WO2016064245A1 - 신규한 펩티드 화합물, 이의 생산 방법, 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 펩티드 화합물, 이의 생산 방법, 및 이의 용도 Download PDF

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WO2016064245A1
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신종헌
오기봉
오동찬
이상국
료리연
유민정
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서울대학교 산학협력단
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus

Definitions

  • Novel peptide compounds methods for their production, and uses thereof.
  • Biologically active substances derived from microorganisms have generally been sources of antibiotics, antifungal and anticancer drugs, and have been developed as new drugs for treating various diseases including these or have been the basis for new drug development.
  • Antibiotics derived from microorganisms are for example amphotericin, erythromycin, streptomycin, tetratracycline, and vancomycin.
  • daptomycin isolated from actinomycetes Streptomyces, was approved by the US Food and Drug Administration (FDA) as the next-generation antibiotic.
  • anticancer agents derived from bacteria are, for example, doxorubicin, bleomycin, mithramycin, neocarzinostatin, pentostatin, and epothilone. There is this. As such, the study of bacterially derived physiologically active substances is very important in the development of antibacterial, antifungal and anticancer agents.
  • Novel peptide compounds, isomers, derivatives thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof are provided.
  • a peptide compound, an isomer, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt comprising a novel lipopeptide and benzophenone.
  • a strain of genus Aspergillus F452 producing the peptide compound is provided.
  • a method of producing the peptide compound is provided.
  • compositions for preventing or treating cancer comprising the peptide compound, isomers, derivatives, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • a method of preventing or treating cancer using the peptide compound, isomer, derivative thereof, or pharmaceutically acceptable salt thereof is provided.
  • novel peptide compounds including lipopeptides and benzophenones, have anticancer activity and can be used to prevent or treat various types of cancer.
  • inexpensive bulk culture media can be used to provide high yields of the peptide compounds.
  • 1A and 1B are structural formulas of asperphenin A and B, respectively.
  • Figure 2 is a photograph of the culture medium of the Aspergillus sp. F452 strain.
  • Figure 3a is a graph showing the percentage (%) of RKO cells in each cell cycle according to the concentration of asperphenin B
  • Figures 3b and 3c are cells according to the incubation time of 2.5 ⁇ M and 5 ⁇ M of asperphenin B, respectively It is a graph showing the percentage (%) of RKO cells in the cycle.
  • Figure 4 is a graph showing the percentage (%) of living cells, early cell death cells, terminal apoptosis cells or necrosis, or cell necrosis according to the concentration of asperphenin B.
  • 5A and 5B are immunoblotting images of cell cycle related proteins according to the concentration of asperphenin B and the incubation time (hours) of 5 ⁇ M of asperphenin B, respectively.
  • 6A and 6B are immunoblotting images of apoptosis-related proteins according to the concentration of asperphenin B and the incubation time (hours) of 5 ⁇ M of asperphenin B, respectively.
  • 7A to 7C are graphs showing cell survival rate (%) by a combination of asperphenin B and another anticancer agent, or another anticancer agent alone.
  • FIG 8 is a graph showing the tumor volume (mm 3 ) of mice according to days passed after administration of asperphenin B after administration of 4 mg / kg or 8 mg / kg of asperphenin B.
  • One aspect provides peptide compounds, isomers, derivatives, or pharmaceutically acceptable salts thereof, including lipopeptide and benzophenone.
  • peptide compound refers to a compound comprising a peptide.
  • Peptides are compounds in which two or more amino acids are linked by peptide bonds between carboxyl and amino groups. Dipeptide, tripeptide, tetrapeptide, etc., depending on the number of constituent amino acids, those having less than about 10 peptide bonds, oligopeptides, having multiple peptide bonds It is called a polypeptide.
  • isomer refers to a compound having the same molecular formula but not the same way of connection or spatial arrangement of the constituent atoms in the bonsai. Isomers include, for example, structural isomers, and stereoisomers.
  • derivative refers to a compound obtained by substituting a part of the structure of the compound with another atom or group of atoms.
  • pharmaceutically acceptable salts refers to inorganic and organic acid addition salts of compounds.
  • lipopeptide refers to a substance in which lipid is bound to a peptide. Lipopeptides may be lipids linked by amide bonds to peptides. Amide bonds, also called peptide bonds, refer to covalent bonds in which an amino group in one molecule and a carboxyl group in one molecule bond.
  • the lipid may be a substituted or unsubstituted C 12 to C C20 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 2 to C C20 alkenyl group, or a substituted or unsubstituted C 2 to C C20 alkanyl group.
  • the alkyl group may be an alkyl group of C 2 to C 20 , C 5 to C 20 , C 10 to C 20 , or C 10 to C 15 .
  • the alkyl group may be an alkyl group of C 12 .
  • the alkenyl group may be an alkenyl group which is C 2 to C 20 , C 5 to C 20 , C 10 to C 20 , or C 10 to C 15 .
  • the alkanyl group may be an alkanyl group of C 2 to C 20 , C 5 to C 20 , C 10 to C 20 , or C 10 to C 15 .
  • “Substituted” in the “substituted” refers to the introduction of a substituted group, and “substituent” refers to the introduced atomic group when a derivative is formed by substituting a hydrogen atom in an organic compound with another atom group.
  • Substituents can include, for example, heterocyclic group of a hydroxy group, a halogen atom, C 1 to C C20 alkyl group, C 2 to C 20 alkenyl groups, C 2 to C 20 alkynyl group, C 1 to C 20 of the, C 6 to C 20 aryl group, C 6 to C 20 arylalkyl group, C 6 to C 20 heteroaryl group, or C 6 to C 20 heteroarylalkyl group, nitro group, cyano group, amino group, amidino group, hydrazine, hydra Zone, carboxyl group or salt thereof, sulfonic acid group or salt thereof, phosphoric acid or salt thereof.
  • a halogen atom C 1 to C C20 alkyl group, C 2 to C 20 alkenyl groups, C 2 to C 20 alkynyl group, C 1 to C 20 of the, C 6 to C 20 aryl group, C 6 to C 20 arylalkyl group, C 6 to C 20
  • the peptide may be one containing two, three, or four or more amino acids.
  • the peptide can be for example a tripeptide comprising three amino acids.
  • the peptide may comprise, for example, a peptide at the N-terminal-asparagine (Asp) -glutamine (Gln) -leucine-leu-C terminus.
  • the peptide may comprise one or more ⁇ (beta) -amino acids.
  • Amino acids consist of amino groups, carboxyl groups, and side chains specific for amino acids. Twenty kinds of standard biological amino acids have an amino group bonded to the ⁇ carbon of the carboxyl group, while ⁇ -amino acids have an amino group bonded to the ⁇ carbon of the carboxyl group.
  • ⁇ -amino acid is ⁇ 3 -amino acid when the side chain is bonded to the carbon next to the amine, and ⁇ 2 -amino acid when the side chain is bonded to the carbon next to the carboxyl group.
  • the ⁇ -amino acid may be ⁇ -leucine.
  • the ⁇ -amino acid may be ⁇ 3 -leucine.
  • the benzophenone is an organic compound having the general formula (C 6 H 5 ) 2 CO as diphenylmethanone.
  • Benzophenones can be, for example, compounds substituted with one, two or three or more hydroxy groups.
  • benzophenone may be a compound in which any one or more of carbon 5, carbon 9 and carbon 13 are substituted with a hydroxy group.
  • the lipopeptides and benzophenones can be linked by ketone bonds.
  • benzophenone can be linked to the C terminus of the lipopeptides.
  • the peptide compound may be a compound represented by Formula 1:
  • R 1 is a substituted or unsubstituted C 1 to C 20 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 1 to C 20 alkenyl group, or a substituted or unsubstituted C 1 to C 20 alkanyl group and each R 1 is optionally substituted with a hydroxy group or unsubstituted,
  • R 5 may be a substituted or unsubstituted benzophenone.
  • alkyl group alkenyl group, alkynyl group, substitution, and benzophenone are as described above.
  • the peptide compound may be a compound represented by Formula 2:
  • the compound represented by Formula 2 may be a compound represented by Formula 3 or Formula 4, an isomer thereof, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • One aspect provides the Aspergillus genus F452 strain (Accession No .: KCTC12688BP) that produces a peptide compound comprising lipopeptides and benzophenones.
  • lipopeptides are as described above.
  • Such strains include variants thereof.
  • the variant may be, for example, a variant resulting from a natural mutation or an artificial mutation.
  • Artificial mutations can be caused by physical mutagens, such as ultraviolet light, or chemical mutagens, such as base compounds.
  • the strain comprises spores, cells, or culture thereof of the strain.
  • the strain may be isolated or derived from marine sediment.
  • One aspect includes the steps of culturing the Aspergillus genus F452 strain (Accession Number: KCTC12688BP); And it provides a method for producing a peptide compound comprising a lipopeptide and benzophenone comprising the step of separating the peptide compound comprising a lipopeptide and benzophenone from the culture.
  • the method includes culturing Aspergillus genus F452 strain (Accession Number: KCTC12688BP).
  • Aspergillus strain F452 is as described above.
  • the culturing step may be culturing the strain in liquid medium or solid medium.
  • the medium may comprise an artificial ocean.
  • the medium may include, for example, glucose, rice, syrup, dextrin, starch, molasses, animal oil, or vegetable oil as a carbon source.
  • the nitrogen source may include, for example, yeast extract, peptone, bran, soybean meal, wheat, malt, cottonseed meal, fishmeal, corn steep liquor, gravy, ammonium sulfate, sodium nitrate or urea.
  • the medium may include salts, potassium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid or other inorganic salts that promote the formation of ions.
  • the medium may include, for example, artificial seawater, yeast extract, peptone, and rice.
  • the culturing may be culturing while shaking or standing under aerobic conditions.
  • the culture temperature may be for example about 20 ° C to about 37 ° C, about 25 ° C to about 30 ° C, or 27 ° C.
  • Incubation time can be for example 1 day to 2 months, 1 week to 2 months, 2 weeks to 2 months, 1 month to 2 months, or 6 weeks.
  • the method includes the step of separating the peptide compound comprising the lipopeptide and benzophenone from the culture.
  • lipopeptides are as described above.
  • Separating the peptide compound from the culture may include concentration, centrifugation, filtration, or chromatography of the culture.
  • the culture solution may be extracted by ethyl acetate, water, or a combination thereof.
  • the concentrate obtained can be chromatographed to give eight fractions depending on the polarity.
  • the chromatography can be reverse phase flash chromatography, for example with water, acetonitrile, or a combination thereof as the mobile phase.
