WO2015178428A1 - Bactericide dependent on host foreign material elimination response - Google Patents
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Abstract
The problem addressed by the present invention is to provide a novel bactericide using an oxidative stress-dependent foreign material elimination response by causing the collapse of SodB-dependent antioxidative activity in gram-negative pathogenic bacteria such as Helicobacter pylori. The present invention provides a bactericide dependent on a host foreign material elimination response in response to a gram-negative pathogenic bacteria such as Helicobacter pylori and resulting from a FecA1-compatible compound selected from nordihydroguaiaretic acid, secoisolariciresinol, 2,3,4,4'-tetrahydroxydiphenylmethane, terameprocol, phyllanthine, and the like.
Description
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年５月２２日に出願された、日本国特許出願第２０１４－１０６１９２号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。 [Cross-reference of related applications]
This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2014-106192 filed on May 22, 2014, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.
本出願は、２０１４年５月２２日に出願された、日本国特許出願第２０１４－１０６１９２号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。 [Cross-reference of related applications]
This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2014-106192 filed on May 22, 2014, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.
本発明はヘリコバクターピロリをはじめとするグラム陰性病原細菌に対する宿主異物排除応答依存的除菌剤に関する。
The present invention relates to a host foreign body exclusion response-dependent disinfectant against Gram-negative pathogenic bacteria such as Helicobacter pylori.
ヘリコバクターピロリ(H. pylori)の除菌療法に限らず、現行の細菌感染症に用いられる抗菌薬は、種々の細菌を広く標的化した薬剤であり、病原細菌を特異的に標的化した薬剤ではない。従って、抗生剤投与によって、腸内細菌叢も影響を受け、その結果、腸内細菌叢の破綻が誘導され、下痢や腸炎が誘発される。現行のH. pyloriの一次、二次除菌療法の実施により、30%程度の患者で、腸内フローラへの影響から、下痢症状が認められる。
Antibacterial drugs used for current bacterial infections are not limited to Helicobacter pylori (H. pylori) eradication therapy, and are drugs that target a wide range of bacteria. Absent. Therefore, administration of antibiotics also affects the intestinal microflora, and as a result, the breakdown of the intestinal microflora is induced and diarrhea and enteritis are induced. Due to the current primary and secondary eradication therapy of H. pylori, about 30% of patients have diarrhea symptoms due to the effects on intestinal flora.
また、プロトンポンプ阻害薬 (PPI) と抗生物質2剤を組み合わせたH. pyloriの現行の3剤除菌療法の除菌成功率は、一次除菌療法で65%であり、成功率は低下傾向にある。また、一次除菌療法失敗症例に対するメトロニダゾールを用いた二次除菌療法の成功率は85%となっており、保険治療によりH. pyloriの除菌が成功しない症例が5%程度存在する。
In addition, the success rate of H. 成功 pylori's current three-drug sterilization therapy combining proton pump inhibitor (PPI) 2 and two antibiotics is 65% in the first eradication therapy, and the success rate is declining It is in. In addition, the success rate of secondary sterilization therapy using metronidazole for patients who failed primary sterilization therapy is 85%, and there are about 5% of cases where sterilization of H. pylori is not successful by insurance treatment.
一方、FecA1はH. pyloriの鉄トランスポーターの一種で、ホモログタンパク質としてグラム陰性細菌間で保存されている蛋白質である。これまでに発明者らは、fecA1遺伝子欠損H. pyloriはスナネズミへの感染・定着能が低下することを明らかとした。その機序は、fecA1遺伝子欠損株では、H. pyloriの抗酸化分子である鉄イオン共役型superoxid dismutase(SodB)活性が有意に低下するため、宿主の酸化ストレス依存的異物排除応答抵抗性が失われるためであると考えられる。
On the other hand, FecA1 is a kind of iron transporter of H. pylori, and is a protein conserved among gram-negative bacteria as a homologous protein. To date, the inventors have clarified that the fecA1 gene-deficient H. pylori has a reduced ability to infect and establish gerbils. The mechanism is that in the fecA1 gene-deficient strain, the iron ion-coupled superoxid dismutase (SodB) activity, which is an antioxidant molecule of H. pylori, is significantly reduced, and thus the host's resistance to oxidative stress-dependent foreign body exclusion response is lost. It is thought that it is to be.
また、H. pyloriの二次除菌療法で用いられるメトロニダゾールは、プロドラックであり、菌体内で還元活性化されsuperoxideを発生することで抗菌活性を発揮する。そのため、SodB強発現誘導させたH. pylori菌株はメトロニダゾール耐性を示す。実際に、臨床分離されたメトロニダゾール耐性菌株の中には、SodBの強発現株（KS0145, KS0048）が存在し、これら菌株に対してfecA1遺伝子を欠損させることで、SodB活性は有意に低下し、メトロニダゾール感受性も亢進する。
Also, metronidazole used in the secondary sterilization therapy of H. pylori is a prodrug and exhibits antibacterial activity by reducing and activating superoxide. Therefore, the H. pylori strain induced to induce strong SodB expression is resistant to metronidazole. Actually, among the clinically isolated metronidazole resistant strains, there are strong SodB expression strains (KS0145, KS0048), and by deleting the fecA1 gene from these strains, SodB activity is significantly reduced, Metronidazole sensitivity is also increased.
本発明は、H. pyloriをはじめとするグラム陰性病原細菌のSodB依存的抗酸化活性を破綻させ、宿主の酸化ストレス依存的異物排除応答を利用した新規な除菌剤を提供することを課題とする。
An object of the present invention is to provide a novel disinfectant that disrupts the SodB-dependent antioxidant activity of Gram-negative pathogenic bacteria such as H. pylori and utilizes the host's oxidative stress-dependent foreign body exclusion response. To do.
本発明者らは上記課題を達成すべく鋭意研究を進めた結果、FecA1親和性化合物がH. pyloriをはじめとするグラム陰性病原細菌のSodB依存的抗酸化活性を破綻させ、宿主の酸化ストレス依存的異物排除応答により、H. pyloriをはじめとするグラム陰性病原細菌の除菌を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
As a result of diligent research to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have confirmed that the FecA1-affinity compound disrupts the SodB-dependent antioxidant activity of Gram-negative pathogenic bacteria such as H. pylori and depends on the host oxidative stress. It has been found that sterilization of Gram-negative pathogenic bacteria such as H. pylori can be achieved by an objective foreign body exclusion response, and the present invention has been completed.
即ち、本発明は、以下を提供するものである。
That is, the present invention provides the following.
（１）鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩を含む宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤。
(1) A sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria dependent on the host foreign body exclusion response, comprising a compound that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1 or a salt thereof.
（２）下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含む宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤：
(2) A sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria dependent on the host foreign body exclusion response, comprising a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof:
[式中、Ａは、置換されていてもよい炭素数１～５の直鎖状アルキレン基を示す。
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。 [Wherein, A represents an optionally substituted linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ].
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。 [Wherein, A represents an optionally substituted linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ].
（３）グラム陰性病原細菌がヘリコバクターピロリ、サルモネラ菌及び腸管病原性大腸菌からなる群より選択される少なくとも一種である、（１）又は（２）に記載の除菌剤。
(3) The disinfectant according to (1) or (2), wherein the Gram-negative pathogenic bacterium is at least one selected from the group consisting of Helicobacter pylori, Salmonella and enteropathogenic E. coli.
（４）前記化合物又はその塩がノルジヒドログアイヤレチン酸（Nordihydroguaiaretic acid）である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の除菌剤。
(4) The disinfectant according to any one of (1) to (3), wherein the compound or a salt thereof is nordihydroguaiaretic acid.
（５）前記化合物又はその塩がセコイソラリシレシノール（Secoisolariciresinol）である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の除菌剤。
(5) The disinfectant according to any one of (1) to (3), wherein the compound or a salt thereof is Secoisolariciresinol.
（６）前記化合物又はその塩が2,3,4,4'-テトラヒドロキシジフェニルメタン（2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane）である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の除菌剤。
(6) In any one of (1) to (3), the compound or a salt thereof is 2,3,4,4′-tetrahydroxydiphenylmethane (2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane) The disinfectant as described.
（７）前記化合物又はその塩がテラメプロコール（Terameprocol）である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の除菌剤。
(7) The disinfectant according to any one of (1) to (3), wherein the compound or a salt thereof is terameprocol.
（８）前記化合物又はその塩がフィランチン（Phyllanthin）である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の除菌剤。
（９）患者に鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩を投与する工程を含む、グラム陰性病原細菌を除菌する方法。
（１０）患者に、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を投与する工程を含む、グラム陰性病原細菌を除菌する方法：
[式中、Ａは、置換されていてもよい炭素数１～５の直鎖状アルキレン基を示す。
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。
（１１）グラム陰性病原細菌を除菌するための鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩。
（１２）グラム陰性病原細菌を除菌するための、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩：
[式中、Ａは、置換されていてもよい炭素数１～５の直鎖状アルキレン基を示す。
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。
（１３）グラム陰性病原細菌用除菌剤を製造するための、鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩の使用。
（１４）グラム陰性病原細菌用除菌剤を製造するための、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の使用：
[式中、Ａは、置換されていてもよい炭素数１～５の直鎖状アルキレン基を示す。
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
（１５）グラム陰性病原細菌がヘリコバクターピロリ、サルモネラ菌及び腸管病原性大腸菌からなる群より選択される少なくとも一種である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、又は（１３）もしくは（１４）に記載の使用。
（１６）前記化合物又はその塩がノルジヒドログアイヤレチン酸又はその塩である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。
（１７）前記化合物又はその塩がセコイソラリシレシノール又はその塩である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。
（１８）前記化合物又はその塩が、2,3,4,4'-テトラヒドロキシジフェニルメタン又はその塩である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。
（１９） 前記化合物又はその塩がテラメプロコール又はその塩である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。
（２０）前記化合物又はその塩がフィランチンである、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。 (8) The disinfectant according to any one of (1) to (3), wherein the compound or a salt thereof is phyllanthin.
(9) A method for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria, comprising a step of administering to a patient a compound or a salt thereof that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1.
(10) A method for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria comprising the step of administering a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof to a patient:
[Wherein, A represents an optionally substituted linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ].
(11) A compound or a salt thereof that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1 for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria.
(12) A compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria:
[Wherein, A represents an optionally substituted linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ].
(13) Use of a compound or a salt thereof that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1 for producing a disinfectant for Gram-negative pathogenic bacteria.
(14) Use of a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof for producing a disinfectant for Gram-negative pathogenic bacteria:
[Wherein, A represents an optionally substituted linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
(15) The method according to (9) or (10), wherein the Gram-negative pathogenic bacterium is at least one selected from the group consisting of Helicobacter pylori, Salmonella and enteropathogenic E. coli, (11) or (12) Or a salt thereof, or use according to (13) or (14).
(16) The method according to (9) or (10), the compound or salt thereof according to (11) or (12), wherein the compound or salt thereof is nordihydroguaiaretinic acid or a salt thereof; ) Or (14), or the method, compound or salt or use thereof according to (15).
(17) The method according to (9) or (10), wherein the compound or a salt thereof is secoisolariciresinol or a salt thereof, the compound or a salt thereof according to (11) or (12), (13) Alternatively, the use according to (14), or the method, compound or salt or use according to (15).
(18) The method according to (9) or (10), wherein the compound or salt thereof is 2,3,4,4′-tetrahydroxydiphenylmethane or a salt thereof, or (11) or (12) The compound or a salt thereof, the use according to (13) or (14), or the method, the compound or a salt or use thereof according to (15).
(19) The method according to (9) or (10), wherein the compound or a salt thereof is terameprocol or a salt thereof, the compound or a salt thereof according to (11) or (12), (13) or ( The use according to 14), or the method, compound or salt or use according to (15).
(20) The method according to (9) or (10), the compound or salt thereof according to (11) or (12), or the salt thereof according to (13) or (14), wherein the compound or salt thereof is filantin. Use, or the method, compound or salt or use according to (15).
