WO2016050656A1 - Verfahren zur biotechnologischen herstellung von flavonoiden - Google Patents

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WO2016050656A1
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amino acid
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acid sequence
methyltransferase
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Ludger Wessjohann
Anne-Kathrin BAUER
Jakob Ley
Thorsten GEIßLER
Katrin Geißler
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Symrise AG
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    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/14—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced flavin or flavoprotein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.14)
    • C12Y114/14001—Unspecific monooxygenase (1.14.14.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)

Definitions

  • the invention is in the field of biotechnology and relates to a method in which one converts flavanones without chemical intermediate steps in the corresponding flavonoids, a corresponding microorganism, a vector and a host cell.
  • Flavonoids such as homoeriodictyol, eriodictyol (EP 1258200 Bl) and hesperetin (EP 1998636 Bl) are important flavoring and flavoring agents. Usually, these substances are produced by aldol reaction of free or partially methylated acetophloroglucinol with free or partially methylated protocatechualdehyde. Although the processes are now industrially established, they have significant disadvantages: there is a need to provide the phenolic functions during the course of the reaction with protective groups that must be removed later. As a result, the syntheses become multistep, i. technically complex and, of course, expensive as a result.
  • WO 2005 115377 A1 is a food composition comprising flavonoids and tocotrienol, wherein the flavonoids may be naringenin, hesperetin, nobiletin or tangeretine.
  • these processes are time consuming and costly, based in part on wild collection of plants, are seasonal, solvent and process intensive, and therefore also unsuitable for broad commercial use.
  • the object of the present invention has thus since there was to provide a process for the preparation of flavonoids, in particular of eriodictyol, hesperetin, sterol and / or Homoeriodictyol available, which is free of the disadvantages described above.
  • Particular attention should be paid to the fact that the flavonoids can be provided in short reaction times and in high yields, the process should be free of chemical reaction steps, so that the reaction products can be referred to as natural or nature identical.
  • a first subject of the invention relates to a process for the preparation of flavonoids, comprising the steps:
  • a first nucleic acid segment (A) comprising or consisting of a gene coding for a CYP450 oxidase
  • a second nucleic acid section (B) comprising or consisting of a gene coding for a plant O-methyltransferase, as well as
  • naringenin can be converted into eriodictol by transgenic microorganisms such as Sacharomyces cerevisiae, which form a flavonoid 3'-hydroxylase from gerbera hydride or a CYP450 oxidase from Phanerochaete chrysosporium 1 (Kasai, N., Et al., Enzymatic properties of cytochrome P450 catalyzing 3'-hydroxylation of naringenin from the white-red fungus Phanerochaete chrysosporium, Biochem., Biophys. Res. Commun., 387, 103-8 (2009)).
  • CYP450 OXIDASES a variant of CYP450 oxidase from Bacillus megaterium, which could be produced by heterologous expression and hydroxylated naringenin regioselectively at the 3 'or 5'-position.
  • O-methyltransferase By the additional expression of an O-methyltransferase, it is advantageously possible that the intermediately formed eriodictyol is converted to homoeriodictyol.
  • a "CYP450 oxidase” in the context of the present invention is an enzyme which catalyzes the reaction "flavanone 3'-hydroxyflavanone".
  • CYP450 catalyzes the reaction of naringenin to eriodictyol (see the reaction scheme shown at the beginning).
  • Particularly preferred are CYP450 oxidases from the Gram-positive bacterium Bacillus megaterium.
  • expressly preferred is a method in which encodes the coding for a bacterial CYP450 oxidase gene for an oxidase from the microorganism Bacillus megaterium.
  • a particular embodiment of the present invention therefore relates to a method which is characterized in that the introduced into the transgenic microorganism nucleic acid section (A)
  • nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 (nucleotide sequence of the gene coding for the A75G / F88V / L189Q / R472C variant of the bacterial CYP450 from B. megaterium ATCC 14581) and / or
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 2 nucleotide sequence of the gene coding for the A75G / F88V / L189Q / A331S / R472C variant of the bacterial CYP450 from B. megaterium ATCC 14581) and / or
  • Mutatis mutandis is also the subject of the invention, a method in which the preferably bacterial CYP450 oxidase
  • nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 (nucleotide sequence of the gene coding for the A75G / F88V / L189Q / R472C variant of the bacterial CYP450 from B. megaterium ATCC 14581) and / or
  • nucleotide sequence SEQ ID NO: 2 nucleotide sequence of the gene coding for the A75G / F88V / L189Q / A331S / R472C variant of the bacterial CYP450 from B. megaterium ATCC 14581) and / or
  • (i-iii) a similar nucleotide sequence having a nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 2, preferably 50% or more, 60% or more or 80% or more, more preferably 95% or more.
  • a further particular embodiment of the present invention accordingly relates to a process which is distinguished in that the amino acid section (A) introduced into the transgenic microorganism
  • (i-iii) a similar amino acid sequence having an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 6 and / or SEQ ID NO: 7, preferably 50% or more, 60% or more or 80% or more, particularly preferably 95% or more, comprises or consists of.
  • Mutatis mutandis is also the subject of the invention, a method in which the preferably bacterial CYP450 oxidase
  • amino acid sequence SEQ ID NO: 7 amino acid sequence of the gene coding for the A75G / F88V / L189Q / A331S / R472C variant of the bacterial CYP450 from B. megaterium ATCC 14581) and / or
  • (i-iii) a similar amino acid sequence having an amino acid sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 6 and / or SEQ ID NO: 7, preferably 50% or more, 60% or more or 80% or more, most preferably 95% or more,
  • nucleic acid and / or amino acid sequence identity is preferably based on the Waterman-Smith algorithm with a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5 and the BLOSUM62 matrix (for the Waterman-Smith algorithm, see, for example, Smith, TF and Waterman, MS, "Identification of Common Molecular Subsequences," Journal of Molecular Biology (1981), 147: 195-197; implemented online via the corresponding tool page of the EM BL).
  • the presented nucleotide sequences were generated using the BISSAP software of the European Patent Office in accordance with WI PO Standard 25.
  • O-methyltransferase in the context of the present invention is an enzyme which catalyzes the regiospecific methylation of certain compounds, in particular the reaction of eriodicytol to hesperetin, sterubin and / or homoeriodictyol (see the reaction scheme shown at the outset
  • O-methyltransferases from Mesembryanthemum crystallinum or Arabidopsis thaliana.
  • a method is expressly preferred in which the gene coding for a plant O-methyltransferase codes for an O-methyltransferase from the plant genus Mesembryanthemum.
  • a further particular embodiment of the invention therefore relates to a method which is distinguished in that the nucleic acid section (B) introduced into the transgenic microorganism
  • nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 3 (nucleotide sequence of the OMT from M. crysteininum (McPFOMT)), and / or
  • nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 4 (nucleotide sequence of O-methyltransferase 1 (OMT1)) and / or
  • nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 5 (nucleotide sequence of O-methyltransferase (AOMT)) and / or
  • nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 5, preferably 50% or more, 60% or more or 80% or more, more preferably 95% or more,
  • nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 3 (nucleotide sequence of the OMT from M. crysteininum (McPFOMT)), and / or
  • nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 4 (nucleotide sequence of O-methyltransferase 1 (OMT1)) and / or
  • nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 5 (nucleotide sequence of the O-methyltransferase (AOMT)) and / or
  • nucleotide sequence identity of 40% or more to SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 5, preferably 50% or more, 60% or more or 80% or more, more preferably 95% or more,
  • a further particular embodiment of the invention therefore relates to a method which is characterized in that the amino acid section (B) introduced into the transgenic microorganism
  • the or one, several or all of the flavanones or precursors or derivatives thereof to be used according to the invention are preferably selected from the group consisting of: naringenin, naringin, narirutin, or other naturally occurring or artificially produced naringenin glycosides, sakuranetin, sakuraneting glycosides, Isosakuranetin, Isosakuranetinglycoside, 4 ', 7-Dihydroxy-flavanone or its glycosides, 4', 7-dihydroxy-3'-methoxy-flavanone or its glycosides, 3 ', 7-dihydroxy-4'-methoxy-flavanone or its glycosides, 3 ', 4', 7-trihydroxy-flavanone or its glycosides, wherein the flavanones with respect to the 2-position of Flavanongerüsts as (S) -, as (R) -enantiomer, racemate or any
  • the flavonoids to be prepared according to the invention are preferably selected from the group consisting of: eriodictyol and its glycosides (eg eriocitrin, neoeriocitrin), homoeriodictyol and its glycosides, sterol and its glycosides, hesperidin, hesperetin and other hesperetin glycosides (eg neohesperidin), apigenin and its glycosides, luteolin, diosmetin, chrysoeriol
  • flavanones and the flavonoids formed therefrom are: naringenin and eriodictyol, naringenin and homoeriodictyol, naringenin and sterubin, naringenin and hesperetin naringin and eriodictyol, naringin and homoeriodictyol, naringin and hesperetin, naringenin and apigenin, naringenin and luteolin, naringenin and sterubin, naringenin and diosmetin, naringenin and chryseriol, naringin and luteolin, naringin and sterubin, naringin and diosmetin, and naringin and chryseriol.
