WO2016016505A1 - Material híbrido como agente de contraste en imágenes de resonancia magnética - Google Patents

Material híbrido como agente de contraste en imágenes de resonancia magnética Download PDF

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WO2016016505A1
WO2016016505A1 PCT/ES2015/070595 ES2015070595W WO2016016505A1 WO 2016016505 A1 WO2016016505 A1 WO 2016016505A1 ES 2015070595 W ES2015070595 W ES 2015070595W WO 2016016505 A1 WO2016016505 A1 WO 2016016505A1
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silica
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Pablo BOTELLA ASUNCIÓN
Alejandro CABRERA GARCÍA
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad Politecnica de Valencia
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad Politecnica de Valencia
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01C—AMMONIA; CYANOGEN; COMPOUNDS THEREOF
    • C01C3/00—Cyanogen; Compounds thereof
    • C01C3/08—Simple or complex cyanides of metals

Definitions

  • HYBRID MATERIAL AS A CONTRACTING AGENT IN IMAGES OF
  • the present invention is framed within the applications of Prussian blue derivatives (AP) for imaging and diagnosis.
  • AP Prussian blue derivatives
  • the incorporation of an insoluble and biocompatible silica-based shell stabilizes the nanoparticles of the AP derivative and reduces its toxicity in vitro and in vivo, while promoting the accumulation of the magnetically active compound in pathogenic tissues due to the increased permeability and retention effect. and improves the contrast in the magnetic resonance imaging.
  • Magnetic resonance imaging is a widely used non-invasive and non-radioactive clinical diagnostic technique.
  • the intensity of the images obtained by MRI depends on the proton density of the water in the examined tissues, as well as the longitudinal (Ti) and transverse (T 2 ) relaxation times.
  • Ti longitudinal
  • T 2 transverse
  • CA contrast agent
  • It is a compound capable of modifying the values of Ti and T 2 in tissues. Two types of these agents are usually differentiated: those capable of reducing the value of Ti and those capable of lowering T 2 .
  • the contrast agent for MRI can be injected intravenously (/ V) to improve the visualization of tumors, blood vessels and / or inflamed tissues, among others.
  • a contrast agent can be injected directly into a certain organ or tissues, or into a joint, when it is desired to obtain a specific image thereof.
  • Gd 3+ is a potent toxic system to renal, can lead to systemic nephrogenic fibrosis and fibrosing nephrogenic dermopathy, as a result of the release of the cation by the chelate.
  • This toxicity is a consequence of the atomic radius of Gd 3+ (1, 02 A), very similar to that of Ca 2+ (1, 00 A). In this way, the presence of free Gd 3+ in the body causes the alteration of the functions of the calcium channels depending on the voltage of the cell membranes.
  • T 2 contrast agents approved for hospital use in MRI are based on superparamagnetic ferric oxide nanoparticles (SPIONs, 5-500 nm). Although these are materials with high sensitivity, non-toxic and with the ability to enter the cells, from the point of view of clinical diagnosis and cell imaging, the resolution of the images obtained with T 2 agents is lower than those generated by Ti compounds and it is often difficult to distinguish them from hemorrhages, calcifications, metallic deposits and other possible formations in a damaged tissue.
  • SPIONs superparamagnetic ferric oxide nanoparticles
  • both ⁇ and T 2 contrast agents are unstable in the stomach acid medium, which prevents their oral administration.
  • the development of a new contrast agent requires a stable system in physiological medium, with high plasma residence time and capable of accumulating in the tissues and target cells, allowing to improve the contrast in MRI images at low concentration, at The time during which the study is possible is increased.
  • it must be an easy elimination system, mainly by the renal or digestive route, once its mission has been fulfilled, without the intracellular processes to which it can be subjected give rise to toxic metabolites.
  • it would be of great interest that such a contrast agent allows the Ti and T 2 values to be significantly reduced together.
  • AP derivatives doped with a Gd 3+ or other paramagnetic cation have utility as contrast agents ⁇ and T 2 .
  • US patent 2010/0254912 2010; Huang, SD; Li, Y .; Shokouhimehr, M. presents a material based on ultrafine AP nanoparticles doped with Gd 3+ , of generic formula A 4x Fe 4- x '"[Fe" (CN) 6] 3 + x nl-l20, where A it is a cation selected from the group consisting of Li + , Na + , K + , Rb + , Cs + , NH 4 + or ⁇ , Fe '"is substituted by Gd 3+ in a proportion ranging from 1 to 100%, x varies from 0 to 1 and n varies from 1 to 24, and its application as a contrast agent T
  • the partial solubility of the derivatives of the AP in biological medium considerably limits the clinical use of these materials, due to the possible release of ions G
  • composition of said metal core responds to the formula A x M m [M (CN) 6 ] n, where A can correspond to a metal selected from the group consisting of Li, Na, K, Rb, Cs, Fr and TI, M corresponds to a metal selected from the group consisting of V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Ga, Zr, Nb, Mo, Ru, Cd, In, Hf, Ta, W, Os or Hg, M 'corresponds to a metal selected from the group consisting of Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Sr, Zr, Nb, Mo, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Lu, Ba, Hf, Ta, W, Os, Pt, Hg, La, Eu, Gd, Tb, Dy and Ho, m varies from 0 to 5, x varies from 0 to 5 and n varies from 0.5 to 10.
  • the biocompatible organic shell comprises one or more biocompatible materials selected from the group consisting of antibodies, dextran, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone and citrate.
  • biocompatible materials selected from the group consisting of antibodies, dextran, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone and citrate.
  • the nanoparticles of a hybrid material composed of an organ-metallic core derived from the AP and a silica cover have very high ⁇ and r 2 values, while being biocompatible and very stable in physiological medium , being able to incorporate a large number of molecules that give them multifunctional character.
  • the encapsulation of nanoparticles of derivatives of the AP with a silica layer is strongly impeded, because these compounds dissolve virtually instantaneously in the alkaline medium in which silicate polymerization is carried out.
  • the present invention relates to a magnetic resonance contrast (MRI) agent based on a hybrid material that can comprise at least: - An organometric metal core of nanometer size derived from Prussian blue (AP), of generic formula
  • M is Cr, Mn, Fe, Co, Ru, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, or combinations thereof;
  • M ' is Cr, Mn, Fe, Co, Ru or combinations thereof;
  • the silica shell may be a silica shell preferably selected from unstructured and non-porous, which homogeneously coats the core nanoparticles, between unstructured and porous, with pore diameter between 1 and 100 nm, which homogeneously coats the core nanoparticles, between structured and porous, preferably mesoporous, with a pore diameter between 1 and 30 nm, which homogeneously coats the core nanoparticles.
  • the joint presence of an agent ⁇ (eg, Gd 3+ ) and a T 2 agent (eg, Fe 3+ ) in the contrast system of the present invention is beneficial to improve the overall contrast (positive and negative) of the images. of MRI and, therefore, the resolution, especially when the values of relajativity r- ⁇ and r 2 are very high.