（９）患者に鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩を投与する工程を含む、グラム陰性病原細菌を除菌する方法。
（１０）患者に、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を投与する工程を含む、グラム陰性病原細菌を除菌する方法：
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。
（１１）グラム陰性病原細菌を除菌するための鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩。
（１２）グラム陰性病原細菌を除菌するための、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩：
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。
（１３）グラム陰性病原細菌用除菌剤を製造するための、鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩の使用。
（１４）グラム陰性病原細菌用除菌剤を製造するための、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の使用：
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
（１５）グラム陰性病原細菌がヘリコバクターピロリ、サルモネラ菌及び腸管病原性大腸菌からなる群より選択される少なくとも一種である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、又は（１３）もしくは（１４）に記載の使用。
（１６）前記化合物又はその塩がノルジヒドログアイヤレチン酸又はその塩である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。
（１７）前記化合物又はその塩がセコイソラリシレシノール又はその塩である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。
（１８）前記化合物又はその塩が、2,3,4,4'-テトラヒドロキシジフェニルメタン又はその塩である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。
（１９） 前記化合物又はその塩がテラメプロコール又はその塩である、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。
（２０）前記化合物又はその塩がフィランチンである、（９）もしくは（１０）に記載の方法、（１１）もしくは（１２）に記載の化合物又はその塩、（１３）もしくは（１４）に記載の使用、又は（１５）に記載の方法、化合物又はその塩もしくは使用。 (8) The disinfectant according to any one of (1) to (3), wherein the compound or a salt thereof is phyllanthin.
(9) A method for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria, comprising a step of administering to a patient a compound or a salt thereof that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1.
(10) A method for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria comprising the step of administering a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof to a patient:
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ].
(11) A compound or a salt thereof that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1 for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria.
(12) A compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria:
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ].
(13) Use of a compound or a salt thereof that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1 for producing a disinfectant for Gram-negative pathogenic bacteria.
(14) Use of a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof for producing a disinfectant for Gram-negative pathogenic bacteria:
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
(15) The method according to (9) or (10), wherein the Gram-negative pathogenic bacterium is at least one selected from the group consisting of Helicobacter pylori, Salmonella and enteropathogenic E. coli, (11) or (12) Or a salt thereof, or use according to (13) or (14).
(16) The method according to (9) or (10), the compound or salt thereof according to (11) or (12), wherein the compound or salt thereof is nordihydroguaiaretinic acid or a salt thereof; ) Or (14), or the method, compound or salt or use thereof according to (15).
(17) The method according to (9) or (10), wherein the compound or a salt thereof is secoisolariciresinol or a salt thereof, the compound or a salt thereof according to (11) or (12), (13) Alternatively, the use according to (14), or the method, compound or salt or use according to (15).
(18) The method according to (9) or (10), wherein the compound or salt thereof is 2,3,4,4′-tetrahydroxydiphenylmethane or a salt thereof, or (11) or (12) The compound or a salt thereof, the use according to (13) or (14), or the method, the compound or a salt or use thereof according to (15).
(19) The method according to (9) or (10), wherein the compound or a salt thereof is terameprocol or a salt thereof, the compound or a salt thereof according to (11) or (12), (13) or ( The use according to 14), or the method, compound or salt or use according to (15).
(20) The method according to (9) or (10), the compound or salt thereof according to (11) or (12), or the salt thereof according to (13) or (14), wherein the compound or salt thereof is filantin. Use, or the method, compound or salt or use according to (15).
本発明によれば、H. pyloriをはじめとするグラム陰性病原細菌のSodB依存的抗酸化活性を破綻させ、宿主の酸化ストレス依存的異物排除応答を利用した新規な除菌剤を提供することができる。
According to the present invention, it is possible to provide a novel disinfectant that disrupts the SodB-dependent antioxidant activity of Gram-negative pathogenic bacteria such as H. pylori and uses the host's oxidative stress-dependent foreign body exclusion response. it can.
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to examples. The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
本発明はFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩を含む宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤を提供する。
The present invention provides a sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria dependent on the host foreign body exclusion response, comprising a compound that specifically binds to FecA1 or a salt thereof.
本発明において除菌剤とは、所定の細菌の増殖を抑えるための薬剤を意味し、抗菌剤と換言することもできる。グラム陰性病原細菌としては、サルモネラ菌、腸管病原性大腸菌、ヘリコバクターピロリ等が挙げられ、好ましくはヘリコバクターピロリ等が挙げられる。
In the present invention, the disinfectant means a drug for suppressing the growth of a predetermined bacterium, and can also be called an antibacterial agent. Examples of Gram-negative pathogenic bacteria include Salmonella, enteropathogenic Escherichia coli, Helicobacter pylori and the like, and preferably Helicobacter pylori and the like.
本発明における宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤の有効成分である化合物は、FecA1の活性を阻害することによりグラム陰性病原細菌のSodB依存的抗酸化活性を破綻させる。その結果、宿主の酸化ストレス依存的異物排除応答等により標的となるグラム陰性病原細を除菌することができる。従って、本発明において、宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤とは、標的となるグラム陰性病原細菌の抗酸化活性を低下させることにより、宿主由来の酸化ストレス依存的異物排除応答等により標的となるグラム陰性病原細を除菌するような除菌剤を意味する。従って、本発明において、宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤とは、グラム陰性病原細菌の抗酸化活性低下型除菌剤、グラム陰性病原細菌の抗酸化活性低下剤と示すこともできる。従って、本発明の宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤は、その有効成分自体が単独で除菌作用を有さなくてもよい。
The compound which is an active ingredient of the sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria dependent on the foreign body exclusion response in the present invention disrupts the SodB-dependent antioxidant activity of Gram-negative pathogenic bacteria by inhibiting the activity of FecA1. As a result, the target Gram-negative pathogen can be sterilized by the host's oxidative stress-dependent foreign body exclusion response or the like. Therefore, in the present invention, the sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria dependent on the host foreign body exclusion response refers to the host-derived oxidative stress-dependent foreign body exclusion response by reducing the antioxidant activity of the target Gram-negative pathogenic bacteria. This means a sterilizing agent that sterilizes target Gram-negative pathogens. Therefore, in the present invention, the sterilization agent for Gram-negative pathogenic bacteria dependent on the foreign body exclusion response is referred to as an anti-oxidative activity-decreasing agent for Gram-negative pathogenic bacteria and an anti-oxidant activity reducing agent for Gram-negative pathogenic bacteria. You can also. Therefore, the active ingredient itself of the sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria dependent on the foreign body exclusion response-dependent of the present invention may not have a sterilizing action.
また、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含む宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤を提供する：
In addition, the present invention provides a sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria dependent on the host foreign body exclusion response, which contains a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof:
[式中、Ａは、置換されていてもよい炭素数１～５の直鎖状アルキレン基を示す。
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。
上記化合物がFecA1の活性の阻害作用を有することは本発明者らが初めて見出した新規の知見である。
尚、以下、本明細書において、「FecA1と特異的に結合する化合物」及び「上記一般式（Ｉ）で表わされる化合物」を単に「本発明の有効成分である化合物」と示すこともある。 [Wherein, A represents an optionally substituted linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ].
It is a novel finding that the present inventors have found for the first time that the above compound has an inhibitory action on the activity of FecA1.
Hereinafter, in the present specification, “a compound that specifically binds to FecA1” and “a compound represented by the above general formula (I)” may be simply referred to as “a compound that is an active ingredient of the present invention”.
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。
上記化合物がFecA1の活性の阻害作用を有することは本発明者らが初めて見出した新規の知見である。
尚、以下、本明細書において、「FecA1と特異的に結合する化合物」及び「上記一般式（Ｉ）で表わされる化合物」を単に「本発明の有効成分である化合物」と示すこともある。 [Wherein, A represents an optionally substituted linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ].
It is a novel finding that the present inventors have found for the first time that the above compound has an inhibitory action on the activity of FecA1.
Hereinafter, in the present specification, “a compound that specifically binds to FecA1” and “a compound represented by the above general formula (I)” may be simply referred to as “a compound that is an active ingredient of the present invention”.
前記一般式（Ｉ）において示される各基は、具体的には次の通りである。
The groups shown in the general formula (I) are specifically as follows.
低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、２，２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎ－ヘキシル基等の炭素数１～６（好ましくは１～３、より好ましくは１）の直鎖又は分枝鎖状アルキル基を挙げることができる。
Examples of the lower alkyl group include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, and n-hexyl group. And straight chain or branched alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms (preferably 1 to 3, more preferably 1).
低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、２，２－ジメチルプロポキシ、１－エチルプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ基等の炭素数１～６（好ましくは１～３、より好ましくは１）の直鎖又は分枝鎖状アルコキシ基を挙げることができる。
Examples of the lower alkoxy group include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, 2,2-dimethylpropoxy, 1-ethylpropoxy, n-butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, n-pentyloxy, isopentyloxy, Examples thereof include linear or branched alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms (preferably 1 to 3, more preferably 1) such as an n-hexyloxy group.
低級ヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシ基が１～３個、好ましくは１個置換した、前記に列挙した低級アルキル基等を挙げることができる。
Examples of the lower hydroxyalkyl group include the lower alkyl groups listed above in which 1 to 3, preferably 1 hydroxy group is substituted.
低級アルコキシ低級アルキル基としては、例えば、前記に列挙した１個の低級アルコキシ基で置換した、前記に列挙した低級アルキル基等を挙げることができる。
炭素数１～５の直鎖状アルキレン基等を挙げることができる。 Examples of the lower alkoxy lower alkyl group include the lower alkyl groups listed above substituted with one of the lower alkoxy groups listed above.
Examples thereof include a linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
炭素数１～５の直鎖状アルキレン基等を挙げることができる。 Examples of the lower alkoxy lower alkyl group include the lower alkyl groups listed above substituted with one of the lower alkoxy groups listed above.
Examples thereof include a linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms.
炭素数１～５の直鎖状アルキレン基としては、メチレン、エチレン基（ジメチレン基）、トリメチレン基、テトラメチレン基及びペンタメチレン基が挙げられる。
Examples of the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms include methylene, ethylene group (dimethylene group), trimethylene group, tetramethylene group and pentamethylene group.
本発明においてＡは炭素数１～５（好ましくは１～４）の直鎖状アルキレン基を示し、当該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基は置換されていてもよい。該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、置換基の数は限定されず、例えば、１～４個が好ましく、１～２個がより好ましい。該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。置換基を複数有する場合、それらの置換基は同一であっても、異なっていてもよい。
In the present invention, A represents a linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms (preferably 1 to 4 carbon atoms), and the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms may be substituted. When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the number of substituents is not limited, and is preferably 1 to 4, for example, and more preferably 1 to 2. The substituent is at least one selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. When there are a plurality of substituents, these substituents may be the same or different.
本発明において、Ａで示される「置換されていてもよい炭素数１～５の直鎖状アルキレン基」としては、好ましくは
In the present invention, the “optionally substituted linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms” represented by A is preferably
（これらの式中、Ｒ3は、同一又は異なって、水素原子、水酸基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基又は低級アルコキシ低級アルキル基を示す。）等を挙げることができ、好ましくは
(In these formulas, R 3 may be the same or different and each represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, or a lower alkoxy lower alkyl group). Is
（これらの式中、Ｒ3は、前述の通り。）
等を挙げることができる。 (In these formulas, R 3 is as described above.)
Etc.
等を挙げることができる。 (In these formulas, R 3 is as described above.)
Etc.
