WO2016080633A1 - 위암 표적용 펩타이드 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

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peptide
gastric cancer
cancer
targeting
peptides
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최은경
정성윤
송시열
이경진
신설화
주은진
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울산대학교 산학협력단
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a stomach cancer target peptide and gastric cancer diagnostic composition and drug delivery according to the radiation irradiation using the same.
  • cancer The smallest unit of the human body, the cell, normally divides, grows and dies by intracellular control and maintains cell balance. If a cell is damaged for some reason, it is treated and recovered to act as a normal cell, but if it is not recovered, it dies on its own.
  • cancer is defined as a condition in which abnormal cells, which are not controlled for such proliferation and suppression, proliferate excessively, invade surrounding tissues and organs, and cause mass formation and destruction of normal tissues for various reasons. Cancer is the proliferation of non-suppressive cells, which destroys the structure and function of normal cells and organs, so the diagnosis and treatment are of great importance.
  • drug delivery systems or targeted therapies that selectively deliver drugs to cancer cells and tissues are techniques of great interest. Because using the same amount of anticancer drugs can increase the efficacy of the drug and at the same time significantly reduce side effects on normal tissues.
  • the virus when applied to gene therapy, the virus can be selectively delivered to cancer cells to increase treatment efficiency and reduce serious side effects. To this end, it has been mainly developed antigens specific to tumor cells and antibodies targeting them. However, in the case of antibodies, there are problems such as fear of immune response and low efficiency of penetration into tissues. Peptides, on the other hand, have a low molecular weight, which is less likely to cause an immune response and is easier to penetrate into tissues. Therefore, when the cancer target peptide is connected with an existing anticancer agent, it can be utilized as an intelligent drug delivery agent that selectively delivers drugs to tumors.
  • the present invention constructs a mouse model in which actual human cancer tissue is transplanted, and divides it into a group of irradiated population and a group not irradiated with the control group, and is specific to each population.
  • a mouse model in which actual human cancer tissue is transplanted, and divides it into a group of irradiated population and a group not irradiated with the control group, and is specific to each population.
  • the present invention provides a peptide for gastric cancer target consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6 and a polynucleotide encoding the same.
  • the present invention provides a peptide for gastric cancer targeting consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 specific to the gastric cancer tissues irradiated.
  • the present invention provides a drug delivery composition comprising the peptide for gastric cancer targeting.
  • the present invention relates to a stomach cancer target peptide and gastric cancer diagnostic composition and drug delivery according to the irradiation using the same, the treatment responsiveness due to the genetic differences of individual cancer patients with different treatment cases according to different treatment cases
  • functional peptides that can be targeted to implement customized diagnosis and treatment for each patient.
  • An animal model similar to a cancer microenvironment of an actual patient was constructed and divided into a group irradiated and a group unirradiated with its control group, and screened peptides specifically binding to each population to target each of the selected peptides. The efficiency was verified. Through this, it can be used to develop an image diagnosis technology for predicting the responsiveness of radiotherapy and to develop a customized target therapy accordingly.
  • A Gastric cancer tissue from BRC, B: Xenotransplantation into NOD / SCID mouse flank; C: B cancer tissue grows to 400-500 mm 3 , then cancer tissue 3x3 mm for passage Amputation, D: Mouse model in which anesthesia is injected into the nude mouse and one xenograft is transplanted to both subcutaneous subcutaneous tissues. E: A wide area where cancer tissue is formed when cancer tissue grows to a size of 150-200 mm 3 . The radiation dose of 10Gy was irradiated only on the leg part. The control group was not irradiated.
  • FIG. 2 is a biopanning scheme for identifying peptide sequences targeting in vivo patient gastric cancer tissues irradiated using the M13 phage display method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a result of comparing the phage concentration by extracting the phage after extraction of the heart, lung, liver, spleen, kidney, tumor during the five biopanning process.
  • FIG. 5 shows the results of confirming that the peptide phages connected to Cy5.5 fluorescence were respectively injected into the mouse model, and then specifically confirmed by imaging on the second day.
  • FIG. 6 shows the results of clarifying the fluorescence intensity of only cancer tissues and equally dividing the cancer tissues by extracting only cancer tissues and ending each day in vivo imaging.
  • Figure 7 is a plan for observing the change in target capacity of the peptide phage selected in the present invention, with or without irradiation.
  • Mouse model grown to 150-200 mm 3 after gastric cancer tissue transplantation 1)
  • Non-irradiated mouse model 2 10Gy irradiated mouse model, divided into two groups, 10Gy irradiated mice within 24 hours recovery time After having, the selected peptide phage sample was injected and confirmed in vivo imaging until the second day.
  • FIG. 10 is the result of connecting the peptide to the drug-encapsulated liposomes.
  • FIG. 10A Schematic diagram of connecting peptides to drug-encapsulated liposomes and chemical structural formulas expressing actual linking residues.
  • FIG. 10B Reduction test results for calculating how much -SH residues are in liposomes before peptide linkage and size distribution after peptide linkage. This is the result of checking stability through verification.
  • FIG. 13 shows the results of confirming the selection peptide targeting ability upon irradiation to another patient gastric cancer tissue transplant mouse according to Example 8.
  • the present invention provides a peptide for gastric cancer targeting consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence of this SEQ ID NO is listed in Table 1.
  • the peptide of the present invention is a low molecular peptide consisting of seven amino acids.
  • Small molecule peptides have the advantage of being small in size, stabilized in three dimensions, easily passing through mucous membranes, and recognizing molecular targets deep in tissues.
  • the small molecule peptide according to the present invention has the advantage of early diagnosis of cancer because stability can be secured through local injection and minimize the immune response.
  • the low molecular weight peptides according to the present invention are relatively simple in mass production and weak in toxicity.
  • the low molecular weight peptide according to the present invention has an advantage of having a higher binding strength to the target material than the antibody, and does not occur degeneration during thermal / chemical treatment.
  • the small size of the molecule can be used as a fusion protein by attaching to other proteins. Specifically, since it can be used by attaching to a polymer protein chain, it can be used as a diagnostic kit and drug delivery material.
  • Peptides of the present invention can be readily prepared by chemical synthesis known in the art (Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983). Representative methods include liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, F-MOC or T-BOC chemistry (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997 A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
  • the peptide of the present invention can be prepared by genetic engineering methods.
  • a DNA sequence encoding the peptide is constructed according to a conventional method.
  • DNA sequences can be constructed by PCR amplification using appropriate primers.
  • DNA sequences may be synthesized by standard methods known in the art, such as using automated DNA synthesizers (such as those sold by Biosearch or AppliedBiosystems).
  • the constructed DNA sequence is a vector comprising one or more expression control sequences (e.g., promoters, enhancers, etc.) that are operatively linked to this DNA sequence to regulate expression of the DNA sequence.
  • the host cell is transformed with the recombinant expression vector formed therefrom.
  • substantially pure peptide means that the peptide according to the invention is substantially free of any other protein derived from the host.
  • the present invention provides a peptide for gastric cancer targeting consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 specific to the gastric cancer tissues irradiated.
  • the peptide consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 of the present invention specifically binds to gastric cancer tissues, especially gastric cancer tissues irradiated.
