FR3028858A1

FR3028858A1 - Anticorps monoclonal specifique de borrelia crocidurae et une methode de diagnostic in vitro d'une fievre recurrente de borreliose

Info

Publication number: FR3028858A1
Application number: FR1461399A
Authority: FR
Inventors: Michel Drancourt; Scola Bernard La; Remi Charrel; Didier Raoult; Fotso Aurelien Fotso
Original assignee: Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM; Fondation Mediterranee Infection
Current assignee: Aix Marseille Universite; Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM; Fondation Mediterranee Infection
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2016-05-27
Anticipated expiration: 2034-11-25
Also published as: WO2016083708A1; FR3028858B1

Abstract

La présente invention concerne un anticorps monoclonal spécifique d'au moins une espèce de bactérie du genre Borrelia responsable de fièvre récurrente en Afrique comprenant au moins Borrelia crocidurae ainsi qu'une méthode de détection in vitro ou ex vivo d'une bactérie Borrelia crocidurae dans un échantillon biologique.

Description

1 Anticorps monoclonal spécifique de Borrelia crocidurae et une méthode de diagnostic in vitro d'une fièvre récurrente de borréliose La présente invention concerne un anticorps monoclonal spécifique de Borrelia crocidurae et une méthode de diagnostic in vitro d'une fièvre récurrente de borréliose liée à une infection par une bactérie Borrelia crocidurae. En Afrique, la fièvre récurrente est une pathologie négligée due à des bactéries spirochètes du genre Borrelia, transmises depuis un réservoir mammifère par des arthropodes vecteurs. Plus précisément, les borrélia concernées cultivées incluent Borrefia crocidurae, Borrelia duttonii, Borrelia hispanica et Borrefia recurrentis. Ces borrelia sont transmises par les tiques du genre Ornithodoros sauf B. recurrentis qui est transmise par les poux [Elbir H, Abi-Rached L, Pontarotti P, Yoosuf N, Drancourt M. African relapsing fever borreliae genomospecies revealed by comparative genomics. Front Public Health. 2014;2:43]. Ces borrelia sont responsables de fièvres récurrentes dont les complications et la mortalité dépendent de l'espèce responsable de l'infection [Elbir H, Raoult D, Drancourt M. Relapsing fever borreliae in Africa. Am J Trop Med Hyg. 2013;89:288-92]. Il y a donc un intérêt à déterminer chez un patient présentant un tableau clinique compatible avec une fièvre récurrente, en zone d'endémie ou au retour d'une zone d'endémie, l'espèce de Borrelia responsable de l'infection. Actuellement, la détection de ces pathogènes dans les arthropodes vecteurs et les patients, se fait par des méthodes moléculaires basées sur la PCR exigeant beaucoup de ressources et des équipements spécifiques [Elbir H, Raoult D, Drancourt M. Relapsing fever borreliae in Africa. Am J Trop Med Hyg. 2013;89:288-92], en plus de l'examen microscopique direct du sang qui est un test de laboratoire peu sensible et non spécifique de l'espèce de Borrelia. L'examen microscopique ne peut pas distinguer entre les espèces différentes de Borrefia et les méthodes moléculaires ne sont pas disponibles partout, étant principalement utilisées dans quelques centres de référence qui ne sont pas localisés dans les régions endémiques.

3028858 2 Il est donc souhaitable de développer des tests diagnostiques moins chers et plus faciles à mettre en oeuvre pour la détection rapide des Borrelia responsables des fièvres récurrentes. Dans cette perspective, quelques anticorps ont été décrits pour Borrelia hermsii et Borrelia turcicatae, deux 5 espèces de Borrelia restreintes à l'Amérique et qui ne sont pas retrouvées sur les autres continents. En effet, les anticorps pourraient être utilisés pour la détection directe et l'identification de Borrelia, mais aucun anticorps n'a été rapporté pour être spécifique d'une des espèces de Borrelia responsables de fièvre récurrente en Afrique.