  • the fractions can be fractionated by reverse phase flash chromatography to give eight fractions.
  • the fraction eluted with water / acetonitrile in a volume ratio of 50:50 in the obtained fractions can be separated by performing high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the HPLC can be carried out using a reversed phase preparative HPLC column with water / methanol in a volume ratio of 70:30 as the mobile phase.
  • Isolated peptide compounds may be obtained with at least about 80%, about 90%, or about 99% purity.
  • One aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a peptide compound comprising lipopeptides and benzophenone, isomers, derivatives, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • lipopeptides benzophenones, peptide compounds, isomers, derivatives, and pharmaceutically acceptable salts are as described above.
  • Such cancers include, for example, intrahepatic bile duct cancer, liver cancer, thyroid cancer, colon cancer, testicular cancer, myelodysplastic syndrome, glioblastoma, oral cancer, myxosarcoma, acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, basal cell carcinoma , Ovarian epithelial cancer, ovarian germ cell tumor, male breast cancer, brain tumor, pituitary adenoma, multiple myeloma, gallbladder cancer, cholangiocarcinoma, colon cancer, retinoblastoma, choroidal melanoma, batterous swollen cancer, bladder cancer, peritoneal cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, Non-small cell lung cancer, tongue cancer, astrocytoma, small cell lung cancer, childhood brain tumor, childhood lymphoma, childhood leukemia, small intestine cancer, meningioma,
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of a disease by administration of a composition.
  • treatment refers to any action by which administration of a composition improves or advantageously alters the condition of a disease.
  • the pharmaceutical composition may further include a known active ingredient having anticancer activity.
  • Known active ingredients having anticancer activity may be anticancer agents.
  • the anticancer agent may be irinotecan, 5-fluorouracil, gemcitabine, etoposide, paclitaxel, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may be a single composition or individual compositions.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a carrier, excipient or diluent.
  • Carriers, excipients and diluents are, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, undetermined Vaginal cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil.
  • compositions may each be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, or the like, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. which are commonly used.
  • the solid preparation for oral administration may be a tablet, pill, powder, granule, or capsule.
  • the solid preparation may further comprise an excipient. Excipients can be, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, or gelatin.
  • the solid preparation may further comprise a lubricant such as magnesium stearate, or talc.
  • the liquid formulation for oral may be a suspension, a solution, an emulsion, or a syrup.
  • the liquid formulation may comprise water, or liquid paraffin.
  • the liquid formulation may include excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, or preservatives.
  • the preparation for parenteral administration may be sterile aqueous solution, non-aqueous solvent, suspension, emulsion, lyophilized, or suppository.
  • Non-aqueous solvents or suspending agents may contain vegetable oils or esters.
  • the vegetable oil may be, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, or olive oil.
  • the ester may for example be ethyl oleate.
  • the base of the suppository may be witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, or glycerogelatin.
  • One aspect is a method of preventing cancer comprising administering to a subject a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a peptide compound comprising lipopeptide and benzophenone, an isomer, derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Or a method of treatment.
  • lipopeptides benzophenones, peptide compounds, isomers, derivatives, pharmaceutically acceptable salts, cancer, prevention, treatment, and pharmaceutical compositions are as described above.
  • the subject may be a mammal, including rats, mice, dogs, cattle, horses, monkeys, and humans.
  • the preferred dosage of the peptide compound depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the peptide compound may be administered, for example, in an amount of about 0.0001 mg / kg to about 100 mg / kg, or about 0.001 mg / kg to about 100 mg / kg, once or several times daily.
  • the peptide compound in the pharmaceutical composition may be included in about 0.0001% to about 10% by weight, or about 0.001% to about 1% by weight based on the total weight of the total composition.
  • compositions of the peptide compounds may be in the form of their pharmaceutically acceptable salts.
  • the peptide compound may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds.
  • the pharmaceutical composition can be administered to mammals including rats, mice, dogs, cattle, horses, monkeys, and humans by various routes.
  • the method of administration may be, for example, oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the method may further comprise administering an anticancer agent to the subject.
  • Peptide compounds, isomers, derivatives, or pharmaceutically acceptable salts and anticancer agents may be administered simultaneously, separately, or sequentially.
  • an anticancer agent may be administered to the subject after the peptide compound, isomer, derivative, or pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to the subject.
  • F452 strains were isolated from marine sediments in the tropics. The whole genome of the F452 strain was isolated, 18S ribosomal DNA was cloned by polymerase chain reaction (PCR), and the nucleic acid sequence of 8S ribosomal DNA was analyzed (SEQ ID NO: 1).
  • F452 strain was a novel strain that was systematically similar to Aspergillus versicolor . This strain was named F452 strain of the genus Aspergillus, and the strain was deposited with the depository on October 13, 2014 (Accession No .: KCTC12688BP).
  • Aspergillus F452 strain was transferred to sterile YPG solid medium (5 g yeast extract, 5 g peptone, 10 g glucose, 16 g agar, 24.8 g Instant Ocean (Aquarium systems) per sterile distilled water). Inoculation and primary incubation for several days at 27 °C.
  • F452 strains cultured in primary cultured solid medium were sterilized in 100 ml of YPG liquid medium (5 g yeast extract per 1 L of distilled water, 5 g peptone, 10 g glucose, 24.8 g Instant Ocean (Aquarium systems) ) Was incubated for 2 days at 27 ° C. with shaking at 150 rpm.
  • YPG liquid medium 5 g yeast extract per 1 L of distilled water, 5 g peptone, 10 g glucose, 24.8 g Instant Ocean (Aquarium systems)
  • Example 1-2 a solid medium obtained by tertiary culturing of the F452 strain was obtained, and then immersed in 1 L of ethyl acetate (Daejung Chemical Co., Ltd.) per 100 g of the solid medium for one day, and the process was repeated three times in total.
  • the obtained ethyl acetate was filtered through a filter paper (Advantec), and the filtrate was decompressed to remove ethyl acetate as a solvent. This process was repeated to give 25 g of crude extract.
  • 200 ml of methanol (Daejunghwa Co., Ltd.) was added, and the methanol layer was depressurized to obtain 11.4 g of methanol extract.
  • the obtained methanol extract was divided into 8 fractions using reverse phase chromatography (MERCK, C18, 700 g, reversed-phase). Five fractions of the eluate were used with a 5% reduction in water from acetonitrile (Burdick & Jackson) in a volume ratio of 60:40. The final fraction was 100% methanol (Daejung Chemical Co., Ltd.), acetone. Fractions were obtained by (Dae Jung Hwa Gold Co., Ltd.) and ethyl acetate (Dae Jung Hwa Gold Co., Ltd.).
  • Fraction 3 fractionated with water / acetonitrile in a volume ratio of 50:50 was analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry and hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy.
  • the composition of the fractions was determined using LC / MS connected to Agilent Technologies' 1200 series LC and 6130 series mass spectrometer. Mass spectra were measured using a LTQ-Orbitrap ESI-MS mass spectrometer from Thermo-Finnigan, which was expressed in the form of mass / charge (m / z). Liquid chromatography-mass spectrometry and hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopic analysis confirmed that the culture medium of the strain contained new secondary metabolites. The new secondary metabolite was named Asperphenin.
  • Fraction 3 was subjected to C 18 reversed-phase semi-preparative HPLC column, particle diameter 5 ⁇ m, 250 x 10 mm (length x inner diameter), elution rate 2 ml / min, refractive index (RI) Separated by detector (Shodex)
  • the mobile phase used for the separation was water / methanol at a volume ratio of 70:30, and reverse phase semi-preparative HPLC was performed for about 1 hour 30 minutes, whereby 50.0 mg of asperphenin A And 46.0 mg of asperphenin B were obtained.
  • Asperphenin A and Asperphenin B are pale yellow, and soluble in methanol and acetone, which are stable at room temperature and are medium organic solvents.
  • the structures of asperphenin A and asperphenin B were determined by nuclear magnetic resonance spectrum, infrared and ultraviolet spectroscopy, optical luminosity, and high resolution mass spectrometry data.
  • Nuclear magnetic resonance spectra ( 1 H NMR, 13 C NMR) were used at 500 MHz NMR by Bruker, and DMSO- d 6 was used as the solvent.
  • Mass spectra were measured in the form of mass / charge (m / z) using a LTQ-Orbitrap ESI-MS mass spectrometer manufactured by Thermo-Finnigan.
  • Infrared spectra were used by Jasco's FT-IR-4200 spectrometer.
  • Ultraviolet spectrum was a U-3010 UV / VIS spectrometer manufactured by Hitachi.
  • the fluorescence was measured using a P-1020 polarimeter from Jasco.
  • Lung cancer cell line A549 (Korean Cell line Bank), colon cancer cell line HCT116 (ATCC), gastric cancer cell line SNU638 (Korean Cell Line Bank), liver cancer cell line SK-HEP-1 (Korean Cell line Bank), and breast cancer cell line MDA-MB-231
  • SRB Sulforhodamine B
  • 190 ⁇ l of a cell suspension at a concentration of 3.5 ⁇ 10 4 cells / ml was inoculated into each well of a 96 well microplate.
  • 0.8 ⁇ M, 4 ⁇ M, 20 ⁇ M, or 100 ⁇ M of asperphenin was added to the cell culture and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for 72 hours.
  • 50 ⁇ l of 50% (v / v) trichloroacetic acid solution (Sigma Aldrich) per well was added and incubated at 4 ° C. for 30 minutes to fix cells. Fixed cells were washed five times with water and dried in air.
  • asperphenin A showed a strong cell growth inhibitory effect against cell lines of lung cancer, colon cancer, gastric cancer, liver cancer, and breast cancer.
  • Asperphenin B showed a strong cell growth inhibitory effect against colorectal cancer, gastric cancer, liver cancer, and breast cancer except A549 cell line.
  • both asperphenin A and asperphenin B showed similar or better anticancer activity to etoposide, a positive control against HCT116, a colorectal cancer cell line.
  • asperphenin B is not only expressed in colon cancer cell line HCT116 but also in other It was also confirmed that the colon cancer cell line had a cell growth inhibitory effect.
  • asperphenin B strongly inhibited cell growth of four colorectal cancer cell lines except SW480 cell line, and showed the strongest cell growth inhibitory effect against RKO cell line.