  • target or “specific” means the ability to specifically bind to stomach cancer tissues, in particular radiation-treated stomach cancer tissues without binding to other normal tissues.
  • the gastric cancer specific peptide may specifically bind inside or outside gastric cancer tissue.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3.
  • polynucleotide is a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides present in single- or double-stranded form. It encompasses RNA genomic sequences, DNA (gDNA and cDNA) and RNA sequences transcribed therefrom and includes analogs of natural polynucleotides unless specifically stated otherwise.
  • the polynucleotide includes not only the nucleotide sequence encoding the gastric cancer target peptide, but also a sequence complementary to the sequence.
  • Such complementary sequences include sequences that are substantially complementary, as well as sequences that are substantially complementary.
  • the polynucleotide may also be modified. Such modifications include addition, deletion or non-conservative substitutions or conservative substitutions of nucleotides.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence is to be interpreted to also include a nucleotide sequence showing substantial identity to the nucleotide sequence. The substantial identity is at least 80% homology when the nucleotide sequence is aligned with any other sequence as closely as possible and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art. A sequence exhibiting at least 90% homology or at least 95% homology.
  • the present invention also provides a gastric cancer diagnostic composition
  • a gastric cancer diagnostic composition comprising a peptide for gastric cancer target consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 6.
  • the present invention also provides a radiation reactive gastric cancer diagnostic composition consisting of any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 comprising a gastric cancer targeting peptide specific to the radiation-treated gastric cancer tissue. .
  • diagnosis in the present invention is meant identifying the presence or characteristic of a pathological condition.
  • diagnosis is to identify the presence or characteristics of gastric cancer.
  • Diagnosis of gastric cancer using the peptide of the present invention can be diagnosed by reacting the peptide of the present invention with a tissue or cell obtained directly by blood, urine or biopsy to detect their binding.
  • the peptide of the present invention may be provided in a labeled state.
  • the detectable label may be provided in a link (eg, covalently bonded or crosslinked).
  • the detectable label may be a colorase (e.g. peroxidase, alkaline phosphatase), radioisotope (e.g. 124 I, 125 I, 111 In, 99 mTc, 32 P, 35 S), Chromophores, luminescent or fluorescent materials (e.g. FITC, RITC, rhodamine, cyanine, Texas red, fluorescein, phycoerythrin, And quantum dots.
  • the detectable label can be an antibody epitope, substrate, cofactor, inhibitor or affinity ligand. Such labeling may be carried out in the course of synthesizing the peptide of the present invention, or may be performed in addition to the peptide already synthesized.
  • fluorescent material is used as a detectable label
  • cancer can be diagnosed by fluorescence mediated tomography (FMT).
  • FMT fluorescence mediated tomography
  • the peptide of the present invention labeled with a fluorescent material can be circulated into the blood and fluorescence by the peptide can be observed by fluorescence tomography. If fluorescence is observed, it is diagnosed as cancer.
  • the present invention provides a drug delivery composition comprising the peptide for gastric cancer targeting.
  • Peptides according to the present invention can be used as an intelligent drug carrier for selectively delivering drugs to cancer tissue. If the peptide of the present invention is used in the treatment of cancer in connection with a conventionally known drug, since the drug is selectively delivered only to cancer tissue and cancer cells by the peptide of the present invention, the effect of the drug can be increased and at the same time, the drug affects the normal tissue. Side effects can be significantly reduced.
  • the drug is an anticancer agent, and any anticancer agent that may be linked to the peptide of the present invention may be used without limitation as long as it is used in the conventional treatment of cancer.
  • anticancer agent examples include cisplatin, 5-fluorouracil, adriamycin, methotrexate, vinblastine, busulfan, chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, nitrogen mustard, nitrosourea, taxol, paclitaxel, docetaxel, 6 Mercaptopurine, 6-thioguanine, bleomycin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitomycin-C, hydroxyurea and the like.
  • Linkage between the anticancer agent and the peptide of the present invention can be carried out through methods known in the art, such as covalent bonds, crosslinking and the like.
  • the peptide of the present invention may be chemically modified if necessary so long as its activity is not lost.
  • anesthesia was intraperitoneally injected into NOD / SCID mice, followed by anesthesia, cutting the cancer tissue to a size of 3x3 mm, and transplanting one tissue to each side of the mouse subcutaneously, 100 ⁇ l of 100 IU / ml penicillin, 100 ⁇ g / After treatment with ml streptomycin, 100 ⁇ g / ml gentamicin and 2.5 ⁇ g / ml amphotericin B antibiotic solution, suture and recover on a warm pad (approximately 2 hours). Thereafter, cancer tissue formation and growth is observed every week, and if the cancer tissue grows to a size of 400-500 mm 3 , the cancer tissue is separated and cut into 3 ⁇ 3 mm sizes for passage culture.
  • the library is a loop-type peptide library [library fused to M13 phage gp3 minor coat protein] -Ph.D TM phage display peptide library, which has about 2.7 billion diverse amino acid sequences through a random arrangement of 7 amino acids.
  • kit, New England Biolabs (NEB) was purchased and used.
  • M13 phage peptide library (a loop peptide consisting of 7 amino acids with approximately 2.7 billion different amino acid sequences) was passed through the tail vein of the mouse.
  • M13 phage peptide library was passed through the tail vein of the mouse.
  • Peptide expression phage that specifically binds was selected.
  • a screening plan in this regard is shown in FIG. 2.
  • Figure 2 is a plan of M13 phage screening for peptide screening targeting cancer tissue, (1) to build a mouse model with cancer tissue formed on the right hind limbs, (2) 7 amino acids on the surface of M13 phage After circulating the phage library in which the constructed loop peptide library was expressed and circulated through the tail vein, (3) it was washed under various conditions, and (4) the targeted phage was finally eluted to obtain phage.
  • the phage obtained as described above was infected with E. coli, amplified, injected again through the mouse tail vein, circulated, and then repeated at a higher intensity washing condition, thereby repeating the process of finding a phage having a more specific and stronger binding force. (This is called biopanning).
  • Peptide Sequence Irradiation group (10 Gy) P1 TVRTSAD (SEQ ID NO: 1) P2 RYVGTLF (SEQ ID NO: 2) P3 NRGDRIL (SEQ ID NO: 3) Unirradiated controls W1 NWGDRIL (SEQ ID NO: 4) W2 QRSLPSL (SEQ ID NO: 5) W3 DVWHSAY (SEQ ID NO: 6)
  • the phages in which each loop-type peptide was obtained were subjected to amplification, and then, in order to confirm specific binding and target efficiency of peptide phage through in vivo imaging, a fluorescent probe was first attached. Specifically, 1 ⁇ g / ⁇ l of N-hydroxysuccinimide esters of Cy5.5 (Amersham) was added to 10 11 plaque forming units (pfu) in 1 mL of bicarbonate buffer (pH 8.3) and maintained in a dark environment for 3 hours. Phage surface proteins and Cy5.5 fluorescent probes were linked at room temperature.
  • Phage expressing each looped peptide linked to the Cy5.5 fluorescent probe was obtained by precipitating 170 ⁇ l of 20% (w / v) PEG 8000 / 2.5 M NaCl solution. To determine the rate at which Cy5.5 fluorescent probes were connected to each of the resulting phage samples, measured by the IVIS Spectrum Imaging System (Xenogen), and using the instrument's software program to determine the ROI values, It was confirmed that the ratio of Cy5.5 connections between phage samples was constant. The results are shown in FIG.