10 Selon la présente invention on a cherché à produire des anticorps monoclonaux contre B. crocidurae, qui est l'espèce prévalente en Afrique de l'Ouest responsable de plus de 95% des fièvres de borréliose en Afrique de l'Ouest dans la perspective de leur incorporation dans des tests diagnostiques rapides de la fièvre récurrente à B. crocidurae, en particulier 15 dans un point-de-soins. En effet, les manifestations cliniques des fièvres récurrentes à Borrelia sont souvent confondues avec les manifestations cliniques du paludisme [Cutler S, Abdissa A, Trape J (2009) New concepts for the old challenge of African relapsing fever borreliosis. Clin Microbiol Infect 15:400-406]. Cependant, les fièvres récurrentes et le paludisme n'ont 20 en commun ni leur pronostic, ni leur traitement ni leur prévention. Il est donc souhaitable de disposer d'un test diagnostique permettant de réaliser dans le temps du soin, le diagnostic des fièvres récurrentes à Borrelia. Plus particulièrement, il est souhaitable de disposer d'un test diagnostique utilisable dans les conditions du soin dans les pays d'endémie, c'est-à-dire 25 d'un test donnant une réponse rapide (moins de 30 minutes), facilement manipulable sans instrumentation. Les différents formats de tests incorporant des anticorps spécifique (« lateral flow assays ») répondent à ces critères et il est donc souhaitable de disposer d'anticorps dirigés spécifiquement contre les Borrelia responsables de fièvres récurrentes dans 30 une région géographique, en Afrique dans cette invention. Un autre but de la présente invention était de fournir un anticorps à une concentration dans le surnageant de culture de l'hybridome d'au moins 10 pg /mL de préférence au moins 20 pg /mL d'une part et d'autre part un 3028858 3 anticorps fortement réactif, avec la dite bactérie notamment réactif à une dilution supérieure à 1/320 à partir d'une concentration initiale produite par l'hybridome d'au moins 10 pg/mL, de préférence au moins 20 pg/mL. Ces titres en anticorps et réactivité sont nécessaires pour permettre de détecter 5 des concentrations sanguines de bactéries de 10 pg/mL par les techniques d'immunodétection par luminescence sur membrane ou sur plaque par test ELISA du type sandwich comme il est requis en pratique. La présente invention fournit un anticorps monoclonal spécifique d'au moins une espèce de bactérie du genre Borrelia responsable de fièvre 10 récurrente en Afrique comprenant au moins Borrelia crocidurae. Dans une première variante ledit anticorps monoclonal est spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae. Plus particulièrement, ledit anticorps est dirigé contre la protéine flagelline de Borrelia crocidurae. Cette protéine flagelline est caractérisée 15 par une séquence de 335 acides aminés (codée par le gène GenBank : GU357619.1) d'un poids moléculaire de 35,6 kDa et un point isoélectrique de 5.44. Plus particulièrement encore, il s'agit d'un anticorps dénommé ci-après P3A10 de type IgG1 produit par l'hybridome déposé à la collection DSMZ 20 sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3255 le 5 novembre 2014. Dans une deuxième variante, ledit anticorps monoclonal est spécifique des deux espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttonii. Borrelia duttonll est peu présente en Afrique de l'Ouest mais en revanche davantage présente en Afrique de l'Est que Borrelia crocidurae.