また、本発明において、
ｍ、ｎの好ましい組み合わせとしては、
（ｍ，ｎ）＝（１，３）、
（ｍ，ｎ）＝（２，２）
等が挙げられる。
ｍ、ｎの好ましい組み合わせ及びＯＲ1及びＯＲ2の位置としては、
ｍ＝１（例えば、パラ位）、ｎ＝３（例えば、オルト位、メタ位及びパラ位１箇所ずつ置換）
ｍ＝２（例えば、メタ位及びパラ位１箇所ずつ置換）、ｎ＝２（例えば、メタ位及びパラ位１箇所ずつ置換）
等が挙げられる。ここで、オルト位、メタ位及びパラ位とは、置換基－Ａ－が結合している炭素原子に対し、それぞれオルト、メタ及びパラの位置を意味する。 In the present invention,
As a preferable combination of m and n,
(M, n) = (1,3),
(M, n) = (2,2)
Etc.
As preferred combinations of m and n and positions of OR 1 and OR 2 ,
m = 1 (for example, para position), n = 3 (for example, substitution at one position of ortho position, meta position and para position)
m = 2 (for example, one substitution at the meta and para positions), n = 2 (for example, one substitution at the meta and para positions)
Etc. Here, the ortho-position, meta-position and para-position mean the positions of ortho, meta and para, respectively, with respect to the carbon atom to which the substituent —A— is bonded.
ｍ、ｎの好ましい組み合わせとしては、
（ｍ，ｎ）＝（１，３）、
（ｍ，ｎ）＝（２，２）
等が挙げられる。
ｍ、ｎの好ましい組み合わせ及びＯＲ1及びＯＲ2の位置としては、
ｍ＝１（例えば、パラ位）、ｎ＝３（例えば、オルト位、メタ位及びパラ位１箇所ずつ置換）
ｍ＝２（例えば、メタ位及びパラ位１箇所ずつ置換）、ｎ＝２（例えば、メタ位及びパラ位１箇所ずつ置換）
等が挙げられる。ここで、オルト位、メタ位及びパラ位とは、置換基－Ａ－が結合している炭素原子に対し、それぞれオルト、メタ及びパラの位置を意味する。 In the present invention,
As a preferable combination of m and n,
(M, n) = (1,3),
(M, n) = (2,2)
Etc.
As preferred combinations of m and n and positions of OR 1 and OR 2 ,
m = 1 (for example, para position), n = 3 (for example, substitution at one position of ortho position, meta position and para position)
m = 2 (for example, one substitution at the meta and para positions), n = 2 (for example, one substitution at the meta and para positions)
Etc. Here, the ortho-position, meta-position and para-position mean the positions of ortho, meta and para, respectively, with respect to the carbon atom to which the substituent —A— is bonded.
より具体的には、ノルジヒドログアイヤレチン酸（Nordihydroguaiaretic acid）、セコイソラリシレシノール（Secoisolariciresinol）、2,3,4,4'-テトラヒドロキシジフェニルメタン（2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane）、テラメプロコール（Terameprocol）、フィランチン（Phyllanthin）、これらの化合物の塩等が挙げられる。
More specifically, nordihydroguaiaretic acid, secoisolariciresinol, 2,3,4,4'-tetrahydroxydiphenylmethane (2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane) ), Terameprocol, phyllanthin, salts of these compounds, and the like.
本発明の有効成分である化合物の塩は、酸付加塩と塩基との塩を包含する。酸付加塩の具体例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。塩基との塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のような有機塩基との塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。
The salt of a compound that is an active ingredient of the present invention includes a salt of an acid addition salt and a base. Specific examples of acid addition salts include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, perchlorate, phosphate and other inorganic acid salts, oxalate, malonate, succinic acid Salt, maleate, fumarate, lactate, malate, citrate, tartrate, benzoate, trifluoroacetate, acetate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, trifluoromethane Examples include organic acid salts such as sulfonates, and acidic amino acid salts such as glutamates and aspartates. Specific examples of salts with bases include alkali metal or alkaline earth metal salts such as sodium salt, potassium salt or calcium salt, salts with organic bases such as pyridine salt and triethylamine salt, bases such as lysine and arginine. And salts with sexual amino acids.
本発明の有効成分である化合物及びその塩は、水和物又は溶媒和物の形で存在することもあるので、これらの水和物及び溶媒和物もまた本発明の有効成分である化合物に包含される。また、式(Ｉ) の化合物及びそのプロドラッグは、場合により１個以上の不斉炭素原子を有し、また幾何異性を生じることがある。したがって、本発明の有効成分である化合物及びそのプロドラッグは、場合により、数種の立体異性体として存在しうる。これらの立体異性体、それらの混合物及びラセミ体は本発明の有効成分である化合物に包含される。
Since the compound which is an active ingredient of the present invention and a salt thereof may exist in the form of a hydrate or a solvate, these hydrate and solvate are also included in the compound which is an active ingredient of the present invention. Is included. Also, the compounds of formula (I) 及 び and their prodrugs optionally have one or more asymmetric carbon atoms and may cause geometric isomerism. Accordingly, the compound which is an active ingredient of the present invention and its prodrug may optionally exist as several stereoisomers. These stereoisomers, mixtures thereof and racemates are included in the compound which is an active ingredient of the present invention.
溶媒和物を形成する溶媒としては、水、エタノール、プロパノール等のアルコール、酢酸等の有機酸、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、ＤＭＳＯ等が例示される。
Examples of solvents that form solvates include water, alcohols such as ethanol and propanol, organic acids such as acetic acid, esters such as ethyl acetate, ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether, DMSO, and the like.
本発明においては、本発明の有効成分である化合物そのものを除菌剤として用いても、医薬的に許容可能な賦形剤等と組み合わせてとして用いても、薬学的に許容される各種担体（ 賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤等が含まれる）と配合した医薬組成物として用いてもよい。上記医薬組成物は慣用の添加剤を含んでいてよい。
In the present invention, various compounds that are pharmaceutically acceptable (e.g., the compound itself, which is the active ingredient of the present invention) may be used as a disinfectant or in combination with a pharmaceutically acceptable excipient or the like. It may be used as a pharmaceutical composition blended with excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc.). The pharmaceutical composition may contain conventional additives.
また、上記医薬組成物は、抗菌作用を有することが知られている化合物（本明細書において、単に抗菌化合物と示すこともある）をさらに含んでいてもよい。かかる抗菌化合物としてはメトロニダゾール、アモキシシリン、クラリスロマイシン等を挙げることができる。ここでメトロニダゾールは、H. pyloriの二次除菌療法で用いられる、プロドラックであり、菌体内で還元活性化されsuperoxideを発生することで抗菌活性を発揮する。これらの抗菌化合物は１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。本発明の有効成分である化合物は標的とするグラム陰性病原細菌の抗酸化活性を破綻させることができる。従って、メトロニダゾール等のようなsuperoxideを発生することで抗菌活性を発揮する抗菌化合物と組み合わせることにより、当該抗菌化合物の抗菌活性を増強させることができるため非常に有用である。
The pharmaceutical composition may further contain a compound known to have an antibacterial action (sometimes referred to simply as an antibacterial compound in the present specification). Examples of such antibacterial compounds include metronidazole, amoxicillin, clarithromycin and the like. Here, metronidazole is a prodrug used in the secondary sterilization therapy of H. pylori, and exhibits antibacterial activity by being reduced and activated in the cells to generate superoxide. These antibacterial compounds can be used alone or in combination of two or more. The compound which is an active ingredient of the present invention can destroy the antioxidant activity of the target Gram-negative pathogenic bacteria. Therefore, it is very useful because the antibacterial activity of the antibacterial compound can be enhanced by combining with an antibacterial compound that exhibits antibacterial activity by generating superoxide such as metronidazole.
本発明にかかる除菌剤の製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤； 注射剤（静脈注射、筋肉注射）、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤等などの各種製剤形態を挙げることができる。
The formulation form of the disinfectant according to the present invention is not particularly limited. For example, oral administration agents such as tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups, etc .; vaginal injections (intravenous injection, intramuscular injection), infusion Various pharmaceutical forms such as a parenteral agent such as an agent, an external preparation and a suppository can be exemplified.
本発明にかかる除菌剤は哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられ、好ましくはヒト等が挙げられる。
The disinfectant according to the present invention is administered to a patient such as a mammal. Examples of mammals include humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cats, dogs, pigs, cows, horses, sheep, and the like, and preferably humans and the like.
本発明にかかる除菌剤の投与量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、本発明の有効成分である化合物の１日投与量が通常10～5000mg程度、より好ましくは100～1000mg程度になる量とすればよい。１日１回投与する場合は、1製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの3分の１量が含まれていればよい。
The dose of the disinfectant according to the present invention varies depending on the administration route, patient age, body weight, symptoms, etc., and cannot be specified unconditionally, but the daily dose of the compound as the active ingredient of the present invention is usually about 10 to 5000 mg. More preferably, the amount may be about 100 to 1000 mg. When it is administered once a day, it is sufficient that this amount is contained in one preparation, and when it is administered three times a day, it is sufficient that this one-third amount is contained in one preparation.
＜実施例１＞NDGAによるH. pyloriのH2O2感受性試験
（実験方法および結果）
H. pylori ATCC700392株を血液寒天培地にて24時間培養し、菌体を回収後、OD600 nmを0.1に調整し、NDGAを0, 10, 50, 100 μMを含む血液寒天培地へそれぞれ100 μLずつプレーティングした。5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、3日間、37℃、微好気条件下で培養後、阻止円長を測定した。その結果、NDGA含有血液寒天培地で培養した阻止円の大きさがNDGA非含有血液寒天培地で培養した阻止円よりも大きくなり、NDGAは、H. pylori のH2O2感受性を亢進することが示された（図1）。また、NDGAのH. pylori に対するH2O2感受性亢進活性は、NDGA用量依存的に認められた（図2）。 <Example 1> H 2 O 2 sensitivity test of H. pylori by NDGA (Experimental method and results)
H. pylori ATCC700392 strain was cultured on blood agar medium for 24 hours, and the cells were collected, then OD600 The nm was adjusted to 0.1, and 100 μL each was plated on a blood agar medium containing NDGA at 0, 10, 50, and 100 μM. A filter paper supplemented with 10 μL of 5 MH 2 O 2 was placed and cultured for 3 days at 37 ° C. under microaerobic conditions, and then the inhibition circle length was measured. As a result, the size of the inhibition circle cultivated on blood agar medium containing NDGA is larger than the inhibition circle cultured on blood agar medium not containing NDGA, and NDGA may enhance H 2 O 2 sensitivity of H. pylori. (Figure 1). In addition, NDGA's activity to enhance H 2 O 2 sensitivity to H. pylori was observed in an NDGA dose-dependent manner (Fig. 2).
（実験方法および結果）
H. pylori ATCC700392株を血液寒天培地にて24時間培養し、菌体を回収後、OD600 nmを0.1に調整し、NDGAを0, 10, 50, 100 μMを含む血液寒天培地へそれぞれ100 μLずつプレーティングした。5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、3日間、37℃、微好気条件下で培養後、阻止円長を測定した。その結果、NDGA含有血液寒天培地で培養した阻止円の大きさがNDGA非含有血液寒天培地で培養した阻止円よりも大きくなり、NDGAは、H. pylori のH2O2感受性を亢進することが示された（図1）。また、NDGAのH. pylori に対するH2O2感受性亢進活性は、NDGA用量依存的に認められた（図2）。 <Example 1> H 2 O 2 sensitivity test of H. pylori by NDGA (Experimental method and results)
H. pylori ATCC700392 strain was cultured on blood agar medium for 24 hours, and the cells were collected, then OD600 The nm was adjusted to 0.1, and 100 μL each was plated on a blood agar medium containing NDGA at 0, 10, 50, and 100 μM. A filter paper supplemented with 10 μL of 5 MH 2 O 2 was placed and cultured for 3 days at 37 ° C. under microaerobic conditions, and then the inhibition circle length was measured. As a result, the size of the inhibition circle cultivated on blood agar medium containing NDGA is larger than the inhibition circle cultured on blood agar medium not containing NDGA, and NDGA may enhance H 2 O 2 sensitivity of H. pylori. (Figure 1). In addition, NDGA's activity to enhance H 2 O 2 sensitivity to H. pylori was observed in an NDGA dose-dependent manner (Fig. 2).
