10 com me décrit précédemment [Yu Y, owalczewska M, Decloquement P, Nappez C, La Scola B (2006) Production of monoclonal antibodies to Tropheryma whipplei and identification of recog nized epitopes by two- dimensional electrophoresis and mass spectrometry. J Clin Microbiol 44:4179- 4185] . Aucune Borrelia n'a été détectée dans le sang des animaux témoins- négatifs (figure 2A) alors que des organismes de morphologie compatible avec les Borrelia ont été détectés chez 5/5 des animaux inoculés (figure 2B) . 4) Détection de B. crocidurae par technique ELISA
Dans cet exemple, illustré par le schéma de la figure 3, les inventeurs ont cherché à détecter la bactérie B. crocidurae par une technique ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) qui consiste à fixer un premier anticorps spécifique selon l'invention (2) sur un support solide (1) qui est le fond d'un puits d'une plaque, à déposer l'échantillon à tester, puis à révéler la réaction anticorps-bactérie B. crocidurae (3) par une réaction colorimétrique avec un anticorps secondaire de détection marqué détectable directement ou indirectement, à savoir ici un deuxième anticorps spécifique selon l'invention biotinylé (4,4a) différent du premier anticorps. Plus particulièrement, les inventeurs ont déposé au fond des puits d'une plaq ue ELISA à 96 puits (TopYield microtiter module, VWR, Fontenay- sous-bois, France), 100pL / puits d'une solution d'anticorps anti-z?. crocidurae titrant à 10 pg/m L (anticorps P3A10; anticorps P6D9; ou mélange des deux anticorps P3A10 + P6D9) après dilution dans un tampon carbonate (0.05 M carbonate buffer, pH 9.6) . La plaque ELISA a été ensuite scellée et incubée pendant une nuit à 4°C. L'excès d'anticorps non-fixés au fond des puits, a été éliminé par trois lavages successifs par un tampon phosphate (PBS) additionné de Tween20 à la concentration finale de 0,01% (PBST), puis la plaque a été saturée pendant 30 minutes par une solution de PBS- albumine sérique bovine (BSA) à la concentration finale de 5%. Après trois nouveaux lavages par du PBST, une suspension de bactéries Borrelia crocidurae diluées dans d u PBST-BSA 3% contenant 10 pg de protéines totales /mL a été ajoutée sous un volume de 100 μΙ_ par puits, et incubée pendant 60 mi nutes à 37°C. Le dit deuxième anticorps de détection biotinylé est ensuite incubé pendant 60 minutes à 37°C puis trois nouveaux lavages sont réalisés. La plaque a été lavée trois fois de suite par du PBST et 100pL d'anticorps conjugué à la bioti ne (20 pg/mL) ont été ajoutés et incubés à température a mbiante pendant une heure dans du PBST-BSA 3%. La plaque a été lavée trois fois de suite avec du PBST. Un volume de lOOpL de streptavidin-H RP (enzyme peroxydase de raifort) (GE Healthcare) diluée à 1/10000 dans du PBST-BSA 3% a été incubé pendant 30 min dans chaque puits. Après trois lavages successifs avec du PBST, 200 pL de o- phenylenediamine dihydrochloride (Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) ont été ajoutés dans chaque puits pendant 20 minutes et l'absorbance a été mesurée à 485 nm en utilisant le microtiter plate reader (Biotek EL800, Col mar, France) .
La lecture des densités optiques est rapportée dans le Tableau 3 suivant.
Tableau 3
Figure imgf000016_0001
Dans ce tablea u 3, pour un anticorps donné, la densité optique d u contrôle négatif est toujours plus basse que cel le du puits homologue contenant les bactéries (essai) avec un rapport de densité optique variant de 2 à 3, indiquant la capacité des anticorps à détecter la bactérie B. crocidurae. Egalement, ces résultats indiquent que les deux anticorps P3A10 et P6D9 sont équivalents et qu'il n'y a pas de bénéfice à ajouter les deux anticorps dans le même puits comme anticorps de capture .
Chacun de ces deux anticorps peut donc être utilisé dans un test de format ELISA de détection des bactéries B. crocidurae. 2) Détection de B. crocidurae par dot-blot (immunodétection sur membrane de nitrocell ulose) .