  • RKO cells (ATCC) were diluted to 1 ⁇ 10 5 cells / ml in medium containing 10% (v / v) FBS and seeded in 60 mm culture dishes. Inoculated cells were incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for about 24 hours. The cultured cells were washed once with PBS (phosphate-buffered saline) and exchanged with fresh medium. Asperphenin B at a final concentration of 0.625 ⁇ M, 1.25 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M or 10 ⁇ M was added to the cultured cells and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for a period of time.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the cells attached to the culture dish and the cells not attached to the medium were collected to obtain cells.
  • the obtained cells were washed once with PBS, 1 ml of cold 70% (v / v) ethanol was added and incubated at 4 ° C. for at least 12 hours to fix the cells.
  • 70% (v / v) ethanol was removed and the fixed cells were washed once with PBS.
  • 500 ⁇ l of 50 ⁇ g / ml RNase A (Sigma Aldrich) was added to the cells and incubated for about 30 minutes at room temperature.
  • Propidium iodide (PI) at a final concentration of 50 ⁇ g / ml was added to the cells and incubated at room temperature for about 30 minutes with the reaction shielded.
  • G 2 / M phase cells When treated with 2.5 ⁇ M or 5 ⁇ M of asperphenin B for about 24 hours, G 2 / M phase cells increased compared to the control. When treated with 2.5 ⁇ M or 5 ⁇ M of asperphenin B for about 48 hours, the cells of G 2 / M phase decreased compared to the group treated with about 24 hours, and changed from 0 hours to 24 hours of asperphenin B treatment. The percentage of cells in sub-G 1 phase that did not have increased. Asperphenin B caused cell cycle arrest of G 2 / M phase until 24 hours after treatment, and induced cell death after about 48 hours.
  • 0.625 ⁇ M, 1.25 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M, or 10 ⁇ M of asperphenin B was added to RKO cells, and the cells were obtained after incubation for 48 hours.
  • 300 ⁇ l of 1 ⁇ binding buffer was added to the obtained cells and mixed well.
  • 5 ⁇ l of Annexin V and 5 ⁇ l of PI were added to 100 ⁇ l of the mixture, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes in a shielded state.
  • 400 ⁇ l of 1 ⁇ Binding Buffer was added to the reaction and cell death was analyzed using a FAX Caliber flow cytometer (BD FACSCalibur, BD Biosciences).
  • Example 2-3 As in the method described in Example 2-3, 0.625 ⁇ M, 1.25 ⁇ M, 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M, or 10 ⁇ M of asperphenin B was added to RKO cells, and the cells were obtained after incubation for 48 hours. Meanwhile, 5 ⁇ M of asperphenin B was added to RKO cells, and the cells were obtained after culturing for 0 to 48 hours. Protein was obtained from the obtained cells.
  • anti-ATM antibody Cell Signaling Technology
  • anti-p-Chk (Thr68) antibody Cell Signaling Technology
  • anti-Chk antibody Cell Signaling Technology
  • anti-p -H2AX antibody Cell Signaling Technology
  • anti-p53 antibody Santa Cruz
  • anti-Bax antibody Santa Cruz
  • anti-BID antibody Cell Signaling Technology
  • anti-Caspase-8 antibody Cell Signaling Technology
  • Immunoblotting with -Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology
  • anti-Caspase-9 antibody Cell Signaling Technology
  • anti-cleaved PARP antibody BD Biosciences
  • anti- ⁇ -actin antibody Santa Cruz
  • ROS reactive oxygen species
  • Example 2-3 2.5 ⁇ M, 5 ⁇ M, or 10 ⁇ M of asperphenin B was added to RKO cells. The cells were obtained after culturing the cells for 24 hours. In addition, 5 ⁇ M and 10 ⁇ M asperphenin B were added to the control group, and 5 mM antioxidant N-acetylcysteine (NAC) (Sigma Aldrich) was added to the cell group, and asperphenin B and Cell groups without all NAC added were prepared.
  • NAC N-acetylcysteine
  • DCFH-DA 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetate
  • Sigma Aldrich 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetate
  • the unattached cells and attached cells in the cell medium were collected, washed twice with cold PBS, and then suspended again with 1 ml of PBS.
  • 2 ', 7' were analyzed using a BD FACSCalibur (BD Biosciences).
  • the intensity of Dichlorofluorescin (DCF) was measured.
  • the intensity of DCF was used to calculate the proportion of cells that produced reactive oxygen species, and the results are shown in Table 7.
  • RKO cells diluted with medium containing 10% (v / v) FBS were seeded in 96 well microplates at 7 ⁇ 10 3 cells per well and incubated for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • a medium containing 10% (v / v) FBS irinotecan (Sigma Aldrich), 5-fluorouracil (Sigma Aldrich) or gemcitabine (Sigma Aldrich) is mixed with asperphenin B in a 1: 1 ratio, The mixture was added to the cultured cells. The cells were then incubated for 48 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. Cell viability was measured using the SRB assay. The measured cell viability is shown in FIGS. 7A-7C.
  • FIG. 7A-7C The measured cell viability is shown in FIGS. 7A-7C.
  • FIG. 7A shows the cell viability (%) by irinotecan alone (•) of 1.25 ⁇ M to 10 ⁇ M or a combination of irinotecan and 2.5 ⁇ M of asperphenin B ( ⁇ )
  • FIG. 7B shows gemcitabine of 1 nM to 100 nM Cell survival rate (%) alone or in combination with gemcitabine and 8 ⁇ M of asperphenin B ( ⁇ )
  • FIG. 7C shows 5-fluorouracil alone ( ⁇ ) of 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M or Cell survival rate (%) by combination ( ⁇ ) of 5-fluorouracil and 8 ⁇ M of asperphenin B is shown.
  • (Dx) 1 Concentration of Asperphenin B, which is expected to be effective when Asperphenin B is administered alone.
  • Anticancer drugs Anticancer concentration ( ⁇ M ) Asperphenin B's density( ⁇ M ) Concomitant administration effect Combination Effect Rating symbol Irinotecan 1.25 2.5 0.792 ++ 2.5 2.5 0.751 ++ 5 2.5 0.691 +++ 10 2.5 0.650 +++ 5-fluorouracil 0.08 8 0.863 + 0.4 8 0.852 + 2 8 0.786 ++ 10 8 0.765 ++ Gemcitabine 0.32 8 0.907 ⁇ 1.6 8 0.882 + 8 8 0.801 ++ 40 8 0.714 ++
  • asperphenin B The anticancer effect of asperphenin B was confirmed in a tumor xenograft mouse model transplanted with a human colon cancer cell line.
  • RKO cells were injected subcutaneously into the right flank of nude mice (central laboratory animals, mice with a hairless whiskers and thymus without a thymus) at a concentration of 3.5 ⁇ 10 6 cells / 150 ⁇ l.
  • nude mice central laboratory animals, mice with a hairless whiskers and thymus without a thymus
  • Tumor volume was calculated by Equation 2 below, and tumor growth inhibition rate was calculated by Equation 3 from the calculated tumor volume.
  • Tumor volume (mm 3 ) (horizontal) ⁇ (vertical) ⁇ (height) ⁇ ⁇ / 6
  • % Tumor Growth Inhibition [1- (final mean tumor volume of asperphenin B treated group) / (final mean tumor volume of control)] ⁇ 100
  • the tumor volume (mm 3 ) of the mice according to the days elapsed after the administration of asperphenin B after the administration of asperphenin B is shown in FIG. 8 ( ⁇ : control, ⁇ : administration of asperphenin B at 4 mg / kg, ⁇ : 8 mg / kg of asperphenin B administration, *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.005), and the tumor growth inhibition rate calculated therefrom is shown in Table 9.

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Abstract

신규한 펩티드 화합물, 이의 생산 방법, 및 이의 용도를 제공한다. 상기 화합물은 항암 활성을 가지므로, 상기 화합물은 암을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.

Description

신규한 펩티드 화합물, 이의 생산 방법, 및 이의 용도
신규한 펩티드 화합물, 이의 생산 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
미생물로부터 유래한 생리 활성 물질은 대체로 항생제, 항진균, 항암제의 원천이었으며 이를 비롯한 다양한 질병 치료를 위한 신약으로 개발되거나 신약 개발의 바탕(template)이 되어 왔다. 미생물로부터 유래한 항생제는 예를 들면, 암포테리신(amphotericin), 에리트로마이신(erythromycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 및 반코마이신(vancomycin)이 대표적이다. 또한, 2003년에는 방선균인 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 분리된 댑토마이신(daptomycin)이 차세대 항생제로서 미국 식품의약안전청(FDA)의 승인을 받은 바 있다. 한편, 세균으로부터 유래한 항암제는 예를 들면, 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 미스라마이신(mithramycin), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 펜토스타틴(pentostatin), 및 에포틸론(epothilone)이 있다. 이와 같이, 세균 유래 생리 활성 물질의 연구는 항균제, 항진균제, 및 항암제 개발에서 매우 중요하다.
구조적으로 기존의 물질과는 판이하게 다른 생리활성물질을 탐색하기 위하여 최근 천연물 연구 중 하나의 전략은 지리적, 계통분류학적으로 특이한 환경에서 천연물을 연구하는 것이다. 손쉽게 접근이 가능한 토양 서식 미생물이나 육상식물들은 오랜 기간에 걸쳐서 천연물 획득을 위하여 깊게 연구되었지만, 해양 기원의 미생물에 대한 연구는 상대적으로 활발하게 이루어지지 않았다. 해양은 지구 표면의 70%를 차지하고 있고 그 자체가 대부분 탐사되지 않은 기회의 공간으로 제시되고 있다. 해양 미생물은 그 다양성에 대하여 정확하게 파악되지 않고 있지만 현재까지 해양 미생물 중 단지 1%만이 배양되거나 동정된 것으로 추정될 정도로 이 분야의 연구가 미진한 상황이다.
따라서, 구조적으로 새로운 항생제 및 항암제의 개발을 위하여, 유용한 생리 활성 물질을 생산하는 해양 미생물을 선별하고, 이들이 생산하는 신규 화합물을 탐색, 발굴하는 것이 필요하다.
이와 같이 새로운 해양 진균을 선별하고 연구하던 도중 새로운 균주를 발견하였다. 또한 상기 균주를 연구하던 중 상기 균주가 신규한 펩티드 화합물을 생산함을 발견하였고, 신규한 펩티드 화합물이 항암 활성을 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
신규한 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
또한 상기 화합물을 생산하는 아스페르길루스 속 F452 균주를 제공한다.
또한 상기 화합물을 생산하는 방법을 제공한다.
