WO2016039339A1 - 脱髄疾患の予防又は治療剤 - Google Patents

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WO2016039339A1
WO2016039339A1 PCT/JP2015/075473 JP2015075473W WO2016039339A1 WO 2016039339 A1 WO2016039339 A1 WO 2016039339A1 JP 2015075473 W JP2015075473 W JP 2015075473W WO 2016039339 A1 WO2016039339 A1 WO 2016039339A1
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fgf21
group
cells
demyelinating disease
production
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PCT/JP2015/075473
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里衣子 池田
真里子 黒田
山下　俊英
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国立大学法人大阪大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Definitions

  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for demyelinating diseases. More specifically, the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for demyelinating diseases that can promote the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells and can effectively repair the myelin sheath. Furthermore, the present invention relates to a method for preventing or treating a demyelinating disease.
  • Nerve cells are in contact with other nerve cells by extending neurites, and nerve functions are carried by propagation of nerve activity through this contact.
  • the central nervous system which consists of the brain and spinal cord, most of the neurites are covered with myelin sheaths.
  • the myelin sheath accelerates the propagation of nerve activity by promoting jumping conduction of the nerve activity, and also contributes to the maintenance of homeostasis of the axon inside the myelin sheath.
  • Demyelinating diseases are broadly divided into two groups: central nervous system such as multiple sclerosis and acute disseminated encephalomyelitis, and peripheral nervous system such as Guillain-Barre syndrome and chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuritis.
  • central nervous system such as multiple sclerosis and acute disseminated encephalomyelitis
  • peripheral nervous system such as Guillain-Barre syndrome and chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuritis.
  • the In multiple sclerosis one of the demyelinating diseases of the central nervous system, abnormal activation of the autoimmune system causes demyelinating lesions in time and space, visual impairment, sensory impairment, motor dysfunction, autonomy Symptoms such as neuropathy appear.
  • Multiple sclerosis has a prevalence in Japan of 8-9 per 100,000 people, and there are approximately 12,000-16000 affected people in Japan.
  • Demyelinating diseases including multiple sclerosis Establishing a fundamental treatment method has become an urgent issue.
  • myelin sheaths are formed by oligodendrocyte progenitor cells that have proliferated, migrated and differentiated. Therefore, for the treatment of demyelinating diseases, it is considered effective to restore the dropped myelin sheath by promoting the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells.
  • drugs that can promote the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells have not been developed so far, and the treatment of demyelinating diseases has been centered on symptomatic treatment such as administration of steroids and immunosuppressants and rehabilitation. No effective treatment has been established yet.
  • FGFs fibroblast growth factors
  • FGF21 is a therapeutic agent for obesity, diabetes, pancreatitis, dyslipidemia, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), insulin resistance, hyperinsulinemia, impaired glucose tolerance, hyperglycemia, metabolic syndrome, and the like. It is also attempted to use as (for example, Patent Document 1).
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • FGF21 is a therapeutic agent for obesity, diabetes, pancreatitis, dyslipidemia, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), insulin resistance, hyperinsulinemia, impaired glucose tolerance, hyperglycemia, metabolic syndrome, and the like.
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • Patent Document 1 conventionally, the effect of FGF21 on the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells has not been clarified.
  • An object of the present invention is to provide a medicament that can promote the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells and can effectively prevent or treat demyelinating diseases.
  • FGF21 has an action of promoting the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells, FGF21, a DNA encoding FGF21, and an FGF21 production promoting substance. And / or administration of FGF21-producing cells was found to be effective in the prevention or treatment of demyelinating diseases.
  • the present invention has been completed by further studies based on this finding.
  • Item 1 A prophylactic or therapeutic agent for demyelinating disease, comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of FGF21, DNA encoding FGF21, an FGF21 production promoting substance, and FGF21 producing cells.
  • Item 2. Item 2. The preventive or therapeutic agent for demyelinating disease according to Item 1, wherein the active ingredient is FGF21.
  • Item 3. Item 3. The agent for preventing or treating demyelinating disease according to Item 1 or 2, wherein the demyelinating disease is a demyelinating disease of the central nervous system.
  • Item 4. Item 4.
  • the preventive or therapeutic agent for demyelinating disease according to any one of Items 1 to 3, which is used for improving the sequelae of demyelinating disease of the central nervous system.
  • Item 5. An oligodendrocyte progenitor cell growth promoter comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of FGF21, FGF21-encoding DNA, FGF21 production-promoting substances, and FGF21-producing cells.
  • An agent for repairing myelin sheath comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of FGF21, DNA encoding FGF21, an FGF21 production promoting substance, and FGF21-producing cells.
  • Item 8. Use for the manufacture of the proliferation promoter of at least 1 sort (s) selected from the group which consists of FGF21, DNA which codes FGF21, a FGF21 production promoter, and a FGF21 production cell.
  • a person in need of prevention or treatment of a demyelinating disease is treated with at least one selected from the group consisting of FGF21, FGF21-encoding DNA, FGF21 production promoting substance, and FGF21-producing cells.
  • a method for preventing or treating a demyelinating disease comprising a step of administering a therapeutically effective amount. Item 11. To those who are required to promote the proliferation of oligodendrocyte precursor cells, at least one selected from the group consisting of FGF21, FGF21-encoding DNA, FGF21 production-promoting substance, and FGF21-producing cells is added to oligodendrocytes.
  • a method for promoting the proliferation of oligodendrocyte precursor cells comprising a step of administering an effective amount for promoting the proliferation of cytoprogenitor cells.
  • Item 12. For those who require repair of myelin sheath, at least one selected from the group consisting of FGF21, FGF21-encoding DNA, FGF21 production promoting substance, and FGF21-producing cells is effective for repairing myelin sheath.
  • a method for repairing myelin sheath comprising the step of administering a suitable amount.
  • Item 14 At least one selected from the group consisting of FGF21, DNA encoding FGF21, an FGF21 production-promoting substance, and FGF21-producing cells, which are used for the treatment of promoting the proliferation of oligodendrocyte precursor cells.
  • Item 15 At least one selected from the group consisting of FGF21, FGF21-encoding DNA, an FGF21 production-promoting substance, and FGF21-producing cells, used for treatment of myelin repair.
  • the present invention by increasing the amount of FGF21 in a living body, it is possible to promote the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells that are responsible for repair of myelin sheath, and to effectively prevent or treat demyelinating diseases. it can. Further, according to the present invention, the sequelae of demyelinating diseases of the central nervous system can be improved by repairing the myelin sheath. Thus, the present invention has established a method for promoting the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells, and can provide the gospel to patients suffering from demyelinating diseases as a fundamental therapy for demyelinating diseases.
  • Example 1 the result of having measured the amount of BrdU incorporation in oligodendrocyte precursor cells is shown.
  • Test Example 2 the measurement results of BrdU incorporation in oligodendrocyte progenitor cells are shown.
  • Test Example 3 the measurement results of BrdU incorporation in oligodendrocyte progenitor cells are shown.
  • Test Example 4 the results of measuring the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells in the spinal cord tissue of a demyelination model mouse are shown.
  • Test Example 5 the result of measuring the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells in the spinal cord tissue of a demyelination model mouse is shown.
  • the preventive or therapeutic agent for demyelinating disease of the present invention is at least one selected from the group consisting of FGF21, FGF21-encoding DNA, FGF21 production promoter, and FGF21-producing cells. Is an active ingredient.
  • Active ingredient in the present invention, at least one selected from the group consisting of FGF21, FGF21-encoding DNA, FGF21 production promoting substance, and FGF21-producing cells is used as an active ingredient.
  • FGF21 itself can be used as an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for demyelinating diseases because it promotes the proliferation of oligodendrocyte precursor cells in the administered organism.
  • FGF21 used in the present invention include human FGF21, orthologs thereof, and mutants thereof.
  • Human FGF21 is a secreted protein (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) containing a signal sequence of 28 amino acids.
  • human FGF21 one containing a signal sequence (amino acid residues 1 to 28 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) may be used. Also good.
  • the ortholog of FGF21 is not particularly limited, and examples thereof include mammals such as rats, hamsters, guinea pigs, mice, cows, sheep, pigs, goats, monkeys, and rabbits; and those derived from birds such as chickens and ostriches. It is done.
  • the origin of FGF21 may be appropriately set according to the species to be administered.
  • the FGF21 mutant is not particularly limited as long as it retains the biological activity inherent to FGF21. Examples thereof include mutated FGF21 and FGF21 modified by genetic engineering techniques. Further, FGF21 mutants have been reported in JP-T-2011-523561, JP-T-2012-504965, JP-T-2012-525844, JP-T-2012-525847, etc. These known FGF21 mutants can also be used.