  • Each prepared loop-expressing phage was injected into the irradiated reactive xenograft mouse model and the control group constructed in Example 1 through the tail vein, respectively, and immediately after the injection, the image was measured up to 2 days in vivo. In the circulating pathway of the peptide and in other organs and tissues, the image was gradually removed and only targeted to cancer tissue was confirmed, thereby demonstrating complete targeting to gastric cancer tissue in vivo. 5 shows that the peptide sequence identified through the biopanning process in Example 2 exhibits excellent targeting ability in imaging results in vivo .
  • Example 4> selectively combined during irradiation Peptide To identify sequences in vivo Imaging
  • the target efficiency according to the irradiation was confirmed to prove that the sequence is a sequence reacting according to the cancer microenvironment upon irradiation.
  • the difference in irradiation was intended to determine whether the peptide was targeted according to the difference in the cancer microenvironment.
  • tumor-forming mice were transplanted by transplanting patient gastric cancer tissues, and only a part of them was irradiated to establish a control group and an experimental group.
  • Peptide expression phage selected in the same manner as in Example 3 was amplified and fluorescent labeling, and the same sample was injected into the irradiated mouse and its control mice to confirm the image on the last 2 days.
  • FIG. 7 shows that there is a difference in targeting efficiency when targeting in a mouse model irradiated with radiation, compared with targeting in a control mouse model, and the image measurement result of the embodiment is shown in FIG. 7.
  • the target efficiency was lowered in the mouse gastric tissue transplant mouse model used as a control, it was confirmed that the specific binding in the mouse model irradiated with the same patient gastric cancer tissue transplanted mouse.
  • each population was injected through the tail vein, and after 24 hours, cancer tissue was extracted and paraffin blocks and sections were prepared. Specifically, (1) the extracted cancer tissues were immersed in paraformaldehyde solution to fix the tissues at room temperature for 24 hours, then dehydrated and infiltrated with paraffin to form a paraffin block of cancer tissues, followed by 3 ⁇ m thickness using a microtome. Sectional sections were prepared by sectioning slides. In order to perform full-scale immunohistostaining, (2) deparaffinization was performed on the slice slide, and (3) the structure of various proteins immobilized in the tissue slice was restored so that the antibody-binding site could be restored normally. Unmasking process was performed.
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine, concentration 50 mM
  • DPPG-Na dipalmitoylphosphatidylglycerol, concentration 50 mM
  • lipids constituting liposomes DPPE-PDP (N- [3- (2Pyridinyldithio) -1-oxopropyl] -L- ⁇ -dipalmitoylphosphatidylcholine , 50mM)
  • cholesterol concentration 200mM
  • cholesterol-PEG concentration 200mM
  • DPPG-Na did not melt at room temperature, so it was completely dissolved at 55 ° C. for at least 30 minutes.
  • Each of the five dissolved lipids were mixed in a round bottom flask with DPPC: DPPE-PDP: DPPG-Na: Cholesterol-PEG: Cholesterol at a molar concentration of 15: 15: 30: 4: 36 and at 55 ° C.
  • HEPES (10 nM, pH4) buffer was added to prepare liposomes, the flask was rotated in a thermostat (55 ° C), dissolved for 1 hour, and shaken vigorously with a vortex to completely dissolve.
  • the 200 nm and 100 nm filters were extruded twice or several times.
  • the liposome was dissolved in PBS (pH 7.0) using a Sephadex column.
  • the inside of the liposome completed up to this process was pH 4.0, and the outside was pH 7.0.
  • After dissolving in the buffer mix the liposomes with the buffer substitution and the doxorubicin drug dissolved in the pH 7.0 buffer in a round flask and insert the dissolved drug in pH 7.0 into the liposome at pH 4.0.
  • the drug delivery system was optimized by measuring the size and stability of the final drug-encapsulated liposomes using the DLS method. As described above, the drug delivery process and the optimization process and the results are shown in FIG. 9.
  • Example 5 a peptide having a 'TVRTSAD' sequence was synthesized and subjected to a linking process with a liposome encapsulated with the drug in Example 6.
  • Cy7 fluorescent probe is connected to the C-terminus of the 'TVRTSAD' peptide, and the N-terminus was prepared by synthesizing a peptide which has not undergone any process in order to connect to liposomes.
  • the N-terminal residue of the prepared peptide was processed to be connected to a disulfide bond when the liposome was linked with a thiol group (-SH).
  • a liposome reduction experiment was conducted to identify the number of thiol groups in liposomes and to link them with peptides according to their ratios.
  • In vivo imaging was performed to determine whether the drug transporter linked to the drug-encapsulated liposome with the 'TVRTSAD' sequence processed in Example 6 actually works in vivo .
  • the injection-reactive xenograft mouse model and the control group constructed in Example 1 were injected through the tail vein, respectively, and immediately after the injection, the image was measured until the last 2 days, thereby circulating the pathways of peptides and other organs in vivo. And the image was gradually removed from the tissue and confirmed only target the cancer tissue, thereby demonstrating the complete target to the gastric cancer tissue in vivo.
  • In vivo imaging results performed according to the above embodiment are shown in FIG. 11.
  • in vivo tumor growth delay was performed for validation as a target drug carrier as well as in vivo imaging.
  • a new concept anticancer agent capable of diagnosis and treatment at the same time by verifying that the material made by linking the peptide with the drug-encapsulated liposome can be applied to in vivo imaging and in vivo tumor growth delay.
  • the results demonstrate the potential for development.
  • the discovery peptide selectively binds when irradiated in other patient gastric cancer tissues having the same characteristics as the same gastric cancer in addition to the gastric cancer case.
  • a mouse model was constructed by securing gastric cancer tissues extracted from other patients. Specifically, two kinds of gastric cancer tissues of other patients were obtained in addition to the patient gastric cancer tissues used in the above example, and it was confirmed that all the gastric cancer tissues used were carcinomas having the characteristics of adenocarcinoma. As in Example 1, a mouse model was constructed for each of the gastric cancer tissues, and some of them were irradiated to establish a control group and an experimental group.
  • Target efficiency according to the irradiation was verified.
  • Selection peptide expression phage amplification and fluorescence labeling was carried out in the same manner as in Example 3, and the final sample was injected into irradiated experimental mice and control mice, respectively, to confirm imaging on the last 2 days.
  • peptide phage was selectively accumulated only in tumors of the experimental group mice irradiated with radiation as in the other cases of gastric cancer tissues of the other patients, and the image measurement results of the example are shown in FIG. 13. .
  • FIG. 13 it was confirmed that the peptide expression phage does not target cancer tissue when not irradiated with radiation, but selectively targets cancer tissue when irradiated with radiation.
  • the peptide sequence selected in this technique was clearly verified as a peptide sequence that selectively targets gastric cancer tissues upon irradiation, and also the radiation activity of gastric cancer tissues of other patients was not investigated. Only if the peptide sequence exhibits a target ability selectively, it proved that the scope of application in clinical applications is not limited.

