WO2015170609A1 - Method for fabricating light-driven high-energy saccharomycotina - Google Patents
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Abstract
Provided are: a method for fabricating light-driven high-energy Saccharomycotina which are capable of converting light energy into intracellular energy; and said light-driven high-energy Saccharomycotina. The present invention is provided by imparting, by bioengineering photosynthesis, a photophosphorylation function to Saccharomycotina, which cannot use light energy. More specifically, rhodopsin, which is a light-driven proton pump protein, and to which a mitrochondria localization signal has been added, is expressed in the mitochondrioa of Saccharomycotina.
Description
本発明は、光のエネルギーを細胞内エネルギーに変換することのできる光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母およびその利用に関する。
The present invention relates to a method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast capable of converting light energy into intracellular energy, a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast, and use thereof.
生体や環境にやさしいクリーンなエネルギーが望まれる時代にあって、無尽蔵に存在する光エネルギーを利用する太陽電池や、光エネルギーを有機物として蓄積した植物体をエネルギー源や化成品の発酵原料として用いようとするバイオリファイナリーの研究が盛んである。また、光合成細菌や藍藻などの光合成能を有する微生物を用いて、光エネルギーを用いて有用物質を生産させる研究が行なわれている。しかし、これらの微生物は概して増殖速度が遅いことや、代謝経路の全貌が不明確であることが、実用化するうえでの課題となっている。一方で、増殖速度が速い大腸菌や出芽酵母などの発酵微生物に代謝工学的な改良を施し、医薬品や食品、化粧品、燃料、ポリマー原料等の様々な有用物質の発酵生産性を向上させる研究が行なわれている。しかし、目的物質の生産性が向上するにつれ、野生株とは異なる偏った負荷を課せられたこれらの発酵微生物が、しばしば細胞内エネルギー（ATP：Adenosine triphosphate）不足に陥り、生育の低下や目的物質の生産性の頭打ちに直面することが多い。
In an era when clean energy friendly to living organisms and the environment is desired, let's use solar cells that use inexhaustible light energy and plants that store light energy as organic matter as energy sources and fermentation raw materials for chemical products The research of the biorefinery that is said to be active. In addition, studies have been conducted to produce useful substances using light energy using microorganisms having photosynthetic ability such as photosynthetic bacteria and cyanobacteria. However, these microorganisms generally have a slow growth rate and the whole picture of metabolic pathways are unclear, which are problems for practical use. On the other hand, research on improving fermentative productivity of various useful substances such as pharmaceuticals, foods, cosmetics, fuels, polymer raw materials, etc. by applying metabolic engineering improvements to fermenting microorganisms such as Escherichia coli and budding yeast that have a fast growth rate. It is. However, as the productivity of the target substance increases, these fermenting microorganisms, which are subject to a biased load different from wild strains, often fall short of intracellular energy (ATP: Adenosine triphosphate), resulting in decreased growth and target substances. Often face productivity peaks.
ロドプシンを光捕獲核酸として組み込んだ微生物が示されており、光捕獲および炭素固定の効率を遺伝的に改善することによって、ならびにフォトバイオリアクター内で増やすための増殖特性を最適化することによって、光合成生物を安定して利用する経路を操作するための方法および組成物について開示がある（特許文献１）。特許文献１では、光独立栄養生物を高光合成生物に変換することを可能にしていることが示されており、段落番号００６２において光独立栄養生物として真核生物の植物および藻類、並びに原核生物のラン藻類、緑色硫黄細胞、緑色非硫黄細胞、紅色硫黄細胞、および紅色非硫黄細胞が例示されている。さらに、段落番号００６３から００７０に至って各種微生物が具体的に例示されているものの、酵母に係る記載はない。
Microorganisms incorporating rhodopsin as a light-capturing nucleic acid have been shown, photosynthesis by genetically improving the efficiency of light-capturing and carbon fixation, and by optimizing growth characteristics to increase within the photobioreactor There is a disclosure about a method and a composition for manipulating a pathway for stably utilizing an organism (Patent Document 1). Patent Document 1 shows that it is possible to convert a photoautotrophic organism into a highly photosynthetic organism. In paragraph No. 0062, eukaryotic plants and algae as well as prokaryotic organisms as photoautotrophic organisms are shown. Cyanobacteria, green sulfur cells, green non-sulfur cells, red sulfur cells, and red non-sulfur cells are illustrated. Further, although various microorganisms are specifically exemplified from paragraph numbers 0063 to 0070, there is no description relating to yeast.
ハロバクテリウム・サリナルム（Halobacterium salinarium）由来の光駆動プロトンタンパク質であるバクテリオロドプシンを、ミトコンドリアに発現させたシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）について開示がある（非特許文献１）。ここでは、モデル生物であるS. pombeを用いて膜タンパク質のプロトン濃度勾配依存的な物質のミトコンドリア輸送活性やミトコンドリアへの局在化やホールディングの研究を行うためのモデルが報告されているが、エネルギー産生に係る記載はない。
There is a disclosure of Schizosaccharomyces pombe in which mitochondria express bacteriorhodopsin, a light-driven proton protein derived from Halobacterium salinarium (Non-patent Document 1). Here, a model for studying mitochondrial transport activity, localization to mitochondria and holding of a substance dependent on the proton concentration gradient of membrane protein using S. pombe , a model organism, has been reported. There is no mention of energy production.
有用物質の発酵生産性を向上し、増殖速度が速く、細胞内エネルギー状態が改善されている微生物の開発が望まれている。
Development of microorganisms that improve the fermentation productivity of useful substances, have a high growth rate, and have improved intracellular energy status is desired.
本発明は、光のエネルギーを細胞内エネルギーに変換することのできる光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法および当該光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を提供することを課題とする。さらに、当該光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を用いたATPの産生方法および産生されたATPを利用する代謝産物の産生方法を提供することを課題とする。
An object of the present invention is to provide a method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast capable of converting light energy into intracellular energy, and the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast. It is another object of the present invention to provide a method for producing ATP using the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast and a method for producing a metabolite using the produced ATP.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、光エネルギーを利用できないサッカロミセス亜門酵母に、光合成生物工学的に光リン酸化能を付与することで光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を創製することにより、光エネルギーを利用可能にする新しい光駆動有用物質生産宿主細胞が得られた。より具体的には、光駆動プロトンポンプタンパク質であるロドプシンにミトコンドリア局在化シグナルを付加したものを、サッカロミセス亜門酵母のミトコンドリアに発現させることで、本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を作製することに成功し、本発明を完成した。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present invention have provided a light-synthesizing biotechnological photophosphorylation ability to Saccharomyces saccharomyces yeast that cannot utilize light energy, thereby producing a light-driven high-energy Saccharomyces. By creating Amon yeast, a new light-driven useful substance-producing host cell that can utilize light energy was obtained. More specifically, the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention can be expressed by expressing in the mitochondria of Saccharomyces saccharomyces yeast the addition of a mitochondrial localization signal to the light-driven proton pump protein rhodopsin. The invention was completed successfully.
