WO2016049877A1

WO2016049877A1 - 无创产前亲子鉴定中基于str分型技术的检测方法和系统

Info

Publication number: WO2016049877A1
Application number: PCT/CN2014/087987
Authority: WO
Inventors: 蒋浩君; 芦静; 陈芳; 蒋慧; 徐讯; 刘萍
Original assignee: 深圳华大基因股份有限公司
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2016-04-07

Abstract

本发明提供了一种无创产前亲子鉴定的检测方法和系统。所述方法包括如下步骤：1）选取STR并设计引物；2）用所述引物对来自孕妇和疑似父的样本的核酸进行扩增，得到扩增序列；3）对所述扩增序列进行测序以得到测序序列；4）对于上述测序序列，获得各STR相应的碱基序列，根据所述碱基序列进行STR分型；5）对获得的STR型别进行筛选；6）进行亲子鉴定相关参数的计算。

Description

无创产前亲子鉴定中基于STR分型技术的检测方法和系统

技术领域

本发明涉及亲子鉴定领域，具体涉及无创产前亲子鉴定的检测方法和系统。

背景技术

亲子鉴定是一项利用法医学、生物学和遗传学的技术，尤其是利用基因指纹分析技术(genetic fingerprinting)来判断两个个体是否具有亲子遗传关系[1-3]。现有的亲子鉴定技术主要是利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、限制性片段长度多态性(restricted fragment length polymorphisms，RFLP)和短串联重复片段(short tandem repeat)多态性技术来计算父权指数(paternity index)和亲子关系的可能性(probability of parentage)，从而进行判断[4]。

近年来，随着司法案件尤其是强奸案件对产前亲子鉴定的需要，亲子鉴定技术也逐渐应用于该领域。现有的方法主要基于有创取样，包括绒毛膜绒毛取样(chorionic villus sampling，CVS)和羊水穿刺(amniocentesis)，但是这样的取样会造成一定流产风险。羊水穿刺会有1/300～1/500的流产风险[5]，并有一定造成一些其他并发症的可能[6-7]。绒毛膜穿刺同样有类似的流产风险，并有1/3000会造成胎儿肢体发育不全，尤其是取样时间在10周之前时[8-9]。

1997年在孕妇血浆中游离胎儿DNA(fetal cell-free DNA，cff DNA)的发现，使得无创产前检测成为可能，无创产前检测将会避免有创取样带来的风险[10]。尽管cff DNA在1997年就已经发现了，但可靠的基于孕妇外周血的无创产前检测仍未成功开发出来，其原因在于cff DNA在孕妇血浆中含量较低，一般认为＜20％，而在低孕周孕妇中其含量更低，并且cff DNA为高度片段化样本，其片段大小在140-196bp左右[12]。如何有效的克服这样的壁垒并将其应用到无创产亲子鉴定领域的问题急需解决。

基于现有的有创取样技术(绒毛膜穿刺或羊水穿刺)，取样时间均不可早于10周。而一般强奸案中引产时间均在10周左右。无创产前亲子鉴定技术应运而生，但是现有的技术大多基于SNP分型技术成本较高[13]，而基于STR分型技术的检测方法又仅能检测怀有男胎的样本且需要构建文库，均存在一定的局限性[14]。

因此，开发一种基于现有STR分型方法但适用于所有孕妇尤其是低孕周(6-9周)的检测流程，迫在眉睫。

发明内容

本发明首次提供了一种基于短串联重复序列(STR)分型技术的检测方法或系统，应用于在无创产前亲子鉴定中，并且该发明的检测方法或系统包括现有的基于Sanger测序、二代高通量测序的分型技术，在大规模样本运用中，首次创新性的采用了高通量建库策略，可快速大规模(例如一次多达144例样本)筛选适应于二代测序平台的(包括但不限于Illumina Hiseq或Miseq、Ion Torrent)文库。该发明的检测方法或系统不限于胎儿性别，可适用于6到24周孕周，可有效的进行产前的无创亲子鉴定。