또한 상기 화합물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 상기 화합물을 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상에 따르면, 신규한 리포펩티드(lipopeptide)와 벤조페논(benzophenone)을 포함하는 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
일 양상에 따르면, 상기 펩티드 화합물을 생산하는 아스페르길루스 속 F452 균주를 제공한다.
일 양상에 따르면, 상기 펩티드 화합물을 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상에 따르면, 상기 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상에 따르면, 상기 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
[유리한 효과]
리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 신규한 펩티드 화합물은 항암 활성을 갖고, 다양한 종류의 암을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다. 또한, 저렴한 대량 배양 배지를 이용하여 상기 펩티드 화합물을 높은 수득률을 제공할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 각각 아스퍼페닌 A 및 B의 구조식이다.
도 2는 아스페르길루스 속(Aspergillus sp.) F452 균주를 배양한 배지의 사진이다.
도 3a는 아스퍼페닌 B의 농도에 따른 각 세포 주기의 RKO 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이고, 도 3b 및 도 3c는 각각 2.5 μM 및 5 μM의 아스퍼페닌 B의 인큐베이션 시간에 따른 세포 주기의 RKO 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 4는 아스퍼페닌 B의 농도에 따른 살아있는 세포, 초기 세포 사멸 세포, 말기 세포사멸 세포 또는 괴사, 또는 세포괴사인 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 아스퍼페닌 B의 농도 및 5 μM의 아스퍼페닌 B의 인큐베이션 시간(시)에 따른 세포주기 관련 단백질의 면역블로팅 이미지이다.
도 6a 및 도 6b는 각각 아스퍼페닌 B의 농도 및 5 μM의 아스퍼페닌 B의 인큐베이션 시간(시)에 따른 세포사멸 관련 단백질의 면역블로팅 이미지이다.
도 7a 내지 도 7c는 아스퍼페닌 B와 다른 항암제의 조합, 또는 다른 항암제 단독에 의한 세포 생존율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 8은 4 mg/kg 또는 8 mg/kg의 아스퍼페닌 B 투여 후 아스퍼페닌 B 투여 후 경과일수(일)에 따른 마우스의 종양 부피(mm3)를 나타내는 그래프이다.
일 양상은 리포펩티드(lipopeptide)와 벤조페논(benzophenone)을 포함하는 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
상기 용어 "펩티드 화합물(peptide compound)"은 펩티드를 포함하는 화합물을 말한다. 펩티드(peptide)는 두개 이상의 아미노산이 카르복시기와 아미노기 간의 펩티드 결합으로 연결된 형태의 화합물이다. 구성 아미노산의 수에 따라 디펩티드(dipeptide), 트리펩티드(tripeptide), 테트라펩티드(tetrapeptide) 등이라 하고, 약 10개 이하의 펩티드 결합이 있는 것을 올리고펩티드(oligopeptide), 다수의 펩티드 결합이 있는 것을 폴리펩티드(polypeptide)라고 한다.
상기 용어 "이성질체(isomer)"는 분자식은 같지만 분재 내에 있는 구성 원자의 연결 방식이나 공간 배열이 동일하지 않은 화합물을 말한다. 이성질체는 예를 들면, 구조 이성질체(structural isomers), 및 입체이성질체(stereoisomer)를 포함한다.
상기 용어 "유도체(derivative)"는 상기 화합물의 구조 일부를 다른 원자나 원자단으로 치환하여 얻어지는 화합물을 말한다.
상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물의 무기 및 유기산 부가염을 말한다.
상기 용어 "리포펩티드(lipopeptide)"는 펩티드에 지질이 결합된 물질을 말한다. 리포펩티드는 지질이 펩티드에 아미드 결합으로 연결된 것일 수 있다. 아미드 결합은 펩티드 결합으로도 불리고, 일 분자 중 아미노기와 일 분자 중 카르복실기가 결합한 공유결합을 말한다.
상기 지질은 치환 또는 비치환된 C12 내지 C C20 알킬기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C C20 알케닐기, 또는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C C20 알카닐기인 것인 것일 수 있다. 상기 알킬기는 C2 내지 C20, C5 내지 C20, C10 내지 C20, 또는 C10 내지 C15인 알킬기일 수 있다. 상기 알킬기는 C12인 알킬기일 수 있다. 상기 알케닐기는 C2 내지 C20, C5 내지 C20, C10 내지 C20, 또는 C10 내지 C15인 알케닐기일 수 있다. 상기 알카닐기는 C2 내지 C20, C5 내지 C20, C10 내지 C20, 또는 C10 내지 C15인 알카닐기일 수 있다. 상기 "치환된"에서의 "치환"은 유기 화합물 중의 수소 원자를 다른 원자단으로 치환하여 유도체를 형성한 경우 수소 원자 대신에 도입되는 것을 말하고, "치환기"는 도입된 원자단을 말한다. 치환기는 예를 들어, 히드록시기, 할로겐 원자, C1 내지 C C20의 알킬기, C2 내지 C20의 알케닐기, C2 내지 C20의 알키닐기, C1 내지 C20의 헤테로알킬기, C6 내지 C20의 아릴기, C6 내지 C20의 아릴알킬기, C6 내지 C20의 헤테로아릴기, 또는 C6 내지 C20의 헤테로아릴알킬기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 카르복실기나 그의 염, 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염일 수 있다.
상기 펩티드는 2개, 3개, 또는 4개 이상의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 상기 펩티드는 예를 들어 3개의 아미노산을 포함하는 트리펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 예를 들어, N 말단-아스파라긴(Asp)-글루타민(Gln)-류신(leu)-C 말단의 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 1개 이상의 β(베타)-아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산은 아미노기, 카르복시기, 및 아미노산에 특이적인 측쇄로 이루어진다. 20 종류의 표준 생물학적 아미노산은 카르복시기의 α 탄소에 아미노기가 결합되는 반면에, β-아미노산은 카르복시기의 β 탄소에 아미노기가 결합된다. β-아미노산은 측쇄가 아민 옆의 탄소에 결합하면 β3-아미노산이고, 측쇄가 카르복시기 옆의 탄소에 결합하면 β2-아미노산이다. 상기 β-아미노산은 β-류신일 수 있다. 상기 β-아미노산은 β3-류신일 수 있다.
상기 벤조페논(benzophenone)은 화학식 (C6H5)2CO를 갖는 유기 화합물로서 디페닐메타논이다. 벤조페논은 예를 들어 1개, 2개 또는 3개 이상의 히드록시기로 치환된 화합물일 수 있다. 예를 들어, 벤조페논은 5번 탄소, 9번 탄소, 13번 탄소 중 어느 하나 이상이 히드록시기로 치환된 화합물일 수 있다.
상기 리포펩티드와 벤조페논은 케톤 결합으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 리포펩티드의 C 말단에 벤조페논이 결합될 수 있다.
상기 펩티드 화합물은 식 1로 표시되는 화합물일 수 있다:
[식 1]
Figure PCTKR2015011281-appb-I000001
.
상기 식 1에서, R1은 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 알케닐기, 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 알카닐기이고 각각의 R1은 선택적으로 히드록시기로 치환되거나 비치환된 것이고,
R2, R3, 및 R4는 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -OCO(ORa), -C=N(Ra), -SRa, -S(=O)Ra, -S(=O)2Ra, -PRa, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C20의 알키닐기, C2 내지 C20의 알킬렌 옥사이드기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합이고,
R5는 치환 또는 비치환된 벤조페논인 것인 것일 수 있다.
상기 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 치환, 및 벤조페논은 전술한 바와 같다.
상기 펩티드 화합물은 식 2로 표시되는 화합물일 수 있다:
[식 2]
Figure PCTKR2015011281-appb-I000002
.
상기 식 2로 표시되는 화합물은 식 3 또는 식 4로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다:
[식 3]
Figure PCTKR2015011281-appb-I000003
; 및
[식 4]
Figure PCTKR2015011281-appb-I000004
.
일 양상은 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물을 생산하는 아스페르길루스 속 F452 균주(수탁번호: KCTC12688BP)를 제공한다.
상기 리포펩티드, 벤조페논, 및 펩티드 화합물은 전술한 바와 같다.
상기 균주는 그의 변이체를 포함한다. 변이체는 예를 들면, 자연 돌연변이 또는 인위적 돌연변이에 의해 생긴 변이체일 수 있다. 인위적 돌연변이는 자외선 등 물리적 돌연변이원, 또는 염기 화합물 등 화학적 돌연변이원에 의해 발생할 수 있다.
상기 균주는 균주의 포자, 균체, 또는 이것의 배양물을 포함한다.
상기 균주는 해양 퇴적물로부터 분리 또는 유래된 것일 수 있다.
일 양상은 아스페르길루스 속 F452 균주(수탁번호: KCTC12688BP)를 배양하는 단계; 및 상기 배양액으로부터 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 아스페르길루스 속 F452 균주(수탁번호: KCTC12688BP)를 배양하는 단계를 포함한다.
상기 아스페르길루스 속 F452 균주는 전술한 바와 같다.
배양하는 단계는 액체 배지 또는 고체 배지에서 균주를 배양하는 것일 수 있다. 상기 배지는 인공 해수(instant ocean)를 포함할 수 있다. 상기 배지는 탄소원으로서 예를 들어, 글루코스, 쌀, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 또는 식물유를 포함할 수 있다. 상기는 질소원으로서 예를 들면, 효모 추출물, 펩톤, 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 황산암모니움, 질산소다 또는 요소를 포함할 수 있다. 배지는 필요에 따라, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 또는 기타 이온 생성을 촉진하는 무기염류를 포함할 수 있다. 상기 배지는 예를 들어, 인공 해수, 효모 추출물, 펩톤, 및 쌀을 포함할 수 있다.
배양은 호기성 조건에서 진탕 또는 정치하면서 배양하는 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 약 20℃ 내지 약 37℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 또는 27℃일 수 있다. 배양 시간은 예를 들어 1 일 내지 2 개월, 1 주 내지 2 개월, 2 주 내지 2 개월, 1 개월 내지 2 개월, 또는 6 주일 수 있다.
상기 방법은 배양액으로부터 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.
상기 리포펩티드, 벤조페논, 및 펩티드 화합물은 전술한 바와 같다.