  • FGF21 may be a natural protein or a recombinant produced by a genetic engineering technique.
  • DNA encoding FGF21 Since DNA encoding FGF21 expresses FGF21 in an administered organism and promotes the proliferation of oligodendrocyte precursor cells, it can be used as an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for demyelinating diseases.
  • DNA encoding FGF21 is known, for example, the DNA encoding human FGF21 is known as the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • DNA encoding FGF21 can be obtained by genetic engineering techniques based on the base sequence.
  • the DNA encoding FGF21 by incorporating it into an expression vector so that FGF21 can be expressed in vivo.
  • the expression vector examples include plasmid vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors, and the like.
  • a viral vector is preferable when a mammal such as a human is to be administered.
  • the FGF21-encoding DNA is functionally linked to a promoter capable of exhibiting promoter activity in cells in vivo to be administered.
  • the promoter used for the expression vector is not particularly limited as long as it can function in the living body to which it is administered.
  • SV40-derived promoter cytomegalovirus LTR, Rous sarcoma virus LTR, MoMuLV-derived LTR, adenovirus Virus promoters such as promoters derived from mammals; mammalian constituent protein gene promoters such as ⁇ -actin gene promoter, PGK gene promoter, transferrin gene promoter and the like.
  • the expression vector preferably contains a transcription termination signal downstream of the DNA encoding FGF21. Furthermore, the expression vector may further contain a selection marker gene for selecting transformed cells.
  • the FGF21 expression promoting substance is a substance that promotes the expression of FGF21 in vivo.
  • the FGF21 production promoting substance improves the FGF21 expression ability inherent in the living body in the administered body, and the expressed FGF21 promotes the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells. Therefore, the prevention or treatment of demyelinating diseases It can be used as an active ingredient of an agent.
  • the FGF21 expression promoting substance acts at any stage such as transcription, post-transcriptional regulation, translation, post-translational modification, localization, and folding of FGF21 as long as it promotes FGF21 expression in vivo. May be.
  • FGF21 expression promoting substance examples include PPAR ⁇ agonists such as fenofibrate, rosiglitazone, and GW7647; and transcription factors such as CREBH, ATF2, ATF4, PAR ⁇ , thyroid hormone receptor ⁇ , and ROP ⁇ .
  • PPAR ⁇ agonists such as fenofibrate, rosiglitazone, and GW7647
  • transcription factors such as CREBH, ATF2, ATF4, PAR ⁇ , thyroid hormone receptor ⁇ , and ROP ⁇ .
  • a transcription factor it may be used in the state of being incorporated into an expression vector as in the case of DNA encoding FGF21.
  • FGF21 producing cells An FGF21 producing cell is a cell having an FGF21 producing ability.
  • the FGF21-producing cells produce FGF21 in the administered organism, and the produced FGF21 promotes the proliferation of oligodendrocyte precursor cells. Therefore, the FGF21-producing cells can be used as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for demyelinating diseases.
  • the FGF21-producing cells are not particularly limited as long as they have the ability to produce FGF21 and can be administered to a living body, but specifically, in vivo cells such as pancreatic islets, cardiomyocytes, and hepatocytes; And a transformed FGF21-producing cell derived from a stem cell such as an iPS cell.
  • the FGF21-producing cells used in the present invention are preferably autologous cells obtained from a living body to be administered, or cells transformed or derived from the autologous cells, but obtained from other than the living body to be administered. It may also be an autologous cell, or a cell transformed or derived from the autologous cell.
  • FGF21 (Preferred active ingredient)
  • FGF21-encoding DNA (Preferred active ingredient)
  • FGF21-producing cells may be selected and used, or two or more of these may be used in combination. May be.
  • FGF21 is preferable from the viewpoint of promoting the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells more effectively.
  • the preventive or therapeutic agent for demyelinating diseases of the present invention may contain other pharmacologically active components effective for preventing or treating demyelinating diseases in addition to the above active ingredients.
  • the preventive or therapeutic agent for demyelinating disease of the present invention contains a pharmaceutically acceptable carrier, if necessary, in addition to the above active ingredient, in order to prepare a desired dosage form and preparation form.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include suspending agents such as methyl cellulose, polysorbate 80, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragacanth powder, sodium carboxymethyl cellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate; polyoxyethylene Hardened castor oil, polysorbate 80, nicotinamide, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Magrogol and other solubilizing agents; human serum albumin, dextran, methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, sodium metasulfite, and other stabilizers; human Serum albumin, lecithin, dextran, ethylene oxide / propylene oxide copolymer, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, poly Adsorption inhibitors such as methyl
  • a transfection reagent used in a gene therapeutic agent is used when a gene encoding FGF21, a transcription factor such as CREBH, etc. is used as an active ingredient. May be included.
  • the preventive or therapeutic agent dosage form of demyelinating disease dosage forms the present invention is not particularly limited, may be appropriately set according to the active substance used type and dosage forms and the like.
  • Specific examples of the dosage form of the preventive or therapeutic agent for demyelinating diseases of the present invention include liquid preparations such as injections, syrups, cell suspensions, liposome preparations; tablets, hard capsules, soft capsules, granules Solid preparations such as powders, powders and pills.
  • a powder for preparation for example, freeze-dried powder
  • physiological saline before use.
  • the present invention can be used for the prevention or treatment of demyelinating diseases because it can repair the myelin sheath by promoting the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells.
  • a demyelinating disease is one of the neurological diseases caused by damage to the myelin sheath of myelinated nerves.
  • the demyelinating disease to be prevented or treated in the present invention may be any demyelinating disease of the central nervous system or the peripheral nervous system.
  • Specific examples of the demyelinating diseases of the central nervous system to be prevented or treated in the present invention include inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis, optic neuromyelitis, acute disseminated encephalomyelitis, and concentric sclerosis.
  • Viral demyelinating diseases such as subacute sclerosing panencephalitis and progressive multifocal leukoencephalopathy; Toxic demyelinating diseases such as CO poisoning and hypoxic encephalopathy; Metabolism such as metachromatic leukodystrophy and adrenoleukodystrophy Demyelinating diseases; bridge central myelin destruction, vitamin B12 deficiency and the like.
  • Specific examples of the demyelinating disease of the peripheral nervous system to be prevented or treated in the present invention include Guillain-Barre syndrome, chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuritis and the like.
  • the subject of prevention or treatment in the present invention is preferably central nervous system demyelinating disease, more preferably central nervous system inflammatory demyelinating disease, more preferably multiple sclerosis. .
  • the agent for preventing or treating demyelinating disease of the present invention when administered to a patient who has a sequelae of a demyelinating disease of the central nervous system, the sequela can be improved by repairing the myelin sheath.
  • the organism to be administered may be any organism that suffers from demyelinating disease, and in addition to humans, rats, hamsters, guinea pigs, mice, cows, sheep, Examples include mammals such as pigs, goats, monkeys, and rabbits; birds such as chickens and ostriches. What is necessary is just to set the origin of the active ingredient used by this invention according to the kind of organism used as administration object.
  • active ingredients include human FGF21, DNA encoding human FGF21, human FGF21 production promoter, human-derived cells that produce human FGF21, etc. Select from among them.
  • administration form of the agent for preventing or treating demyelinating disease of the present invention examples include oral administration, topical administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, intravenous administration, rectal administration, intradermal administration and the like. And may be appropriately set according to the type of active ingredient to be used.
  • the prevention or treatment of the demyelinating disease of the present invention is preferably local administration.
  • the prevention of demyelinating disease depends on the type of active ingredient used, the age, sex, weight, degree of symptoms, dosage form, etc. of the administration subject.
  • a therapeutically effective amount may be set as appropriate.
  • FGF21 when used as an active ingredient, the amount that is about 0.1 to 10 ⁇ g, preferably about 1 to 5 ⁇ g per day is 1 or What is necessary is just to divide it into several times.
  • Oligodendrocyte progenitor cell proliferation promoter / myelin repair agent
  • the active ingredient promotes the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells, so it can also be used as a proliferation promoter for oligodendrocyte progenitor cells.
  • the active ingredient can repair the fallen myelin sheath by promoting the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells, it can also be used as a repair agent for myelin sheath.
  • the present invention further relates to the proliferation of oligodendrocyte precursor cells containing as an active ingredient at least one selected from the group consisting of FGF21, FGF21-encoding DNA, FGF21 production promoting substance, and FGF21-producing cells.
  • the present invention also provides a myelin repair agent comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of FGF21, FGF21-encoding DNA, FGF21 production-promoting substance, and FGF21-producing cells.
  • oligodendrocyte progenitor cell growth promoter and myelin repair agent the types of active ingredients, other components that can be optionally blended, dosage forms, administration subjects, administration methods, etc. are described in “1. Demyelination”. It is the same as in the case of “a prophylactic or therapeutic agent for a disease”.