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Abstract

본 발명은 위암 표적용 펩타이드 및 이를 이용한 방사선 조사 여부에 따른 위암 진단용 조성물 및 약물전달 용도에 관한 것으로서, 암 발병환자 개개인의 유전적 차이로 인해 치료 반응성이 달라 환자별 치료사례가 달라짐에 따라 치료 시 문제점을 염두에 두고, 환자 개인별 맞춤형 진단 및 치료를 구현하고자 이를 표적할 수 있는 기능성 펩타이드를 발굴하였다. 실제 환자의 암 미세환경과 유사한 동물모델을 구축하여 방사선 조사한 개체군과 그의 대조군으로 방사선을 조사하지 않은 개체군으로 구분하고, 각 개체군에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하여 선별된 펩타이드에 대해 각각의 표적효율을 검증하였다. 이를 통해 최종적으로 방사선 치료 반응성을 예측하기 위한 영상진단 기술 개발 및 그에 따른 맞춤형 표적 치료제 개발에 활용될 수 있다.

Description

위암 표적용 펩타이드 및 이의 의학적 용도
본 발명은 위암 표적용 펩타이드 및 이를 이용한 방사선 조사 여부에 따른 위암 진단용 조성물 및 약물전달 용도에 관한 것이다.
인간의 몸을 구성하고 있는 가장 작은 단위인 세포는 정상적일 때 세포 내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하면서 세포 수 균형을 유지한다. 어떤 원인으로 세포가 손상을 받는 경우, 치료를 받아 회복하여 정상적인 세포로 역할을 하게 되지만, 회복이 안 된 경우는 스스로 죽게 된다. 그러나 여러 가지 이유로 인해 이러한 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 과다하게 증식할 뿐만 아니라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 형성 및 정상 조직의 파괴를 초래하는 상태를 암(cancer)이라 정의한다. 암은 이렇듯 억제가 안 되는 세포의 증식으로, 정상적인 세포와 장기의 구조와 기능을 파괴하기에 그 진단과 치료의 중요성은 매우 크다.
한편, 암 발병환자 개개인의 유전적 차이로 인해 치료 반응성이 달라 환자별 치료 사례가 달라짐에 따라 치료 시 문제점이 있다. 이에 암 환자의 효과적인 치료를 위해 방사선 반응성에 따라 달라지는 암 미세환경 및 그에 따른 바이오마커를 표적할 수 있는 기능성 표적 치료제 개발이 요구되고 있으며, 이를 통하여 환자 개인별 맞춤형 진단 및 치료를 구현할 수 있다.
또한, 약물을 암 세포 및 조직에 선택적으로 전달하는 약물전달체계 또는 표적 치료는 많은 관심을 받아온 기술이다. 왜냐하면 동일 양의 항암제를 사용하더라도 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 있기 때문이다. 또한 유전자 치료에 적용할 경우 바이러스를 암 세포에 선택적으로 전달시킴으로써 치료 효율을 올리고 심각한 부작용을 줄일 수 있다. 이를 위해 지금까지는 주로 종양세포에 특이한 항원 및 이를 표적하는 항체를 개발하여 왔다. 그러나 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제가 존재한다. 반면 펩타이드의 경우는 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내 침투가 용이한 것이 장점이다. 따라서, 암 표적 펩타이드를 기존의 항암제와 연결하게 되면 종양에 선택적으로 약물을 전달하는 지능형 약물전달체로 활용될 수 있다.
본 발명은 기존의 배양 세포 수준에서 연구되었던 스크리닝 방법과 달리 실제 사람 암 조직을 이식한 마우스 모델을 구축하여, 방사선 조사한 개체군과 그의 대조군으로 방사선을 조사하지 않은 개체군으로 구분하고, 각 개체군에 특이적으로 결합하는 펩타이드 스크리닝 방법을 통해, 신규한 위암 표적용 펩타이드 및 이의 의학적 용도를 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 위암 표적용 펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지며, 방사선이 조사된 위암 조직에 특이적인 위암 표적용 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 위암 진단용 조성물 및 방사선 반응성 위암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 위암 표적용 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 위암 표적용 펩타이드 및 이를 이용한 방사선 조사 여부에 따른 위암 진단용 조성물 및 약물전달 용도에 관한 것으로서, 암 발병환자 개개인의 유전적 차이로 인해 치료 반응성이 달라 환자별 치료사례가 달라짐에 따라 치료 시 문제점을 염두에 두고, 환자 개인별 맞춤형 진단 및 치료를 구현하고자 이를 표적할 수 있는 기능성 펩타이드를 발굴하였다. 실제 환자의 암 미세환경과 유사한 동물모델을 구축하여 방사선 조사한 개체군과 그의 대조군으로 방사선을 조사하지 않은 개체군으로 구분하고, 각 개체군에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하여 선별된 펩타이드에 대해 각각의 표적효율을 검증하였다. 이를 통해 최종적으로 방사선 치료 반응성을 예측하기 위한 영상진단 기술 개발 및 그에 따른 맞춤형 표적 치료제 개발에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 마우스에 실제 환자 위암조직을 이식 후, 방사선을 조사한 동물모델 구축 방법 및 확인 결과를 나타낸다. A: BRC에서 분양 받은 환자 위암조직, B: NOD/SCID 마우스 옆구리에 이종이소 이식, C: B에서 암조직이 400-500 mm3의 크기로 자라면 계대 배양을 위해 암조직을 3x3 mm 크기로 절단함, D:누드마우스에 마취제를 복강주사하고, 양쪽 넙적다리 피하에 조직 1개 이종이소 이식한 마우스 모델, E: 암조직이 150-200 mm3의 크기로 자라면 암조직을 형성한 넓적다리 부분에만 10Gy의 방사선량을 조사하였다. 대조군은 방사선 조사하지 않았다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 M13 파아지 디스플레이 방법을 이용하여 방사선 조사한 생체 내 환자 위암 조직을 타겟팅 하는 펩타이드 서열을 동정하기 위한 바이오패닝 계획도이다.
도 3은 5회의 바이오패닝 과정을 거치면서 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 종양을 적출 후 파아지를 용출하여 파아지 농도를 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 발굴된 펩타이드 발현 파아지를 증폭 후 동일 농도의 파아지를 계산하여 Cy5.5 형광 프로브를 연결하고, ROI 값을 측정함으로써 Cy5.5 형광 프로브와 파아지 간의 연결비율을 계산한 결과이다.
도 5는 Cy5.5 형광이 연결된 펩타이드 파아지를 각각 마우스 모델에 주사한 후 2일째 영상으로 확인하여 생체 내 위암조직에 특이적으로 결합함을 확인한 결과이다.
도 6은 in vivo 영상 확인 2일차에 종료하여, 암 조직만을 적출하여 암조직만의 형광세기 확인 및 각각 균등 분할하여 암조직의 어느 부위에 형광이 위치해 있는지 확인한 결과이다.
도 7은 방사선 조사 유무에 따라, 본 발명에서 선별된 펩타이드 파아지의 표적능력 변화에 대해 관찰하기 위한 계획도이다. 환자 위암조직 이식 후 150-200 mm3의 크기로 성장한 마우스 모델을 1) 방사선 조사하지 않은 마우스 모델 2) 10Gy 방사선 조사한 마우스 모델, 두 개 그룹으로 나누고, 10Gy 방사선 조사한 마우스가 24시간 이내의 회복시간을 가진 후, 선별된 펩타이드 파아지 샘플을 주사하고 2일 째까지 in vivo 이미징을 확인한 결과이다.