  • agent ⁇ eg, Gd 3+
  • T 2 agent eg, Fe 3+
  • the contrast agent of the present invention may have values of longitudinal relaxivity (r- ⁇ ) between 5.0 and 50.0 mM “1 s “ 1 , preferably between 5.0 and 30.0 mM “1 s “ 1 , and transverse relaxivity values (r 2 ) between 10 and 300 mM “1 s “ 1 , preferably between 10 and 200 mM “1 s “ 1 , in a magnetic force field preferably between 0.5 and 1 1.0 T, and more preferably between 1, 2 and 9.4 T.
  • longitudinal relaxivity r- ⁇
  • r 2 transverse relaxivity values
  • the purpose of incorporating the silica shell onto the nanoparticles of the AP derivative is multiple;
  • the inorganic layer stabilizes the nanocrystals of the AP derivative, minimizing or suppressing the dissolution in physiological medium and release of toxic ions, such as Gd 3+ and Fe (CN) 6 3 " .
  • the silica cover prevents phenomena of uncontrolled aggregation of the nanoparticles of the organometallic compound, while preventing phenomena of extravasation, immune reactions and rapid renal elimination.
  • the silica cover has a large number of surface silanole groups on which it can be attached by covalent bond many molecules that provide multifunctionality to the hybrid material, in any case, the encapsulation of the nanopar AP derivative with a silica cover does not imply any structural and / or functional alteration of the contrast agent, as shown in Figure 1.
  • the presence of the silica surface layer is evidenced by a wide band in the infrared spectrum at 1080 cm "1 , which is not seen in the uncoated material, (see Figure 2).
  • the particles of said contrast agent may have different shapes.
  • its particles may have the shape selected between spherical, rod, blade or star and combinations thereof.
  • the particles are in the form of a blade or star.
  • the particles of the contrast agent may have an average diameter between 10 and 3000 nm, preferably between 20 and 1000 nm.
  • the silica cover of the contrast agent may have a thickness between 1 and 100 nm, preferably between 5 and 50 nm.
  • the silica cover of the contrast agent can be functionalized with a molecule, that is, the silica cover of the contrast agent can further comprise a molecule selected from a poly (ethylene glycol) (PEG) , a fluorescent agent, a radionuclide, a directing molecule and combinations thereof.
  • PEG poly (ethylene glycol)
  • this molecule increases the solubility and stability of the material in aqueous medium, allowing the preparation of stable colloids while reducing the interactions of the nanoparticles with plasma components. blood, increasing plasma residence time, reducing or eliminating the immune response, reducing toxicity and increasing efficacy, and promoting accumulation in specific tissues and / or cells.
  • the molecular weight of the PEG molecule can range from 200 to 20,000 Da and its concentration can range from 1 to 30% by weight.
  • the contrast agent is functionalized with a covalently bound fluorescent agent.
  • the fluorescent agent molecule allows the study of the biodistribution of the contrast agent.
  • the fluorescent agent may be selected from 5-amino fluorescein, fluorescein isothiocyanate, NHS-fluorescein, rhodamine B isothiocyanate, tetramethylrodamine B isothiocyanate, NHS-Cy5 and / or NHS-Cy5.5 or a derivative thereof incorporating a organic ligand that facilitates covalent bonding with the inorganic shell, as well as combinations thereof.
  • the concentration of the fluorescent agent may range from 0.01 to 5% by weight.
  • the silica cover of the contrast agent may incorporate a radionuclide, preferably an 18 F radionuclide as a functionalizing molecule.
  • the radioactive isotope allows the study of the biodistribution and pharmacokinetics of the pharmaceutical preparation using the positron emission tomography (PET) technique.
  • PET positron emission tomography
  • the concentration of the 18 F radionucle can range from 0.0001 to 1% by weight.
  • the silica coating of the contrast agent may incorporate a directing molecule, the directing molecule being understood as any molecule that favors endocytosis internalization in the target cells.
  • the directing molecule may be selected from a synthetic, semi-synthetic, natural molecule and combinations thereof.
  • the targeting molecule according to the present invention may be selected from proteins, carbohydrates, lipids, nucleic acids, hormones and hormonal analogs, vitamins, enzymatic co-factors and metabolites of protein synthesis, a derivative thereof that incorporates an organic ligand that facilitates the covalent attachment to the inorganic shell and combinations thereof.
  • the present invention also relates to a method of preparing the contrast agent defined above.
  • This method may comprise, at least, contacting an aqueous suspension of nanoparticles of the Prussian blue derivative (AP) with a solution of at least one silicon compound preferably selected from a silicon alkoxide, an alkylsilane, sodium silicate and colloidal silica and combinations thereof, in the presence of at least one amine preferentially selected from primary, secondary, tertiary amine and combinations thereof and its molecular weight is less than 1000 Da, preferably maintaining the pH between 7 and 8 , and shaking to allow the growth of the inorganic wall that surrounds the organ-metallic core.
  • Said method may further comprise a step of washing and lyophilization of the hybrid material obtained.
  • the formation of the inorganic shell can be carried out in the presence of an organic surfactant, which can be added to the mixture, and which will subsequently be removed, preferably by extraction with alcohols.
  • This organic surfactant may preferably be a cationic, anionic or neutral compound, with a surfactant ratio: Si0 2 preferably between 0.005 and 0.65 molar, more preferably between 0.01 and 0.5 molar.
  • said surfactant can be removed after obtaining the particles of the hybrid material, by refluxing with short chain alcohols.
  • the method of preparing the contrast agent may further comprise the use of an organic co-solvent, adding this to the mixture, with a preferred co-solvent ratio: water in volume between 1: 1 and 10: 1, more preferably between 2: 1 and 4: 1.
  • said solvent may preferably be an aliphatic chain alcohol with a carbon number between 1 and 6.
  • the present invention also relates to the use of the contrast agent defined above and obtained by the method described above for magnetic resonance imaging (MRI), specifically to improve the resolution of MRI images, said use comprising administration to humans and animals either orally, parenterally, respiratoryly or transdermally in sufficient concentration to achieve non-selectively pathological tissues.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • the contrast agent defined above can be administered to the host by direct injection into the injured area, accumulating in the interstitial tissue.
  • the contrast agent described in the present invention can be used with a magnetic field of varying force between 0.5 and 1.0 T, preferably between 1.2 and 9.4 T.
  • the dose of the contrast agent of the present invention will depend on the host, tissue and / or cells under study and the route of administration. In general, the dose varies between 0.001 and 0.1 mmol / Kg.
  • the blood half-life of the contrast agent of the present invention is sufficient to be able to obtain MRI images in the different hosts, said half-life being in the range of 0.5 to 6 h, preferably between 1 and 6 h.
  • the word "comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • FIGURES Figure 1 shows the X-ray diffractograms of the Gd [Fe (CN) 6] material prepared according to Example 1 (A) and Example 3 (C), and of the contrast agent of the present invention prepared according to Example 2 (B) and Example 4 (D).
  • Figure 2 shows the infrared spectra of the Gd [Fe (CN) 6] material prepared according to Example 1 (A) and the y of the contrast agent of the present invention prepared according to Example 2 (B).
