WO2016075312A1 - Kits de criblage et d'expression de proteines chez la levure yarrowia lipolytica - Google Patents

Kits de criblage et d'expression de proteines chez la levure yarrowia lipolytica Download PDF

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WO2016075312A1
WO2016075312A1 PCT/EP2015/076607 EP2015076607W WO2016075312A1 WO 2016075312 A1 WO2016075312 A1 WO 2016075312A1 EP 2015076607 W EP2015076607 W EP 2015076607W WO 2016075312 A1 WO2016075312 A1 WO 2016075312A1
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WO
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vector
gene
interest
expression
recombination
Prior art date
Application number
PCT/EP2015/076607
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English (en)
Inventor
Jean-Marc Nicaud
Christophe LEPLAT
Original Assignee
Pivert
Institut National De La Recherche Agronomique
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Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • Yeast expression systems combine the ease of manipulation and growth of unicellular organisms with the post-translational modifications of eukaryotes.
  • Unconventional yeasts have been used to produce heterologous proteins as an alternative to Saccharomyces cerevisiae (Dominguez et al., 1998), especially for Yarrowia lipolytica yeast (Nicaud et al., 2002, Madzak et al., 2004).
  • Yarrowia lipolytica provides an attractive expression platform (Nicaud, 2012). It has several advantages in producing heterologous proteins over other yeasts (Madzak et al., 2004). First, it is a non-pathogenic yeast capable of growing on various substrates. His genome has been completely sequenced (Dujon et al., 2004). Several methods using this one have thus been classified GRAS (generally recognized as safe) by the FDA. It has recently become a major microorganism for the production and bioconversion of lipids (Beopoulos et al., 201 1, Blazeck et al., 2014, Coelho et al., 2010). In addition, Y. lipolytica naturally has a strong secretory capacity.
  • promoters constitutive or inducible (TEF, hp4d, hybrid promoter, TEF-hp4d, etc.), make it possible to express heterologous proteins with more or less significant levels of expression. These promoters can be associated with different selection markers (URA3, LEU2, ADE2, LYS5, etc.) to transform recipient strains.
  • the inventors have developed a set of tools and methods for generating easily and rapidly a large number of expression vectors for expressing proteins of interest in oleaginous yeasts, including Yarrowia lipolytica.
  • yeast means yeast strains in general, that is to say that this term includes, inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp. , Hansenula polymorpha, Schizzosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp. , Klu veromyces sp. , Kluyveromyces lactis, Candida albicans.
  • yeasts within the meaning of the invention are oleaginous yeasts (Ratledge, in: Ratledge C, Wilkinson SG editors, Microbial lipids, Vol 2. London: Academy Press 1988).
  • the term "oleaginous” refers to organisms that tend to store their energy source in the form of oil (Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2nd Ed, Plenum, 1980.).
  • an "oleaginous yeast” according to the invention is a yeast that can make oil.
  • the best known yeasts include the genera Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon, Lypomyces, Yarrowia.
  • yeasts within the meaning of the invention include Yarrowia lipolytica, Rhodotura glutinis and Rhodosporidium toruloides.
  • a yeast preferred in the sense of the present invention is Yarrowia lipolytica.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid molecule to which it has been linked.
  • Vectors useful in the invention include, but are not limited to, plasmids, phagemids, viruses, as well as any other vehicle derived from a viral or bacterial source that has been manipulated by insertion or incorporation of one or more nucleic acid sequences. interest.
  • Some vectors are capable of autonomous replication in oleaginous yeast, for example Y. lipolytica, into which they are introduced: they are "episomal vectors".
  • Such vectors contain the elements necessary for maintaining and replicating said vector in the cell, including a centromer (Vernis, L., et al., 1997) and an origin of replication (Fournier, et al., 1991; Matsuoka et al., 1993).
  • centromer Vernis, L., et al., 1997)
  • origin of replication Flournier, et al., 1991; Matsuoka et al., 1993.
  • Other vectors are said to be "integrative" because they can be integrated into the genome of an oleaginous yeast after introduction into the cell, and are thus replicated with the genome of the host.
  • the vector of the invention is an expression vector.
  • expression vector refers to a DNA sequence capable of directing the expression of a particular nucleotide sequence to which said expression vector is operably linked in the appropriate host cell.
  • the expression vector of the invention is functional in oleaginous yeasts, in particular Y. lipolytica, that is to say that said expression vector is capable of directing the transcription of the nucleic acid of interest. in oleaginous yeasts, including Y. lipolytica in particular.
  • the Expression vector of the invention comprises an "expression cassette", i.e., a nucleotide sequence encoding a protein of interest, operably linked to regulatory sequences such as, for example, promoter sequences and / or transcription termination sequences.
  • the present invention provides in a first aspect a pair of vectors which makes it possible to generate an expression vector of interest by simple recombination. More specifically, the subject of the invention is a pair of vectors, in which the first vector is the donor vector and the second vector is the acceptor vector.
  • the donor vector is a vector in which the polynucleotide of interest is cloned in a first step, while the acceptor vector is a vector in which said polynucleotide of interest is subsequently transferred by recombination.
  • the polynucleotide can thus be transferred simply and efficiently from one vector to another without the use of restriction enzymes.
  • the first and second vectors preferably comprise recombination sites.
  • each of the donor and acceptor vectors of the invention therefore carries recombination sites, the recombination sites present on the donor vector allowing recombination with the recombination sites present on the acceptor vector.
  • recombination site is meant here a discrete section of a nucleic acid molecule that is recognized and bound by one or more specific recombination proteins during the initial phases of an integration or excision reaction.
  • recombinant protein or “recombinase” is meant herein a protein that is involved in a recombination reaction involving one or more recombination sites.
  • the recombination proteins within the meaning of the invention include both the proteins allowing the integration of a polynucleotide in another than those allowing the excision of said polynucleotide. They are both tyrosine recombinases and serine recombinases.
  • the recombination proteins are as well wild proteins as mutant proteins or fragments of said proteins, or variants thereof.
  • Such recombination sites are present in phage genomes, such as phages ⁇ or P1, of plasmids, such as the plasmid of S. cerevisiae 2 ⁇ , or else of transposon, such as the transposons Tn3 and ⁇ , and are well known to humans.
  • AttB, attP, attL and attR sequences are recognized by the recombinase enzyme (integrase or Int) to allow integration of phage ⁇ into the E. coli chromosome. After integration, the ⁇ genome is flanked by attL and attR sites. These are generated by the recombination between attB and attP sequences, which means that their sequences come partly from attB and partly from attP.
  • the attL and attR sites can not recombine with each other without the help of integrase and excisionase (Xi) of the phage, as well as fis and IHF proteins of f. coli.
  • each vector comprises two recombination sites, the recombination sites present on the donor vector allowing recombination with the recombination sites present on the acceptor vector.
  • these recombination sites are mutated so as not to recombine with a site that does not have the same specificity, such as for example a wild site.
  • the attB and attP mutated sites (designated attB1 and attP1 respectively) can no longer recombine with the attP and attB wild sites, respectively.
  • the attL and attR mutated sites (designated respectively attL1 and attR1) can no longer recombine with the attL and attR wild sites, respectively.
  • Mutated recombination sites for substantially eliminating any recombination with sites not having the same specificity have been described in the prior art (see for example WO 96/40724A1, WO 99/21977 A1, WO 00/12729 A1, WO 00/29000 A1 , WO00 / 52027A1, WO01 / 42509A1, WO02 / 16594A2, WO0246372A1, WO02 / 061034A2, WO02 / 095055A2, WO03 / 103600A2).
  • the recombination sites of the vectors of the invention are chosen such that a recombination site of a donor vector can recombine only with one of the two sites of the acceptor vector. In particular, it will not be able to recombine with the other recombination site of the donor vector or the other recombination site of the acceptor vector. This makes it possible, by cleverly selecting the recombination sites of the donor and acceptor (s) vectors, to generate vectors carrying an insert with a specific orientation.
  • the recombination sites of the vectors of the invention are chosen from attB1, attB2, attP1, attP2, attL1, attL2, attR1 and attR2, the respective sequences of which are represented by SEQ ID NO. 1 -8.
  • These sites are well known to those skilled in the art because they have been described frequently in the literature and have been commonly used in laboratories for more than ten years. These sites are particularly interesting because of their specificity: the attB1 sites only react with the attP1 sites, the attB2 sites only react with the attP2 sites, the attl_1 sites only react with the attR1 sites and the attl_2 sites. only react with the attR2 sites. Still more preferably, one of the two vectors carries the sequences attl_1 and attl_2, while the other carries the sequences attR1 and attR2.
  • said sites present on the donor vector only allow recombination with the recombination sites present on the acceptor vector after having previously undergone a recombination step.
  • recombination between two recombination sites may make it possible to generate new recombination sites.
  • the recombination between attB1 and attP1 generates an attl_1 site
  • the recombination between attB2 and attP2 generates an attl_2 site.
  • one of the two vectors carries the attB1 and attB2 sequences or the attP1 and attP2 sequences, while the other vector carries the attR1 and attR2 sequences.
  • the donor vector it is particularly advantageous for the donor vector to carry the attB1 and attB2 sequences or the attP1 and attP2 sequences, as this allows cloning of the gene of interest by simple recombination.
  • said sites present on the donor vector only allow recombination with the recombination sites present on the acceptor vector after having previously undergone a recombination step with recombination sites present on the gene of the invention. interest.
  • the donor vector may also contain a multiplicity of cloning sites, each being specific for a restriction enzyme.
  • the polynucleotide can thus be easily cloned into the donor vector.
  • the gene of interest is cloned in an orientation such that it is under the control of the transcriptional regulatory sequences carried by the acceptor vector after recombination in the latter.
  • the use of two restriction enzymes for this allows directional cloning, as is well known to those skilled in the art.
  • the multiple cloning sites of the donor vector are lined on either side by a recombination site.
  • counter-selection marker is meant here a marker whose presence on said donor vector is deleterious under certain conditions and which is intended to be eliminated by successful cloning.
  • This marker may for example be a toxic gene for the cells in which the product of the cloning reaction is introduced. This toxicity can be caused directly by said gene, but can also be linked to a product of said gene.
  • Toxic genes are well known in the art: for example, restriction endonucleases (for example, DpnI), genes linked to apoptosis (for example, ASK1 or members of the bcl-2 / ced-9 family).
  • retroviral genes especially those of the human immunodeficiency virus (VI H), defensins, such as NP-1, inverse repeats or palindromic paired sequences, lytic genes of bacteriophages such as bacteriophage ⁇ 174 or T4, antibiotic susceptibility genes such as rpsL, antimicrobial susceptibility genes such as pheS, plasmid killer genes, eukaryotic transcription vector genes that produce a gene product toxic to bacteria, such as GATA- 1, and genes that kill hosts in the absence of a deletion function, for example, kicB, ccdB, ⁇ 174E (Liu et al, 1998), and other genes that negatively affect stability and / or the replication of a replicon.
  • VI H human immunodeficiency virus
  • defensins such as NP-1, inverse repeats or palindromic paired sequences
  • lytic genes of bacteriophages such as bacteriophage ⁇ 174 or T4
  • the toxic gene is the ccdB gene.
  • the ccdB gene is part of the ccd operon of f. coli with the ccdA gene.
  • the CcdB protein is an inhibitor of bacterial topoisomerase II, whose activity is normally countered by its antidote CcdA.
  • the donor vector comprises the ccdB gene, but not the ccdA gene.
  • a carrier vector of the ccdB gene therefore allows positive selection of clones having integrated the DNA of interest, leaving only the cells which have incorporated the new gene in the culture medium to survive. Vectors carrying the ccdB gene can be routinely maintained on bacterial strains resistant to the CcdB protein.
  • strains expressing the CcdA protein allow the replication of such vectors.
  • CcdB resistant strains are well known to those skilled in the art (see, for example, Bernard, 1996). Some are commercially available, such as ccdB Survival and DB3.1 (Life Technologies, Carslbad, CA).
  • the counter-selection marker preferably ccdB
  • the counter-selection marker is located between the multiple cloning sites, i.e., between the two donor vector recombination sites.
  • Successful cloning of the gene of interest into the donor vector makes it possible to eliminate the counter-selection marker and to obtain a plasmid in which the gene of interest is found between the two recombination sites.
  • Such a plasmid can now replicate in a bacterial strain normally sensitive to ccdB, i.e. a strain in which the expression of CcdB is lethal.
  • the donor vectors according to the invention comprise a second counter-selection marker.
  • This second marker is contiguous with the first, between the multiple cloning sites. It makes it possible to ensure that the loss of the CcdB marker is indeed linked to a successful cloning: in this case indeed, said second counter-selection marker is also eliminated.
  • said second counter-selection marker is an antibiotic resistance marker. More preferably, said second counter-selection marker is the chloramphenicol resistance gene.
  • the acceptor vector allows the expression of the gene of interest in the yeast.
  • the acceptor vector it is advantageous for the acceptor vector to contain regulatory sequences which make it possible to control this expression.
  • these regulatory sequences are not placed between the recombination sites present on the acceptor vector: thus they are not removed by recombination when the gene of interest is introduced into the acceptor vector.
  • the insertion of the gene of interest by recombination into the acceptor vector therefore puts it under the control of these regulatory sequences and thus creates an expression cassette.
  • "Expression cassette” here means a DNA fragment comprising a polynucleotide of interest operably linked to several regulatory elements controlling the expression of gene sequences, such as, for example, promoter sequences and terminator sequences. .
  • regulatory sequences or “regulatory elements” is meant herein polynucleotide sequences which are necessary to affect the expression and processing of the coding sequences to which they are functionally linked. Such regulatory sequences include transcription initiation and termination sequences, promoter sequences and sequences. “Enhancer”; efficient RNA processing signals, such as splicing and polyadenylation signals; sequences stabilizing cytoplasmic mRNAs; sequences improving translation efficiency (eg, Kozak sequences); sequences that increase the stability of proteins; and, if necessary, sequences that increase the secretion of proteins.
  • the regulatory sequences of the invention comprise promoter sequences, i.e. the gene of interest is preferably operably linked to a promoter that allows the expression of the corresponding mRNA.
  • a gene of interest is preferably operably linked to a promoter when it is located downstream of the promoter, thereby forming an expression cassette.
  • a polynucleotide is "operably linked" to regulatory elements when these different nucleic acid sequences are associated on a single nucleic acid fragment such that the function of one is affected by the others.
  • a regulatory DNA sequence is "operably linked” to a DNA sequence encoding an RNA or a protein if both sequences are located such that the regulatory DNA sequence affects expression of the coding DNA sequence (that is, that the coding DNA sequence is under the transcriptional control of the promoter).
  • the coding sequences may be operably linked to regulatory sequences in both sense orientation and antisense orientation.
  • the coding sequences of the invention are operably linked to the regulatory sequences in the sense orientation.
  • promoter is intended to mean a nucleotide sequence, most often located upstream (5 ') of the coding sequence, which is recognized by the RNA polymerase and the other factors necessary for transcription, and thus controls the expression of said coding sequence.
  • a “promoter” as it is understood here comprises in particular the minimal promoters, that is to say short DNA sequences composed of a TATA box and other sequences which make it possible to specify the site of starting the transcription.
  • a “promoter” within the meaning of the invention also comprises nucleotide sequences including a minimal promoter and regulatory elements capable of controlling the expression of a coding sequence.
  • the promoter sequences of the invention may contain regulatory sequences such as "enhancer” sequences that can influence the level of expression of a gene.
  • the promoters according to the invention are those that function in the cells of the organism of interest.
  • several promoters are known to function in oleaginous yeasts and, in particular, in Y. lipolytica.
  • the expression of the protein of interest is controlled by a promoter which functions in oleaginous yeasts, in particular in Y. lipolytica.
  • promoter sequences are well known to those skilled in the art and can correspond in particular to inducible or constitutive promoters.
  • promoters that can be used in the process according to the invention, mention may be made in particular of the promoter of a Y. lipolytica gene which is strongly repressed by glucose and which is inducible by fatty acids or triglycerides such that the POX2 promoter of the Yarrowia lipolytica acyl CoA oxidase 2 gene and the LIP2 gene promoter described in PCT application WO 01/83773.
  • FBA1 gene of the fructose-bisphosphate aldolase gene US Pat. No.
  • the promoter of the phosphoglycerate-GPM mutase gene (WO 2006/0019297, US Pat. No. 259,255, US Pat. No. 7,459,456), the promoter of the YAT1 gene of the US Pat. ammonium transporter gene (US 2006/0094102 A1), the EXP1 gene promoter encoding an export protein (US 7,932,077), the GPAT gene promoter of the glycerol-3-phosphate O-acyltransferase gene (US 7,264,949), the GPDIN gene promoter of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (US Pat. No.
  • TEF gene promoter (Muller et al., 1998; US 6,265,185), the hybrid hp4d promoter (WO 96/41889), XPR2 hybrid promoters described in Madzak et al. (2000) or the hybrid promoters UAS1 -TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS and UAStef-TEF described in Blazeck et al. (2001 1, 2013, 2014).
  • the promoter carried by the acceptor vector is chosen from the promoters POX2, LIP2, FBA1, GPM, YAT1, EXP1, GPAT, GPDIN, TEF hp4d, XPR2, UAS1 -TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS and UAStef-TEF.
  • the promoter carried by the acceptor vector it is advantageous for the promoter carried by the acceptor vector to be placed outside the recombination sites of said vector.
  • said promoter is oriented to direct transcription of a gene of interest inserted between said recombination sites.
  • the regulatory sequences of the invention comprise transcription termination sequences. "Terminating sequences", also referred to as “terminators” as used herein, are regions 3 'of a coding sequence whose transcription termination they regulate and which further confer stability on the transcript. .
  • the expression cassette of the invention thus comprises a terminator chosen from the terminator sequence of the PGK1 gene, the terminator sequence of the LIP2 gene, the terminator sequence of the XPR2 gene, the terminator sequence of the CYC1 gene, or a synthetic terminator described by Alper et al. (Curran et al, 2014).
  • the terminator sequences carried by the acceptor vector are placed outside the recombination sites of said vector.
  • said terminator sequences are oriented so as to be able to stop the transcription of a gene of interest inserted between said recombination sites.
  • said regulatory sequences comprise promoter sequences and terminator sequences, both placed outside the recombination sites, said promoter sequences being oriented to direct transcription of a gene of interest inserted between said recombination sites and said terminator sequences being oriented so as to stop the transcription of said gene of interest.
  • the promoter and terminator sequences used belong to different genes so as to minimize the risks of unwanted recombination in the genome of the Yarrowia strain.
  • the recombination sites present on the acceptor vector are flanked by promoter and terminator sequences, said promoter sequences being oriented so as to direct the transcription of a gene of interest inserted between said sites of expression. recombination and said sequences terminators being oriented so as to stop the transcription of said gene of interest.
  • the acceptor vectors of the invention are preferably integrative vectors.
  • zeta sequences which correspond to the LRT (long terminal repeats) of the retrotransposon Yltl of Y. lipolytica.
  • the expression cassettes can thus be integrated into random locations in the genome using these Zeta terminal repeats (Mauersberger et al., 2001), which usually border the expression cassettes used in the field. More recently, an integration platform (hereinafter referred to as a "zeta hosting platform") comprising zeta sequences in which it is possible to integrate genes with one or two recombination events has been developed in strains lacking retrotransposon (Bordes et al., 2007; Juretzek et al., 2001; WO 00/012729; WO 2009/098263). When vectors carrying inserts flanked by zeta sequences are used to transform oleaginous yeast cells, in particular Y. lipolytica, containing in its genome such a zeta host platform, the DNA of the insert is most preferably integrated into the genome at these sequences. In this case, only one copy is integrated.
  • the zeta sequences flank the two homologous recombination sites carried by the acceptor vector, so that after recombination, the gene of interest is found between said zeta sequences and can be integrated on the chromosome. More preferably, said zeta sequences frame not only the recombination sites, but also the regulatory sequences carried by the acceptor vector. This allows the gene of interest to be expressed after it has been recombinantly integrated into the chromosome.
  • the zeta sequences are flanked by rare restriction sites, that is to say sites that occur only rarely in the genome: an enzyme whose recognition site is 7 nucleotides does not cut DNA every 4 7bp (16,384 bp) and whose site consists of 8 nucleotides cuts only every 4 8 bp (65,536 bp).
  • rare restriction sites that is to say sites that occur only rarely in the genome: an enzyme whose recognition site is 7 nucleotides does not cut DNA every 4 7bp (16,384 bp) and whose site consists of 8 nucleotides cuts only every 4 8 bp (65,536 bp).
  • sites are used to release a linear insert bordered by zeta sequences without the risk of cleavage within said insert. They are well known to those skilled in the art. They can be natural or synthetic. For example, the sites of the NotI, SfiI, Pmel, PacI, Ascl, and Cell enzymes are mentioned.
  • the acceptor vectors according to the invention preferably carry a selection marker which thus makes it possible to select the yeasts having integrated in their chromosomes the insert bearing said selection marker.
  • the selection marker is located between the zeta sequences of the acceptor vector, preferably in contiguity with the expression cassette of interest, so as to be integrated into the genome with it.
  • Selection markers that can be used in acceptor vectors are auxotrophy markers or resistance markers. Selection markers for the complementation of an auxotrophy, also commonly referred to as auxotrophy markers, are well known to those skilled in the art.
  • any known method of selection of the prior art compatible with the gene (or genes) marker (s) used any strain expressing the selected marker gene being potentially a yeast strain defective in the genes ADE2, URA3, LEU2 or LYS5.
  • the selection marker URA3 is well known to those skilled in the art. More specifically, a strain of Y. lipolytica including the URA3 gene (said sequence is also accessible by the accession number YALI0E26719g at the address www.genolevures.orpJ or at http: / /gryc.inra.fr/ ), encoding orotidine-5'-phosphate decarboxylase, is inactivated (for example by deletion), will not be able to grow on a medium not supplemented with uracil. The integration of selection marker URA3 in this strain of Y. lipolytica will then restore the growth of this strain on a medium devoid of uracil.
  • the selection marker LEU2 described in particular in US Pat. No. 4,937,189 is also well known to those skilled in the art. More specifically, a Y. lipolytica strain whose LEU2 gene (YALI0E26719g), encoding ⁇ -isopropylmalate dehydrogenase, is inactivated (for example by deletion), will not be able to grow on a medium not supplemented with leucine. Like before. The integration of the selection marker LEU2 in this strain of Y. lipolytica will then restore the growth of this strain on a medium not supplemented with leucine.
  • the ADE2 selection marker is also well known to those skilled in the field of yeast transformation.
  • a strain of Yarrowia whose gene ADE2 (YALI0B23188g), encoding phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, is inactivated (for example by deletion), will not be able to grow on a medium not supplemented with adenine.
  • the integration of the selection marker ADE2 in this strain of Y. lipolytica will then restore the growth of this strain on a medium not supplemented with adenine.
  • the LYS5 selection marker is also well known to those skilled in the field of yeast transformation.
  • a Yarrowia strain whose LYS5 gene (YALI0B1 5444g), encoding saccharopine dehydrogenase, is inactivated (for example by deletion), will not be able to grow on a medium not supplemented with lysine.