도 8은 각 개체군에서 발굴한 펩타이드 서열의 특이적 결합 능력을 조직면역염색을 통해 검증한 결과이다.
도 9는 리포좀의 제작, 약물 봉입과정 및 최적화를 나타내었다. 리포좀 제작 공정 과정 및 약물봉입 과정과 size distribution 결과 검증한 결과, 약물 봉입 전과 후의 size 차이가 없고 분산도가 고루 분포되어 있는 결과를 확인하였다.
도 10은 약물이 봉입된 리포좀에 펩타이드를 연결한 결과이다. 도 10a: 약물봉입된 리포좀에 펩타이드를 연결하는 모식도 및 실제 연결되는 잔기를 표현한 화학 구조식, 도 10b: 펩타이드 연결 전, 리포좀에 -SH 잔기가 얼마나 있는지 계산하기 위한 환원 테스트 결과 및 펩타이드 연결 후의 size distribution 검증을 통한 안정도 확인 결과이다.
도 11은 펩타이드와 약물봉입 리포좀을 연결한 물질의 표적능력 검증을 위한 in vivo imaging 결과 이다. 오직 방사선이 조사된 마우스에서 펩타이드가 연결된 리포좀만이 표적함을 확인하였다.
도 12는 펩타이드와 약물봉입 리포좀을 연결한 물질의 항암제로써의 가능성 검증을 위한 in vivo tumor growth delay 결과이다. 오직 펩타이드가 연결된 약물봉입 리포좀만이 방사선을 조사한 그룹에서 tumor 치료 효과를 보임을 증명하였다.
도 13은 본 발명의 실시예 8에 따른 다른 환자 위암 조직 이식 마우스에 방사선 조사 시 선별 펩타이드 표적능을 확인한 결과이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 위암 표적용 펩타이드를 제공한다. 상기 서열번호의 아미노산 서열은 표 1에 기재되어 있다.
본 발명의 펩타이드는 아미노산 7개로 이루어진 저분자 펩타이드이다. 저분자 펩타이드는 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 국소 주사를 통해 안정성이 확보되고 면역 반응성을 최소화 할 수 있기 때문에, 암을 조기 진단할 수 있는 장점이 있다. 그리고 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 약하다.
또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 항체보다 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되지만(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989), 이들로 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 AppliedBiosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지며, 방사선이 조사된 위암 조직에 특이적인 위암 표적용 펩타이드를 제공한다.
상세하게는, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 위암 조직, 특히 방사선이 조사된 위암 조직에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 “표적” 또는 “특이적”이란 다른 정상 조직에 결합하지 않고 위암 조직, 특히 방사선이 조사된 위암 조직에 한하여 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. 상기 위암 특이적 펩타이드는 위암 조직 내부 또는 외부에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 위암 표적 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 위암 표적용 펩타이드를 포함하는 위암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지며, 방사선이 조사된 위암 조직에 특이적인 위암 표적용 펩타이드를 포함하는 방사선 반응성 위암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 위암의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다.
본 발명의 펩타이드를 이용한 위암의 진단은 혈액, 소변이나 바이옵시(biopsy)에 의해 직접 얻은 해당 조직 또는 세포에 본 발명의 펩타이드를 반응시켜 이들의 결합을 검출함으로써 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드가 위암 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예: 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 시아닌(cyanine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots))등 일 수 있다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 암을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 암으로 진단된다.
또한, 본 발명은 상기 위암 표적용 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 약물을 암조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 공지의 약물과 연결하여 암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 약물이 암 조직 및 암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약물의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
상기 약물은 항암제로서, 본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 항암제로는 종래 암의 치료에 사용되는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다. 예컨대, 시스플라틴, 5-플로오우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 부설판, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜팔란, 니트로겐 무스타드, 니트로소우레아, 탁솔, 파클리탁셀, 도세탁셀, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 하이드록시우레아 등이 있다. 항암제와 본 발명의 펩타이드 간의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 환자 위암 조직 이식 마우스 모델 구축
기존의 암세포 이식 동물모델의 한계를 극복하고자 실제 환자의 암 미세환경과 유사한 이상적인 암 질환 동물 모델을 확보하고, 방사선 조사에 따른 암조직의 영향을 확인할 수 있는 모델을 구축하기 위해, 먼저 실제 위암 환자로부터 적출된 암 조직을 이식한 마우스 모델을 확립하였다. 상기 동물 모델 구축을 위해 적출한 환자 암 조직을 NOD/SCID 마우스에서 배양하여 암조직이 확보되면, 다음 계대배양에서부터는 Balb/c 누드마우스를 사용하여 계대배양 하였다. 구체적으로, NOD/SCID 마우스에 마취제를 복강 주사하여 마취한 후, 3x3 mm 크기로 암조직을 절단하여 마우스 양쪽 옆구리 피하에 각각 조직 1개씩 이식하고, 100 μl의 100 IU/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 100 μg/ml gentamicin, 2.5 μg/ml amphotericin B 항생제 혼합액 처리 후 봉합한 뒤, 보온패드에서 회복한다(약 2 시간 소요). 이 후 매 주마다 암 조직 형성 및 성장을 관찰하고, 암 조직이 400-500 mm3의 크기로 자라면 분리하여 계대 배양을 위해 암조직을 3x3 mm 크기로 절단한다. 이후 다음 계대배양을 위해 누드마우스에 마취제를 복강주사하고, 양쪽 넙적다리 피하에 조직 1개씩 이식하였다. 이식 부위를 양쪽 넓적다리 피하로 변경함은 차후 다른 부위에 영향을 주지 않고 방사선을 부분적으로 조사하기 위함이며 상기와 같은 방법을 통해 계대배양을 진행, 4번째까지 재이식하여 암조직을 형성한 마우스 모델을 구축하였으며, 약 1개월 (4주) 까지 암 조직의 성장을 관찰하여 암 조직의 크기가 200 mm3 정도 성장하였을 때, 암 조직에만 국소적으로 10 Gy의 방사선을 조사하고, 24 시간 회복시간을 가진 후에 in vivo 펩타이드 스크리닝에 이용하였다. 방사선 조사군의 대조군으로 동일 마우스 모델에서 방사선 조사만 하지 않은 마우스 모델을 펩타이드 스크리닝에 이용하였다. 상기 마우스 모델 구축 결과를 도 1에 나타내었다.