25 Plus particulièrement, dans cette deuxième variante, ledit anticorps est dirigé contre la protéine Variable like protein (VIp) de Borrelia crocidurae et la protéine Variable like protein (VIp) de Borrelia duttonii. La protéine Variable like protein (VIp) de Borrelia crocidurae est caractérisée par une séquence de 340 acides aminés (codée par le gène GenBank : 12818170) 30 d'un poids moléculaire de 35,19 kDa et un point isoélectrique de : 6.37 ; et la protéine Variable like protein (VIp) de Borrelia duttonii est caractérisée par une séquence de 340 acides aminés (codée par le gène GenBank : 3028858 4 6920221) d'un poids moléculaire de 35,25 kDa et un point isoélectrique de 5.86. Plus particulièrement, il s'agit d'un anticorps dénommé ci-après P6D9 de type IgG2 produit par l'hybridome déposé à la collection DSMZ- sous le 5 numéro d'enregistrement DSM ACC3256 le 5 novembre 2014. Les hybridomes ci-dessus DSM ACC3255 et DSM ACC3256 ont été déposés à la collection DSMZ-(« Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen » GmbH Inhoffenstraf3e 7 B 38124 Braunschweig, Allemagne ») selon le traité de Budapest ; ce sont des hybridomes de 10 cellules myélomateuses produits selon le protocole précédemment décrit [Kôhler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-7]. Les hybridomes ci-dessus produisent les dits anticorps à la concentration de 30-40 pg/mL et ces anticorps sont réactifs à des dilutions 15 de 640 pour P3A10 et 1280 pour P6D9. La présente invention fournit également une méthode de détection in vitro ou ex-vivo d'une une bactérie Borrelia crocidurae dans laquelle on détecte la présence d'une dite bactérie Borrelia crocidurae dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'on utilise au moins un anticorps 20 spécifique d'une dite bactérie selon l'invention pour détecter une réaction immunologique d'une dite bactérie et/ou un fragment de la dite bactérie dans ledit échantillon avec un anticorps selon l'invention. Plus particulièrement, on détecte un dit fragment de bactérie comprenant l'antigène reconnu par : 25 - soit l'anticorps spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae, de type IgG1 produit par l'hybridome déposé à DSMZ sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3255, à savoir la protéine intracellulaire flagelline qui se caractérise par une séquence de 335 acides aminés (codé par le gène GenBank : GU357619.1) d'un poids moléculaire de 35,6 kDa et un point 30 isoélectrique de 5.44. 3028858 5 - soit l'anticorps spécifique deux espèces Borrefia crocidurae et Borrefia duttonii, de type IgG2 produit par l'hybridome déposé à DSMZ sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3256, à savoir la protéine de surface Variable like protein (VIp) de Borrefia crocidurae caractérisée par une 5 séquence de 340 acides aminés (codé par le gène GenBank : 12818170) d'un poids moléculaire de 35,19 kDa et un point isoélectrique de : 6.37 ; et la protéine de surface Variable like protein (VIp) de Borrefia duttonii caractérisée par une séquence de 340 acides aminés (codé par le gène GenBank : 6920221) d'un poids moléculaire de 35,25 kDa et un point 10 isoélectrique de 5.86. Dans un mode préféré de réalisation, on détecte la présence d'une dite bactérie Borrefia crocidurae dans un échantillon biologique d'un patient humain ou animal, de préférence un échantillon sanguin et on utilise au moins un anticorps monoclonal selon l'invention pour détecter une réaction 15 immunologique entre une dite bactérie du dit échantillon avec un anticorps monoclonal selon l'invention. Plus particulièrement, on réalise les étapes dans lesquelles : a) on met en contact le dit échantillon avec un support solide sur lequel on a fixé un premier dit anticorps monoclonal spécifique d'au moins 20 Borrefia crocidurae, et b) on met en contact le dit support solide avec une substance de détection apte à se lier avec un dit premier anticorps ou de préférence avec la dite bactérie. De préférence, à l'étape b), on met en contact le dit support solide 25 avec une substance de détection apte à se lier une dite bactérie ayant réagie avec un dit premier anticorps fixée audit support solide, de préférence un anticorps de détection consistant en un dit deuxième anticorps monoclonal spécifique d'au moins Borrefia crocidurae différent dudit premier anticorps monoclonal.

3028858 6 Plus particulièrement, on met en oeuvre la méthode selon l'invention pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d'une fièvre récurrente liée à une infection par une bactérie Borrelia crocidurae. Le dit support solide peut être notamment une plaque de verre ou 5 plastique ou une membrane de gel polyacrylamide ou de nitrocellulose. Le dit échantillon biologique peut être un échantillon de sang ou de tissu ou organe d'un patient humain ou animal ou un échantillon d'un insecte de préférence d'une tique susceptible de contenir être infecté par la dite bactérie.

10 Le dit tissu peut être notamment un échantillon de cerveau, foi ou rate préparé pour l'histologie ou un examen d'anatomie pathologique. En particulier, on fixe le dit échantillon de tissu ou organe au formol et on l'inclut dans une résine notamment de la paraffine et l'on en coupe une tranche pour analyse.