  • Example 1 Examination of involvement of FGF receptor in oligodendrocyte progenitor cell proliferation effect by culture supernatant of cardiomyocytes Culture supernatant of cardiomyocytes producing various growth factors is oligodendrocyte progenitor cells Whether to proliferate was examined, and the effect of FGF receptor antagonist on its proliferative effect was examined.
  • the collected supernatant was suspended in MEM (modified Eagle's medium) containing 5% calf serum, and the cell solution was poured into a culture dish. After 30 minutes, floating cells were collected, suspended in MEM containing 5% calf serum, and then centrifuged (2000 rpm, 6 minutes). Thereafter, the precipitate was suspended in MEM containing 5% calf serum, and cardiomyocytes were separated by the Percoll method. Next, the obtained cardiomyocytes were seeded in a culture dish and cultured for 2 days in MEM containing 5% calf serum, and the culture supernatant was collected. The obtained culture supernatant of cardiomyocytes was used in the following experiment.
  • MEM modified Eagle's medium
  • Oligodendrocyte progenitor cells were collected from the brain of C57BL / 6j mice (1 day old) by the following method. First, the cortex isolated from C57BL / 6j mice was dispersed using a Neurodissociation kit (Millteny) so as to be in a single cell state to obtain a cell solution. The obtained cell solution was reacted with anti-A2B5 binding beads (Millteny) to collect only oligodendrocyte progenitor cells (A2B5 positive cells). A2B5 is a marker for oligodendrocyte progenitor cells.
  • the collected oligodendrocyte progenitor cells were seeded on a plastic tissue culture dish coated with poly-L-lysinde (manufactured by Sigma) and cultured in a medium for 1 day (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • the media used were 4 mM L-gludamine (manufactured by Sigma), 1 mM sodium pyruvate (manufactured by Sigma), 0.1% Bovine serum albumin (manufactured by Sigma), 50 ⁇ g / ml apo-Transferrin (manufactured by Sigma) / ml Insulin (manufactured by Sigma), 30 nM sodium serenite (manufactured by Sigma), 10 nM Biotin (manufactured by Sigma), 10 nM Hydrocortisone (manufactured by Sigma), 10 ng / ml Platelet-Derived GrowAp A DMEM containing 10 ng / ml basic Fibroblast growth factor (manufactured by Peprotech) .
  • BrdU incorporation was measured under the same conditions as described above except that the culture supernatant of cardiomyocytes was not added. In this experiment, 5 to 6 patients were studied in each group.
  • FIG. 1 shows the mean value ⁇ standard error of the results of measuring the BrdU incorporation amount of each group. Further, the BrdU incorporation amount of each group was statistically analyzed by analysis of variance.
  • the culture supernatant of cardiomyocytes contains a growth factor that promotes the proliferation of oligodendrocyte precursor cells.
  • the proliferation effect of oligodendrocyte progenitor cells by the culture supernatant of cardiomyocytes is an action via FGF receptor.
  • Example 2 Identification of FGF subtype involved in proliferation effect of oligodendrocyte progenitor cells produced by myocardium Any subtype of FGF contained in the culture supernatant of cardiomyocytes is involved in promoting proliferation of oligodendrocyte progenitor cells I examined whether or not.
  • oligodendrocyte progenitor cells were collected from the brains of C57BL / 6j mice (1 day old) in the same manner as in Example 1.
  • the obtained oligodendrocyte progenitor cells were divided into 4 groups: FGF1 neutralizing antibody added group, FGF2 neutralizing antibody added group, FGF18 siRNA introduced group, and FGF21 siRNA introduced group, and the following experiment was conducted. In this experiment, four cases were studied in each group.
  • oligodendrocyte progenitor cells were first seeded on a plastic tissue culture dish coated with poly-L-lysinde (manufactured by Sigma) and cultured in the following medium for 1 day (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • the media used were 4 mM L-gludamine (Sigma), 1 mM Sodium pyruvate (Sigma), 0.1% Bovine serum albumin (Sigma), 50 ⁇ g / ml apo-Transferrin (Sigma), 5 ⁇ g / ml apo-Transferrin (Sigma) / ml Insulin (manufactured by Sigma), 30 nM sodium serenite (manufactured by Sigma), 10 nM Biotin (manufactured by Sigma), 10 nM Hydrocortisone (manufactured by Sigma), 10 ng / ml Platelet-Derived GrowAp A DMEM containing 10 ng / ml basic Fibroblast growth factor (manufactured by Peprotech) .
  • the culture solution of oligodendrocyte progenitor cells was removed, and the culture supernatant of cardiomyocytes obtained above was added to 100% by weight, and at the same time, FGF1 neutralizing antibody (IgG, manufactured by R & D) was added. They were added to 3 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml, and cultured at 37 ° C. for 24 hours. Subsequently, BrdU was added and cultured at 37 ° C. for 24 hours, and then the cells were collected. BrdU incorporation was detected by a cell proliferation ELISA and BrdU color development kit (Roche).
  • FGF2 neutralizing antibody addition group an experiment was performed under the same conditions as the FGF1 neutralizing antibody addition group except that an FGF2 neutralizing antibody (IgG, manufactured by Millipore) was used instead of the FGF1 neutralizing antibody.
  • an FGF2 neutralizing antibody IgG, manufactured by Millipore
  • the control IgG was used instead of the FGF2 neutralizing antibody. It was measured.
  • FGF18 siRNA manufactured by Lifetechnologies
  • Lipofectamine RNAi / MAX manufactured by Invitroges
  • oligodendrocyte progenitor cells were seeded on a plastic tissue culture dish coated with poly-L-lysinde (manufactured by Sigma) and cultured in the following medium for 1 day (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • the media used were 4 mM L-gludamine (Sigma), 1 mM Sodium pyruvate (Sigma), 0.1% Bovine serum albumin (Sigma), 50 ⁇ g / ml apo-Transferrin (Sigma), 5 ⁇ g / ml apo-Transferrin (Sigma) / ml Insulin (manufactured by Sigma), 30 nM sodium serenite (manufactured by Sigma), 10 nM Biotin (manufactured by Sigma), 10 nM Hydrocortisone (manufactured by Sigma), 10 ng / ml Platelet-Derived GrowAp A DMEM containing 10 ng / ml basic Fibroblast growth factor (manufactured by Peprotech) .
  • FGF21 siRNA addition group an experiment was performed under the same conditions as the FGF18 siRNA addition group except that FGF21 siRNA (manufactured by Lifetechnologies) was used instead of FGF18 siRNA.
  • FGF21 siRNA manufactured by Lifetechnologies
  • a control siRNA Applied Biosystems, Silencer select control siRNA
  • FIG. 2 shows the mean ⁇ standard error of the results of measuring the BrdU incorporation amount of each group. Further, the BrdU incorporation amount of each group was statistically analyzed by analysis of variance. As is clear from FIG. 2, the addition of cardiomyocyte culture supernatant significantly increased BrdU incorporation. In the FGF1 neutralizing antibody added group, the FGF2 neutralizing antibody added group, and the FGF18 siRNA introduced group, The increase in BrdU incorporation due to the addition of the culture supernatant was not suppressed.
  • FGF1, FGF2 and FGF18 do not affect the proliferation of oligodendrocyte precursor cells, but FGF21 is involved in promoting the proliferation of oligodendrocyte precursor cells.
  • Example 3 Examination of the growth promoting action of FGF21 on oligodendrocyte precursor cells The growth promoting action of FGF21 on oligodendrocyte precursor cells was verified using cultured cells.
  • FGF15 (manufactured by Abcam), FGF21 (manufactured by R & D), and FGF23 (manufactured by R & D) were diluted with physiological saline immediately before use to prepare a FGF21-containing solution.
  • Oligodendrocyte progenitor cells were collected from the brains of C57BL / 6j mice (1 day old) in the same manner as in Example 1.
  • oligodendrocyte progenitor cells were seeded on a plastic tissue culture dish coated with poly-L-lysinde (manufactured by Sigma) and cultured in the following medium for 1 day (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • the media used were 4 mM L-gludamine (Sigma), 1 mM Sodium pyruvate (Sigma), 0.1% Bovine serum albumin (Sigma), 50 ⁇ g / ml apo-Transferrin (Sigma), 5 ⁇ g / ml apo-Transferrin (Sigma) / ml Insulin (manufactured by Sigma), 30 nM sodium serenite (manufactured by Sigma), 10 nM Biotin (manufactured by Sigma), 10 nM Hydrocortisone (manufactured by Sigma), 10 ng / ml Platelet-Derived GrowAp A DMEM containing 10 ng / ml basic Fibroblast growth factor (manufactured by Peprotech) .