상기 배양액으로부터 상기 펩티드 화합물을 분리하는 단계는 배양액을 농축, 원심분리, 여과, 또는 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 배양액을 에틸아세테이트, 물, 또는 이들의 조합에 의해 추출할 수 있다. 수득된 농축물을 크로마토그래피로 분획하여 극성에 따라 8개의 분획물을 수득할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어 물, 아세토니트릴, 또는 이들의 조합을 이동상으로 하여 역상 플래시 크로마토그래피일 수 있다. 상기 분획물을 역상 플래시 크로마토그래피로 분획하여 8개의 분획물을 수득할 수 있다. 수득된 분획물 중 부피비 50:50의 물/아세토니트릴로 용출한 분획은 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC)를 수행하여 상기 펩티드 화합물을 분리할 수 있다. 상기 HPLC는 부피비 70:30의 물/메탄올을 이동상으로 하고 역상 반분취 HPLC 칼럼을 이용하여 수행할 수 있다. 분리된 펩티드 화합물은 순도 약 80%, 약 90%, 또는 약 99% 이상으로 수득될 수 있다.
일 양상은 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 리포펩티드, 벤조페논, 펩티드 화합물, 이성질체, 유도체, 및 약학적으로 허용가능한 염은 전술한 바와 같다.
상기 암은 예를 들면 간내 담관암, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 균상식육종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 기저세포암, 난소 상피암, 난소 생식 세포 종양, 남성 유방암, 뇌종양, 뇌하수체선종, 다발성 골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아 뇌종양, 소아 림프종, 소아 백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우요관암, 신장암, 악성 연부 조직 종양, 악성 골종양, 악성 림프종, 악성 중피종, 악성 흑색종, 안종양, 외음부암, 요도암, 원발부위 불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관 간질 종양, 윌름 종양, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신 융모 질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 뇌종양, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수종양, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 편도암, 편평 상피세포 암, 폐선암, 폐암, 폐 편평상피 세포암, 피부암, 항문암, 후두암 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 암은 예를 들어 폐암, 대장암, 위암, 간암, 또는 유방암일 수 있다.
상기 용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 조성물의 투여에 의해 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
상기 약학적 조성물은 항암 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 항암 활성을 갖는 공지의 유효 성분은 항암제일 수 있다. 상기 항암제는 이리노테칸, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 에토포시드, 파클리탁셀, 또는 이들의 조합일 수 있다. 항암제를 더 포함하는 경우, 상기 약학적 조성물은 단일 조성물 또는 개별적인 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제 및 희석제는 예를 들면, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제를 더 포함할 수 있다. 부형제는 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크와 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조, 또는 및 좌제일 수 있다. 비수성용제 또는 현탁제는 식물성 기름 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 식물성 기름은 예를 들면, 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 또는 올리브 오일일 수 있다. 에스테르는 예를 들면 에틸올레이트일 수 있다. 좌제의 기제는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 또는 글리세로젤라틴일 수 있다.
일 양상은 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 리포펩티드, 벤조페논, 펩티드 화합물, 이성질체, 유도체, 약학적으로 허용가능한 염, 암, 예방, 치료, 및 약학적 조성물은 전술한 바와 같다.
상기 개체는 쥐, 마우스, 개, 소, 말, 원숭이, 및 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 펩티드 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 상기 펩티드 화합물은 예를 들면, 약 0.0001 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 또는 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 약학적 조성물 중 펩티드 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.001 중량% 내지 약 1 중량%로 포함될 수 있다.
상기 펩티드 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. 상기 펩티드 화합물은 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 마우스, 개, 소, 말, 원숭이, 및 인간을 포함한 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방법은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사일 수 있다.
상기 방법은 개체에 항암제를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염과 항암제는 동시, 개별, 또는 순차로 투여될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여한 후에 항암제를 상기 개체에 투여할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 아스퍼페닌 A 및 B의 분리 및 확인
1-1. 아스페르길루스 속( Aspergillus species) F452 균주의 분리
항암 활성을 갖는 물질을 생산하는 균주를 스크리닝하기 위하여, 열대 지방의 해양 퇴적물로부터 F452 균주를 분리하였다. F452 균주의 전체 지놈(whole genome)을 분리하고 18S ribosomal DNA을 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 클로닝하고, 8S ribosomal DNA의 핵산 서열을 분석하였다(서열번호 1).
핵산 서열 분석 결과, 상기 F452 균주는 아스페르길루스 베르시콜로르(Aspergillus versicolor)와 계통분류학적으로 유사한 신규한 균주인 것으로 동정되었다. 이 균주를 아스페르길루스 속 F452 균주로 명명하고, 상기 균주를 2014년 10월 13일자로 기탁기관에 기탁하였다(수탁번호: KCTC12688BP).
1-2. 아스페르길루스 속 F452 균주의 배양
아스페르길루스 속 F452 균주를 멸균된 YPG 고체 배지(증류수 1 L 당 5 g의 효모 추출물, 5 g의 펩톤, 10 g의 글루코스, 16 g의 한천, 24.8 g의 Instant Ocean(Aquarium systems))에 접종하고 27℃에서 수일 동안 1차 배양하였다.
1차 배양한 고체 배지에서 배양한 F452 균주를 멸균된 100 ㎖의 YPG 액체 배지(증류수 1 L 당 5 g의 효모 추출물, 5 g의 펩톤, 10 g의 글루코스, 24.8 g의 Instant Ocean(Aquarium systems))에 접종하고, 150 rpm으로 진탕하면서 27℃에서 7 일 동안 2차 배양하였다.
2차 배양한 배양액 10 ㎖를 고체 쌀 배지(증류수 500 ㎖ 당 200 g의 쌀(주식회사 올가니카, 경기도 이천쌀), 2.5 g의 효모 추출물, 2.5 g의 펩톤, 12.4 g의 Instant Ocean(Aquarium systems))에 접종하고, 27℃에서 6 주 동안 3차 배양하였다.
1-3. 아스퍼페닌 A 및 B의 분리 및 정제
실시예 1-2에서 F452 균주를 3차 배양한 고체 배지를 수득하고, 고체 배지 100 g 당 1 L의 에틸아세테이트(대정화금주식회사)에 하루 동안 침지시키고, 이 과정을 총 3회 반복하였다. 수득된 에틸아세테이트를 거름 종이(Advantec)에 여과시키고, 여과물을 감압하여 용매인 에틸아세테이트를 제거하였다. 이 과정을 반복하여 25 g의 조(crude) 추출물을 수득하였다. 수득된 조 추출물에 200 ㎖의 메탄올(대정화금주식회사)을 첨가하고, 메탄올 층을 감압하여 11.4 g의 메탄올 추출물을 수득하였다. 수득된 메탄올 추출물을 역상 크로마토그래피(MERCK, C18, 700 g, reversed-phase)를 이용하여 8개의 분획(fraction)으로 나누었다. 이 중 5개 분획의 용리액은 부피비 60:40의 물/아세토니트릴(acetonitril)(Burdick & Jackson)로부터 물을 5%씩 감소시켜 사용하였고, 마지막 분획은 100% 메탄올(대정화금주식회사), 아세톤(대정화금주식회사), 및 에틸아세테이트(대정화금주식회사)로 분획하여 분획물을 수득하였다.
부피비 50:50의 물/아세토나이트릴로 분획한 분획물 3을 액체 크로마토그래피-질량분석법과 수소 핵자기 공명 분광스펙트럼으로 분석하였다. 분획물의 조성 확인은 아질런트(Agilent technologies) 사의 1200 시리즈 LC와 6130 시리즈 질량분석기를 연결한 LC/MS를 사용하였다. 질량(mass) 스펙트럼은 써모-핀니간(Thermo-Finnigan) 사의 LTQ-Orbitrap ESI-MS 질량 분석기를 사용하였고, 질량/전하(m/z)의 형태로 표시하였다. 액체 크로마토그래피-질량분석법과 수소 핵자기 공명 분광스펙트럼 분석을 통하여 상기 균주의 배양액에 신규한 이차 대사 물질이 함유되어 있다는 것을 확인하였다. 신규한 이차 대사 물질은 아스퍼페닌(Asperphenin)으로 명명하였다.
분획물 3를 역상 반-분취 HPLC 컬럼(C18 reversed-phase semi-preparative HPLC column, 입자 직경 5 ㎛, 250 x 10 ㎜(길이 x 내경), 용출 속도 2 ㎖/분, 굴절률(refractive index: RI) 검출기(Shodex)로 분리하였다. 분리를 위해 사용된 이동상은 부피비 70:30의 물/메탄올이고, 약 1 시간 30 분 동안 역상 반-분취 HPLC를 수행하였다. 이에 의해, 50.0 ㎎의 아스퍼페닌 A와 46.0 ㎎의 아스퍼페닌 B를 수득하였다.
1-4. 아스퍼페닌 A 및 아스퍼페닌 B의 물리화학적 특성 분석
아스퍼페닌 A와 아스퍼페닌 B는 연한 노란 상태이고, 상온에서 안정하고 중간 정도 유기용매인 메탄올, 아세톤 등에 잘 녹았다. 아스퍼페닌 A와 아스퍼페닌 B의 구조는 핵자기 공명 스펙트럼(nuclear magnetic resonance spectrum), 적외선 및 자외선 분광자료, 선광도, 및 고해상 질량 분석 데이터로 결정하였다. 핵자기 공명 스펙트럼 (1H NMR, 13C NMR)은 브로커 (Bruker) 사의 500 MHz NMR을, 용매는 DMSO-d 6을 사용하였다. 질량(mass) 스펙트럼은 스펙트럼은 써모-핀니간(Thermo-Finnigan) 사의 LTQ-Orbitrap ESI-MS 질량 분석기를 사용하였고, 질량/전하(m/z)의 형태로 표시하였다. 적외선 스펙트럼은 자스코(Jasco)사의 FT-IR-4200 분광기를 사용하였다. 자외선 스펙트럼은 히타치(Hitachi) 사의 U-3010 UV/VIS 분광기를 사용하였다. 선광도는 자스코(Jasco) 사의 P-1020 polarimeter를 사용하였다.
핵자기공명 스펙트럼에 의한 아스퍼페닌 A 및 아스퍼페닌 B의 구조 위치 지정을 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다.