< 실시예 2> M13 파아지 펩타이드 라이브러리 in vivo 스크리닝 - in vivo 파아지 디스플레이
상기 실시예 1에서 구축된 마우스 모델인 방사선 반응성 환자 위암 이식 xenograft 모델에 랜덤 루프형 펩타이드 라이브러리를 이용한 in vivo 상에서의 스크리닝 과정에서 높은 특이성을 가지는 펩타이드를 동정할 수 있도록 디자인하였다. 상기 라이브러리는 7개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 약 27억 개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 루프형태의 펩타이드 라이브러리[M13 파아지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 라이브러리]-Ph.DTM phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)를 구입하여 사용하였다. 구축한 마우스 모델에서 방사선 조사한 위암 조직에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝 하기 위하여, 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 M13 파아지 펩타이드 라이브러리(약 27억 개의 서로 다른 아미노산 서열을 지닌 7개 아미노산으로 구성된 루프형 펩타이드가 M13 파아지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 라이브러리)를 주사하여 생체 내에서 15분 간 순환시킨 후(생체 암조직과 M13 파아지 펩타이드 라이브러리의 결합 방법), 과정이 진행될 때 세척조건을 달리하여 암 조직에 특이적으로 결합하는 펩타이드 발현 파아지를 선별하였다. 이와 관련한 스크리닝 계획을 도 2 에 나타내었다. 구체적으로, 도 2는 암 조직에 타겟팅하는 펩타이드 스크리닝을 위한 M13 파아지 스크리닝의 계획도로서, (1) 오른쪽 뒷다리에 암 조직이 형성된 마우스 모델을 구축하고, (2) M13 파아지 표면에 7개 아미노산으로 구성된 루프형 펩타이드 라이브러리가 발현된 파아지 라이브러리를 꼬리정맥을 통해 주사하여 순환시킨 뒤에, (3) 이를 다양한 조건으로 세척한 후, (4) 최종적으로 타겟팅 된 파아지를 용출하여 파아지를 얻었다. 상기와 같이 얻은 파아지를 대장균에 감염시켜 증폭시키고, 이를 다시 마우스 꼬리정맥을 통해 주사하여 순환시킨 후, 보다 높은 강도의 세척 조건으로 반복시킴으로써, 보다 특이적이고 강한 결합력을 갖는 파아지를 찾는 과정을 반복하였다(이를 바이오 패닝(biopanning)이라 함). 이에 따라 각 5회의 바이오 패닝을 실시하여 생체 내에서 형성된 환자 위암 조직에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열이 발현된 파아지를 확보하였다. 실제 파아지가 생체 내의 다른 장기와 비교하였을 때 암조직만을 표적하는지를 확인하기 위해 바이오패닝 매 회 마다 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 그리고 암조직을 각각 적출하여 파아지를 용출하였고 파아지 농도를 측정하여 비교한 결과를 도 3에 나타내었다. 최종적으로 상기에 의하여 얻어진 파아지를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시켜 LB 배지 상에서 증폭시킨 후, 방사선 조사군(실험군)과 방사선을 조사하지 않은 개체군(대조군) 각각에서 100 여개의 파아지 플라그를 무작위로 선택하여 M13 파아지 게놈성 DNA(단일 스트랜드화 원형 DNA)를 분리 정제하고 유전자 염기서열을 확인하여, 파아지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에 발현되어 암 조직에 타겟팅하는 펩타이드 부분의 아미노산 염기서열을 규명하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1은 Clustal X 서열 분석 프로그램을 통하여 방사선 조사군(실험군)과 방사선을 조사하지 않은 개체군(대조군) 각각에서 발굴된 서열을 정리하였다.
그룹 번호 펩타이드서열
방사선 조사군(10 Gy) P1 TVRTSAD (서열번호 1)
P2 RYVGTLF (서열번호 2)
P3 NRGDRIL (서열번호 3)
방사선 조사하지 않은 대조군 W1 NWGDRIL (서열번호 4)
W2 QRSLPSL (서열번호 5)
W3 DVWHSAY (서열번호 6)
< 실시예 3> 루프형 펩타이드가 발현된 파아지의 환자 위암조직 표적능력 확인을 위한 in vivo 이미징
상기에서 얻은 각각의 루프형 펩타이드가 발현된 파아지는 증폭과정을 거친 후, in vivo 영상(imaging)을 통해 펩타이드 파아지의 특이적인 결합과 표적효율을 확인하고자, 우선 형광 프로브를 붙이는 공정을 실시하였다. 구체적으로, 1 mL의 bicarbonate 버퍼 (pH 8.3)에서 파아지 농도 1011 plaque forming units (pfu) 에 N-hydroxysuccinimide esters of Cy5.5 (Amersham) 1 μg/μl를 첨가하고, 어두운 환경을 유지하며 3 시간동안 상온에서 파아지 표면 단백질과 Cy5.5 형광 프로브를 연결하였다. 상기에서 Cy5.5 형광 프로브와 연결된 각각의 루프형 펩타이드가 발현된 파아지를 170μl의 20%(w/v) PEG 8000/ 2.5 M NaCl 용액으로 침전하는 방법으로 얻었다. 최종으로 얻은 각각의 파아지 샘플에 Cy5.5 형광 프로브가 연결된 비율을 확인하고자, IVIS 스펙트럼 이미징 시스템 (Xenogen)을 통해 측정하고 해당 기기의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 ROI 값을 결정하여 연결 비율을 비교하여 각 파아지 샘플 간 Cy5.5 연결 비율이 일정함을 확인하였다. 해당 결과는 도 4에서 나타내었다.
준비된 각각의 루프형 펩타이드가 발현된 파아지를 실시예 1에서 구축한 방사선 조사 반응성 xenograft 마우스 모델 및 대조군에 각각 꼬리정맥을 통해 주사한 후, 주사 직후를 시작으로 최종 2일까지 영상을 측정하여 생체 내에서 펩타이드의 순환 경로 및 다른 장기 및 조직에서는 점차 제거되고 암조직에서만 표적하는 영상을 확인하였으며, 이에 따라 생체 내 위암 조직에 완전하게 표적함을 증명하였다. 상기 실시예 2에서 바이오패닝 과정을 통해 동정된 펩타이드 서열이 in vivo 상의 이미징 결과에서 우수한 타겟팅 능력을 나타냄을 도 5에 나타내었다. 또한 각각의 루프형 펩타이드가 발현된 파아지가 암 조직의 어느 부위를 표적하는지를 ex vivo 상에서 확인하고자, 암 조직만을 분리 적출하여 온전한 암 조직 자체와 해당 암 조직을 여러 조각으로 단면화하여 영상을 측정한 결과를 도 6에 나타내었다.
또한 도 5 및 도 6의 결과를 토대로 보다 정확하게 표적 효율을 비교하기 위하여 적출한 암 조직들을 각각 모으고 특이적으로 암조직에 결합한 파아지만을 용출하고 타이터링을 통해 각각의 파아지 농도를 측정하였으며, 각각의 적출한 암 조직의 크기 및 무게가 다르므로 표준화를 위해 각 암 조직의 무게를 측정하여, 암 조직 무게 대비 확인된 파아지 양을 계산하였다. 또한 각각의 이미징 결과를 보다 정확하게 수치화하기 위하여, in vivo 및 ex vivo 이미징을 IVIS 스펙트럼(Xenogen)의 프로그램인 ROI (Region Of Interest)를 측정하여 확인한 결과를 표 2에 나타내었다.