  • the integration of the selection marker LYS5 in this strain of Y. lipolytica will then restore the growth of this strain on a medium not supplemented with lysine (Xuan et al, 1990).
  • resistance genes that may be used as a selection marker for conferring a predominant phenotype on the oleaginous yeast strain, in particular Yarrowia, there may be mentioned:
  • the mouse-derived MDR3 gene codes for P-glycoprotein and, when expressed in a Yarrowia strain, confers resistance to FK520, an antifungal and immunosuppressive agent (Raymond et al., 1994).
  • the KanMX module which contains the kan r sequence derived from the Escherichia coli Tn903 transposon fused to the transcriptional sequences of the TEF gene of the The filamentous fungus Ashbya gossypii, or any functional transcription promoter and terminator, confers resistance to geneticin to a strain of Yarrowia (G418, Wach et al., 1994).
  • the hph (HYG) gene native to an Escherichia coli plasmid, allows resistance to hygromycin B (Gritz & Davies, 1983, Fickers et al., 2003;
  • the Tn5ble gene derived from Escherichia coli, allows the transformed yeast to acquire resistance to phleomycin (Gaillardin & Ribet, 1987, Wenzel et al., 1992).
  • Other selection markers that can be used in the process according to the invention are also described by Barth & Gaillardin (The dimoorphic fungus Yarrowia lipolytica In: No, a conventional method of biotechnology (Wolf K. Ed.) Springer-Verlag, Berlin, pages 313-388, 1996).
  • the acceptor vector selection marker is flanked by sequences allowing its excision after targeted integration of said recombinant vector.
  • This same selection marker in particular an auxotrophy marker, can then be reused for another targeted integration during a new transformation step.
  • Such sequences allowing the excision and elimination, in a Yarrowia strain, of a framed sequence are well known to those skilled in the art.
  • SRD direct repeat sequences
  • the selection marker in yeast optionally itself flanked by sites permitting its excision, will be located, as well as the two recombination sites themselves bordered by the regulatory sequences, between the two zeta sequences. carried by the acceptor vector.
  • the invention more particularly relates to a group of vectors, comprising a donor vector and at least one acceptor vector, wherein:
  • Said donor vector comprises two recombination sites chosen from attB1, attB2, attP1, attP2, attl_1, attl2, attR1 and attR2, said recombination sites flanking at least one counter-selection marker; and
  • Said acceptor vector comprises an insert lined with zeta sequences, said insert comprising:
  • said sites present on the donor vector only allow recombination with the recombination sites present on the acceptor vector after having previously undergone a recombination step.
  • promoters, terminators and selection markers can be easily combined by those skilled in the art. Indeed, it is quite within the abilities of those skilled in the art to construct, on the basis of the indications given above, and using basic techniques of molecular biology, the different acceptor vectors containing the different combinations. promoters, terminators and selection markers, as well as the two recombination sites optionally framing one or two counter-selection markers.
  • acceptor vector an acceptor vector or more than one acceptor vector.
  • the number of acceptor vectors is greater or 2, preferably 3, preferably 4, preferably 5, preferably 6, preferably 7, preferably 8, preferably 9, preferably 10, preferably 1, more preferably 12.
  • acceptors are then advantageously distinguished by the regulatory sequences and / or by the selection marker they carry.
  • each acceptor vector then carries a unique combination of regulatory sequences and selection marker.
  • a "unique combination” means that said combination is not present on any of the other acceptor vectors of the vector group of the invention.
  • the invention relates to a group of vectors, said group comprising a donor vector and several acceptor vectors, in which each acceptor vector comprises an insert bordered by two zeta sequences, said insert comprising:
  • a pair of recombination sites chosen from attB1, attB2, attP1, attP2, attL1, attL2, attR1 and attR2;
  • a selection marker chosen from the auxotrophy markers and the resistance markers the auxotrophy marker being chosen from ADE2, URA3, LEU2 and LYS5, and said resistance marker being chosen from MDR3, KanMX, hph (HYG); , and Tn5ble.
  • the recombination sites present on the acceptor vectors allowing recombination with the recombination sites present on the donor vector.
  • said sites present on the donor vector only allow recombination with the recombination sites present on the acceptor vector after having previously undergone a recombination step.
  • each acceptor vector differs from the other acceptor vectors of said set only by the regulatory sequences and / or by the selection marker that it carries.
  • each acceptor vector can be distinguished by the promoter and / or terminator it contains.
  • each acceptor vector differs from the others only by its promoter and / or by its terminator and / or by its selection marker.
  • Such a set of acceptor vectors is particularly advantageous because it makes it possible to place the gene of interest under the control of any promoter and to associate this expression cassette with any marker. It is therefore possible to test different levels of expression of the gene of interest, while easily transferring the expression cassette from one strain to another.
  • the invention in another aspect, relates to a method of constructing at least one expression vector of a gene of interest using a group of vectors described above. More specifically, the method of the invention, comprising steps of: a) cloning said gene of interest into the donor vector, and b) cloning said gene of interest by recombination between the vector obtained in step a) and said acceptor vector.
  • the gene of interest is introduced into the donor vector before being transferred by recombination into the acceptor vector in a second step.
  • the gene of interest can be introduced by any means known to those skilled in the art into the donor vector.
  • Techniques for inserting a nucleic acid sequence into a vector are well known in the art and include conventional methods such as those described, for example, in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Edition (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (2000)), Silhavy et al (Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984)). Ausubel et al (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience (1987)) In brief, a donor vector has several cloning sites, each having a specificity for a given restriction enzyme.
  • encoding a transcription factor can be cloned using enzymes from restriction and positioned in an orientation compatible with that of the acceptor vector transcription promoter and / or terminator so that the gene of interest can be overexpressed after it has been recombinantly transferred into the acceptor vector.
  • the gene of interest Once the gene of interest has been cloned into the donor vector, it can be transferred into an acceptor vector by recombination to create an expression vector.
  • the gene of interest is amplified and recombination sites are added at each of its ends.
  • said recombination sites are attP1 and attP2.
  • said recombination sites are attB1 and attB2.
  • the recombination sites of the donor vector are attP1 and attP2.
  • the recombination sites added to the ends of the gene of interest are attP1 and attP2, whereas the recombination sites of the donor vector are attB1 and attB2.
  • the recombination sites added to the ends of the gene of interest are attB1 and attB2, while the recombination sites of the donor vector are attP1 and attP2.
  • the gene of interest carrying recombination sites is brought into contact with the donor vector carrying the appropriate recombination sites and at least one recombination enzyme.
  • This (these) enzyme (s) is (are) protein (s) capable of binding to the nucleic acids and generating recombination.
  • This (these) enzyme (s) is (are) in particular specific (s) recombination sites carried by the gene of interest and the donor vector.
  • these sites are chosen from attB1, attB2, attP1 and attP2
  • it is advantageous to use two recombination enzymes that is to say the lambda phage integrase, the HF protein of f. coli.
  • These proteins are well known to those skilled in the art. Compositions comprising these proteins are commercially available (Life Science).
  • the gene of interest is transferred from the donor vector into at least one acceptor vector by recombination.
  • the donor vector containing said gene of interest is brought into contact with the acceptor vector and minus a recombinant enzyme.
  • This (these) enzyme (s) is (are) protein (s) capable of binding to the nucleic acids and generating recombination.
  • This (these) enzyme (s) is (are) in particular specific (s) recombination sites carried by the gene of interest and the donor vector.
  • the sites are chosen from among attl_1, attl_2, attR1 and attR2, it is advantageous to use three recombination enzymes, that is to say integrase and excisionase of phage lambda, the IHF protein of E. coli.
  • the Fis protein of E. coli can be further used.
  • These proteins are well known to those skilled in the art. Compositions comprising these proteins are commercially available (Life Science).
  • the acceptor vector carrying the gene of interest can then be identified by any means known to those skilled in the art.
  • acceptor vector will choose the acceptor vector according to their needs, such as the desired level of expression or the type of selection marker.
  • the method of the invention will result in the construction of an expression vector in which the gene of interest is under the control of regulatory sequences (promoter and / or terminator) specific to the vector.
  • the expression cassette carried by the vector may then be integrated into the genome of an oleaginous yeast host cell, in particular Y. lipolytica.
  • Targeted integration of a gene into the genome of a yeast is a technique of molecular biology frequently used by those skilled in the art, whose principles will be merely recalled.
  • a linear DNA fragment carrying the expression cassette of the invention is introduced into the cell to be transformed, which DNA fragment then integrates by homologous recombination into a targeted region of the recipient genome (Orr- Weaver et al., 1981).
  • transformation methods are well known to those skilled in the art and are described, in particular, in Ito et al. (1983), in Klebe et al.
  • this recombination event is rare, selection markers are inserted between the sequences ensuring the recombination in order to allow, after transformation, to isolate the cells where the integration of the fragment has occurred by highlighting the corresponding markers.
  • the digestion of the acceptor vector by the rare enzyme whose sites are located on either side of the zeta sequences releases a linear nucleic acid fragment bordered by the zeta sequences.
  • This fragment comprises the expression cassette and a selection marker, the nature of which varies according to the acceptor vector. As explained above, when this fragment carrying the expression cassette is used to transform an oleaginous yeast cell, in particular Y.
  • lipolytica containing a zeta reception platform
  • lipolytica it fits very preferentially into the genome at the level of this platform. In this case, only one copy is integrated. This makes it possible to precisely control the level of expression of the gene of interest.
  • the recipient strain does not contain a zeta reception platform, but rather many copies of the retrotransposon Ylt1, the linear fragment bearing the expression cassette of interest is integrated at random in the chromosome many times. Such a situation can achieve high expression levels and easily overexpress the protein of interest.
  • the method of the invention makes it easy to construct a library of expression vectors comprising the gene of interest. It suffices to introduce the gene of interest into several acceptor vectors by the method described above.
  • the method of the invention leads to expression vectors which all carry the gene of interest, but differ from each other by the nature of the regulatory sequences (for example, promoter and / or terminator) and / or by the nature of the selection marker.
  • These vectors include in particular all zeta sequences that allow integration into the genome of the host cell. After release of the expression cassettes, they are transformed into a Y. lipolytica receptor strain and the transformants are screened.
  • this also relates to a method of constructing a library of strains expressing a gene of interest, said method comprising a step of transformation by the expression library comprising the gene of interest described above.
  • the method of the invention preferably comprises a prior step of releasing the insert contained in the acceptor vector.
  • this release is obtained by digestion with at least one rare enzyme.
  • it is the said rare enzyme (s) is (are) chosen from among the rare enzymes whose sites border the zeta sequences in the acceptor vector.
  • Any transfer method known from the prior art can be used to introduce the insert containing the expression cassette of the protein of interest into the yeast strain.
  • the lithium acetate and polyethylene glycol method may be used (Gaillardin et al., 1987, Le Dali et al., 1994).
  • the cells are transformed by a transformation protocol adapted to broadband.
  • oleaginous yeast strains for example Y. lipolytica
  • the inventors have developed a high-throughput yeast transformation method. This method makes it possible to simultaneously transform a large number of yeast strains, preferably at least 50, more preferably at least 60, even more preferably at least 70, still more preferably at least 80, most preferably at least 90. It also allows to work in 96-well microplates, which is a benefit
  • the cells are then brought into contact with the nucleic acid to be transformed, such as, for example, linearized expression vector nucleic acid, presence of nucleic acid coach. After incubation at a temperature of between 25 ° C.
  • the mixture is incubated for at least 30 minutes, preferably for at least 45 minutes, more preferably for at least 60 minutes, at a temperature between 25 ° C and 30 ° C, preferably at 28 ° C, before being transferred to a temperature of at least 37 ° C, preferably at least 38 ° C, more preferably at least 39 ° C, for a time between 5 and 15 minutes, preferably 10 minutes.
  • the cells are then directly plated on selection medium to identify the transformants.
  • the invention also relates to a yeast cell bank obtained by the methods described above.
  • the cells of said library contain expression cassettes of a gene of interest which differ from each other only by the regulatory sequences they contain.
  • each cassette can be distinguished from another by the promoter or terminator it contains, or both.
  • the cells of said library can also be distinguished from each other by the nature of the selection marker associated with said expression cassette.
  • said cells are distinguished from each other by their expression cassettes and by the selection marker associated with said cassette.
  • the invention therefore relates to the use of an oleaginous yeast strain, in particular Y. lipolytica, to produce proteins.
  • the invention relates to the use of an oleaginous yeast strain, preferably a strain of Y. lipolytica, in which an expression cassette has been integrated, as described above, for protein production.
  • the invention relates to the use of an oleaginous yeast strain, preferably a strain of Y. lipolytica, in which an expression cassette has been integrated, for the production of a protein encoded by the gene of interest of the expression cassette.
  • the genes of interest according to the invention are more particularly genes whose transcription and possibly translation into the target cell generate products having a therapeutic, vaccinal, agronomic or veterinary interest.
  • genes of therapeutic interest there may be mentioned more particularly the genes encoding enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, etc. (FR 9203120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc .; apolipoproteins: ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc. (FR 93 05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 91 1 1947), tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc.
  • trophic factors BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc .
  • apolipoproteins ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc.
  • the therapeutic gene may also be an antisense gene or sequence whose expression in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs. Such sequences may for example be transcribed in the target cell to RNA complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the gene of interest may also be a vaccinating gene, that is to say a gene encoding an antigenic peptide, capable of generating in humans or animals an immune response, for the purpose of producing vaccines.
  • vaccinating gene that is to say a gene encoding an antigenic peptide, capable of generating in humans or animals an immune response, for the purpose of producing vaccines.
  • antigenic peptides specific for Epstein Barr virus, HIV virus, hepatitis B virus (EP 185 573), pseudo-rabies virus, or tumor-specific (EP 259 212).
  • the invention relates to the use of an oleaginous yeast strain, preferably a strain of Y. lipolytica, wherein an expression cassette has been randomly integrated for the production of proteins.
  • the subject of the invention is the use of an oleaginous yeast strain, preferably a strain of Y. lipolytica, in which an expression cassette has been integrated into a specific place of the genome in a single copy, for the purpose. protein production.
  • the present invention relates to a method of producing proteins in which: a) in a first step, a yeast strain transformed according to the invention is cultured in a suitable medium and
  • step b) in a second step, the proteins produced by the culture of step a) are harvested.
  • the method of the invention makes it possible to produce a protein of interest.
  • the judicious choice of the transformation method used and / or the yeast strain that has been transformed will make it possible to obtain transformants having non-specific integration, potentially at multiple locations in the genome, or integration into a given locus, via the home platform zeta for example.
  • the growth of the yeast in liquid medium is in several phases.
  • the exponential phase corresponds to the active division phase of the yeast cells, that is to say to the phase during which the growth rate is the largest.
  • the number of cells in the yeast culture increases rapidly.
  • the number of yeast cells in the culture remains constant during the stationary phase, because cells no longer divide or because a balance between divisions and cell death is achieved.
  • the media allowing the growth of oleaginous yeast strains, in particular Y. lipolytica are well known to those skilled in the art. This will therefore be able to determine without difficulty the appropriate culture medium for each of the strains of the invention.
  • the method of the invention makes it possible to produce a protein of interest during the exponential phase.
  • the method of the invention makes it possible to produce a heterologous protein during the stationary phase.
  • the proteins produced can then be purified from the culture medium or from the cell extracts. They can then be purified using any method known to those skilled in the art, such as, for example, chromatography (ion exchange, affinity, by gel filtration, etc.), centrifugation. , differential solubility or by any other usual technique for the purification of proteins.
  • chromatography ion exchange, affinity, by gel filtration, etc.
  • centrifugation e.g., differential solubility
  • differential solubility e.g., differential solubility or by any other usual technique for the purification of proteins.
  • the methods Depending on the nature of the protein to be purified, these will vary, but will be easily identifiable by those skilled in the art.
  • Fig. 1 Schematic representation of the construction of an expression vector from a donor vector containing a gene of interest and an acceptor vector.
  • Fig. 2. Schematic representation of the construction of an expression vector library from a donor vector containing a gene of interest and multiple acceptor vectors.
  • FIG. 3 A) Schematic representation of the structure of the gateway overexpression cassette. B) Genomic structure of the Zeta platform at the URA3 locus. C) Genomic structure of the Zeta platform at the URA3 locus after integration of an overexpression cassette. The sizes of the PCR products for Zeta platform integration validation are indicated.
  • Fig. Validation of the overexpression system.
  • A) Observation by fluorescence microscopy of the overexpression of eYFP in a strain constitutively expressing Redstar2 (JMY2812).
  • C) Growth of the control strain and the strain overexpressing SUC2 (JMY2815) on sucrose.
  • FIG. 7 Distribution of V max (RFU / min) of the protease activity of 96 XPR2 overexpressing mutants. Protease activity was measured using FTC-casein in microplates at an excitation wavelength of 494 nm and an emission wavelength of 517 nm every minute for 1 h with a microplate reader (Biotek). The V max is calculated with a sliding window of 30 points. The number of clones for each range of V max is indicated above each bar.
  • the vectors contain the following promoters; the pTEF promoter (pTEF), the pTEF promoter with two copies of UASI (2UAS1 -pTEF), the pTEF promoter with three copies of UASI (3UAS1 -pTEF), the pTEF promoter with four copies of UASI (4UAS1 -pTEF) ), the pTEF promoter with eight copies of UASI (8UAS1 - pTEF), the hybrid hp4d promoter with four copies of UASI (hp4d) and hybrid promoter with eight copies of UASI (hp8d).
  • Each promoter is contained in a ClaI-BamHI fragment.
  • the expression vectors contain either the kanamycin resistance antibiotic marker (KanR) and the LEU2 selection marker when the cloning vectors are derived from the Redstart2 vectors, or the ampicillin resistance antibiotic marker ( AmpR) and the selection marker URA3 when the cloning vectors are derived from vectors containing CmR + CcdB (Table 3).
  • the expression vectors contain different genes of interest contained in a BamHI -Avrl fragment 1; the gene coding for ResStar2 fluorescent protein, and the secreted proteins aspergillus niger glucoamylase (glucoamylase), Aspergillus niger aspartic Pepl protease (Pepl) and Aspergillus niger XlnC xylanase containing the lipase secretion sequence.
  • LI P2 of Y. lipolytica pre-Lip2
  • Fig. 10 Quantification of secreted proteins in the extracellular medium by Bradford assay for different promoters. Each sample is concentrated 20 times before being assayed.
  • Fig. 1 Comparison of the secretion of proteins in the culture medium according to the different promoters.
  • Fig. 12 Test of the enzymatic activity of the glucoamylase revealed on a box by gaseous release of iodine crystals.
  • Acceptor vectors in which the gene coding for glucoamylase is under the control of the pTEF, Hp4d, Hp8d, 2UAS1-pTEF, 3UAS1-pTEF, 4UAS1-pTEF and 8UAS1-pTEF promoters have been constructed and integrated into a single copy in a strain of Y. lipolytica. The level of expression of the protein varies depending on the strength of the promoter.
  • Fig. 13 XlnC xylanase activity assay measured from the Thermo-Scientific EnzChek Ultra Xylanase Assay Kit.
  • Acceptor vectors in which the gene coding for the XlnC protein is under the control of the pTEF, Hp4d, Hp8d, 2UAS1-pTEF, 3UAS1-pTEF, 4UAS1-pTEF and 8UAS1-pTEF promoters have been constructed and integrated into a single copy in a strain.
  • Y. lipolytica The level of expression of the protein varies depending on the strength of the promoter.
  • Y. lipolytica strains used in this study are derived from Po1 d and are listed in Table 1.
  • Yeast strains are usually grown on YPD medium (1% (w / v) yeast extracts, 1% (w / v) Bacto Peptone, 1% (w / v) glucose), this being added with 1.5% (w / v) agar to obtain solid medium if necessary.
  • the URA + transformants are selected after incubation at 28 ° C. on YNB minimal medium (0.17% (w / v) of Yeast Nitrogen Base without ammonium and without amino acids, 0.5% (w / v) of ammonium chloride.
  • YNBsuc YNB with 0.5% sucrose instead of glucose
  • YNBoa YNB with 0.5% oleic acid instead of glucose
  • YNBsm YNB with 1, 6% skim milk instead of glucose
  • Table 1 Y. lipolytica strains, E. coli strains and vectors used in this study.
  • MATa ura3 :: pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY2810 This work
  • MATa ura3 :: pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY281 1 This work
  • MATa ura3 :: pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY2812 This work
  • MATa ura3 :: pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY2813 This work
  • MATa ura3 pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY2815 This job
  • KanR PTura3- Lazar et al. (Lazar, et al.,
  • JME1592 JMP1592 pDONR207-XPR2 This work JME1593 JMP1593 pDONR207-SUC2 This job JME1594 JMP1594 pDONR207-eYFP This job
  • JME1598 JMP1598 JMP1529-SUC2 This Work JME1599 JMP1599 JMP1529-eYFP This Work JME1600 JMP1600 JMP1529-RedStar2 This Work JME1603 JMP1603 JMP1529-XPR2 This Work
  • JMP62 LEU2ex Kabran et al. Korean, and JME1394 JMP1394
  • the 96-well microplate cultures were performed as follows except when specificities are mentioned.
  • the precultures are made in 96-well YPD plates for 48 hours.
  • the cells are then inoculated with approximately 0.1 to D0 6 oo ⁇ in 200 of culture medium.
  • the wells at the periphery of the plate are filled with water to prevent evaporation of the culture wells.
  • the OD 6 oo is read every 20 minutes for 48 hours in a Biotek Synergy MX microplate reader (http: / / www, biotek. Corn) while the plate is maintained at 28 ° C. with constant stirring.
  • growth is monitored using the RedStar2 fluorescent reporter protein using an excitation wavelength of 545 nm and an emission wavelength of 585 nm with the same equipment and the same conditions as above.
  • a fragment of pBR322 containing the ori replication origin and the ampicillin resistance gene was amplified from pDEST14 (Invitrogen) using the PBRup and PBRdown primers (Table 2). These two primers comprise two NotI restriction sites and Iceul. After digestion with NotH and purification, the dephosphorylated fragment was ligated with the purified NotI fragment of JMP62 JMP1047 which contains the Not / -zeta-URA3ex-pTef-term-zeta-Not / expression cassette. The resulting vector JMP1521 was verified by digestion and sequencing.
  • Attb1 -Redstar2 G G G G AC AAGTTTGTAC AAAAAAG CAG G CTATG AGTG CTTCTTCTG AAG A Attb2-Redstar2 G G G G ACCACTTTGTACAAG AAAG CTG G GTCTTACAAG AACAAGTG GTGTC
  • Attk -eYFP GGGG AC AAGTTTGTAC AAAAAAG CAG G CTATG GTGAGCAAGGGCGAGGA Attb2-eYFP GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC Attack -SUC2 GGGG AC AAGTTTGTAC AAAAAAG CAG G CTATG CTTTTG CAAG CTTTCC GGGGACCACCTTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATTTTACTTCCCTTACTTGG GGGG AC AAGTTTGTAC AAAAAAG CAG G CTATG CTCG CTAG CCTG CTGCGGACCACCACCTTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAATGCCAACACCGTTGTAG TG ATCCTAG GGGGTCTGTG G TCTTCTGCCTCCAGGAAGTC
  • the Gateway cassette (attR1 -ccdb-chloramphenicol-attR2), which allows recombination using Gateway® clonase, was amplified by PCR from pDEST1 (Invitrogen) with primers bgl2_gate_plus and gate_Avr2_plus (Table 2), in adding Bglll and Avril restriction sites that make it possible to clone in JMP1 521 between promoter and terminator.