[아스퍼페닌 A(Asperphenin A)]
(1) 분자식 : C42H61N5O11
(2) 분자량 : 811
(3) 색깔 : 연한 노란색
(4) 선광도 : -24.7 (c 1.0, 메탄올, 25℃)
(5) 적외선 흡수대 (neat) : 3309, 1671 파수
(6) 1H-NMR (DMSO-d 6, 600 MHZ) : 표 1 참조
(7) 13C-NMR (DMSO-d 6, 150 MHZ) : 표 1 참조
아스퍼페닌 A의 핵 자기 공명 스펙트럼의 화학적 이동값
위치 δc 유형 δH mult (Hz 중 J) 위치 δc 유형 δH mult (Hz 중 J)
1 136.0 C 25 31.4 CH2 2.02 t (7.9)
2 120.4 CH 7.21 s 26 173.9 C
3 138.5 C 26-NH2 7.14 br s
4 120.4 CH 6.84 s 6.70 br s
5 153.4 C 27 170.9 C
6 128.6 C 28 49.8 CH 4.44 m
7 201.8 C 28-NH 8.04 d (7.5)
8 111.1 C 29 36.9 CH2 2.40 m
9 161.6 C 30 171.8 C
10 106.8 CH 6.19 d (8.3) 30-NH2 7.39 br s
11 135.7 CH 7.15 t (8.3) 6.91 br s
12 106.8 CH 6.19 d (8.3) 31 171.2 C
13 161.6 C 32 43.7 CH2 2.18 m
14 20.8 CH3 2.29 s 33 67.5 CH 3.75 m
15 198.3 C 33-OH 4.59 brs
34 37.0 CH2 1.30 m
16 44.7 CH2 3.00 dd (16.5, 4.5) 35 25.1 CH2 1.30 m
2.85 dd (16.5, 8.7) 1.19 m
36 31.3 CH2 1.19 m
17 43.4 CH 4.13 m 37 29.1 CH2 1.19 m
17-NH 7.66 d (8.3) 38 29.1 CH2 1.19 m
18 42.5 CH2 1.28 m 39 29.0 CH2 1.19 m
0.98 ddd (13.7, 9.4, 3.4) 40 28.7 CH2 1.19 m
19 24.1 CH 1.45 m 41 22.1 CH2 1.21 m
20 21.3 CH3 0.66 d (6.7) 42 13.9 CH3 0.81 t (7.0)
21 23.3 CH3 0.71 d (6.7)
22 170.2 C
23 52.6 CH 4.02 m
23-NH 7.92 d (7.7)
24 27.6 CH2 1.87 m
1.65 m
[아스퍼페닌 B(Asperphenin B)]
(1) 분자식 : C42H61N5O11
(2) 분자량 : 811
(3) 색깔 : 연한 노란색
(4) 선광도 : -18.4 (c 1.0, 메탄올, 25℃)
(5) 적외선 흡수대 (neat) : 3309, 1671 파수
(6) 1H-NMR (DMSO-d 6, 600 MHZ) : 표 2 참조
(7) 13C-NMR (DMSO-d 6, 150 MHZ) : 표 2 참조
아스퍼페닌 B의 핵 자기 공명 스펙트럼의 화학적 이동값
위치 δc 유형 δH mult (Hz 중 J) 위치 δc 유형 δH mult (Hz 중 J)
1 136.0 C 25 31.5 CH2 2.02 m
2 120.3 CH 7.21 s 26 174.1 C
3 138.6 C 26-NH2 7.16 br s
4 120.5 CH 6.84 s 6.74 br s
5 153.4 C 27 171.0 C
6 128.7 C 28 49.9 CH 4.46 ddd (6.9, 6.9, 5.1)
7 201.8 C 28-NH 8.05 d (5.1)
8 111.1 C 29 37.0 CH2 2.53 dd (15.6, 6.9)
2.42 dd (15.6, 6.9)
9 161.6 C 30 171.9 C
10 106.8 CH 6.19 d (8.1) 30-NH2 7.41 br s
11 135.7 CH 7.14 t (8.1) 6.95 br s
12 106.8 CH 6.19 d (8.1) 31 171.3 C
13 161.6 C 32 43.7 CH2 2.18 m
14 20.8 CH3 2.29 s 2.18 m
15 198.4 C 33 67.5 CH 3.75 m
33-OH 4.60 brs
16 44.6 CH2 2.97 dd (16.4, 4.2) 34 37.0 CH2 1.30 m
2.83 dd (16.4, 8.5) 35 25.1 CH2 1.30 m
1.19 m
17 43.5 CH 4.13 m 36 31.3 CH2 1.19 m
17-NH 7.63 d (8.2) 37 29.1 CH2 1.19 m
18 42.6 CH2 1.34 m 38 29.1 CH2 1.19 m
1.01 m 39 29.0 CH2 1.19 m
19 24.2 CH 1.46 m 40 28.8 CH2 1.19 m
20 21.4 CH3 0.69 d (6.4) 41 22.1 CH2 1.22 m
21 23.4 CH3 0.74 d (6.4) 42 14.0 CH3 0.81 t (6.7)
22 170.4 C
23 52.7 CH 4.02 m
23-NH 8.03 d (8.4)
24 27.5 CH2 1.87 m
1.65 m
핵자기공명 스펙트럼 자료로부터 분석된 아스퍼페닌 A 및 B의 화학구조식을 하기에 나타내었다.
아스퍼페닌 A:
Figure PCTKR2015011281-appb-I000005
.
아스퍼페닌 B:
Figure PCTKR2015011281-appb-I000006
.
실시예 2. 아스퍼페닌 A 및 아스퍼페닌 B의 항암 활성
2-1. 아스퍼페닌 A 및 아스퍼페닌 B의 항암 활성 확인
폐암 세포주 A549(Korean Cell line Bank), 대장암 세포주 HCT116(ATCC), 위암 세포주 SNU638(Korean Cell Line Bank), 간암 세포주 SK-HEP-1(Korean Cell line Bank), 및 유방암 세포주 MDA-MB-231(Korean Cell line Bank)에 대하여 세포 생존율 측정 방법인 술포로다민 B(Sulforhodamine B: SRB) 검정을 이용하여 아스퍼페닌의 세포 사멸 효과를 측정하였다.
구체적으로, 96 웰 마이크로플레이트 각 웰당 3.5x104 개의 세포/㎖ 농도의 세포 현탁액을 190 ㎕씩 접종하였다. 세포 배양액에 0.8 μM, 4 μM, 20 μM, 또는 100 μM의 아스퍼페닌을 첨가하고, 72 시간 동안 37℃ 및 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 배양 후 각 웰당 50 ㎕의 50%(v/v) 트리클로로아세트산 용액(Sigma Aldrich)을 첨가하고 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 세포를 고정하였다. 고정된 세포를 물로 5번 세척하고, 공기 중에서 건조하였다.
그 다음, 세포에 각 웰 당 80 ㎕의 1%(v/v) 아세트산(DUKSAN)을 포함하는 0.4%(w/v) SRB 수용액(Sigma Aldrich)을 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 세포를 염색하고, 염색된 세포를 물로 세척하고 건조하였다. 각 웰당 200 ㎕의 10 mM Tris (pH 10.0)(Sigma Aldrich)을 첨가하여 세포를 녹였고, 515 nm에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포의 수를 산출하였다. 살아있는 세포의 수로부터 50%의 세포 성장을 억제하는 화합물의 농도, 즉 IC50(50% inhibition concentration)을 산출하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 양성 대조군으로서 에토포시드(etoposide)(Sigma Aldrich)를 사용하였다.
아스퍼페닌 A 및 아스퍼페닌 B의 세포 성장 억제 농도(IC50, μM)
A549 HCT116 SNU638 SK-HEP-1 MDA-MB-231
아스퍼페닌 A 14.6 1.7 5.8 2.3 3.1
아스퍼페닌 B 41.8 2.6 11.7 3.0 6.0
에토포시드 0.7 1.9 0.8 0.6 10.6
표 3에 나타난 바와 같이, 아스퍼페닌 A는 폐암, 대장암, 위암, 간암, 및 유방암의 세포주에 대하여 강한 세포 성장 억제 효과를 나타냈다. 아스퍼페닌 B는 A549 세포주를 제외한 대장암, 위암, 간암, 및 유방암에 대하여 강한 세포 성장 억제 효과를 나타냈다. 특히, 아스퍼페닌 A 및 아스퍼페닌 B 모두 대장암 세포주인 HCT116에 대해 양성 대조군인 에토포시드와 유사하거나 또는 더 좋은 항암 활성을 나타냈다.
2-2. 아스퍼페닌 B의 대장암 세포주에 대한 항암 활성 확인
표 3에 나타난 바와 같이, 아스퍼페닌 B가 대장암 세포주 HCT116 뿐만 아니라 다른 대장암 세포주에 대하여도 세포 성장 억제 효과를 갖는지 확인하였다.
대장암 세포주 HCT116(ATCC), HCT15(Korean Cell Line Bank), LS174T(Korean Cell Line Bank), RKO(ATCC), 및 SW480(ATCC)에 대하여 실시예 2-1에 기재된 바와 같이 세포 성장 억제 농도(IC50, μM)를 산출하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 양성 대조군으로서 파클리탁셀(paclitaxel)(Sigma Aldrich)를 사용하였다.
아스퍼페닌 B에 대한 대장암 세포 성장 억제값(IC50)
HCT15 HCT116 LS174T RKO SW480
아스퍼페닌 B(μM) 7.20 4.05 1.84 1.17 31.35
파클리탁셀(nM) > 100 0.42 0.46 0.21 > 100
표 4에 나타난 바와 같이, 아스퍼페닌 B는 SW480 세포주를 제외한 네 개의 대장암 세포주의 세포 성장을 강하게 억제하였고, 그 중 RKO 세포주에 대하여 가장 강한 세포 성장 억제 효과를 보였다.
2-3. 아스퍼페닌 B에 의한 대장암 세포주의 세포 주기 변화 측정
아스퍼페닌 B가 RKO 대장암 세포주의 세포 주기에 미치는 영향을 유세포 분석법(flow cytometry)으로 확인하였다.
RKO 세포(ATCC)를 10%(v/v) FBS가 함유된 배지로 1x105 개의 세포/㎖가 되도록 희석하고 60 mm 배양 접시에 접종하였다. 접종된 세포를 약 24 시간 동안 37℃ 및 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 배양된 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 1회 세척하고, 신선한 배지로 교환하였다. 배양된 세포에 최종 농도 0.625 μM, 1.25 μM, 2.5 μM, 5 μM 또는 10 μM의 아스퍼페닌 B를 가하고, 일정 시간 동안 37℃ 및 5% CO2의 조건에서 배양하였다.