＜実施例２＞NDGA及びNDGA類縁化合物によるH. pyloriのH2O2感受性試験 （実験方法および結果）
H. pylori ATCC700392株と、H. pylori ATCC700392株を親株とし、相同組み換え法により作製したfecA1遺伝子欠損株（ATCC700392 △fecA1）並びに、SodBのORF領域をライゲーションしたpHel3発現vector (pHel3::sodB)をH. pylori ATCC700392株へ形質転換させて構築したSodB強発現株（ATCC700392 pHel3::sodB)の3菌株を用いた。これら菌株を血液寒天培地にて24時間培養し、菌体を回収後、OD600 nmを0.1に調整し、NDGA、Secoisolariciresinol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane、Terameprocol、Phyllanthinを各20 μM含有する血液寒天培地へそれぞれ100 μLプレーティングした。5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、3日間、37℃、微好気条件下で培養後、阻止円の長さを測定した。その結果、Terameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane、NDGA、Phyllanthin、Secoisolariciresinolの順に、H. pyloriのH2O2感受性が亢進した。特に、Terameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane及びNDGA処理したH. pyloriのH2O2感受性はATCC700392 △fecA1が示すH2O2感受性レベルにまで亢進した（図３）。さらに、これら薬剤は、ATCC700392 pHel3::sodBに対してもH2O2感受性を亢進させた（図３）。 <Example 2> H 2 O 2 sensitivity test of H. pylori with NDGA and NDGA-related compounds (Experimental method and results)
H. pylori ATCC700392 strain, H. pylori ATCC700392 strain as parent strain, fecA1 gene-deficient strain (ATCC700392 △ fecA1) prepared by homologous recombination method, and pHel3 expression vector (pHel3 :: sodB) ligated with ORF region of SodB Three strains of strong SodB expression (ATCC700392 pHel3 :: sodB) constructed by transforming into H. pylori ATCC700392 strain were used. After culturing these strains on a blood agar medium for 24 hours and collecting the cells, OD600 The nm was adjusted to 0.1, and 100 μL of each was plated on a blood agar medium containing 20 μM each of NDGA, Secoisolariciresinol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane, Terameprocol, and Phyllanthin. A filter paper to which 10 μL of 5 MH 2 O 2 was added was placed and cultured for 3 days at 37 ° C. under microaerobic conditions, and then the length of the inhibition circle was measured. As a result, the sensitivity of H. pylori to H 2 O 2 was increased in the order of Terameprocol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane, NDGA, Phyllanthin, Secoisolariciresinol. In particular, the H 2 O 2 sensitivity of Terameprocol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane and H. pylori treated with NDGA was enhanced to the H 2 O 2 sensitivity level shown by ATCC700392 ΔfecA1 (FIG. 3). Furthermore, these drugs enhanced H 2 O 2 sensitivity to ATCC700392 pHel3 :: sodB (FIG. 3).
H. pylori ATCC700392株と、H. pylori ATCC700392株を親株とし、相同組み換え法により作製したfecA1遺伝子欠損株（ATCC700392 △fecA1）並びに、SodBのORF領域をライゲーションしたpHel3発現vector (pHel3::sodB)をH. pylori ATCC700392株へ形質転換させて構築したSodB強発現株（ATCC700392 pHel3::sodB)の3菌株を用いた。これら菌株を血液寒天培地にて24時間培養し、菌体を回収後、OD600 nmを0.1に調整し、NDGA、Secoisolariciresinol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane、Terameprocol、Phyllanthinを各20 μM含有する血液寒天培地へそれぞれ100 μLプレーティングした。5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、3日間、37℃、微好気条件下で培養後、阻止円の長さを測定した。その結果、Terameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane、NDGA、Phyllanthin、Secoisolariciresinolの順に、H. pyloriのH2O2感受性が亢進した。特に、Terameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane及びNDGA処理したH. pyloriのH2O2感受性はATCC700392 △fecA1が示すH2O2感受性レベルにまで亢進した（図３）。さらに、これら薬剤は、ATCC700392 pHel3::sodBに対してもH2O2感受性を亢進させた（図３）。 <Example 2> H 2 O 2 sensitivity test of H. pylori with NDGA and NDGA-related compounds (Experimental method and results)
H. pylori ATCC700392 strain, H. pylori ATCC700392 strain as parent strain, fecA1 gene-deficient strain (ATCC700392 △ fecA1) prepared by homologous recombination method, and pHel3 expression vector (pHel3 :: sodB) ligated with ORF region of SodB Three strains of strong SodB expression (ATCC700392 pHel3 :: sodB) constructed by transforming into H. pylori ATCC700392 strain were used. After culturing these strains on a blood agar medium for 24 hours and collecting the cells, OD600 The nm was adjusted to 0.1, and 100 μL of each was plated on a blood agar medium containing 20 μM each of NDGA, Secoisolariciresinol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane, Terameprocol, and Phyllanthin. A filter paper to which 10 μL of 5 MH 2 O 2 was added was placed and cultured for 3 days at 37 ° C. under microaerobic conditions, and then the length of the inhibition circle was measured. As a result, the sensitivity of H. pylori to H 2 O 2 was increased in the order of Terameprocol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane, NDGA, Phyllanthin, Secoisolariciresinol. In particular, the H 2 O 2 sensitivity of Terameprocol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane and H. pylori treated with NDGA was enhanced to the H 2 O 2 sensitivity level shown by ATCC700392 ΔfecA1 (FIG. 3). Furthermore, these drugs enhanced H 2 O 2 sensitivity to ATCC700392 pHel3 :: sodB (FIG. 3).
＜実施例３＞NDGA及びNDGA類縁化合物によるH. pyloriのH2O2感受性の用量依存性試験 （実験方法および結果）
実施例２において、H2O2感受性レベルをATCC700392 △fecA1株と同レベルにまで亢進させたTerameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane及びNDGAの活性に用量依存性があるかを明らかとする目的で、0, 20, 40, 80 μMのTerameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane及びNDGAをそれぞれ調整し、以下の方法により、H. pylori ATCC700392株に対するH2O2感受性変化への影響を評価した。血液寒天培地にて24時間培養した菌体を回収後、OD600nmを0.1に調整し、上記各濃度の各薬剤を含有させた血液寒天培地へそれぞれ100 μLプレーティングした。5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、3日間、37℃、微好気条件下で培養後、阻止円の長さを測定した。その結果、Terameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane及びNDGAの各薬剤は、用量依存的にH. pylori ATCC700392株のH2O2感受性を亢進させた（図４）。 <Example 3> Dose dependence test of H 2 O 2 sensitivity of H. pylori with NDGA and NDGA-related compounds (Experimental method and results)
In Example 2, it is clarified whether the activity of Terameprocol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane, and NDGA, whose H 2 O 2 sensitivity level was increased to the same level as that of the ATCC700392 △ fecA1 strain, is dose-dependent Therefore, 0, 20, 40, 80 μM Terameprocol, 2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane and NDGA were prepared, respectively, and H 2 O 2 sensitivity to H. pylori ATCC700392 strain by the following method. The impact on change was assessed. After recovering the cells cultured on the blood agar medium for 24 hours, the OD600nm was adjusted to 0.1, and each 100 μL was plated on the blood agar medium containing each drug at each concentration. A filter paper to which 10 μL of 5 MH 2 O 2 was added was placed and cultured for 3 days at 37 ° C. under microaerobic conditions, and then the length of the inhibition circle was measured. As a result, each drug of Terameprocol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane and NDGA enhanced H 2 O 2 sensitivity of H. pylori ATCC700392 strain in a dose-dependent manner (FIG. 4).
実施例２において、H2O2感受性レベルをATCC700392 △fecA1株と同レベルにまで亢進させたTerameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane及びNDGAの活性に用量依存性があるかを明らかとする目的で、0, 20, 40, 80 μMのTerameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane及びNDGAをそれぞれ調整し、以下の方法により、H. pylori ATCC700392株に対するH2O2感受性変化への影響を評価した。血液寒天培地にて24時間培養した菌体を回収後、OD600nmを0.1に調整し、上記各濃度の各薬剤を含有させた血液寒天培地へそれぞれ100 μLプレーティングした。5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、3日間、37℃、微好気条件下で培養後、阻止円の長さを測定した。その結果、Terameprocol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane及びNDGAの各薬剤は、用量依存的にH. pylori ATCC700392株のH2O2感受性を亢進させた（図４）。 <Example 3> Dose dependence test of H 2 O 2 sensitivity of H. pylori with NDGA and NDGA-related compounds (Experimental method and results)
In Example 2, it is clarified whether the activity of Terameprocol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane, and NDGA, whose H 2 O 2 sensitivity level was increased to the same level as that of the ATCC700392 △ fecA1 strain, is dose-dependent Therefore, 0, 20, 40, 80 μM Terameprocol, 2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane and NDGA were prepared, respectively, and H 2 O 2 sensitivity to H. pylori ATCC700392 strain by the following method. The impact on change was assessed. After recovering the cells cultured on the blood agar medium for 24 hours, the OD600nm was adjusted to 0.1, and each 100 μL was plated on the blood agar medium containing each drug at each concentration. A filter paper to which 10 μL of 5 MH 2 O 2 was added was placed and cultured for 3 days at 37 ° C. under microaerobic conditions, and then the length of the inhibition circle was measured. As a result, each drug of Terameprocol, 2,3,4,4′-Tetrahydroxy diphenylmethane and NDGA enhanced H 2 O 2 sensitivity of H. pylori ATCC700392 strain in a dose-dependent manner (FIG. 4).
＜実施例４＞NDGA及びNDGA類縁化合物によるH. pyloriの増殖能試験 （実験方法および結果）
NDGA、Secoisolariciresinol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane、Terameprocol、Phyllanthinの各薬剤が、H. pylori の増殖に直接的な影響を与えるかを明らかとする目的で次の実験を行った。血液寒天培地にて24時間培養したH. pylori ATCC700392株を回収し、OD600nmを0.06に調整し、20 μMのNDGA、Secoisolariciresinol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane、Terameprocol、Phyllanthinをそれぞれ添加した７% FBS含有Brucella Brothへ播種した。この時OD600nmを測定し、37℃、微好気条件下で２４時間培養した後、OD600nmを測定した。その結果、各薬剤の存在によりH. pyloriの増殖が抑制されることはなく、これらの薬剤は、H. pylori の増殖に影響しないことが示された（図５）。 <Example 4> H. pylori growth ability test with NDGA and NDGA-related compounds (Experimental method and results)
The following experiment was conducted to clarify whether NDGA, Secoisolariciresinol, 2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane, Terameprocol, and Phyllanthin had a direct effect on the growth of H. pylori. Collect H. pylori ATCC700392 strain cultured on blood agar for 24 hours, adjust OD600nm to 0.06, and add 20 μM NDGA, Secoisolariciresinol, 2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane, Terameprocol, Phyllanthin respectively 7% FBS-containing Brucella Broth was seeded. At this time, OD600nm was measured, and after culturing at 37 ° C under microaerobic condition for 24 hours, OD600nm was measured. As a result, the presence of each drug did not inhibit the growth of H. pylori, indicating that these drugs did not affect the growth of H. pylori (FIG. 5).