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．ロドプシンをコードする核酸およびミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸をサッカロミセス亜門酵母に導入することを特徴とする光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
２．ロドプシンが、デルタロドプシン、バクテリオロドプシン、センサリーロドプシンI、センサリーロドプシンII、プロテオロドプシン、チャンネルロドプシンI、チャンネルロドプシンII、ハロロドプシン、キサントロドプシン、ナトリウムポンプ型ロドプシンから選択されるいずれかのロドプシンである、前項１に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
３．ロドプシンが、デルタロドプシンである、前項２に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
４．デルタロドプシンが、ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンである、前項３に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
５．ミトコンドリア局在化シグナルが、5-アミノレブリン酸シンターゼ由来のシグナルである、前項１～４のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
６．以下の工程を含む、前項４または５に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法：
１）ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンをコードする核酸と5-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
２）上記１）の核酸が組み込まれたサッカロミセス亜門酵母を培養する工程。
７．以下の工程を含む、前項４または５に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法：
１）ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンをコードする核酸を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
２）さらに、5-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
３）上記１）および２）の核酸が組み込まれたサッカロミセス亜門酵母を培養する工程。
８．サッカロミセス亜門酵母が、サッカロミセス・セレビシエである、前項１～７のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
９．前項１～８のいずれかに記載の作製方法により作製された光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１０．デルタロドプシンをコードする核酸と、ミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸が組み込まれてなる光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１１．サッカロミセス亜門酵母に組み込まれたデルタロドプシンをコードする核酸に基づき、当該サッカロミセス亜門酵母のミトコンドリアにデルタロドプシンが発現していることを特徴とする、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１２．デルタロドプシンが、ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンである、前項１０または１１に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１３．ミトコンドリア局在化シグナルが、5-アミノレブリン酸シンターゼ由来のシグナルである、前項１０～１２のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１４．サッカロミセス亜門酵母が、サッカロミセス・セレビシエである、前項１０～１３のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１５．前項９～１４のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を培養することを特徴とする、ATPの産生方法。
１６．前項１５に記載のATPの産生方法により得られるATPを利用することを特徴とする当該光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母代謝産物の産生方法。
１７．光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母代謝産物が、グルタチオン、トレハロースおよび／またはコハク酸である前項１６に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母代謝産物の産生方法。
１８．前項９～１４のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を宿主とし、所望のタンパク質をコードする遺伝子を組込み、培養することを特徴とする所望のタンパク質の製造方法。 That is, this invention consists of the following.
1. A method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast, comprising introducing a nucleic acid encoding rhodopsin and a nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal into Saccharomyces saccharomyces yeast.
2. Rhodopsin is any rhodopsin selected from deltarhodopsin, bacteriorhodopsin, sensory rhodopsin I, sensory rhodopsin II, proteorhodopsin, channelrhodopsin I, channelrhodopsin II, halorhodopsin, xanthrhodopsin, sodium pump rhodopsin A method for producing the light-driven, high-energy Saccharomyces subtilis yeast according toitem 1 above.
3. 3. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to item 2, wherein rhodopsin is deltarhodopsin.
4). 4. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces subtilis yeast according to item 3 above, wherein the deltarhodopsin is a deltarhodopsin derived from Halotherigena tacummenica.
5. 5. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one ofitems 1 to 4, wherein the mitochondrial localization signal is a signal derived from 5-aminolevulinate synthase.
6). 6. A method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according toitem 4 or 5, comprising the following steps:
1) a step of introducing a nucleic acid encoding a deltarhodopsin derived from Halotherigena turkmenica and a nucleic acid encoding a 5-aminolevulinate synthase into Saccharomyces submonas yeast;
2) A step of culturing Saccharomyces subtilis yeast in which the nucleic acid of 1) above is incorporated.
7). 6. A method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according toitem 4 or 5, comprising the following steps:
1) a step of introducing a nucleic acid encoding deltarhodopsin derived from Halotherigena turkmenica into Saccharomyces subtrophic yeast;
2) Furthermore, a step of introducing a nucleic acid encoding 5-aminolevulinate synthase into Saccharomyces subyeast;
3) A step of culturing Saccharomyces subtilis yeast in which the nucleic acids of 1) and 2) are incorporated.
8). 8. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of 1 to 7 above, wherein the Saccharomyces saccharomyces yeast is Saccharomyces cerevisiae.
9. 9. A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast produced by the production method described in any one of 1 to 8 above.
10. A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast comprising a nucleic acid encoding deltarhodopsin and a nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal.
11. A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast, characterized in that deltarhodopsin is expressed in mitochondria of the Saccharomyces saccharomyces yeast based on a nucleic acid encoding deltarhodopsin incorporated into Saccharomyces saccharomyces yeast.
12 12. The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according toitem 10 or 11, wherein the deltarhodopsin is deltarhodopsin derived from Halotherigena turkmenicus.
13. 13. The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of 10 to 12 above, wherein the mitochondrial localization signal is a signal derived from 5-aminolevulinate synthase.
14 14. The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one ofitems 10 to 13, wherein the Saccharomyces saccharomyces yeast is Saccharomyces cerevisiae.
15. 15. A method for producing ATP, comprising culturing the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast according to any one of 9 to 14 above.
16. 16. A method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast metabolite, wherein ATP obtained by the method for producing ATP according toitem 15 is used.
17. 17. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast metabolite according to 16 above, wherein the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast metabolite is glutathione, trehalose and / or succinic acid.
18. 15. A method for producing a desired protein, which comprises incorporating and culturing a gene encoding a desired protein, using the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast according to any one of 9 to 14 as a host.