일정 시간이 지난 후, 배양 접시에 부착된 세포와 배지 내에 부착되지 않은 세포를 모아 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 PBS로 1 회 세척하고, 차가운 70%(v/v)의 에탄올을 1 ㎖씩 첨가하고 4℃에서 약 12 시간 이상 인큐베이션하여 세포를 고정하였다. 70%(v/v) 에탄올을 제거하고, 고정된 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 세포에 500 ㎕의 50 ㎍/㎖ RNase A(Sigma Aldrich)를 첨가하고, 상온에서 약 30 분 동안 인큐베이션하였다. 최종 농도 50 ㎍/㎖의 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide: PI)을 세포에 가하고, 반응물을 차광한 상태에서 상온에 약 30 분동안 인큐베이션하였다. PI로 염색된 세포를 팩스칼리버 유세포분석기(BD FACSCalibur, BD Biosciences)를 사용하여 세포의 주기를 분석하였다. 유세포분석 결과로부터 서브-G1 기(sub-G1), G0/G1 기, S 기, 및 G2/M 기인 세포의 비율을 산출하였다. 음성 대조군으로 아스퍼페닌 B를 가하지 않은 세포를 사용하였다.
RKO 세포를 아스퍼페닌 B 존재 하에서 48 시간 동안 인큐베이션한 경우, 아스퍼페닌 B의 농도에 따른 세포의 비율(%)을 도 3a 및 표 5에 나타내었다. RKO 세포를 2.5 μM 및 5 μM의 아스퍼페닌 B 존재 하에서 인큐베이션한 경우, 인큐베이션 시간에 따른 세포의 비율(%)을 도 3b, 도 3c, 및 표 6에 나타내었다.
아스퍼페닌 B의 농도
0 μM(대조군) 0.625 μM 1.25 μM 2.5 μM 5 μM 10 μM
서브-G1 기 3.03% 7.14% 24.18% 38.60% 59.90% 67.82%
G0/G1 기 59.69% 52.49% 23.02% 17.99% 17.59% 17.07%
S 기 14.85% 8.11% 6.39% 6.63% 5.29% 5.46%
G2/M 기 20.50% 29.56% 43.94% 34.58% 15.97% 8.92%
대조군 2.5 μM의 아스퍼페닌 B 5 μM의 아스퍼페닌 B
0시간 6시간 12시간 24시간 48시간 6시간 12시간 24시간 48시간
서브-G1 기 4.40% 3.77% 3.25% 5.03% 33.38% 3.19% 3.80% 4.86% 48.23%
G0/G1 기 66.21% 62.16% 56.50% 30.73% 17.80% 60.66% 57.60% 28.35% 20.53%
S 기 9.70% 13.82% 15.09% 17.38% 6.55% 13.48% 14.63% 14.08% 5.90%
G2/M 기 17.55% 18.28% 22.18% 40.76% 39.31% 20.21% 20.93% 48.88% 23.37%
도 3a 및 표 5에 나타난 바와 같이, RKO 세포와 아스퍼페닌 B를 48 시간 동안 인큐베이션한 경우, 대조군에 비해 서브-G1 기의 세포는 아스퍼페닌의 농도에 따라 증가하였고, G0/G1 기의 세포와 S 기의 세포는 감소하였다. G2/M 기의 세포는 저농도의 아스퍼페닌 B 처리시 대조군에 비해 증가하였고, 고농도 처리 시 대조군에 비해 감소하였다. 또한, 도 3b, 도 3c, 및 표 6에 나타난 바와 같이, 서브-G1 기의 세포와 G2/M 기의 세포는 아스퍼페닌 B를 처리한 시간에 따라 변화하였다. 2.5 μM 또는 5 μM의 아스퍼페닌 B를 약 24 시간 동안 처리한 경우, G2/M 기의 세포는 대조군에 비해 증가하였다. 2.5 μM 또는 5 μM의 아스퍼페닌 B를 약 48 시간 동안 처리한 경우, G2/M 기의 세포는 약 24 시간 처리한 군에 비해 감소하였고, 아스퍼페닌 B 처리 0 시간부터 24 시간까지 변화가 없던 서브-G1 기의 세포의 비율이 증가하였다. 아스퍼페닌 B는 처리 후 24 시간까지는 G2/M 기의 세포 주기 멈춤(cell cycle arrest)을 일으키며 약 48 시간 후에는 세포 사멸을 유도함을 확인하였다.
2-4. 아스퍼페닌 B의 세포 사멸 유도 측정
아스퍼페닌 B에 의한 RKO 세포주의 세포사멸 과정을 Annexin V-FITC 아폽토시스 측정 키트(BD Pharmingen)를 사용하여 확인하였다.
실시예 2-3에 기재된 방법과 같이, RKO 세포에 0.625 μM, 1.25 μM, 2.5 μM, 5 μM, 또는 10 μM의 아스퍼페닌 B를 가하고, 48 시간 동안 배양한 후 세포를 수득하였다. 수득된 세포에 300 ㎕의 1x 결합 완충액(binding buffer)을 첨가하고, 잘 혼합하였다. 그 중 100 ㎕의 혼합물에 5 ㎕의 Annexin V와 5 ㎕의 PI를 첨가하고, 차광한 상태에서 15 분간 상온에서 방치하였다. 반응물에 400 ㎕의 1x 결합 완충액을 첨가하고, 팩스칼리버 유세포분석기(BD FACSCalibur, BD Biosciences)를 사용하여 세포 사멸을 분석하였다. 유세포분석 결과로부터 염색되지 않은 살아있는 세포, annexin V만 염색된 초기 세포 사멸 세포, PI와 annexin V 모두 염색된 말기 세포사멸 세포 또는 괴사, 또는 PI만 염색된 세포괴사인 세포의 비율을 산출하였다. 음성 대조군으로 아스퍼페닌 B를 가하지 않은 세포를 사용하였다.
RKO 세포를 아스퍼페닌 B 존재 하에서 48 시간 동안 인큐베이션한 경우, 아스퍼페닌 B의 농도에 따른 세포의 비율(%)을 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 초기 세포사멸 세포와 말기 세포사멸 또는 괴사 세포의 비율은 대조군에 비해 증가하였다. 괴사된 세포의 비율은 대조군에 비해 증가하였다. 따라서, 아스퍼페닌 B는 RKO 대장암 세포주의 세포 사멸과 괴사를 유도함을 확인하였다.
2-5. 아스퍼페닌 B의 세포 주기 관련 단백질 및 세포 사멸 관련 단백질에 미치는 영향의 평가
실시예 2-3에 기재된 방법과 같이, RKO 세포에 0.625 μM, 1.25 μM, 2.5 μM, 5 μM, 또는 10 μM의 아스퍼페닌 B를 가하고, 48 시간 동안 배양한 후 세포를 수득하였다. 한편, RKO 세포에 5 μM의 아스퍼페닌 B를 가하고, 0 시간 내지 48시간 동안 배양한 후 세포를 수득하였다. 수득된 세포로부터 단백질을 수득하였다.
세포 주기 관련 단백질의 발현과 관련하여, 항-p-cyclin B1(Ser147) 항체(Cell Signaling Technology), 항-cyclin B1 항체(Santa Cruz), 항-p-cdc2(Tyr15) 항체(Cell Signaling Technology), 항-cdc2 항체(Santa Cruz), 및 항-β-액틴 항체(Santa Cruz)를 사용하여 면역블로팅을 수행하였다. 면역블로팅으로 얻어진 이미지를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이, RKO 세포를 아스퍼페닌 B 존재 하에서 48 시간 동안 인큐베이션한 경우, 비활성 형태의 p-cdc2(Tyr15) 단백질의 발현은 농도 의존적으로 증가하였다. 비활성 형태의 p-cyclin B1(Ser147) 단백질의 발현은 2.5 μM의 아스퍼페닌 B에서 증가하였다. p-cyclin B1(Ser147) 단백질과 cyclin B1 단백질의 발현은 5 μM과 10 μM의 아스퍼페닌 B에서 감소하였다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 5 μM의 아스퍼페닌 B를 처리한 경우, p-cdc2(Tyr15) 단백질의 발현은 시간 의존적으로 증가하였고, p-cyclin B1(Ser147) 단백질의 발현은 약 24 시간에서 가장 높게 나타났다. 따라서, 아스퍼페닌 B는 RKO 대장암 세포의 세포 주기 관련 인자들의 발현을 조절함을 확인하였다.
한편, 세포 사멸 관련 단백질의 발현과 관련하여, 항-ATM 항체(Cell Signaling Technology), 항-p-Chk(Thr68) 항체(Cell Signaling Technology), 항-Chk 항체(Cell Signaling Technology), 항-p-H2AX 항체(Cell Signaling Technology), 항-p53 항체(Santa Cruz), 항-Bax 항체(Santa Cruz), 항-BID 항체(Cell Signaling Technology), 항-Caspase-8 항체(Cell Signaling Technology), 항-Caspase-3 항체(Cell Signaling Technology), 항-Caspase-9 항체(Cell Signaling Technology), 항-절단된 PARP 항체(BD Biosciences), 및 항-β-액틴 항체(Santa Cruz)를 사용하여 면역블로팅을 수행하였다. 면역블로팅으로 얻어진 이미지를 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.
도 6a에 나타난 바와 같이, RKO 세포를 아스퍼페닌 B 존재 하에서 48 시간 동안 인큐베이션한 경우, 농도 의존적으로 ATM 단백질의 발현이 증가하였고, ATM 단백질의 하위 조절 인자인 Chk2와 H2AX가 인산화되어 활성화되었다. p53 단백질의 발현이 농도 의존적으로 증가하여 Bax의 발현도 증가하였다. 아스퍼페닌 B 처리는 Bid, 카스파아제-8, 카스파아제-9, 카스파아제-3 및 카스파아제-3의 기질인 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(poly(ADP-ribose) polymerase: PARP)의 절단을 유도하였다. 도 6b에 나타난 바와 같이, 5 μM의 아스퍼페닌 B를 처리한 경우, 세포사멸 유도 및 마커 단백질인 p-Chk2(Thr68), p-H2AX(Ser139), 절단된 카스파아제-8, 절단된 카스파아제-9, 절단된 카스파아제-3, 및 PARP가 48 시간 처리군에서 증가하였다. p53과 Bax는 시간 의존적으로 증가하였다. 따라서, 아스퍼페닌 B는 RKO 대장암 세포의 세포 사멸 관련 인자들의 발현을 조절함을 확인하였다.
2-6. 아스퍼페닌 B에 의한 활성 산소종 생성
활성 산소종(reactive oxygen species: ROS)은 세포 내에서 세포 사멸을 유도할 수 있으므로, 아스퍼페닌 B에 의해 세포에서 활성 산소종이 생성되는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2-3에 기재된 방법과 같이, RKO 세포에 2.5 μM, 5 μM, 또는 10 μM의 아스퍼페닌 B를 가하였다. 세포를 24 시간 동안 배양한 후 세포를 수득하였다. 또한, 비교군으로 5 μM 및 10 μM 아스퍼페닌 B에 5 mM의 항산화제 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine: NAC)(Sigma Aldrich)을 첨가한 세포군을 준비하고, 대조군으로 아스퍼페닌 B 및 NAC를 모두 첨가하지 않은 세포군을 준비하였다.