本发明提供了一种无创产前亲子鉴定中基于STR分型技术的检测方法和系统，所述方法和系统包括如下步骤：

1)选取STR(例如，根据STR数据库(http：//www.cstl.nist.gov/strbase/)和相关文献报道)，并针对这些STR设计引物；

2)用所述引物对进行来自实验相关样本的核酸扩增，得扩增序列，所述实验相关样本包括孕妇的外周血样本(例如5ml)和来自疑似父的样本，所述孕妇的外周血样本优选在采样后(例如2h内)通过离心进行血浆分离，得到孕妇的血浆样本和白细胞样本，所述来自疑似父的样本优选为全血、唾液、血斑、毛发；

3)对所述扩增序列进行测序，得到其序列；

4)对于上述序列，获得各STR相应的碱基序列，根据所述碱基序列进行STR分型，例如碱基序列来源可选地为一代Sanger测序序列和二代高通量测序序列，对Sanger序列将通过ABI 3130测序仪自带的IDX软件进行STR分型，如可得到D13S317为9，11型别，针对二代测序序列将通过软件进行STR分型；

5)对获得的STR型别(如D13S317为9，11型别)进行筛选筛选，标准为：1)特定的STR位点如D13S317有型别结果，2)特定的STR位点如D13S317的型别结果不能超过三态，例如D13S317为9，11，12，14则该位点不合格，不可用于下一步计算；

6)进行亲子鉴定相关参数的计算，包括CPI、W，其中CPI为累加父权系数，由每个STR位点的父权系数PI(paternity index)相乘而得，在亲子鉴定中作为评判肯定父权关系的重要指标，当CPI大于400，一般即可肯定性父权(http：//baike.baidu.com/view/29220.htm？fr＝aladdin)，W为亲子可能性，即当W计算为99％时，则说明有99％的可能这个疑似父是胎儿的父亲，1％的可能不是这个胎儿的父亲。

所述检测不限于胎儿性别，适用于低孕周检测，孕周达到6周即可用此方法检测。

所述选取STR包括：

选取16个常染色体STR位点，分别是CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、vWA、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、Penta D、Penta E、D2S1338、Amelogenin，

选取16个Y染色体STR位点，分别是DYS438、DYS391、DYS392、DYS393、DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS458、DYS19、DYS385、DYS439、DYS635、Y-GATA-H4、DYS437、DYS448，

选取8个X染色人体STR位点，分别是DXS7130、DXS7424、DXS101、DXS10147、DXS7132、DXS6803、HPRTB、DXS7423。

本发明的方法和系统最大限度地利用既有的STR分型系统，以及对二代测序的利用，有效的对低孕周不限胎儿性别的孕妇进行无创产前进行检测。

本发明还可以描述为：

1.一种无创产前亲子鉴定中基于STR分型技术的检测方法，所述方法包括如下步骤：

1)选取STR，并针对这些STR设计引物；

2)用所述引物对进行来自孕妇和疑似父的样本的核酸扩增，得扩增序列；

3)对所述扩增序列进行测序，得到测序序列；

4)对于上述测序序列，获得各STR相应的碱基序列，根据所述碱基序列进行STR分型；

5)对获得的STR型别进行筛选筛选，标准为：

保留有型别结果且型别结果不超过三态的STR位点用于下一步计算；

6)进行亲子鉴定相关参数的计算并根据所述参数确定亲子关系，所述参数包括CPI、W，其中CPI为累加父权系数，由每个STR位点的父权系数PI相乘而得，W为父权概率，表示亲子可能性，

优选地，所述检测不限于胎儿性别，适用于低孕周检测，孕周达到6周即可用此方法检测。

2.上述第1项的方法，所述来自孕妇的样本包括孕妇的外周血样本，所述孕妇的外周血样本优选在采样后(例如2h内)通过离心进行血浆分离，得到孕妇的血浆样本和白细胞样本。

3.上述第1或2项的方法，所述来自疑似父的样本为全血、唾液或血斑。

4.上述第1-3任一项的方法，所述适用于二代高通量测序的文库构建方法采用基于大规模建库的纳米孔技术的Wafergen平台建库方法。

5.上述第1-4任一项的方法，所述碱基序列来源可选地为一代Sanger测序序列和二代高通量测序序列，例如，对Sanger序列将通过ABI 3130测序仪自带的IDX软件进行STR分型，如可得到D13S317为9，11型别，例如针对二代测序序列将通过软件进行STR分型。