１．ロドプシンをコードする核酸およびミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸をサッカロミセス亜門酵母に導入することを特徴とする光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
２．ロドプシンが、デルタロドプシン、バクテリオロドプシン、センサリーロドプシンI、センサリーロドプシンII、プロテオロドプシン、チャンネルロドプシンI、チャンネルロドプシンII、ハロロドプシン、キサントロドプシン、ナトリウムポンプ型ロドプシンから選択されるいずれかのロドプシンである、前項１に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
３．ロドプシンが、デルタロドプシンである、前項２に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
４．デルタロドプシンが、ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンである、前項３に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
５．ミトコンドリア局在化シグナルが、5-アミノレブリン酸シンターゼ由来のシグナルである、前項１～４のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
６．以下の工程を含む、前項４または５に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法：
１）ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンをコードする核酸と5-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
２）上記１）の核酸が組み込まれたサッカロミセス亜門酵母を培養する工程。
７．以下の工程を含む、前項４または５に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法：
１）ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンをコードする核酸を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
２）さらに、5-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
３）上記１）および２）の核酸が組み込まれたサッカロミセス亜門酵母を培養する工程。
８．サッカロミセス亜門酵母が、サッカロミセス・セレビシエである、前項１～７のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。
９．前項１～８のいずれかに記載の作製方法により作製された光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１０．デルタロドプシンをコードする核酸と、ミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸が組み込まれてなる光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１１．サッカロミセス亜門酵母に組み込まれたデルタロドプシンをコードする核酸に基づき、当該サッカロミセス亜門酵母のミトコンドリアにデルタロドプシンが発現していることを特徴とする、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１２．デルタロドプシンが、ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンである、前項１０または１１に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１３．ミトコンドリア局在化シグナルが、5-アミノレブリン酸シンターゼ由来のシグナルである、前項１０～１２のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１４．サッカロミセス亜門酵母が、サッカロミセス・セレビシエである、前項１０～１３のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。
１５．前項９～１４のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を培養することを特徴とする、ATPの産生方法。
１６．前項１５に記載のATPの産生方法により得られるATPを利用することを特徴とする当該光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母代謝産物の産生方法。
１７．光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母代謝産物が、グルタチオン、トレハロースおよび／またはコハク酸である前項１６に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母代謝産物の産生方法。
１８．前項９～１４のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を宿主とし、所望のタンパク質をコードする遺伝子を組込み、培養することを特徴とする所望のタンパク質の製造方法。 That is, this invention consists of the following.
1. A method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast, comprising introducing a nucleic acid encoding rhodopsin and a nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal into Saccharomyces saccharomyces yeast.
2. Rhodopsin is any rhodopsin selected from deltarhodopsin, bacteriorhodopsin, sensory rhodopsin I, sensory rhodopsin II, proteorhodopsin, channelrhodopsin I, channelrhodopsin II, halorhodopsin, xanthrhodopsin, sodium pump rhodopsin A method for producing the light-driven, high-energy Saccharomyces subtilis yeast according to
3. 3. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to item 2, wherein rhodopsin is deltarhodopsin.
4). 4. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces subtilis yeast according to item 3 above, wherein the deltarhodopsin is a deltarhodopsin derived from Halotherigena tacummenica.
5. 5. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of
6). 6. A method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to
1) a step of introducing a nucleic acid encoding a deltarhodopsin derived from Halotherigena turkmenica and a nucleic acid encoding a 5-aminolevulinate synthase into Saccharomyces submonas yeast;
2) A step of culturing Saccharomyces subtilis yeast in which the nucleic acid of 1) above is incorporated.
7). 6. A method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to
1) a step of introducing a nucleic acid encoding deltarhodopsin derived from Halotherigena turkmenica into Saccharomyces subtrophic yeast;
2) Furthermore, a step of introducing a nucleic acid encoding 5-aminolevulinate synthase into Saccharomyces subyeast;
3) A step of culturing Saccharomyces subtilis yeast in which the nucleic acids of 1) and 2) are incorporated.
8). 8. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of 1 to 7 above, wherein the Saccharomyces saccharomyces yeast is Saccharomyces cerevisiae.
9. 9. A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast produced by the production method described in any one of 1 to 8 above.
10. A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast comprising a nucleic acid encoding deltarhodopsin and a nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal.
11. A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast, characterized in that deltarhodopsin is expressed in mitochondria of the Saccharomyces saccharomyces yeast based on a nucleic acid encoding deltarhodopsin incorporated into Saccharomyces saccharomyces yeast.
12 12. The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to
13. 13. The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of 10 to 12 above, wherein the mitochondrial localization signal is a signal derived from 5-aminolevulinate synthase.
14 14. The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of
15. 15. A method for producing ATP, comprising culturing the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast according to any one of 9 to 14 above.
16. 16. A method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast metabolite, wherein ATP obtained by the method for producing ATP according to
17. 17. The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast metabolite according to 16 above, wherein the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast metabolite is glutathione, trehalose and / or succinic acid.
18. 15. A method for producing a desired protein, which comprises incorporating and culturing a gene encoding a desired protein, using the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast according to any one of 9 to 14 as a host.
ミトコンドリアでは、電子を内膜に伝達させて、水素イオン（H+：プロトン）を膜間スペース（膜間腔）に輸送し（電子伝達系）、生じるプロトン濃度勾配（電位差、pH差）を用いて、酸化的リン酸化によって共役的にATPの合成が行われる。通常、出芽酵母を含むサッカロミセス亜門酵母は細胞内に光駆動プロトン輸送タンパク質、即ちロドプシンを有さないため、ATPの合成において光エネルギーを利用することはできない。一方、本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母は、ロドプシンをサッカロミセス亜門酵母のミトコンドリアに機能的に発現させることで、光エネルギーを細胞内の化学エネルギーへ変換する機能を有する（図１参照）。本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母によれば、ミトコンドリアに局在しないロドプシンを組み込んだサッカロミセス亜門酵母と比較して、細胞内のATP濃度は約１．５～２倍に高まった。また、産生されたグルタチオンも同様に約２倍に高まった。これらの結果より、本発明の方法により作製された光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母は光駆動高エネルギー宿主細胞として利用可能である。
In mitochondria, electrons are transferred to the inner membrane, hydrogen ions (H + : protons) are transported to the intermembrane space (intermembrane space) (electron transfer system), and the resulting proton concentration gradient (potential difference, pH difference) is used. Thus, ATP is synthesized in a conjugate manner by oxidative phosphorylation. Usually, Saccharomyces subtilis yeast including budding yeast does not have a light-driven proton transport protein, that is, rhodopsin, in the cell, and thus cannot use light energy in the synthesis of ATP. On the other hand, the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention has a function of converting light energy into intracellular chemical energy by functionally expressing rhodopsin in the mitochondria of Saccharomyces saccharomyces yeast (see FIG. 1). ). According to the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention, the intracellular ATP concentration increased by about 1.5 to 2 times compared to Saccharomyces saccharomyces yeast incorporating rhodopsin not localized in mitochondria. Similarly, the amount of glutathione produced increased about twice. From these results, the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast produced by the method of the present invention can be used as a light-driven high-energy host cell.