  • FIG. 3 shows the mean ⁇ standard error of the results of measuring the BrdU incorporation amount of each group.
  • the BrdU incorporation amount of each group was statistically analyzed.
  • the addition of FGF21 significantly increases the BrdU uptake of oligodendrocyte progenitor cells.
  • the control serum addition
  • a significant difference was observed in the amount of BrdU incorporation.
  • Example 4 Examination of effects on proliferation of oligodendrocyte progenitor cells in demyelination model mice (1) The growth promoting effect of FGF21 on oligodendrocyte precursor cells was examined using a demyelinating model mouse.
  • Recombinant FGF21 (R & D) diluted with physiological saline to a concentration of 4.17 ⁇ g / ml is filled into an osmotic pump (Alzette), a cannula is attached to the tip of the pump, and the tip is FGF21 was continuously administered along with the lysophosphatidylcholine administration site of demyelinating model mice. Seven days later, the demyelinating model mouse was anesthetized, and the spinal cord tissue was collected by transcardially refluxing physiological saline. Finally, FGF21 was administered at 350 ng. The spinal cord tissue was fixed with a 4% paraformaldehyde solution and replaced with a 30% sucrose solution, and then frozen sliced sections were prepared.
  • the sections were immunostained using anti-PDGFR ⁇ antibody and anti-Ki67 antibody, and the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells in the sections was counted.
  • PDGFR ⁇ is a marker for oligodendrocyte progenitor cells
  • Ki67 is a cell proliferation marker.
  • the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells was measured under the same conditions as described above using physiological saline. In this experiment, 5 mice were used for each group.
  • Example 5 Examination of the effect on proliferation of oligodendrocyte progenitor cells in demyelination model mice The growth promoting action of FGF21 on oligodendrocyte progenitor cells was examined using demyelination model mice.
  • FGF21 was subcutaneously administered at a dose of 500 ng / kg body weight per day for 2 weeks.
  • the demyelinating model mouse was anesthetized, and the spinal cord tissue was collected by transcardially refluxing physiological saline.
  • the collected spinal cord tissue was fixed with a 4% paraformaldehyde solution and replaced with a 30% sucrose solution, and then frozen thin layer sections were prepared.
  • the sections were immunostained using anti-PDGFR ⁇ antibody and anti-Ki67 antibody, and the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells in the sections was counted.
  • the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells was measured under the same conditions as described above using physiological saline containing 0.5% BSA. In this experiment, 5 or 6 mice were used for each group.
  • FIG. 5 shows the mean ⁇ standard error for the results of counting the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells. Also in this test, the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells increased in demyelinating model mice administered with FGF21, and it was revealed that FGF21 can promote the proliferation of oligodendrocyte precursor cells in vivo.
  • Example 6 Examination of effect of demyelination model mouse on myelination repair The effect of FGF21 on myelination repair was examined using a demyelination model mouse.
  • a section was prepared from the collected spinal cord tissue in the same manner as in Example 5, and the section was immunostained with an anti-MBP antibody, and the MBP positive region in the section was measured.
  • an MBP positive region was measured under the same conditions as described above using a physiological saline containing 0.5% BSA. In this experiment, one mouse was used for each group.
  • Results Fig. 6 shows the average values of the results of measuring the MBP positive area.
  • the MBP positive region increased, and it was revealed that FGF21 can promote myelin repair in vivo.
  • Example 7 Examination of effect on neurological symptoms of demyelination model mice The therapeutic effect of FGF21 on neurological symptoms was examined using demyelination model mice.
  • Results Figure 7 shows the average value ⁇ standard error for the results of calculating the ratio of the number of times the ladder was stepped off. In the demyelinating model mouse administered with FGF21, the number of times the ladder was stepped down was decreased, and it was revealed that FGF21 promotes improvement of nerve function.
  • Example 8 Examination of growth promoting action of FGF21 on human oligodendrocyte precursor cells The growth promoting action of FGF21 on oligodendrocyte precursor cells was verified using cultured cells derived from humans.
  • oligodendrocyte progenitor cells are seeded on a plastic tissue culture dish (Greiner Bio-One) coated with poly-L-lysinde and cultured in the following medium for 1 day (37 ° C., 5% CO 2 ). did.
  • the media used were 4 mM L-gludamine (Sigma), 1 mM Sodium pyruvate (Sigma), 0.1% Bovine serum albumin (Sigma), 50 ⁇ g / ml apo-Transferrin (Sigma), 5 ⁇ g / ml apo-Transferrin (Sigma) / ml Insulin (manufactured by Sigma), 30 nM sodium serenite (manufactured by Sigma), 10 nM Biotin (manufactured by Sigma), 10 nM Hydrocortisone (manufactured by Sigma), 10 ng / ml Platelet-Derived GrowAp 10 ng / ml basic Fibroblast growth factor (manufactured by Peprotech) 1 (v / v)% pe Is a DMEM containing icillin / streptomycin (Life Technologies).
  • an FGF21-containing solution was added to the oligodendrocyte progenitor cell culture solution so that FGF21 was 6 g / ml, followed by culturing at 37 ° C. for 24 hours.
  • BrdU was added and cultured at 37 ° C. for 24 hours, and then the cells were collected.
  • BrdU incorporation was detected by a cell proliferation ELISA and BrdU color development kit (Roche).
  • As a control BrdU uptake was measured under the same conditions as described above using the same amount of physiological saline instead of the FGF21-containing solution. In this experiment, 6 cases were studied for the control group and 4 cases for the FGF21 group.
  • FIG. 8 shows the mean ⁇ standard error of the results of measuring the BrdU incorporation amount of each group.
  • the BrdU incorporation amount of each group was statistically analyzed.
  • the uptake of BrdU of oligodendrocyte progenitor cells was remarkably increased by adding FGF21.
  • FGF21 has an action of promoting the proliferation of human oligodendrocyte precursor cells.
  • Example 7 Examination of the effect of cerebral contusion model mice on the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells The growth promoting action of FGF21 on oligodendrocyte progenitor cells was examined using cerebral contusion model mice.
  • mice Male, 7 weeks old were fixed to a stereotaxic apparatus (manufactured by Narishige) under anesthesia. A midline incision was made in the scalp, the fascia was removed, and the skull was exposed. Craniotomy was performed in a circle with a diameter of 4 mm, centered on a point 2 mm lateral to the bregma. A brain contusion was created by connecting a 3 mm diameter chip to a Pnematic Impact Device (AmScien Instruments). The parameters giving impact were a speed of 4 to 4.5 mm / second, a depth of 1 mm, and a duration of 120 milliseconds.
  • AmScien Instruments Pnematic Impact Device
  • FGF21-containing solution obtained by diluting recombinant FGF21 (manufactured by R & D) with physiological saline was filled into an osmotic pump (manufactured by Alzette). Further, a cannula was attached to the tip of the osmotic pump, and Brain infusion kit (manufactured by Alzette) was connected to the tip, and the FGF21-containing solution was continuously administered into the ventricle. Administration of the FGF21-containing solution was carried out for 1 week at a dose at which FGF21 was 50 ng / kg body weight per day. Thereafter, brain contusion mice were anesthetized, and brain tissue was collected by transcardially refluxing physiological saline.
  • the collected brain tissue was fixed with a 4% paraformaldehyde solution and replaced with a 30% sucrose solution, and then a frozen thin layer section was prepared.
  • the sections were immunostained using anti-PDGFR ⁇ antibody and anti-Ki67 antibody, and the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells in the sections was counted.
  • the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells was measured under the same conditions as described above using physiological saline (Vehicle) containing 0.5% BSA. In this experiment, 5 or 6 mice were used for each group.
  • FIG. 9 shows the mean ⁇ standard error for the results of counting the number of PDGFR ⁇ and Ki67 co-positive cells. Also in this study, the number of co-positive cells in PDGFR ⁇ and Ki67 increased in cerebral contusion model mice administered with FGF21, and it became clear that FGF21 can promote the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells even after cerebral contusion. .