6.上述第1-5任一项的方法，父权指数PI的计算公式为：PI＝X/Y，

其中X＝具有疑似父亲遗传表型的男子是孩子生物学父亲的概率，Y＝随机男子是孩子生物学父亲的概率。

7.上述第6项的方法，父权累加指数

其中PIi为STR位点为i时的父权指数PI。

8.上述第7项的方法，父权概率W的计算公式为：W＝CPI/(CPI+1)。

9.上述第1-8任一项的方法，当CPI大于400，为肯定性父权。

10.上述第1-9任一项的方法，所述检测不限于胎儿性别。

11.上述第1-10任一项的方法，所述检适用于低孕周检测；例如，孕周达到6周即可检测。

12.上述第1-11任一项的方法，所述选取STR包括：

13.一种STR位点的组合，包括：

16个常染色体STR位点，分别是CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、vWA、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、Penta D、Penta E、D2S1338、Amelogenin，

16个Y染色体STR位点，分别是DYS438、DYS391、DYS392、DYS393、DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS458、DYS19、DYS385、DYS439、DYS635、Y-GATA-H4、DYS437、DYS448，

8个X染色人体STR位点，分别是DXS7130、DXS7424、DXS101、DXS10147、DXS7132、DXS6803、HPRTB、DXS7423。

14.一种STR分析亲子关系的信息分析方法：

1)筛选具有型别结果的STR位点，且型别不超过三态的结果

2)进行亲子鉴定相关参数的计算，并根据所述参数确定亲子关系，

所述参数包括CPI、W，其中CPI为累加父权系数，由每个STR位点的父权系数PI相乘而得，W为父权概率，表示亲子可能性。

在一个实施方案中，父权指数PI的计算公式为：PI＝X/Y，

其中X＝具有疑似父亲遗传表型的男子是孩子生物学父亲的概率，Y＝随机男子是孩子生物学父亲的概率；

优选地，父权累加指数

其中PIi为STR位点类型为i时的父权指数PI；

优选地，当CPI大于400，为肯定性父权；

优选地，父权概率W的计算公式为：W＝CPI/(CPI+1)。

附图说明

图1为高通量芯片。

图2为整个发明的实施过程路线图。

图3文库质量检测中2100检测峰图。

具体实施方式

定义

本发明所称的“STR”是短串联重复序列，又称为微卫星DNA，重复单位为 2-6bp，重复次数10-60多次，基因片段，400bp以下。

本发明所称的“STR型别”是指STR genotype，即STR的基因型，STR具有两个等位基因，如D13S317型别可为9，11(http：//www.cstl.nist.gov/strbase/glossary.htm)。具体而言，在STR型别中，不同的数字代表该位点不同的拷贝数，如D8S1179型别为12，14，即意味着在D8S1179的基因位置一个具有12个核心序列的拷贝数，另一个等位基因的位置具有14个核心序列的拷贝数。

本文所用的“条形码(barcode)”是指由一组按某种规则排列的碱基序列构成的标记，用以表示一定的信息。

本发明所称的“内引物”是指加入特定连接序列的针对某一特定位点的引物，即在原有的普通引物F和R的5’加入特定的公共接头。

本发明所称的“外引物”(包括外侧正向引物和反向引物)是指.含有特定的公共接头和适应于二代测序序列的引物。

在一个具体实施方案中，本发明的方法和系统具体实施步骤如下：

1.STR位点筛选和评估，引物设计和测试；可用试剂盒了解筛选，了解内容包括该试剂盒所包含的STR位点数，STR位点具体情况即是哪几个位点，以及该位点引物扩增后的长度，由于血浆中游离DNA长度在170bp左右，所以引物扩增产物原则上不大于300bp；

2.实验相关样本所需的实验相关样本包括孕妇的外周血样本5ml，在采样后2h内通过离心进行血浆分离，得到孕妇的血浆样本和白细胞样本，来自疑似父的样本，可选的为全血、唾液、血斑，并对实验检材进行相应的DNA提取包括但不限于血浆、全血和血斑DNA提取；