本発明は、光のエネルギーを細胞内エネルギーに変換することのできる光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母およびその利用に関する。本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母は、ロドプシンのＮ末端にサッカロミセス亜門酵母のミトコンドリア局在化シグナルを付与し、サッカロミセス亜門酵母に導入することで作製することができる。
The present invention relates to a method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast capable of converting light energy into intracellular energy, a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast, and use thereof. The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention can be prepared by adding a mitochondrial localization signal of Saccharomyces saccharomyces yeast to the N-terminus of rhodopsin and introducing it into Saccharomyces saccharomyces yeast.
本明細書において「サッカロミセス亜門酵母」は、サッカロミセス亜門に属する酵母であれば、特に制限はなく、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・フラギリス（Saccharomyces fragilis）、サッカロミセス・ルーキシー（Saccharomyces rouxii）などのサッカロミセス属、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）などのキャンディダ属、ピキア（Pichia）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、ヤロイワ（Yarrowia）属、ハンゼニュラ（Hansenula）属、エンドマイセス（Endomyces）属などの酵母が挙げられる。中でも、サッカロミセス属、キャンディダ属、またはピキア属の酵母が好ましく、サッカロミセス属のサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）、キャンディダ属のキャンディダ・ユーティリス（C. utilis）がより好ましく、最も好ましくはS. cerevisiaeである。出芽酵母を含むサッカロミセス亜門酵母は、物質生産や研究の広範さにおいて分裂酵母よりも実用面での有用性と実験面での利便性を有するという特徴がある。
In the present specification, the “Saccharomyces subtrophic yeast” is not particularly limited as long as it is a yeast belonging to Saccharomyces subtype. For example, Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces fragilis (Saccharomyces fragilis), Saccharomyces genus such as Saccharomyces Rukishi (Saccharomyces rouxii), Candida You Tirith (Candida utilis), the genus Candida, such as Candida tropicalis (Candida tropicalis), Pichia (Pichia) sp., Kluyveromyces ( Examples include yeasts such as Kluyveromyces genus, Yarrowia genus, Hansenula genus and Endomyces genus. Among them, yeasts of the genus Saccharomyces, Candida or Pichia are preferable, Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae) and Candida utilis ( C. utilis ) are more preferable, most preferably S. cerevisiae . Saccharomyces saccharomyces yeast including budding yeast is characterized in that it has practical utility and experimental convenience over fission yeast in a wide range of substance production and research.
本明細書において「ロドプシン」とは、ロドプシンはオプシン（Opsin）というタンパク質とビタミンＡであるレチナール(Retinal）の複合体であり、光受容体タンパク質をいう。ロドプシンの種類としては、例えばデルタロドプシン（Delta-rhodopsin：dR） 、バクテリオロドプシン（アーキアロドプシン、クルックスロドプシンを含む）、センサリーロドプシンI、センサリーロドプシンII、プロテオロドプシン(pR)、チャンネルロドプシンI、チャンネルロドプシンII、ハロロドプシン、キサントロドプシン、ナトリウムポンプ型ロドプシンなどが挙げられる。例えば、デルタロドプシンやバクテリオロドプシンは光照射によりプロトンを細菌の内部から外部へ汲み出す機能を有し、ハロロドプシンは光により塩素イオンを取り込む機能を有する。本発明のロドプシンは、好ましくはデルタロドプシンやバクテリオロドプシンであり、より好ましくはデルタロドプシンである。デルタロドプシンは、ハロテリジェナ・タークメニカ（Haloterrigena turkmenica, Haloterrigenasp. Arg-4）由来のものが挙げられる。大腸菌に発現させたH. turkmenica由来のデルタロドプシンについて報告がある（Biochem Biophys Res Commun 2006, 341: 285-290, GeneBank Accession No. AB00962）。
In the present specification, “rhodopsin” is a complex of a protein called Opsin and retinal which is vitamin A, and refers to a photoreceptor protein. Examples of the rhodopsin include delta-rhodopsin (Delta-rhodopsin: dR), bacteriorhodopsin (including archaloghodopsin and crux-rhodopsin), sensory rhodopsin I, sensory rhodopsin II, proteorhodopsin (pR), channel rhodopsin I, channel Examples include rhodopsin II, halorhodopsin, xanthrodopsin, and sodium pump rhodopsin. For example, deltarhodopsin and bacteriorhodopsin have a function of pumping protons from the inside of bacteria to the outside by light irradiation, and halorhodopsin has a function of taking in chloride ions by light. The rhodopsin of the present invention is preferably deltarhodopsin or bacteriorhodopsin, more preferably deltarhodopsin. Deltarhodopsin is derived from Haloterrigena turkmenica , Haloterrigenasp. Arg-4. There is a report on deltarhodopsin derived from H. turkmenica expressed in E. coli (Biochem Biophys Res Commun 2006, 341: 285-290, GeneBank Accession No. AB00962).
本明細書において、「ロドプシンをコードする核酸」とは、上述のロドプシンを発現可能な配列からなる核酸をいう。また、発現されるロドプシンは、必ずしも完全長のロドプシンでなくてもよく、光エネルギーにより活性化し、電子伝達機構の活性化によりプロトン濃度勾配やATPなどの細胞内エネルギーが産生しうる長さであればよい。このような機能を有するロドプシンをコードする核酸であればよい。
In this specification, “nucleic acid encoding rhodopsin” refers to a nucleic acid comprising a sequence capable of expressing rhodopsin. In addition, the expressed rhodopsin does not necessarily have to be full-length rhodopsin, as long as it is activated by light energy and can generate intracellular energy such as proton concentration gradient and ATP by activating the electron transfer mechanism. That's fine. Any nucleic acid encoding rhodopsin having such a function may be used.