  • step (ii) of a method of the invention one or more flavanones are added to the transgenic microorganism, wherein the transgenic microorganism is cultured under conditions permitting the reaction of the flavanone (s).
  • the transgenic microorganisms are cultivated first, ie before step (ii), under aerobic conditions, preferably until a maximum biomass concentration has been reached.
  • the OD 600 should preferably be at least in the range from 1 to 15 or more, preferably in the range from 5 to 300, in particular in the range from 10 to 275, preferably in the range from 15 to 250.
  • step (ii) preferably cultured under anaerobic conditions, wherein the expression of the desired amino acid sequences or the desired enzymes based on the introduced nucleic acid sections or the transgenes transduced, for example, stimulated by I ndulement by IPTG and / or lactose (when using a corresponding suitable promoter or a corresponding, suitable expression system).
  • step (ii) takes place at least partially or completely under aerobic conditions.
  • step (ii) can create suitable environmental conditions for the purposes of the present invention and in particular provide a suitable (culture) medium.
  • Cultivation is preferably carried out in LB or TB medium.
  • a (more complex) medium consisting of or comprising vegetable raw materials, in particular from citrus, grapefruit and orange plants, can be used.
  • the cultivation is carried out, for example, at a temperature of more than 20 ° C, preferably of more than 25 ° C, in particular of more than 30 ° C (preferably in the range of 30 to 40 ° C), which in particular favor the formation of homoeriodictyol from naringenin or increase the yield.
  • a temperature for induction (see above) of less than 40 ° C., in particular of less than 35 ° C. (preferably in the range from 20 to 30 ° C.), can favor the formation of homoeriodictyol or increase the yield.
  • the flavonoids are based on the (culture) medium containing the transgenic microorganisms in step (ii) preferably in an amount of 0.1 mM to 100 mM (m mol / L), preferably from 0.5 to 95 mM, more preferably from 1 to 90 mM, to the transgenic microorganism.
  • Suitable (co-) solvents can be used here.
  • the inducer e.g., IPTG or lactose
  • extractions with organic solvents can be made. These are preferably selected from the following list: isobutane, 2-propanol, toluene, methyl acetate, cyclohexane, 2-butanol, hexane, 1-propanol, light petroleum, 1,1,1,2-tetrafluoroethane, methanol, propane, 1-butanol, butane, ethyl methyl ketone, ethyl acetate, diethyl ether, ethanol, dibutyl ether, C0 2 , tert. Butyl methyl ether, acetone, dichloromethane and N 2 0.
  • a removal of the residual water in the solvent and the removal of the solvent itself can be offered, which in turn can be followed by a re-dissolving of the dihydrochalcone in a (possibly other) solvent, which is suitable for example for subsequent crystallization and drying of the product.
  • a re-dissolving of the dihydrochalcone in a (possibly other) solvent which is suitable for example for subsequent crystallization and drying of the product.
  • an adsorptive, a distillative and / or a chromatographic purification can take place.
  • drying processes in particular, vacuum belt drying, spray drying, distillation or lyophilization processes of the cell-containing or -free fermentation solution may be used.
  • transgenic microorganism is to be understood as meaning a genetically modified or modified microorganism in which nucleic acid sections (see nucleic acid sections (A) and (B), such as described herein) or genes of another organism (so-called transgenes) have been introduced.
  • Another object of the invention therefore comprises a transgenic microorganism containing
  • this is a microorganism selected from the group consisting of facultative anaerobic microorganisms, in particular facultative anaerobic bacteria, preferably proteobacteria, especially enterobacteria, for example of the genus Escherichia, preferably E. coli, in particular E. coli K12, E coli BL21 and E. coli MG1655 and their derivatives, yeasts, for example 5. cerevesiae and P. pastoris, K. lactis, H. polymorpha and fungi such as Aspergillus spp. or Trichoderma spp ..
  • BM3 microorganism Bacillus megaterium
  • BM3 microorganism Bacillus megaterium
  • F88V variant of BM3 in particular for the A75G / F88V variant of BM3, particularly preferably for variant A75G / F8V / L189Q / R472C of the BM3 or for the variant A75G / F88V / L189Q / A331S / R472C of the BM3 encoded, and / or
  • Methods for enabling expression of the desired amino acid sequences or of the desired enzymes on the basis of the introduced nucleic acid segments or of the transgenes are likewise sufficiently known to the person skilled in the art, e.g. using a regulatory element, in particular a promoter.
  • Another aspect of the present invention relates to a vector, i. a transport vesicle ("gene shuttle”) for transferring foreign nucleic acid (s) into a recipient cell, in particular a plasmid vector, which allows the cloning of one or more nucleic acid segments containing
  • the invention comprises a vector, preferably a plasmid vector, which is characterized in that it
  • a vector according to the invention for the purposes of the present invention may optionally contain further customary components, in particular those which express the expression of the transgenes described herein in microorganisms, in particular in those as above described, improved or possibly make possible.
  • a vector according to the invention preferably also contains one or more further constituents or elements selected from the group consisting of promoter, ori sequence, sequence for affinity chromatographic purification, selection marker, operator sequence, terminator, ribosomal binding sites, protease cleavage sequence, recombination binding sites, sequences of fusion proteins and chaperone sequences ,
  • the present invention also relates to a host cell containing one or more identical or different vectors of the invention as described herein.
  • a host cell which is both one or more vectors ....
  • a host cell according to the invention is preferably a microorganism to be used according to the invention or a microorganism according to the invention (as described above).
  • the host cells according to the invention or microorganisms to be used according to the invention or described herein are preferably used as (production) strain for the biotechnological production of flavonoids described herein, in particular of eriodictyol, hesperetin, sterubin and / or homoeriodictyol
  • flavanones can thus be converted biotechnologically into flavonoids, which are characterized by the fact that they taste less bitter and sweeter than the starting preparation and, at the same time, may be termed natural or nature-identical.
  • Another object of the invention is therefore directed to food preparations containing the flavonoids obtained by the process of the invention or a method for improving the flavor of the flavanone-containing food, comprising the conversion of the food by the method described above.
  • the resulting flavanone-containing foods or preparations suitable for food production are then converted by the process according to the invention into flavanoid-containing, naturally markable preparations and can then be used as such or after removal of the host cell and / or its constituents and optional concentration be used by physical processes as a preparation suitable for food production, preferably as a preparation suitable for food production with bitter-masking or sweet-enhancing effect.
  • suitable foods include in particular confectionery (for example, chocolates, chocolate bar products, other bar products, fruit gums, hard and soft caramels, chewing gum), alcoholic or non-alcoholic beverages (for example coffee, tea, iced tea, wine, wine-based drinks, beer, Beverages containing beer, liqueurs, brandies, brandy, (carbonated) fruit-based sodas, (carbonated) isotonic drinks, (carbonated) soft drinks, nectars, spritzers, fruit and vegetable juices, fruit or vegetable juice preparations and instant drinks (for example instant cocoa drinks, Instant tea drinks, instant coffee drinks, instant fruit drinks).
  • confectionery for example, chocolates, chocolate bar products, other bar products, fruit gums, hard and soft caramels, chewing gum
  • alcoholic or non-alcoholic beverages for example coffee, tea, iced tea, wine, wine-based drinks, beer, Beverages containing beer, liqueurs, brandies, brandy, (carbonated) fruit-based sodas, (carbonated) isotonic drinks, (carbonated) soft drinks
  • Citrus juices in particular orange juices, which contain a high content of naringin and can be converted by the method according to the invention into flavonoid-containing orange juices according to the invention are particularly preferred as the flavanone-containing food.
  • E. coli BL21 (DE) cells were incubated on ice for 5 minutes. After addition of 100 ng of plasmid DNA (pSYM_BM3), the suspension was stirred and incubated for an additional 10 minutes on ice. The transformation was carried out by the suspension for 30 s at 42 ° C in a water bath and then transferred for 5 min in ice water. Thereafter, 250 ⁇ S.O.C. Medium was added and the cells were cultured for 1 h at 37 ° C and 200 rpm. Finally, 200 ⁇ of the culture on LB agar were streaked with the respective antibiotic. The Petri dish was incubated for 14 h at 37 ° C.
  • the QuickChange II site-directed mutagenesis kit from Agilent was used. Using specific primers (Table 1) containing the desired mutation together with adjacent unmodified regions, a PCR was performed with the BM3 plasmid DNA. Subsequently, the PCR reaction was placed on ice for 2 minutes. This was followed by the addition of 10 U Dpn I, wherein the reaction for 1 h at 37 ° C is incubated.