3.对提取DNA进行定量和质量评估；

4.对特定STR位点进行扩增；

5.对扩增产物进行测序，测序方案包括Sanger测序、Ion Torrent测序但不限于此；

6.对测序数据进行分析，获得特定STR型别；

7.对获得的STR型别进行筛选和评估，并进行亲子鉴定相关参数包括CPI等计算；

8.对得到的结果进行进一步确认评估。

一种无创产前亲子鉴定中基于传统STR分型技术的检测方法和系统，具体实施步骤如下：

1.STR位点筛选，根据http：//www.cstl.nist.gov/strbase/数据进行筛选，具体为根据STR基因频率分布情况，多态性结合文献报道情况，选择常用的有效的STR位点。引物设计和测试，测试内容包括内引物特异性验证，具体过程如下：

内引物来料一般为干粉，暂不溶解时保存在-20℃。引物溶解前应14000rpm离心5min，再根据根据引物订购单给出的nmol数对引物进行溶解(引物溶解至10μM时，加入溶解液体积为100乘以nmol数，例如引物为2.5nmol，加入水250μL，则引物浓度为10μM)。引物溶解前超净工作台需要提前灭菌30min，溶解时不能打开风，可以间断开风去污染，开风时所有引物管盖都要盖上。加入溶解液后，Votex混匀，离心。用移液器转适量内引物溶液至96孔板备用。内引物稀释至250nM each(2.5μL Primer F+2.5μL Primer R+95μLH₂O)置于96孔板内，用铝封膜封好后再盖上一层塑料膜。暂不使用时-20℃保存。

内引物验证体系：

引物验证程序：

95℃ 5min；

10个循环：

95℃ 15sec

60℃ 30sec

72℃ 1min；

2个循环：

8个循环：

95℃ 15sec

60℃ 30sec

72℃ 1min；

2个循环：

8个循环：

95℃ 15sec

60℃ 30sec

72℃ 1min；

15个循环：

对以上PCR产物进行电泳检测，结果可见图1，仅展示其中一部分数据。仅用于举例说明。

2.可用试剂盒筛选，具体为了解内容包括该试剂盒所包含的STR位点数，STR位点具体情况即是哪几个位点，以及该位点引物扩增后的长度，由于血浆中游离DNA长度在170bp左右，所以引物扩增产物原则上不大于300bp，根据以上标准进行初步过滤，对选中的试剂盒进行检测实验。实验包括使用S1样本的全血DNA命名为S1-blood、S1全血DNA随机打断到200bp的打断DNA样本命名为S1-blood-cut、S1样本的血浆提取DNA样本命名为S1-Plasma，使用选定的试剂盒进行扩增，并进行Sanger测序，使用相关软件如IDx、GeneMapper4.0进行STR分型，根据所得的结果一致性进行判断。结果详见表1：

表1：

根据STR数据库(http：//www.cstl.nist.gov/strbase/)和相关文献报道，选取16个常染色体STR位点，16个Y染色体STR位点，8个X染色体STR位点，并设计适用于wafergen平台(可参考网站http：//www.wafergen.com/seq-ready/custom/)扩增的引物，引物如下表所列：

除上面发明人自己设计的引物之外，也可选择其他公司已推出的用于STR扩增的试剂盒，如

MiniFiler^TMPCR Amplification Kit和AmpFLSTR Yfiler kit，但不限于此。

3.DNA提取

1)血浆DNA提取

根据SNAVO或Tiangen DP316提取试剂盒操作说明书进行DNA提取。样本来自采集孕妇的5ml外周血，在2h内进行离心，得到血浆和白细胞样本，具体过程如下：

外周血的分离步骤：

4.室温静置半个小时，在4℃条件下以1600g离心10分钟，离心后将上清(血浆)分装到多个2.0ml的离心管中，在吸取的过程中注意不要吸取到中间层的白细胞。

5.在4℃条件下对分装的2.0ml的离心管以16000g(正常14000g)离心10分钟，去除残余细胞，将上清转入新的1.5ml或2.0ml的离心管中，即为所需的血浆。打上标签-80℃保存。