本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母は、上記サッカロミセス亜門酵母に導入したロドプシンを、サッカロミセス亜門酵母ミトコンドリアの内膜に発現させることで達成される。ロドプシンをサッカロミセス亜門酵母ミトコンドリア内膜に発現させる方法として、ロドプシンをコードする核酸と共にミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸をサッカロミセス亜門酵母に導入することによって達成される。本明細書において、「ミトコンドリア局在化シグナル」とは、サッカロミセス亜門酵母のミトコンドリアに局在的に発現していることが知られているタンパク質のＮ末端シグナル配列であればよく特に限定されない。例えば、ヘム合成経路の酵素である5-アミノレブリン酸シンターゼ（ALA合成酵素）由来のシグナル配列を利用することができ、より具体的にはALA合成酵素Hem1のＮ末端シグナル配列が挙げられる。ALA合成酵素Hem1のＮ末端シグナル配列を利用することができる。
The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention is achieved by expressing rhodopsin introduced into the Saccharomyces saccharomyces yeast in the inner membrane of the Saccharomyces saccharomyces yeast. As a method of expressing rhodopsin in the inner mitochondrial membrane of Saccharomyces cerevisiae yeast, it is achieved by introducing a nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal together with a nucleic acid encoding rhodopsin into Saccharomyces cerevisiae yeast. In the present specification, the “mitochondrial localization signal” is not particularly limited as long as it is an N-terminal signal sequence of a protein known to be locally expressed in mitochondria of Saccharomyces subtrophic yeast. For example, a signal sequence derived from 5-aminolevulinate synthase (ALA synthase), which is an enzyme in the heme synthesis pathway, can be used, and more specifically, an N-terminal signal sequence of ALA synthase Hem1. The N-terminal signal sequence of ALA synthase Hem1 can be used.
本明細書において、ミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸とは、上述のミトコンドリア局在化シグナルを発現可能な配列を含む核酸であればよく、特に制限されない。ミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸は、具体的には例えばALA合成酵素Hem1のＮ末端シグナル配列としては、開始コドンから制限酵素StuIサイトまでのALA合成酵素Hem1のＮ末端シグナル配列を利用することができる。
In the present specification, the nucleic acid encoding the mitochondrial localization signal may be any nucleic acid containing a sequence capable of expressing the mitochondrial localization signal, and is not particularly limited. The nucleic acid encoding the mitochondrial localization signal specifically uses, for example, the N-terminal signal sequence of ALA synthase Hem1 from the start codon to the restriction enzyme StuI site as the N-terminal signal sequence of ALA synthase Hem1 Can do.
本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母は、具体的には、以下の１）および２）の工程によって作製することができる。
１）「ロドプシンをコードする核酸」と「ミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸」を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
２）上記１）の核酸が組み込まれたサッカロミセス亜門酵母を培養する工程。 Specifically, the light-driven high energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention can be produced by the following steps 1) and 2).
1) introducing a “nucleic acid encoding rhodopsin” and a “nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal” into Saccharomyces submonas yeast;
2) A step of culturing Saccharomyces subtilis yeast in which the nucleic acid of 1) above is incorporated.
１）「ロドプシンをコードする核酸」と「ミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸」を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
２）上記１）の核酸が組み込まれたサッカロミセス亜門酵母を培養する工程。 Specifically, the light-driven high energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention can be produced by the following steps 1) and 2).
1) introducing a “nucleic acid encoding rhodopsin” and a “nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal” into Saccharomyces submonas yeast;
2) A step of culturing Saccharomyces subtilis yeast in which the nucleic acid of 1) above is incorporated.
「ロドプシンをコードする核酸」および「ミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸」のサッカロミセス亜門酵母への導入の方法は、自体公知の方法により導入することができる。例えばこれらの核酸を発現しうる発現ベクターをサッカロミセス亜門酵母へ導入することにより行うことができる。「ロドプシンをコードする核酸」および／または「ミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸」を挿入する発現ベクターは、宿主であるサッカロミセス亜門酵母において複製保持され、上記遺伝子を発現し得る自律複製型ベクターであってもよいし、サッカロミセス亜門酵母の染色体に組み込まれる、染色体組み込み型プラスミドベクターであってもよい。自律複製型ベクターおよび染色体組み込み型プラスミドベクターは、宿主であるサッカロミセス亜門酵母において保持され、かつ機能するものであれば制限なく利用することができる。ベクターとしては、例えば、pGYRや酵母由来のプラスミドYEp352GAP、YEp51、pSH19などを挙げることができる。染色体組み込み型プラスミドベクターとしては、pAURなどを挙げることができる。調製したプラスミドベクターは自体公知の方法、例えば酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法等の手法によりサッカロミセス亜門酵母に導入し、形質転換体を作製することができる。
The method of introducing “a nucleic acid encoding rhodopsin” and “a nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal” into Saccharomyces cerevisiae yeast can be introduced by a method known per se. For example, it can be carried out by introducing an expression vector capable of expressing these nucleic acids into Saccharomyces subtrophic yeast. An expression vector into which a “rhodopsin-encoding nucleic acid” and / or a “mitochondrial localization signal-encoding nucleic acid” is inserted is an autonomously replicating vector that can be replicated and expressed in the host Saccharomyces subtrophic yeast and express the gene. Alternatively, it may be a chromosomally integrated plasmid vector that is integrated into the chromosome of Saccharomyces submonas yeast. An autonomously replicating vector and a chromosomally integrated plasmid vector can be used without limitation as long as they are retained and function in the host Saccharomyces subtrophic yeast. Examples of the vector include pGYR and yeast-derived plasmids YEp352GAP, YEp51, and pSH19. Examples of the chromosomal integration plasmid vector include pAUR. The prepared plasmid vector can be introduced into Saccharomyces subtrophic yeast by a method known per se, for example, a lithium acetate method, an electroporation method, a spheroplast method, or the like to produce a transformant.