15 L'échantillon de tique peut être de l'hémolymphe ou un tissu de la tique préparé pour l'histologie ou un examen d'anatomie pathologique. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description qui va suivre, faite de manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés sur 20 lesquels : - la figure 1 représente le profil de protéines obtenues par SDS-PAGE avec coloration au nitrate d'argent de Borrelia sp.et immunoblots avec les anticorps monoclonaux P6D9 et P3A10. Les marqueurs standards de poids moléculaire sont indiqués sur la gauche ; 25 - les Figures 2A et 2B présentent les résultats d'immunodétection par immunofluorescence utilisant un anticorps spécifique de B. crocidurae P3A10 dans le sang de cobaye non-infecté (figure 2 A) et infecté (figure 2B) ; - Sur la figure 3, on montre un schéma de test ELISA du type sandwich avec P3A10 comme dit premier anticorps de réaction fixé sur support solide 30 et P6D9 comme anticorps secondaire de détection biotinylé ; et 3028858 7 - les figures 4A et 4B présentent des Dot-blot contre B. crocidurae utilisant l'anticorps P3A10 (figure 4A) et P6D9 (figure 4B). 1) Production d'anticorps monoclonaux. B. crocidurae, souche Achema, B. duttonll souche Ly et B. burgdorferi 5 souche B31 ont été cultivées à 32°C dans le milieu Barbour-Stoenner-Kelly-H (BSK-H) (Sigma, Saint-Quentin-Fallavier, la France) complété avec 10 % de sérum de lapin inactivé par la chaleur (Eurobio, Courtaboeuf, la France). Pour la production des anticorps monoclonaux, des souris BALB/C femelles âgées de 6 semaines ont été immunisées par inoculation intra- 10 péritonéale de la souche de B. crocidurae purifiée en présence d'hydroxyde d'aluminium comme adjuvant. Les souris ont été stimulées trois fois à l'intervalle de 2 semaines, et 5 jours après la dernière injection, les souris ont été euthanasiées et la rate a été prélevée. Les cellules de la rate ont été fusionnées avec des cellules de myélome (lignée cellulaire X63 Ag 8.653) et 15 les cellules fusionnées ont été cultivées dans un milieu RPMI comme précédemment décrit [Kôhler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-7]. Les surnageants de culture ont été examinés par immunofluorescence comme suit. B. crocidurae purifiée a été utilisée comme antigène, déposée 20 sur des plaques en verre et fixée avec du méthanol pendant 10 min. Le surnageant de culture des hybridomes a été ensuite déposé sur la plaque et incubé pendant 30 minutes à 37°C. Les plaques sont ensuite lavées deux fois par un tampon phosphate (PBS) contenant 0.1% de Tween, pendant 5 minutes et avec l'eau déminéralisée pendant 5 minutes. Après le séchage, les 25 anticorps de l'hybridome sont marqués avec un anticorps IgG de chèvre anti- immunoglobulines de souris marqué à FITC (Immunotech, Marseille, France) dilué à 1:400 dans PBS. Après le lavage, les plaques en verre étaient séchées, montées avec du Fluoprep (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France) et observées sous lumière UV en utilisant un microscope epifluorescent Leica 30 2500 DM (Leica, Saint Jorioz, France) à un grandissement de x 400. Les sérums de souris immunisées ont été utilisés comme des contrôles positifs et les sérums de souris non-exposées saines ont été utilisés comme des 3028858 8 contrôles négatifs. Les cellules des hybridomes intéressants ont été multipliées et les isotypes des anticorps monoclonaux ont été déterminés avec un kit d'isotypage (Isostrip, Roche Diagnostique, Meylan, France) permettant le typage en IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA et IgM. Au total, 5 nous avons obtenu 12 anticorps monoclonaux dont l'isotypage a montré des immunoglobulines G1, G2a, G2b et M ayant tous une chaine légère kappa (Tableau 1). Les surnageants de culture présentaient des concentrations en anticorps de 30pg/mL pour P3A10 et 40pg/mL pour P6D9. 10 2) La spécificité des anticorps monoclonaux a été ensuite confirmée immunofluorescence indirecte, par Western immunoblotting et par immunoblot bidimensionnel selon les méthodes précédemment décrites [Renesto P, Samson L, Ogata H, Azza S, Fourquet P, et al. (2006) Identification of two putative rickettsial adhesins by proteomic analysis. Res 15 Microbiol 157: 605-612]. Ainsi, 12 anticorps ont été testés par immunofluorescence indirecte contre B. crocidurae, B. duttonii, B. burgdorferi et 10 organismes responsables de fièvre en Afrique occidentale et retrouvés dans le sang des patients fébriles [Sokhna C, Mediannikov O, Fenollar F, Bassene H, Diatta G, et al. (2013) Point-of-Care Laboratory of 20 Pathogen Diagnosis in Rural Senegal. PLoS Negl Trop Dis 7(1): e1999; D'Acremont V, Kilowoko M, Kyungu E, Philipina S, Sangu W, et al (2014) Beyond Malaria-causes of fever in outpatient Tanzanian children. N Engi J Med 370: 809] à savoir Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Salmonella Paratyphi, Escherichia colt Pseudomonas aeruginosa, Bartonella 25 quintana, Acetinobacter baurnanii, Haernophilus influenza, Coxiella burnetii, Rickesttstia felis et Plasmodium falciparurn. Le Tableau 1 ci-après mentionne l'isotypage et tests de spécificité de 12 anticorps monoclonaux dirigés contre B. crocidurae par immunofluorescence indirecte. Pos = positif ; neg= negatif.