  • Figure 3 is a schematic illustration of the nanoparticle preparation process of the contrast agent of the present invention.
  • Figure 4 shows nanoparticle transmission electron microscopy images of the contrast agent of the present invention prepared according to Example 2, showing the general morphology (A) and the silica coating deposited on the surface of the Gd material [Fe (CN) 6 ] (B).
  • Figure 5 shows the evolution of the longitudinal (1 / ⁇ ) and transverse (1 / T 2 ) relaxation velocity with respect to the concentration of the contrast agent of the present invention prepared according to Example 2, as well as the calculated values of longitudinal relaxivity (n) and transverse (r 2 ).
  • Figure 6 shows the evolution of the longitudinal (1 / ⁇ ) and transverse (1 / T 2 ) relaxation velocity with respect to the concentration of the contrast agent of the present invention prepared according to Example 4, as well as the calculated values of longitudinal relaxivity (n) and transverse (r 2 ).
  • the present invention is illustrated by the following examples that are not intended to be limiting thereof.
  • EXAMPLE 1 Preparation of nanoparticles of the Gd [Fe (CN) 6 ] material of average diameter between 100 and 400 nm (modified from J. Phys. Chem. C 2009, 113, 21531-21537; Yamada, M; Yonekura, S .) - In a 500 ml balloon connected to the N 2 line, 3.30 g (10 mmol) of K 3 [Fe (CN) 6 ] and 6.30 g (30 mmol) of tetraethyl ammonium bromide are introduced (Et 4 NBr), and dissolved with stirring in 200 ml of methanol at 30 ° C for 3 days under nitrogen atmosphere.
  • Et 4 NBr tetraethyl ammonium bromide
  • EXAMPLE 2 Preparation of a magnetic resonance contrast agent based on nanoparticles of a hybrid material composed of a Gd core [Fe (CN) 6 ] prepared according to Example 1 and a silica cover. 3.80 g of the material Gd [Fe (CN) 6 ] prepared according to Example 1 is dispersed in 1900 ml of a H 2 0 hydroalcoholic mixture: ethanol (2: 5 v / v) and 3.6 ml (0.019 mol) of cyanopropyl trimethoxysilane with vigorous magnetic stirring.
  • TMOS tetramethyl orthosilicate
  • EXAMPLE 4 Preparation of a magnetic resonance contrast agent based on nanoparticles of a hybrid material composed of a Gd core [Fe (CN) 6 ] prepared according to Example 3 and a silica cover.
  • the resulting dispersion is kept under stirring for 24 hours, which allows the growth of a wall of amorphous non-porous silica on the surface of the crystals of the material Gd [Fe (CN) 6 ].
  • TMOS 9.5 ml, 0.064 mol
  • the suspension is centrifuged (500 g, 2 h), washed three times with a hydroalcoholic mixture H 2 0: ethanol (2: 5 v / v) (2000 g, 20 min).
  • the sediment is lyophilized at -55 ° C for 16 h.
  • An orange powder is obtained, consisting of particles of Gd [Fe (CN) 6 ] @ Si0 2 of average diameter between 20-200 nm.
  • the X-ray diffractogram of the material is shown in Figure 1 D.
  • EXAMPLE 5 Measurement of longitudinal (n) and transverse (r 2 ) relaxivity with respect to the concentration of the contrast agent prepared in Example 2.
  • Stable suspensions of the contrast agent Gd [Fe (CN) 6 ] @ Si0 2 are prepared obtained according to the procedure described in Example 2, varying the concentration of Gd 3+ from 0.1 to 2.0 mM, and measuring the relaxation of the Ti and T 2 protons in a 400 MHz NMR device (9.4 T).
  • the results obtained expressed as normalized relaxivity versus concentration are presented in Figure 5.
  • the values obtained from r- ⁇ and r 2 are also indicated in Table 1.
  • EXAMPLE 6 Measurement of longitudinal (n) and transverse (r 2 ) relaxivity with respect to the concentration of the contrast agent prepared in Example 4.
  • Stable suspensions of the contrast agent Gd [Fe (CN) 6 ] @ Si0 2 are prepared obtained according to the procedure described in Example 4, varying the concentration of Gd 3+ from 0.1 to 2.0 mM, and the relaxation of the Ti and T 2 protons in a 400 MHz NMR device (9.4 T).
  • the results obtained expressed as normalized relaxivity versus concentration are presented in Figure 6.
  • the values obtained from r- ⁇ and r 2 are also indicated in Table 1.

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Abstract

La presente invención se refiere a un agente de contraste de resonancia magnética basado en un material híbrido compuesto de un núcleo organo-metálico derivado del azul de Prusia y una cubierta de sílice y, opcionalmente, moléculas de un poli(etilenglicol), un agente fluorescente, un radionúcleo y/o una sustancia directora a receptores, células o tejidos específicos, unidas por enlace covalente a la superficie de la cubierta inorgánica.

Description

MATERIAL HÍBRIDO COMO AGENTE DE CONTRASTE EN IMÁGENES DE
RESONANCIA MAGNÉTICA
DESCRIPCIÓN
Campo de la Técnica
La presente invención se enmarca dentro de las aplicaciones de los derivados del azul de Prusia (AP) para imagen y diagnóstico. La elevada solubilidad de los materiales en fluidos biológicos y el carácter altamente tóxico de sus componentes limita su utilización en la práctica clínica. La incorporación de una cubierta insoluble y biocompatible basada en sílice estabiliza las nanopartículas del derivado del AP y reduce su toxicidad in vitro e in vivo, a la vez que favorece la acumulación del compuesto magnéticamente activo en tejidos patógenos por el efecto de permeabilidad y retención aumentada y mejora el contraste en la imágenes de resonancia magnética.