形質転換体からなるサッカロミセス亜門酵母を常法により、培養、増殖させることで「光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母」を回収することができる。培養の条件は、酵母形質転換体の生育に適した条件において適宜設定することができる。形質転換体の培養に用いる栄養培地としては、炭素源、窒素源、無機物、および必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養法としては、特に限定されないが、液体培養法がよく、回分培養、流加培養、連続培養または灌流培養のいずれを用いてもよい。工業的には通気攪拌培養法が好ましい。培養温度とpHは、使用する形質転換体の増殖に最も適した条件を選べばよい。培養時間は微生物が増殖し始める時間以上の時間であればよい。例えば、温度20～40℃、好ましくは25～35℃、pH 2～9、好ましくは5～8、培養日数0.5～7日間から選ばれる条件で振盪または通気攪拌して培養することができる。サッカロミセス亜門酵母の増殖を確認する方法は特に制限はないが、たとえば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、0.5～20ppmが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加することができる。
The “light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast” can be recovered by culturing and growing the Saccharomyces saccharomyces yeast comprising the transformant by a conventional method. The culture conditions can be appropriately set under conditions suitable for the growth of yeast transformants. The nutrient medium used for culturing the transformant may be either a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and, if necessary, micronutrients required by the strain used. . The culture method is not particularly limited, but a liquid culture method is preferable, and batch culture, fed-batch culture, continuous culture, or perfusion culture may be used. Industrially, the aeration stirring culture method is preferable. The culture temperature and pH may be selected under conditions most suitable for the growth of the transformant to be used. The culture time may be a time longer than the time when the microorganisms start to grow. For example, the culture can be performed with shaking or aeration and stirring under conditions selected from a temperature of 20 to 40 ° C., preferably 25 to 35 ° C., pH 2 to 9, preferably 5 to 8, and a culture period of 0.5 to 7 days. The method for confirming the growth of Saccharomyces submonas yeast is not particularly limited. For example, the culture may be collected and observed with a microscope, or may be observed with absorbance. The dissolved oxygen concentration in the culture solution is not particularly limited, but usually 0.5 to 20 ppm is preferable. Therefore, the amount of ventilation can be adjusted, stirred, and oxygen can be added to the ventilation.
本発明は、「光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母」にも及ぶ。光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母は、製法に限定されず、ロドプシンをコードする核酸およびミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸が組み込まれてなる光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母であればよいが、好適には上記方法により作製された光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母である。さらに本発明は、サッカロミセス亜門酵母に組み込まれたデルタロドプシンをコードする核酸に基づき、当該サッカロミセス亜門酵母のミトコンドリアにデルタロドプシンが発現していることを特徴とする、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母にも及ぶ。
The present invention extends to “light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast”. The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast is not limited to the production method, but may be a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast that incorporates a nucleic acid encoding rhodopsin and a nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal, A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast produced by the above method is preferred. Furthermore, the present invention relates to a light-driven high-energy Saccharomyces subtilis characterized in that the deltarhodopsin is expressed in the mitochondria of the Saccharomyces saccharomyces yeast based on a nucleic acid encoding deltarhodopsin incorporated into Saccharomyces saccharomyces yeast. It extends to yeast.
本発明の「光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母」は、サッカロミセス亜門酵母のミトコンドリア内膜にロドプシンを発現させたものであるので、当該ミトコンドリアに本来の酸化的リン酸化に加え、光駆動ATP合成能が付与されているものである（図１参照）。この光駆動ATP合成ミトコンドリアを保持した酵母を用いて、ATP駆動反応によって有用物質を産生させることもできる。具体的には、その生合成において直接または間接的にATPをエネルギー源とする、工業上有用とされている物質であればいずれでもよく、該物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸、生理活性低分子化合物および脂質などをあげることができる。より具体的には以下があげられる。タンパク質としては、イノシンキナーゼ、Glutamate 5-kinase (EC 2.7.2.11)、Glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.41)、Pyrroline-5-carboxylate reductase (EC 1.5.1.2)、γ－グルタミルシステイン合成酵素(EC 6.3.2.2)、グルタチオン合成酵素(EC 6.3.2.3)、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、キシロースレダクターゼ、Ｐ４５０などをあげることができる。ペプチドとしてはグルタチオン、アラニルグルタミンなどをあげることができ、ポリペプチドとしては、ポリリジン、ポリグルタミン酸をあげることができる。アミノ酸としては、L-アラニン、グリシン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-リジン、L-メチオニン、L-スレオニン、L-ロイシン、L-バリン、L-イソロイシン、L-プロリン、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-フェニルアラニン、L-セリン、L-システイン、L-3-ヒドロキシプロリン、L-4-ヒドロキシプロリン、5-アミノレブリン酸などをあげることができる。核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸などをあげることができる。ビタミンとしては、リボフラビン、チアミン、アスコルビン酸などをあげることができる。糖としては、トレハロース、キシロースなどをあげることができ、糖アルコールとしては、キシリトールなどをあげることができ、アルコールとしてはエタノールなどをあげることができ、有機酸としては乳酸、コハク酸などをあげることができる。生理活性低分子化合物としてはグルタチオン、S-アデノシルメチオニンなどをあげることができ、脂質としては、EPA（エイコサペンタエン酸）やDHA（ドコサヘキサエン酸）などをあげることができる。
Since the “light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast” of the present invention expresses rhodopsin in the mitochondrial inner membrane of Saccharomyces saccharomyces yeast, in addition to the original oxidative phosphorylation in the mitochondria, light-driven ATP synthesis Performance is given (see FIG. 1). A useful substance can be produced by an ATP-driven reaction using yeast that retains this light-driven ATP synthetic mitochondria. Specifically, it may be any industrially useful substance that uses ATP as an energy source directly or indirectly in its biosynthesis, such as a protein, peptide, amino acid, nucleic acid, Examples thereof include vitamins, sugars, sugar alcohols, alcohols, organic acids, physiologically active low molecular weight compounds, and lipids. More specifically, the following can be mentioned. Proteins include inosine kinase, Glutamate 5-kinase (EC 2.7.2.11), Glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.41), Pyrroline-5-carboxylate reductase (EC 1.5.1.2), γ-glutamylcysteine synthase (EC 6.3.2.2), glutathione synthase (EC 6.3.2.3), human granulocyte colony-stimulating factor, xylose reductase, P450 and the like. Examples of the peptide include glutathione and alanylglutamine, and examples of the polypeptide include polylysine and polyglutamic acid. Amino acids include L-alanine, glycine, L-glutamine, L-glutamic acid, L-asparagine, L-aspartic acid, L-lysine, L-methionine, L-threonine, L-leucine, L-valine, L-isoleucine , L-proline, L-histidine, L-arginine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-serine, L-cysteine, L-3-hydroxyproline, L-4-hydroxyproline, 5-aminolevulin Acids can be raised. Examples of nucleic acids include inosine, guanosine, inosinic acid, guanylic acid and the like. Examples of vitamins include riboflavin, thiamine, and ascorbic acid. Examples of the sugar include trehalose and xylose, examples of the sugar alcohol include xylitol, examples of the alcohol include ethanol, and examples of the organic acid include lactic acid and succinic acid. Can do. Examples of the physiologically active low molecular weight compound include glutathione and S-adenosylmethionine, and examples of the lipid include EPA (eicosapentaenoic acid) and DHA (docosahexaenoic acid).