  • the purified BglII-AvrII fragment was cloned into the BamHI and April digested JMP1 521 vector.
  • the resulting vector JMP1 529 was partially sequenced to verify the construct ( Figure 1).
  • a set of acceptor vectors with different promoters was constructed by Clal-BamHI digestion of the JMP1 529 vector, and the elimination of the Clal-BamHI fragment containing the pTEF promoter and the replacement with a Clal-BamHI fragment bearing variable force promoters ( Table 3).
  • Expression vectors may be constructed from a Gateway donor vector containing a gene of interest to construct expression vectors with different promoters ( Figure 2).
  • RedStar2 expression vectors under different promoters were constructed from the JMP1 394 vector containing the LEU2 selection marker (Table 3).
  • Table 3 Acceptor vectors having different promoters and expression vectors of RedStar2 under different promoters.
  • the pTEF-RedStar2-term cassette was amplified by PCR from the JMP1394 vector with primers each containing an Agel restriction site (F_AGE1_tefred, R_AGE1_tefred, Table 2).
  • the PCR fragment thus comprises the sequence of RedStar2 flanked by the pTEF promoter and a terminator. This fragment is ligated after digestion with Agel in the Agel digested and dephosphorylated JMP1226 vector, thus giving the vector JMP190.
  • the orientation of the integration was verified by PCR with two pairs of external and internal primers (61TEFstart, For_in_Dsred , uraup_1226, leudown_1226; Table 2).
  • This vector contains the zeta platform, the auxotrophic marker LEU2 and a unique Agel restriction site, all surrounded by upstream and downstream URA3 sequences for integration into the genome at the URA3 locus by homologous recombination (Lazar et al., 2013). .
  • the pTEF-RedStar2-term fragment is located between the URA3 upstream sequence and the LEU2 marker.
  • the expression cassette extracted from the vector by NotI digestion was used to transform the Po1 d strain.
  • the upstream and downstream sequences of URA3 allow integration into the URA3 locus in the genome by double crossing over.
  • the URA3 gene was previously inactive by integration of the S. cerevisiae SUC2 gene (Nicaud et al., 1989).
  • the integration of the cassette replaces the remaining ura3 sequences and the SUC2 gene with the construct corresponding to the pTEF-RedStar2-LEU2-Zeta platform (see Figure 3B).
  • Transformants were screened for leukine prototrophy, Red fluorescence and the inability to grow on sucrose caused by removal of the SUC2 expression cassette in Po1d.
  • JMY2566 The transformant strain thus obtained was designated JMY2566. Integration into the URA3 locus was verified by PCR on genomic DNA with two pairs of external and internal primers (Puraextver, RED2_no_skl, VerZetasens, Turaextver, Table 2). JMY2566 shows the same growth as the W29 wild strain on YNB. Construction of control strains
  • the open reading sequences eYFP, RedStar2, SUC2, and XPR2 were amplified by PCR from the JMP91 1 and JMP1394 vector DNAs (Kabran et al., 2012), W29 genomic DNA, and JMP1 62 vector DNA, respectively (Lazar, et al., 201 3), with primers for introducing attb sites at each end of the PCR product (Attb1-gene name, Attb2-gene name, listed in FIG. Table 2). Each PCR fragment was then cloned into pDONR207 (I nvitrogen) using the Gateway® BP Clonase TM following the manufacturer's instructions and then transformed into E. coli strain Mach1 T1.
  • the PCRs were performed on colonies of Y. lipolytica lysed by 10 ⁇ l of 0.2 N NaOH and incubated in the thermocycler for 5 minutes at 99 ° C.
  • the primers used for this verification were ATTR2zetaup and Turadown (Table 2).
  • the ATTR2zetaup primer has two possible hybridization sites. In the absence of integration with the platform, the PCR gives a band of 2680 bp, whereas in the presence of an integration, the PCR gives a band of 1052 bp (see Figures 3B and 1 C). These primers thus make it possible to detect both negative and positive signals.
  • the "forward" ATTR2zetaup primer can hybridize upstream of the LEU2 gene, which would lead to the amplification of a fragment larger than 4 Kb, depending on the size of the insert.
  • the expression cassettes were transformed into the Y. lipolytica strains by following the miniaturized protocols adapted to the 96 well plate format which are described below.
  • the following transformation methods are performed in 96-well rigid plates, and the incubations are done in a thermocycler.
  • the following protocols are modifications of the lithium acetate (LiAC) method (Chen, et al., 1997, Le Dali, et al., 1994).
  • Protocol 1 is based on the use of a commercial buffer (YLEX Expression Kit, Yeastern Biotech Co., Ltd.). The cells are streaked on boxes of YPD and incubated for 20 to 24 h at 28 ° C. The cells are then scraped from the surface of the agar plate, washed in TE buffer and centrifuged at 3000 rpm at room temperature for 5 minutes. minutes. For 100 single transformations, approximately 5.10 9 cells are resuspended in 10 ml of complete YLOS buffer (Yeastern Biotech) comprising 9.5 ml of YLOS buffer (described in Chen et al., One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.
  • 3 ⁇ l of linearized vector DNA ( ⁇ 50 ng) are added to 100 ⁇ l of cells resuspended in full YLOS buffer in 96-well plate for PCR and incubated at 39 ° C for 60 minutes.
  • the cells are plated directly on a minimal solid YNB selection medium. Protocol 2 is based on the standard LiAC method.
  • the cells are streaked on YPD plates and incubated for 20 to 24 hours at 28 ° C.
  • the cells are scraped from the surface of the agar plate, washed in 15 ml of TE buffer and centrifuged at room temperature. 3000 rpm at room temperature for 5 minutes. The cells are resuspended in 10 ml of 0.1 M LiAC pH 6 and incubated for 1 hour at 28 ° C to obtain competent cells. The cells are centrifuged at 2000 rpm at room temperature for 2 minutes and resuspended in 1 ml 0.1 M LiAC pH 6. Ten microliters of cells are then transferred to 96-well PCR plates, gently mixed with 3 ⁇ l of DNA.
  • Protease activity is measured using the Fluorescein thiocarbamoyl-Casein substrate (FTC-Thermo-Scientific casein). 50 ⁇ l of culture supernatant (diluted 1/5) are incubated with 50 ⁇ FTC-casein (5 ⁇ g / ml in 50 mM phosphate buffer pH 6.8). Fluorescence and cell density were measured every 1 min for 1 h in a microplate reader (Biotek) with an excitation wavelength at 494 nm and an emission wavelength at 517 nm for fluorescence. V max is expressed as relative fluorescence per minute (RFU / min).
  • Protein Quantification Proteins are quantified by Bradford from a standard range of BSA with increasing concentrations ranging from 0 to 2000 ⁇ g / mL (Thermo Scientific: Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit). The colorimetric reading is performed on a spectrophotometer at a wavelength of 595 nm.
  • SDS Gel Page Proteins are recovered from the culture medium supernatant after centrifugation for 10 minutes at 4500 rpm at 4 ° C. Each protein extract is then concentrated 20 times on Amicon Ultra 0.5ml column (Millipore ref: UFC501096). The concentrated protein extracts are denatured by heating for 5 minutes at 95 ° C. in loading buffer (Invitrogen NuPAGE LDS Sample Buffer 4x) and then deposited on Novex polyacrylamide gel 4-12% or 10% Tris-Glycine (Life Technologies ref: EC6035BOX or EC60752BOX).
  • Protein migration is carried out in a XCell SureLock tank (Novex ref: EI0001) for 5 minutes at 180 volts and 40 minutes at 1 30 volts (Apelex PS304 II generator).
  • the gels are then stained for 30 minutes with Coomassie blue (0.2 g Coomassie blue, 30 mL methanol, 6.67 mL acetic acid and 30 mL H 2 O) and washed with Destain buffer (700 mL H 2 O, 200 mL). mL ethanol, 100 mL acetic acid) until observation of the protein bands.
  • the activity of the Aspergillus niger glucoamylase enzyme (AEE60909.1) is measured by enzymatic degradation of the starch.
  • a gelled medium was made with 1% agar (PASTAGAR B BioRad) and 2% starch (soluble starch P.A. Prolabo) in a petri dish.
  • PASTAGAR B BioRad 1% agar
  • starch soluble starch P.A. Prolabo
  • Xylanase Activity Assay The activity of Aspergillus niger xylanase XlnC enzyme (strain CBS51 3.88 / FGSC A1 51 3) is measured from the Thermo Scientific EnzChek ® Ultra Xylanase Assay Kit Kit. The analysis is carried out in 96-well plate (Greiner cellstar F-bottom) by mixing 5 ⁇ of culture supernatant (dilution range from 1 to 20), 45 ⁇ of reaction buffer buffer of the kit and 25 ⁇ of substrate. component A ".
  • the plate is then incubated for 90 minutes at room temperature and the fluorescence is measured every minute with the microplate reader (Bioteck) at the excitation wavelength of 360 nm and an emission wavelength of 460 nm.
  • the enzymatic activity V max is expressed as relative fluorescence per minute (RFU / min).
  • Fluorescence microscopy The microscopy images are made with a Zeiss lmager.M2 microscope equipped with a 120 C HXP lamp and filters to visualize the fluorescence of the protein. eYFP (46-YFP filter) and Redstar2 protein (45-Texasred filter; http: //www.zeiss.com).
  • Gateway® overexpression vector for Y. lipolytica In order to take advantage of the Gateway® system, a destination vector for overexpression in Y. lipolytica compatible with this cloning methodology was constructed.
  • the Gateway® cloning system allows in vitro cloning with high efficiency based on recombination and does not require restriction enzymes (Walhout et al., 2000).
  • the ampicillin resistance gene and pBR322 origin of the Invitrogen pDEST Gateway® vectors were used with the expression cassette of the JMP62 expression vector for Y. lipolytica in which the Gateway® recombination cassette was has been integrated into the cloning site (see materials and methods).
  • a vector has been obtained that includes the ampicillin resistance marker, the excisable URA3 auxotrophy marker and the Gateway® cloning site between the pTEF promoter and the LIP2 terminator.
  • the expression cassette is surrounded by zeta sequences that allow recombination into the yeast genome after excision by digestion with NotI or Iceul ( Figure 3A). Both restriction sites can be used to provide flexibility to the system if sites for either restriction enzyme are present in the cloned gene.
  • This vector makes it possible to clone PCR-amplified genes to which Attb sequences have been added or cDNAs cloned in a Gateway® pDONR vector by simple recombination at the Gateway® cloning site to give the Y. lipolytica specific overexpression vectors and containing the gene of interest ( Figure 3A).
  • a strain was constructed that contains a zeta platform that allows specific integration at a specific locus by simple crossing over with the zeta sequences present in the expression cassettes (Bordes, et al., 2007), so as to avoid integrations. in the genome.
  • Most strains of Y. lipolytica are derived from an original auxotrophic mutant ura "wherein the S. cerevisiae invertase has been introduced at the URA3 locus.
  • a host platform zeta targeting the ura3 locus was built. Previous construction has been replaced, resulting in strain JMY2033 (Lazar, et al., 2013). This deletion completely removes all URA3 sequences in the genome, eliminating the possibility of ura3 conversion.
  • Y. lipolytica is usually grown in media based on a fatty acid emulsion. Such media are opaque, which prevents the cell density from being directly estimated by measuring the optical density since the cells must be washed several times.
  • a reporter gene coding an activity that is measurable and proportional to the cell density of the culture.
  • the fluorescent protein RedStar2 was used as a reporter under the control of the constitutive pTEF promoter.
  • strains of Y. lipolytica are not naturally capable of assimilating sucrose.
  • overexpression of S. cerevisiae invertase SUC2 in the recipient strain is expected to provide the ability to grow on sucrose.
  • the SUC2 overexpressing strain JMY2815 grows on sucrose as well as on glucose, whereas the wild strain can not grow on this carbon source, as expected.
  • the use of a strain that constitutively expresses a fluorescent protein makes it possible to monitor the growth of the cells even in opaque media such as those based on skimmed milk, fatty acid emulsions, molasses or any substrate that interferes with the transmission. of light and therefore prevents the measurement of optical density.
  • the control strain JMY2810 was used to show that the intensity of the fluorescence is proportional to the optical density in a translucent medium.
  • Figure 5A shows an example of XPR2-expressing and non-expressing strains in a skimmed milk medium (opaque medium) in which the OD 6 oo can not be measured.
  • XPR2 clearly confers an advantage over skimmed milk medium over a deleted strain for this protease.
  • the Gateway cloning strategy allows you to create a large number of vectors. As a result, an efficient method of high throughput transformation of Y. lipolytica is required.
  • protocol 1 produced 2.2.10 3 transformants per ⁇ of DNA
  • protocol 2 gave 1, 3.10 3 transformants per ⁇ of DNA.
  • the transformation rate seems better with Protocol 1 in one step ( Figure 6).
  • the one-step protocol without DTT resulted in an extremely small number of transformants and was not studied further. Strain-related differences appeared during these tests, regardless of the protocol used.
  • JMY2033 gives twice as many transformants as JMY2566 which itself gives twice as many transformants as JMY2101. These differences have been observed both with protocol 1 and with 2.
  • these two protocols adapted to 96-well microplates make it possible to obtain good conversion rates and are easy to implement.
  • Strains JMY2033 and JMY2566 have the peculiarity of having a zeta home platform that allows specific integration to the zeta locus.
  • the proportion of specific integrations and random integrations in each of these two strains was tested for each of the two transformation methods described above. Both types of integration were differentiated using a PCR test (see “Materials and Methods" section). This test does not eliminate the possibility of double integration; however, we have never detected a case of integration with the locus associated with random integration.
  • the integration at the locus was evaluated in 389 transformants out of the 708 obtained with each of the two strains JMY2033 and JMY2566 and the two plasmids tested.
  • protocol 1 Such a specific integration is observed in 82.5% of the transformants obtained with protocol 2 but only with 17.3% for protocol 1 (FIG. 6). This marked difference is probably due to the presence of DTT in Protocol 1. He is known in effect that it improves the efficiency of transformation but increases in return the non-specific integration. Those skilled in the art will therefore favor protocol 1 when the number of transformants is greater than the specific integration at a given locus. This type of situation occurs when all the transformants are screened for the same phenotype or activity, without the transformants being individually characterized. On the other hand, if it is important for the integration to take place at a given locus, for example to avoid nonspecific expression, those skilled in the art will use protocol 2.
  • strain JMY2566 (xpr2) was transformed according to protocol 1 by the vector JMP1603 which makes it possible to overexpress protease XPR2. This is a good reporter because its overexpression is easily measurable.
  • RedStar2 is directed by different promoters
  • JMP1 394 vector containing the LEU2 selection marker Table 3
  • Derivatives of these vectors for expressing Aspergillus niger glucoamylase were obtained by replacing the RedStar2 coding region with the BamH I -Avr1 fragment from the JME2928 vector (Ledesma-Amaro et al., 201 5). .
  • the expression vectors obtained are described in Table 2; JME3769 (2UAS1 -pTEF), JME3770 (3UAS1 -pTEF), JME3771 (4UAS1 -pTEF), JME3772 (8UAS1 -pTEF), JME3773 (Hp4d) and JME3774 (Hp8d).
  • Expression cassettes of glucoamylase under the control of different promoters were introduced into strain JMY330.
  • the strains expressing GA obtained are described in Table 2. They are JMY5083 (pTEF-GA), JMY5771 (2UAS1-pTEF-GA), JMY5774 (3UAS1-pTEF-GA), JMY5777 (4UAS1-pTEF-GA), respectively.
  • JMY5780 (8UAS1 -pTEF-GA), JMY5783 (Hp4d-GA) and JMY5785 (Hp8d-GA).
  • Expression of the glucoamylase at 72 h in YNB medium was studied either by analysis of the secreted proteins in the culture medium by SDS PAGE gel (FIG. 11A), or by assaying the proteins by the Bradford method (FIG. 10). and by box activity test ( Figure 12). There is an increase in the production of GA depending on the promoter strength, 8UAS1 -pTEF and Hp8d promoters to obtain the highest amounts of protein.
  • JMY4407 pTEF-Pepl
  • JMY5802 (2UAS1-pTEF-Pepl)
  • JMY5804 (3UAS1-pTEF-Pepl)
  • JMY5806 (4UAS1 -pTEF-Pepl, respectively).
  • JMY5808 (8UAS1 -pTEF-Pepl)
  • JMY5810 Hp4d-Pepl
  • JMY5812 Hp8d-Pepl.
  • the expression of PepI at 48h in YNB medium was studied by analysis of secreted proteins in the culture medium by SDS PAGE gel (FIG. 11B) and by Bradford method assay of proteins (FIG. 10). It is observed that for this protein the best production is obtained with the 2UAS1 -pTEF and Hp8d promoters (FIG. 11B and FIG. 10).
  • the expression vectors obtained are described in Table 2; JME3096 (2UAS1 -pTEF-XlnC), JME3097 (3UAS1-pTEF-XlnC), JME3098 (4UAS1-pTEF-XlnC), JME3099 (8UAS1-pTEF-XlnC), JME3100 (Hp4d-XlnC) and JME3101 (Hp8d-XlnC).
  • Expression cassettes of xylanase under the control of different promoters were introduced into strain JMY330.
  • the strains expressing XlnC obtained are described in Table 2.
  • JMY4639 pTEF-XlnC
  • JMY5310 (2 UAS1-pTEF-XlnC)
  • JMY5312 (3 UAS1-pTEF-XlnC)
  • JMY5314 (4 UAS1-pTEF-XlnC)
  • JMY5316 (8 UAS1-pTEF-XlnC)
  • JMY5318 Hp4d-XlnC
  • JMY5320 Hp8d-XlnC.
  • the expression of the xylanase at 72 h in YNB medium was studied either by analysis of the secreted proteins in the culture medium by SDS PAGE gel (FIG. 11C), or by assaying the proteins by the Bradford method (FIG. 10).
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Abstract

L'invention porte sur un ensemble d'outils et de mèthodes permettant de générer aisèment et rapidement un grand nombre de vecteurs d'expression pour exprimer des protèines d'intèrêt dans les levures olèagineuses, notamment Yarrowia lipolytica.

Description

KITS DE CRIBLAGE ET D'EXPRESSION DE PROTEINES CHEZ LA LEVURE YARROWIA
LIPOLYTICA
INTRODUCTION L'optimisation de l'expression des gènes hétérologues est d'une grande importance pour la production industrielle de protéines pour des applications pharmaceutiques ou techniques. Les protéines recombinantes forment une part toujours plus grande des produits biologiques commercialisés. Elles sont utilisées dans un nombre toujours croissant d'applications, depuis le traitement de l'hémophilie jusqu'aux immunothérapies anticancéreuses les plus récentes.
Les systèmes d'expression utilisant la levure combinent la facilité de manipulation et la croissance des organismes unicellulaires avec les modifications post- traductionnelles des eucaryotes. Les levures non conventionnelles ont été utilisées pour produire des protéines hétérologues comme alternative à Saccharomyces cerevisiae (Dominguez et al. , 1998), notamment pour la levure Yarrowia lipolytica (Nicaud et al. , 2002, Madzak et al., 2004).
Parmi ces levures, Yarrowia lipolytica fournit une plate-forme d'expression attrayante (Nicaud, 2012). Elle possède plusieurs avantages pour produire des protéines hétérologues par rapport à d'autres levures (Madzak et al. , 2004). Tout d'abord, c'est une levure non pathogène capable de croître sur des substrats variés. Son génome a été complètement séquencé (Dujon et al. , 2004). Plusieurs procédés utilisant celle-ci ont ainsi été classifiés GRAS (generally recognized as safe) par la FDA. Elle est d'ailleurs devenue récemment un microorganisme majeur pour la production et la bioconversion de lipides (Beopoulos et ai , 201 1 , Blazeck et ai , 2014, Coelho et al. , 2010). En outre, Y. lipolytica est dotée naturellement une forte capacité sécrétoire.
De nombreux outils de génétique et de biologie moléculaires sont à la disposition de l'homme du métier pour exprimer des protéines dans Y. lipolytica. En particulier, des cassettes d'expression épisomales ou intégratives ont été construites. Plusieurs promoteurs, constitutifs ou inductibles (TEF, hp4d, promoteur hybride, TEF-hp4d etc.), permettent d'exprimer des protéines hétérologues avec des niveaux d'expression plus ou moins importants. Ces promoteurs peuvent être associés avec différents marqueurs de sélection (URA3, LEU2, ADE2, LYS5, etc.) pour transformer des souches réceptrices.
De nombreuses méthodes de transformations ont été mises au point (Gaillardin et ai, 1985 ; Barth and Gaillardin, 1996 ; Davidow et ai, 1985 ; Chen et ai, 1997, Xuan et al., 1988 ; Barth and Gaillardin, 1996). A l'heure actuelle, la méthode de transformation à l'acétate de lithium est la plus utilisée, que ce soit pour inactiver des gènes endogènes ou pour transformer des cassettes d'expression (Le Dali et al., 1994).
Grâce au développement d'outils d'automatisation et des approches génomiques fonctionnelles, des méthodes de criblage haut débit de grandes collections de souches ont été mises au point (Bordes, et ai, 2007, Mauersberger, et al., 2001 , Neuveglise et ai, 1998). Cependant, les études de surexpression systématique d'un grand nombre de phases ouvertes de lecture, comme par exemple toutes les phases ouvertes d'un génome, nécessitent de créer un grand nombre de vecteurs différents. En effet, certaines souches peuvent ne présenter qu'un nombre restreint d'auxotrophies. Si les gènes d'intérêt sont dans un vecteur qui ne porte pas de marqueur compatible avec ces souches, il faut recloner tous ces gènes dans un autre vecteur. D'autre part, il est connu qu'une expression trop forte de certains gènes hétérologues peut être toxique dans la levure (Le Dali et al., 1994 ; Ogrydziak et Nicaud 2012). Pour éviter cela, il faut disposer d'une batterie de vecteurs dans lesquels le gène d'intérêt est contrôlé par différents promoteurs, chacun permettant d'exprimer la protéine d'intérêt à un niveau plus ou moins élevé.
Les études de génomique fonctionnelle nécessitent donc de créer un grand nombre de vecteurs et ce, pour pouvoir tester l'expression de chaque phase ouverte de lecture dans plusieurs souches et avec plusieurs niveaux d'expression. Or cette étape de construction de vecteurs d'expression nécessite beaucoup de temps et de travail par rapport à l'étape d'analyse proprement dite. De fait, si on veut utiliser différent marqueurs ou différent promoteurs, cela nécessite des clonages dans les différents vecteurs, mais pas nécessairement avec les même enzymes de restriction. En outre, quand il s'agit de transformer le grand nombre de vecteurs différents ainsi obtenus, les méthodes de transformation actuelles sont rapidement limitantes. Par exemple, si on veut obtenir des souches de production avec différents niveaux de production, il faut transformer la souche receveuse avec chacun des différents vecteurs, sélectionner les transformants et tester les niveaux de production individuellement. Le temps et le travail nécessités par cette étape sont sans commune mesure avec l'analyse proprement dite.