Antecedentes La resonancia magnética de imagen (MRI) es una técnica de diagnóstico clínico no invasiva y no radiactiva de amplia utilización. La intensidad de las imágenes obtenidas por MRI depende de la densidad de protones del agua en los tejidos examinados, así como de los tiempos de relajación longitudinal (T-i) y tranversal (T2). Habitualmente, la diferencia en la densidad de protones del agua en los distintos tejidos es escasa, por lo que para obtener alta resolución en las imágenes de MRI es necesaria la administración de un agente de contraste (CA). Se trata de un compuesto capaz de modificar los valores de T-i y T2 en los tejidos. Habitualmente se diferencia dos tipos de estos agentes: aquellos capaces de reducir el valor de T-i y aquellos capaces de bajar el T2. En el primer caso, se trata de sustancias que aumentan el brillo (contraste positivo) de las imágenes de MRI, mientras que en el segundo caso se trata de compuestos que oscurecen aquellas regiones en las que se acumulan (contraste negativo). Al respecto, desde un punto de vista de su aplicación en diagnostico clínico, la información aportada por los agentes T-i es muy superior a la que ofrecen las sustancias que disminuyen el T2, si bien la combinación de ambos puede resultar complementaria. El agente de contraste para MRI puede ser inyectado vía intravenosa (/V) para mejorar la visualización de tumores, vasos sanguíneos y/o tejidos inflamados, entre otros. Igualmente, un agente de contraste puede ser inyectado directamente sobre un determinado órgano o tejidos, o sobre una articulación, cuando se desee obtener una imagen específica de los mismos. Como se ha comentado, se diferencian dos tipos de estos materiales magnéticamente activos capaces de modificar el contraste en las imágenes de MRI: paramagnéticos, capaces de reducir primariamente el T-i (agentes Ti) y ferromagnéticos, capaces de bajar primariamente el T2 (agentes T2). Todos los agentes T-i utilizados en MRI clínica están basados en complejos paramagnéticos de Gd3+ y ligandos poliaminopolicarboxilatos solubles en medio fisiológico. El elevado spin electrónico de este catión, con 7 electrones desapareados (4f7, S=7/2), unido a su estado electrónico basal (8S7/2) y a la lenta relajación electrónica (10"9 s), proporciona al Gd3+ unas propiedades magnético-nucleares únicas para la disminución del tiempo de relajación longitudinal de los protones del agua. Sin embargo, el uso de estos compuestos solubles de Gd3+ conlleva una serie de problemas y riegos que limitan la práctica clínica. En primer lugar, la baja relajatividad del T-i de estos agentes ante la acción de un campo magnético de alta intensidad obliga a administrar elevadas dosis para obtener contraste, debiendo alcanzar una concentración plasmática superior a 0,1 mM. Además, estas moléculas de pequeño tamaño presentan una velocidad de aclarado plasmático muy elevada, lo que reduce considerablemente el tiempo de medida. Todo esto complica la utilización clínica de los agentes T-i, puesto que el Gd3+ es un potente tóxico del sistema renal, pudiendo dar lugar a fibrosis sistémica nefrogénica y dermopatía nefrogénica fibrosante, como consecuencia de la liberación del catión por el quelato. Dicha toxicidad es una consecuencia del radio atómico del Gd3+ (1 ,02 A), muy similar al del Ca2+ (1 ,00 A). De esta forma, la presencia de Gd3+ libre en el organismo provoca la alteración de las funciones de los canales de calcio dependientes del voltaje de las membranas celulares.
Todos los agentes de contraste T2 aprobados para uso hospitalario en MRI se basan en nanopartículas de óxido férrico superparamagnéticas (SPIONs, 5-500 nm). A pesar de que se trata de materiales con elevada sensibilidad, no tóxicos y con capacidad para entrar en las células, desde el punto de vista de diagnóstico clínico e imagen celular, la resolución de las imágenes obtenidas con agentes T2 es inferior a las generadas por compuestos Ti y, con frecuencia, resulta difícil distinguirlas de hemorragias, calcificaciones, depósitos metálicos y otras formaciones posibles en un tejido dañado.
Por otro lado, tanto los agentes de contraste ΤΊ como T2 son inestables en el medio ácido estomacal, lo que impide su administración oral. Al respecto, el desarrollo de un nuevo agente de contraste requiere un sistema estable en medio fisiológico, con elevado tiempo de residencia plasmática y capaz de acumularse en los tejidos y células diana, permitiendo mejorar el contraste en las imágenes de MRI a baja concentración, a la vez que se aumenta el periodo durante el cual es posible realizar el estudio. Asimismo, debe tratarse de un sistema de fácil eliminación, fundamentalmente por vía renal o digestiva, una vez cumplido su cometido, sin que los procesos intracelulares a los que pueda verse sometido den lugar a metabolitos tóxicos. Por último, con vistas a mejorar la resolución de las imágenes de MRI, sería de gran interés que dicho agente de contraste permita reducir sensiblemente los valores de T-i y T2 conjuntamente.
Los derivados del AP dopados con un Gd3+ u otro catión paramagnético presentan utilidad como agentes de contraste ΤΊ y T2. En la patente US 2010/0254912 2010; Huang, S.D.; Li, Y.; Shokouhimehr, M., se presenta un material basado en nanopartículas ultrafinas de AP dopado con Gd3+, de fórmula genérica A4xFe4- x'"[Fe"(CN)6]3+x nl-l20, en donde A es un catión seleccionado del grupo formado por Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+, NH4 + o Τ , Fe'" esta sustituido por Gd3+ en una proporción que oscila entre 1 y 100 %, x varía de 0 a 1 y n varía de 1 a 24, y su aplicación como agente de contraste T Sin embargo, la solubilidad parcial de los derivados del AP en medio biológico limita considerablemente el uso clínico de estos materiales, debido a la posible liberación de iones Gd3+ y Fe(CN)6 4", ambos altamente tóxicos.
En la patente WO2012/108856 2012; Huang, S.; Khitrin, A.K.; Perea, V.S.; Kandanapitive, M.S., se describe un agente de contraste de MRI basado en nanopartículas (4-500 nm) del compuesto AxMny[M(CN)6]z nH20, en donde A=Li, Na, K, NH4 o TI, M=Cr, Mn, Fe, Co o Ru, x=0-2, y=1 -4, z=1-4, y n=0 o 1-20, protegidas con una cubierta hidrófila de ácido carboxílico o polímero biocompatible. Asimismo, se indica que la liberación in vitro de iones CN" en agua es menor de 0,1 mM durante un periodo de 24 h, lo que indica un cierto efecto estabilizador de la cubierta orgánica sobre el derivado del AP nanoparticulado. La patente WO2012/1 10835 2012; Máthé, D.; Szigeti, K., reivindica un material basado en nanopartículas con un núcleo metálico de AP dopado con uno o más isótopos metálicos y una cubierta orgánica biocompatible, así como su aplicación como agente de contraste en MRI. La composición de dicho núcleo metálico responde a la fórmula AxM m[M(CN)6]n, donde A puede corresponde a un metal seleccionado del grupo formado por Li, Na, K, Rb, Cs, Fr y TI, M corresponde a un metal seleccionado del grupo formado por V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Ga, Zr, Nb, Mo, Ru, Cd, In, Hf, Ta, W, Os o Hg, M' corresponde a un metal seleccionado del grupo formado por Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Sr, Zr, Nb, Mo, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Lu, Ba, Hf, Ta, W, Os, Pt, Hg, La, Eu, Gd, Tb, Dy y Ho, m varía de 0 a 5, x varía de 0 a 5 y n varía de 0,5 a 10. Respecto de la cubierta orgánica biocompatible, comprende uno o más materiales biocompatibles seleccionados del grupo formado por anticuerpos, dextrano, polietilen glicol, polivinil pirrolidona y citrato. De nuevo la aplicación hospitalaria de este tipo de materiales, que requiere de administración iv, se ve limitada por la posible liberación de iones como Gd3+ y Fe(CN)6 4" en plasma (no se ofrece dato alguno acerca de la estabilidad del material en medio biológico), y sus posibles efectos tóxicos.