  • the primer sequences for mutagenesis are shown in Table 1.
  • naringenin 200 ⁇ naringenin were dissolved in 50 mM Tris buffer, pH 7.5 and together with 5 mM glucose-6-phosphate, 14 U glucose-6-phosphate dehydrogenase, 100 ⁇ NADPH and 50 ⁇ cell extract (0.5 - 1 ⁇ CYP450) in a total volume of 1 mL for 14 h at 25 ° C and 200 rpm incubated. Subsequently, the reaction solution was extracted twice with 500 ⁇ of ethyl acetate, the organic phases were combined and the solvent was removed in vacuo.
  • E. coli BL21 (DE3) cells transformed with pSYM_BM3 were cultured in LB medium to an optical density of 600 nm of 0.7 and protein production was induced by addition of 1 mM isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside. After the incubation period of 3 h, the cultures were mixed directly with 200 ⁇ M eriodictyol and incubated at 37 ° C. for 14 h. The cultures were centrifuged at 20,000 x g for 10 min and extracted with three times the volume of ethyl acetate, the organic phase washed with a saturated saline solution and the solvent distilled off in vacuo.
  • Cells transformed with pSYM_BM3 and pSYM_PfOMT were inoculated in ZYM-5052 1:20 with starter culture and with 200 ⁇ naringenin and incubated at 38 ° C and 200 rpm for 24 h.
  • the course of the optical density, the gene expression and the substrate turnover were followed by regular sampling of 1 mL samples.
  • the cells were harvested by centrifugation at 14,000 xg for 10 minutes and digested by 150 ⁇ B-PER l l reagent (Thermo Scientific, Rockford) with 50 ⁇ DNAse I according to the manufacturer's instructions.
  • the obtained samples were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Cells transformed with pSYM_BM3 and pSYM_AOMT were inoculated in ZYM-5052 1:20 with starter culture and with 200 ⁇ naringenin and incubated at 38 ° C and 200 rpm for 24 h.
  • the course of the optical density, the gene expression and the substrate turnover were followed by regular sampling of 1 mL samples.
  • the cells were harvested by centrifugation at 14,000 x g for 10 minutes and digested by 150 ⁇ B-PER II reagent (Thermo Scientific, Rockford) with 50 ⁇ DNAse I according to the manufacturer's instructions.
  • the obtained samples were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.

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Abstract

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zur Herstellung von Flavonoiden, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines transgenen Mikroorganismus, enthaltend (i) einen ersten Nukleinsäure-Abschnitt (A), umfassend oder bestehend aus einem für eine CYP450-Oxidase kodierenden Gen, (ii) einen zweiten Nukleinsäure-Abschnitt (B), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche O-Methyltransferase kodierenden Gen, sowie (b) Hinzufügen eines oder mehrerer Flavanone zu dem transgenen Mikroorganismus, (c) die Umsetzung der Substrat Flavanone durch des transgenen Mikroorganismus zu den entsprechenden Flavonoiden, sowie gegebenenfalls (d) Isolierung und Aufreinigung der Endprodukte.

Description

VERFAHREN ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN HERSTELLUNG VON
FLAVONOIDEN
GEBIET DER ERFINDUNG
[0001 ] Die Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der Biotechnologie und betrifft ein Verfahren, bei dem man Flavanone ohne chemische Zwischenschritte in die entsprechenden Flavonoide umwandelt, einen entsprechenden Mikroorganismus, einen Vektor und eine Wirtszelle. STAND DER TECHNIK
[0002] Flavonoide wie beispielsweise Homoeriodictyol, Eriodictyol (EP 1258200 Bl) und Hesperetin (EP 1998636 Bl) stellen wichtige Geschmacks- und Aromastoffe dar. Üblicherweise werden diese Stoffe durch Aldolreaktion von freiem oder partiell methylierten Acetophloroglucinol mit freiem oder partiell methylierten Protocatechualdehyd erzeugt. Obwohl die Verfahren inzwischen industriell etabliert sind, weisen sie entscheidende Nachteile auf: so besteht die Notwendigkeit, die phenolischen Funktionen während des Reaktionsverlaufes mit Schutzgruppen zu versehen, die später wieder entfernt werden müssen. Dadurch werden die Synthesen vielstufig, d.h. technisch aufwendig und im Ergebnis natürlich auch kostspielig.
[0003] Gegenstand der WO 2005 115377 AI ist eine Nahrungsmittelzusammensetzung umfassend Flavonoide und Tocotrienol, worin die Flavonoide Naringenin, Hesperetin, Nobiletin oder Tangeretin darstellen können.
[0004] Besonders nachteilig ist indes, dass es sich hierbei um chemische Herstellverfahren handelt, d.h. aus regulatorischen Gründen dürfen die damit herstellten Lebensmittel- Zusatzstoffe, Geschmacksstoffe und Aromen nicht als natürlich bezeichnet werden. Die Kennzeichnung als natürlich oder naturidentisch ist indes für viele Verbraucher für ausschlaggebend für eine Kaufentscheidung, es liegt daher auf der Hand, dass ein besonderer Bedarf an entsprechenden Flavonoiden besteht, die diese Kennzeichnung tragen dürfen.
[0005] Ein Ausweg könnte die Gewinnung der Flavonoiden aus pflanzlichen Rohstoffen sein, beispielsweise durch Extraktion aus Eriodictyon spp. Diese Prozesse sind jedoch zeit- und kostenaufwändig, beruhen zum Teil auf Wildsammlungen der Pflanzen, sind saisonabhängig, Lösungsmittel- und Prozess-intensiv und daher ebenfalls für eine breite kommerzielle Nutzung ungeeignet. [0006] Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung hat somit da rin bestanden, ein Verfahren zur Herstellung von Flavonoiden, insbesondere von Eriodictyol, Hesperetin, Sterubin und/oder Homoeriodictyol zur Verfügung zu stellen, das frei von den eingangs geschilderten Nachteilen ist. Ein besonderes Augenmerk sollte darauf liegen, dass die Flavonoide in kurzen Reaktionszeiten und in hohen Ausbeuten zur Verfügung gestellt werden können, wobei das Verfahren frei von chemischen Reaktionsschritten sein sollte, damit die Reaktionsprodukte anschließend als natürlich oder naturidentisch bezeichnet werden können.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
[0007] Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Flavonoiden, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines transgenen Mikroorganismus, enthaltend
(i) einen ersten Nukleinsäure-Abschnitt (A), umfassend oder bestehend aus einem für eine CYP450-Oxidase kodierenden Gen,
(ii) einen zweiten Nukleinsäure-Abschnitt (B), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche O-Methyltransferase kodierenden Gen, sowie
(b) Hinzufügen eines oder mehrerer Flavanone zu dem transgenen Mikroorganismus,
(c) die Umsetzung der Substrat Flavanone durch des transgenen Mikroorganismus zu den entsprechenden Flavonoiden, sowie gegebenenfalls
d) Isolierung und Aufreinigung der Endprodukte.
[0008] Überraschenderweise wurde gefunden, dass durch Einbau von zwei unterschiedlichen N ukleinsäure-Abschnitten, die einmal ein für eine bakterielle CYP450 Oxidase und zum anderen ein für eine pflanzliche O-Methyltransferase kodierendes Gen enthalten in einen geeigneten Mikroorganismus, vorzugsweise einen fakultativ anaeroben Mikroorganismus ein System zur Verfügung steht, welches bei Zugabe von Flavanonen und Kultivierung die Umsetzung zum Flavonoid in kurzen Zeiten und ausgezeichneten Ausbeuten möglich macht.
[0009] Das Verfahren wird anhand des Beispiels Homoeriodictoyl aus Naringenin in dem fol enden Schema verdeutlicht:
Figure imgf000004_0001
[0010] Im Stand der Technik war bekannt, dass Naringenin durch transgene Mikroorganismen wie z.B. Sacharomyces cerevisiae, welche eine Flavonoid-3'-hydroxylase aus Gerbera hydrid oder eine CYP450-Oxidase aus Phanerochaete chrysosporium bilden1, in Eriodicytol umgewandelt werden kann (Kasai, N . et al. Enzymatic properties of cytochrome P450 catalyzing 3'-hydroxylation of naringenin from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 103-8 (2009)). Jedoch erfolgte hier die Umwandlung nur bis zum Eriodictyol, eine direkte Weiterreaktion zum Homoeriodictyol konnte bisher nicht nachgewiesen werden.