本発明は、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を培養することを特徴とする、ATPの産生方法にもおよび、当該光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母から産生される有用産物、即ちATPをエネルギー源とする代謝産物、例えばグルタチオンの産生方法にも及ぶ。ATPをエネルギー源とするグルタチオンの産生概念図を図２に示す。
The present invention also relates to a method for producing ATP, characterized by culturing a light-driven high-energy Saccharomyces sub-yeast, and a useful product produced from the light-driven high-energy Saccharomyces sub-yeast, that is, ATP as an energy source. And the production method of metabolites such as glutathione. A conceptual diagram of production of glutathione using ATP as an energy source is shown in FIG.
本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母によれば、ミトコンドリアに局在しないロドプシンを組み込んだサッカロミセス亜門酵母と比較して、細胞内のATP濃度は約１．５～２倍に高いものを得ることができる。従来の発酵生産プロセスでは、酵母を用いて遺伝子組換え技術や代謝等により得られる目的物質の生産性が向上するにつれ、生存環境や野生株とは異なる偏った負荷を課せられたこれらの発酵微生物が、しばしば細胞内エネルギー（ATP）不足に陥り、生育の低下や目的物質の生産性の頭打ちに直面することが多かった。一方、本発明の方法により作製された光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母は、このような問題を解決し、生育が優れ、目的物質の高い生産性が期待される。本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母は、光駆動高エネルギー宿主細胞としても利用可能である。本発明は、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を宿主とし、所望のタンパク質をコードする遺伝子を組込み、培養することを特徴とする所望のタンパク質の製造方法にも及ぶ。
According to the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention, the intracellular ATP concentration is about 1.5 to 2 times higher than that of Saccharomyces saccharomyces yeast incorporating rhodopsin not localized in mitochondria. Obtainable. In the conventional fermentation production process, these fermenting microorganisms that are subject to a biased load different from the living environment and wild strains as yeast improves the productivity of the target substance obtained by genetic recombination technology, metabolism, etc. However, they often fell short of intracellular energy (ATP) and faced a decline in growth and the productivity of the target substance. On the other hand, the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast produced by the method of the present invention solves such problems and is expected to have excellent growth and high productivity of the target substance. The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention can also be used as a light-driven high-energy host cell. The present invention also extends to a method for producing a desired protein, characterized by incorporating and culturing a gene encoding a desired protein using a light-driven high-energy Saccharomyces sub-yeast yeast as a host.
本発明の理解を深めるために、本発明の内容を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。
In order to deepen the understanding of the present invention, the contents of the present invention will be specifically described with reference to examples. However, it is obvious that the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製
本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を、Saccharomyces cerevisiae BY4741（ATCC201388）を用いて作製した。S. cerevisiae BY4741のミトコンドリアにデルタロドプシン（以下、デルタロドプシンを単に「dR」ともいう。）を発現させた。 (Example 1) Production of light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention was produced using Saccharomyces cerevisiae B Y4741 (ATCC201388). Deltarhodopsin (hereinafter referred to simply as “dR”) was expressed in mitochondria of S. cerevisiae BY4741.
本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を、Saccharomyces cerevisiae BY4741（ATCC201388）を用いて作製した。S. cerevisiae BY4741のミトコンドリアにデルタロドプシン（以下、デルタロドプシンを単に「dR」ともいう。）を発現させた。 (Example 1) Production of light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention was produced using Saccharomyces cerevisiae B Y4741 (ATCC201388). Deltarhodopsin (hereinafter referred to simply as “dR”) was expressed in mitochondria of S. cerevisiae BY4741.
１）pGK426-dRcytの作製
H. turkmenica (JCM 9743, Riken BRC)由来のdRをコードする核酸(DNA)を、以下に示すプライマーを用いてPCRにより増幅して得た。
5'- GGCAGTCGACATGTGTTACGCTGCTCTAGC-3'（配列番号１）（SalI制限酵素認識部位下線）
5'- ATCTAGATCAGGTCGGGGCAGCCGTCG-3' （配列番号２）（XbaI制限酵素認識部位下線）
増幅して得たDNAをSalI制限酵素およびXbaI制限酵素を用いて消化し、pGK426ベクターに導入し、pGK426-dRcytを作製した。 1) Preparation of pGK426-dRcyt A nucleic acid (DNA) encoding dR derived from H. turkmenica (JCM 9743, Riken BRC) was obtained by PCR amplification using the primers shown below.
5'-GGCA GTCGACA TGTGTTACGCTGCTCTAGC-3 '(SEQ ID NO: 1) (SalI restriction enzyme recognition site underlined)
5'- A TCTAGA TCAGGTCGGGGCAGCCGTCG-3 '(SEQ ID NO: 2) (XbaI restriction enzyme recognition site underlined)
The amplified DNA was digested with SalI restriction enzyme and XbaI restriction enzyme and introduced into pGK426 vector to prepare pGK426-dRcyt.
H. turkmenica (JCM 9743, Riken BRC)由来のdRをコードする核酸(DNA)を、以下に示すプライマーを用いてPCRにより増幅して得た。
5'- GGCAGTCGACATGTGTTACGCTGCTCTAGC-3'（配列番号１）（SalI制限酵素認識部位下線）
5'- ATCTAGATCAGGTCGGGGCAGCCGTCG-3' （配列番号２）（XbaI制限酵素認識部位下線）
増幅して得たDNAをSalI制限酵素およびXbaI制限酵素を用いて消化し、pGK426ベクターに導入し、pGK426-dRcytを作製した。 1) Preparation of pGK426-dRcyt A nucleic acid (DNA) encoding dR derived from H. turkmenica (JCM 9743, Riken BRC) was obtained by PCR amplification using the primers shown below.
5'-GGCA GTCGACA TGTGTTACGCTGCTCTAGC-3 '(SEQ ID NO: 1) (SalI restriction enzyme recognition site underlined)
5'- A TCTAGA TCAGGTCGGGGCAGCCGTCG-3 '(SEQ ID NO: 2) (XbaI restriction enzyme recognition site underlined)
The amplified DNA was digested with SalI restriction enzyme and XbaI restriction enzyme and introduced into pGK426 vector to prepare pGK426-dRcyt.