NDGA、Secoisolariciresinol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane、Terameprocol、Phyllanthinの各薬剤が、H. pylori の増殖に直接的な影響を与えるかを明らかとする目的で次の実験を行った。血液寒天培地にて24時間培養したH. pylori ATCC700392株を回収し、OD600nmを0.06に調整し、20 μMのNDGA、Secoisolariciresinol、2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane、Terameprocol、Phyllanthinをそれぞれ添加した７% FBS含有Brucella Brothへ播種した。この時OD600nmを測定し、37℃、微好気条件下で２４時間培養した後、OD600nmを測定した。その結果、各薬剤の存在によりH. pyloriの増殖が抑制されることはなく、これらの薬剤は、H. pylori の増殖に影響しないことが示された（図５）。 <Example 4> H. pylori growth ability test with NDGA and NDGA-related compounds (Experimental method and results)
The following experiment was conducted to clarify whether NDGA, Secoisolariciresinol, 2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane, Terameprocol, and Phyllanthin had a direct effect on the growth of H. pylori. Collect H. pylori ATCC700392 strain cultured on blood agar for 24 hours, adjust OD600nm to 0.06, and add 20 μM NDGA, Secoisolariciresinol, 2,3,4,4'-Tetrahydroxy diphenylmethane, Terameprocol, Phyllanthin respectively 7% FBS-containing Brucella Broth was seeded. At this time, OD600nm was measured, and after culturing at 37 ° C under microaerobic condition for 24 hours, OD600nm was measured. As a result, the presence of each drug did not inhibit the growth of H. pylori, indicating that these drugs did not affect the growth of H. pylori (FIG. 5).
＜実施例５＞NDGA及びTerameprocolのH. pylori 野生株及びSodB強発現メトロニダゾール耐性株のH2O2感受性試験
（実験方法および結果）
H. pylori ATCC700392及び、臨床分離されたSodB強発現メトロニダゾール耐性H. pylori（KS0145）を用いた。各菌株を血液寒天培地にて24時間培養後、OD600 nmを0.1に調整し、７% FBS含有Brucella Brothに懸濁後、40 μMのNDGA及びTerameprocolを添加し、37℃、微好気条件下で、３０分間 pre-cultureした。その後、菌液をニッスイプレート・ヘリコバクター寒天培地へ100 μLプレーティングし、5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、3日間、37℃、微好気条件下で培養後、阻止円の長さを測定した。KS0145は、SodB強発現株であることから、H2O2感受性はH. pylori ATCC700392株に比べて低かったが、NDGA及びTerameprocolは共に、KS0145株に対してもH2O2感受性を亢進させた（図6）。前述のようにメトロニダゾールは、菌体内で還元活性化されsuperoxideを発生することで抗菌活性を発揮する。そのため、SodB強発現誘導させたH. pylori菌株はメトロニダゾール耐性を示す。実際に、臨床分離されたメトロニダゾール耐性菌株の中には、SodBの強発現株（KS0145, KS0048）が存在し、これら菌株に対してfecA1遺伝子を欠損させることで、SodB活性は有意に低下し、メトロニダゾール感受性も亢進する。40 μM Terameprocol処理では、SodB強発現メトロニダゾール耐性株に対しても、H2O2感受性をメトロニダゾール感受性株と同レベルにまで亢進させた。この結果から、FecA1機能阻害化合物によるH. pyloriの抗酸化能破綻活性が、メトロニダゾール耐性解除にも貢献する可能性が示された。 <Example 5> H 2 O 2 sensitivity test of NDGA and Terameprocol H. pylori wild strain and SodB strong expression metronidazole resistant strain (Experimental method and results)
H. pylori ATCC 700392 and clinically isolated SodB strong expression metronidazole resistant H. pylori (KS0145) were used. After culturing each strain on blood agar for 24 hours, adjusting OD600 nm to 0.1, suspending in 7% FBS-containing Brucella Broth, adding 40 μM NDGA and Terameprocol, 37 ° C, microaerobic condition So I pre-cultured for 30 minutes. Then, 100 μL of the bacterial solution was plated on Nissui plate / Helicobacter agar medium, and a filter paper supplemented with 10 μL of 5 M H 2 O 2 was placed on it. The length of was measured. Since KS0145 is a strong SodB expression strain, H 2 O 2 sensitivity was lower than that of H. pylori ATCC700392 strain, but both NDGA and Terameprocol also enhanced H 2 O 2 sensitivity to KS0145 strain. (Figure 6). As described above, metronidazole exhibits antibacterial activity by being reduced and activated in the microbial cells to generate superoxide. Therefore, the H. pylori strain induced to induce strong SodB expression is resistant to metronidazole. Actually, among the clinically isolated metronidazole resistant strains, there are strong SodB expression strains (KS0145, KS0048), and by deleting the fecA1 gene from these strains, the SodB activity is significantly reduced. Metronidazole sensitivity is also increased. Treatment with 40 μM Terameprocol increased H 2 O 2 sensitivity to the same level as that of metronidazole-sensitive strains even in strains resistant to SodB. From these results, it was shown that the antioxidative ability-disrupting activity of H. pylori by FecA1 function-inhibiting compounds may contribute to the release of metronidazole resistance.
（実験方法および結果）
H. pylori ATCC700392及び、臨床分離されたSodB強発現メトロニダゾール耐性H. pylori（KS0145）を用いた。各菌株を血液寒天培地にて24時間培養後、OD600 nmを0.1に調整し、７% FBS含有Brucella Brothに懸濁後、40 μMのNDGA及びTerameprocolを添加し、37℃、微好気条件下で、３０分間 pre-cultureした。その後、菌液をニッスイプレート・ヘリコバクター寒天培地へ100 μLプレーティングし、5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、3日間、37℃、微好気条件下で培養後、阻止円の長さを測定した。KS0145は、SodB強発現株であることから、H2O2感受性はH. pylori ATCC700392株に比べて低かったが、NDGA及びTerameprocolは共に、KS0145株に対してもH2O2感受性を亢進させた（図6）。前述のようにメトロニダゾールは、菌体内で還元活性化されsuperoxideを発生することで抗菌活性を発揮する。そのため、SodB強発現誘導させたH. pylori菌株はメトロニダゾール耐性を示す。実際に、臨床分離されたメトロニダゾール耐性菌株の中には、SodBの強発現株（KS0145, KS0048）が存在し、これら菌株に対してfecA1遺伝子を欠損させることで、SodB活性は有意に低下し、メトロニダゾール感受性も亢進する。40 μM Terameprocol処理では、SodB強発現メトロニダゾール耐性株に対しても、H2O2感受性をメトロニダゾール感受性株と同レベルにまで亢進させた。この結果から、FecA1機能阻害化合物によるH. pyloriの抗酸化能破綻活性が、メトロニダゾール耐性解除にも貢献する可能性が示された。 <Example 5> H 2 O 2 sensitivity test of NDGA and Terameprocol H. pylori wild strain and SodB strong expression metronidazole resistant strain (Experimental method and results)
H. pylori ATCC 700392 and clinically isolated SodB strong expression metronidazole resistant H. pylori (KS0145) were used. After culturing each strain on blood agar for 24 hours, adjusting OD600 nm to 0.1, suspending in 7% FBS-containing Brucella Broth, adding 40 μM NDGA and Terameprocol, 37 ° C, microaerobic condition So I pre-cultured for 30 minutes. Then, 100 μL of the bacterial solution was plated on Nissui plate / Helicobacter agar medium, and a filter paper supplemented with 10 μL of 5 M H 2 O 2 was placed on it. The length of was measured. Since KS0145 is a strong SodB expression strain, H 2 O 2 sensitivity was lower than that of H. pylori ATCC700392 strain, but both NDGA and Terameprocol also enhanced H 2 O 2 sensitivity to KS0145 strain. (Figure 6). As described above, metronidazole exhibits antibacterial activity by being reduced and activated in the microbial cells to generate superoxide. Therefore, the H. pylori strain induced to induce strong SodB expression is resistant to metronidazole. Actually, among the clinically isolated metronidazole resistant strains, there are strong SodB expression strains (KS0145, KS0048), and by deleting the fecA1 gene from these strains, the SodB activity is significantly reduced. Metronidazole sensitivity is also increased. Treatment with 40 μM Terameprocol increased H 2 O 2 sensitivity to the same level as that of metronidazole-sensitive strains even in strains resistant to SodB. From these results, it was shown that the antioxidative ability-disrupting activity of H. pylori by FecA1 function-inhibiting compounds may contribute to the release of metronidazole resistance.
＜実施例６＞NDGAによるサルモネラ菌及び腸管出血性大腸菌O157の増殖能試験 （実験方法および結果）
NDGAが、サルモネラ菌及びO157 の増殖に直接的な影響を与えるかを明らかとする目的で次の実験を行った。LB寒天培地にて24時間培養したSalmonella enterica serovar Typhimuriumを回収し、OD600nmを0.1に調整し、50 μMのNDGAを添加したLB Brothへ播種した。この時OD600nmを測定し、37℃、好気条件下で３時間培養した後、OD600 nmを測定した。また、Salmonella enterica serovar Typhimuriumに代えてEscherichia coli O157 Sakai株を用いる以外、上記と同様にして、試験を行った。結果を図７に示す。その結果、NDGAの存在によりサルモネラ菌及びO157の増殖が抑制されることはなく、NDGAは、これらの細菌の増殖に影響しないことが示された（図７）。 <Example 6> Proliferation test of Salmonella and enterohemorrhagic Escherichia coli O157 by NDGA (Experimental method and results)
The following experiment was conducted to clarify whether NDGA directly affects the growth of Salmonella and O157. Salmonella enterica serovar Typhimurium cultured on LB agar medium for 24 hours was collected, and OD600nm was adjusted to 0.1 and seeded on LB Broth supplemented with 50 μM NDGA. At this time, OD600 nm was measured, and after culturing at 37 ° C. under aerobic conditions for 3 hours, OD600 nm was measured. Further, the test was performed in the same manner as described above except that Escherichia coli O157 Sakai strain was used instead of Salmonella enterica serovar Typhimurium. The results are shown in FIG. As a result, the presence of NDGA did not inhibit the growth of Salmonella and O157, indicating that NDGA does not affect the growth of these bacteria (FIG. 7).
NDGAが、サルモネラ菌及びO157 の増殖に直接的な影響を与えるかを明らかとする目的で次の実験を行った。LB寒天培地にて24時間培養したSalmonella enterica serovar Typhimuriumを回収し、OD600nmを0.1に調整し、50 μMのNDGAを添加したLB Brothへ播種した。この時OD600nmを測定し、37℃、好気条件下で３時間培養した後、OD600 nmを測定した。また、Salmonella enterica serovar Typhimuriumに代えてEscherichia coli O157 Sakai株を用いる以外、上記と同様にして、試験を行った。結果を図７に示す。その結果、NDGAの存在によりサルモネラ菌及びO157の増殖が抑制されることはなく、NDGAは、これらの細菌の増殖に影響しないことが示された（図７）。 <Example 6> Proliferation test of Salmonella and enterohemorrhagic Escherichia coli O157 by NDGA (Experimental method and results)
The following experiment was conducted to clarify whether NDGA directly affects the growth of Salmonella and O157. Salmonella enterica serovar Typhimurium cultured on LB agar medium for 24 hours was collected, and OD600nm was adjusted to 0.1 and seeded on LB Broth supplemented with 50 μM NDGA. At this time, OD600 nm was measured, and after culturing at 37 ° C. under aerobic conditions for 3 hours, OD600 nm was measured. Further, the test was performed in the same manner as described above except that Escherichia coli O157 Sakai strain was used instead of Salmonella enterica serovar Typhimurium. The results are shown in FIG. As a result, the presence of NDGA did not inhibit the growth of Salmonella and O157, indicating that NDGA does not affect the growth of these bacteria (FIG. 7).