[0011 ] Weitere Verfahren zur Herstellung von Eriodictyol aus Naringenin sind in Kitamura, E. et al.„Production of Hydroxlated Flavonoids with Cytochrome P450 BM3 Variant F88V and Their Antioxidative Activities" [Biosci. Biotechnol. Biochem. 77, 1340-1343 (2013)] und Kabumoto, H., Miyazaki, K. & Arisawa, "A Directed Evolution of the Actinomycete Cytochrome P450 MoxA (CYP105) for Enhanced Activity" [Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 1922-1927 (2009)] veröffentlicht. Weiterhin sind hierunter keine (biotechnologischen) Verfahren zur Herstellung von Eriodictyol und/oder Homoeriodictyol im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verstehen, insbesondere kein Verfahren (wie oben beschrieben), das sich zur industriellen Herstellung von Eriodictyol und/oder Homoeriodictyol eignet, da die Ausbeuten als sehr gering einzuschätzen sind (z.B. 5,2 % in Kitamura et al.).
[0012] Aus J. Microbiol. Biotech. 16(7), s.1090-1096 (2006) Ist zudem die Methylierung von Flavonoiden unter Verwendung des Enzyms O-Methyltransferaseaus aus Bacillus cereus bekannt, wobei Homoeriodictyol aus Eriodictyol gebildet wird.
[0013] Im Rahmen der Untersuchungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung konnten für die Zwecke des hierin beschriebenen Verfahrens entscheidende molekularbiologische und biochemische Grundlagen der Biotransformation - mit dem Ziel der Produktion von Eriodictyol und/oder Homoeriodictyol in industriellem Maßstab - aufgeklärt und charakterisiert werden.
[0014] Im Stand der Technik sind zwar unterschiedliche Enzymsysteme zur Bildung von Eriodictyol ausgehend von Kaffeesäure beschrieben (Leonard, E., Yan, Y. & Koffas, M . A. G. „Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli" [Metab. Eng. 8, 172-81 (2006)] . Allerdings gehen diese stets vom in Pflanzen beschriebenen Biosyntheseweg für Flavonoide aus und wobei Naringenin nur als Zwischenprodukt gebildet wird. Weiterhin werden hier ausschließlich pflanzliche Enzyme genutzt. Eine Synthesemethode zur Bildung von Homoeriodicytol oder Hesperetin ausgehend von Naringenin ist noch nicht bekannt.
[0015] In den beiden internationalen Patentanmeldungen WO 2006 010117 AI (KOFFAS) und WO 2005 084305 AI (SCHM IDT-DANN ERT) ist die Anwendung heterologer Expression zur Bildung von Flavonoiden beschrieben. Darin werden (ausschließlich) pflanzliche Gene beschrieben, die für eine heterologe Expression verschiedener Substanzen (ausgehend von L-Phenylalanin, Tyrosin und Zimtsäure) genutzt werden.
[0016] Überraschenderweise wurde in der vorliegenden Erfindung eine Variante der CYP450-Oxidase aus Bacillus megaterium identifiziert, die durch heterologe Expression produziert werden konnte und Naringenin regioselektiv an der 3' bzw. 5'-Position hydroxyliert. Durch die zusätzliche Expression einer O-Methyltransferase gelingt es vorteilhafterweise, dass das intermediär gebildete Eriodictyol zum Homoeriodictyol umgewandelt wird. [0017] CYP450 OXIDASEN
[0018] Eine„CYP450-Oxidase" (CYP450) im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Enzym, das die Reaktion„Flavanon 3'-Hydroxyflavanon" katalysiert. Insbesondere katalysiert die CYP450 die Reaktion von Naringenin zu Eriodictyol (vgl. das eingangs gezeigte Reaktionsschema). Besonders bevorzugt sind CYP450-Oxidasen aus dem grampositiven Bakterium Bacillus megaterium.
[0019] Ausdrücklich bevorzugt ist daher ein Verfahren, bei dem das für eine bakterielle CYP450 Oxidase kodierende Gen für eine Oxidase aus dem Mikrorganismus Bacillus megaterium kodiert.
[0020] Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft demnach ein Verfahren, welches sich dadurch auszeichnet, dass der in den transgenen Mikroorganismus eingebrachte Nukleinsäure-Abschnitt (A)
(i-i) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:l (Nukleotidsequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-ii) eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2 (Nukleotidsequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/A331S/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-iii) eine ähnliche Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:lund/oder SEQ ID NO:2, , vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht.
[0021] Mutatis mutandis ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung ein Verfahren, bei dem die vorzugsweise bakterielle CYP450 Oxidase
(i-i) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:l (Nukleotidsequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-ii) eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2 (Nukleotidsequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/A331S/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-iii) eine ähnliche Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:l und/oder SEQ ID NO:2, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, enthält.
[0022] Eine weitere besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft demnach ein Verfahren, welches sich dadurch auszeichnet, dass der in den transgenen Mikroorganismus eingebrachte Aminosäure-Abschnitt (A)
(i-i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6 (Aminosäuresequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder (i-ii) eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:7 (Aminosäuresequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/A331S/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-iii) eine ähnliche Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:6 und/oder SEQ ID NO:7, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr, umfasst oder daraus besteht.
[0023] Mutatis mutandis ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung ein Verfahren, bei dem die vorzugsweise bakterielle CYP450 Oxidase
(i-i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6 (Aminosäuresequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-ii) eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:7 (Aminosäuresequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/A331S/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-iii) eine ähnliche Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:6 und/oder SEQ ID NO:7, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
[0024] enthält. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die „Nukleinsäure- und/oder Aminosäuresequenz-Identität" bevorzugt anhand des Waterman-Smith-Algorithmus mit einer Lückeneröffnungs-Strafe („gap open penalty") von 10, einer Lückenvergrößerungsstrafe („gap extension penalty") von 0,5 und der BLOSUM62-Matrix zu bestimmen (bezüglich des Waterman-Smith-Algorithmus siehe beispielsweise Smith, T.F. and Waterman, M.S.,„Identification of common molecular subsequences", Journal of Molecular biology (1981), 147:195-197; online implementiert über die entsprechende Werkzeugseite des EM BL). Die vorgelegten Nukleotid-Sequenzen wurden mit Hilfe der Software BISSAP des Europäischen Patentamtes gemäß WI PO Standard 25 erzeugt.
[0025] O-METHYLTRANSFERASEN
[0026] Eine „O-Methyltransferase" (OMT) im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Enzym, das die regiospezifische Methylierung bestim mter Verbindungen katalysiert, insbesondere die Reaktion von Eriodicytol zu Hesperetin, Sterubin und/oder Homoeriodictyol (vgl. das eingangs gezeigte Reaktionsschema). Besonders bevorzugt sind kationunabhängige O-Methyltransferasen aus Mesembryanthemum crystallinum oder Arabidopsis thaliana.
[0027] Ausdrücklich bevorzugt ist daher ein Verfahren, bei dem das für eine pflanzliche O- Methyltransferase kodierende Gen für eine O-Methyltransferase aus der Pflanzengattung Mesembryanthemum kodiert.
[0028] In Summe bevorzugt sind bestimmte Kombinationen aus CYP450 Oxidasen und O- Methyltransferasen, nämlich solchen die zum einen aus dem Bakterium Bacillis megaterium und zum anderen aus den Pflanzen der Spezies Mesembryanthemum crystallinum oder Arabidopsis thaliana gewonnen werden. Eine weitere besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft daher ein Verfahren welches sich dadurch auszeichnet, dass der in den transgenen Mikroorganismus eingebrachte Nukleinsäure-Abschnitt (B)
(ii-i) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:3 (N ukleotidsequenz der OMT aus M. cry- stallinum (McPFOMT)), und/oder
(ii-ii) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:4 (N ukleotidsequenz der O-Methyl- transferase 1 (OMT1)) und/oder
(ii-iii) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:5 (N ukleotidsequenz der O-Methyl- transferase (AOMT)) und/oder
(ii-iv) eine weitere Nukleotidsequenz mit einer N ukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und/oder SEQ ID NO:5, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
umfasst oder daraus besteht.
[0029] Mutatis-mutandis ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung ein Verfahren, bei dem die O-Methyltransferase
(ii-i) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:3 (N ukleotidsequenz der OMT aus M. cry- stallinum (McPFOMT)), und/oder
(ii-ii) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:4 (N ukleotidsequenz der O-Methyltransferase 1 (OMT1)) und/oder
(ii-iii) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:5 (N ukleotidsequenz der O-Methyltransferase (AOMT)) und/oder
(ii-vii) eine weitere Nukleotidsequenz mit einer N ukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und/oder SEQ ID NO:5, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
enthält.
Eine weitere besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft daher ein Verfahren welches sich dadurch auszeichnet, dass der in den transgenen Mikroorganismus eingebrachte Aminosäure-Abschnitt (B)
(ii-i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 (Aminosäuresequenz der OMT aus M. crystallinum (McPFOMT)), und/oder
(ii-ii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:9 (Aminosäuresequenz der O-Methyltransferase 1 (OMT1)) und/oder
(ii-iii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:10 (Aminosäuresequenz der O-Methyltransferase (AOMT)) und/oder
(ii-iv) eine weitere Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:8 und/oder SEQ ID NO:10, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
umfasst oder daraus besteht.