Il existe donc un besoin pour des outils permettant de construire et d'analyser un grand nombre de clones rapidement.
DESCRIPTION
Les inventeurs ont mis au point un ensemble d'outils et de méthodes pour pouvoir générer aisément et rapidement un grand nombre de vecteurs d'expression permettant d'exprimer des protéines d'intérêt dans les levures oléagineuses, notamment Yarrowia lipolytica.
Ils ont ainsi mis au point un système d'expression de protéines dans les levures oléagineuses, notamment Yarrowia lipolytica, basé sur un groupe de vecteurs donneur et accepteurs. Dans ce système, il n'est besoin que de simples recombinaisons pour générer un groupe de vecteurs d'expression portant différentes cassettes d'expression d'un gène d'intérêt et différents marqueurs de sélection. Contrairement aux techniques de l'art antérieur, il n'y a pas ici besoin de recourir à des sous-clonages longs et délicats pour créer chacun de ces différents vecteurs. En outre, les inventeurs ont montré que l'expression de la protéine d'intérêt dépend à la fois du promoteur et du gène d'intérêt. Le système d'expression de l'invention est donc particulièrement avantageux, car il permet donc d'obtenir rapidement un ensemble de cassettes d'expression portant toutes le même gène d'intérêt et ainsi de tester aisément plusieurs niveaux d'expression de celui-ci grâce aux différents promoteurs. En outre, chaque cassette d'expression peut facilement être introduite dans des souches variées de levure, grâce aux différents marqueurs de sélection portés.
On entend au sens de la présente invention par le terme « levure » les souches de levure en général, c'est-à-dire que ce terme comprend, entre autres, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp. , Hansenula polymorpha, Schizzosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindnerï), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp. , Klu veromyces sp. , Kluyveromyces lactis, Candida albicans.
Les levures préférées au sens de l'invention sont les levures oléagineuses (Ratledge, in : Ratledge C, Wilkinson SG editors, Microbial lipids, Vol 2. London : Académie press 1988). Le terme «oléagineux» désigne les organismes qui ont tendance à stocker leur source d'énergie sous la forme d'huile (Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2nd Ed., Plénum, 1980). Plus précisément, une « levure oléagineuse » selon l'invention est une levure qui peut faire de l'huile. Les levures oléagineuses les plus connues incluent les genres Candida, Cryptoccocus, Rhodotorula, Rhizopus, Trichosporon, Lypomyces, Yarrowia. Les levures particulièrement préférées au sens de l'invention comprennent Yarrowia lipolytica, Rhodotura glutinis et Rhodosporidium toruloides. Une levure préférée au sens de la présente invention est Yarrowia lipolytica.
Le terme « vecteur », tel qu'utilisé ici, désigne une molécule d'acide nucléique capable de transporter une autre molécule d'acide nucléique à laquelle elle a été liée. Les vecteurs utiles dans l'invention comprennent, mais ne sont pas limités aux plasmides, phagemides, virus, ainsi que tout autre véhicule dérivé de source virale ou bactérienne qui a été manipulé par insertion ou incorporation d'une ou plusieurs séquences d'acides nucléiques d'intérêt. Certains vecteurs sont capables de réplication autonome dans la levure oléagineuse, par exemple Y. lipolytica, dans laquelle ils sont introduits : ce sont des « vecteurs épisomaux ». De tels vecteurs contiennent les éléments nécessaires au maintien et à la réplication dudit vecteur dans la cellule, y compris un centromère (Vernis, L. , et al. , 1997) et une origine de réplication (Fournier, et al. , 1991 ; Matsuoka et al. , 1993). D'autres vecteurs sont dits « intégratifs », car ils peuvent être intégrés dans le génome d'une levure oléagineuse après introduction dans la cellule, et sont ainsi répliqués avec le génome de l'hôte.
Plus préférablement, le vecteur de l'invention est un vecteur d'expression. Le terme « vecteur d'expression » tel qu'utilisé ici désigne une séquence d'ADN capable de diriger l'expression d'une séquence nucléotidique particulière à laquelle ledit vecteur d'expression est lié de manière fonctionnelle, dans la cellule hôte appropriée. Avantageusement, le vecteur d'expression de l'invention est fonctionnel dans les levures oléagineuses, notamment Y. lipolytica, c'est-à-dire que ledit vecteur d'expression est capable de diriger la transcription de l'acide nucléique d'intérêt dans des levures oléagineuses, dont Y. lipolytica en particulier. Plus avantageusement, le vecteur d'expression de l'invention comprend une « cassette d'expression », à savoir une séquence nucléotidique codant une protéine d'intérêt, liée de manière fonctionnelle à des séquences régulatrices telles que, par exemple, des séquences promotrices et/ou des séquences de terminaison de transcription. La présente invention fournit dans un premier aspect un couple de vecteurs qui permet de générer un vecteur d'expression d'intérêt par simple recombinaison. Plus précisément, l'invention a pour objet un couple de vecteurs, dans lequel le premier vecteur est le vecteur donneur et le second vecteur le vecteur accepteur. Le vecteur donneur est un vecteur dans lequel le polynucléotide d'intérêt est cloné dans une première étape, tandis que le vecteur accepteur est un vecteur dans lequel ledit polynucléotide d'intérêt est ensuite transféré par recombinaison. Le polynucléotide peut ainsi être transféré de façon simple et efficace d'un vecteur à l'autre sans utiliser d'enzymes de restriction.
Pour cela, le premier et le second vecteur comprennent préférablement des sites de recombinaison. En particulier, chacun des vecteurs donneur et accepteur de l'invention porte donc des sites de recombinaison, les sites de recombinaison présents sur le vecteur donneur permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur. Par « site de recombinaison », on entend ici, une section discrète d'une molécule d'acide nucléique qui est reconnue et liée par une ou des protéines de recombinaison spécifique durant les phases initiales d'une réaction d'intégration ou d'excision. On entend ici par « protéine de recombinaison » ou « recombinase », une protéine qui est impliquée dans une réaction de recombinaison impliquant un ou plusieurs sites de recombinaison. Les protéines de recombinaison au sens de l'invention comprennent aussi bien les protéines permettant l'intégration d'un polynucléotide dans un autre que celles permettant l'excision dudit polynucléotide. Ce sont aussi bien des tyrosine recombinases que des sérine recombinases. Les protéines de recombinaison sont aussi bien des protéines sauvages que des protéines mutantes ou des fragments desdites protéines, ou encore des variants de celles-ci. De tels sites de recombinaison sont présents dans des génomes de phages, comme les phages λ ou P1 , de plasmides, comme le plasmide de S. cerevisiae 2μ, ou encore de transposon, comme les transposons Tn3 et γδ, et sont bien connus de l'homme du métier (voir par exemple Landy, 1993) Parmi les sites de recombinaison les plus connus, on citera notamment les séquences attB, attP, attL et attR. Les séquences attB et attP sont reconnues par l'enzyme recombinase (intégrase ou Int) pour permettre l'intégration du phage λ dans le chromosome de E. coli. Après intégration, le génome de λ est flanqué par des sites attL et attR. Ceux-ci sont générés par la recombinaison entre les séquences attB et attP, ce qui signifie que leurs séquences proviennent pour partie de attB et pour partie de attP. Les sites attL et attR ne peuvent pas recombiner entre eux sans l'aide de l'intégrase et l'excisionase (Xi) du phage, ainsi que des protéines Fis et IHF de f. coli.
Comme autres exemples de sites de recombinaison les plus connus, on mentionnera la séquence loxP de P1 qui est reconnue par la recombinase Cre et la séquence FRT de S. cerevisiae qui est reconnue par l'enzyme FLP.
De préférence, chaque vecteur comprend deux sites de recombinaison, les sites de recombinaison présents sur le vecteur donneur permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur. De préférence, ces sites de recombinaison sont mutés afin de ne pas recombiner avec un site ne présentant pas la même spécificité, comme par exemple un site sauvage. Par exemple, les sites attB et attP mutés (désignés respectivement attB1 et attP1 ) ne peuvent plus recombiner avec les sites sauvages attP et attB, respectivement. De même, les sites attL et attR mutés (désignés respectivement attL1 et attR1 ) ne peuvent plus recombiner avec les sites sauvages attL et attR, respectivement. Des sites de recombinaison mutés pour éliminer substantiellement toute recombinaison avec des sites ne présentant pas la même spécificité ont été décrits dans l'art antérieur (voir par exemple WO 96/40724A1 , WO 99/21977A1 , WO 00/ 12729A1 , WO 00/29000A1 , WO 00/52027A1 , WO 01 /42509A1 , WO 02/16594A2, WO 0246372A1 , WO 02/061034A2, WO 02/095055A2, WO 03/103600A2). Plus préférentiellement, les sites de recombinaison des vecteurs de l'invention sont choisis de telle sorte qu'un site de recombinaison d'un vecteur donneur ne pourra recombiner qu'avec un des deux sites du vecteur accepteur. Il ne pourra en particulier pas recombiner avec l'autre site de recombinaison du vecteur donneur ou l'autre site de recombinaison du vecteur accepteur. Cela permet, en choisissant habilement les sites de recombinaison des vecteurs donneur et accepteur(s), de générer des vecteurs portant un insert avec une orientation spécifique. Plus préférentiellement encore, les sites de recombinaison des vecteurs de l'invention sont choisis parmi attB1 , attB2, attP1 , attP2, attL1 , attL2, attR1 et attR2, dont les séquences respectives sont représentées par SEQ ID NO. 1 -8. Ces sites sont bien connus de l'homme du métier car ils ont été décrits fréquemment dans la littérature et sont couramment utilisés en laboratoire depuis plus de dix ans. Ces sites sont particulièrement intéressants du fait de leur spécificité : les sites attB1 ne réagissent qu'avec les sites attP1 , les sites attB2 ne réagissent qu'avec les sites attP2, les sites attl_1 ne réagissent qu'avec les sites attR1 et les sites attl_2 ne réagissent qu'avec les sites attR2. Toujours plus préférentiellement, un des deux vecteurs porte les séquences attl_1 et attl_2, tandis que l'autre porte les séquences attR1 et attR2.
Selon un mode de réalisation préféré, lesdits sites présents sur le vecteur donneur ne permettent la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur qu'après avoir préalablement subi une étape de recombinaison. En effet, l'homme du métier notera que la recombinaison entre deux sites de recombinaison peut permettre de générer de nouveaux sites de recombinaison. Ainsi, la recombinaison entre attB1 et attP1 génère un site attl_1 , tandis que la recombinaison entre attB2 et attP2 génère un site attl_2. Selon un mode de réalisation très préféré, un des deux vecteurs porte les séquences attB1 et attB2 ou les séquences attP1 et attP2, tandis que l'autre vecteur porte les séquences attR1 et attR2. Il est particulièrement avantageux que le vecteur donneur porte les séquences attB1 et attB2 ou les séquences attP1 et attP2, car cela permet le clonage du gène d'intérêt par simple recombinaison. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, lesdits sites présents sur le vecteur donneur ne permettent la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur qu'après avoir préalablement subi une étape de recombinaison avec des sites de recombinaison présents sur le gène d'intérêt. Pour faciliter le clonage du polynucléotide d'intérêt, le vecteur donneur peut aussi contenir une multiplicité de sites de clonage, chacun étant spécifique d'une enzyme de restriction. Le polynucléotide peut ainsi être facilement cloné dans le vecteur donneur. De façon préférée, le gène d'intérêt est cloné dans une orientation telle qu'il se retrouve sous le contrôle des séquences régulatrices de transcription portées par le vecteur accepteur après recombinaison dans ce dernier. L'utilisation de deux enzymes de restriction pour cela permet un clonage directionnel, comme il est bien connu de l'homme du métier. De préférence, les sites de clonage multiples du vecteur donneur sont bordés de chaque côté par un site de recombinaison. I l peut être utile, pour sélectionner les vecteurs donneurs ayant inséré le polynucléotide d 'intérêt, de disposer d 'un marqueur de contre-sélection. Par « marqueur de contre-sélection », on entend ici un marqueur dont la présence sur ledit vecteur donneur est délétère dans certaines conditions et qui est destiné à être éliminé par un clonage réussi. Ce marqueur peut par exemple être un gène toxique pour les cellules dans lesquelles le produit de la réaction de clonage est introduit. Cette toxicité peut être causée directement par ledit gène, mais peut aussi être liée à un produit dudit gène. Les gènes toxiques sont bien connus dans le domaine : on citera par exemple les endonucléases de restriction (par exemple, Dpnl), les gènes liés à l'apoptose (par exemple, ASK1 ou des membres de la famille bcl-2 / ced-9 ), les gènes rétroviraux, notamment ceux du virus de l'immunodéficience humaine (VI H), les défensines, telles que NP-1 , les répétitions inversées ou les séquences appariées palindromiques, les gènes lytiques de bactériophages tels que ceux des bactériophages ΦΧ174 ou T4, les gènes de sensibilité aux antibiotiques tels que rpsL, les gènes de sensibilité aux antimicrobiens tels que pheS, des gènes tueurs de plasmides, des gènes de vecteur de transcription eucaryotes qui produisent un produit de gène toxique à des bactéries, tels que GATA-1 , et des gènes qui tuent les hôtes en l'absence d'une fonction de suppression, par exemple, kicB, ccdB, ΦΧ174 E (Liu et al, 1998), et d'autres gènes qui affectent négativement la stabilité et / ou la réplication d 'un réplicon.
De façon préférée, le gène toxique est le gène ccdB. Le gène ccdB fait partie de l'opéron ccd d 'f. coli avec le gène ccdA. La protéine CcdB est un inhibiteur de la topoisomérase I I bactérienne, dont l'activité est normalement contrée par son antidote CcdA. Dans le mode de réalisation préférée de l'invention, le vecteur donneur comprend le gène ccdB, mais pas le gène ccdA. Un vecteur porteur du gène ccdB permet donc une sélection positive des clones ayant intégré l'ADN d 'intérêt, ne laissant survivre dans le milieu de culture que les cellules ayant incorporé le nouveau gène. Les vecteurs portant le gène ccdB peuvent être maintenus en routine sur des souches bactériennes résistantes à la protéine CcdB. Par exemple, des souches exprimant la protéine CcdA permettent la réplication de tels vecteurs. Les souches résistantes à CcdB sont bien connues de l'homme du métier (voir par exemple Bernard, 1996). Certaines sont disponibles commercialement, comme par exemple les souches ccdB Survival et DB3.1 (Life Technologies, Carslbad, CA). Dans le vecteur donneur, le marqueur de contre-sélection, préférablement ccdB, est situé entre les sites de clonage multiples, c'est-à-dire entre les deux sites de recombinaison du vecteur donneur. Le clonage réussi du gène d'intérêt dans le vecteur donneur permet d'éliminer le marqueur de contre-sélection et d'obtenir un plasmide dans lequel le gène d'intérêt se retrouve entre les deux sites de recombinaison. Un tel plasmide peut maintenant se répliquer dans une souche bactérienne normalement sensible à ccdB, c'est-à-dire une souche dans laquelle l'expression de CcdB est létale.
De façon encore plus préférée, les vecteurs donneurs selon l'invention comprennent un second marqueur de contre-sélection. Ce second marqueur est contigu du premier, entre les sites de clonage multiples. Il permet de s'assurer que la perte du marqueur CcdB est bien liée à un clonage réussi : dans ce cas en effet, ledit second marqueur de contre-sélection est lui aussi éliminé. De préférence, ledit second marqueur de contre-sélection est un marqueur de résistance à un antibiotique. De façon plus préférée, ledit second marqueur de contre-sélection est le gène de résistance au chloramphénicol.
De préférence, le vecteur accepteur permet l'expression du gène d'intérêt dans la levure. Pour cela, il est avantageux que le vecteur accepteur contienne des séquences régulatrices qui permettent de contrôler cette expression. Préférablement, ces séquences régulatrices ne sont pas placées entre les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur : ainsi elles ne sont pas éliminées par recombinaison quand le gène d'intérêt est introduit dans le vecteur accepteur. Selon ce mode de réalisation, l'insertion du gène d'intérêt par recombinaison dans le vecteur accepteur met donc celui-ci sous le contrôle de ces séquences régulatrices et crée ainsi une cassette d'expression. Par « cassette d'expression », on entend ici un fragment d'ADN comprenant un polynucléotide d'intérêt lié de façon fonctionnelle à plusieurs éléments régulateurs contrôlant l'expression des séquences géniques, comme, par exemple, les séquences promotrices et les séquences terminatrices.
Par « séquences régulatrices » ou « éléments régulateurs », on entend ici des séquences polynucléotidiques qui sont nécessaires pour affecter l'expression et la maturation des séquences codantes auxquelles elles sont liées fonctionnellement. De telles séquences régulatrices comprennent les séquences d'initiation et de terminaison de la transcription, les séquences promotrices et les séquences « enhancer » ; les signaux de maturation efficace des ARN, comme les signaux d'épissage et de polyadénylation ; les séquences stabilisant les ARNm cytoplasmiques ; les séquences améliorant l'efficacité de la traduction (par exemple, les séquences de Kozak) ; les séquences qui augmentent la stabilité des protéines ; et, si nécessaire, des séquences qui augmentent la sécrétion des protéines.
De préférence, les séquences régulatrices de l'invention comprennent des séquences promotrices, c'est-à-dire que le gène d'intérêt est de préférence lié de façon fonctionnelle à un promoteur qui permet l'expression de l'ARNm correspondant. Un gène d'intérêt est de préférence lié de façon fonctionnelle à un promoteur quand il est situé en aval de ce dernier, formant ainsi une cassette d'expression.
Un polynucléotide est « lié de façon fonctionnelle » à des éléments régulateurs quand ces différentes séquences d'acides nucléiques sont associées sur un seul fragment d'acide nucléique de telle façon que la fonction de l'une est affectée par les autres. Par exemple, une séquence d'ADN régulatrice est « liée de façon fonctionnelle » à une séquence d'ADN codant un ARN ou une protéine si les deux séquences sont situées de telle façon que la séquence d'ADN régulatrice affecte l'expression de la séquence d'ADN codante (autrement dit, que la séquence d'ADN codante soit sous le contrôle transcriptionnel du promoteur). Les séquences codantes peuvent être liées de façon fonctionnelle à des séquences régulatrices aussi bien dans une orientation sens que dans une orientation antisens. Préférablement, les séquences codantes de l'invention sont liées de façon fonctionnelle aux séquences régulatrices dans l'orientation sens.
On entend ici par « promoteur » une séquence nucléotidique, le plus souvent située en amont (5') de la séquence codante, qui est reconnue par l'ARN polymérase et les autres facteurs nécessaires pour la transcription, et ainsi contrôle l'expression de ladite séquence codante. Un « promoteur » tel qu'on l'entend ici comprend en particulier les promoteurs minimaux, c'est-à-dire de courtes séquences d'ADN composées d'une boite TATA et d'autres séquences qui permettent de spécifier le site de démarrage de la transcription. Un « promoteur » au sens de l'invention comprend aussi des séquences nucléotidiques incluant un promoteur minimal et des éléments régulateurs capables de contrôler l'expression d'une séquence codantes. Par exemple, les séquences promotrices de l'invention peuvent contenir des séquences régulatrices comme des séquences « enhancer » pouvant influencer le niveau d'expression d'un gène.
Avantageusement, les promoteurs selon l'invention sont ceux qui fonctionnent dans les cellules de l'organisme d'intérêt. Par exemple, plusieurs promoteurs sont connus pour fonctionner dans les levures oléagineuses et, en particulier, dans Y. lipolytica. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, l'expression de la protéine d'intérêt est contrôlée par un promoteur qui fonctionne dans les levures oléagineuses, notamment dans Y. lipolytica.
De telles séquences promotrices sont bien connues de l'homme du métier et peuvent correspondre notamment à des promoteurs inductibles ou constitutifs. A titre d'exemple de promoteurs utilisables dans le procédé selon l'invention, on peut citer notamment le promoteur d'un gène de Y. lipolytica qui est fortement réprimé par le glucose et qui est inductible par les acides gras ou les triglycérides tel que le promoteur POX2 du gène de l'acyl CoA oxydase 2 de Yarrowia lipolytica et le promoteur du gène LIP2 décrit dans la demande PCT WO 01 /83773. On peut aussi utiliser le promoteur du gène FBA1 du gène de la fructose-bisphosphate aldolase (US 202,356), le promoteur du gène de la phosphoglycerate mutase GPM (WO 2006/0019297, US 259,255, US 7,459,456), le promoteur du gène YAT1 du gène du transporteur de l'ammonium (US 2006/0094102 A1 ), le promoteur du gène EXP1 codant une protéine d'export (US 7,932,077), le promoteur du gène GPAT du gène de la glycérol-3-phosphate O-acyltransferase (US 7,264,949), le promoteur du gène GPDIN du gène de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (US 7,459,546), le promoteur du gène TEF (Muller et ai , 1998 ; US 6,265,185), le promoteur hybride hp4d (WO 96/41889), les promoteurs hybrides XPR2 décrits dans Madzak et al. (2000) ou encore les promoteurs hybride UAS1 -TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS et UAStef-TEF décrits dans Blazeck et al. (2001 1 , 2013, 2014). Dans un mode de réalisation préféré, le promoteur porté par le vecteur accepteur est choisi parmi les promoteurs POX2, LIP2, FBA1, GPM, YAT1, EXP1, GPAT, GPDIN, TEF hp4d, XPR2, UAS1 -TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS et UAStef-TEF. Comme indiqué plus haut, il est avantageux que le promoteur porté par le vecteur accepteur soit placé à l'extérieur des sites de recombinaison dudit vecteur. Préférablement, ledit promoteur est orienté de façon à diriger la transcription d'un gène d'intérêt inséré entre lesdits sites de recombinaison. Selon un autre mode de réalisation, les séquences régulatrices de l'invention comprennent des séquences de terminaison de la transcription. Les « séquences de terminaison », appelées aussi « terminateurs », telles qu'on les entend ici, sont des régions situées en 3' d'une séquence codante dont elles régulent la terminaison de la transcription et qui en outre confèrent la stabilité au transcrit.