简言之，提取上述分离的孕妇血浆600ul，等分3管，每管200ul分别进行提取，共回溶DNA体积20ul，如体积过大，可采用真空浓缩仪进行浓缩以达到适合的体积。

2)全血DNA提取

根据QIAamp DNA Mini kit或DNeasy 96 Blood & Tissue Kit提取试剂盒说明书中对全血的提取说明进行DNA提取。样本来源为上步分离的孕妇的白细胞以及采集的来自疑似父的5ml外周血样本简言之，提取全血初体积为200ul，回溶100ul。

3)血斑DNA提取

根据Tiagen DP316试剂盒中对血斑的提取说明书进行DNA提取。样本来源为采取的来自疑似父的血斑样本，该实施例中为全血样本，回溶体积为20ul。

6.DNA定量

采用德国BMG公司的POLARstar Omega全自动化酶标仪进行DNA定量，定量样本包括提取的孕妇血浆DNA、孕妇的白细胞DNA、疑似父的全血DNA，每个样本定量各需4ul。

7.对特定STR位点进行扩增

的提取DNA发明人自主研发的STR扩增系统扩增的全为mini-STR，包含16个常染色体mimi-STR，16个Y染色体mini-STR和8个X染色体mini-STR。该类mini-STR扩增引物包含测序引物结合的序列，经过两轮扩增后可直接定量上机。

选择自主设计的引物中的16个常染色体STR、16个Y染色体STR和8个染色体中的4个X染色体STR共计36个位点。通过高通量PCR的方法进行目的片段的扩增。本发明采用的高通量PCR芯片(由wafergen公司进行提供，订购网址为http：//www.wafergen.com/seq-ready/custom/共有5184个(36*144)微量PCR反应孔(图1)，每个反应孔可进行100nL体系的PCR反应，每个样品检测54个位点总共只需要30ng的基因组DNA。应用含有条形码的外引物和本发明设计的内引物进行一轮PCR反应，扩增出目的片段，同时将每个样品加上条形码和测序接头，使PCR产物不必再经过测序文库的构建过程，直接进行二代高通量测序。本发明中应用的高通量PCR扩增芯片每个样品检测36个STR位点，一次可以进行144个样品的PCR反应，相当于一次可以构建144个二代测序文库，大大节省了测序文库构建的时间和成本。应用高通量PCR芯片配套的试剂及外引物进行目的片段扩增及建库，具体过程如下：

1)配制PCR Mix：

根据高通量芯片36*144的模式，wafergen平台提供不同模式的反应，具体情况如下表，按如下表体系配制PCR Mix，震荡混匀后，放在冰盒上备用：

2)准备样品板：

将144个待测样品浓度全部稀释至10ng/μL，每孔20μL分装至两块96孔PCR板中，再根据芯片36×144的模式，分别将PCR Mix，模板DNA，外侧反向引物，根据wafergen公司提供的36*144模式样本加样表加入到384孔板相应的96个孔位，Outer Reverse Primer连有条形码，注意按事先安排好的条形码编号严格对应样品，具体加入体积如下表所示：

3)准备引物板：

将引物干粉稀释至100μM配制成母液，再将母液稀释至0.25μM，每孔100μL分装至96孔板中，再根据芯片36×144的模式，分别将PCR Mix，根据wafergen公司提供的36*144模式的引物加样表内引物对加入到384孔板的相应的36个孔位，具体加入体积如下表所示：

试剂 V/孔

PCR Mix 12.2μL

内引物Pair(0.25μM) 8.1μL

4)上机点样：

分别将样品板和芯片放入点样仪的相应位置，选择36×144的模式，50nL体积，开始点样。约30min点样结束后，取下芯片，将芯片用特定封口膜封好，离心。取下样品板，封口膜封口存入-20℃冰柜备用。再将引物板和离心好的芯片放入点样仪的相应位置，选择36×144的模式，50nL体积，开始点样。约30min点样结束后，取下芯片，封口膜封口，离心，准备上PCR扩增。取下引物板，封口膜封口存入-20℃冰柜备用。