[0030] Mutatis-mutandis ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung ein Verfahren, bei dem die O-Methyltransferase
(ii-i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 (Aminosäuresequenz der OMT aus M. crystallinum (McPFOMT)), und/oder
(ii-ii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:9 (Aminosäuresequenz der O-Methyltransferase 1 (OMT1)) und/oder
(ii-iii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:10 (Aminosäuresequenz der O-Methyltransferase (AOMT)) und/oder
(ii-vii) eine weitere Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 und/oder SEQ ID NO:10, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
[0031 ] enthält.FLAVANONE
[0032] Das bzw. ein, mehrere oder sämtliche der erfindungsgemäß zu verwendenden Flavanone bzw. Vorstufen oder Derivate davon sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Naringenin, Naringin, Narirutin, oder andere natürlich vorkommenden oder künstlich hergestellten Naringeninglycoside, Sakuranetin, Sakuranetinglycoside, Isosakuranetin, Isosakuranetinglycoside, 4',7-Dihydroxy-flavanon oder dessen Glycoside, 4',7-Dihydroxy-3'-methoxy-flavanon oder dessen Glycoside, 3', 7- Dihydroxy-4'-methoxy-flavanon oder dessen Glycoside, 3',4',7-Trihydroxy-flavanon oder dessen Glycoside, wobei die Flavanone bezüglich der 2-Position des Flavanongerüsts als (S)-, als (R)-Enantiomer, als Racemat oder als beliebige Mischung der beiden Enantiomere vorliegen können.
[0033] Im Folgenden sind einige der bevorzugt einzusetzenden Flavanone exemplarisch abgebildet:
Figure imgf000010_0001
Liquiritigenin Pinocembrin Steppogenin
Figure imgf000010_0002
Scuteamoenin Dihydroechiodinin Ponci retin
Figure imgf000010_0003
7-Dihydroxy-3'-methoxyflavanon 3,7-Dihydroxy-4'-methoxyflavanon 3',4,7-Trihydroxy-flavanon
Figure imgf000010_0004
Pinostrobin
Figure imgf000010_0005
4'-Hydroxyflavanon 3-Hydroxyflavanon Tsugafolin [0034] Die erfindungsgemäß herzustellenden Flavonoide sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Eriodictyol und dessen Glycoside (z.B. Eriocitrin, Neoeriocitrin), Homoeriodictyol und dessen Glycoside, Sterubin und dessen Glycoside, Hesperidin, Hesperetin und andere Hesperetinglycoside (z.B. Neohesperidin), Apigenin und dessen Glycoside, Luteolin, Diosmetin, Chrysoeriol
[0035 Im Folgenden sind erfindungsgemäß besonders bevorzugte Flavonoide abgebildet:
Figure imgf000011_0001
Sterubin Homoeriodictyol Apigenin
Figure imgf000011_0002
Luteolin Diosmetin Chrysoeriol
[0036] Besonders bevorzugte Flavanone und die jeweils daraus gebildeten Flavonoide sind: Naringenin und Eriodictyol, Naringenin und Homoeriodictyol, Naringenin und Sterubin, Naringenin und Hesperetin Naringin und Eriodictyol, Naringin und Homoeriodictyol, Naringin und Hesperetin, Naringenin und Apigenin, Naringenin und Luteolin, Naringenin und Sterubin, Naringenin und Diosmetin, Naringenin und Chryseriol, Naringin und Luteolin, Naringin und Sterubin, Naringin und Diosmetin sowie Naringin und Chryseriol. [0037] KULTIVIERUNG; EXPRESSION UND ISOLIERUNG
[0038] Wie oben beschrieben wird bzw. werden in Schritt (ii) eines erfindungsgemäßen Verfahrens ein oder mehrere Flavanone zu dem transgenen Mikroorganismus hinzugefügt, wobei der transgene Mikroorganismus unter Bedingungen kultiviert wird, die die Umsetzung des bzw. der Flavanone ermöglichen.
[0039] Gemäß einer bevorzugten Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens werden die transgenen Mikroorganismen zunächst, d.h. vor Schritt (ii), unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise bis zum Erreichen einer maximalen Biomassenkonzentration, kultiviert. Dabei sollte die OD600 bevorzugt wenigstens im Bereich von 1 bis 15 oder darüber liegen, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 300, insbesondere im Bereich von 10 bis 275, bevorzugt im Bereich von 15 bis 250. Anschließend werden die Mikroorganismen in Schritt (ii) bevorzugt unter anaeroben Bedingungen kultiviert, wobei die Expression der gewünschten Aminosäuresequenzen bzw. der gewünschten Enzyme auf Basis der eingeschleusten Nukleinsäure-Abschnitte bzw. der eingeschleusten Transgene erfolgt, beispielsweise angeregt mittels I nduktion durch IPTG und/oder Lactose (bei Verwendung eines entsprechenden, geeigneten Promotors bzw. eines entsprechenden, geeigneten Expressionssystems).
[0040] Grundsätzlich ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die I nkubation in Schritt (ii) zumindest teilweise oder vollständig unter aeroben Bedingungen erfolgt.
[0041 ] Je nach Mikroorganismus kann der Fachmann in Schritt (ii) für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Umgebungsbedingungen schaffen und insbesondere ein geeignetes (Kultivierungs-)Medium bereitstellen. Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise in LB- oder TB-Medium. Alternativ kann ein (komplexeres) Medium bestehend oder umfassend pflanzliche Rohstoffe, insbesondere aus Zitrus-, Grapefruit- und Orange-Pflanzen, verwendet werden. Die Kultivierung erfolgt beispielsweise bei einer Temperatur von mehr als 20 °C, bevorzugt von mehr als 25 °C, insbesondere von mehr als 30 °C (bevorzugt im Bereich von 30 bis 40 °C), was insbesondere die Bildung von Homoeriodictyol aus Naringenin begünstigen bzw. die Ausbeute erhöhen kann. Weiterhin kann auch eine Temperatur zur I nduktion (vgl. oben) von weniger als 40 °C, insbesondere von weniger als 35 °C (bevorzugt im Bereich von 20 bis 30 °C), die Bildung von Homoeriodictyol begünstigen bzw. die Ausbeute erhöhen.
[0042] Die Flavonoide werden bezogen auf das (Kultivierungs-) Medium, das die transgenen Mikroorganismen enthält, in Schritt (ii) vorzugsweise in einer Menge von 0,1 mM bis 100 mM (m Mol / L), bevorzugt von 0,5 bis 95 mM, besonders bevorzugt von 1 bis 90 mM, zu dem transgenen Mikroorganismus hinzugefügt. Hierbei können geeignete (Ko-)Solventien zum Einsatz kommen.
[0043] Falls zur I nduktion (z.B. des lac-operons) ein oder mehrere geeignete Induktoren, z.B. IPTG oder Lactose , verwendet werden, ist es bevorzugt, den Induktor bezogen auf das (Kultivierungs-)Medium, das die transgenen Mikroorganismen enthält, in Schritt (ii) in einer Menge von 0,001 bis 1 mM, bevorzugt von 0,005 bis 0,9 mM, besonders bevorzugt von 0,01 bis 0,8 mM, einzusetzen, da hierbei besonders gute Ausbeuten erzielt werden können.
[0044] Zu Isolierung oder Aufreinigung der exprimierten Flavonoide kann beispielsweise Extraktionen mit organischen Lösemitteln vorgenommen werden. Diese sind bevorzugt ausgewählt aus der folgenden Liste: Isobutan, 2-Propanol, Toluol, Methylacetat, Cyclohexan, 2-Butanol, Hexan, 1-Propanol, Light petroleum, 1,1,1,2-Tetrafluorethan, Methanol, Propan, 1-Butanol, Butan, Ethylmethylketon, Ethylacetat, Diethylether, Ethanol, Dibutylether, C02, tert. Butylmethylether, Aceton, Dichloromethan und N20. Besonders bevorzugt sind solche Lösungsmittel, die mit Wasser eine optisch erkennba re Phasengrenze ausbilden. Hiernach kann sich eine Entfernung des Restwassers im Lösemittel sowie die Entfernung des Lösemittels selbst anbieten, an die sich wiederum ein Rücklösen des Dihydrochalkons in einem (ggf. anderen) Lösemittel anschließen kann, welches z.B. für eine gegebenenfalls nachfolgende Kristallisation und Trocknung des Produkts geeignet ist. Alternativ oder ergänzend können eine adsorptive, eine destillative und/oder eine chromatographische Aufreinigung erfolgen.