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Abstract

　本発明の目的は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進でき、脱髄疾患を効果的に予防又は治療できる医薬を提供することである。　ＦＧＦ２１にはオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進する作用があり、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及び／又はＦＧＦ２１産生細胞の投与が脱髄疾患の予防又は治療に有効である。

Description

脱髄疾患の予防又は治療剤
　本発明は、脱髄疾患の予防又は治療剤に関する。より詳細には、本発明は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進でき、髄鞘を効果的に修復できる、脱髄疾患の予防又は治療剤に関する。更に、本発明は、脱髄疾患の予防又は治療方法に関する。
　神経細胞は神経突起を伸ばして他の神経細胞と接触しており、この接触によって神経活動の伝播することで神経機能が担われている。脳と脊髄からなる中枢神経系では、大部分の神経突起の周りが髄鞘に覆われている。髄鞘は、神経活動の跳躍的な伝導を促すことで神経活動の伝播を加速させ、また、髄鞘内部の軸索の恒常性の維持にも寄与している。
　髄鞘の脱落により神経活動の伝達が破綻すると、多彩な神経症状が現れ、脱髄疾患と呼ばれる神経疾患が生じることが知られている。脱髄疾患は、多発性硬化症や急性散在性脳脊髄炎等の中枢神経系と、ギラン・バレー症候群や慢性炎症性脱髄性多発根神経炎等の末梢神経系の２つに大別される。中枢神経系の脱髄疾患の１つである多発性硬化症では、自己免疫系の異常な活性化によって時間的、空間的に脱髄病巣が生じ、視力障害、感覚障害、運動機能障害、自律神経障害等の症状があらわれる。多発性硬化症は、日本の有病率は１０万人あたり８～９人とされ、国内で約１２０００～１６０００人の罹患者が存在しており、多発性硬化症を初めとする脱髄疾患の根本的な治療方法の確立が緊急性のある課題となっている。
　髄鞘は、オリゴデンドロサイト前駆細胞が増殖、遊走、分化を遂げて形成されることが知られている。そのため、脱髄疾患の治療には、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することにより、脱落した髄鞘を修復させることが有効であると考えられている。しかしながら、従来、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進できる薬剤は開発されておらず、脱髄疾患の治療は、ステロイドや免疫抑制剤投与やリハビリテーション等の対症療法が中心になっており、根本的な治療法は依然として確立できていない。
　一方、繊維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ；ＦＧＦｓ）は、血管新生、創傷治癒、細胞増殖に関与する成長因子として知られている。ＦＧＦには、２３個のサブタイプがあり、その中の１つであるＦＧＦ２１は、肝臓及び膵臓で高度に発現しており、栄養摂取、脂肪分解、糖代謝、体内時計制御等の多彩な活性を有することが明らかにされている。また、近年では、ＦＧＦ２１は、肥満、糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム等に対する治療薬として利用することも試みられている（例えば、特許文献１）。しかしながら、従来、ＦＧＦ２１が、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に及ぼす影響については明らかにされていない。
国際公開第２０１２／６６０７５号
　本発明の目的は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進でき、脱髄疾患を効果的に予防又は治療できる医薬を提供することである。
　本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、ＦＧＦ２１にはオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進する作用があり、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及び／又はＦＧＦ２１産生細胞の投与が脱髄疾患の予防又は治療に有効であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、脱髄疾患の予防又は治療剤。
項２．　前記有効成分がＦＧＦ２１である、項１に記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
項３．　前記脱髄疾患が中枢神経系の脱髄疾患である、項１又は２に記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
項４．　中枢神経系の脱髄疾患の後遺症の改善に使用される、項１～３のいずれかに記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
項５．　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤。
項６．　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、髄鞘の修復剤。
項７．　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の、脱髄疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
項８．　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤の製造のための使用。
項９．　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分の髄鞘の修復剤の製造のための使用。
項１０．　脱髄疾患の予防又は治療が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、その予防又は治療に有効な量を投与する工程を含む、脱髄疾患の予防又は治療方法。
項１１．　オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進に有効な量を投与する工程を含む、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進方法。
項１２．　髄鞘の修復が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、髄鞘の修復に有効な量を投与する工程を含む、髄鞘の修復方法。
項１３．　脱髄疾患の予防又は治療の処置に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
項１４．　オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進の処置に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
項１５．　髄鞘の修復の処理に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
　本発明によれば、生体内のＦＧＦ２１量を増大させることにより、髄鞘の修復を担うオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することができ、脱髄疾患を効果的に予防又は治療することができる。また、本発明によれば、髄鞘の修復によって、中枢神経系の脱髄疾患の後遺症を改善することもできる。このように、本発明は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させる手法を確立できており、脱髄疾患の根本療法として、脱髄疾患を罹患している患者に福音をもたらし得る。
試験例１において、オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果を示す。 試験例２において、オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果を示す。 試験例３において、オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果を示す。 試験例４において、脱髄モデルマウスの脊髄組織におけるＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果を示す。 試験例５において、脱髄モデルマウスの脊髄組織におけるＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果を示す。 試験例５において、脱髄モデルマウスの脊髄組織におけるＭＢＰ陽性領域を計測した結果を示す。 試験例５において、脱髄モデルマウスの後肢の運動機能を解析した結果を示す。 試験例６において、ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果を示す。 試験例５において、脳挫傷モデルマウスの脳組織におけるＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果を示す。
１．脱髄疾患の予防又は治療剤
　本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤は、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明について、詳述する。
有効成分
　本発明では、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として使用する。
（ＦＧＦ２１）
　ＦＧＦ２１は、それ自体、投与された生体内でオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するため、脱髄疾患の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
　本発明で使用されるＦＧＦ２１としては、具体的には、ヒトＦＧＦ２１、そのオルソログ、及びそれらの変異体が挙げられる。
　ヒトＦＧＦ２１は、２８個のアミノ酸のシグナル配列を含む分泌タンパク質（配列番号１に示すアミノ酸配列）である。本発明では、ヒトＦＧＦ２１として、シグナル配列（配列番号１に示すアミノ酸配列において１～２８番目のアミノ酸残基）を含むものを使用してもよいが、シグナル配列が除去されたものを使用してもよい。
　ＦＧＦ２１のオルソログとしては、特に制限されないが、例えば、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類等に由来するものが挙げられる。ＦＧＦ２１は、投与対象となる生物種に応じて、その由来を適宜設定すればよい。
　ＦＧＦ２１の変異体としては、ＦＧＦ２１が本来有する生物活性を保持していることを限度として特に制限されず、例えば、突然変異したＦＧＦ２１、遺伝子工学的手法によって改変したＦＧＦ２１等が挙げられる。また、ＦＧＦ２１の変異体については、特表２０１１－５２３５６１号公報、特表２０１２－５０４９６５号公報、特表２０１２－５２５８４４号公報、特表２０１２－５２５８４７号公報等において報告されており、本発明では、これらの公知のＦＧＦ２１の変異体を使用することもできる。
　ＦＧＦ２１は、天然タンパク質であってもよいが、遺伝子工学的手法により製造された組換え体であってもよい。
（ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ）
　ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡは、投与された生体内でＦＧＦ２１を発現し、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するため、脱髄疾患の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
　ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡにおける塩基配列は公知であり、例えば、ヒトＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡは、配列番号２に示す塩基配列として知られている。ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡは、その塩基配列に基づいて、遺伝子工学的手法によって得ることができる。
　また、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡは、生体内でＦＧＦ２１を発現できるように、発現ベクターに組み込んで使用することが好ましい。
　当該発現ベクターとしては、具体的には、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられる。これらの中でも、ヒト等の哺乳動物を投与対象とする場合には、ウイルスベクターが好適である。
　当該発現ベクターでは、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡが、投与対象となる生体内の細胞でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていればよい。発現ベクターに使用されるプロモーターは、投与対象である生体で機能可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、ＳＶ４０由来プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来プロモーター等のウイルスプロモーター；β－アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター等が挙げられる。
　当該発現ベクターは、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡの下流に転写終結シグナルを含んでいることが好ましい。更に、当該発現ベクターには、更に形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子含んでいてもよい。
（ＦＧＦ２１発現促進物質）
　ＦＧＦ２１発現促進物質とは、生体内でＦＧＦ２１の発現を促進させる物質である。ＦＧＦ２１産生促進物質は、投与された生体において、生体が本来有しているＦＧＦ２１発現能を向上させ、発現されたＦＧＦ２１がオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するため、脱髄疾患の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