30 5 10 15 20 3028858 9 Tableau 1 Hybridome P4F7 P6G9 P1OH6 P2E1 P3A10 P6D9 P2E9 P9B1 P6A1 P5A7 P7D7 P1D4 Isotype IgGlk IgGlk IgG2ak IgGlk IgG2bk IgGlk IgGlk IgGlk IgG2bk IgGlk IgM k IgG2bk Titre 320 320 80 40 640 1280 320 160 80 40 320 160 B. crocidurae pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos pos B. duttonil pos pos pos pos neg pos pos pos pos pos pos pos B. recurrentis pos neg pos neg neg neg neg pos pos pos pos pos aburgdorferi pos pos neg neg neg neg neg pos pos neg pos pos S paratyphy neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg S agalactiae neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg Spneumonia neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg R. felis neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg P. falciparum neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg E coli neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg C. burnetll neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg B. quintana neg neg neg neg neg neg neg neg neg pos neg neg P. eroginosa neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg H. influenzae neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg A. baumanil neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg 3028858 10 Plus particulièrement, seulement deux anticorps ont présenté des titres plus élevés que les autres anticorps, avec des réactivités après dilution au 1/640 contre B. crocidurae pour l'anticorps P3A10 et 1/1280 pour P6D9) conformément au but requis selon la présente invention et ont été 5 caractérisés plus avant. Le Tableau 2 suivant liste les Souches de Borrelia et autres organismes utilisés pour le dépistage et les tests de spécificité des anticorps monoclonaux. Species Strain Source Borrelia crocidurae Achema Ornithodoros sonrai, Mauritania Borrelia duttonii Ly Ornithodoros moubata, Marseille, France Borrelia recurrentis Al Pediculus humanus, Marseille, France Borrelia burgdorferi B31 Ixodes scapularis, ATCC 35210 Salmonella paratyphy DK336 Blood culture, Dakar, Senegal Streptococcus aga/actiae DK003 Vagina, Dakar, Senegal Streptococcus pneumoniae 8CV Soil, Marseille, France Rickettsia felis URRWXCa 1(2)(T) Flea, Marseille, France Plasmodium falciparum Blood, Dakar, Senegal Escherichia coli DK031 Urine, Dakar, Senegal Coxellia bumetll RSA 493 Infective endocarditis, Marseille, France Bartonella quintana URBQMTF14 Trench Fever, Marseille, France Pseudomonas aeruginosa DK 069 Catheter, Dakar, France Haernophilus influenza DK 102 Pus, Dakar, Senegal Acinetobacter baurnannii DK 007 Pus, Dakar, Senegal 3028858 11 3) Pour confirmer la réactivité et la spécificité de ces deux anticorps dans le genre Borrelia, les inventeurs ont réalisé des tests en immunoblotting par immunodétection sur membrane, les bactéries (B. crocidurae, B. duttonii et B. burgdorferi) purifiées ont été lysées par sonication dans une solution 5 réhydratée (urée, 7 M ; thiourée, 2 M ; 4 % w/v de CHAPS) et ont centrifugées (10,000 x g, 20 minutes, 4°C) pour enlever des débris bactériens cellulaires et les bactéries intactes. L'extrait de protéines cellulaires a été précipité en utilisant le kit de nettoyage 2D PlusOne (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Royaume-Uni). Le culot a été re-suspendu en 10 solution hydratée et la concentration en protéines a été déterminée utilisant la méthode de Bradford modifiée [Kowalczewska M, Fenollar F, Villard C, Azza S, Roux M, Raoult D. An immunoproteomic approach for identification of clinical biomarkers of Whipple's disease. Proteomics Clin Appl. 2008;2:50416]. Les résultats ont montré que l'anticorps P3A10 est spécifique à B. 15 crocidurae tandis que l'anticorps P6D9 reconnait à la fois B. crocidurae et B. duttonll et que aucun des deux anticorps testés ne reconnait B. burgdorferi (borrelia du groupe Lyme) (figure 1). Afin de caractériser les protéines antigéniques contre lesquelles ces deux anticorps sont dirigés, les inventeurs ont utilisé une technique 20 d'immunoblotting sur gel bi-dimensionnel. Toutes les immuno-électrofocalisations à pH 3-10 (Immobiline DryStrips, GE Healthcare, Aulnay sous Bois, France) ont été réalisées avec 30 p G de protéines solubilisées et les étapes d'électrophorèse 2D ont été réalisées comme décrites précédemment [Renesto P, Samson L, Ogata H, Azza S, Fourquet P, et al. (2006) 25 Identification of two putative rickettsial adhesins by proteomic analysis. Res Microbiol 157: 605-612]. Les protéines ont été résolues par l'électrophorèse à travers le gel à SDS-polyacrylamide 10 % (EttanTM DALT, GE Healthcare) à 5 W/gel pendant 30 minutes, suivie par 17 W/gel pour 4-5 h. Après l'électrophorèse, les gels ont été colorés à l'argent ou ont été transférés sur 30 une membrane de nitrocellulose. Des images numériques ont été produites par balayage de transmission (Image Scanner, GE Healthcare). Les protéines de Borrelia crocidurae résolues par l'électrophorèse de gel 2D ont été transférés sur des membranes nitrocellulose (Trans-blot Transfer Medium, pure Nitrocellulose Membrane 0.45 pm BioRad, Ville-d'Avray, France). Les 3028858 12 membranes ont été ensuite bloquées dans PBS additionné de 0,2 % Tween 20 et 5% de lait sec sans matières grasses (PBS-Tween-milk) pendant 1,5 h à température ambiante avant l'incubation avec les sérums de patients infectés. On a utilisé une dilution de 1:100 pour le Western Blot réalisé avec 5 une association de 5 sérums (10 p L de chaque sérum individuel) de donneurs de sang sains. Après 1 h d'incubation les membranes ont été lavées trois fois avec PBS-TWEEN et révélées avec des anticorps secondaires de détection spécifiques de la chaine lourde des immunoglobulines de type IgG conjugués à la peroxydase de raifort IgG (1:5,000; GE Healthcare).