＜実施例７＞NDGAのサルモネラ菌及び腸管出血性大腸菌O157のH2O2感受性試験
（実験方法および結果）
Salmonella enterica serovar Typhimurium及びEscherichia coli O157 Sakai株を用いた。各菌株をLB寒天培地にて24時間培養後、OD600nmを0.1に調整し、LB Brothに懸濁後、50 μMのNDGAを添加し、37℃、好気条件下で、３時間 pre-cultureした。その後、菌液をLB寒天培地へ100 μLプレーティングし、5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、24時間、37℃、好気条件下で培養後、阻止円の長さを測定した。結果を図８に示す。図８に示されるように、NDGAは、サルモネラ菌及び腸管出血性大腸菌O157のH2O2感受性を亢進した。 <Example 7> H 2 O 2 sensitivity test of Salmonella NDGA and enterohemorrhagic Escherichia coli O157 (Experimental method and results)
Salmonella enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli O157 Sakai strain were used. After each strain was cultured on LB agar for 24 hours, OD600nm was adjusted to 0.1, suspended in LB Broth, 50 μM NDGA was added, and pre-cultured at 37 ° C under aerobic conditions for 3 hours . Then, 100 μL of the bacterial solution is plated on LB agar medium, and a filter paper supplemented with 10 μL of 5 MH 2 O 2 is placed on it. It was measured. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8, NDGA enhanced H 2 O 2 sensitivity of Salmonella and enterohemorrhagic E. coli O157.
（実験方法および結果）
Salmonella enterica serovar Typhimurium及びEscherichia coli O157 Sakai株を用いた。各菌株をLB寒天培地にて24時間培養後、OD600nmを0.1に調整し、LB Brothに懸濁後、50 μMのNDGAを添加し、37℃、好気条件下で、３時間 pre-cultureした。その後、菌液をLB寒天培地へ100 μLプレーティングし、5 M H2O2を10 μL添加したろ紙を載せて、24時間、37℃、好気条件下で培養後、阻止円の長さを測定した。結果を図８に示す。図８に示されるように、NDGAは、サルモネラ菌及び腸管出血性大腸菌O157のH2O2感受性を亢進した。 <Example 7> H 2 O 2 sensitivity test of Salmonella NDGA and enterohemorrhagic Escherichia coli O157 (Experimental method and results)
Salmonella enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli O157 Sakai strain were used. After each strain was cultured on LB agar for 24 hours, OD600nm was adjusted to 0.1, suspended in LB Broth, 50 μM NDGA was added, and pre-cultured at 37 ° C under aerobic conditions for 3 hours . Then, 100 μL of the bacterial solution is plated on LB agar medium, and a filter paper supplemented with 10 μL of 5 MH 2 O 2 is placed on it. It was measured. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 8, NDGA enhanced H 2 O 2 sensitivity of Salmonella and enterohemorrhagic E. coli O157.
＜実施例８＞
材料及び方法
菌株及び培養条件
本試験において、H. pylori ATCC700392株、KS0048株及びKS0145株を用いた。KS numberの H. pylori菌株は、臨床分離された菌株で、25% (vol/vol) グリセロールを含むBrucella broth培地中で-80°Cで保存した。KS0048株及びKS0145株は、SodBの過剰発現をもたらすferric uptake regulator (Fur)アミノ酸変異を有するメトロニダゾール(Mtz)耐性株である。SodBのORF領域をライゲーションしたpHel3発現vector (pHel3::sodB)と、pHel3発現vectorのみ（pHel3 ctrl）をH. pylori ATCC700392株へそれぞれ形質転換させて構築したSodB強発現株（ATCC700392 pHel3::sodB)とそのコントロール株（ATCC700392 pHel3 ctrl）を用いた（H. Tsugawa, H. Suzuki, K. Satoh et al., Antioxidants and Redox Signaling, vol. 14, no. 1, pp. 15-23, 2011.）。ATCC700392 pHel3::sodBは、そのSodB 活性がATCC700392 pHel3 ctrl株よりも高いことが確認されている（同上）。また、H. pylori ATCC700392株、H. pylori ＫＳ0048株並びにH. pylori KS0145株を親株として相同組み換え法により構築した各菌株のfecA1遺伝子欠損株（ATCC700392ΔfecA1株、KS0048ΔfecA1株、及びKS0145ΔfecA1株）を用いた（H. Tsugawa, H. Suzuki, J. Matsuzaki, K. Hirata, and T. Hibi, Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.）。各菌株のfecA1欠損株のSodB活性は、親株よりも著しく低下することが確認されている（同上）。これらの株は、25% (vol/vol)グリセロールを含むBrucella broth培地中、-80°Cで保存した。これらの菌を、7%ヒツジ血液及び7%ウシ胎児血清を含むBrucella 寒天培地で、AnaeroPack MicroAeroにより微好気条件下、37°C で２日間培養した。 <Example 8>
Materials and Methods Strains and Culture Conditions In this test, H. pylori ATCC700392 strain, KS0048 strain and KS0145 strain were used. KS number H. pylori strain was clinically isolated and stored at -80 ° C in Brucella broth medium containing 25% (vol / vol) glycerol. The KS0048 and KS0145 strains are metronidazole (Mtz) resistant strains with a ferric uptake regulator (Fur) amino acid mutation that results in SodB overexpression. SodB strong expression strain (ATCC700392 pHel3 :: sodB) constructed by transforming the pHel3 expression vector (pHel3 :: sodB) ligated with the ORF region of SodB and only the pHel3 expression vector (pHel3 ctrl) into H. pylori ATCC700392 strain. ) And its control strain (ATCC700392 pHel3 ctrl) (H. Tsugawa, H. Suzuki, K. Satoh et al., Antioxidants and Redox Signaling, vol. 14, no. 1, pp. 15-23, 2011. ). ATCC700392 pHel3 :: sodB has been confirmed to have a higher SodB activity than the ATCC700392 pHel3 ctrl strain (same as above). In addition, fecA1 gene-deficient strains (ATCC700392ΔfecA1, KS0048ΔfecA1 and KS0145ΔfecA1) constructed by homologous recombination using the H. pylori ATCC700392 strain, the H. pylori KS0048 strain and the H. pylori KS0145 strain as parent strains were used ( H. Tsugawa, H. Suzuki, J. Matsuzaki, K. Hirata, and T. Hibi, Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.). It has been confirmed that the SodB activity of the fecA1-deficient strain of each strain is significantly lower than that of the parent strain (same as above). These strains were stored at -80 ° C in Brucella broth medium containing 25% (vol / vol) glycerol. These bacteria were cultured on a Brucella agar medium containing 7% sheep blood and 7% fetal calf serum for 2 days at 37 ° C. under microaerobic conditions using AnaeroPack MicroAero.
材料及び方法
菌株及び培養条件
本試験において、H. pylori ATCC700392株、KS0048株及びKS0145株を用いた。KS numberの H. pylori菌株は、臨床分離された菌株で、25% (vol/vol) グリセロールを含むBrucella broth培地中で-80°Cで保存した。KS0048株及びKS0145株は、SodBの過剰発現をもたらすferric uptake regulator (Fur)アミノ酸変異を有するメトロニダゾール(Mtz)耐性株である。SodBのORF領域をライゲーションしたpHel3発現vector (pHel3::sodB)と、pHel3発現vectorのみ（pHel3 ctrl）をH. pylori ATCC700392株へそれぞれ形質転換させて構築したSodB強発現株（ATCC700392 pHel3::sodB)とそのコントロール株（ATCC700392 pHel3 ctrl）を用いた（H. Tsugawa, H. Suzuki, K. Satoh et al., Antioxidants and Redox Signaling, vol. 14, no. 1, pp. 15-23, 2011.）。ATCC700392 pHel3::sodBは、そのSodB 活性がATCC700392 pHel3 ctrl株よりも高いことが確認されている（同上）。また、H. pylori ATCC700392株、H. pylori ＫＳ0048株並びにH. pylori KS0145株を親株として相同組み換え法により構築した各菌株のfecA1遺伝子欠損株（ATCC700392ΔfecA1株、KS0048ΔfecA1株、及びKS0145ΔfecA1株）を用いた（H. Tsugawa, H. Suzuki, J. Matsuzaki, K. Hirata, and T. Hibi, Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.）。各菌株のfecA1欠損株のSodB活性は、親株よりも著しく低下することが確認されている（同上）。これらの株は、25% (vol/vol)グリセロールを含むBrucella broth培地中、-80°Cで保存した。これらの菌を、7%ヒツジ血液及び7%ウシ胎児血清を含むBrucella 寒天培地で、AnaeroPack MicroAeroにより微好気条件下、37°C で２日間培養した。 <Example 8>
Materials and Methods Strains and Culture Conditions In this test, H. pylori ATCC700392 strain, KS0048 strain and KS0145 strain were used. KS number H. pylori strain was clinically isolated and stored at -80 ° C in Brucella broth medium containing 25% (vol / vol) glycerol. The KS0048 and KS0145 strains are metronidazole (Mtz) resistant strains with a ferric uptake regulator (Fur) amino acid mutation that results in SodB overexpression. SodB strong expression strain (ATCC700392 pHel3 :: sodB) constructed by transforming the pHel3 expression vector (pHel3 :: sodB) ligated with the ORF region of SodB and only the pHel3 expression vector (pHel3 ctrl) into H. pylori ATCC700392 strain. ) And its control strain (ATCC700392 pHel3 ctrl) (H. Tsugawa, H. Suzuki, K. Satoh et al., Antioxidants and Redox Signaling, vol. 14, no. 1, pp. 15-23, 2011. ). ATCC700392 pHel3 :: sodB has been confirmed to have a higher SodB activity than the ATCC700392 pHel3 ctrl strain (same as above). In addition, fecA1 gene-deficient strains (ATCC700392ΔfecA1, KS0048ΔfecA1 and KS0145ΔfecA1) constructed by homologous recombination using the H. pylori ATCC700392 strain, the H. pylori KS0048 strain and the H. pylori KS0145 strain as parent strains were used ( H. Tsugawa, H. Suzuki, J. Matsuzaki, K. Hirata, and T. Hibi, Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.). It has been confirmed that the SodB activity of the fecA1-deficient strain of each strain is significantly lower than that of the parent strain (same as above). These strains were stored at -80 ° C in Brucella broth medium containing 25% (vol / vol) glycerol. These bacteria were cultured on a Brucella agar medium containing 7% sheep blood and 7% fetal calf serum for 2 days at 37 ° C. under microaerobic conditions using AnaeroPack MicroAero.
細胞内Fe2+レベルの測定
OD600nmを0.5に調整した菌株を、NDGA添加又は未添加で３時間インキュベートした。菌株をHBSSで３回洗浄後、10 μM RhoNox-1を添加した（T. Hirayama, K. Okuda, and H. Nagasawa, Chemical Science, vol. 4, no. 3, pp. 1250-1256, 2013）。37°C、１時間のインキュベーションの後、菌株をHBSSで洗浄し、OD600nmを0.1に調整した。蛍光強度を560nm excitation及び595nm emissionを用いて測定した。 Measurement of intracellular Fe 2+ level A strain with an OD600nm adjusted to 0.5 was incubated for 3 hours with or without the addition of NDGA. The strain was washed 3 times with HBSS, and 10 μM RhoNox-1 was added (T. Hirayama, K. Okuda, and H. Nagasawa, Chemical Science, vol. 4, no. 3, pp. 1250-1256, 2013). . After incubation at 37 ° C for 1 hour, the strain was washed with HBSS and the OD600nm was adjusted to 0.1. The fluorescence intensity was measured using 560 nm excitation and 595 nm emission.
OD600nmを0.5に調整した菌株を、NDGA添加又は未添加で３時間インキュベートした。菌株をHBSSで３回洗浄後、10 μM RhoNox-1を添加した（T. Hirayama, K. Okuda, and H. Nagasawa, Chemical Science, vol. 4, no. 3, pp. 1250-1256, 2013）。37°C、１時間のインキュベーションの後、菌株をHBSSで洗浄し、OD600nmを0.1に調整した。蛍光強度を560nm excitation及び595nm emissionを用いて測定した。 Measurement of intracellular Fe 2+ level A strain with an OD600nm adjusted to 0.5 was incubated for 3 hours with or without the addition of NDGA. The strain was washed 3 times with HBSS, and 10 μM RhoNox-1 was added (T. Hirayama, K. Okuda, and H. Nagasawa, Chemical Science, vol. 4, no. 3, pp. 1250-1256, 2013). . After incubation at 37 ° C for 1 hour, the strain was washed with HBSS and the OD600nm was adjusted to 0.1. The fluorescence intensity was measured using 560 nm excitation and 595 nm emission.