Todo lo anterior conduce a la necesidad de desarrollar nuevos sistemas para mejorar la resolución de las imágenes de MRI mediante un aumento del contraste, que reúnan las siguientes propiedades: i) biocompatibilidad, es decir, no provocar respuesta inmune inespecífica o específica; ii) elevados valores de relajatividad longitudinal (r-ι) y transversal (r2), permitiendo aumentar, respectivamente, el contraste positivo y negativo en las imágenes de MRI con dosis bajas del producto; iii) estabilidad en plasma humano, esto es, que no libere componente alguno en medio fisiológico o, en caso de que se produzca liberación de alguno de sus componentes, su concentración en sangre debe mantenerse por debajo de los niveles de toxicidad; iv) capacidad para incorporar sobre su superficie moléculas de diversa funcionalidad (terapéutica, diagnóstico, estabilizadora, etc.) mediante unión covalente estable.
En nuestro caso, hemos encontrado que las nanopartículas de un material híbrido compuesto de un núcleo órgano-metálico derivado del AP y una cubierta de sílice, presentan valores de π y r2 muy altos, a la vez que resultan biocompatibles y muy estables en medio fisiológico, pudiendo incorporar gran cantidad de moléculas que les confieren carácter multifuncional. Al respecto, el encapsulamiento de nanopartículas de derivados del AP con una capa de sílice se encuentra fuertemente impedido, debido a que estos compuestos se disuelven de forma prácticamente instantánea en el medio alcalino en que se lleva a cabo la polimerización del silicato. Para superar este inconveniente, se ha desarrollado un procedimiento de deposición de una capa de sílice sobre nanopartículas de derivados del AP a pH neutro mediante hidrólisis controlada de un precursor de sílice, utilizando aminas de bajo peso molecular como agentes activadores del silicato. Como resultado se ha obtenido un nanocomposite AP@Si02 en el que se mejora ostensiblemente la estabilidad en medio fisiológico de los nanocristales del derivado de AP, a la vez que se controla los parámetros texturales de la cubierta, la cual ofrece numerosas posibilidades de funcionalización. Descripción de la Invención
La presente invención se refiere a un agente de contraste de resonancia magnética (MRI) basado en un material híbrido que puede comprender, al menos: - Un núcleo órgano-metálico de tamaño nanométrico derivado del azul de Prusia (AP), de fórmula genérica
AxMm[M'(CN)6]n
donde
A es Li, Na, K, Rb, Cs, Fr, TI, NR4 siendo R=H o cualquier radical alquilo de estequiometria CaH2a+2, o combinaciones de los mismos;
M es Cr, Mn, Fe, Co, Ru, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, o combinaciones de los mismos;
M' es Cr, Mn, Fe, Co, Ru o combinaciones de los mismos;
x=0-2,
m=1-4,
n=1 -3, y
- Una cubierta de sílice que recubre homogéneamente las nanopartículas del núcleo. Según una realización particular, la cubierta de sílice puede ser una cubierta de sílice seleccionada preferentemente entre no estructurada y no porosa, que recubre homogéneamente las nanopartículas del núcleo, entre no estructurada y porosa, con diámetro de poro comprendido entre 1 y 100 nm, que recubre homogéneamente las nanopartículas del núcleo, entre estructurada y porosa, preferentemente mesoporosa, con diámetro de poro comprendido entre 1 y 30 nm, que recubre homogéneamente las nanopartículas del núcleo.
La presencia conjunta de un agente ΤΊ (p.e., Gd3+) y un agente T2 (p.e., Fe3+) en el sistema de contraste de la presente invención resulta beneficiosa para mejorar el contraste global (positivo y negativo) de las imágenes de MRI y, por tanto, la resolución, especialmente cuando los valores de relajatividad r-ι y r2 son muy altos. Así, el agente de contraste de la presente invención puede presentar valores de relajatividad longitudinal (r-ι) entre 5,0 y 50,0 mM"1 s"1, preferentemente entre 5,0 y 30,0 mM"1 s"1, y valores de relajatividad transversal (r2) entre 10 y 300 mM"1 s"1 , preferentemente entre 10 y 200 mM"1 s"1 , en un campo magnético de fuerza preferentemente entre 0,5 y 1 1 ,0 T, y más preferentemente entre 1 ,2 y 9,4 T.
La finalidad de la incorporación de la cubierta de sílice sobre las nanopartículas del derivado del AP es múltiple; de un lado, la capa inorgánica estabiliza los nanocristales del derivado del AP, minimizando o suprimiendo la disolución en medio fisiológico y liberación de iones tóxicos, como Gd3+ y Fe(CN)6 3". De esta forma se evitan efectos indeseados causados por la toxicidad de dichos iones, a la vez que se favorece la acumulación del agente de contraste en los tejidos y células diana, lo que permite reducir la dosis administrada sin perder resolución en las imágenes de MRI. Asimismo, la cubierta de sílice evita fenómenos de agregación no controlada de las nanopartículas del compuesto órgano-metálico, a la vez que impide fenómenos de extravasación, reacciones inmunitarias y rápida eliminación renal. Por otro lado, la cubierta de sílice presenta gran cantidad de grupos silanoles en superficie sobre los cuales puede unirse por enlace covalente multitud de moléculas que proporcionan multifuncionalidad al material híbrido. En cualquier caso, el encapsulamiento de las nanopartículas del derivado del AP con una cubierta de sílice no supone alteración estructural y/o funcional alguna del agente de contraste, tal y como se muestra en la Figura 1 . La presencia de la capa superficial de sílice queda en evidencia por una banda ancha en el espectro de infrarrojo a 1080 cm"1 , que no se aprecia en el material sin recubrir, (véase Figura 2).
En el agente de contraste de la presente invención las partículas de dicho agente de contraste pueden presentar diferentes formas. De manera preferente sus partículas pueden presentar la forma seleccionada entre esférica, varilla, aspa o estrellada y combinaciones de las mismas. De manera preferente, las partículas tienen forma de aspa o estrellada.
Según la presente invención las partículas del agente de contraste pueden presentar un diámetro medio comprendido entre 10 y 3000 nm, preferentemente entre 20 y 1000 nm.
Según una realización particular, la cubierta de sílice del agente de contraste puede tener un espesor entre 1 y 100 nm, preferentemente entre 5 y 50 nm. En una realización adicional de la presente invención la cubierta de sílice del agente de contraste puede funcionalizarse con una molécula, es decir, la cubierta de sílice del agente de contraste puede comprender, además, una molécula seleccionada entre un poli(etilenglicol) (PEG), un agente fluorescente, un radionúcleo, una molécula directora y combinaciones de los mismos.
Según la realización particular en la que el agente de contraste se funcionaliza con un PEG, esta molécula aumenta la solubilidad y estabilidad del material en medio acuoso, permitiendo la preparación de coloides estables a la vez que reduce las interacciones de las nanopartículas con componentes del plasma sanguíneo, aumentando el tiempo de residencia plasmática, reduciendo o eliminando la respuesta inmune, reduciendo la toxicidad y aumentando la eficacia, y promoviendo la acumulación en tejidos y/o células específicos. En el material de la presente invención, el peso molecular de la molécula de PEG puede oscilar entre 200 y 20.000 Da y su concentración puede oscilar entre el 1 y el 30% en peso.