10 Chaque membrane traitée avec l'anticorps secondaire a été lavée trois fois comme indiqué précédemment. Les protéines marquées ont été visualisées (figure 1) en utilisant un kit de chemoluminescence commercialisé (ECLTM Western blotting Analysis System, GE Healthcare). Ensuite, les membranes ont été exposées à Hyperfilm TM ECL et développées par la suite utilisant un 15 processeur de film automatisé (Hyperprocesseur TM GE Healthcare). Les spots protéines ont été extraits du gel et identifiés utilisant par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Ultraflex II, Bruker Daltonics, Wissembourg, France). Les spectres de masses ont été calibrés en utilisant les peptides autolytiques de trypsine. Les empreintes de masse peptidique 20 ont été utilisées pour identifier les protéines en utilisant le logiciel de Mascotte. On a comparé les résultats obtenus avec toutes les séquences disponibles dans des bases de données publiques, y compris ceux pour les eucaryotes (http://www.matrixscience.com). Les résultats révèlent que l'anticorps P3A10 reconnait la protéine flagelline qui se caractérise chez 25 Borrelia crocidurae par une séquence de 335 acides aminés (codé par le gène GenBank : GU357619.1) d'un poids moléculaire de 35,6 kDa et un point isoélectrique de 5.44 alors que l'anticorps P6D9 reconnait la protéine Vlp caractérisée chez Borrelia crocidurae par une séquence de 340 acides aminés (codé par le gène GenBank : 12818170) d'un poids moléculaire de 35,19 kDa 30 et un point isoélectrique de : 6.37. Les inventeurs ont montré que les 2 anticorps P3A10 et P6D9 avaient la capacité à détecter la bactérie B. crocidurae dans le sang de cobayes expérimentalement infectés avec cette bactérie. Brièvement, cinq cobayes femelles âgées de 7 semaines ont été inoculées par voie intrapéritonéale 3028858 13 avec 107 B. crocidurae ou du tampon (contrôle négatif). Après euthanasie, le sang obtenu par ponction intracardiaque 5 jours après l'inoculation, a été testé par immunofluorescence incorporant l'anticorps P6D9 ou l'anticorps P3A10 comme décrit précédemment [Yu Y, Kowalczewska M, Decloquement 5 P, Nappez C, La Scola B (2006) Production of monoclonal antibodies to Tropheryrna whipp/ei and identification of recognized epitopes by twodimensional electrophoresis and mass spectrometry. J Clin Microbiol 44:41794185]. Aucune Borrelia n'a été détectée dans le sang des animaux témoins-négatifs (figure 2A) alors que des organismes de morphologie compatible 10 avec les Borrelia ont été détectés chez 5/5 des animaux inoculés (figure 2B). 4) Détection de B. crocidurae par technique ELISA Dans cet exemple, illustré par le schéma de la figure 3, les inventeurs ont cherché à détecter la bactérie B. crocidurae par une technique ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) qui consiste à fixer un premier 15 anticorps spécifique selon l'invention (2) sur un support solide (1) qui est le fond d'un puits d'une plaque, à déposer l'échantillon à tester, puis à révéler la réaction anticorps-bactérie B. crocidurae (3) par une réaction colorimétrique avec un anticorps secondaire de détection marqué détectable directement ou indirectement, à savoir ici un deuxième anticorps spécifique 20 selon l'invention biotinylé (4,4a) différent du premier anticorps. Plus particulièrement, les inventeurs ont déposé au fond des puits d'une plaque ELISA à 96 puits (TopYield microtiter module, VWR, Fontenay sous bois, France), 100pL / puits d'une solution d'anticorps anti-B. crocidurae titrant à 10 pg/mL (anticorps P3A10; anticorps P6D9; ou mélange 25 des deux anticorps P3A1O+P6D9) après dilution dans un tampon carbonate (0.05 M carbonate buffer, pH 9.6). La plaque ELISA a été ensuite scellée et incubée pendant une nuit à 4°C. L'excès d'anticorps non-fixés au fond des puits, a été éliminé par trois lavages successifs par un tampon phosphate (PBS) additionné de Tween20 à la concentration finale de 0,01% (PBST), puis 30 la plaque a été saturée pendant 30 minutes par une solution de PBSalbumine sérique bovine (BSA) à la concentration finale de 5%. Après trois nouveaux lavages par du PBST, une suspension de bactéries Borrelia crocidurae diluées dans du PBST-BSA 3% contenant 10 pg de protéines 3028858 14 totales /mL a été ajoutée sous un volume de 100 pL par puits, et incubée pendant 60 minutes à 37°C. Le dit deuxième anticorps de détection biotinylé est ensuite incubé pendant 60 minutes à 37°C puis trois nouveaux lavages sont réalisés. La plaque a été lavée trois fois de suite par du PBST et 100pL 5 d'anticorps conjugué à la biotine (20 pg/mL) ont été ajoutés et incubés à température ambiante pendant une heure dans du PBST-BSA 3%. La plaque a été lavée trois fois de suite avec du PBST. Un volume de 100pL de streptavidin-HRP (enzyme peroxydase de raifort) (GE Healthcare) diluée à 1/10000 dans du PBST-BSA 3% a été incubé pendant 30 min dans chaque 10 puits. Après trois lavages successifs avec du PBST, 200 pL de ophenylenediamine dihydrochloride (Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) ont été ajoutés dans chaque puits pendant 20 minutes et l'absorbance a été mesurée à 485 nm en utilisant le microtiter plate reader (Biotek EL800, Colmar, France).