SOD 活性の測定
OD600nmを0.5に調整した菌株を、NDGA添加又は未添加で３時間インキュベートした。各菌株をPBS洗浄後、超音波処理（25% powerで1.5min)し、蛋白質を回収した。その後、SOD活性をSOD Assay Kit (Dojindo, Kumamoto, Japan)を用いて測定した（H. Tsugawa, H. Suzuki, J. Matsuzaki, K. Hirata, and T. Hibi, Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.）。回収した蛋白質濃度は、BCA assayにより測定した。 Measurement of SOD activity A strain with an OD600nm adjusted to 0.5 was incubated for 3 hours with or without the addition of NDGA. Each strain was washed with PBS and sonicated (1.5 min at 25% power) to recover the protein. Then, SOD activity was measured using SOD Assay Kit (Dojindo, Kumamoto, Japan) (H. Tsugawa, H. Suzuki, J. Matsuzaki, K. Hirata, and T. Hibi, Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.). The recovered protein concentration was measured by BCA assay.
OD600nmを0.5に調整した菌株を、NDGA添加又は未添加で３時間インキュベートした。各菌株をPBS洗浄後、超音波処理（25% powerで1.5min)し、蛋白質を回収した。その後、SOD活性をSOD Assay Kit (Dojindo, Kumamoto, Japan)を用いて測定した（H. Tsugawa, H. Suzuki, J. Matsuzaki, K. Hirata, and T. Hibi, Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.）。回収した蛋白質濃度は、BCA assayにより測定した。 Measurement of SOD activity A strain with an OD600nm adjusted to 0.5 was incubated for 3 hours with or without the addition of NDGA. Each strain was washed with PBS and sonicated (1.5 min at 25% power) to recover the protein. Then, SOD activity was measured using SOD Assay Kit (Dojindo, Kumamoto, Japan) (H. Tsugawa, H. Suzuki, J. Matsuzaki, K. Hirata, and T. Hibi, Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.). The recovered protein concentration was measured by BCA assay.
Mtz のMICの測定
OD600nmを0.5に調整した菌株を、50 μM NDGA添加又は未添加で３時間インキュベートした。菌株（OD600nm=0.1）を、２倍ずつ段階希釈したMt z (0.5-128 μg/mL).を含む寒天プレートに播種した。全てのプレートを３７℃、微好気性条件でインキュベートし、最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration (MIC)）を決定した（Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012）。 Measurement of Mtz's MIC A strain with an OD600nm adjusted to 0.5 was incubated for 3 hours with or without 50 μM NDGA. The strain (OD600nm = 0.1) was inoculated on an agar plate containing Mtz (0.5-128 μg / mL) serially diluted 2-fold. All plates were incubated at 37 ° C. under microaerobic conditions to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) (Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010 , 2012).
OD600nmを0.5に調整した菌株を、50 μM NDGA添加又は未添加で３時間インキュベートした。菌株（OD600nm=0.1）を、２倍ずつ段階希釈したMt z (0.5-128 μg/mL).を含む寒天プレートに播種した。全てのプレートを３７℃、微好気性条件でインキュベートし、最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration (MIC)）を決定した（Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012）。 Measurement of Mtz's MIC A strain with an OD600nm adjusted to 0.5 was incubated for 3 hours with or without 50 μM NDGA. The strain (OD600nm = 0.1) was inoculated on an agar plate containing Mtz (0.5-128 μg / mL) serially diluted 2-fold. All plates were incubated at 37 ° C. under microaerobic conditions to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) (Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010 , 2012).
H2O2 感受性の測定
OD600nmを0.5に調整した菌株を、50 μM NDGA添加又は未添加で３時間インキュベートした。各菌株をＰＢＳ洗浄後、OD600nmを0.1に調整し、Nissui Helicobacter agarへ100 μL播種した。5 M 過酸化水素 (H2O2)を10 μL添加した直径5mmのろ紙をプレートに載せ、３７℃、微好気性条件で３日間培養後、ろ紙周辺の発育阻止円の長さを測定した（Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012）。 Measurement of H 2 O 2 sensitivity A strain adjusted to OD600nm of 0.5 was incubated for 3 hours with or without 50 μM NDGA. After washing each strain with PBS, OD600nm was adjusted to 0.1, and 100 μL was inoculated into Nissui Helicobacter agar. A 5 mm diameter filter paper with 10 μL of 5 M hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) was placed on the plate, cultured for 3 days at 37 ° C. under microaerobic conditions, and the length of the growth inhibition circle around the filter paper was measured. (Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012).
OD600nmを0.5に調整した菌株を、50 μM NDGA添加又は未添加で３時間インキュベートした。各菌株をＰＢＳ洗浄後、OD600nmを0.1に調整し、Nissui Helicobacter agarへ100 μL播種した。5 M 過酸化水素 (H2O2)を10 μL添加した直径5mmのろ紙をプレートに載せ、３７℃、微好気性条件で３日間培養後、ろ紙周辺の発育阻止円の長さを測定した（Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012）。 Measurement of H 2 O 2 sensitivity A strain adjusted to OD600nm of 0.5 was incubated for 3 hours with or without 50 μM NDGA. After washing each strain with PBS, OD600nm was adjusted to 0.1, and 100 μL was inoculated into Nissui Helicobacter agar. A 5 mm diameter filter paper with 10 μL of 5 M hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) was placed on the plate, cultured for 3 days at 37 ° C. under microaerobic conditions, and the length of the growth inhibition circle around the filter paper was measured. (Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012).
統計的解析
全ての値を平均 ±SDで示した。３群以上の統計的有意差は、Tukey testを用いて評価した。P < 0.05の場合、統計的に有意差があると評価した。 Statistical analysis All values are shown as mean ± SD. Statistical significance of 3 groups or more was evaluated using Tukey test. When P <0.05, it was evaluated that there was a statistically significant difference.
全ての値を平均 ±SDで示した。３群以上の統計的有意差は、Tukey testを用いて評価した。P < 0.05の場合、統計的に有意差があると評価した。 Statistical analysis All values are shown as mean ± SD. Statistical significance of 3 groups or more was evaluated using Tukey test. When P <0.05, it was evaluated that there was a statistically significant difference.
結果
H. pyloriの細胞内Fe2+レベル及び SodB活性に対するNDGAの効果
Fe2+ を選択的に検出するためにturn-on蛍光プローブRhoNox-1を用いて細胞内Fe2+レベルに対するNDGAの効果を試験した（Chemical Science, vol. 4, no. 3, pp. 1250-1256, 2013）。H. pyloriの細胞内Fe2+ レベルは、NDGA用量依存的に有意に低下した（図９左）。本発明者らは、既に、fecA1欠損株が野生株よりも低いSodB活性を示すことを実証している（Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.）。従って、今回、SodB活性に対するNDGAの効果を調べた。SodB活性は、NDGAへの曝露に伴い、用量依存的有意に低下した(図９、右)。また、50 μM NDGAでの処理により、fecA1欠損株(ΔfecA1)が示すレベルまでSodB活性は低下した(図９右)。また、本発明者らは、Mtz耐性株(KS0048 and KS0145)のSodB活性がFurアミノ酸変異に起因して上昇することを実証している（Antioxidants and Redox Signaling, vol. 14, no. 1, pp. 15-23, 2011.）。従って、KS0048及びKS0145で増強されたSodB 活性がNDGAにより抑制されるか否かを試験した。まず、50 μM NDGAへの曝露によりSodB強発現株(ATCC700392 pHel3::sodB)の細胞内Fe2+レベルは、コントロール株(ATCC700392 pHel3 ctrl)に比べ、有意に減少した（図１０上）。同様に、KS0048 及びKS0145の細胞内Fe2+レベルも50 μM NDGA曝露により有意に減少した（図１０上）。その結果、50 μM NDGA曝露により各菌株のSodB活性は、fecA1欠損株（KS0048ΔfecA1及びKS0145ΔfecA1）が示すレベルまで有意に減少した（図１０下）。これらの結果から、NDGAがKS0048及びKS0145の増強されたSodB活性も抑制することが示唆される。 Results H. pylori intracellular Fe 2+ levels and NDGA against SodB active effect Fe 2+ selectively detect for the turn-on fluorescent probe RhoNox-1 effect of NDGA on intracellular Fe 2+ levels using (Chemical Science, vol. 4, no. 3, pp. 1250-1256, 2013). The intracellular Fe 2+ level of H. pylori was significantly reduced in an NDGA dose-dependent manner (FIG. 9 left). The present inventors have already demonstrated that a fecA1-deficient strain shows lower SodB activity than a wild-type strain (Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012. ). Therefore, the effect of NDGA on SodB activity was investigated this time. SodB activity decreased significantly in a dose-dependent manner with exposure to NDGA (Figure 9, right). In addition, the treatment with 50 μM NDGA decreased SodB activity to the level indicated by the fecA1-deficient strain (ΔfecA1) (right side of FIG. 9). In addition, the inventors have demonstrated that the SodB activity of Mtz resistant strains (KS0048 and KS0145) is increased due to Fur amino acid mutation (Antioxidants and Redox Signaling, vol. 14, no. 1, pp 15-23, 2011.). Therefore, it was tested whether the SodB activity enhanced by KS0048 and KS0145 was suppressed by NDGA. First, exposure to 50 μM NDGA significantly decreased the intracellular Fe 2+ level of the SodB strong expression strain (ATCC700392 pHel3 :: sodB) compared to the control strain (ATCC700392 pHel3 ctrl) (upper FIG. 10). Similarly, the intracellular Fe 2+ levels of KS0048 and KS0145 were also significantly reduced by exposure to 50 μM NDGA (upper FIG. 10). As a result, exposure to 50 μM NDGA significantly reduced the SodB activity of each strain to the level indicated by the fecA1-deficient strains (KS0048ΔfecA1 and KS0145ΔfecA1) (bottom of FIG. 10). These results suggest that NDGA also inhibits the enhanced SodB activity of KS0048 and KS0145.