　ＦＧＦ２１発現促進物質は、生体内でＦＧＦ２１の発現を促進させることを限度として、ＦＧＦ２１の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化、及びフォールディング等のいかなる段階で作用するものであってもよい。
　ＦＧＦ２１発現促進物質として、具体的には、フェノフィブラート、ロシグリタゾン、ＧＷ７６４７等のＰＰＡＲαアゴニスト；ＣＲＥＢＨ、ＡＴＦ２、ＡＴＦ４、ＰＡＲβ、甲状腺ホルモン受容体β、ＲＯＰα等の転写因子が挙げられる。転写因子の場合には、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡの場合と同様に発現ベクターに組み込んだ状態で使用すればよい。
（ＦＧＦ２１産生細胞）
　ＦＧＦ２１産生細胞とは、ＦＧＦ２１産生能を備えている細胞である。ＦＧＦ２１産生細胞は、投与された生体内でＦＧＦ２１を産生し、産生されたＦＧＦ２１がオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するため、脱髄疾患の予防又は治療剤の有効成分として使用できる。
　ＦＧＦ２１産生細胞は、ＦＧＦ２１産生能を有し、且つ生体への投与が許容されることを限度として特に制限されないが、具体的には膵島、心筋細胞、肝細胞等の生体内細胞；ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡを組み込んだ形質転換細胞；ｉＰＳ細胞等の幹細胞から誘導した分化させたＦＧＦ２１産生細胞等が挙げられる。
　本発明で使用されるＦＧＦ２１産生細胞は、投与対象となる生体から得られた自家細胞、又は当該自家細胞から形質転換若しくは誘導した細胞であることが好ましいが、投与対象となる生体以外から得られた他家細胞、又は当該他家細胞から形質転換若しくは誘導した細胞であってもよい。
（好適な有効成分）
　本発明では、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞の中から１種を選択して使用してもよく、またこれらの中から２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの有効成分の中でも、より一層効果的にオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させるという観点から、好ましくはＦＧＦ２１が挙げられる。
他の成分
　本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤は、前記有効成分の他に、脱髄疾患の予防又は治療に有効な他の薬理活性成分を含んでいてもよい。
　また、本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤は、前記有効成分の他に、所望の投与形態及び製剤形態に調製するために、必要に応じて、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体としては、具体的には、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等の懸濁化剤；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール等の溶解補助剤；ヒト血清アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等の安定化剤；ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等の吸着防止剤；ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；水、生理食塩水等の希釈剤；脂質；緩衝剤；乳化剤；着色料；着香料；甘味料等が挙げられる。
　また、本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤において、有効成分としてＦＧＦ２１をコードしている遺伝子、ＣＲＥＢＨ等の転写因子等を使用する場合であれば、遺伝子治療剤において使用されるトランスフェクション試薬が含まれていてもよい。
剤型
　本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤の剤型については、特に制限されず、使用する有効成分の種類や投与形態等に応じて適宜設定すればよい。本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤の剤型として、具体的には、注射剤、シロップ剤、細胞懸濁液、リポソーム製剤等の液状製剤；錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、等の固形状製剤等が挙げられる。また、注射剤にする場合には、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
投与対象
　本発明は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することにより髄鞘を修復できるので脱髄疾患の予防又は治療目的で使用される。脱髄疾患とは、有髄神経の髄鞘が障害されることによって生じる神経疾患の１つである。
　本発明において予防又は治療対象となる脱髄疾患は、中枢神経系及び末梢神経系のいずれの脱髄疾患であってもよい。本発明において予防又は治療対象となる中枢神経系の脱髄疾患としては、具体的には、多発性硬化症、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、同心円硬化症等の炎症性脱髄疾患；亜急性硬化性全脳炎、進行性多巣性白質脳症等のウイルス性脱髄疾患；ＣＯ中毒、低酸素脳症等の中毒性脱髄疾患；異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー等の代謝性脱髄疾患；橋中心髄鞘破壊症、ビタミンＢ１２欠乏症等が挙げられる。また、本発明において予防又は治療対象となる末梢神経系の脱髄疾患としては、具体的には、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎等が挙げられる。これらの脱髄疾患の中でも、本発明における予防又は治療対象として、好ましくは中枢神経系の脱髄疾患、更に好ましくは中枢神経系の炎症性脱髄疾患、より好ましくは多発性硬化症が挙げられる。
　また、本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤は、中枢神経系の脱髄疾患の後遺症がある患者に投与すると、髄鞘を修復することによって当該後遺症を改善することもできる。
　本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤において、投与対象となる生物は、脱髄疾患に罹患している生物であればよく、ヒトの他、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類等が挙げられる。本発明で使用される有効成分の由来は、投与対象となる生物の種類に応じて設定すればよい。例えば、ヒトの脱髄疾患の予防又は治療する場合であれば、有効成分は、ヒトＦＧＦ２１、ヒトＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ヒトＦＧＦ２１の産生促進物質、ヒトＦＧＦ２１を産生するヒト由来細胞等の中から選択して使用すればよい。
投与方法
　本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤の投与形態としては、例えば、経口投与、局所投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経直腸的、皮内投与等が挙げられ、使用する有効成分の種類に応じて適宜設定すればよい。これらの投与形態の中でも、本発明の脱髄疾患の予防または治療として、好ましくは局所投与が挙げられる。
　本発明の脱髄疾患の予防又は治療剤の投与量については、使用する有効成分の種類、投与対象者の年齢、性別、体重、症状の程度、投与形態等に応じて、脱髄疾患の予防又は治療に有効な量を適宜設定すればよいが、例えば、ＦＧＦ２１を有効成分として使用する場合であれば、１日当たり、０．１～１０μｇ程度、好ましくは１～５μｇ程度となる量を１又は数回に別けて投与すればよい。また、有効成分としてＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及び／又はＦＧＦ２１産生細胞を使用する場合であれば、生体内でのＦＧＦ２１の産生量が、前記範囲内になるように適宜設定すればよい。
２．オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤・髄鞘の修復剤
　前記有効成分は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させるので、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤として使用することもできる。また、前記有効成分は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させることにより、脱落した髄鞘を修復させることができるので、髄鞘の修復剤として使用することもできる。
　即ち、本発明は、更に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤を提供する。また、本発明は、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、髄鞘の修復剤を提供する。
　当該オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤及び髄鞘の修復剤において、有効成分の種類、任意に配合可能な他の成分、剤型、投与対象、投与方法等については、前記「１．脱髄疾患の予防又は治療剤」の場合と同様である。
　以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：心筋細胞の培養上清によるオリゴデンドロサイト前駆細胞増殖効果に対するＦＧＦ受容体の関与の検討
　様々な増殖因子（growth factor）を産生する心筋細胞の培養上清がオリゴデンドロサイト前駆細胞を増殖させるか検討し、またその増殖効果に対するＦＧＦ受容体拮抗剤の作用について検討した。
（１）材料及び方法
　Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）から摘出した心臓をミンチングした後に１ｍｇ／ｍｌの１型コラーゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）に注いで３７℃で２０分振とうした。得られた細胞溶液をピペッティングし、静置後、上清を回収した。上清を回収した残りの心筋細胞に再び１ｍｇ／ｍｌの１型コラーゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）に注ぎ、３７℃で２０分振とうした後に上清を回収する操作を３回繰り返した。集めた上清を５％ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍを含むＭＥＭ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）で懸濁し、培養用ディッシュに細胞溶液を注いだ。３０分後、浮遊細胞を回収し、更に５％ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍを含むＭＥＭで懸濁した後に遠心分離した（２０００ｒｐｍ、６分）。その後、沈殿物を５％ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍを含むＭＥＭで懸濁後、パーコール法により心筋細胞を分離した。次いで、得られた心筋細胞を培養用ディッシュに播種して、５％ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍを含むＭＥＭにて２日間培養し、培養上清を回収した。得られた心筋細胞の培養上清を、以下の実験に用いた。
　オリゴデンドロサイト前駆細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）の脳から、以下の手法で採取した。先ず、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスから単離した皮質を、Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ｍｉｌｌｔｅｎｙ社製）を使用して、単一細胞の状態となるように分散させて細胞溶液を得た。得られた細胞溶液をａｎｔｉ－Ａ２Ｂ５結合ビーズ（Ｍｉｌｌｔｅｎｙ社製）に反応させ、オリゴデンドロサイト前駆細胞（Ａ２Ｂ５陽性細胞）のみを採取した。なお、Ａ２Ｂ５はオリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーである。
　採取したオリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で被膜したプラスティック組織培養皿に播種し、培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％　Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ　ａｐｏ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ　Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　ｂａｓｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液を取り除き、前記で得られた心筋細胞の培養上清を１００重量％となるように添加し、更にＦＧＦＲ阻害剤であるＳＵ５４０２（シグマ社製）を０μＭ、１０μＭ、３０μＭ、及び１００μＭ、又はＦＧＦＲ３阻害剤であるＰＤ１７３０７４（シグマ社製）を０μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、及び１μＭとなるように添加して、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）を添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しないこと以外は、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。本実験では、各群５～６例ずつ検討した。
（２）結果