15 La lecture des densités optiques est rapportée dans le Tableau 3 suivant. Tableau 3 Densités Optiques Anticorps capture/ anticorps essai contrôle négatif de détection P3A10/ P6D9 0,28 0,091 P3A10/P6D9 0,275 0,127 P6D9/P3A10 0,253 0,137 P6D9/P3A10 0,33 0,115 P3A10+P6D9/P3A10 0,349 0,131 P3A1O+P6D9/P6D9 0,217 0,1 Dans ce tableau 3, pour un anticorps donné, la densité optique du contrôle négatif est toujours plus basse que celle du puits homologue contenant les bactéries (essai) avec un rapport de densité optique variant de 2 à 3, indiquant la capacité des anticorps à détecter la bactérie B. 25 crocidurae. Egalement, ces résultats indiquent que les deux anticorps P3A10 20 3028858 15 et P6D9 sont équivalents et qu'il n'y a pas de bénéfice à ajouter les deux anticorps dans le même puits comme anticorps de capture. Chacun de ces deux anticorps peut donc être utilisé dans un test de format ELISA de détection des bactéries B. crocidurae. 5 2) Détection de B. crocidurae par dot-blot (immunodétection sur membrane de nitrocellulose). Un volume de 100 pL d'anticorps titrant à 20 pg/mL (anticorps P3A10; ou anticorps P6D9; ou mélange d'anticorps P3A1O+P6D9) est déposé directement sur une membrane de nitrocellulose (Trans-blot Transfer 10 Medium, pure Nitrocellulose Membrane 0.45pm BioRad, Ville-d'Avray, France). La membrane est incubée pendant une heure à température ambiante puis séchée à l'air libre. La membrane est ensuite saturée par du PBS additionné de Tween20 à une concentration finale de 0,2% et de lait écrémé à une concentration finale de 5% (PBS-Tween-milk), pendant une 15 heure à température ambiante. La membrane est ensuite incubée en présence d'une suspension de Borrelia crocidurae produite par l'hybridome contenant 20 pg de protéines totales /mL dans du tampon de saturation sous un volume de 100pL, pendant une heure à température ambiante. Les membranes témoins négatifs sont incubées dans les mêmes conditions avec 20 du tampon PBS. Les membranes sont ensuite lavées trois fois dans du PBS Tween20 à une concentration finale 0,2% puis incubées avec 100 pL d'anticorps de détection marqué à la biotine décrit ci-dessus à la concentration de 20 pg/mL, pendant une heure à température ambiante dans du PBS Tween20 à une concentration finale de 0,2% lait écrémé à une 25 concentration 5%; puis lavées trois fois comme indiqué ci-dessus. Un volume de 100 pL de streptavidin-HRP (GE Healthcare, Aulnay sous-Bois, France) diluée à 1/10000 dans du PBS Tween20 0,2% a été incubé pendant 30 min dans chaque puits. Les taches ont été visualisées en utilisant un kit commercialisé de chemoluminescence (ECLTM Western blotting Analysis 30 System, GE Healthcare). Enfin, les membranes ont été exposées à un film révélateur (HyperfilmTM ECL, GE Healthcare, Aulnay sous Bois, France) et développées (HyperprocessorTM, GE Healthcare).