Según otra realización particular el agente de contraste se funcionaliza con un agente fluorescente unido por enlace covalente. La molécula del agente fluorescente permite el estudio de la biodistribución del agente de contraste. De manera preferente, el agente fluorescente puede estar seleccionado entre 5-amino fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, NHS-fluoresceina, rodamina B isotiocianato, tetrametilrodamina B isotiocianato, NHS-Cy5 y/o NHS-Cy5.5 o un derivado de estos que incorpore un ligando orgánico que facilite la unión covalente con la cubierta inorgánica, así como combinaciones de los mismos. En el material de la presente invención, la concentración del agente fluorescente puede oscilar entre el 0,01 y el 5% en peso. Según otra realización particular de la presente invención la cubierta de sílice del agente de contraste puede incorporar un radionúcleo, preferentemente un radionúcleo de 18F como molécula funcionalizadora. El isótopo radioactivo permite el estudio de la biodistribución y la farmacocinética del preparado farmacéutico mediante la técnica de tomografía de emisión de positrones (PET). En el material de la presente invención, la concentración del radionúcleo de 18F puede oscilar entre el 0,0001 y el 1 % en peso.
En otra realización particular de la presente invención, la cubierta de sílice del agente de contraste puede incorporar una molécula directora, entendiendo por molécula directora cualquier molécula que favorezca la internalización por endocitosis en las células diana. La molécula directora puede estar seleccionada entre una molécula sintética, semi-sintética, natural y combinaciones de las mismas. La molécula directora según la presente invención puede estar seleccionada entre proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas y análogos hormonales, vitaminas, co-factores enzimáticos y metabolitos de la síntesis de proteínas, un derivado de estos que incorpore un ligando orgánico que facilite la unión covalente a la cubierta inorgánica y combinaciones de los mismos.
La presente invención también se refiere a un método de preparación del agente de contraste definido anteriormente. Este método puede comprender, al menos, poner en contacto una suspensión acuosa de nanopartículas del derivado del azul de Prusia (AP) con una solución de al menos un compuesto de silicio seleccionado de manera preferente entre un alcóxido de silicio, un alquilsilano, silicato sódico y sílice coloidal y combinaciones de los mismos, en presencia de al menos una amina seleccionada de manera preferente entre amina primaria, secundaria, terciaria y combinaciones de las mismas y su peso molecular es inferior a 1000 Da, manteniendo preferentemente el pH entre 7 y 8, y agitando para permitir el crecimiento de la pared inorgánica que envuelve el núcleo órgano-metálico. Dicho método puede comprender, además, una etapa de lavado y liofilización del material híbrido obtenido. De forma adicional, según una realización particular, la formación de la cubierta inorgánica puede llevarse a cabo en presencia de un surfactante orgánico, que se puede añadir a la mezcla, y que posteriormente será eliminado, preferentemente mediante extracción con alcoholes. Este surfactante orgánico puede ser de manera preferente un compuesto catiónico, aniónico o neutro, con una relación surfactante:Si02 comprendida preferentemente entre 0,005 y 0,65 molar, más preferentemente entre 0,01 y 0,5 molar. Como se ha comentado, dicho surfactante puede ser eliminado tras la obtención de las partículas del material híbrido, mediante extracción a reflujo con alcoholes de cadena corta.
Según otra realización particular, el método de preparación del agente de contraste puede comprender, además, el uso de un co-solvente orgánico, añadiendo este a la mezcla, con una relación preferente co-solvente:agua en volumen comprendida entre 1 :1 y 10:1 , más preferentemente entre 2:1 y 4:1 . Según esta realización, dicho co- solvente puede ser de manera preferente un alcohol de cadena alifática con un número de carbonos comprendido entre 1 y 6.
La presente invención se refiere también al uso del agente de contraste definido anteriormente y obtenido por el método descrito arriba para resonancia magnética (MRI), concretamente para mejorar la resolución de las imágenes de MRI, comprendiendo dicho uso la administración a humanos y animales ya sea por vía oral, parenteral, respiratoria o transdérmica en concentración suficiente para alcanzar de forma no selectiva los tejidos patológicos. La elevada estabilidad del agente de contraste en medio biológico y el incremento del tiempo de residencia plasmática respecto de los compuestos solubles de Gd3+, así como los procesos de angiogénesis y destrucción parcial del endotelio vascular asociados a las lesiones internas, favorece la extravasación de las nanopartículas del agente de contraste (efecto EPR), permitiendo su acumulación de en la matriz extracelular. Alternativamente el agente de contraste definido anteriormente puede ser administrado al huésped mediante inyección directa en la zona lesionada, acumulándose en el tejido intersticial.
El agente de contraste descrito en la presente invención puede ser utilizado con campo magnético de fuerza variable entre 0,5 y 1 1 ,0 T, preferiblemente entre 1 ,2 y 9,4 T.
La dosis del agente de contraste de la presente invención dependerá del huésped, el tejido y/o células objeto de estudio y la vía de administración. De una forma general, la dosis varía entre 0,001 y 0,1 mmol/Kg.
La vida media en sangre del agente de contraste de la presente invención es suficiente para poder obtener imágenes de MRI en los diferentes huéspedes, estando dicha vida media en el rango de 0,5 a 6 h, preferiblemente entre 1 y 6 h. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
Breve descripción de las figuras Figura 1 muestra los difractogramas de rayos X del material Gd[Fe(CN)6] preparado según el Ejemplo 1 (A) y el Ejemplo 3 (C), y del agente de contraste de la presente invención preparado según el Ejemplo 2 (B) y el Ejemplo 4 (D).
Figura 2 muestra los espectros de infrarrojo del material Gd[Fe(CN)6] preparado según el Ejemplo 1 (A) y el y del agente de contraste de la presente invención preparado según el Ejemplo 2 (B).
Figura 3 es una ilustración esquemática del proceso de preparación de nanopartículas del agente de contraste de la presente invención.
Figura 4 muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión de nanopartículas del agente de contraste de la presente invención preparadas según el Ejemplo 2, mostrando la morfología general (A) y el recubrimiento de sílice depositado sobre la superficie del material Gd[Fe(CN)6] (B).