5)PCR仪扩增

离心好的芯片，特定PCR仪运行如下程序：

95℃ 5min；

10个循环：

95℃ 15sec

60℃ 30sec

72℃ 1min；

2个循环：

8个循环：

95℃ 15sec

60℃ 30sec

72℃ 1min；

2个循环：

8个循环：

95℃ 15sec

60℃ 30sec

72℃ 1min；

15个循环：

6)产物纯化

将上述步骤得到的扩增产物应用板式离心机离心后收集到500ul的EP管中，取50ul加入1.5倍体积的磁珠进行产物纯化。

7)质量检测

应用Agilent 2100Bioanalyzer和荧光定量PCR(QPCR)进行文库质量检测，2100检测峰图如图3所示，片段范围200-300bp，符合扩增目的片段大小，具体检测结果如下：

其余文库质控要求同PGM上机文库需达到的要求。

当样本数量较少时，可采用multi-PCR的方式，进行手工构建二代测序文库。在一个具体实例中，具体过程如下：

8.将16对常染色体STR引物，16对Y染色体STR引物和8对X染色体STR引物稀释到100uM。分别各自取1ul引物稀释液至新的1.5ml的Epp管内，则得引物混合液共计80ul，其中每对引物的浓度为均2.5uM。

9.进行首轮PCR，目的为扩增出目的条带，PCR配制Mix如下：

PCR反应程序如下：

95℃ 3min；

30个循环：

10.进行二轮PCR，目的为加上测序所需的接头和条形码，将上步PCR产物稀释100倍，PCR反应配制的Mix如下：

PCR反应程序如下：

95℃ 3min；

30个循环：

11.对上述PCR产物进行纯化

1倍磁珠进行纯化。

12.对纯化产物进行质检

13.应用Agilent 2100Bioanalyzer和荧光定量PCR(QPCR)进行文库质量检测，2100检测峰图如图2所示，片段范围200-300bp，符合扩增目的片段大小，具体检测结果如下：

14.对扩增产物进行测序，获得STR序列

根据第4步不同的获得目的STR位点产物的扩增方法的不同，进行不同测序方法。

1)Sanger测序

采取市场上常用STR试剂盒

MiniFiler^TMPCR Amplification Kit和AmpFLSTR Yfi ler kit直接扩增的产物用ABI 3130或ABI3730进行测序，通过荧光信号获得指定STR的序列。

2)二代测序平台

对于构建的文库进行测序，包含但不仅限于Life Ion Torrent平台，现以Ion Torrent平台为例。选择的测序类型为PGM 400。每个样本每个位点的测序数据量为1000读段(read)。

7.对STR序列进行STR分型

1)对Sanger数据进行分析

根据ABI 3130附带软件GeneMap4.0或id-x和STR数据库进行STR分型，以得到不同样本的不同STR位点的基因型，用于下步累计父权系数、亲子指数的计算。

2)对二代测序平台数据进行分析

本发明中优先采取的测序类型为Ion Torrent测序，故此流程是针对Ion Torrent平台数据进行分析，对下机数据进行T-map比对后，过滤含有完整STR序列读段，与STR数据库进行比对，确定STR型别，以得到不同样本的不同STR位点的基因型，用于下步累计父权系数、亲子指数的计算。

8.筛选合格的STR位点

选取特定扩增成功的STR位点并且母亲STR型别和胎儿不一样的位点，作为后续分析。结果见表2，本实施例采用的是

MiniFiler^TMPCR Ampl ification Kit和AmpFLSTR Yfiler kit试剂盒，试剂盒分别共包含9个常染色体STR位点和16个Y染色体位点，根据ABI软件id-x的分析结果进行整理汇总。

表2为常染色体STR分型结果。

表2为Y染色人体STR分型结果：16个常染色体STR型别信息，不同的数字代表该位点不同的拷贝数，如D8S1179型别为12，14，即意味着在D8S1179的基因位置一个具有12个核心序列的拷贝数，另一个等位基因的位置具有14个核心序列的拷贝数。