그 후, 세포 배양액에 최종 농도 20 μM의 2',7'-디클로로플루오로세인 디아세테이트(Dichlorofluorescin diacetate: DCFH-DA)(Sigma Aldrich)를 가하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 30 분간 배양하였다. 세포 배지 내에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모아 차가운 PBS로 2회 세척한 후 다시 1 ㎖의 PBS로 세포를 현탁시키고 팩스칼리버 유세포분석기(BD FACSCalibur, BD Biosciences)를 사용하여 2',7'-디클로로플루오로세인(Dichlorofluorescin: DCF)의 강도를 측정하였다. DCF의 강도를 통해 활성 산소종을 생성한 세포의 비율을 산출하고, 그 결과를 표 7에 나타내었다.
약물 활성 산소종을 생성한 세포의 비율
약물 미처리(대조군) 5.95%
2.5 μM 아스퍼페닌 B 8.14%
5 μM 아스퍼페닌 B 13.86%
10 μM 아스퍼페닌 B 14.26%
5 μM 아스퍼페닌 B + 5 mM NAC 1.41%
10 μM 아스퍼페닌 B + 5 mM NAC 2.55%
표 7에 나타난 바와 같이, RKO 세포를 아스퍼페닌 B 존재 하에서 24 시간 동안 인큐베이션한 경우, 대조군과 비교하여 활성 산소종의 생성이 약 2.4배 증가하였다. 아스퍼페닌 B에 의한 활성 산소종의 생성은 항산화제 NAC에 의해 억제되었다. 따라서, 아스퍼페닌 B는 RKO 대장암 세포의 활성 산소종의 생성을 유도함을 확인하였다.
2-7. 아스퍼페닌 B와 다른 항암제의 병용 투여
인 비트로에서 아스퍼페닌 B와 다른 항암제와의 병용 투여시 효과를 확인하였다.
10%(v/v) FBS가 함유된 배지로 희석된 RKO 세포를 96 웰 마이크로플레이트에 웰 당 7x103 개의 세포가 되도록 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24 시간 동안 배양하였다. 10%(v/v) FBS가 함유된 배지에 이리노테칸(Sigma Aldrich), 5-플루오로우라실(Sigma Aldrich) 또는 젬시타빈(Sigma Aldrich)을 아스퍼페닌 B와 1:1의 비율로 혼합하고, 혼합물을 배양된 세포에 가하였다. 그 후, 세포를 37℃ 및 5% CO2 조건에서 48 시간 동안 배양하였다. 세포 생존율을 SRB 검정을 이용하여 측정하였다. 측정된 세포 생존율을 도 7a 내지 도 7c에 나타내었다. 도 7a는 1.25 μM 내지 10 μM의 이리노테칸 단독(●) 또는 이리노테칸과 2.5 μM의 아스퍼페닌 B의 조합(■)에 의한 세포 생존율(%)을 나타내고, 도 7b는 1 nM 내지 100 nM의 젬시타빈 단독(●) 또는 젬시타빈과 8 μM의 아스퍼페닌 B의 조합(■)에 의한 세포 생존율(%)을 나타내고, 및 도 7c는 0.1 μM 내지 10 μM의 5-플루오로우라실 단독(●) 또는 5-플루오로우라실과 8 μM의 아스퍼페닌 B의 조합(■)에 의한 세포 생존율(%)을 나타낸다.
또한, 병용 투여의 효과를 하기 수학식 1에 의해 구하여 표 8에 나타내었다.
[수학식 1]
병용처리 효과 = D1/(Dx)1 + D2/(Dx)2
D1: 병용 투여시 예상 효과가 나타나는 아스퍼페닌 B의 농도
D2: 병용 투여시 예상 효과가 나타나는 다른 항암제의 농도
(Dx)1: 아스퍼페닌 B 단독 투여 시 예상 효과가 나타나는 아스퍼페닌 B의 농도
(Dx)2: 다른 항암제 단독 투여 시 예상 효과가 나타나는 다른 항암제의 농도
산출된 병용투여 효과가 <1이면 상승(synergistic) 효과, =1이면 상가(additive) 효과, >1이면 길항(antagonistic) 효과를 의미한다.
항암제 항암제의 농도 ( μM ) 아스퍼페닌 B의 농도( μM ) 병용투여 효과 병용 효과 등급 기호
이리노테칸 1.25 2.5 0.792 ++
2.5 2.5 0.751 ++
5 2.5 0.691 +++
10 2.5 0.650 +++
5-플루오로우라실 0.08 8 0.863 +
0.4 8 0.852 +
2 8 0.786 ++
10 8 0.765 ++
젬시타빈 0.32 8 0.907 ±
1.6 8 0.882 +
8 8 0.801 ++
40 8 0.714 ++
도 7a 내지 도 7c 및 표 8에 나타난 바와 같이, 이리노테칸, 5-플루오로우라실, 또는 젬시타빈을 단독 투여한 경우보다 아스퍼페닌 B와 병용한 경우에 세포 성장 억제 효과가 증가하였다.
2-8. 종양 이종 이식 마우스 모델에서 아스퍼페닌 B의 항암 효과의 확인
아스퍼페닌 B의 항암 효과를 사람 대장암 세포주를 이식한 종양 이종이식 마우스 모델에서 확인하였다.
구체적으로, RKO 세포를 3.5x106개의 세포/150 ㎕의 농도로 누드 마우스(중앙실험동물, 털이 없는 작은 몸집에 출생 시 말린 수염을 갖지며 흉선이 없는 생쥐)의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. RKO 세포를 주사한 날로부터 14 일 후 종양 크기가 60 mm3에 달하였을 때, 4 mg/kg 또는 8 mg/kg의 아스퍼페닌 B를 일주일에 3회 총 21 일간 복강 투여하였다(n=5). 종양 크기는 디지털 칼리퍼(digital caliper)를 사용하여 21 일 동안 3 일 내지 4 일 간격으로 측정하였다. 대조군으로 아스퍼페닌 B를 투여하지 않은 누드 마우스를 이용하였다(n=5).
종양 부피를 하기 수학식 2로 산출하고, 산출된 종양 부피로부터 종양 성장 저해율을 하기 수학식 3으로 산출하였다.
[수학식 2]
종양 부피 (mm3) = (가로) ×(세로) ×(높이)×π/6
[수학식 3]
종양 성장 저해율(%) = [1- (아스퍼페닌 B 투여군의 최종 평균 종양 부피)/(대조군의 최종 평균 종양 부피)] × 100
아스퍼페닌 B 투여 후 아스퍼페닌 B 투여 후 경과일수(일)에 따른 마우스의 종양 부피(mm3)를 도 8에 나타내고(●: 대조군, ■: 4 mg/kg의 아스퍼페닌 B 투여, ▲: 8 mg/kg의 아스퍼페닌 B 투여, *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.005), 이로부터 산출된 종양 성장 저해율을 표 9에 나타내었다.
투여군 4 mg / kg의 아스퍼페닌 B 8 mg / kg의 아스퍼페닌 B
저해율 (%) 38.9 68.7
도 8 및 표 9에 나타난 바와 같이, 아스퍼페닌 B를 투여한 군에서 화합물의 농도 의존적으로 종양의 성장 억제를 확인하였다.
기탁기관명 : 미생물자원센터(국외)
수탁번호 : KCTC12688BP
수탁일자 : 20141013
Figure PCTKR2015011281-appb-I000007

Claims (19)

  1. 리포펩티드(lipopeptide)와 벤조페논(benzophenone)을 포함하는 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 리포펩티드는 지질이 펩티드에 아미드 결합으로 연결된 것인 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 지질은 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 알킬기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C20 알케닐기, 또는 치환 또는 비치환된 C2 내지 C20 알카닐기인 것인 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 펩티드는 2개, 3개, 또는 4개 이상의 아미노산을 포함하는 것인 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 펩티드는 β(베타)-아미노산을 포함하는 것인 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 벤조페논은 1개 이상의 히드록시기로 치환된 것인 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 리포펩티드와 벤조페논은 케톤 결합으로 연결된 것인 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드 화합물은 리포펩티드의 C 말단에 벤조페논이 결합된 것인 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드 화합물은 식 1로 표시되는 것인 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염:
    [식 1]
    Figure PCTKR2015011281-appb-I000008
    ,
    상기 식 1에서, R1은 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 알케닐기, 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20 알카닐기이고 각각의 R1은 선택적으로 히드록시기로 치환되거나 비치환된 것이고,
    R2, R3, 및 R4는 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -OCO(ORa), -C=N(Ra), -SRa, -S(=O)Ra, -S(=O)2Ra, -PRa, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C20의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C2 내지 C20의 알키닐기, C2 내지 C20의 알킬렌 옥사이드기, 치환 또는 비치환된 C3 내지 C30의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 30의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C6 내지 C30의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합이고,
    R5는 치환 또는 비치환된 벤조페논인 것인 것임.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드 화합물은 식 2로 표시되는 것인 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염:
    [식 2]
    Figure PCTKR2015011281-appb-I000009
    .
  11. 청구항 10에 있어서, 식 2로 표시되는 화합물은 식 3 또는 식 4로 표시되는 것인 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염:
    [식 3]
    Figure PCTKR2015011281-appb-I000010
    ; 및
    [식 4]
    Figure PCTKR2015011281-appb-I000011
    .
  12. 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물을 생산하는 아스페르길루스 속 F452 균주(수탁번호: KCTC12688BP).
  13. 아스페르길루스 속 F452 균주(수탁번호: KCTC12688BP)를 배양하는 단계; 및
    상기 배양액으로부터 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물을 분리하는 단계를 포함하는, 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물을 생산하는 방법.
  14. 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 암은 폐암, 대장암, 위암, 간암, 또는 유방암인 것인 약학적 조성물.
  16. 청구항 14에 있어서, 항암제를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 항암제는 이리노테칸, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 에토포시드, 파클리탁셀, 또는 이들의 조합인 것인 약학적 조성물.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단일 조성물 또는 개별적인 조성물인 것인 약학적 조성물.
  19. 리포펩티드와 벤조페논을 포함하는 펩티드 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법.
PCT/KR2015/011281 2014-10-23 2015-10-23 신규한 펩티드 화합물, 이의 생산 방법, 및 이의 용도 WO2016064245A1 (ko)

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