Figura 5 muestra la evolución de la velocidad de relajación longitudinal (1/ΤΊ) y transversal (1/T2) respecto de la concentración del agente de contraste de la presente invención preparado según el Ejemplo 2, así como los valores calculados de relajatividad longitudinal (n) y transversal (r2). Figura 6 muestra la evolución de la velocidad de relajación longitudinal (1/ΤΊ) y transversal (1/T2) respecto de la concentración del agente de contraste de la presente invención preparado según el Ejemplo 4, así como los valores calculados de relajatividad longitudinal (n) y transversal (r2). La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que no pretenden ser limitantes de la misma.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1. Preparación de nanopartículas del material Gd[Fe(CN)6] de diámetro medio comprendido entre 100 y 400 nm (modificado de J. Phys. Chem. C 2009, 113, 21531 -21537; Yamada, M; Yonekura, S.)- En un balón de 500 mi conectado a la línea de N2 se introduce 3,30 g (10 mmol) de K3[Fe(CN)6] y 6,30 g (30 mmol) de bromuro de tetraetil amonio (Et4NBr), y se disuelven con agitación en 200 mi de metanol a 30°C durante 3 días bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla se filtra (0,45 m), y el filtrado se concentra hasta unos 10 mi en un rotavapor. La disolución resultante se agita con 100 mi de éter etílico y se filtra el precipitado amarillo obtenido. El producto crudo se disuelve en 100 mi de acetonitrilo a reflujo; a continuación se deja enfriar la disolución para cristalizar el polvo purificado de (Et4N)3[Fe(CN)6]. En un balón de 250 mi se disuelven 1 1 ,75 g de CH3COOH (225 mmol) y Gd(N03)3-5H20 (1 ,08 g, 2,50 mmol) en 50 mi de una mezcla H20:etanol (2:5 v/v). Luego se añade una disolución de (Et4N)3[Fe(CN)6] (1 ,50 g, 2,50 mmol) en 15 mi de metanol. La mezcla se mantiene a 25°C un día completo en reposo. El precipitado se filtra y se lava con etanol, y se seca a vacío para obtener un polvo naranja de Gd[Fe(CN)6], constituido por cristales en forma de aspa y de varilla de diámetro medio comprendido entre 100 y 400 nm. En la Figura 1A se muestra el difractograma de rayos X del material.
EJEMPLO 2. Preparación de un agente de contraste de resonancia magnética basado en nanopartículas de un material híbrido compuesto de un núcleo de Gd[Fe(CN)6] preparado según el Ejemplo 1 y una cubierta de sílice. Se dispersa 3,80 g del material Gd[Fe(CN)6] preparado según el Ejemplo 1 en 1900 mi de una mezcla hidroalcohólica H20:etanol (2:5 v/v) y se añade 3,6 mi (0,019 mol) de cianopropil trimetoxisilano con agitación magnética vigorosa. Después de 30 minutos, se introduce 9.5 mi (0,064 mol) de tetrametil ortosilicato (TMOS) y, a continuación, se adiciona 0,38 mi (0,003 mol) de trietilamina. La dispersión resultante se mantiene en agitación durante 24h, lo que permite el crecimiento de una pared de sílice no porosa amorfa sobre la superficie de los cristales del material Gd[Fe(CN)6]. A las 24 h y a las 48 h se llevan a cabo sucesivas adiciones de TMOS (9,5 mi, 0,064 mol) manteniendo la agitación. Finamente, la suspensión se centrifuga (500 g, 2 h), se lava tres veces con una mezcla hidroalcohólica H20:etanol (2:5 v/v) (2000 g, 20 min). El sedimento se liofiliza a -55°C durante 16 h. Se obtiene un polvo de color naranja, constituido por partículas de Gd[Fe(CN)6]@Si02 de diámetro medio comprendido entre 100-400 nm. En la Figura 1 B se muestra el difractograma de rayos X del material, y en la Figura 4 se muestran imágenes de microscopía electrónica de transmisión de las partículas. EJEMPLO 3. Preparación de nanopartículas del material Gd[Fe(CN)6] de diámetro medio comprendido entre 20 y 200 nm (modificado de J. Phys. Chem. C 2009, 113, 21531 -21537; Yamada, M; Yonekura, S.)-
En un balón de 500 mi conectado a la línea de N2 se introduce 3,30 g (10 mmol) de K3[Fe(CN)6] y 6,30 g (30 mmol) de bromuro de tetraetil amonio (Et4NBr), y se disuelven con agitación en 200 mi de metanol a 30°C durante 3 días bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla se filtra (0,45 m), y el filtrado se concentra hasta unos 10 mi en un rotavapor. La disolución resultante se agita con 100 mi de éter etílico y se filtra el precipitado amarillo obtenido. El producto crudo se disuelve en 100 mi de acetonitrilo a reflujo; a continuación se deja enfriar la disolución para cristalizar el polvo purificado de (Et4N)3[Fe(CN)6]. En un balón de 250 mi se disuelve Gd(N03)3-5H20 (1 ,08 g, 2,50 mmol) en 50 mi de una mezcla H20:etanol (2:5 v/v). Luego se añade una disolución de (EtN)3[Fe(CN)6] (1 ,50 g, 2,50 mmol) en 15 mi de metanol. La mezcla se mantiene a 25°C un día completo en reposo. El precipitado se filtra y se lava con etanol, y se seca a vacío para obtener un polvo naranja de Gd[Fe(CN)6], constituido por cristales en forma de varilla de diámetro medio comprendido entre 20 y 200 nm. En la Figura 1 C se muestra el difractograma de rayos X del material.
EJEMPLO 4. Preparación de un agente de contraste de resonancia magnética basado en nanopartículas de un material híbrido compuesto de un núcleo de Gd[Fe(CN)6] preparado según el Ejemplo 3 y una cubierta de sílice.
Se dispersa 3,80 g del material Gd[Fe(CN)6] preparado según el Ejemplo 3 en 1900 mi de una mezcla hidroalcohólica H20:etanol (2:5 v/v) y se añade 3,6 mi (0,019 mol) de cianopropil trimetoxisilano con agitación magnética vigorosa. Después de 30 minutos, se introduce 9.5 mi (0,064 mol) de tetrametil ortosilicato (TMOS) y, a continuación, se adiciona 0,38 mi (0,003 mol) de trietilamina. La dispersión resultante se mantiene en agitación durante 24h, lo que permite el crecimiento de una pared de sílice no porosa amorfa sobre la superficie de los cristales del material Gd[Fe(CN)6]. A las 24 h y a las 48 h se llevan a cabo sucesivas adiciones de TMOS (9,5 mi, 0,064 mol) manteniendo la agitación. Finamente, la suspensión se centrifuga (500 g, 2 h), se lava tres veces con una mezcla hidroalcohólica H20:etanol (2:5 v/v) (2000 g, 20 min). El sedimento se liofiliza a -55°C durante 16 h. Se obtiene un polvo de color naranja, constituido por partículas de Gd[Fe(CN)6]@Si02 de diámetro medio comprendido entre 20-200 nm. En la Figura 1 D se muestra el difractograma de rayos X del material.
EJEMPLO 5. Medida de la relajatividad longitudinal (n) y transversal (r2) respecto de la concentración del agente de contraste preparado en el Ejemplo 2. Se preparan suspensiones estables del agente de contraste Gd[Fe(CN)6]@Si02 obtenido según el procedimiento descrito el Ejemplo 2, variando la concentración de Gd3+ de 0,1 a 2,0 mM, y se miden la relajación de los protones T-i y T2 en un equipo de RMN de 400 MHz (9,4 T). Los resultados obtenidos expresados como relajatividad normalizada frente a la concentración se presentan en la Figura 5. Los valores obtenidos de r-ι y r2 se indican igualmente en la Tabla 1 .