[0045] Alternativ können zur Isolierung oder Aufreinigung der gebildeten Flavonoide Verfahren der Trocknung, insbesondere Verfahren der Vakuumbandtrockung, Sprühtrocknung, Destillation oder Lyophilisation der zellhaltigen oder -freien Fermentationslösung verwendet werden. [0046] TRANSGENE MIKROORGANISMEN
[0047] Unter einem „transgenen Mikroorganismus" ist im Zusam menhang mit der vorliegenden Erfindung ein gentechnisch veränderter bzw. modifizierter Mikroorganismus zu verstehen, in den gezielt mittels biotechnologischer Verfahren Nukleinsäure-Abschnitte (siehe N ukleinsäure-Abschnitte (A) und (B) wie hierin beschrieben) bzw. Gene eines anderen Organismus (sog. Transgene) eingeschleust worden sind.
[0048] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfasst daher einen transgener Mikroorganismus, enthaltend
(i) einen ersten N ukleinsäure-Abschnitt (A) enthaltend ein für eine bakterielle CYP450 Oxidase kodierendes Gen, sowie
(ii) einen zweiten Nukleinsäure-Abschnitt (B), enthaltend ein für eine pflanzliche O- Methyltransferase kodierendes Gen.
[0049] Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen Mikroorganismus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fakultativ anaeroben Mikroorganismen, insbesondere fakultativ anaeroben Bakterien, bevorzugt Proteobakterien, insbesondere Enterobakterien, zum Beispiel der Gattung Escherichia, bevorzugt E. coli, insbesondere E. coli K12, E. coli BL21 und E. coli MG1655 und deren Abkömmlinge, Hefen, zum Beispiel 5. cerevesiae und P. pastoris, K. lactis, H. polymorpha sowie Pilze wie Aspergillus spp. oder Trichoderma spp..
[0050] Der erfindungsgemäße transgene Mikroorganismus zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass
(i) das für eine CYP450-Oxidase kodierende Gen für eine CYP450-Oxidase aus dem Mikroorganismus Bacillus megaterium (BM3), vorzugsweise für die F88V Variante der BM3, insbesondere für die A75G/F88V Variante der BM3, besonders bevorzugt für die Variante A75G/F88V/L189Q/R472C der BM3 oder für die Variante A75G/F88V/ L189Q/A331S/R472C der BM3 kodiert, und/oder
(ii) das für eine O-Methyltransferase kodierende Gen für eine O-Methyltransferase aus einer Pflanze der Ordnung der Brassicales, vorzugsweise der Familie der Brassicaceae, bevorzugt der Unterfamilie der Camelineae, insbesondere der Gattung der Arabidopsis, vor allem der Art Arabidopsis thaliana, oder der Ordnung der Caryophyllales, vorzugsweise der Familie der Aizoaceae, bevorzugt der Unterfamilie der Mesembryanthemoideae, insbesondere der Gattung der Mesembryanthemum, vor allem der Art Mesembryanthemum crystalliunum, also besonders bevorzugt für eine O-methyltransferase aus ,4. thaliana oder M. crystalliunum kodiert.
[0051 ] Methoden, um auf Basis der eingeschleusten Nukleinsäure-Abschnitte bzw. der Transgene eine Expression der gewünschten Aminosäuresequenzen bzw. der gewünschten Enzyme zu ermöglichen, sind dem Fachmann ebenfalls hinreichend bekannt, z.B. unter Verwendung eines regulatorischen Elements, insbesondere eines Promotors.
[0052] VEKTOR
[0053] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, d.h. ein Transportvesikel („Genfähre") zur Übertragung von Fremd-Nukleinsäure(n) in eine Empfängerzelle, insbesondere einen Plasmidvektor, der das Klonieren eines oder mehrerer Nukleinsäure-Abschnitte ermöglicht, enthaltend
(i) einen ersten N ukleinsäure-Abschnitt (A) enthaltend ein für eine bakterielle CYP450 Oxidase kodierendes Gen, sowie
(ii) einen zweiten Nukleinsäure-Abschnitt (B), enthaltend ein für eine pflanzliche O- Methyltransferase kodierendes Gen.
[0054] Ebenfalls umfasst die Erfindung einen Vektor, vorzugsweise einen Plasmidvektor, der sich dadurch auszeichnet, dass er
(i) einen ersten N ukleinsäure-Abschnitt (A) enthaltend ein für eine bakterielle CYP450 Oxidase kodierendes Gen, sowie
(ii) einen zweiten Nukleinsäure-Abschnitt (B), enthaltend ein für eine pflanzliche O- Methyltransferase kodierendes Gen
aufweist.
[0055] Neben Nukleinsäure-Abschnitt(en) (A) und (B) kann ein erfindungsgemäßer Vektor für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls weitere übliche Bestandteile, insbesondere solche, die die Expression der hierin beschriebenen Transgene in Mikroorganismen, insbesondere in solchen wie oben beschrieben, verbessern oder gegebenenfalls erst ermöglichen. Grundsätzlich enthält ein erfindungsgemäßer Vektor vorzugsweise zudem einen oder mehrere weitere Bestandteile bzw. Elemente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Promotor, ori-Sequenz, Sequenz zur affinitätschromatographischen Reinigung, Selektionsmarker, Operatorsequenz, Terminator, ribosomale Bindestellen, Proteasespaltsequenz, Rekombinationsbindestellen, Sequenzen von Fusionsproteinen und Chaperonsequenzen.
[0056] WIRTSZELLE
[0057] Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, enthaltend ein oder mehrere identische oder unterschiedliche erfindungsgemäße Vektoren wie hierin beschrieben. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Wirtszelle, die sowohl ein oder mehrere Vektoren .... [0058] Bei einer erfindungsgemäßen Wirtszelle handelt es sich vorzugsweise um einen erfindungsgemäß einzusetzenden bzw. einen erfindungsgemäßen Mikroorganismus (wie oben beschrieben). Die hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Wirtszellen bzw. erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismen sind bzw. dienen vorzugsweise als (Produktions-)Stamm zur biotechnologischen Herstellung hierin beschriebener Flavonoide, insbesondere von Eriodictyol, Hesperetin, Sterubin und/oder Homoeriodictyol
[0059] ZUBEREITUNGEN
[0060] Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich somit Flavanone auf biotechnologischem Wege in Flavonoide umwandeln, die dadurch charakterisiert sind, dass sie weniger bitter und süßer schmecken als die Ausgangszubereitung und gleichzeitig als natürlich oder naturidentisch bezeichnet werden dürfen.
[0061 ] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher auf Nahrungsmittelzubereitungen gerichtet, die die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Flavonoide enthalten bzw. ein Verfahren zur Verbesserung des Geschmacks des Flavanon-haltigen Lebensmittels, umfassend die Umwandlung des Lebensmittels durch das oben beschriebene Verfahren.
[0062] Die so erhaltenen Flavanon-haltigen Lebensmittel oder zur Lebensmittelherstellung geeigneten Zubereitungen werden dann mit den erfindungsgemäßen Verfahren in Flavanoid-haltige, natürlich bezeichenbare Zubereitungen umgewandelt und können dann als solche verwendet werden oder nach Entfernung der Wirtszelle und/oder deren Bestandteilen und optionaler Aufkonzentration durch physikalische Prozesse als zur Lebensmittelherstellung geeigneten Zubereitung, bevorzugt als zur Lebensmittelherstellung geeigneten Zubereitung mit bittermaskierender oder süßverstärkender Wirkung eingesetzt werden.
[0063] Beispiele für geeignete Nahrungsmittel umfassen insbesondere Süßwaren (beispielsweise Schokoladen, Schokoladenriegelprodukte, sonstige Riegelprodukte, Fruchtgummi, Hart- und Weichkaramellen, Kaugummi), alkoholische oder nicht-alkoholische Getränke (beispielsweise Kaffee, Tee, Eistee, Wein, weinhaltige Getränke, Bier, bierhaltige Getränke, Liköre, Schnäpse, Weinbrände, (carbonisierte) fruchthaltige Limonaden, (carbonisierte) isotonische Getränke, (carbonisierte) Erfrischungsgetränke, Nektare, Schorlen, Obst- und Gemüsesäfte, Frucht- oder Gemüsesaftzubereitungen sowie Instantgetränke (beispielsweise I nstant-Kakao-Getränke, I nstant-Tee-Getränke, Instant- Kaffeegetränke, Instant-Fruchtgetränke).
[0064] Besonders bevorzugt sind dabei als Flavanon-haltigen Lebensmittel Zitrussäfte, insbesondere Orangensäfte, die einen hohen Gehalt an Naringin enthalten und durch das erfindungsgemäße Verfahren in erfindungsgemäße Flavonoid-haltige Orangensäfte umgewandelt werden können. BEISPIELE
[0065] BEISPIEL 1
Bereitstellen transgener Mikroorganismen (vgl. Schritt (i))
[0066] Transformation
[0067] Auf 50 μΙ aliquotierte chemisch kompetente E. coli BL21(DE) Zellen wurden für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 100 ng Plasmid-DNA (pSYM_BM3) wurde die Suspension gerührt und für weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die Transformation erfolgte indem die Suspension für 30 s bei 42 °C in einem Wasserbad und nachfolgend für 5 min in Eiswasser überführt wurde. Danach wurden 250 μΙ S.O.C. Medium zugegeben und die Zellen wurden für 1 h bei 37 °C und 200 rpm kultiviert. Letztlich wurden 200 μί der Kultur auf LB-Agar mit dem jeweiligen Antibiotikum ausgestrichen. Die Petrischale wurde für 14 h bei 37°C inkubiert.