H. pyloriの細胞内Fe2+レベル及び SodB活性に対するNDGAの効果
Fe2+ を選択的に検出するためにturn-on蛍光プローブRhoNox-1を用いて細胞内Fe2+レベルに対するNDGAの効果を試験した（Chemical Science, vol. 4, no. 3, pp. 1250-1256, 2013）。H. pyloriの細胞内Fe2+ レベルは、NDGA用量依存的に有意に低下した（図９左）。本発明者らは、既に、fecA1欠損株が野生株よりも低いSodB活性を示すことを実証している（Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012.）。従って、今回、SodB活性に対するNDGAの効果を調べた。SodB活性は、NDGAへの曝露に伴い、用量依存的有意に低下した(図９、右)。また、50 μM NDGAでの処理により、fecA1欠損株(ΔfecA1)が示すレベルまでSodB活性は低下した(図９右)。また、本発明者らは、Mtz耐性株(KS0048 and KS0145)のSodB活性がFurアミノ酸変異に起因して上昇することを実証している（Antioxidants and Redox Signaling, vol. 14, no. 1, pp. 15-23, 2011.）。従って、KS0048及びKS0145で増強されたSodB 活性がNDGAにより抑制されるか否かを試験した。まず、50 μM NDGAへの曝露によりSodB強発現株(ATCC700392 pHel3::sodB)の細胞内Fe2+レベルは、コントロール株(ATCC700392 pHel3 ctrl)に比べ、有意に減少した（図１０上）。同様に、KS0048 及びKS0145の細胞内Fe2+レベルも50 μM NDGA曝露により有意に減少した（図１０上）。その結果、50 μM NDGA曝露により各菌株のSodB活性は、fecA1欠損株（KS0048ΔfecA1及びKS0145ΔfecA1）が示すレベルまで有意に減少した（図１０下）。これらの結果から、NDGAがKS0048及びKS0145の増強されたSodB活性も抑制することが示唆される。 Results H. pylori intracellular Fe 2+ levels and NDGA against SodB active effect Fe 2+ selectively detect for the turn-on fluorescent probe RhoNox-1 effect of NDGA on intracellular Fe 2+ levels using (Chemical Science, vol. 4, no. 3, pp. 1250-1256, 2013). The intracellular Fe 2+ level of H. pylori was significantly reduced in an NDGA dose-dependent manner (FIG. 9 left). The present inventors have already demonstrated that a fecA1-deficient strain shows lower SodB activity than a wild-type strain (Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012. ). Therefore, the effect of NDGA on SodB activity was investigated this time. SodB activity decreased significantly in a dose-dependent manner with exposure to NDGA (Figure 9, right). In addition, the treatment with 50 μM NDGA decreased SodB activity to the level indicated by the fecA1-deficient strain (ΔfecA1) (right side of FIG. 9). In addition, the inventors have demonstrated that the SodB activity of Mtz resistant strains (KS0048 and KS0145) is increased due to Fur amino acid mutation (Antioxidants and Redox Signaling, vol. 14, no. 1, pp 15-23, 2011.). Therefore, it was tested whether the SodB activity enhanced by KS0048 and KS0145 was suppressed by NDGA. First, exposure to 50 μM NDGA significantly decreased the intracellular Fe 2+ level of the SodB strong expression strain (ATCC700392 pHel3 :: sodB) compared to the control strain (ATCC700392 pHel3 ctrl) (upper FIG. 10). Similarly, the intracellular Fe 2+ levels of KS0048 and KS0145 were also significantly reduced by exposure to 50 μM NDGA (upper FIG. 10). As a result, exposure to 50 μM NDGA significantly reduced the SodB activity of each strain to the level indicated by the fecA1-deficient strains (KS0048ΔfecA1 and KS0145ΔfecA1) (bottom of FIG. 10). These results suggest that NDGA also inhibits the enhanced SodB activity of KS0048 and KS0145.
H. pyloriのMtz 感受性に対するNDGAの効果
既に、本発明者らは、KS0048 及びKS0145のfecA1欠損株においてMtzに対するMICが減少することを実証している（Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012）。従って、KS0048及びKS0145のMtz耐性がNDGA処理によって変化するか試験した。50 μM NDGA曝露によりKS0048及びKS0145のMICは、それぞれ、32 μg/mLから8 μg/mL、及び128 μg/mLから16 μg/mLへと減少した(表１)。特に、ATCC700392 pHel3::sodBのMtz耐性は、50 μM NDGA (MIC < 8 μg/mL)での処理により解除された（表１）。 Effect of NDGA on Mtz sensitivity of H. pylori Already, the present inventors have demonstrated that MIC against Mtz is reduced in fecA1-deficient strains of KS0048 and KS0145 (Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no 6, pp. 1003-1010, 2012). Therefore, it was tested whether the Mtz resistance of KS0048 and KS0145 was changed by NDGA treatment. Exposure to 50 μM NDGA decreased the MICs of KS0048 and KS0145 from 32 μg / mL to 8 μg / mL and from 128 μg / mL to 16 μg / mL, respectively (Table 1). In particular, the Mtz resistance of ATCC700392 pHel3 :: sodB was canceled by treatment with 50 μM NDGA (MIC <8 μg / mL) (Table 1).
既に、本発明者らは、KS0048 及びKS0145のfecA1欠損株においてMtzに対するMICが減少することを実証している（Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no. 6, pp. 1003-1010, 2012）。従って、KS0048及びKS0145のMtz耐性がNDGA処理によって変化するか試験した。50 μM NDGA曝露によりKS0048及びKS0145のMICは、それぞれ、32 μg/mLから8 μg/mL、及び128 μg/mLから16 μg/mLへと減少した(表１)。特に、ATCC700392 pHel3::sodBのMtz耐性は、50 μM NDGA (MIC < 8 μg/mL)での処理により解除された（表１）。 Effect of NDGA on Mtz sensitivity of H. pylori Already, the present inventors have demonstrated that MIC against Mtz is reduced in fecA1-deficient strains of KS0048 and KS0145 (Free Radical Biology and Medicine, vol. 52, no 6, pp. 1003-1010, 2012). Therefore, it was tested whether the Mtz resistance of KS0048 and KS0145 was changed by NDGA treatment. Exposure to 50 μM NDGA decreased the MICs of KS0048 and KS0145 from 32 μg / mL to 8 μg / mL and from 128 μg / mL to 16 μg / mL, respectively (Table 1). In particular, the Mtz resistance of ATCC700392 pHel3 :: sodB was canceled by treatment with 50 μM NDGA (MIC <8 μg / mL) (Table 1).
H. pyloriのH2O2感受性に対するNDGAの効果
H. pyloriのSodB強発現株の抗酸化活性をNDGA が抑制するか調べるために、H. pyloriのH2O2感受性をディスクアッセイで試験した。SodB強発現株 (ATCC700392 pHel3::sodB, KS0048、及びKS0145)のH2O2感受性は、NDGA曝露により、容量依存的に有意に上昇した(図１１)。fecA1遺伝子欠損により増強されたH2O2感受性(KS0048ΔfecA1及びKS0145ΔfecA1)は、NDGAにより影響を受けなかった（図１１）。これらの結果から、NDGAは、FecA1の阻害を介してH. pyloriのSodB依存抗酸化活性を低下させているものと考えられる。 Effect of NDGA on H 2 O 2 sensitivity of H. pylori To examine whether NDGA suppresses the antioxidant activity of H. pylori SodB overexpressing strain, H. pylori's H 2 O 2 sensitivity was tested by disc assay . The H 2 O 2 sensitivity of the SodB strong expression strains (ATCC700392 pHel3 :: sodB, KS0048, and KS0145) was significantly increased in a dose-dependent manner by NDGA exposure (FIG. 11). H 2 O 2 sensitivity (KS0048ΔfecA1 and KS0145ΔfecA1) enhanced by fecA1 gene deletion was not affected by NDGA (FIG. 11). From these results, it is considered that NDGA decreases the SodB-dependent antioxidant activity of H. pylori through inhibition of FecA1.
H. pyloriのSodB強発現株の抗酸化活性をNDGA が抑制するか調べるために、H. pyloriのH2O2感受性をディスクアッセイで試験した。SodB強発現株 (ATCC700392 pHel3::sodB, KS0048、及びKS0145)のH2O2感受性は、NDGA曝露により、容量依存的に有意に上昇した(図１１)。fecA1遺伝子欠損により増強されたH2O2感受性(KS0048ΔfecA1及びKS0145ΔfecA1)は、NDGAにより影響を受けなかった（図１１）。これらの結果から、NDGAは、FecA1の阻害を介してH. pyloriのSodB依存抗酸化活性を低下させているものと考えられる。 Effect of NDGA on H 2 O 2 sensitivity of H. pylori To examine whether NDGA suppresses the antioxidant activity of H. pylori SodB overexpressing strain, H. pylori's H 2 O 2 sensitivity was tested by disc assay . The H 2 O 2 sensitivity of the SodB strong expression strains (ATCC700392 pHel3 :: sodB, KS0048, and KS0145) was significantly increased in a dose-dependent manner by NDGA exposure (FIG. 11). H 2 O 2 sensitivity (KS0048ΔfecA1 and KS0145ΔfecA1) enhanced by fecA1 gene deletion was not affected by NDGA (FIG. 11). From these results, it is considered that NDGA decreases the SodB-dependent antioxidant activity of H. pylori through inhibition of FecA1.
Claims (14)
- 鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩を含む宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤。 A sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria dependent on the foreign body exclusion response, containing a compound that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1 or a salt thereof.
- 下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含む宿主異物排除応答依存的グラム陰性病原細菌用除菌剤：
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。 A host foreign substance exclusion response-dependent sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria comprising a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof:
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ]. - グラム陰性病原細菌がヘリコバクターピロリ、サルモネラ菌及び腸管病原性大腸菌からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１又は２に記載の除菌剤。 The disinfectant according to claim 1 or 2, wherein the Gram-negative pathogenic bacterium is at least one selected from the group consisting of Helicobacter pylori, Salmonella and enteropathogenic E. coli.
- 前記化合物又はその塩がノルジヒドログアイヤレチン酸又はその塩である、請求項１～３のいずれか１項に記載の除菌剤。 The disinfectant according to any one of claims 1 to 3, wherein the compound or a salt thereof is nordihydroguaiaretinic acid or a salt thereof.
- 前記化合物又はその塩がセコイソラリシレシノール又はその塩である、請求項１～３のいずれか１項に記載の除菌剤。 The disinfectant according to any one of claims 1 to 3, wherein the compound or a salt thereof is secoisolariciresinol or a salt thereof.
- 前記化合物又はその塩が、2,3,4,4'-テトラヒドロキシジフェニルメタン又はその塩である、請求項１～３のいずれか１項に記載の除菌剤。 The disinfectant according to any one of claims 1 to 3, wherein the compound or a salt thereof is 2,3,4,4'-tetrahydroxydiphenylmethane or a salt thereof.
- 前記化合物又はその塩がテラメプロコール又はその塩である、請求項１～３のいずれか１項に記載の除菌剤。 The disinfectant according to any one of claims 1 to 3, wherein the compound or a salt thereof is terameprocol or a salt thereof.
- 前記化合物又はその塩がフィランチンである、請求項１～３のいずれか１項に記載の除菌剤。 The disinfectant according to any one of claims 1 to 3, wherein the compound or a salt thereof is filantin.
- 患者に鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩を投与する工程を含む、グラム陰性病原細菌を除菌する方法。 A method of sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria, comprising the step of administering to a patient a compound or its salt that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1.
- 患者に、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を投与する工程を含む、グラム陰性病原細菌を除菌する方法：
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。 A method for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria comprising the step of administering to a patient a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof:
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ]. - グラム陰性病原細菌を除菌するための鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩。 A compound or a salt thereof that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1 for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria.
- グラム陰性病原細菌を除菌するための、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩：
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。
ｎが２以上の場合、複数のＲ2は同一でも異なっていてもよい。］。 A compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof for sterilizing Gram-negative pathogenic bacteria:
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
When n is 2 or more, the plurality of R 2 may be the same or different. ]. - グラム陰性病原細菌用除菌剤を製造するための、鉄取り込みトランスポーターFecA1と特異的に結合する化合物又はその塩の使用。 Use of a compound or a salt thereof that specifically binds to the iron uptake transporter FecA1 for producing a sterilizing agent for Gram-negative pathogenic bacteria.
- グラム陰性病原細菌用除菌剤を製造するための、下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩の使用：
該炭素数１～５の直鎖状アルキレン基が置換基を有する場合、該置換基は低級アルキル基、水酸基、低級アルコキシ基、低級ヒドロキシアルキル基及び低級アルコキシ低級アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種を示す。
ｍは１～３を示す。
ｎは１～３を示す。
Ｒ1及びＲ2は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル基を示す。
ｍが２以上の場合、複数のＲ1は同一でも異なっていてもよい。 Use of a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof for producing a disinfectant for Gram-negative pathogenic bacteria:
When the linear alkylene group having 1 to 5 carbon atoms has a substituent, the substituent is selected from the group consisting of a lower alkyl group, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower hydroxyalkyl group, and a lower alkoxy lower alkyl group. Show at least one kind.
m represents 1 to 3.
n represents 1 to 3.
R 1 and R 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a lower alkyl group.
When m is 2 or more, the plurality of R 1 may be the same or different.
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| US20100129302A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-05-27 | Oy Granula Ab Ltd | Antimicrobial composition with low cytotoxicity |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100129302A1 (en) * | 2008-11-25 | 2010-05-27 | Oy Granula Ab Ltd | Antimicrobial composition with low cytotoxicity |
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