　各群のＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果について、平均値±標準誤差を図１に示す。また、各群のＢｒｄＵの取り込み量については、分散分析により統計解析を行った。
　図１から明らかなように、心筋細胞の培養上清を添加した群では、オリゴデンドロサイト前駆細胞におけるＢｒｄＵの取り込みが増加し、ＳＵ５４０２又はＰＤ１７３０７４を共処置するとＢｒｄＵの取り込み増加が抑制された。また、心筋細胞の培養上清を添加した群と心筋細胞の培養上清をしなかった群（コントロール）の間には有意な差（ｐ＜０．０１）が認められた。
　即ち、本実験結果から、心筋細胞の培養上清には、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進させる増殖因子が含まれていることが示唆された。また、心筋細胞の培養上清によるオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖効果は、ＦＧＦ受容体を介した作用であることが示された。
実施例２：心筋が産生するオリゴデンドロサイト前駆細胞増殖効果に関わるＦＧＦのサブタイプの同定
　心筋細胞の培養上清に含まれるＦＧＦのいずれのサブタイプが、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進に関与しているかについて検討した。
（１）材料及び方法
　心筋細胞の培養上清は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）を用いて、実施例１と同様の方法で調製した。また、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）の脳から実施例１と同様の方法で採取した。得られたオリゴデンドロサイト前駆細胞を、ＦＧＦ１中和抗体添加群、ＦＧＦ２中和抗体添加群、ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡ導入群、及びＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡ導入群の４群に分けて、以下の実験を行った。なお、本実験では、各群４例ずつ検討した。
　ＦＧＦ１中和抗体添加群では、先ず、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で被膜したプラスティック組織培養皿に播種し、次の培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％　Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ　ａｐｏ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ　Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　ｂａｓｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液を取り除き、前記で得られた心筋細胞の培養上清を１００重量％となるように添加し、これと同時にＦＧＦ１中和抗体（ＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ社製）を３μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、ＢｒｄＵを添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しなかった場合、ＦＧＦ１中和抗体の代わりにコントロールＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｉ５２５６）を使用した場合についても、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。
　ＦＧＦ２中和抗体添加群では、ＦＧＦ１中和抗体の代わりに、ＦＧＦ２中和抗体（ＩｇＧ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使用したこと以外は、前記ＦＧＦ１中和抗体添加群と同条件で実験を行った。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しなかった場合、ＦＧＦ２中和抗体の代わりにコントロールＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｉ５２５６）を使用した場合についても、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。
　ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡ添加群では、先ず、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＲＮＡｉ/ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅs社製）を用いてＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を心筋細胞に導入した。次いで、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で被膜したプラスティック組織培養皿に播種し、次の培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％　Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ　ａｐｏ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ　Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　ｂａｓｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液を取り除き、前記で得られた心筋細胞の培養上清を１００重量％となるように添加し、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、ＢｒｄＵを添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しなかった場合、ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡを心筋細胞へ導入しなかった場合、ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡの代わりにコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ　ｓｅｌｅｃｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ）を使用した場合についても、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。
　ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡ添加群では、ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡの代わりに、ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用したこと以外は、前記ＦＧＦ１８ ｓｉＲＮＡ添加群と同条件で実験を行った。また、コントロールとして、心筋細胞の培養上清を添加しなかった場合、ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡの代わりにコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ　ｓｅｌｅｃｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｉＲＮＡ）を使用した場合についても、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。
（２）結果
　各群のＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果について、平均値±標準誤差を図２に示す。また、各群のＢｒｄＵの取り込み量については、分散分析により統計解析を行った。図２から明らかなように、心筋細胞の培養上清を添加することによって、ＢｒｄＵの取り込みが著しく上昇し、ＦＧＦ１中和抗体添加群、ＦＧＦ２中和抗体添加群、及びＦＧＦ１８ｓｉＲＮＡ導入群では、心筋細胞の培養上清を添加することによるＢｒｄＵの取り込みの上昇は抑制されなかった。一方、ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡ導入群では、心筋細胞の培養上清を添加した条件で、ＦＧＦ２１ ｓｉＲＮＡを導入しなかった場合、及びコントロールｓｉＲＮＡを使用した場合に比べて、ＢｒｄＵの取り込みの上昇が顕著に抑制できていた（ｐ＜０．０１）。
　以上の結果から、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１８は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に影響を及ぼさないが、ＦＧＦ２１は、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進に関与していることが示唆された。
実施例３：オリゴデンドロサイト前駆細胞に対するＦＧＦ２１の増殖促進作用の検討
　オリゴデンドロサイト前駆細胞に対するＦＧＦ２１の増殖促進作用を、培養細胞を用いて検証した。
（１）材料及び方法
　組み換えＦＧＦ１５（Ａｂｃａｍ社製）、ＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）、ＦＧＦ２３（Ｒ＆Ｄ社製）を使用直前に生理食塩水で希釈して、ＦＧＦ２１含有液を準備した。オリゴデンドロサイト前駆細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（生後１日齢）の脳から実施例１と同様の手法で採取した。
　先ず、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で被膜したプラスティック組織培養皿に播種し、次の培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％　Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ　ａｐｏ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ　Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　ｂａｓｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液中に各種ＦＧＦ含有液を各種ＦＧＦが１０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、ＢｒｄＵを添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、ＦＧＦ２１含有液の代わりに同量の生理食塩水を使用して、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。なお、本実験では、各群３例ずつ検討した。
（２）結果
　各群のＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果について、平均値±標準誤差を図３に示す。また、各群のＢｒｄＵの取り込み量については、統計解析を行った。図３から明らかなように、ＦＧＦ２１を添加することによって、オリゴデンドロサイト前駆細胞のＢｒｄＵの取り込みが著しく増加しており、ＦＧＦ２１を添加した群とコントロール（生理食塩水添加）との間には、ＢｒｄＵの取り込み量において有意な差が認められた。ＦＧＦ１５、ＦＧＦ２３を添加した群とコントロールトの間には、ＢｒｄＵの取り込み量において有意な差が認められなかった。即ち、本結果から、ＦＧＦ２１には、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進する作用があることが確認された。
実施例４：脱髄モデルマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に対する効果の検討（１）
　ＦＧＦ２１のオリゴデンドロサイト前駆細胞に対する増殖促進作用を、脱髄モデルマウスを用いて検討した。
（１）材料及び方法
　Ｃ５７ＢＬ/６ｊマウス（メス、７週齢）の脊髄内に、生理食塩水で１％（w/v）に希釈したリゾフォスファチジルコリンをマウス１匹当たり２μｌ局所投与し、脱髄モデルマウスを作製した。
　組み換えＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を生理食塩水で４．１７μｇ／ｍｌとなるように希釈したＦＧＦ２１含有液を浸透圧ポンプ（アルゼット社製）に充填し、ポンプの先端にカニューレを装着し、先端を脱髄モデルマウスのリゾフォスファチジルコリン投与部位に添えて、ＦＧＦ２１の投与を持続的に行った。７日後に、脱髄モデルマウスを麻酔し、生理食塩水を経心的に還流して脊髄組織を採取した。最終的にＦＧＦ２１は３５０ｎｇ投与した。脊髄組織を４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、３０％スクロース溶液で置換した後、凍結薄層切片を作製した。切片を抗ＰＤＧＦＲα抗体と抗Ｋｉ６７抗体を使用して免疫染色を行い、切片内のＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した。ＰＤＧＦＲαはオリゴデンドロサイト前駆細胞のマーカーであり、Ｋｉ６７は細胞増殖マーカーである。また、コントロールとして、生理食塩水を使用して、前記と同条件でＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を測定した。なお、本実験では、各群５匹のマウスを用いて検討した。
（２）結果
　ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果について、平均値±標準誤差を図４に示す。また、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数については、分散分析により統計解析を行った。図４から分かるように、ＦＧＦ２１を投与した脱髄モデルマウスでは、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数が増加しており、ＦＧＦ２１を投与した群とコントロール（生理食塩水添加）との間には、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数において有意な差（ｐ＜０．０５）が認められた。この結果から、ＦＧＦ２１は、生体内で、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進できることが明らかとなった。