[0068] Mutagenese
[0069] Es wurde der QuickChange II Site-Directed Mutagenese Kit der Firma Agilent verwendet. Mit Hilfe von spezifischen Primern (Tabelle 1), welche die gewünschte Mutation samt angrenzenden unmodifizierten Bereichen enthalten, wurde eine PCR mit der BM3- Plasmid-DNA durchgeführt. Anschließend wurde der PCR-Reaktionsansatz für 2 Minuten auf Eis platziert. Danach erfolgte die Zugabe von 10 U Dpn I, wobei die Reaktion für 1 h bei 37 °C inkubiert wird. Die Primersequenzen für die Mutagenese sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
[0070] Tabelle 1
Primersequenzen für die Mutagenese
Figure imgf000016_0001
[0071 ] BEISPIEL 2
Biotechnologische Herstellung von Eriodictyol (vgl. Schritt (ii))
[0072] Enzymatische Darstellung von Eriodicytol
[0073] 200 μΜ Naringenin wurden in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5 gelöst und zusammen mit 5 mM Glucose-6-phosphat, 14 U Glucose-6-phosphat dehydrogenase, 100 μΜ NADPH und 50 μί Zellextrakt (0,5 - 1 μΜ CYP450) in einem Gesamtvolumen von 1 mL für 14 h bei 25°C und 200 rpm inkubiert. Nachfolgend wurde die Reaktionslösung zweimal mit 500 μί Ethylacetat extrahiert, wobei die organischen Phasen vereinigt wurden und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde.
[0074] Fermentative Darstellung von Eriodicytol
[0075] Mit pSYM_BM3 transformierte E. coli BL21 (DE3)-Zellen wurden in LB-Medium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,7 kultiviert und die Proteinproduktion durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid induziert. Nach der I nkubationszeit von 3 h wurden die Kulturen direkt mit 200 μΜ Eriodictyol versetzt und bei 37 °C für 14 h inkubiert. Die Kulturen wurden bei 20.000 x g für 10 min zentrifugiert und mit dem dreifachen Volumen an Ethylacetat extrahiert, die organische Phase mit einer gesättigten Kochsalzlösung gewaschen und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert.
[0076] BEISPIEL 3
Biotechnologische Herstellung von Homoeriodictyol und/oder Hesperertin (vgl. Schritt (ii))
[0077] Enzymatische Darstellung von Homoeriodicytol
[0078] 20 μΜ Eriodicytol wurden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 gelöst und zusammen mit 1 μΜ PfOMT, 250 μΜ Magnesiumchlorid und 1 mM S-Adenosylmethionin für 10 Minuten bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Nachfolgend wurde die Reaktionslösung zweimal mit 500 μί Ethylacetat extrahiert, wobei die organischen Phasen vereinigt wurden und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde.
[0079] Fermentative Darstellung von Homoeriodicytol (vgl. Schritt (ii))
[0080] Mit pSYM_BM3 und pSYM_PfOMT transformierte Zellen wurden in ZYM-5052 1:20 mit Starterkultur sowie mit 200 μΜ Naringenin angeimpft und bei 38°c und 200 rpm für 24 h inkubiert. Der Verlauf der optischen Dichte, der Genexpression und des Substratumsatzes wurden regelmäßige Entnahme von 1 mL Proben verfolgt. Zur Analyse wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 10 Minuten geerntet und mittels 150 μί B-PER l l- Reagenz (Thermo Scientific, Rockford) mit 50 μί DNAse I nach Herstellerangaben aufgeschlossen. Die erhaltenen Proben wurden mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Zur Analyse der Substratumsetzung wurden 1 mL der Kultur zweimal mit 500 μί Ethylacetat extrahiert, wobei die organischen Phasen vereinigt wurden und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Die Proben wurden nachfolgend in Acetonitril aufgenommen und mittels HPLC und UPLC-MS/MS analysiert.
[0081 ] Enzymatische Darstellung von Hesperetin
[0082] 20 μΜ Eriodicytol wurden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 gelöst und zusammen mit 1 μΜ AOMT, 250 μΜ Magnesiumchlorid und 1 mM S-Adenosylmethionin für 10 Minuten bei 37°C und 200 rpm inkubiert. Nachfolgend wurde die Reaktionslösung zweimal mit 500 μί Ethylacetat extrahiert, wobei die organischen Phasen vereinigt wurden und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde.
[0083] Fermentative Darstellung von Hesperetin
[0084] Mit pSYM_BM3 und pSYM_AOMT transformierte Zellen wurden in ZYM-5052 1:20 mit Starterkultur sowie mit 200 μΜ Naringenin angeimpft und bei 38°c und 200 rpm für 24 h inkubiert. Der Verlauf der optischen Dichte, der Genexpression und des Substratumsatzes wurden regelmäßige Entnahme von 1 mL Proben verfolgt. Zur Analyse wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 10 Minuten geerntet und mittels 150 μί B-PER ll- Reagenz (Thermo Scientific, Rockford) mit 50 μί DNAse I nach Herstellerangaben aufgeschlossen. Die erhaltenen Proben wurden mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Zur Analyse der Substratumsetzung wurde 1 mL der Kultur zweimal mit 500 μί Ethylacetat extrahiert, wobei die organischen Phasen vereinigt wurden und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Die Proben wurden nachfolgend in Acetonitril aufgenommen und mittels HPLC und UPLC-MS/MS analysiert.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von Flavonoiden, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines transgenen Mikroorganismus, enthaltend
(i) einen ersten Nukleinsäure-Abschnitt (A), umfassend oder bestehend aus einem für eine CYP450-Oxidase kodierenden Gen,
(ii) einen zweiten Nukleinsäure-Abschnitt (B), umfassend oder bestehend aus einem für eine pflanzliche O-Methyltransferase kodierenden Gen, sowie
(b) Hinzufügen eines oder mehrerer Flavanone zu dem transgenen Mikroorganismus,
(c) die Umsetzung der Substrat Flavanone durch des transgenen Mikroorganismus zu den entsprechenden Flavonoiden, sowie gegebenenfalls
(d) Isolierung und Aufreinigung der Endprodukte.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das für eine bakterielle CYP450 Oxidase kodierende Gen für eine Oxidase aus dem Mikrorganismus Bacillus megaterium kodiert.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das für eine pflanzliche O-Methyltransferase kodierende Gen für eine O-Methyltransferase aus der Pflanzengattung Mesembryanthemum kodiert.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet dass der in den transgenen Mikroorganismus eingebrachte Nukleinsäure-Abschnitt (A)
(i-i) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:l (Nukleotidsequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-ii) eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2 (Nukleotidsequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/A331S/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-iii) eine ähnliche Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:l und/oder SEQ ID NO:2, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
umfasst oder daraus besteht.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die CYP450 Oxidase
(i-i) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:l (Nukleotidsequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder (i-ii) eine Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2 (Nukleotidsequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/A331S/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-iii) eine ähnliche Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:l und/oder SEQ ID NO:2, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
enthält.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der in den transgenen Mikroorganismus eingebrachte Aminosäure-Abschnitt (A)
(i-i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6 (Aminosäuresequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-ii) eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:7 (Aminosäuresequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/A331S/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-iii) eine ähnliche Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:6 und/oder SEQ ID NO:7, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
umfasst oder daraus besteht.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die vorzugsweise bakterielle CYP450 Oxidase
(i-i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:6 (Aminosäuresequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-ii) eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:7 (Aminosäuresequenz der für die A75G/ F88V/L189Q/A331S/R472C Variante der bakterielle CYP450 aus B. megaterium ATCC 14581 kodierenden Gens) und/oder
(i-iii) eine ähnliche Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:6 und/oder SEQ ID NO:7, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
enthält.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet dass der in den transgenen Mikroorganismus eingebrachte Nukleinsäure-Abschnitt (B)
(ii-i) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:3 (Nukleotidsequenz der OMT aus M. crystallinum (McPFOMT)), und/oder
(ii-ii) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:4 (Nukleotidsequenz der O- Methyltransferase 1 (OMT1)) und/oder (ii-iii) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:5 (N ukleotidsequenz der 0- Methyltransferase (AOMT)) und/oder
(ii-iv) eine weitere Nukleotidsequenz mit einer N ukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und/oder SEQ ID NO:5, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
umfasst oder daraus besteht.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die O-Methyltransferase
(ii-i) eine N ukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:3 (N ukleotidsequenz der OMT aus M. crystallinum (McPFOMT)), und/oder
(ii-ii) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:4 (N ukleotidsequenz der O- Methyltransferase 1 (OMT1)) und/oder
(ii-iii) eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:5 (N ukleotidsequenz der O- Methyltransferase (AOMT)) und/oder
(ii-iv) eine weitere Nukleotidsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und/oderSEQ ID NO:5, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
enthält.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der in den transgenen Mikroorganismus eingebrachte Aminosäure-Abschnitt (B)
(ii-i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 (Aminosäuresequenz der OMT aus M. crystallinum (McPFOMT)), und/oder
(ii-ii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:9 (Aminosäuresequenz der O- Methyltransferase 1 (OMT1)) und/oder
(ii-iii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:10 (Aminosäuresequenz der O- Methyltransferase (AOMT)) und/oder
(ii-iv) eine weitere Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:8 und/oder SEQ ID NO:10, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
umfasst oder daraus besteht.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die O-Methyltransferase
(ii-i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:8 (Aminosäuresequenz der OMT aus M. crystallinum (McPFOMT)), und/oder
(ii-ii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:9 (Aminosäuresequenz der O- Methyltransferase 1 (OMT1)) und/oder (ii-iii) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:10 (Aminosäuresequenz der 0- Methyltransferase (AOMT)) und/oder
(ii-iv) eine weitere Aminosäuresequenz mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40 % oder mehr zu SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 und/oder SEQ ID NO:10, vorzugsweise von 50 % oder mehr, 60 % oder mehr oder 80 % oder mehr, besonders bevorzugt von 95 % oder mehr,
enthält.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Flavanone ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Naringenin, Naringin, Narirutin, oder anderen natürlich vorkommenden oder künstlich hergestellten Naringeninglycosiden, Sakuranetin, Sakuranetinglycoside, Isosakuranetin, Isosakuranetinglycosiden, 4',7-Dihydroxy- flavanon oder dessen Glycosiden, 4',7-Dihydroxy-3'-methoxy-flavanon oder dessen Glycosiden, 3',7-Dihydroxy-4'-methoxy-flavanon oder dessen Glycosiden, 3',4',7-Trihydroxy-flavanon oder dessen Glycosiden, wobei die Flavanone bezüglich der 2-Position des Flavanongerüsts als (S)-, als (R)-Enantiomer, als Racemat oder als beliebige Mischung der beiden Enantiomere vorliegen können.