De telles séquences terminatrices sont également bien connues de l'homme du métier et on peut citer, à titre d 'exemple de séquences terminatrices utilisables dans le procédé selon l'invention, la séquence terminatrice du gène PGK1, la séquence terminatrice du gène LIP2 décrit dans la demande PCT WO 01 /83773. Selon ce mode de réalisation, la cassette d'expression de l'invention comprend donc un terminateur choisi parmi la séquence terminatrice du gène PGK1, la séquence terminatrice du gène LIP2, la séquence terminatrice du gène XPR2, la séquence terminatrice du gène CYC1, ou un terminateur synthétique décrit par Alper et collaborateurs (Curran et al, 2014). Comme indiqué plus haut, il est avantageux que les séquences terminatrices portées par le vecteur accepteur soient placées à l'extérieur des sites de recombinaison dudit vecteur. Préférablement, lesdites séquences terminatrices sont orientées de façon à pouvoir arrêter la transcription d 'un gène d'intérêt inséré entre lesdits sites de recombinaison. De façon plus préférée, lesdites séquences régulatrices comprennent des séquences promotrices et des séquences terminatrices, les unes et les autres placées à l'extérieur des sites de recombinaison, lesdites séquences promotrices étant orientées de façon à diriger la transcription d 'un gène d'intérêt inséré entre lesdits sites de recombinaison et lesdites séquences terminatrices étant orientées de façon à pouvoir arrêter la transcription dudit gène d 'intérêt.
De préférence, les séquences promotrices et terminatrices utilisées appartiennent à des gènes différents de manière à minimiser les risques de recombinaison non désirée dans le génome de la souche de Yarrowia.
Selon le mode de réalisation le plus préféré, les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur sont encadrés par des séquences promotrices et terminatrices, lesdites séquences promotrices étant orientées de façon à diriger la transcription d'un gène d 'intérêt inséré entre lesdits sites de recombinaison et lesdites séquences terminatrices étant orientées de façon à pouvoir arrêter la transcription dudit gène d'intérêt.
En vue de permettre l'expression de ces gènes d'intérêt, différentes technologies ont été développées, lesquelles ont en commun d'utiliser des vecteurs dits « intégratifs » qui permettent l'insertion d'un segment d'ADN portant le gène d'intérêt dans l'ADN chromosomique, lequel gène d'intérêt est exprimé par la suite.
Les vecteurs accepteurs de l'invention sont de préférence des vecteurs intégratifs.
Parmi les séquences de Y. lipolytica utilisées pour la construction de vecteurs intégratifs, on citera notamment les séquences dénommées : « séquences zeta », qui correspondent aux LRT (longues répétitions terminales) du rétrotransposon Yltl de Y. lipolytica. Ces séquences ont été décrites par Schmid-Berger et al. (1994) qui indiquent qu'elles sont présentes en un grand nombre de copies (environ 35 copies du rétrotransposon complet, et environ 30 copies de la séquence zeta isolée) dans l'ADN chromosomique de certaines souches de Y. lipolytica. Les cassettes d'expression peuvent ainsi être intégrées à des locations aléatoires dans le génome à l'aide de ces répétitions terminales Zeta (Mauersberger et al. , 2001 ), lesquelles bordent habituellement les cassettes d'expression utilisées dans le domaine. Plus récemment, une plateforme d'intégration (désignée ci-après une « plateforme d'accueil zeta ») comprenant des séquences zeta dans laquelle il est possible d'intégrer des gènes par un ou deux événements de recombinaison a été mise au point dans des souches dépourvues du rétrotransposon (Bordes et ai , 2007 ; Juretzek et ai , 2001 ; WO 00/012729 ; WO 2009/098263). Lorsque des vecteurs portant des inserts flanqués de séquences zeta sont utilisés pour transformer des cellules de levures oléagineuses, notamment Y. lipolytica, contenant dans son génome une telle plateforme d'accueil zeta, l'ADN de l'insert s'intègre très préférentiellement dans le génome au niveau de ces séquences. Dans ce cas, une seule copie est intégrée.
De façon préférée, les séquences zeta flanquent les deux sites de recombinaison homologue portés par le vecteur accepteur, de façon à ce qu'après recombinaison, le gène d'intérêt se retrouve entre lesdites séquences zeta et puisse être intégré sur le chromosome. De façon plus préférée, lesdites séquences zeta encadrent non seulement les sites de recombinaison, mais aussi les séquences régulatrices portées par le vecteur accepteur. Cela permet ainsi d'exprimer le gène d'intérêt après qu'il a été intégré par recombinaison dans le chromosome. De façon particulièrement préférée, les séquences zeta sont encadrées par des sites de restriction rares, c'est-à-dire des sites qui ne surviennent que rarement dans le génome : une enzyme dont le site de reconnaissance est de 7 nucléotides ne coupe l'ADN que toutes les 47 pb (16 384 pb), et une dont le site consiste en 8-nucléotides ne coupe que toutes les 48 pb (65,536 pb). De tels sites sont utilisés pour libérer un insert linéaire bordés par les séquences zeta sans risque de coupure à l'intérieur dudit insert. I ls sont bien connus de l'homme du métier. I ls peuvent être naturels ou synthétiques. On citera par exemple les sites des enzymes Notl , Sfil , Pmel , Pacl , Ascl et l -Ceul . On notera en outre qu'il peut être avantageux de pouvoir identifier facilement les transformants, c'est-à-dire les cellules qui auront reçu et intégré l'insert dans leur génome. Les vecteurs accepteurs selon l'invention portent préférentiellement un marqueur de sélection qui permet ainsi de sélectionner les levures ayant intégré dans leurs chromosomes l'insert portant ledit marqueur de sélection. Avantageusement, le marqueur de sélection est situé entre les séquences zeta du vecteur accepteur, préférentiellement en contiguïté avec la cassette d 'expression d'intérêt, de façon à pouvoir être intégré dans le génome avec celle-ci. Les marqueurs de sélection qui peuvent être utilisés dans les vecteurs accepteurs sont des marqueurs d'auxotrophie ou des marqueurs de résistance. Les marqueurs de sélection permettant la complémentation d 'une auxotrophie, également communément appelés marqueurs d 'auxotrophie, sont bien connus de l'homme du métier. Selon l'invention, il est possible d'utiliser toute méthode de sélection connue de l'art antérieur compatible avec le gène (ou les gènes) marqueur(s) utilisés, toute souche exprimant le gène marqueur choisi étant potentiellement une souche de levure défective dans les gènes ADE2, URA3, LEU2 ou LYS5.
Le marqueur de sélection URA3 est bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de Y. lipolytica dont le gène URA3 (ladite séquence est aussi accessible par le numéro d'accession YALI0E26719g à l'adresse www.genolevures.orpJ ou a l'adresse http: / /gryc.inra.fr/ ), codant l'orotidine-5'- phosphate décarboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en uracile. L'intégration du marqueur de sélection URA3 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu dépourvu d 'uracile.
Le marqueur de sélection LEU2 décrit notamment dans le brevet US 4,937, 189 est également bien connu de l'homme du métier. Plus spécifiquement, une souche de Y. lipolytica dont le gène LEU2 (YALI0E26719g), codant la β-isopropylmalate déshydrogénase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en leucine. Comme précédemment. L'intégration du marqueur de sélection LEU2 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en leucine.
Le marqueur de sélection ADE2 est également bien connu de l'homme du métier dans le domaine de la transformation de la levure. Une souche de Yarrowia dont le gène ADE2 (YALI0B23188g), codant la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en adénine. Là encore, l'intégration du marqueur de sélection ADE2 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en adénine.
Le marqueur de sélection LYS5 est également bien connu de l'homme du métier dans le domaine de la transformation de la levure. Une souche de Yarrowia dont le gène LYS5 (YALI0B1 5444g), codant la saccharopine déhydrogènase, est inactivé (par exemple par délétion), ne sera pas capable de pousser sur un milieu non supplémenté en lysine. Là encore, l'intégration du marqueur de sélection LYS5 dans cette souche de Y. lipolytica permettra alors de restaurer la croissance de cette souche sur un milieu non supplémenté en lysine (Xuan et al, 1990).
Parmi les gènes de résistance qui pourront être utilisés comme marqueur de sélection pour conférer à la souche de levure oléagineuse, notamment de Yarrowia, un phénotype présentant un caractère dominant, on peut citer :
Le gène MDR3 originaire de la souris code pour la P-glycoprotéine et, lorsqu'il est exprimé dans une souche de Yarrowia, confère une résistance au FK520, un agent antifongique et immunosuppresseur (Raymond et al. , 1994).
Le module KanMX, qui contient la séquence kanr issue du transposon Tn903 d'Escherichia coli fusionnée aux séquences transcriptionnelles du gène TEF du champignon filamenteux Ashbya gossypii, ou à tout promoteur et terminateur de transcription fonctionnels, confère à une souche de Yarrowia la résistance à la généticine (G418 ; Wach et al., 1994).
Le gène hph (HYG), originaire d'un plasmide d'Escherichia coli, permet la résistance à l'hygromycineB (Gritz & Davies, 1983 ; Fickers et al. , 2003 ;
Cordero Otero & Gaillairdin, 1996).
Le gène Tn5ble, issu de Escherichia coli, permet à la levure transformée d'acquérir une résistance à la phléomycine (Gaillardin & Ribet, 1987 ; Wenzel et ai , 1992). D'autres marqueurs de sélection utilisables dans le procédé selon l'invention sont également décrits par Barth & Gaillardin (The dimoorphic fungus Yarrowia lipolytica. In : Non conventional yeasts in biotechnology (Wolf K. Ed.). Springer-Verlag, Berlin, pages 313-388, 1996).
Selon un mode de réalisation préféré selon l'invention, le marqueur de sélection du vecteur accepteur est encadré par des séquences permettant son excision après l'intégration ciblée dudit vecteur recombinant.
Ce même marqueur de sélection, notamment un marqueur d'auxotrophie, peut alors être réutilisé pour une autre intégration ciblée lors d'une nouvelle étape de transformation. De telles séquences permettant l'excision et l'élimination, chez une souche de Yarrowia, d'une séquence encadrée sont bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, on peut citer l'utilisation de deux séquences identiques ou similaires, dites séquences répétées directes (SRD), en vue d'obtenir un événement de recombinaison comme décrit dans le brevet EP 0 994 192 B1 ou dans le brevet EP 0 635 574 B1 .
A titre d'exemple, on peut également citer le système « Cre-lox » tel que décrit dans le brevet EP 0 220 009 B1 , dans lequel les séquences équivalentes aux séquences répétées directes sont dans ce cas des séquences spécifiques dites « lox » et l'excision de la séquence d'ADN comprise entre les deux séquences « lox » s'effectue en présence d'une recombinase « Cre » exprimée par un vecteur d'expression. D'autres systèmes équivalents et utilisant d'autres recombinases spécifiques sont également connus de l'homme du métier notamment le procédé décrit dans le brevet EP 081 165 B1 .
De façon plus préférée, donc, le marqueur de sélection dans la levure, optionnellement lui-même flanqué de sites permettant son excision, sera situé, ainsi que les deux sites de recombinaison eux-mêmes bordés par les séquences régulatrices, entre les deux séquences zeta portées par le vecteur accepteur.
L'invention a plus particulièrement pour objet un groupe de vecteurs, comprenant un vecteur donneur et au moins un vecteur accepteur, dans lequel :
• ledit vecteur donneur comprend deux site de recombinaison choisis parmi attB1 , attB2, attP1 , attP2, attl_1 , attl_2, attR1 et attR2, lesdits sites de recombinaison flanquant au moins un marqueur de contre-sélection ; et
• ledit vecteur accepteur comprend un insert bordé de séquences zeta, ledit insert comprenant :
o deux sites de recombinaison choisis parmi attB1 , attB2, attP1 , attP2, attl_1 , attl_2, attR1 et attR2, lesdits sites de recombinaison encadrant des séquences régulatrices permettant l'expression de protéines dans les levures oléagineuses, et
o un marqueur de sélection de levure oléagineuse ; les sites de recombinaison présents sur le vecteur donneur permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur. Selon un mode de réalisation préféré, lesdits sites présents sur le vecteur donneur ne permettent la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur qu'après avoir préalablement subi une étape de recombinaison.
Il est clair que les différents promoteurs, terminateurs et marqueurs de sélection peuvent être facilement combinés par l'homme du métier. En effet, il est tout à fait à la portée de l'homme du métier de construire, sur la base des indications données plus haut, et à l'aide de techniques de base de biologie moléculaire, les différents vecteurs accepteurs contenant les différentes combinaisons de promoteurs, terminateurs et marqueurs de sélection, ainsi que les deux sites de recombinaison encadrant optionnellement un ou deux marqueurs de contre-sélection.
Par « au moins un vecteur accepteur », on entend ici un vecteur accepteur ou plus d'un vecteur accepteur. Dans ce cas, le nombre de vecteurs accepteurs est supérieur ou égal à 2, préférablement à 3, préférablement à 4, préférablement à 5, préférablement à 6, préférablement à 7, préférablement à 8, préférablement à 9, préférablement à 10, préférablement à 1 1 , plus préférablement à 12. Les différents vecteurs accepteurs se distinguent alors avantageusement par les séquences régulatrices et/ou par le marqueur de sélection qu'ils portent. Autrement dit, chaque vecteur accepteur porte alors une combinaison unique de séquences régulatrices et de marqueur de sélection. Une « combinaison unique » signifie que ladite combinaison n 'est présente sur aucun des autres vecteurs accepteurs du groupe de vecteurs de l'invention. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention porte sur un groupe de vecteurs, ledit groupe comprenant un vecteur donneur et plusieurs vecteurs accepteurs, dans lequel chaque vecteur accepteur comprend un insert bordé de deux séquences zeta, ledit insert comprenant:
• un couple de sites de recombinaison choisis parmi attB1 , attB2, attP1 , attP2, attL1 , attL2, attR1 et attR2 ;
• un promoteur choisi parmi les promoteurs POX2, LIP2, FBA 1, GPM, YAT1, EXP1, GPAT, GPDIN, TEF hp4d, XPR2, UAS1 -TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS et UAStef-TEF, ledit promoteur étant situé à l'extérieur des deux sites de recombinaison et étant préférablement orienté de façon à contrôler l'expression d 'un gène situé entre ceux-ci ;
• un terminateur choisi parmi les terminateurs PGK1, LIP2, XPR2, CYC1, ledit terminateur étant situé à l'extérieur des deux sites de recombinaison et étant préférablement orienté de façon à arrêter l'expression d'un gène situé entre ceux-ci ;
· un marqueur de sélection choisi parmi les marqueurs d'auxotrophie et les marqueurs de résistance, le marqueur d 'auxotrophie étant choisi parmi ADE2, URA3, LEU2 et LYS5, et ledit marqueur de résistance étant choisi parmi MDR3, KanMX, hph (HYG ), et Tn5ble. les sites de recombinaison présents sur les vecteurs accepteurs permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur donneur. Selon un mode de réalisation préféré, lesdits sites présents sur le vecteur donneur ne permettent la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur qu'après avoir préalablement subi une étape de recombinaison. Préférablement, chaque vecteur accepteur ne diffère des autres vecteurs accepteurs dudit ensemble que par les séquences régulatrices et/ou par le marqueur de sélection qu'il porte. Spécifiquement, chaque vecteur accepteur peut se distinguer par le promoteur et/ou le terminateur qu'il contient. Autrement dit, chaque vecteur accepteur ne diffère des autres que par son promoteur et/ou par son terminateur et/ou par son marqueur de sélection. Un tel ensemble de vecteurs accepteurs est particulièrement avantageux car il permet de placer le gène d'intérêt sous le contrôle de n'importe quel promoteur et d'associer cette cassette d'expression avec n'importe quel marqueur. Il est donc possible de tester différents niveaux d'expression du gène d'intérêt, tout en transférant aisément la cassette d'expression d'une souche à l'autre.
Dans un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de construction d'au moins un vecteur d'expression d'un gène d'intérêt en utilisant un groupe de vecteurs décrits plus haut. Plus spécifiquement, le procédé de l'invention, comprenant des étapes de : a) clonage dudit gène d'intérêt dans le vecteur donneur, et b) clonage dudit gène d'intérêt par recombinaison entre le vecteur obtenu à l'étape a) et ledit vecteur accepteur.
Dans une première étape, le gène d'intérêt est introduit dans le vecteur donneur avant d'être transféré par recombinaison dans le vecteur accepteur dans une seconde étape.
Le gène d'intérêt peut être introduit par tout moyen connu de l'homme du métier dans le vecteur donneur. Des techniques pour insérer une séquence d'acide nucléique dans un vecteur sont bien connues dans le domaine technique et comprennent des procédés classiques comme ceux, par exemple, décrits dans Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Edition (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (2000)), Silhavy et al. (Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y. (1984)) et Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interscience (1987)). En bref, un vecteur donneur possède plusieurs sites de clonage, chacun ayant une spécificité pour un enzyme de restriction donné. Un acide nucléique codant un facteur de transcription peut être cloné en utilisant des enzymes de restriction et positionné dans une orientation compatible avec celle du promoteur et/ou terminateur de transcription du vecteur accepteur pour que le gène d'intérêt puisse être surexprimé après qu'il aura été transféré par recombinaison dans le vecteur accepteur. Une fois le gène d 'intérêt cloné dans le vecteur donneur, il peut être transféré dans un vecteur accepteur par recombinaison pour créer un vecteur d'expression.
Alternativement, il est possible d 'introduire le gène d'intérêt dans le vecteur donneur par recombinaison.
Tout d 'abord, le gène d 'intérêt est amplifié et des sites de recombinaison sont ajoutés à chacune de ses extrémités. Préférablement, lesdits sites de recombinaison sont attP1 et attP2. Selon un autre mode de réalisation préféré, lesdits sites de recombinaison sont attB1 et attB2. Selon un mode de réalisation préféré, les sites de recombinaison du vecteur donneur sont attB1 et attB2. Selon un autre mode de réalisation préféré, les sites de recombinaison du vecteur donneur sont attP1 et attP2. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les sites de recombinaison ajoutés aux extrémités du gène d 'intérêt sont attP1 et attP2, tandis que les sites de recombinaison du vecteur donneur sont attB1 et attB2. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les sites de recombinaison ajoutés aux extrémités du gène d 'intérêt sont attB1 et attB2, tandis que les sites de recombinaison du vecteur donneur sont attP1 et attP2.
Ensuite, le gène d 'intérêt porteur de sites de recombinaison est mis en contact avec le vecteur donneur porteur des sites de recombinaison appropriés et au moins une enzyme de recombinaison. Cette (ces) enzyme(s) est (sont) une (des) protéine(s) capable(s) de se lier aux acides nucléiques et de générer une recombinaison. Cette (ces) enzyme(s) est (sont) en particulier spécifique(s) des sites de recombinaison portés par le gène d'intérêt et le vecteur donneur. Notamment, quand ces sites sont choisis parmi attB1 , attB2, attP1 et attP2, il est avantageux d 'utiliser deux enzymes de recombinaison, c'est-à-dire l'intégrase du phage lambda, la protéine I HF de f. coli. Ces protéines sont bien connues de l'homme du métier. Des compositions comprenant ces protéines sont disponibles commercialement (Life Science).
Dans une deuxième étape, le gène d'intérêt est transféré du vecteur donneur dans au moins un vecteur accepteur par recombinaison. Pour cela, le vecteur donneur contenant ledit gène d'intérêt est mis en contact avec le vecteur accepteur et au moins une enzyme de recombinaison. Cette (ces) enzyme(s) est (sont) une (des) protéine(s) capable(s) de se lier aux acides nucléiques et de générer une recombinaison. Cette (ces) enzyme(s) est (sont) en particulier spécifique(s) des sites de recombinaison portés par le gène d'intérêt et le vecteur donneur. Notamment, quand ces sites sont choisis parmi attl_1 , attl_2, attR1 et attR2, il est avantageux d'utiliser trois enzymes de recombinaison, c'est-à-dire l'intégrase et l'excisionase du phage lambda, la protéine IHF de E. coli. Optionnellement, on peut en outre utiliser la protéine Fis de E. coli. Ces protéines sont bien connues de l'homme du métier. Des compositions comprenant ces protéines sont disponibles commercialement (Life Science). Le vecteur accepteur porteur du gène d'intérêt peut ensuite être identifié par tout moyen connu de l'homme du métier.
L'homme du métier choisira le vecteur accepteur selon ses besoins, comme par exemple le niveau d'expression désiré ou le type de marqueur de sélection. Le procédé de l'invention aboutira à la construction d'un vecteur d'expression dans lequel le gène d'intérêt est sous le contrôle des séquences régulatrices (promoteur et/ou terminateur) spécifiques du vecteur.
La cassette d'expression portée par le vecteur peut ensuite être intégrée dans le génome d'une cellule hôte de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica. L'intégration ciblée d'un gène dans le génome d'une levure est une technique de biologie moléculaire fréquemment utilisée par l'homme du métier, dont on se contentera de rappeler les principes. Dans cette technique, un fragment d'ADN linéaire portant la cassette d'expression de l'invention est introduit dans la cellule à transformer, lequel fragment d'ADN s'intègre alors par recombinaison homologue dans une région ciblée du génome receveur (Orr-Weaver et ai , 1981 ). De tels procédés de transformation sont bien connus de l'homme du métier et sont décrits, notamment, dans Ito et al. (1983), dans Klebe et al. (1983) et dans Gysler et al. (1990). Dans la mesure où cet événement de recombinaison est rare, des marqueurs de sélection sont insérés entre les séquences assurant la recombinaison afin de permettre, après transformation, d'isoler les cellules où l'intégration du fragment s'est produite par mise en évidence des marqueurs correspondant. Dans le cas présent, la digestion du vecteur accepteur par l'enzyme rare dont les sites sont situés de part et d'autre des séquences zeta libère un fragment d'acide nucléique linéaire bordé par les séquences zeta. Ce fragment comprend la cassette d'expression et un marqueur de sélection, dont la nature varie en fonction du vecteur accepteur. Comme expliqué plus haut, lorsque ce fragment portant la cassette d'expression est utilisé pour transformer une cellule de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica, contenant une plateforme d'accueil zeta, il s'intègre très préférentiellement dans le génome au niveau de cette plateforme. Dans ce cas, une seule copie est intégrée. Cela permet de contrôler précisément le niveau d'expression du gène d'intérêt. En revanche, quand la souche réceptrice ne contient pas une plateforme d'accueil zeta, mais plutôt de nombreuses copies du rétrotransposon Ylt1 , le fragment linéaire portant la cassette d'expression d'intérêt est intégré au hasard dans le chromosome de nombreuses fois. Une telle situation peut permettre d'atteindre des niveaux d'expression élevés et de surexprimer facilement la protéine d'intérêt.
L'homme du métier notera que la méthode de l'invention permet de construire aisément une banque de vecteurs d'expression comprenant le gène d'intérêt. Il suffit pour cela d'introduire le gène d'intérêt dans plusieurs vecteurs accepteurs par la méthode décrite ci-dessus. Dans ce mode de réalisation, le procédé de l'invention conduit à des vecteurs d'expression qui portent tous le gène d'intérêt, mais diffèrent entre eux par la nature des séquences régulatrices (par exemple, promoteur et/ou terminateur) et/ou par la nature du marqueur de sélection. Ces vecteurs comprennent en particulier tous des séquences zeta qui permettent l'intégration dans le génome de la cellule hôte. Après libération des cassettes d'expression, celles-ci sont transformées dans une souche réceptrice de Y. lipolytica et les transformants sont criblés.
Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci porte aussi sur un procédé de construction d'une banque de souches exprimant un gène d'intérêt, ledit procédé comprenant une étape de transformation par la banque d'expression comprenant le gène d'intérêt décrite plus haut.