그룹 Sample Sequence pfu/mg in vivo ROI ex vivo ROI
방사선 조사군 (10 Gy) Cy5.5 - - 1.00 1.00
Empty - - 7.37 24.58
P1 T V R T S A D 25.3 16.44 70.66
P2 R Y V G T L F 6.3 9.05 38.83
P3 N R G D R I L 18.6 19.83 77.85
방사선 조사하지 않은 대조군 Cy5.5 - - 1.00 1.00
Empty - - 0.95 0.54
W1 N W G D R I L 11.8 1.86 2.08
W2 Q R S L P S L 18.2 2.19 2.68
W3 D V W H S A Y 8.1 1.90 3.54
< 실시예 4> 방사선 조사 시 선택적으로 결합하는 펩타이드 서열을 확인하기 위한 in vivo 이미징
상기 실시예 3에서 확인한 3개의 펩타이드 서열에 대해 해당 서열이 방사선 조사 시 암 미세 환경에 따라 반응하는 서열인지 증명하고자 방사선 조사 여부에 따른 표적효율을 확인하였다. 구체적으로 동일한 환자 위암을 이식한 마우스 모델에서 오직 방사선 조사의 차이만 두었을 때, 암 미세환경의 차이에 따라 펩타이드의 표적 여부를 확인하고자 하였다. 실시예 1에서 구축한 마우스 모델과 같이 환자 위암 조직을 이식하여 종양이 형성된 마우스를 선별하고, 그 중 일부만 방사선 조사를 시행하여 대조군과 실험군을 확립하였다. 실시예 3에서와 같은 방법으로 선별된 펩타이드 발현 파아지를 증폭 및 형광 라벨링을 진행하였고, 동일 샘플을 방사선 조사 한 마우스와 그의 대조군 마우스에 주사하여 최종 2일 째 영상을 확인하였다. 그 결과 방사선을 조사한 마우스 모델에서의 타겟팅이 대조군 마우스 모델에서의 타겟팅 여부와 비교하였을 때 확실히 표적효율의 차이가 있음을 확인하였고, 해당 실시 예의 영상 측정 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이 대조군으로 이용한 환자 위암조직 이식 마우스 모델에서는 표적효율이 떨어지는 반면, 동일 환자 위암조직 이식 마우스에 방사선을 조사한 마우스 모델에서 특이적으로 결합함을 영상으로 확인할 수 있었다.
<실시예 5> 발굴 펩타이드의 선택적 결합능력에 대한 조직학적 검증
상기에서 선택한 펩타이드 (각 개체군 당 3 개씩 서열)에 대한 조직학적 표적능력 검증을 위해 각 개체군에 각각 꼬리정맥을 통해 주입하고 24시간 후 암조직을 적출하여 각각 파라핀 블록 및 절편 제작을 실시하였다. 구체적으로, (1) 적출한 암조직을 파라 포름알데하이드 용액에 담궈 24시간 동안 상온에서 조직을 고정시킨 후 탈수화 과정을 거친 다음 파라핀을 침투시켜 암조직 파라핀 블록 형성 후, 마이크로톰을 이용해 3 μm 두께로 절편하여 절편 슬라이드를 제작하였다. 본격적인 면역조직염색을 실시하기 위해, (2) 절편 슬라이드 상에서 탈파라핀 과정을 수행한 다음, (3)조직 절편 내 고정되어 있던 다양한 단백질들의 구조를 회복하여 정상적으로 항체가 결합하는 부위를 복원할 수 있도록 Unmasking 과정을 실시하였다. 순차적으로, (4) 5 % BSA 용액으로 blocking, (5) 1차 항체를 결합하고 (사용한 항체는 M13 파아지 캡시드 단백질을 인식하는 anti-mouse M13 IgG), (6) 2차 항체 결합 및 HRP 결합 완료 후, (7) DAB 발색을 통해 파아지가 존재하는 부분을 염색한 다음, (7) Hematoxylin으로 핵을 염색하고 (8) 탈수화 과정 완료 후 마지막으로 mounting 하여 면역조직염색 완료된 조직 슬라이드를 영구 보존시킨다. 상기 내용대로 실시한 면역조직염색 결과를 도 8에 나타내었다.
<실시예 6> 리포좀 제작, 약물 봉입 공정 및 펩타이드와 리포좀 연결 공정
구체적으로, 리포좀을 구성하는 지질인 DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine, 농도 50mM), DPPG-Na(dipalmitoylphosphatidylglycerol, 농도 50mM), DPPE-PDP(N-[3-(2Pyridinyldithio)-1-oxopropyl]-L-α-dipalmitoylphosphatidylcholine, 농도 50mM), 콜레스테롤(농도 200mM), 콜레스테롤-PEG(농도 200mM) 총 5가지를 메탄올과 클로로포름 (1:1 비율로 제조)을 섞은 유기용매에 각각 녹이는 과정을 실시하였다. DPPG-Na는 상온에서 녹지 않기 때문에 55 ℃에서 30분 이상 완전히 녹였다. 각각 녹인 5 종의 지질을 바닥이 둥근 플라스크에 DPPC : DPPE-PDP : DPPG-Na : 콜레스테롤-PEG : 콜레스레롤이 몰농도 비율로 15 : 15 : 30 : 4 : 36이 되게 섞어주고 55 ℃에서 둥근 플라스크를 회전시키며 플라스크 내에 약 2 ~ 3시간 동안 압력을 주어 유기 용매를 휘발시키면서 둥근 플라스크 내에 얇을 지질 막을 형성되도록 하고, 희고 얇은 막이 플라스크 내에 형성이 되면 상온에서 남아있는 유기용매를 모두 휘발시켜 순수한 지질 막만 남도록 공정하였다. 이 후, 리포좀으로 제작하기 위해 HEPES (10nM, pH4) 버퍼를 3 ml 넣어주고 항온조(55℃)에서 플라스크를 회전시키며 1시간 동안 녹이고 충분히 녹이기 위해 vortex를 이용해 강하게 흔들어 주어 뭉쳐진 부분 없이 완전히 녹여주었다. 제작한 리포좀의 크기를 균일하게 만들기 위해 질소가스 압출기와 폴리-카보네이트 필터를 이용해 필터 내의 미세한 구멍의 크기가 800 nm, 400 nm, 200 nm 그리고 100 nm인 순서로 여과시키고, 리포좀의 정확한 크기와 균일성을 위해 200 nm와 100 nm 필터는 2 회 혹은 여러 번에 걸쳐 압출을 실시하였다. 압출이 완료된 리포좀에 약물을 로딩하기 위해 리포좀이 녹아있는 버퍼를 세파덱스컬럼을 이용해 PBS (pH 7.0)로 치환 시켜주어, 이 공정까지 완료된 리포좀의 내부는 pH 4.0 로 되어있고, 외부는 pH 7.0인 버퍼에 녹아있는 상태로 만들어준 다음, 버퍼 치환이 완료된 리포좀과 pH 7.0 버퍼에 녹인 독소루비신 약물을 둥근 플라스크에 섞어 주고 pH 4.0 인 리포좀 안으로 pH 7.0에 녹아있는 약물이 농도구배에 의해 봉입될 수 있게 60 ℃에서 20분 동안 중탕 회전을 실시하였다. 봉입되지 못하고 남아있는 약물을 분리하고자 세파덱스컬럼을 이용하여 순수한 약물봉입 리포좀만을 정제하였다. Dinamic light scattering; DLS method을 이용해 최종적으로 만들어진 약물 봉입 리포좀의 크기 및 안정도를 측정함으로써 약물전달체 시스템을 최적화하였다. 상기 내용과 같이 약물전달체 공정 및 최적화 과정과 결과를 도 9에 나타내었다.