Un volume de 100 μ!_ d'anticorps titrant à 20 pg/mL (anticorps P3A10; ou anticorps P6D9; ou mélange d'anticorps P3A10+P6D9) est déposé directement sur une membrane de nitrocellulose (Trans-blot Transfer Médium, pure Nitrocellulose Membrane 0.45pm BioRad, Ville-d'Avray, France). La membrane est incubée pendant une heure à température ambiante puis séchée à l'air libre. La membrane est ensuite saturée par du PBS additionné de Tween20 à une concentration finale de 0,2% et de lait écrémé à une concentration finale de 5% (PBS-Tween-mil k), pendant une heure à température ambiante. La membrane est ensuite incubée en présence d'une suspension de Borrelia crocidurae produite par l'hybridome contenant 20 pg de protéines totales /mL dans du tampon de saturation sous un volume de 100pL, pendant une heure à température ambiante. Les membranes témoins négatifs sont incubées dans les mêmes conditions avec du tampon PBS. Les membranes sont ensuite lavées trois fois dans du PBS Tween20 à une concentration finale 0,2% puis incubées avec 100 pL d'anticorps de détection marqué à la biotine décrit ci-dessus à la concentration de 20 pg/mL, pendant une heure à température ambiante dans du PBS Tween20 à une concentration finale de 0,2% lait écrémé à une concentration 5%; puis lavées trois fois comme indiqué ci-dessus. Un volume de 100 pL de streptavidin-HRP (GE Healthcare, Aulnay sous-Bois, France) diluée à 1/10000 dans du PBS Tween20 0,2% a été incubé pendant 30 min dans chaque puits. Les taches ont été visualisées en utilisant un kit commercialisé de chemol uminescence (ECL™ Western blotting Analysis System, GE Healthcare) . Enfin, les membranes ont été exposées à un film révélateur (Hyperfilm™ ECL, GE Healthcare, Aul nay sous-Bois, France) et développées (Hyperprocessor™, GE Healthcare) .
L'analyse des membranes Figures 4A et 4B montre une absence de tache visible et donc de fixation dans les témoins négatifs (à droite) et la présence d'une tache visible (Bl et B2) témoignant de la fixation des bactéries B. crocidurae par chacun des deux anticorps P3A10 (figure 4A) et anticorps P6D9 (Figure 4B) .
Ces deux anticorps sont donc utilisables dans un format dot-blot, bien adapté pour le diagnostic rapide de la fièvre récurrente à B. crocidurae.

Claims

REVEN DICATIONS
1. Méthode de détection in vitro ou ex-vivo spécifique d'une bactérie Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii dans laquelle on détecte la présence d'une dite bactérie Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii dans un échantillon biologique d'un patient humain ou animal, de préférence un échantillon sanguin caractérisé en ce qu'on détecte une réaction immunologique d'une dite bactérie et/ou un fragment de la dite bactérie dans ledit écha ntillon avec un anticorps choisi parmi : - un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine flagelline de
Borrelia crocidurae et spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae, et
- un anticorps monoclonal dirigé contre les protéines VLP de Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii et spécifique des deux espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii.
2. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'on détecte spécifiquement la présence d'une dite bactérie Borrelia crocidurae dans un dit échantillon biologique et on utilise au moins un dit anticorps monoclonal spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae pour détecter u ne réaction immunologique entre une dite bactérie du dit échantillon avec un anticorps monoclonal spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae.
3. Méthode selon la revendication 2 caractérisée en ce que ledit anticorps monoclonal spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae est un anticorps de type IgGl produit par l'hybridome déposé à la collection DSMZ sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3255.
4. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'on détecte spécifiquement la présence d'une dite bactérie Borrelia duttonii dans un dit échantillon biologique et on utilise au moins deux anticorps monoclonaux pour détecter une réaction im munologiq ue entre une dite bactérie du dit échantillon et un dit anticorps monoclonal spécifique des deux espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii et une absence de réaction immu nologique entre une dite bactérie dudît échantil lon et un dit anticorps monoclonal spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae.
5. Méthode selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit anticorps monoclonal spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae est u n anticorps de type IgG l produit par l'hybridome déposé à la collection DSMZ sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3255, et ledit anticorps monoclonal spécifique des deux espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii est un anticorps de type IgG2 produit par l'hybridome déposé à la collection DSMZ sous le numéro d'enregistrement ACC3256.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes da ns lesquelles : a) on met en contact le dît échantillon avec un support solide sur lequel on a fixé un prem ier dît anticorps monoclonal, et b) on met en contact le dit support solide avec une substance de détection apte à se lier avec un dit premier anticorps ou la dite bactérie.
7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'à l'étape b), on met en contact le dit support solide avec une substance de détection apte à se lier à une dite bactérie fixée audit support solide ayant réagie avec un dit premier anticorps.
8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que la dite substance de détection apte à se lier à une dite bactérie est un anticorps de détection consistant en u n deuxième dit anticorps monoclonal spécifique d'au moins Borrelia crocidurae ou Borrelia duttonii différent dudit premier anticorps monoclonal .
9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le dit échantillon biologique est un échantillon de sang ou de tissu ou organe d'un patient h u m ai n ou a nimal .
10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le dit échantillon biologique est un échantillon de tique comprenant l'hémolymphe ou un tissu de tique préparé pour l 'histologie ou un examen d'anatomie pathologique.
11. Anticorps monoclonal utile dans une méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre la protéine flagelline de Borrelia crocidurae et est spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae.
12. Anticorps monoclonal selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'i l s'agit d'un anticorps de type IgG l produit par l'hybridome déposé à la collection DSMZ sous le numéro d'enregistrement DS ACC3255.
13. Anticorps monoclonal utile dans une méthode selon la revendication 1 et l'une des revendications 1 et 4 à 10 caractérisé en ce qu'il est dirigé contre les protéi nes VLP de Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii et il est spécifique des 2 espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii.
14. Anticorps monoclonal selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps de type IgG2 produit par l'hybridome déposé à la collection DSMZ sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3256.
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