表2：

表3：16个Y染色体STR型别

基因座	母亲	父亲	孕期血浆
基因座	母亲	父亲	孕期血浆	DYS456	无	16	16
DYS389 I	无	13	13	DYS456	无	16	16
DYS389 I	无	13	13	DYS390	无	23	无
DYS389 II	无	30	无	DYS390	无	23	无
DYS389 II	无	30	无	DYS458	无	17	17
DYS19	无	15	无	DYS458	无	17	17
DYS19	无	15	无	DYS385	无	13/17	无
DYS393	无	14	14	DYS385	无	13/17	无
DYS393	无	14	14	DYS391	无	10	10
DYS439	无	10	无	DYS391	无	10	10
DYS439	无	10	无	DYS635	无	20	无
DYS392	无	13	无	DYS635	无	20	无
DYS392	无	13	无	GATA_H4	无	10	10
DYS437	无	14	无	GATA_H4	无	10	10
DYS437	无	14	无	DYS438	无	11	无
DYS448	无	18	18	DYS438	无	11	无

将STR分型结果按照不同的位点进行整理成表格形式，以便清晰明了地显示分型结果。具体的挑选过程为：

1.整理孕妇血浆、孕妇白细胞DNA、疑似父DNA的STR分型结果，并按表2和表3进行表格绘制；

2.分析STR分型结果是否准确可靠，对于全基因组的STR位点而言，其分型结果一般为杂合或纯合，如出现3态结果，如D13S317为9，11，12则认为有污染，则去除该点。对于血浆DNA的STR位点的分型结果有以下几种情况：

根据上述穷举法得到的有效信息可进一步整理为下表：

以上结果均建立在特定STR位点扩增过程中未有错误引入，我们每次实验均进行2次平行实验并在前期进行STR判定准确性评估，结果显示准确性较高。

9.根据计算公式进行计算非父排除率，父权指数，累加父权指数，父权系数。

非父排除率用于计算该类系统(如该实施例中最后选用8个STR位点进行无创亲子鉴定)的排除任一男性为非父的能力，如EPP等于99.9％时即意味着有99.9％的能力可以排除非父。

父权指数为每个STR位点可以肯定父权的能力，如D13S317的PI值为2时，即通过该位点可以判定该疑似父是该胎儿父亲的可能性是随机男性的2倍。

累加父权系数是该系统所有STR位点可以肯定父权的能力，如该实施例中最后CPI为6064，即意味着该疑似父是该胎儿的父亲的可能性是随机男性的6064倍。

父权系数为判断疑似父亲和该胎儿是父子关系的可能性，如该实施例中W等于99.98％，即意味着该疑似父和该胎儿是父子的可能性为99.98％。

其中非父排除率的计算公式为：

上述公式中pi和pj为某一STR类型为i和j的频率，如D8S1179类型为12的频率为0.131；

父权指数PI的计算公式为：PI＝X/Y，

上述公式中X＝具有被控父亲遗传表型的男子是孩子生物学父亲的概率，Y＝随机男子是孩子生物学父亲的概率；

父权累加指数

上述公式中PIi为STR位点为i时的父权指数PI；

父权概率W的计算公式为：W(RCP)＝CPI/(CPI+1)，

上述公式中CPI为之前计算的父权累加指数，RCP为“父子关系的相对机会(relative chance of paternity)”的缩写。

结果见表4根据PI的计算公式分别计算X具有被控父亲遗传表型的男子是孩子生物学父亲的概率和Y＝随机男子是孩子生物学父亲的概率，从而得到不同STR位点的PI值，并进行相乘后得到累加父权系数CPI。

表4为根据过滤标准后过滤的STR位点，按照上述公式，通过在http：//www.ehstrafd.org/modules/AFGT/form.cfm 和http：//www.genebase.com/in/dnaMarkerDetail.php？t＝y&d＝str&m＝DYS458网址查阅相关的STR位点相关型别的频率信息。

10.判定结果的可靠性

分析方法主要是选取生物学意义上无关的90个男性进行与给定案例胎儿的亲子关系判定，与受试样品的疑似父进行比较，结果与实际完全符合，从而进一步确认了受试样品之间的亲子关系。