3028858 16 L'analyse des membranes Figures 4A et 4B montre une absence de tache visible et donc de fixation dans les témoins négatifs (à droite) et la présence d'une tache visible (B1 et B2) témoignant de la fixation des bactéries B. crocidurae par chacun des deux anticorps P3A10 (figure 4A) et 5 anticorps P6D9 (Figure 4B). Ces deux anticorps sont donc utilisables dans un format dot-blot, bien adapté pour le diagnostic rapide de la fièvre récurrente à B. crocidurae.

Claims

REVENDICATIONS1. Anticorps monoclonal reconnaissant la bactérie Borrelia crocidurae dirigé contre la protéine flagelline ou la protéine VIp de la bactérie Borrelia crocidurae.
2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae et est dirigé contre la protéine flagelline de Borrelia crocidurae.
3. Anticorps monoclonal selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps de type IgG1 produit par l'hybridome déposé à 10 DSMZ sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3255.
4. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est spécifique des deux espèces Borrelia crocidurae et Borrelia duttoniiet est dirigé contre les protéines Vlp de Borrelia crocidurae et Borrelia duttoni. 15
5. Anticorps monoclonal selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps de type IgG2 produit par l'hybridome déposé à la DSMZ sous le numéro d'enregistrement DSM ACC3256.
6. Méthode de détection in vitro ou ex vivo d'une bactérie Borrelia crocidurae dans laquelle on détecte la présence d'une dite bactérie Borrelia 20 crocidurae dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'on utilise au moins un anticorps selon l'une des revendications 1 à 5 pour détecter une réaction immunologique d'une dite bactérie et/ou un fragment de la dite bactérie du dit échantillon avec un dit anticorps.
7. Méthode selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'on détecte 25 spécifiquement la présence d'une dite bactérie Borrelia crocidurae dans undit échantillon biologique et on utilise au moins undit anticorps monoclonal spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae pour détecter une réaction immunologique entre une dite bactérie du dit échantillon avec un anticorps monoclonal spécifique de la seule espèce Borrelia crocidurae. '3028858 2
8. Méthode selon la revendication7, caractérisée en ce qu'on réalise les étapes dans lesquelles : a) on met en contact le dit échantillon avec un support solide sur lequel on a fixé un premier dit anticorps monoclonal d'au moins Borrelia 5 crocidurae, et b) on met en contact le dit support solide avec une substance de détection apte à se lier avec un dit premier anticorps ou la dite bactérie.
9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'à l'étape b), on met en contact le dit support solide avec une substance de détection apte à se lier à une dite bactérie ayant réagie avec un dit premier anticorps fixée audit support solide.
10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que la dite substance de détection apte à se lier à une dite bactérie est un anticorps de détection consistant en un deuxième dit anticorps monoclonal spécifique d'au 15 moins Borrelia crocidurae différent dudit premier anticorps monoclonal.
11. Méthode selon l'une des revendications 6 à 10 pour le diagnostic in vitro ou ex vivo d'une fièvre récurrente liée à une infection par une bactérie Borrelia crocidurae.
12. Méthode selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisée en ce 20 que le dit support solide est une plaque de verre ou plastique ou une membrane de gel polyacrylamide ou de nitrocellulose.
13. Méthode selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisée en ce que le dit échantillon biologique est un échantillon de sang ou de tissu ou organe d'un patient humain ou animal. 25
14. Méthode selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisée en ce que le dit échantillon biologique est un échantillon de tique comprenant l'hémolymphe ou un tissu de tique préparé pour l'histologie ou un examen d'anatomie pathologique.