実施例５：脱髄モデルマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に対する効果の検討
　ＦＧＦ２１のオリゴデンドロサイト前駆細胞に対する増殖促進作用を、脱髄モデルマウスを用いて検討した。
（１）材料及び方法
　Ｃ５７ＢＬ/６ｊマウス（メス、７週齢）に、胸椎１１番目と胸椎１２番目が椎弓を切除し、背柱の正中線に深さ２ｍｍで、生理食塩水で１％（w/v）に希釈したリゾフォスファチジルコリン２μｌを局所投与することにより、脱髄モデルマウスを作製した。
　組み換えＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を生理食塩水で希釈したＦＧＦ２１含有液を用いて、ＦＧＦ２１を１日当たり５００ｎｇ／ｋｇ体重の投与量で２週間皮下投与した。２週間後に、脱髄モデルマウスを麻酔し、生理食塩水を経心的に還流して脊髄組織を採取した。採取した脊髄組織を４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、３０％スクロース溶液で置換した後、凍結薄層切片を作製した。切片を抗ＰＤＧＦＲα抗体と抗Ｋｉ６７抗体を使用して免疫染色を行い、切片内のＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した。また、コントロールとして、０．５％ＢＳＡを含む生理食塩水を使用して、前記と同条件でＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を測定した。なお、本実験では、各群５又は６匹のマウスを用いて検討した。
（２）結果
　ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果について、平均値±標準誤差を図５に示す．本試験でも、ＦＧＦ２１を投与した脱髄モデルマウスにおいて、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数が増加しており、ＦＧＦ２１は、生体内でオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進できることが明らかとなった。
実施例６：脱髄モデルマウスの髄鞘修復に対する効果の検討
　ＦＧＦ２１の髄鞘修復作用を、脱髄モデルマウスを用いて検討した。
（１）材料及び方法
　脱髄モデルマウスは、前記実施例５と同様の手法で作出した。リゾフォスファチジルコリン投与から７日後の脱髄モデルマウスに対して、組み換えＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を生理食塩水で希釈したＦＧＦ２１含有液を用いて、ＦＧＦ２１を１日当たり５００ｎｇ／ｋｇ体重の投与量で２週間皮下投与した。２週間後に、脱髄モデルマウスを麻酔し、生理食塩水を経心的に還流して脊髄組織を採取した。前記実施例５と同様の手法で、採取した脊髄組織から切片を作成し、切片を抗ＭＢＰ抗体にて免疫染色を行い、切片内のＭＢＰ陽性領域を計測した。また、コントロールとして、０．５％ＢＳＡを含む生理食塩水を使用して、前記と同条件でＭＢＰ陽性領域を測定した。なお、本実験では、各群１匹のマウスを用いて検討した。
（２）結果
　ＭＢＰ陽性領域を計測した結果について、平均値を図６に示す．ＦＧＦ２１を投与した脱髄モデルマウスにおいて、ＭＢＰ陽性領域が増加しており、ＦＧＦ２１は、生体内で髄鞘修復を促進できることが明らかとなった。
実施例７：脱髄モデルマウスの神経症状に対する効果の検討
　ＦＧＦ２１の神経症状への治療効果について、脱髄モデルマウスを用いて検討した。
（１）材料及び方法
　脱髄モデルマウスの作出と組み換えＦＧＦ２１の投与は、前記実施例５と同様の手法で実施した。マウスの後肢の運動機能はｌａｄｄｅｒ　ｗａｌｋ　ｔｅｓｔを実施した。長さ１メートルの梯子を高さ１５ｃｍの位置に設置した。梯子の幅はランダムに０．６、１．２、１．８ｃｍにして、マウスを梯子の上を歩かせた。肢を踏み外す回数を計測し、全歩数に対する肢を踏み外す回数の割合（％）を算出した。なお、本実験では、各群３匹のマウスを用いて検討した。
（２）結果
　梯子を踏み外した回数の割合を算出した結果について、平均値±標準誤差を図７に示す．ＦＧＦ２１を投与した脱髄モデルマウスにおいて、梯子を踏み外す回数が低下しており、ＦＧＦ２１は、神経機能の改善を促すことが明らかとなった。
実施例８：ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞に対するＦＧＦ２１の増殖促進作用の検討
　オリゴデンドロサイト前駆細胞に対するＦＧＦ２１の増殖促進作用を、ヒト由来の培養細胞を用いて検証した。
（１）材料及び方法
　組み換えヒトＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を使用直前に生理食塩水で希釈して、ＦＧＦ２１含有液を準備した。また、ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社製）を準備した。
　先ず、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｄｅで被膜したプラスティック組織培養皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製）に播種し、次の培地にて１日間培養（３７℃、５％ＣＯ2）した。使用した培地は、４ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｄａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％　Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ/ｍｌ　ａｐｏ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、５μｇ/ｍｌ　Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、３０ｎＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎＭ　Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ/ｍｌ　ｂａｓｉｃ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）１（ｖ/ｖ）％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ/ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤＭＥＭである。その後、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養液中にＦＧＦ２１含有液をＦＧＦ２１が６ｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で２４時間培養を行った。次いで、ＢｒｄＵを添加して３７℃で２４時間培養した後に細胞を回収し、ＢｒｄＵの取り込みを細胞増殖ＥＬＩＳＡ, ＢｒｄＵ発色キット（ロシュ社製）で検出した。また、コントロールとして、ＦＧＦ２１含有液の代わりに同量の生理食塩水を使用して、前記と同条件でＢｒｄＵの取り込みを測定した。なお、本実験では、コントロール群を６例、ＦＧＦ２１群を４例検討した。
（２）結果
　各群のＢｒｄＵの取り込み量の測定した結果について、平均値±標準誤差を図８に示す。また、各群のＢｒｄＵの取り込み量については、統計解析を行った。図６から明らかなように、ＦＧＦ２１を添加することによって、オリゴデンドロサイト前駆細胞のＢｒｄＵの取り込みが著しく増加しており、ＦＧＦ２１を添加した群とコントロール（生理食塩水添加）との間には、ＢｒｄＵの取り込み量において有意な差が認められた。即ち、本結果から、ＦＧＦ２１には、ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進する作用があることが確認された。
実施例７：脳挫傷モデルマウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖に対する効果の検討
　ＦＧＦ２１のオリゴデンドロサイト前駆細胞に対する増殖促進作用を、脳挫傷モデルマウスを用いて検討した。
（１）材料及び方法
　Ｃ５７ＢＬ/６ｊマウス（メス、７週齢）を麻酔下で、脳定位固定装置（ナリシゲ社製）に固定した。頭皮を正中切開し、筋膜を取り除き、頭蓋を露出した。ブレグマから２ｍｍ側方の地点を中心にして直径４ｍｍの円形で開頭した。脳挫傷はＰｎｅｕｍａｔｉｃ Ｉｍｐａｃｔ Ｄｅｖｉｃｅ（ＡｍＳｃｉｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）に直径３ｍｍのチップを接続して、作成した。衝撃を与えるパラメーターは、速度４～４．５ｍｍ／秒、深さ１ｍｍ、持続時間を１２０ミリ秒とした。
　組み換えＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ社製）を生理食塩水で希釈したＦＧＦ２１含有液を浸透圧ポンプ（アルゼット社製）に充填した。また、当該浸透圧ポンプの先端にカニューレを装着し、更にその先端にＢｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｋｉｔ（アルゼット社製）を繋ぎ、ＦＧＦ２１含有液を脳室内に持続的に投与した。ＦＧＦ２１含有液の投与は、ＦＧＦ２１が１日当たり５０ｎｇ／ｋｇ体重となる投与量で１週間行った。その後、脳挫傷マウスを麻酔し、生理食塩水を経心的に還流して脳組織を採取した。採取した脳組織を４％パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、３０％スクロース溶液で置換した後、凍結薄層切片を作製した。切片を抗ＰＤＧＦＲα抗体と抗Ｋｉ６７抗体を使用して免疫染色を行い、切片内のＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した。また、コントロールとして、０．５％ＢＳＡを含む生理食塩水（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を使用して、前記と同条件でＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を測定した。なお、本実験では、各群５又は６匹のマウスを用いて検討した。
（２）結果
　ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数を計測した結果について、平均値±標準誤差を図９に示す。本試験でも、ＦＧＦ２１を投与した脳挫傷モデルマウスにおいて、ＰＤＧＦＲα及びＫｉ６７共陽性細胞数が増加しており、ＦＧＦ２１は、脳挫傷後においてもオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進できることが明らかとなった。

Claims (15)

  1. 　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、脱髄疾患の予防又は治療剤。
  2. 　前記有効成分がＦＧＦ２１である、請求項１に記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
  3. 　前記脱髄疾患が中枢神経系の脱髄疾患である、請求項１又は２に記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
  4. 　中枢神経系の脱髄疾患の後遺症の改善に使用される、請求項１～３のいずれかに記載の脱髄疾患の予防又は治療剤。
  5. 　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤。
  6. 　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、髄鞘の修復剤。
  7. 　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の、脱髄疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
  8. 　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種の、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進剤の製造のための使用。
  9. 　ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分の髄鞘の修復剤の製造のための使用。
  10. 　脱髄疾患の予防又は治療が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、その予防又は治療に有効な量を投与する工程を含む、脱髄疾患の予防又は治療方法。
  11. 　オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進に有効な量を投与する工程を含む、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進方法。
  12. 　髄鞘の修復が必要とされている者に、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を、髄鞘の修復に有効な量を投与する工程を含む、髄鞘の修復方法。
  13. 　脱髄疾患の予防又は治療の処置に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
  14. 　オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖促進の処置に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
  15. 　髄鞘の修復の処理に使用される、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１をコードしているＤＮＡ、ＦＧＦ２１産生促進物質、及びＦＧＦ２１産生細胞よりなる群から選択される少なくとも１種。
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