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Claims

一种无创产前亲子鉴定中基于STR分型技术的检测方法，所述方法包括如下步骤：

1)选取STR，并针对所选STR设计引物；

2)用所述引物对进行来自孕妇和疑似父的样本的核酸扩增，得扩增序列；

3)对所述扩增序列进行测序，得到测序序列；

4)对于上述测序序列，获得各STR相应的碱基序列，根据所述碱基序列进行STR分型；

5)对获得的STR型别进行筛选，标准为：

保留有型别结果且型别结果不超过三态的STR位点用于下一步计算；

6)进行亲子鉴定相关参数的计算并根据所述参数确定亲子关系，所述参数包括CPI、W，其中CPI为累加父权系数，由每个STR位点的父权系数PI相乘而得，W为父权概率，表示亲子可能性。
权利要求1的方法，所述来自孕妇的样本包括孕妇的外周血样本，优选所述孕妇的外周血样本优选在采样后(例如2h内)通过离心进行血浆分离，得到孕妇的血浆样本和白细胞样本。
权利要求1或2的方法，所述来自疑似父的样本为全血、唾液或血斑、毛发。
权利要求1-3任一项的方法，所述适用于二代高通量测序的文库构建方法采用基于大规模建库的纳米孔技术的Wafergen平台建库方法。
权利要求1-4任一项的方法，所述碱基序列来源为一代Sanger测序序列或二代高通量测序序列，例如对Sanger序列将通过ABI 3130测序仪自带的IDX软件进行STR分型，例如可得到D13S317 为9，11型别，例如针对二代测序序列将通过软件进行STR分型。
权利要求1-5任一项的方法，父权指数PI的计算公式为：PI＝X/Y，

其中X＝具有疑似父亲遗传表型的男子是孩子生物学父亲的概率，Y＝随机男子是孩子生物学父亲的概率；

优选地，父权累加指数

其中PIi为STR位点类型为i时的父权指数PI；

优选地，当CPI大于400，为肯定性父权；

优选地，父权概率W的计算公式为：W＝CPI/(CPI+1)。
权利要求1-6任一项的方法，所述检测不限于胎儿性别。
权利要求1-7任一项的方法，所述检测适用于低孕周检测；例如，孕周达到6周即可检测。
权利要求1-8任一项的方法，所述选取STR包括：

选取16个常染色体STR位点，分别是CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、vWA、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、Penta D、Penta E、D2S1338、Amelogenin，

选取16个Y染色体STR位点，分别是DYS438、DYS391、DYS392、DYS393、DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS458、DYS19、DYS385、DYS439、DYS635、Y-GATA-H4、DYS437、DYS448，

选取8个X染色人体STR位点，分别是DXS7130、DXS7424、DXS101、DXS10147、DXS7132、DXS6803、HPRTB、DXS7423。
一种STR位点的组合，包括：

16个常染色体STR位点，分别是CSF1PO、FGA、TH01、TPOX、vWA、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、Penta D、Penta E、D2S1338、Amelogenin，

16个Y染色体STR位点，分别是DYS438、DYS391、DYS392、DYS393、DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS458、DYS19、DYS385、DYS439、DYS635、Y-GATA-H4、DYS437、DYS448，

8个X染色人体STR位点，分别是DXS7130、DXS7424、DXS101、DXS10147、DXS7132、DXS6803、HPRTB、DXS7423。
一种STR分析亲子关系的信息分析方法：

1)筛选具有型别结果的STR位点，且型别不超过三态的结果

2)进行亲子鉴定相关参数的计算，并根据所述参数确定亲子关系，

所述参数包括CPI、W，其中CPI为累加父权系数，由每个STR位点的父权系数PI相乘而得，W为父权概率，表示亲子可能性。
根据权利11所述方法，父权指数PI的计算公式为：PI＝X/Y，

其中X＝具有疑似父亲遗传表型的男子是孩子生物学父亲的概率，Y＝随机男子是孩子生物学父亲的概率；

优选地，父权累加指数

其中PIi为STR位点类型为i时的父权指数PI；

优选地，当CPI大于400，为肯定性父权；

优选地，父权概率W的计算公式为：W＝CPI/(CPI+1)。