상기 실시예 5에서 검증한 펩타이드 중 ‘TVRTSAD’ 서열을 갖는 펩타이드를 합성 의뢰하여 실시예 6에서 공정한 약물이 봉입된 리포좀과 연결 공정을 실시하였다. ‘TVRTSAD’ 펩타이드 C-말단에 Cy7 형광 프로브가 연결되어 있고, N-말단은 리포좀과 연결하기 위해 아무런 공정을 거치지 않은 펩타이드를 (주)애니젠(대한민국) 에 합성 의뢰하여 제작하였다. 제작된 펩타이드의 N-말단의 잔기는 thiol기(-SH)로 리포좀과 연결 시, disulfide bond로 연결되도록 공정되었다. 리포좀과 연결하기 전, 리포좀의 Thiol 기의 개수를 확인하여 비율에 따라 펩타이드와 연결해주기 위해 리포좀 환원 실험을 실시하였다. DTT 1 mM을 첨가하여 OD343 nm에서 Pyridine 2-thione을 측정함으로써 리포좀의 Thiol기 개수를 확인하였다. 이후 리포좀과 펩타이드의 연결공정을 위해 리포좀 : 펩타이드 = 1 :1.5 (molar ratio)로 섞어주고 상온에서 2시간 반응시킨 다음, 연결되지 않은 펩타이드의 분리를 위해 세파덱스컬럼을 이용하여 순수한 펩타이드 연결 리포좀을 정제하였다. 이 후, 펩타이드 연결 전과 후의 리포좀의 크기 및 안정도에 변화가 없음을 증명하고자 Dinamic light scattering; DLS method을 이용해 검증하였다. 상기 결과에 대해 도 10에 나타내었다.
< 실시예 7> 펩타이드 연결 리포좀의 표적 능력 검증 및 신개념 항암제의 유효성 검증
상기 실시예 6에서 공정된 ‘TVRTSAD’ 서열이 약물이 봉입된 리포좀과 연결된 약물전달체가 실제 생체에서 작용되는지 확인하고자 in vivo imaging을 실시하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 구축한 방사선 조사 반응성 xenograft 마우스 모델 및 대조군에 각각 꼬리정맥을 통해 주사한 후, 주사 직후를 시작으로 최종 2일까지 영상을 측정하여 생체 내에서 펩타이드의 순환 경로 및 다른 장기 및 조직에서는 점차 제거되고 암조직에서만 표적하는 영상을 확인하였으며, 이에 따라 생체 내 위암 조직에 완전하게 표적함을 증명하였다. 상기 실시 예에 따라 실시한 in vivo 이미징 결과를 도 11에 나타내었다.
또한 in vivo 이미징 뿐만 아니라 표적 약물 전달체로써의 유효성 검증을 위해 in vivo tumor growth delay를 실시하였다. 실시예 1에서 구축한 방사선 조사 반응성 xenograft 마우스 모델 및 대조군을 구축하고, 종양 크기가 100 mm3 정도 되었을 때 그룹핑을 진행하여 1; PBS, 2; 방사선 조사 (2 Gy), 3; DOX(2 mg/kg) + 방사선 조사 (2 Gy), 4; LP-DOX (2 mg/kg) + 방사선 조사 (2 Gy), 5; P1(peptide)-LP-DOX (2 mg/kg) + 방사선 조사 (2 Gy) 로 총 5개 그룹으로 실시하였으며, 5번 그룹은 실험군, 1~4 그룹은 대조군으로 지정하여 관찰하였다. 각 그룹당 5 마리씩을 포함하였다(n=5). 대조군에 비해 실험군인 5번 그룹의 종양크기가 현저히 작은 것을 검증하였으며 그에 따라 신개념 항암제로써의 유효성을 검증한 결과를 도 12에 나타내었다.
상기 도 11과 도 12에서 검증한 바와 같이, 해당 펩타이드와 약물 봉입 리포좀의 연결로 만들어진 물질이 in vivo imaging과 in vivo tumor growth delay에 다능하게 적용될 수 있는 것을 검증함으로써 진단과 치료가 동시에 가능한 신개념 항암제 개발로써의 가능성을 보여준 결과를 증명하였다.
< 실시예 8> 다른 환자 위암 조직에 방사선 조사 시 선택적 결합 펩타이드 검증을 위한 in vivo 이미징
상기 실시예에서 확보한 환자 위암 조직에서 방사선 조사 시 선택적으로 결합하는 펩타이드가 해당 위암 케이스 이외에, 같은 위암이면서 동일한 특성을 가지는 다른 환자 위암 조직에서도 방사선 조사 시 발굴 펩타이드가 선택적으로 결합하는지 검증하기 위해 각각 다른 환자에서 적출한 위암 조직을 확보하여 마우스 모델을 구축하였다. 구체적으로 상기 실시 예에서 이용한 환자 위암 조직 이외에 다른 환자의 위암 조직 2종을 확보하였고, 이용한 위암 조직 모두 선암(adenocarcinoma)의 특성을 지니는 암종임을 확인하였다. 실시예 1에서와 같이 해당 위암 조직 각각 마우스 모델을 구축하였고, 그 중 일부를 방사선 조사를 시행하여 대조군과 실험군을 확립하였으며, 실시예 4에서 표적효율을 확인한 방법과 동일한 방법인 in vivo 이미징 기법으로 방사선 조사 여부에 따른 표적효율을 검증하였다. 선별 펩타이드 발현 파아지 증폭 및 형광 라벨링은 실시 예 3과 동일한 방법으로 진행하였고, 완성된 샘플을 방사선을 조사한 실험군 마우스와 그의 대조군 마우스에 각각 주사하여 최종 2일 째 이미징을 확인하였다. 그 결과, 다른 환자 위암 조직 2 케이스에서도 기존의 환자 위암 조직에서의 결과와 마찬가지로 방사선을 조사한 실험군 마우스의 종양에만 선택적으로 펩타이드 파아지가 축적됨을 검증하였으며, 해당 실시 예의 영상 측정 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 보는 바와 같이, 방사선을 조사하지 않을 경우에는 펩타이드 발현 파아지가 암조직을 표적하지 않는 반면, 방사선을 조사하는 경우 선택적으로 암조직을 표적함을 확인하였다. 결론적으로, 해당 기술에서 선별한 펩타이드 서열은 방사선 조사 시 선택적으로 위암 조직을 표적하는 펩타이드 서열임을 명확히 검증하였고, 또한 한 환자의 위암 조직에만 국한되는 표적능이 아니라 다른 환자의 위암 조직에서도 방사선을 조사할 경우에만 선택적으로 표적능을 나타내는 펩타이드 서열로써 임상 적용 시 적용 범위가 한정되지 않음을 증명하였다.
이상으로 본 발명을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 위암 표적용 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 방사선이 조사된 위암 조직에 특이적인 위암 표적용 펩타이드.
  3. 제1항의 위암 표적용 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항의 위암 표적용 펩타이드를 포함하는 위암 진단용 조성물.
  5. 제2항의 위암 표적용 펩타이드를 포함하는 방사선 반응성 위암 진단용 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는 위암 진단용 조성물.
  7. 제1항의 위암 표적용 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
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