Le procédé de l'invention comprend préférablement une étape préalable de libération de l'insert contenu dans le vecteur accepteur. Préférablement, cette libération s'obtient par digestion par au moins une enzyme rare. Encore plus préférablement, il s'agit la(les) dite(s) enzyme(s) rare(s) est(sont) choisie(s) parmi les enzymes rares dont les sites bordent les séquences zeta dans le vecteur accepteur. Toute méthode de transfert connue de l'art antérieur peut être utilisée pour introduire l'insert contenant la cassette d'expression de la protéine d'intérêt dans la souche de levure. Préférentiellement on pourra utiliser la méthode à l'acétate de lithium et au polyéthylène glycol (Gaillardin et ai, 1987 ; Le Dali et ai, 1994). De façon préférée, les cellules sont transformées par un protocole de transformation adapté au haut débit. En effet, les méthodes de l'art antérieur pour transformer des levures oléagineuses, et notamment les méthodes de transformation de Y. lipolytica, ne permettent que des transformations individuelles. Par exemple, ces protocoles nécessitent d'utiliser un tube de transformation par souche, ce qui rend difficile la transformation d'un grand nombre de souches en même temps. De telles méthodes ne sont donc pas adaptées aux contraintes liées au criblage d'une banque de vecteurs d'expression telle que celle décrite ici.
Il n'existe pas à ce jour de méthode permettant de transformer un grand nombre de souches de levures oléagineuses, par exemple de Y. lipolytica, en même temps. Or les inventeurs ont mis au point une méthode de transformation de levure oléagineuse à haut débit. Cette méthode permet de transformer simultanément un grand nombre de souches de levure, préférentiellement au moins 50, plus préférentiellement au moins 60, encore plus préférentiellement au moins 70, toujours plus préférentiellement au moins 80, le plus préférentiellement au moins 90. Elle permet en outre de travailler dans des microplaques de 96 puits, ce qui est un avantage
Dans un premier mode de réalisation, les cellules de levure en phase exponentielle sont incubées dans un tampon contenant 0,1 M LiAc à pH = 6 pendant au moins 30 minutes, préférablement pendant au moins 45 minutes, plus préférablement pendant au moins 60 minutes, à une température comprise entre 25° C et 30° C, préférentiellement à 28° C. Les cellules sont ensuite mises en contact avec l'acide nucléique à transformer, comme par exemple de l'acide nucléique de vecteur d'expression linéarisé, en présence d'acide nucléique entraîneur. Après incubation à une température comprise entre 25° C et 30° C, préférentiellement à 28° C, pendant un temps compris entre 10 et 20 minutes, préférentiellement pendant 10 minutes, deux volumes de tampon contenant du 40 % PEG et 0,1 M LiAc à pH = 6 sont ajoutés au mélange de cellules et d'acides nucléiques. Le mélange est incubé pendant au moins 30 minutes, préférablement pendant au moins 45 minutes, plus préférablement pendant au moins 60 minutes, à une température comprise entre 25° C et 30° C, préférentiellement à 28° C, avant d 'être transféré à une température d'au moins 37° C, préférablement au moins 38° C, plus préférablement au moins 39° C, pendant un temps compris entre 5 et 1 5 minutes, préférentiellement 10 minutes. Les cellules sont ensuite directement étalées sur milieu de sélection pour identifier les transformants.
L'homme du métier notera que selon la méthode de transformation utilisée et/ou la souche de levure qui aura été transformée, il sera donc possible d 'obtenir des transformants présentant une intégration non -spécifique, potentiellement en de multiples endroits du génome, ou une intégration à un locus donné, via la plateforme d'accueil zeta par exemple. La méthode de l'invention permet ainsi d 'obtenir des transformants avec différents niveaux d'expression en une étape.
Selon un autre aspect, l'invention a aussi pour objet une banque de cellules de levure obtenues par les méthodes décrites ci-dessus. Plus particulièrement, les cellules de ladite banque contiennent des cassettes d'expression d'un gène d 'intérêt qui ne diffèrent entre elles que par les séquences régulatrices qu'elles contiennent. Autrement dit, chaque cassette peut se distinguer d 'une autre par le promoteur ou le terminateur qu'elle contient, ou encore par les deux. Les cellules de ladite banque peuvent aussi se distinguer les unes des autres par la nature du marqueur de sélection associé à ladite cassette d'expression. Selon un mode de réalisation préféré, lesdites cellules se distinguent entre elles par leurs cassettes d 'expression et par le marqueur de sélection associé à ladite cassette.
Les différents transformants obtenus par la méthode de transformation à haut débit de l'invention peuvent être sélectionnés sur la base de l'expression de la protéine d'intérêt. Selon encore un autre aspect, l'invention a donc pour objet l'utilisation d 'une souche de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica, pour produire des protéines. Dans un aspect plus particulièrement préféré, l'invention a pour objet l'utilisation d'une souche de levure oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, dans laquelle une cassette d 'expression a été intégrée, ainsi que décrit plus haut, pour la production de protéines. Encore plus préférablement, l'invention a pour objet l'utilisation d 'une souche de levure oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, dans laquelle une cassette d 'expression a été intégrée, pour la production d 'une protéine codée par le gène d 'intérêt de la cassette d 'expression. Les gènes d'intérêt selon l'invention sont plus particulièrement des gènes dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire.
Parmi les gènes d'intérêt thérapeutique, on peut citer plus particulièrement les gènes codant des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc. (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc ; les apolipoprotéines : ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91 1 1947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII , IX, etc, les gènes suicides : thymidine kinase, cytosine désaminase, etc. ; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc. , voir par exemple WO 201 1 /089527), un ARN ligand (WO 91 /19813) etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.
Le gène d'intérêt peut aussi être un gène vaccinant, c'est-à-dire un gène codant un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation d'une souche de levure oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, dans laquelle une cassette d'expression a été intégrée au hasard, pour la production de protéines. Alternativement, l'invention a pour objet l'utilisation d'une souche de levure oléagineuse, préférablement une souche de Y. lipolytica, chez qui une cassette d'expression a été intégrée en un endroit spécifique du génome en une seule copie, pour la production de protéine. Dans un autre aspect, la présente invention a pour objet un procédé de production de protéines dans lequel : a) dans une première étape, on cultive une souche de levure transformée selon l'invention dans un milieu approprié et
b) dans une seconde étape on récolte les protéines produites par la culture de l'étape a).
En particulier, le procédé de l'invention permet de produire une protéine d 'intérêt. Comme indiqué plus haut, le choix judicieux de la méthode de transformation utilisée et/ou la souche de levure qui aura été transformée permettra d 'obtenir des transformants présentant une intégration non-spécifique, potentiellement en de multiples endroits du génome, ou une intégration à un locus donné, via la plateforme d'accueil zeta par exemple.
La croissance de la levure en milieu liquide se fait en plusieurs phases. Notamment, la phase exponentielle correspond à la phase de divisions actives des cellules de levure, c'est-à-dire à la phase durant laquelle le taux de croissance est le plus important. Durant la phase exponentielle, le nombre de cellules dans la culture de levure augmente rapidement. En revanche, le nombre de cellules de levure dans la culture reste constant durant la phase stationnaire, parce que les cellules ne se divisent plus ou parce qu'un équilibre entre les divisions et de mort cellulaire est atteint. Les milieux permettant la croissance des souches de levure oléagineuse, notamment de Y. lipolytica, sont bien connus de l'homme du métier. Celui-ci pourra donc déterminer sans difficulté le milieu de culture approprié pour chacune des souches de l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention permet de produire une protéine d'intérêt durant la phase exponentielle. Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention permet de produire une protéine hétérologue durant la phase stationnaire. Les protéines produites peuvent être ensuite purifiées à partir du milieu de culture ou à partir des extraits cellulaires. Elles peuvent être ensuite purifiées à l'aide de n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier, comme, par exemple, la chromatographie (échangeuse d'ion, d'affinité, par filtration sur gel, etc. ), centrifugation, solubilité différentielle ou par toute autre technique usuelle pour la purification de protéines. Les méthodes appropriées varieront selon la nature de la protéine à purifier, mais seront aisément identifiables par l'homme du métier.
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et Figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée.
LEGENDES DES FIGURES :
Fig. 1. Représentation schématique de la construction d'un vecteur d'expression à partir d'un vecteur donneur contenant un gène d'intérêt et d'un vecteur accepteur. Fig. 2. Représentation schématique de la construction d'une banque de vecteurs d'expression à partir d'un vecteur donneur contenant un gène d'intérêt et de multiples vecteurs accepteurs.
Fig 3. A) Représentation schématique de la structure de la cassette de surexpression gateway. B) Structure génomique de la plateforme Zeta au locus URA3. C) Structure génomique de la plateforme Zeta au locus URA3 après intégration d'une cassette de surexpression. Les tailles des produits de PCR pour la validation de 'intégration à la plateforme Zeta sont indiquées.
Fig 4. Validation du système de surexpression. A) Observation par microscopie à fluorescence de la surexpression de la eYFP dans une souche exprimant constitutivement la Redstar2 (JMY2812). B) Restauration de la formation des halos sur boites de milieu à base lait écrémé (phénotype de dégradation des protéines) d'une souche surexprimant la protéase XPR2 (JMY2813), comparée à une souche sauvage (WT) et à une souche témoin délétée de XPR2 (JMY2810). C) Croissance de la souche témoin et de la souche surexprimant SUC2 (JMY2815) sur saccharose. Fig. 5. Détermination de la croissance à l'aide la protéine fluorescente rapporteur Redstar2. A) Comparaison de l'intensité relative de fluorescence et de la densité optique à D06oo en milieu translucide (YNB 0,5 ou 0,25% glucose +0,1% extraits de levure) de la souche JMY2810. B) Mesure de la fluorescence relative des souches exprimant ou non XPR2 et exprimant la protéine fluorescente rapporteur Redstar2 en milieu opaque (YNBsm +YE 0,1%). Fig. 6. Taux de transformation des protocoles 1 et 2 et ratio d'intégration au locus Zeta par rapport aux intégrations au hasard.
Fig. 7. Distribution des Vmax (RFU/min) de l'activité protéase des 96 mutants surexprimant XPR2. L'activité protéase a été mesurée à l'aide de la FTC-caséine en microplaques à une longueur d'ondes d'excitation de 494 nm et une longueur d'ondes d'émission de 517 nm toutes les minutes pendant 1 h avec un lecteur de microplaques (Biotek). La Vmax est calculée avec une fenêtre glissante de 30 points. Le nombre de clones pour chaque gamme de Vmax est indiqué au dessus de chaque barre. Fig. 8. Expression de la protéine RedStar2 sous contrôle de différents promoteurs. Des vecteurs accepteurs dans lesquels le gène codant la protéine RedStar2 est sous le contrôle des promoteurs pTEF, Hp4d, Hp8d, 4UASpTEF et 8UASpTEF ont été construits et intégrés en une seule copie dans une souche de Y. lipolytica. Le niveau d'expression de la protéine est directement dépendant de la force du promoteur. Fig. 9. Représentation schématique de la construction des vecteurs d'expressions contenant les différents promoteurs et les différents gènes d'intérêt. Les vecteurs contiennent les promoteurs suivants ; le promoteur pTEF (pTEF), le promoteur pTEF avec deux copies d ' UASI (2UAS1 -pTEF), le promoteur pTEF avec trois copies d ' UASI (3UAS1 -pTEF), le promoteur pTEF avec quatre copies d' UASI (4UAS1 -pTEF), le promoteur pTEF avec huit copies d ' UASI (8UAS1 -pTEF), le promoteur hybride hp4d avec quatre copies d 'UASI (hp4d) et promoteur hybride avec huit copies d' UASI (hp8d). Chaque promoteur est contenu dans un fragment Clal -BamHI . Les vecteurs d'expression contiennent soit le marqueur d 'antibiotique de résistance à la kanamycine (KanR) et le marqueur de sélection LEU2 quand les vecteurs de clonage sont issus des vecteurs Redstart2, soit le marqueur d 'antibiotique de résistance à l'ampicilline (AmpR) et le marqueur de sélection URA3 quand les vecteurs de clonage sont issus des vecteurs contenant CmR+CcdB (Table 3). Les vecteurs d'expression contiennent différent gènes d'intérêts contenus dans un fragment BamHI -Avrl l ; le gène codant pour la protéine fluorescente ResStar2, et les protéines sécrétées la glucoamylase d 'aspergillus niger (glucoamylase), la protéase aspartique Pepl d'Aspergillus niger (Pepl ) et la xylanase XlnC d 'Aspergillus niger contenant la séquence de sécrétion de la lipase LI P2 de Y. lipolytica (pré-Lip2). Fig. 10. Quantification des protéines sécrétées dans le milieu extracellulaire par dosage au Bradford en fonction des différents promoteurs. Chaque échantillon est concentré 20 fois avant d'être dosé.
Fig. 1 1. Comparaison de la sécrétion de protéines dans le milieu de culture en fonction des différents promoteurs. A) Glucoamylase. B) Protéase aspartique Pepl. C) Xylanase XlnC. Chaque échantillon est concentré 20 fois puis analysé par électrophorèse en gel SDS Page.
Fig. 12. Test de l'activité enzymatique de la glucoamylase révélé sur boîte par dégagement gazeux de cristaux d'iode. Des vecteurs accepteurs dans lesquels le gène codant la glucoamylase est sous le contrôle des promoteurs pTEF, Hp4d, Hp8d, 2UAS1 -pTEF, 3UAS1 -pTEF, 4UAS1 -pTEF et 8UAS1 -pTEF ont été construits et intégrés en une seule copie dans une souche de Y. lipolytica. Le niveau d'expression de la protéine varie en fonction de la force du promoteur.
Fig. 13. Test d'activité de la xylanase XlnC mesurée à partir du kit EnzChek ® Ultra Xylanase Assay Kit Thermo-Scientific. Des vecteurs accepteurs dans lesquels le gène codant la protéine XlnC est sous le contrôle des promoteurs pTEF, Hp4d, Hp8d, 2UAS1 -pTEF, 3UAS1 -pTEF, 4UAS1 -pTEF et 8UAS1 -pTEF ont été construits et intégrés en une seule copie dans une souche de Y. lipolytica. Le niveau d'expression de la protéine varie en fonction de la force du promoteur.
EXEMPLES
Matériels et méthodes Souches et milieux
Les souches d'Escherichia coli TOP10 et DH5a (Invitrogen) ont été utilisées pour transformation et amplification des plasmides recombinants et ont été cultivées à 37° C sur milieu Luria-Bertani complémenté avec 50 μg/mL de kanamycine ou 100 μg/mL d'ampicilline selon que de besoin.
Les souches de Y. lipolytica utilisées dans cette étude sont dérivées de Po1 d et sont listées dans le tableau 1 . Les souches de levure sont habituellement cultivées sur milieu YPD (1 % (w/v) extraits de levure, 1 % (w/v) Bacto Peptone, 1 % (w/v) glucose), celui-ci étant additionné de 1 ,5% (w/v) agar pour obtenir du milieu solide le cas échéant. Les transformants URA+ sont sélectionnés après incubation à 28° C sur milieu minimal YNB (0,17% (w/v) de Yeast Nitrogen Base sans ammonium et sans acides aminés, 0,5% (w/v) de chlorure d'ammonium, 1 % (w/v) glucose, 1 ,5% (w/v) agar, 50mM tampon phosphate pH 6,8). D'autres milieux minimaux ont été utilisés en fonction des différentes sources de carbone : YNBsuc (YNB avec 0,5% saccharose au lieu de glucose), YNBoa (YNB avec 0,5% acide oléique au lieu de glucose) or YNBsm (YNB avec 1 ,6% de lait écrémé au lieu de glucose).
Tableau 1 : Souches de Y. lipolytica, souches de E. coli et vecteurs utilisés dans cette étude.
Souches Y. lipolytica Génotype Références
M/4 Ta ura3-302 leu2-270 xpr2-322 (pXPR2- Barth and Gaillardin (Barth
JMY195 (Po1 d)
SUC2 au locus URA3) and Gaillardin, 1996)
Lazar et al. (Lazar et al. , JMY2033 MATa ura3::LEU2ex-Zeta leu2-270 xpr2-322
2013)
Barth and Gaillardin (Barth JMY2101 MATa ura3-302 xpr2-322+pXPR2-SUC2
and Gaillardin, 1996) Verbeke et al. (Verbeke et JMY2394 MATa leu2-270 um3-302 xpr2-32 AKu70
al. , 2012)
MATa um3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta
JMY2566 Ce travail
leu2-270 xpr2-322
MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY2810 Ce travail
URA3ex-pTEF leu2-270 xpr2-322
MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY281 1 Ce travail
URA3ex-pTEF-RedStar2 leu2-270 xpr2-322
MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY2812 Ce travail
URA3ex-pTEF-eYFP leu2-270 xpr2-322
MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY2813 Ce travail
URA3ex-pTEF-XPR2 leu2-270 xpr2-322
MATa ura3::pTEF-RedStar2-LEU2ex-Zeta- JMY2815 Ce travail
URA3ex-pTEF-SUC2 leu2-270 xpr2-322
Zeta-LEU2ex-pTEF-RedStar2 leu2-270 um3- JMY4488 Ce travail
302 xpr2-322 AKu70
Zeta-LEU2ex-Hp4d-RedStar2 leu2-270 um3- JMY4490 Ce travail
302 xpr2-322 AKu70
Zeta-LEU2ex-4UAS1-pTEF-RedStar2 leu2-270
JMY4491 Ce travail
ura3-302 xpr2-322 AKu70
Zeta-LEU2ex-Hp8d-RedStar2 leu2-270 um3- JMY4493 Ce travail
302 xpr2-322 AKu70
Zeta-LEU2ex-8UAS-pTEF-RedStar2 leu2-270
JMY4727 Ce travail
ura3-302 xpr2-322 AKu70
Bordes et al. (Bordes et al. , JMY1212 MATa ura3-302, ALip2, ALip7, ALip8
2007)
MATa um3-302 pTEF-XlnC-URA3ex-ALip2,
JMY4639 Ce travail
ALip7, ALip8
JMY5310 MATa leu2-270 2UAS1-pTEF-XlnC-LEU2ex Ce travail
JMY5312 MATa leu2-270 3UAS1-pTEF-XlnC-LEU2ex Ce travail JMY531 MATa leu2-270 4UAS1-pTEF-XlnC-LEU2ex Ce travail
JMY5316 MATa leu2-270 8UAS1-pTEF-XlnC-LEU2ex Ce travail
JMY5318 MATa leu2-270 Hp4d-XlnC-LEU2ex Ce travail
JMY5320 MATa leu2-270 Hp8d-XlnC-LEU2ex Ce travail
MATa (intégration URA3 et LEU2 aux locus
JMY2900 Ref?
respectifs)
Ledesma-Amaro et al.
JMY5083 MATa leu2-270 pTEF-Glucoamylase- LEU2ex (Ledesma-Amaro et al. ,
2015)
MATa leu2-270 2UAS1-pTEF-Glucoamylase-
JMY5771 Ce travail
LEU2ex
MATa leu2-270 3UAS1-pTEF-Glucoamylase- JMY5774 Ce travail
LEU2ex
MATa ieu2-270 4UAS1-pTEF-Glucoamylase- JMY5777 Ce travail
LEU2ex
MATa leu2-270 8UAS1-pTEF-Glucoamylase- JMY5780 Ce travail
LEU2ex
JMY5783 MATa leu2-270 Hp4d-Glucoamylase- LEU2ex Ce travail
JMY5785 MATa leu2-270 Hp8d-Glucoamylase- LEU2ex Ce travail
MATa ura3-302 pTEF-Pepl-URA3ex-ALip2,
JMY4407 Ce travail
ALip7, ALip8
MATa um3-302 2UAS1-pTEF-Pepl-URA3ex- J Y5802 Ce travail
ALip2, Δϋρ7, Δϋρ8
MATa ura3-302 3UAS1-pTEF-Pepl-URA3ex- JMY5804 Ce travail
ALip2, ALip7, ALip8
MATa um3-302 4UAS1-pTEF-Pepl-URA3ex- JMY5806 Ce travail
ALip2, ALip7, ALip8
MATa ura3-302 8UAS1-pTEF-Pepl-URA3ex- JMY5808 Ce travail
ALip2, ALip7, ALip8
MATa ura3-302 Hp4d-Pepl-URA3ex-ALip2,
JMY5810 Ce travail
ALip7, ALip8
MATa ura3-302 Hp8d-Pepl-URA3ex-ALip2,
JMY5812 Ce travail
ALip7, ALip8
Souches E. coli Plasmide Génotype Références
KanR PTura3- Lazar et al. (Lazar, et al. ,
JME1226 JMP1226
LEU2ex-Zeta 2013)
JMP1226 pTEf-
JME1490 JMP1490 Ce travail
RedStar2
JMP62 pTEF
JME1521 JMP1521 URA3ex AmpR et Ce travail
ORI de PBR322
JMP1521 -cassette
JME1529 JMP1529 Ce travail
ccdB Gateway
JME1592 JMP1592 pDONR207-XPR2 Ce travail JME1593 JMP1593 pDONR207-SUC2 Ce travail JME1594 JMP1594 pDONR207-eYFP Ce travail
pDONR207-
JME1595 JMP1595 Ce travail
RedStar2
JME1598 JMP1598 JMP1529-SUC2 Ce travail JME1599 JMP1599 JMP1529-eYFP Ce travail JME1600 JMP1600 JMP1529-RedStar2 Ce travail JME1603 JMP1603 JMP1529-XPR2 Ce travail
JMP62 LEU2ex- Dulermo et al. (Dulermo et
JME1 27 JMP1427
pTEF-YFP al. , 2013) JMP62 LEU2ex Kabran et al. (Kabran, et JME1394 JMP1394
pTEF-RedStar2 al. , 2012) JMP62 URA3ex- Lazar et al. (Lazar, et al. , JME1 69 JMP1469
pTEF-SUC2 2013)
Gateway
JME1030 PDEST14 Invitrogen®
Destination vector
Gateway Donor
JME1488 PDONR207 Invitrogen®
vector
JMP1046 pTEF- JME2603 JMP2603 Ce travail
XlnC
JMP2482
JME3096 JMP3096 Ce travail
2UAS1 pTEF-XlnC
JMP2484
JME3097 JMP3097 Ce travail
3UAS1 pTEF-XlnC
JMP2397
JME3098 JMP3098 Ce travail
4UAS1 pTEF-XlnC
JMP2607
JME3099 JMP3099 Ce travail
8UAS1 pTEF-XlnC
JMP2471 Hp4d- JME3100 JMP3100 Ce travail
XlnC
JMP2473 Hp8d- JME3101 JMP3101 Ce travail
XlnC
JMP1046 pTEF- JME2529 JMP2529 Ce travail
Pepl
JMP3258
JME3679 JMP3679 Ce travail
2UAS1 pTEF-Pepl
JMP3273
JME3680 JMP3680 Ce travail
3UAS1 pTEF-Pepl JMP3052
JME3682 JMP3682 Ce travail
4UAS1 pTEF-Pepl
JMP3048
JME3684 JMP3684 Ce travail
8UAS1 pTEF-Pepl
JMP3275 Hp4d-
JME3685 JMP3685 Ce travail
Pepl
JMP3050 Hp8d-
JME3687 JMP3687 Ce travail
Pepl
JMP1046 pTEF-
JME2928 JMP2928 Ce travail
Glucoamylase
JMP3258
JME3769 JMP3769 2UAS1 pTEF- Ce travail
Glucoamylase
JMP3273
JME3770 JMP3770 3UAS1 pTEF- Ce travail
Glucoamylase
JMP3052
JME3771 JMP3771 Ce travail
4UAS1 pTEF-Pepl
Glucoamylase
JME3772 JMP3772 8UAS1 pTEF- Ce travail
Glucoamylase
JMP3275 Hp4d-
JME3773 JMP3773 Ce travail
Glucoamylase
JMP3050 Hp8d-
JME3774 JMP3774 Ce travail
Glucoamylase
Croissance en microplaques 96 puits
Les cultures en microplaques de 96 puits ont été réalisées comme suit, sauf quand des spécificités sont mentionnées. Les précultures sont réalisées en plaques de 96 puits en YPD pendant 48 h. Les cellules sont ensuite inoculées à environ 0,1 à D06oo dans 200 μΐ de milieu de culture. Les puits à la périphérie de la plaque sont remplis d'eau afin d'éviter l'évaporation des puits de culture. La D06oo est lue toutes les 20 minutes pendant 48h dans un lecteur de microplaque Biotek Synergy MX (http: / / www, biotek. corn ) pendant que la plaque est maintenue à 28 C sous agitation constante. En milieu opaque, la croissance est suivie à l'aide de la protéine rapporteuse fluorescente RedStar2 en utilisant une longueur d'ondes d'excitation de 545 nm et une longueur d'ondes d'émission de 585 nm avec le même équipement et les mêmes conditions que ci -dessus.