Transgener Mikroorganismus, enthaltend
(i) einen ersten Nukleinsäure-Abschnitt (A) enthaltend ein für eine bakterielle CYP450 Oxidase kodierendes Gen, sowie
(ii) einen zweiten Nukleinsäure-Abschnitt (B), enthaltend ein für eine pflanzliche O- Methyltransferase kodierendes Gen.
Mikroorganismus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen fakultativ anaeroben Mikroorganismus handelt.
Mikroorganismus nach den Ansprüchen 13 und/oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass
(i) das für eine CYP450-Oxidase kodierende Gen für eine CYP450-Oxidase aus dem Mikroorganismus Bacillus megaterium (BM3) kodiert, und/oder
(ii) das für eine O-Methyltransferase kodierende Gen für eine O-Methyltransferase aus A thaliana oder M. crystalliunum kodiert.
Vektor, enthaltend
(i) einen ersten Nukleinsäure-Abschnitt (A) enthaltend ein für eine bakterielle CYP450 Oxidase kodierendes Gen, sowie
(ii) einen zweiten Nukleinsäure-Abschnitt (B), enthaltend ein für eine pflanzliche O- Methyltransferase kodierendes Gen.
Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass er
(i) einen ersten Nukleinsäure-Abschnitt (A) enthaltend ein für eine bakterielle CYP450 Oxidase kodierendes Gen, sowie
(ii) einen zweiten Nukleinsäure-Abschnitt (B), enthaltend ein für eine pflanzliche O- Methyltransferase kodierendes Gen. aufweist.
18. Wirtszelle, enthaltend mindestens einen Vektor nach den Ansprüchen 16 und/oder 17.
19. Verfahren zur Verbesserung des Geschmacks des Flavanon-haltigen Lebensmittels, umfassend die Umwandlung des Lebensmittels durch das Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020165182A1 (fr) * 2019-02-11 2020-08-20 Abolis Biotechnologies Methode de biosynthese de la diosmetine et/ou de l hesperetine dans un microorganisme
WO2021058115A1 (en) * 2019-09-27 2021-04-01 Symrise Ag Methods for the biocatalytical manufacturing of dihydrochalcones

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10975403B2 (en) 2017-08-09 2021-04-13 Conagen Inc. Biosynthesis of eriodictyol from engineered microbes
WO2020077367A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 Conagen Inc. Biosynthesis of homoeriodictyol
KR20220081975A (ko) * 2019-10-14 2022-06-16 코나겐 인크. 에리오딕티올의 생합성
CN113462624B (zh) * 2021-06-08 2023-01-10 湖南省农产品加工研究所 基于人工设计的基因工程菌群落及其构建方法和应用
WO2025024794A2 (en) * 2023-07-26 2025-01-30 Debut Biotechnology, Inc. Bioproduction of phloretin

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005084305A2 (en) * 2004-03-01 2005-09-15 Regents Of The University Of Minnesota Flavonoids
WO2005115377A1 (en) * 2004-05-26 2005-12-08 Kgk Synergize Inc Functional foods comprising flavonoids and tocotrienols and methods thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10122898A1 (de) 2001-05-11 2002-11-14 Haarmann & Reimer Gmbh Verwendung von Hydroxyflavanonen zur Maskierung des bitteren Geschmacks
EP1778850A4 (de) 2004-07-10 2011-09-21 Univ New York State Res Found Herstellung von flavonoiden anhand von rekombinanten mikroorganismen
EP2368442B1 (de) 2005-07-27 2014-12-17 Symrise AG Verwendung von Hesperetin zur Verstärkung von süßem Geschmack

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005084305A2 (en) * 2004-03-01 2005-09-15 Regents Of The University Of Minnesota Flavonoids
WO2005115377A1 (en) * 2004-05-26 2005-12-08 Kgk Synergize Inc Functional foods comprising flavonoids and tocotrienols and methods thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMI KITAMURA ET AL: "Production of Hydroxlated Flavonoids with Cytochrome P450 BM3 Variant F87V and Their Antioxidative Activities", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, vol. 77, no. 6, 23 June 2013 (2013-06-23), pages 1340 - 1343, XP055187653, ISSN: 0916-8451, DOI: 10.1271/bbb.130148 *
HIROKI KABUMOTO ET AL: "Directed Evolution of the Actinomycete Cytochrome P450 MoxA (CYP105) for Enhanced Activity", BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, vol. 73, no. 9, 23 September 2009 (2009-09-23), pages 1922 - 1927, XP055187656, ISSN: 0916-8451, DOI: 10.1271/bbb.90013 *
KASAI N ET AL: "Enzymatic properties of cytochrome P450 catalyzing 3'-hydroxylation of naringenin from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, vol. 387, no. 1, 11 September 2009 (2009-09-11), pages 103 - 108, XP026378960, ISSN: 0006-291X, [retrieved on 20090701], DOI: 10.1016/J.BBRC.2009.06.134 *
LEE YOON JUNG ET AL: "Biotransformation of flavonoids with O-methyltransferase from Bacillus cereu", JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 1 July 2006 (2006-07-01), Korea, pages 1090 - 1096, XP055188134, Retrieved from the Internet <URL:http://dfpcorec-p.internal.epo.org/wf/web/citenpl/citenpl.html> [retrieved on 20150507] *
LUDGER A WESSJOHANN ET AL: "Alkylating enzymes", CURRENT OPINION IN CHEMICAL BIOLOGY, vol. 17, no. 2, 1 April 2013 (2013-04-01), pages 229 - 235, XP055188075, ISSN: 1367-5931, DOI: 10.1016/j.cbpa.2013.02.016 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020165182A1 (fr) * 2019-02-11 2020-08-20 Abolis Biotechnologies Methode de biosynthese de la diosmetine et/ou de l hesperetine dans un microorganisme
US12188067B2 (en) 2019-02-11 2025-01-07 Abolis Biotechnologies Method for biosynthesising diosmetin and/or hesperetin in a microorganism
WO2021058115A1 (en) * 2019-09-27 2021-04-01 Symrise Ag Methods for the biocatalytical manufacturing of dihydrochalcones
WO2021058783A3 (en) * 2019-09-27 2021-06-17 Symrise Ag Methods for the biocatalytical manufacturing of dihydrochalcones

Also Published As

Publication number Publication date
EP3002335A1 (de) 2016-04-06
US20180135029A1 (en) 2018-05-17
US10435673B2 (en) 2019-10-08

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