EJEMPLO 6. Medida de la relajatividad longitudinal (n) y transversal (r2) respecto de la concentración del agente de contraste preparado en el Ejemplo 4. Se preparan suspensiones estables del agente de contraste Gd[Fe(CN)6]@Si02 obtenido según el procedimiento descrito el Ejemplo 4, variando la concentración de Gd3+ de 0,1 a 2,0 mM, y se mide la relajación de los protones T-i y T2 en un equipo de RMN de 400 MHz (9,4 T). Los resultados obtenidos expresados como relajatividad normalizada frente a la concentración se presentan en la Figura 6. Los valores obtenidos de r-ι y r2 se indican igualmente en la Tabla 1 .
Tabla 1. Valores de relajatividad longitudinal y transversal medidos a 9,4 T para agentes de contraste preparados según los procedimientos descritos en la presente invención. Ejemplo Composición Tamaño Partícula n r2
Figure imgf000015_0001
2 Gd[Fe(CN)6]@Si02 100-400 1 1 ,7 58,6
2 Gd[Fe(CN)6]@Si02 20-200 13,2 66,6

Claims

REIVINDICACIONES
1. Agente de contraste de resonancia magnética caracterizado porque está basado en un material híbrido que comprende, al menos:
- Un núcleo órgano-metálico de tamaño nanométrico derivado del azul de Prusia, de fórmula genérica
AxMm[M'(CN)6]n
donde
A es Li, Na, K, Rb, Cs, Fr, TI, NR4 siendo R=H o cualquier radical alquilo de estequiometria CaH2a+2, o combinaciones de los mismos;
M es Cr, Mn, Fe, Co, Ru, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, o combinaciones de los mismos;
M' es Cr, Mn, Fe, Co, Ru o combinaciones de los mismos;
x=0-2,
m=1-4,
n=1 -3, y
- Una cubierta de sílice que recubre homogéneamente las nanopartículas del núcleo.
2. Agente de contraste según la reivindicación 1 , caracterizado porque la cubierta de sílice es una cubierta no estructurada y no porosa.
3. Agente de contraste según la reivindicación 1 , caracterizado porque la cubierta de sílice es una cubierta no estructurada y porosa, con diámetro de poro comprendido entre 1 y 100 nm.
4. Agente de contraste según la reivindicación 3, caracterizado porque la cubierta de sílice es una cubierta estructurada y porosa, con diámetro de poro comprendido entre 1 y 30 nm.
5. Agente de contraste según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque presenta valores de relajatividad longitudinal (π) entre 5,0 y 50,0 mM"1 s"1, y valores de relajatividad transversal (r2) entre 10 y 300 mM"1 s"1 , en un campo magnético de fuerza entre 0,5 y 1 1 ,0 T.
6. Agente de contraste según la reivindicación 5, caracterizado porque presenta valores de relajatividad longitudinal (r-ι ) entre 5,0 y 30,0 mM"1 s'
7. Agente de contraste según la reivindicación 5, caracterizado porque presenta valores de relajatividad transversal (r2) entre 10 y 200 mM"1 s'
8. Agente de contraste según la reivindicación 5, caracterizado porque el campo magnético es un campo magnético de fuerza entre 1 ,2 y 9,4 T.
9. Agente de contraste según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque sus partículas presentan forma seleccionada entre esférica, varilla, aspa o estrellada y combinaciones de las mismas.
10. Agente de contraste según la reivindicación 9, caracterizado porque las partículas presentan forma de aspa o varilla.
1 1 . Agente de contraste según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las partículas presentan un diámetro medio comprendido entre 10 y 3000 nm.
12. Agente de contraste según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque las partículas presentan un diámetro medio comprendido entre 20 y 1000 nm.
13. Agente de contraste según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cubierta de sílice tiene un espesor entre 1 y 100 nm.
14. Agente de contraste según la reivindicación 13, caracterizado porque la cubierta de sílice tiene un espesor entre 5 y 50 nm.
15. Agente de contraste según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cubierta de sílice comprende, además, una molécula seleccionada entre un poli(etilenglicol), un agente fluorescente, un radionúcleo, una molécula directora y combinaciones de los mismos.
16. Agente de contraste según la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula es un poli(etilenglicol) unido por enlace covalente de peso molecular seleccionado entre 200 y 20.000 Da y una concentración en peso entre el 1 y el 30%.
17. Agente de contraste según la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula es un agente fluorescente unido por enlace covalente seleccionado entre 5-amino fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, NHS-fluoresceina, rodamina B isotiocianato, tetrametilrodamina B isotiocianato, NHS-Cy5 y/o NHS-Cy5.5 o un derivado de estos que incorpore un ligando orgánico que facilite la unión covalente con la cubierta inorgánica y combinaciones de los mismos.
18. Agente de contraste según la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula es un radionúcleo de 18F.
19. Agente de contraste según la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula es una molécula directora seleccionada entre molécula sintética, semi-sintética, natural y combinaciones de las mismas.
20. Agente de contraste según la reivindicación 19, caracterizado porque la molécula directora está seleccionada entre proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas y análogos hormonales, vitaminas, co-factores enzimáticos y metabolitos de la síntesis de proteínas, o un derivado de estos que incorpore un ligando orgánico que facilite la unión covalente a la cubierta inorgánica, y combinaciones de los mismos.
21 . Método de preparación del agente de contraste descrito según las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque comprende, al menos, poner en contacto una suspensión acuosa de nanopartículas del derivado del azul de Prusia con una solución de al menos un compuesto de silicio en presencia de al menos una amina, manteniendo el pH entre 7 y 8 y agitando.
22. Método de preparación del agente de contraste según la reivindicación 21 , caracterizado porque comprende, además, lavar y liofilizar el material híbrido obtenido.
23. Método de preparación del agente de contraste según las reivindicaciones 21 y 22, caracterizado porque comprende, además, añadir un surfactante orgánico a la mezcla.
24. Método de preparación del agente de contraste según la reivindicación 21 , caracterizado porque el compuesto de silicio está seleccionado entre un alcóxido de silicio, un alquilsilano, silicato sódico, sílice coloidal y combinaciones de los mismos.
25. Método de preparación del agente de contraste según la reivindicación 21 , caracterizado porque la amina está seleccionada entre amina primaria, secundaria, terciaria y combinaciones de las mismas y su peso molecular es inferior a 1000 Da.
26. Método de preparación del agente de contraste según la reivindicación 21 , caracterizado porque comprende, además, añadir un co-solvente orgánico a la mezcla, con una relación co-solvente:agua en volumen comprendida entre 1 :1 y 10:1.
27. Método de preparación del agente de contraste según la reivindicación 21 , caracterizado porque comprende, además, añadir un surfactante orgánico a la mezcla con una relación surfactante:Si02 comprendida entre 0,005 y 0,65 molar.
28. Uso del agente de contraste descrito en las reivindicaciones 1 -20 y obtenido según el método descrito en las reivindicaciones 21 a 27 para resonancia magnética.
29. Uso del agente de contraste según la reivindicación 28, caracterizado porque la fuerza de campo magnético variable está entre 0,5 y 1 1 ,0 T.
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