Construction des vecteurs et des souches
Construction des vecteurs de destination Gateway
Un fragment de pBR322 contenant l'origine de réplication ori et le gène de résistance à l'ampicilline a été amplifié à partir de pDEST14 (Invitrogen) à l'aide des amorces PBRup et PBRdown (Tableau 2). Ces deux amorces comportent deux sites de restriction Notl et Iceul. Après digestion par NotH et purification, le fragment déphosphorylé a été ligaturé avec le fragment Notl purifié du dérivé JMP1047 de JMP62 qui contient la cassette d'expression Not/-zeta-URA3ex-pTef-term-zeta-Not/. Le vecteur résultant JMP1521 a été vérifié par digestion et séquençage.
Tableau 2 : Oligonucléotides utilisés dans cette étude
Nom Séquence
F_AGE1 _tefred CGCACCGGTAATCGATAGAGACCGGGTTG
R_AGE1_tefred GGTGACCGGTCGATTTGTCTTAGAGGAACG
61 TEFstart TCCCCGAATTACCTTTCCTC
For_in_Dsred ACCCAGCTGACATTCCAGAC
uraup_1226 GGTTGGCCGACAACAATATC
leudown_1226 GCCCTCCAAGATGAATGGTA
Puraextver CCTGCGCAAAACATTGTATG
RED2_no_skl TG GTG CCTAG G CTG CTTACAAG AACAAGTG GTGTCTACC
VerZetasens CGAGTAACACTCGCTCTGGAGAGTTAGTCATCC
Turaextver TG CTG G CTTTACGTTGTCAG
pbrup CGCGCGGCCGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAACATCATCAGTAACCC
GTATCGTGAGC
pbrdown CGCGCGGCCGCTTCGCTACCTTAGGACCGTTATAGTTACGGTCAGGTGGCACTTT
TCGGGGAAAT
bgl2_gate_plus CGCAGATCTATCACAAGTTTGTACAAAAAA
gate_avr2_plus G GTG CCTAG G ATCACCACTTTGTACAAG AAA
Attb1 -Redstar2 G G G G AC AAGTTTGTAC AAAAAAG CAG G CTATG AGTG CTTCTTCTG AAG A Attb2-Redstar2 G G G G ACCACTTTGTACAAG AAAG CTG G GTCTTACAAG AACAAGTG GTGTC
Attbl -eYFP G G G G AC AAGTTTGTAC AAAAAAG CAG G CTATG GTGAGCAAGGGCGAGGA Attb2-eYFP GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC Attbl -SUC2 G G G G AC AAGTTTGTAC AAAAAAG CAG G CTATG CTTTTG CAAG CTTTCC GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATTTTACTTCCCTTACTTGG G G G G AC AAGTTTGTAC AAAAAAG CAG G CTATG AAG CTCG CTACCG CCTT GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAATGCCAACACCGTTGTAG TG ATCCTAG G GTGTCTGTG G TCTTCTGCCTCCAGGAAGTC
La cassette Gateway (attR1 -ccdb-chloramphénicol-attR2) qui permet la recombinaison à l'aide de la clonase Gateway® , a été amplifiée par PCR à partir de pDEST1 (Invitrogen) avec les amorces bgl2_gate_plus et gate_Avr2_plus (Tableau 2), en ajoutant des sites de restriction Bglll and Avril qui permettent de cloner dans JMP1 521 entre promoteur et le terminateur. Le fragment purifié Bglll-Avrll a été cloné dans le vecteur JMP1 521 digéré par BamHI et Avril. Le vecteur ainsi obtenu JMP1 529 a été partiellement séquencé pour vérifier la construction (Figure 1 ). Un ensemble de vecteurs accepteurs avec différent promoteurs a été construit par digestion Clal -BamHI du vecteur JMP1 529, et l'élimination du fragment Clal -BamHI contenant le promoteur pTEF et le remplacement par un fragment Clal -BamHI portant des promoteurs de force variable (Tableau 3). Des vecteurs d'expression pourront être construits à partir d'un vecteur donneur Gateway contenant un gène d'intérêt pour construire des vecteurs d'expression avec différent promoteurs (Figure 2). D'une manière similaire, des vecteurs d'expression de la RedStar2 sous différents promoteurs ont été construits à partir du vecteur JMP1 394 contenant le marqueur de sélection LEU2 (Tableau 3).
Tableau 3 : Vecteurs accepteurs possédant différents promoteurs et vecteurs d'expression de la RedStar2 sous différents promoteurs.
Figure imgf000036_0001
JMP3258 2UAS-pTEF Lip2 U RA3ex AmpR CmR+CcdB 7205
JMP3273 3UAS-pTEF Lip2 U RA3ex AmpR CmR+CcdB 7314
JMP3052 4UAS-pTEF Lip2 U RA3ex AmpR CmR+CcdB 7423
JMP3048 8UAS-pTEF Lip2 U RA3ex AmpR CmR+CcdB 7858
Construction de la souche receveuse pour une intégration à un locus spécifique et l'expression constitutive d'une protéine fluorescente rapporteuse.
La cassette pTEF-RedStar2-term a été amplifiée par PCR à partir du vecteur JMP1394 avec des amorces contenant chacune un site de restriction Agel (F_AGE1_tefred, R_AGE1_tefred; Tableau 2). Le fragment PCR comprend ainsi la séquence de la RedStar2 flanquée par le promoteur pTEF et un terminateur. Ce fragment est ligaturé après digestion par Agel dans le vecteur JMP1226 digéré par Agel et dephosphorylé, donnant ainsi le vecteur JMP1 90. L'orientation de l'intégration a été vérifiée par PCR avec deux couples d'amorces externes et internes (61TEFstart, For_in_Dsred, uraup_1226, leudown_1226; Tableau 2). Ce vecteur contient la plateforme zeta, le marqueur d'auxotrophie LEU2 et un site unique de restriction Agel, le tout entouré par des séquences amont et aval de URA3 pour intégration dans le génome au locus URA3 par recombinaison homologue (Lazar et ai , 2013). Dans cette nouvelle construction, le fragment pTEF-RedStar2-term est situé entre la séquence amont URA3 et le marqueur LEU2.
La cassette d'expression extraite du vecteur par digestion Notl a été utilisée pour transformer la souche Po1 d. Les séquences amont et aval de URA3 permettent l'intégration au locus URA3 dans le génome par double crossing over. Dans la souche Po1 d, le gène URA3 a été au préalable inactive par intégration du gène SUC2 de S. cerevisiae (Nicaud et ai , 1989). L'intégration de la cassette remplace les séquences ura3 restantes et le gène SUC2 par la construction correspondant à la plateforme pTEF-RedStar2-LEU2-Zeta (voir Figure 3B). Les transformants ont été criblés sur la base de la prototrophie pour la leucine, la fluorescence Red et l'impossibilité de pousser sur saccharose causée par l'élimination de la cassette d'expression SUC2 dans Po1 d. La souche transformante ainsi obtenue a été désignée JMY2566. L'intégration au locus URA3 a été vérifiée par PCR sur ADN génomique avec deux couples d'amorces externes et internes (Puraextver, RED2_no_skl, VerZetasens, Turaextver; Tableau 2). JMY2566 présente la même croissance que la souche sauvage W29 sur YNB. Construction des souches témoins.
Construction des vecteurs.
Les phases ouvertes de lecture eYFP, RedStar2, SUC2, and XPR2 ont été amplifiées par PCR à partir de l'ADN des vecteurs JMP91 1 et JMP1 394 (Kabran et ai , 2012), de l'ADN génomique de W29 et de l'ADN du vecteur JMP1 62, respectivement (Lazar, et ai , 201 3), avec des amorces permettant d 'introduire des sites attb à chaque extrémité du produit de PCR (Attb1 -nom de gène , Attb2-nom de gène, listés dans le Tableau 2). Chaque fragment PCR a ensuite été cloné dans pDONR207 (I nvitrogen) à l'aide de la Gateway® BP Clonase™ en suivant les instructions du fabriquant, puis a été transformé dans la souche Mach1 T1 de E. coli. La séquence de chacun des vecteurs d 'entrée ainsi obtenus JMP1 594 (eYFP), JMP1 592 (XPR2), JMP1 593 (SUC2) et JMP1 595 (RedStar2) a été vérifiée. Chaque phase ouverte de lecture a été transférée dans un vecteur de destination JMP1 529 spécifique de Y. lipolytica à l'aide de la Gateway® BP Clonase™ en suivant les instructions du fabriquant, puis a été transformé dans la souche Mach1 T1 de E. coli. Les vecteurs d'expression résultants JMP1 598 (SUC2), JMP1 599 (eYFP), JMP1600 (RedStar2), JMP1603 (XPR2) ont été vérifié par PCR et par analyse du profil de restriction. Tous les vecteurs construits sont listés dans le Tableau 1 .
Construction des souches Y. lipolytica. Les 4 vecteurs d'expression obtenus ci-dessus ont été digérés par Notl. Les cassettes d'expression purifiées ont été transformées dans JMY2566 par la méthode à l'acétate de lithium. L'intégration dans la plateforme d'accueil Zeta a été vérifiée pour les 4 souches obtenues, JMY281 1 (RedStar2), JMY2812 (eYFP), JMY281 3 (XPR2) et JMY281 5 (SUC2) comme expliqué dans la section suivante. Une souche témoin a été construite par transformation de la cassette Notl du vecteur vide JMP1047 qui comporte le promoteur pTEF, le terminateur LI P2 et le site de clonage BamHI- Avril sans insert, dans la souche JMY2566. La souche témoin ainsi obtenue a été dénommée JMY2810. Toutes les souches construites sont listées dans le Tableau 1 .
PCR pour vérification de l'intégration à la plateforme zeta Les PCR ont été réalisée sur des colonies de Y. lipolytica lysées par 10 μί de 0.2 N NaOH et incubées dans le thermocycler pendant 5 minutes à 99 ° C. Les amorces utilisées pour cette vérification étaient ATTR2zetaup et Turadown (Tableau 2). L'amorce ATTR2zetaup a deux sites possibles d'hybridation. En l'absence d'intégration à la plateforme, la PCR donne une bande de 2680 pb, tandis qu'en présence d'une intégration, la PCR donne une bande de 1052 pb (voir les Figures 3B et 1 C). Ces amorces permettent donc de détecter aussi bien les signaux négatifs que positifs. Théoriquement, l'amorce « forward » ATTR2zetaup peut s'hybrider en amont du gène LEU2, ce qui conduirait à l'amplification d'un fragment plus grand que 4 Kb, selon la taille de l'insert.
En pratique, nous n'avons jamais été en mesure de détecter en gel d'électrophorèse une amplification avec le temps d'extension de 2 minutes 45 secondes que nous avons utilisé.
Méthodes de transformation.
Les cassettes d'expression ont été transformées dans les souches de Y. lipolytica en suivant les protocoles miniaturisés adaptés au format des plaques de 96 puits qui sont décrits ci-dessous. Les méthodes de transformation suivantes sont réalisées en plaques de 96 puits rigides, et les incubations sont faites dans un thermocycler. Les protocoles suivants sont des modifications de la méthode à l'acétate de lithium (LiAC) (Chen, et ai , 1997, Le Dali, et al. , 1994).
Le protocole 1 est basé sur l'utilisation d'un tampon commercial (YLEX Expression Kit, Yeastern Biotech Co. , Ltd. ). Les cellules sont striées sur des boites de YPD et incubées pendant 20 à 24 h à 28° C. Les cellules sont ensuite raclées de la surface de la boite d'agar, lavées en tampon TE et centrifugées à 3000 rpm à température ambiante pendant 5 minutes. Pour 100 transformations uniques, 5.109 cellules environ sont resuspendues dans 10 ml de tampon YLOS complet (Yeastern Biotech) comprenant 9,5 ml de tampon YLOS (décrit dans Chen et al., One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl Microbiol Biotechnol. 48(2): 232-235, 1997), 500 μΐ de 2 M DTT, 250 μΐ d'ADN simple brin entraîneur (5 à 10 μg d'ADN de saumon, Dualsystems AG Biotech). Pour chaque transformation, 3 μί d'ADN de vecteur linéarisé (~ 50 ng) sont ajoutés à 100 μΐ de cellules resuspendues en tampon YLOS complet en plaque de 96 puits pour PCR et incubées à 39° C pendant 60 minutes. Les cellules sont étalées directement sur un milieu minimal YNB solide de sélection. Le protocole 2 est basé sur la méthode LiAC standard. Les cellules sont striées sur des boites de YPD et incubées pendant 20 à 24 h à 28° C. Pour 100 transformations uniques, les cellules sont raclées de la surface de la boite d'agar, lavées dans 15 ml de tampon TE et centrifugées à 3000 rpm à température ambiante pendant 5 minutes. Les cellules sont resuspendues dans 10 ml de LiAC 0,1 M pH 6 et incubées pendant 1 heure à 28 °C pour obtenir des cellules compétentes. Les cellules sont centrifugées à 2000 rpm à température ambiante pendant 2 minutes et resuspendues dans 1 ml LiAC 0,1 M pH 6. Dix microlitres de cellules sont ensuite transférés dans des plaques de 96 puits pour PCR, mélangés doucement avec 3 μί d'ADN de vecteur linéarisé (~ 50 ng) et 10 μί d'ADN entraîneur (5 à 10 μg, Dualsystems AG Biotech) et incubés 15 minutes à 28 °C. Ensuite, 66 [il de tampon de réaction (40% PEG, 0,1M LiAC pH6) sont ajoutés à chaque mélange de transformation et mélangés doucement. Le mélange est incubé 1 heure à 28 °C. Cette incubation est suivie par un choc thermique de 10 minutes à 39 °C. Les cellules sont étalées directement sur un milieu minimal YNB solide de sélection.
Test d'activité protease.
L'activité protéase est mesurée à l'aide du substrat Fluorescein thiocarbamoyl- Casein (FTC-caséine Thermo-Scientific). 50 μΐ de surnageant de culture (dilué au 1 /5) sont incubés avec 50 μΐ FTC-caséine (5 μg/ml en tampon phosphate 50mM pH 6,8). La fluorescence et la densité cellulaire sont mesurées chaque 1 min pendant 1 h en lecteur microplaque (Biotek) avec une longueur d'onde d'excitation à 494 nm et une longueur d'onde d'émission à 517 nm pour la fluorescence. La Vmax est exprimée en fluorescence relative par minute (RFU/min).
Quantification des protéines Les protéines sont quantifiées par Bradford à partir d'une gamme étalon de BSA avec des concentrations croissantes allant de 0 à 2000 μg/mL (Thermo scientific : Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit). La lecture colorimétrique est réalisée sur spectrophotomètre à une longueur d'onde de 595nm.
Gel SDS Page Les protéines sont récupérées dans le surnageant du milieu de culture après une centrifugation de 10 minutes à 4 500 rpm à 4°C. Chaque extrait protéique est ensuite concentré 20 fois sur colonne Amicon Ultra 0,5ml_ (Millipore ref : UFC501096). Les extraits proteiques concentrés sont dénaturés par chauffage 5 minutes à 95° C dans du tampon de charge (Invitrogen NuPAGE LDS Sample Buffer 4x) puis déposés sur gel de polyacrylamide Novex 4-12% ou 10% Tris-Glycine (Life Technologies ref : EC6035BOX ou EC60752BOX). La migration des protéines est réalisée dans un cuve XCell SureLock (Novex ref: EI0001 ) 1 5 minutes à 180 volts puis 40 minutes à 1 30 volts (Générateur Apelex PS304 I I ). Les gels sont ensuite colorés 30 minutes avec du bleu de Coomassie (0,2g de bleu de Coomassie, 30 mL méthanol, 6,67 mL acide acétique et 30 mL H20) et lavés avec du tampon "Destain" (700 mL H20, 200 mL éthanol, 100 mL acide acétique) jusqu'à observation des bandes protéiques.
Test d'activité glucoamylase.
L'activité de l'enzyme glucoamylase d'Aspergillus niger (AEE60909.1 ) est mesurée par dégradation enzymatique de l'amidon. Un milieu gélifié a été réalisé avec de l'agar 1 % (PASTAGAR B BioRad) et de l'amidon 2% (Amidon soluble P.A. Prolabo) en boîte de Pétri. Pour chaque échantillon, 30 μί de surnageant concentré 20 fois a été déposé dans un puits prédécoupé dans l'agar gélifié puis incubé 16 heures à 37° C. La révélation a été réalisée par dégagement gazeux de cristaux d'iode pendant 5 minutes à température ambiante.
Test d'activité xylanase L'activité de l'enzyme xylanase XlnC d'Aspergillus niger (souche CBS51 3.88/FGSC A1 51 3) est mesurée à partir du kit EnzChek ® Ultra Xylanase Assay Kit Thermo- Scientific. L'analyse est réalisée en plaque 96 puits (Greiner cellstar F-bottom) en mixant 5 μί de surnageant de culture (gamme de dilution de 1 à 20), 45 μί de tampon "reaction buffer" du kit et 25 μί de substrat "composant A". La plaque est ensuite incubée 90 minutes à température ambiante et la fluorescence est mesurée chaque minute avec le lecteur microplaque (Bioteck) à la longueur d 'onde d'excitation de 360 nm et une longueur d'onde d 'émission de 460nm. L'activité enzymatique Vmax est exprimée en fluorescence relative par minute (RFU/min).
Microscopie à fluorescence Les images de microscopie sont réalisées avec un microscope Zeiss lmager.M2 équipé d'une lampe HXP 120 C et de filtres pour visualiser la fluorescence de la protéine eYFP (filtre 46-YFP) et de la protéine Redstar2 (filtre 45-Texasred ; http: //www.zeiss.com).
3. Résultats et discussions
3.1 Vecteur de surexpression Gateway® pour Y. lipolytica Afin de tirer parti du système Gateway®, un vecteur destination pour surexprimer dans Y. lipolytica et compatible avec cette méthodologie de clonage a été construit. Le système Gateway® de clonage permet un clonage in vitro avec une haute efficacité fondé sur la recombinaison et ne nécessitant pas d'enzymes de restriction (Walhout et ai , 2000). Le gène de résistance à l'ampicilline et l'origine de pBR322 des vecteurs pDEST Gateway® d'Invitrogen ont été utilisés avec la cassette d'expression du vecteur d'expression JMP62 pour Y. lipolytica dans lequel la cassette de recombinaison Gateway® a été intégrée au site de clonage (voir les matériels et méthodes). Ainsi, un vecteur a été obtenu qui comprend le marqueur de résistance à l'ampicilline, le marqueur d'auxotrophie URA3 excisable et le site de clonage Gateway® entre le promoteur pTEF et le terminateur LIP2. La cassette d'expression est entourée par des séquences zeta qui permettent la recombinaison dans le génome de levure après excision par digestion avec Notl ou Iceul (Figure 3A). Les deux sites de restriction peuvent être utilisés pour donner de la flexibilité au système si des sites pour l'une ou l'autre enzyme de restriction sont présents dans le gène cloné. Ce vecteur permet de cloner des gènes amplifiés par PCR auxquels des séquences Attb ont été ajoutés ou des ADNc clonés dans un vecteur Gateway® pDONR par simple recombinaison au site de clonage Gateway® pour donner les vecteurs de surexpression spécifiques de Y. lipolytica et contenant le gène d'intérêt (Figure 3A). 3.2 Construction de la souche receveuse avec la plateforme Zeta.
Une souche a été construite qui contient une plateforme zeta permettant l'intégration spécifique à un locus donné par crossing over simple avec les séquences zeta présentes dans les cassettes d'expression (Bordes, et al., 2007), de façon à éviter les intégrations aléatoires dans le génome. La plupart des souches de Y. lipolytica sont dérivées d'un mutant original auxotrophe ura" dans lequel l'invertase de S. cerevisiae a été introduite au locus URA3. Afin de se débarrasser de ce gène hétérologue, une plateforme d'accueil zeta ciblant le locus ura3 a été construite. La construction précédente a ainsi été remplacée, ce qui a donné la souche JMY2033 (Lazar, et al. , 2013). Cette délétion retire complètement toutes les séquences URA3 dans le génome, ce qui élimine toute possibilité de conversion ura3.
Y. lipolytica est habituellement cultivée dans des milieux basés sur une émulsion d'acides gras. De tels milieux sont opaques, ce qui empêche d'estimer directement la densité cellulaire en mesurant la densité optique puisqu'il faut laver plusieurs fois les cellules. Afin d'essayer de contourner cette limitation, on peut introduire un gène rapporteur codant une activité mesurable et proportionnelle à la densité cellulaire de la culture. Ici, la protéine fluorescente RedStar2 a été utilisée comme rapporteur sous le contrôle du promoteur constitutif pTEF. Cela permet de suivre la croissance cellulaire par l'intermédiaire de l'émission de fluorescence, laquelle peut être détectée à l'aide d'un lecteur de microplaques de 96 puits (Morin N, Crutz-Le Coq A-M, Rossignol T & Nicaud J-M (2014) Protocols for Monitoring Growth and Lipid Accumulation in Oleaginous Yeasts. in Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols, McGenity TJ, Ed. , p. 1 -17, Humana Press. ). Afin de pouvoir suivre la croissance de la future collection de souches, on a construit une souche similaire à JMY2033 avec la plateforme zeta, mais comprenant en outre le gène de la Redstar2 derrière le promoteur pTEF intégré dans le génome en une seule étape de transformation afin de réduire le nombre d'auxotrophies requises (voir Matériels et méthodes). La souche résultante JMY2566 exprime constitutivement la protéine RedStar2 et offre une plateforme d'accueil zeta au locus URA3 (Figure 3B). Elle sera utilisée ensuite pour toutes les transformations des cassettes de surexpression Gateway®.
3.3 Validation du système de surexpression Gateway.
Afin de valider notre système de surexpression basé sur la stratégie Gateway, nous avons tout d'abord clone une série de gènes codant des protéines donnant des phénotypes connus et quantifiables. Quatre gènes ont ainsi été clonés en tant que témoins : deux codent des protéines fluorescentes, eYFP et RedStar2 ; un code l'enzyme hétérologue de S. cerevisiae SUC2 ; le dernier code la protéase XPR2 de Y. lipolytica (voir la partie « Matériel et méthodes » pour la description des constructions). Chaque cassette de surexpression a ensuite été transformée dans la souche receveuse JMY2566 et l'intégration correcte au locus URA3 dans la plateforme d'accueil zeta a été vérifiée par PCR. L'expression correcte des protéines fluorescentes a d'abord été vérifiée par microscopie à fluorescence. Pour la surexpression de la eYFP (JMY2812), on a pu ainsi détecter clairement une fluorescence correspondant aux cellules entières (Figure 4A). La souche receveuse exprime déjà la RedStar2 sous le contrôle du promoteur pTEF. L'intégration d'une seconde copie avec le vecteur Gateway (JMY281 1 ) augmente la fluorescence. La quantification de la fluorescence avec un lecteur de microplaque fait apparaître une augmentation de 40% en comparaison de la souche témoin transformée par le vecteur vide (JMY2810). Ce résultat montre que, même si la souche exprime déjà un gène fortement, l'augmentation de l'expression dudit gène résultant de l'addition d'une seconde copie avec notre système de surexpression est facilement détectable. Le promoteur pTEF étant l'un des plus forts de Y. lipolytica, cela signifie que notre système d'expression est suffisamment fort pour que l'on puisse détecter un phénotype de surexpression, même pour des gènes endogènes qui sont déjà fortement exprimés. La souche JMY2566 est Suc" et Xpr2" (Barth et Gaillardin, 1996).
La surexpression de ces gènes devrait donc être détectable par complémentation. La surexpression de la protéase XPR2 (JMY2813) restaure le phénotype de dégradation des protéines qui est mesurable par la formation de halos sur milieu solide à base de lait écrémé à un niveau proche de celui de la souche sauvage (Figure 4B). La légère différence restante est probablement due au fait que le promoteur de XPR2 est lui- même un promoteur fort. De fait, il est même plus fort que pTEF pour la sécrétion des protéines (Muller et ai , 1998).
Les souches de Y. lipolytica ne sont pas capables naturellement d'assimiler le saccharose. On s'attend donc à ce que la surexpression de l'invertase SUC2 de S. cerevisiae dans la souche réceptrice fournisse la capacité à pousser sur saccharose. Or comme le montre la Figure 4C, la souche JMY2815 surexprimant SUC2 pousse sur saccharose aussi bien que sur glucose, alors que la souche sauvage ne peut pas pousser sur cette source de carbone, comme attendu.
Chacune des 4 souches témoins prouve donc que notre système permet une expression fonctionnelle correcte aussi bien de protéines de Y. lipolytica que de protéines hétérologues. En outre, les résultats de surexpression de SUC2 et XPR2 démontrent que les protéines surexprimées sont sécrétées correctement. 3.4 Utilisation des protéines fluorescentes pour suivre la croissance.
L'utilisation d'une souche qui exprime constitutivement une protéine fluorescente permet de suivre la croissance des cellules même dans des milieux opaques comme ceux à base de lait écrémé, les émulsions d'acides gras, les molasses ou tout substrat qui interfère avec la transmission de la lumière et empêche donc la mesure de la densité optique. Les souches construites ici expriment constitutivement la protéine fluorescente RedStar2. On peut ainsi suivre en temps réel la cinétique de croissance des cellules dans de tels milieux en n'ayant besoin que d'un lecteur de fluorescence en microplaques. Tout d'abord, la souche témoin JMY2810 a été utilisée pour montrer que l'intensité de la fluorescence est proportionnelle à la densité optique dans un milieu translucide. De fait, le cinétiques de la D06oo et de la fluorescence sont très semblables, à ceci près que l'augmentation de la fluorescence est légèrement retardée par rapport à celle de la D06oo (Figure 5A). La figure 5B présente un exemple de souches exprimant ou non XPR2 dans un milieu à base de lait écrémé (milieu opaque) dans lequel la D06oo ne peut pas être mesurée. La surexpression de XPR2 confère clairement un avantage sur milieu à base de lait écrémé par rapport à une souche délétée pour cette protéase.
3.5 Méthodes de transformation à haut débit.
La stratégie de clonage Gateway permet de créer un grand nombre de vecteurs. En conséquence, une méthode efficace de transformation à haut débit de Y. lipolytica est nécessaire. Nous avons mis au point et testé des protocoles miniaturisés pour adapter les méthodes de transformation au format des microplaques de 96 puits. Ce format peut être manipulé par la plupart des robots de manipulation de liquides. En outre, il peut être utilisé avec la plupart des kits commerciaux de préparation de plasmide haut débit en microplaques de 96 puits. Le volume final de réaction doit se situer aux environs de 200 μί pour permettre la transformation dans des plaques de 96 puits et l'utilisation d'un thermocycleur pour les différentes étapes d'incubation.
Trois méthodes ont été mises au point et testées :
• un protocole dérivé de Chen et al. (Chen, et al. , 1997) et utilisant le kit YLOS™ de Yeastern® (protocole 1 ) ;
• un protocole identique au précédent mais omettant le DTT afin de favoriser l'intégration au locus désiré plutôt que les intégrations au hasard ; et • la méthode standard des inventeurs (Le Dali, et al. , 1994), adaptée au volume des microplaques de 96 puits, c'est-à-dire 200 μΐ (protocole 2) ;
Les protocoles sont décrits dans la section « Matériel et méthodes ». Trois souches ont été utilisées pour ces tests, JMY2566 et JMY2033, qui ont toutes deux une plateforme d'accueil Zeta dans leur génome, et JMY2101 qui n'en possède pas (Tableau 1 ). Pour chaque protocole de transformation, 2 vecteurs différents Gateway ont été testés, JMP1598, qui surexprime SUC2, et JMP1600, qui surexprime la RedStar2.
En prenant en compte toutes les transformations de souches et de vecteurs, le protocole 1 a produit 2,2.103 transformants par μ d'ADN, alors que le protocole 2 a donné 1 ,3.103 transformants par μ d'ADN. Le taux de transformation semble meilleur avec le protocole 1 en une étape (Figure 6). Le protocole en une étape sans DTT n'a permis d'obtenir qu'un nombre extrêmement restreint de transformants et n'a pas été étudié plus avant. Des différences liées aux souches sont apparues durant ces tests et ce, quel que soit le protocole utilisé. JMY2033 donne deux fois plus de transformants que JMY2566 qui donne elle-même deux fois plus de transformants que JMY2101 . Ces différences ont été observées aussi bien avec le protocole 1 qu'avec le 2. De façon générale, ces deux protocoles adaptés aux microplaques de 96 puits permettent d'obtenir de bons taux de transformation et sont faciles à mettre en œuvre.
Les souches JMY2033 et JMY2566 ont la particularité de posséder une plateforme d'accueil zeta qui permet une intégration spécifique au locus zeta. La proportion d'intégrations spécifiques et d'intégrations au hasard dans chacune de ces deux souches a été testée pour chacune des deux méthodes de transformations décrites plus haut. Les deux types d'intégration ont été différenciés à l'aide d'un test PCR (voir la section « Matériel et méthodes »). Ce test ne permet pas d'éliminer la possibilité d'une double intégration; toutefois, nous n'avons jamais détecté de cas d'une intégration au locus associée à une intégration au hasard. L'intégration au locus a été évaluée dans 389 transformants parmi les 708 obtenus avec chacune des deux souches JMY2033 et JMY2566 et les deux plasmides testés. Une telle intégration spécifique est observée dans 82,5% des transformants obtenus avec le protocole 2 mais seulement avec 17,3% pour le protocole 1 (Figure 6). Cette différence marquée s'explique sans doute par la présence de DTT dans le protocole 1 . Il est connu en effet que celui-ci améliore l'efficacité de transformation mais augmente en contrepartie l'intégration non-spécifique. L'homme du métier privilégiera donc le protocole 1 quand le nombre de transformants est plus important que l'intégration spécifique à un locus donné. Ce type de situations se rencontre quand tous les transformants sont criblés pour le même phénotype ou la même activité, sans que les transformants doivent être caractérisés individuellement. En revanche, s'il est important que l'intégration se fasse à un locus donné, par exemple pour éviter une expression non-spécifique, l'homme du métier utilisera le protocole 2.
3.6 Quantification des niveaux d'activité des transformants intégrés au hasard. Comme mentionné ci-dessus, l'intégration au hasard dans le génome peut être suffisante pour un grand nombre d'utilisations. Toutefois, elle peut aussi conduire à des variations d'expression du gène selon l'endroit où celui-ci est intégré dans le génome. Dans certains cas, l'expression correcte du gène peut même être empêchée. L'intégration non-spécifique peut aussi entraîner des modifications du phénotype de la levure, notamment par inactivation du gène dans lequel la cassette est insérée. Par ailleurs, pour les mêmes raisons, une intégration au hasard dans le génome peut aussi résulter en un accroissement de l'expression du gène en question. Afin d'évaluer la variabilité dans les niveaux d'expression entre les clones obtenus par une intégration non-spécifique, la souche JMY2566 (xpr2 ) a été transformée selon le protocole 1 par le vecteur JMP1603 qui permet de surexprimer la protéase XPR2. Celle-ci est un bon rapporteur car sa surexpression est facilement mesurable.
L'activité protéasique de 96 transformants a ainsi été mesurée en suivant la libération de fluorescence à partir du substrat FTC-caséine (voir la section « Matériel et méthodes »). Le maximum d'activité est détecté après 5 h d'incubation. Cependant, des différences entre transformants ont été observées, comme on s'y attendait. La figure 7 représente la distribution du nombre de clones par tranches successives de Vmax. Parmi les transformants, 3 avaient peu ou pas d'activité (Vmax <=0), tandis que 88 % avaient une Vmax dans la moyenne plus ou moins un écart type. Toutefois, 2 clones présentaient une Vmax supérieure à 2 écarts type au dessus de la moyenne. Dans l'un de ces deux cas en particulier, la Vmax était augmentée de 61% par rapport à la moyenne. Cette approche montre donc qu'il est possible d'augmenter l'activité enzymatique, simplement par une intégration non -spécifique, et sans qu'il soit nécessaire de devoir utiliser d'autres techniques, forcément plus compliquées, comme par exemple l'évolution dirigée. Quand il n'est pas nécessaire de comprendre le mécanisme lié à l'augmentation de l'expression, une telle méthode permet d 'obtenir rapidement des souches qui sont fortement améliorées. Dans le cas présent, par exemple, le criblage de 96 transformants seulement a permis d'isoler 2 souches présentant une activité significativement plus élevée que celle de la moyenne des transformants.
3.7 Expression de la protéine Redsart2 sous le contrôle de différents promoteurs.
Différent vecteurs accepteurs possédant les promoteurs pTEF, Hp4d, Hp8d, 4UASpTEF, 8UASpTEF ont été construits (Tableau 3) (voir les matériels et méthodes). Des vecteurs d 'expression de la RedStar2 sous différents promoteurs ont été construits à partir du vecteur JMP1 394 contenant le marqueur de sélection LEU2 (Tableau 3). Les cassettes d 'expression de la RedStar2 sous le contrôle de différents promoteurs ont été introduites dans la souche JMY330, les souches obtenues sont décrites dans le tableau 2. L'expression de la RedStar2 au cours de la croissance est présentée dans la Figure 8.
3.8 Expression de la glucoamylase sous le contrôle de différents promoteurs.
Plusieurs vecteurs dans lesquels l'expression de la RedStar2 est dirigée par différents promoteurs ont été construits à partir du vecteur JMP1 394 contenant le marqueur de sélection LEU2 (Tableau 3). Des dérivés de ces vecteurs permettant d'exprimer la glucoamylase d 'Aspergillus niger ont été obtenus par replacement de la région codant pour la RedStar2 par le fragment BamH I -Avrl l à partir du vecteur JME2928 (Ledesma-Amaro et al, 201 5). Les vecteurs d 'expression obtenu sont décrites dans le tableau 2 ; JME3769 (2UAS1 -pTEF), JME3770 (3UAS1 -pTEF), JME3771 (4UAS1 -pTEF), JME3772 (8UAS1 -pTEF), JME3773 (Hp4d) et JME3774 (Hp8d). Les cassettes d'expression de la glucoamylase sous le contrôle de différents promoteurs ont été introduites dans la souche JMY330. Les souches exprimant la GA obtenues sont décrites dans le Tableau 2. Elles sont respectivement JMY5083 (pTEF-GA), JMY5771 (2UAS1 -pTEF-GA), JMY5774 (3UAS1 -pTEF-GA), JMY5777 (4UAS1 -pTEF-GA), JMY5780 (8UAS1 -pTEF-GA), JMY5783 (Hp4d-GA) et JMY5785 (Hp8d-GA). L'expression de la glucoamylase à 72h en milieu YNB a été étudiée soit par analyse des protéines sécrétées dans le milieu de cultures par gel SDS PAGE (Figure 1 1 A), soit par dosage des protéines par la méthode de Bradford (Figure 10) et par test d 'activité sur boite (Figure 12). On observe une augmentation de la production de GA en fonction de la force du promoteur, les promoteurs 8UAS1 -pTEF et Hp8d permettant d 'obtenir les quantités les plus élevées de protéine.
3.9 Expression de la protéase PepI sous le contrôle de différents promoteurs.
Plusieurs vecteurs dans lesquels l'expression de la RedStar2 est dirigée par différents promoteurs ont été construits à partir du vecteur JMP1 394 contenant le marqueur de sélection LEU2 (Tableau 3). Des dérivés de ces vecteurs pour l'expression de la protéase aspartique PepI d 'Aspergillus niger ont été obtenus par replacement de la région codant pour CmR + CcdB (Tableau 3) par le fragment BamHI -Avril contenant PepI à partir du vecteur JME2529 (Tableau 2). Les vecteurs d'expression obtenus sont décrits dans le Tableau 2 ; JME3679 (2UAS1 -pTEF-Pepl ), JME3680 (3UAS1 -pTEF-Pepl ), JME3682 (4UAS1 -pTEF-Pepl ), JME3684 (8UAS1 -pTEF-Pepl ), JME3685 (Hp4d-Pepl ) et JME3687 (Hp8d-Pepl ). Les cassettes d 'expression de la protéase PepI sous le contrôle de différents promoteurs ont été introduites dans la souche JMY1212. Les souches exprimant PepI qui ont été obtenues sont décrites dans le Tableau 2. Elles sont respectivement JMY4407 (pTEF-Pepl ), JMY5802 (2UAS1 -pTEF-Pepl ), JMY5804 (3UAS1 - pTEF-Pepl ), JMY5806 (4UAS1 -pTEF-Pepl ), JMY5808 (8UAS1 -pTEF-Pepl ), JMY5810 (Hp4d-Pepl ) et JMY5812 (Hp8d-Pepl ). L'expression de PepI à 48h en milieu YNB a été étudiée par analyse des protéines sécrétées dans le milieu de cultures par gel SDS PAGE (Figure 1 1 B) et par dosage des protéines par la méthode de Bradford (Figure 10). On observe que pour cette protéine la meilleur production est obtenu avec les promoteurs 2UAS1 -pTEF et Hp8d (Figure 1 1 B et Figure 10).
3.10 Expression de la xylanase sous le contrôle de différents promoteurs.
Plusieurs vecteurs permettant d'exprimer la RedStar2 sous le contrôle de différents promoteurs ont été construits à partir du vecteur JMP1 394 contenant le marqueur de sélection LEU2 (Tableau 3). Des dérivés de ces vecteurs pour l'expression de la xylanase XlnC d 'Aspergillus niger ont été obtenus par replacement de la région codant pour la RedStar2 par le fragment BamHI -Avrl l à partir du vecteur JME2603 (Tableau 2). Les vecteurs d 'expression obtenus sont décrits dans le tableau 2 ; JME3096 (2UAS1 -pTEF-XlnC), JME3097 (3UAS1 -pTEF-XlnC), JME3098 (4UAS1 -pTEF- XlnC), JME3099 (8UAS1 -pTEF-XlnC), JME3100 (Hp4d-XlnC) et JME3101 (Hp8d-XlnC). Les cassettes d 'expression de la xylanase sous le contrôle de différents promoteurs ont été introduites dans la souche JMY330. Les souches exprimant XlnC obtenues sont décrites dans le Tableau 2. Elles sont respectivement JMY4639 (pTEF-XlnC), JMY5310 (2UAS1 -pTEF-XlnC), JMY5312 (3UAS1 -pTEF-XlnC), JMY5314 (4UAS1 -pTEF-XlnC), JMY5316 (8UAS1 -pTEF-XlnC), JMY5318 (Hp4d-XlnC) et JMY5320 (Hp8d-XlnC). L'expression de la xylanase à 72h en milieu YNB a été étudiée soit par analyse des protéines sécrétées dans le milieu de cultures par gel SDS PAGE (Figure 1 1 C), soit par dosage des protéines par la méthode de Bradford (Figure 10) et par test d'activité avec le kit EnzChek ® Ultra Xylanase Assay Kit (Figure 13). Une meilleure production de xylanase XlnC est obtenue avec les promoteurs 2UAS1 -pTEF et Hp8d. On observe une augmentation d'un facteur 5 entre l'expression obtenue avec le promoteur pTEF et le promoteur 2UAS1 -pTEF. II est clair au vu des résultats obtenus ci-dessus que la production optimale de chaque protéine recombinante dépend à la fois du promoteur utilisé et de la séquence de la protéine. L'optimisation de l'efficacité de production d'une protéine nécessite de déterminer la meilleure combinaison au cas par cas. La présente invention permet donc d'accélérer ce travail de combinaison. Elle apporte un outil indispensable pour produire des protéines recombinantes de manière optimale en fournissant toute une batterie de promoteurs utilisable en pool et ne nécessitant qu'une seule étape de transformation pour obtenir le meilleur candidat de production.
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Claims

REVENDICATIONS
1 . Un groupe de vecteurs, comprenant un vecteur donneur et plus d 'un vecteur accepteur, dans lequel :
• ledit vecteur donneur comprend deux site de recombinaison choisis parmi attB1 , attB2, attP1 , attP2, attl_1 , attl_2, attR1 et attR2, lesdits sites de recombinaison flanquant au moins un marqueur de contre-sélection ; et
• chaque vecteur accepteur comprend un insert bordé de séquences zeta, ledit insert comprenant :
o deux sites de recombinaison choisis parmi attB1 , attB2, attP1 , attP2, attl_1 , attl_2, attR1 et attR2, lesdits sites de recombinaison encadrant des séquences régulatrices permettant l'expression de protéines dans les levures oléagineuses, et
o un marqueur de sélection de levure oléagineuse, les sites de recombinaison présents sur le vecteur donneur permettant la recombinaison avec les sites de recombinaison présents sur le vecteur accepteur et chaque vecteur accepteur portant une combinaison unique de séquences régulatrices et de marqueur de sélection.
2. Groupe de vecteurs selon la revendication 1 , dans lequel la levure oléagineuse est Yarrowia lipolytica.
3. Groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le promoteur est choisi parmi les promoteurs POX2, LIP2, FBA 1, GPM, YAT1, EXP1, GPAT, GPDIN, TEF hp4d, XPR2, UAS1 -TEF, HP8D, 2UAS, 3UAS, 4UAS, 8UAS et UAStef- TEF.
4. Groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le terminateur est choisi parmi les terminateurs PGK1, LIP2, XPR2 et CYC1.
5. Groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le marqueur de sélection choisi parmi les marqueurs d 'auxotrophie et les marqueurs de résistance.
6. Groupe de vecteurs selon la revendication 5, dans lequel le marqueur d'auxotrophie est choisi parmi ADE2, URA3, LEU2 et LYS5.
7. Groupe de vecteurs selon la revendication 5, dans lequel le marqueur de résistance est choisi parmi MDR3, KanMX, hph (HYG) et Tn5ble.
8. Groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel les séquences zeta sont bordées par des sites de restriction rares.
9. Procédé de construction d'un vecteur d'expression d'un gène d'intérêt en utilisant un groupe de vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant des étapes de : a) clonage dudit gène d'intérêt dans le vecteur donneur, et b) clonage dudit gène d'intérêt par recombinaison entre le vecteur donneur obtenu à l'étape a) et le vecteur accepteur.
10. Procédé selon la revendication 9, comprenant, préalablement à l'étape a), les étapes suivantes de : i) ajout de sites de recombinaison aux extrémités du gène d'intérêt par amplification, lesdits sites de recombinaison étant choisis parmi attB1 , attB2, attP1 , attP2, attl_1 , attl_2, attR1 et attR2 ; et ii) recombinaison entre le gène d'intérêt amplifié de l'étape i) et le vecteur donneur.
11. Procédé de construction d'une banque de vecteurs d'expression d'un gène d'intérêt, comprenant la construction d'un vecteur d'expression d'un gène d'intérêt selon l'une quelconque des revendications 9et 10, dans lequel l'étape b) comprend le clonage du gène d'intérêt dans plusieurs vecteurs accepteurs.
12. Procédé selon la revendication 11 , dans lequel lesdits vecteurs accepteurs diffèrent par leurs séquences régulatrices et/ou leur marqueur de sélection.
13. Banque de vecteurs d'expression obtenue par la méthode de l'une quelconque des revendications 11 et 12.
14. Procédé de construction d'une banque de souches transformantes de levure oléagineuse exprimant un gène d'intérêt, ledit procédé comprenant une étape de transformation d'au moins une souche de levure oléagineuse par la banque d'expression de la revendication 13.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que ladite souche comprend une seule séquence zeta dans son génome.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, dans lequel au moins 50 transformations, plus préférentiellement au moins 60, encore plus préférentiellement au moins 70, toujours plus préférentiellement au moins 80, le plus préférentiellement au moins 90, sont réalisées simultanément.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, dans lequel les transformations sont réalisées en microplaques.
18. Banque de souches de levure oléagineuse obtenue par le procédé de l'une quelconque des revendications 14 à 17.
19. Utilisation d'au moins une souche de la banque de souches de levure oléagineuse de la revendication 18 pour la production d'une protéine d'intérêt.
20. Procédé de production d'une protéine d'intérêt, comprenant des étapes de : a) culture d'au moins une souche de la banque de souches de levure oléagineuse de la revendication 18 dans un milieu approprié et b) récolte de la protéine d'intérêt produite par la culture de l'étape a).
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