２）pGK426-dRmitの作製
S. cerevisiaeのミトコンドリア局在化シグナルとして、ALA合成酵素Hem1をコードする核酸(DNA)、即ちhem1遺伝子(DNA)を用いた。以下に示すプライマーを用いてPCRにより増幅して得た。
5'-GGCCGCTAGCATGCAACGCTCCATTTTTGC-3'（配列番号３） （NheI制限酵素認識部位下線）
5'-GGCCGGATCCTTACTGCTTGATACCACTAGAAAC-3'（配列番号４）
増幅して得たDNAをNheI制限酵素およびStuI制限酵素を用いて消化し、上記１）で作製したpGK426-dRcytに導入し、pGK426-dRmitを得た。 2) Preparation of pGK426-dRmit As a mitochondrial localization signal of S. cerevisiae , a nucleic acid (DNA) encoding ALA synthase Hem1, ie, hem1 gene (DNA) was used. Amplified by PCR using the primers shown below.
5'-GGCC GCTAGC ATGCAACGCTCCATTTTTGC-3 '(SEQ ID NO: 3) (NheI restriction enzyme recognition site underlined)
5'-GGCCGGATCCTTACTGCTTGATACCACTAGAAAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
The amplified DNA was digested with NheI restriction enzyme and StuI restriction enzyme and introduced into pGK426-dRcyt prepared in 1) above to obtain pGK426-dRmit.
S. cerevisiaeのミトコンドリア局在化シグナルとして、ALA合成酵素Hem1をコードする核酸(DNA)、即ちhem1遺伝子(DNA)を用いた。以下に示すプライマーを用いてPCRにより増幅して得た。
5'-GGCCGCTAGCATGCAACGCTCCATTTTTGC-3'（配列番号３） （NheI制限酵素認識部位下線）
5'-GGCCGGATCCTTACTGCTTGATACCACTAGAAAC-3'（配列番号４）
増幅して得たDNAをNheI制限酵素およびStuI制限酵素を用いて消化し、上記１）で作製したpGK426-dRcytに導入し、pGK426-dRmitを得た。 2) Preparation of pGK426-dRmit As a mitochondrial localization signal of S. cerevisiae , a nucleic acid (DNA) encoding ALA synthase Hem1, ie, hem1 gene (DNA) was used. Amplified by PCR using the primers shown below.
5'-GGCC GCTAGC ATGCAACGCTCCATTTTTGC-3 '(SEQ ID NO: 3) (NheI restriction enzyme recognition site underlined)
5'-GGCCGGATCCTTACTGCTTGATACCACTAGAAAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
The amplified DNA was digested with NheI restriction enzyme and StuI restriction enzyme and introduced into pGK426-dRcyt prepared in 1) above to obtain pGK426-dRmit.
３）形質転換体の作製
酢酸リチウム法によりS. cerevisiae BY4741（ATCC201388）上述の各ベクターを導入し、形質転換を行った。得られたS. cerevisiae 形質転換体を各々「dRcyt」、「dRmit」といい、以下の各実験例に供し、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の確認を行った。
４）上記S. cerevisiae 形質転換体を合成デキストロース（SD）培地中で30℃で24時間好気的に培養し、本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を作製した。 3) Preparation of transformant S. cerevisiae BY4741 (ATCC201388) Each of the above-mentioned vectors was introduced by the lithium acetate method for transformation. The obtained S. cerevisiae transformants were referred to as “dRcyt” and “dRmit”, respectively, and were used in the following experimental examples to confirm light-driven high-energy Saccharomyces submonas yeast.
4) The above S. cerevisiae transformant was aerobically cultured at 30 ° C. for 24 hours in a synthetic dextrose (SD) medium to produce the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast of the present invention.
酢酸リチウム法によりS. cerevisiae BY4741（ATCC201388）上述の各ベクターを導入し、形質転換を行った。得られたS. cerevisiae 形質転換体を各々「dRcyt」、「dRmit」といい、以下の各実験例に供し、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の確認を行った。
４）上記S. cerevisiae 形質転換体を合成デキストロース（SD）培地中で30℃で24時間好気的に培養し、本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を作製した。 3) Preparation of transformant S. cerevisiae BY4741 (ATCC201388) Each of the above-mentioned vectors was introduced by the lithium acetate method for transformation. The obtained S. cerevisiae transformants were referred to as “dRcyt” and “dRmit”, respectively, and were used in the following experimental examples to confirm light-driven high-energy Saccharomyces submonas yeast.
4) The above S. cerevisiae transformant was aerobically cultured at 30 ° C. for 24 hours in a synthetic dextrose (SD) medium to produce the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast of the present invention.
（実験例１）酵母ミトコンドリアでのdR発現の確認
本実験例では、dRmitを用いて、酵母ミトコンドリアでのdRの発現を確認した。 dRmitの細胞内局在を分析するために、EGFP（緑色蛍光タンパク質）は、dRのC末端にタグ付けした。ミトコンドリアは、ミトトラッカーレッドCMXRos 、特にミトコンドリアを染色する蛍光色素で染色した。図３に示すように、EGFPからの強い蛍光はミトコンドリア内で観察された。この結果から、dRmitが正常に発現し、S. cerevisiaeのミトコンドリアに局在していることが示唆された。このことより、酵母の細胞質でdRを発現するdRcytと区別された。 (Experimental example 1) Confirmation of dR expression in yeast mitochondria In this experimental example, the expression of dR in yeast mitochondria was confirmed using dRmit. To analyze the intracellular localization of dRmit, EGFP (green fluorescent protein) was tagged to the C-terminus of dR. Mitochondria were stained with mitotracker red CMXRos, particularly fluorescent dyes that stain mitochondria. As shown in FIG. 3, strong fluorescence from EGFP was observed in mitochondria. These results suggest that dRmit is normally expressed and is localized in mitochondria of S. cerevisiae . This was distinguished from dRcyt expressing dR in the cytoplasm of yeast.
本実験例では、dRmitを用いて、酵母ミトコンドリアでのdRの発現を確認した。 dRmitの細胞内局在を分析するために、EGFP（緑色蛍光タンパク質）は、dRのC末端にタグ付けした。ミトコンドリアは、ミトトラッカーレッドCMXRos 、特にミトコンドリアを染色する蛍光色素で染色した。図３に示すように、EGFPからの強い蛍光はミトコンドリア内で観察された。この結果から、dRmitが正常に発現し、S. cerevisiaeのミトコンドリアに局在していることが示唆された。このことより、酵母の細胞質でdRを発現するdRcytと区別された。 (Experimental example 1) Confirmation of dR expression in yeast mitochondria In this experimental example, the expression of dR in yeast mitochondria was confirmed using dRmit. To analyze the intracellular localization of dRmit, EGFP (green fluorescent protein) was tagged to the C-terminus of dR. Mitochondria were stained with mitotracker red CMXRos, particularly fluorescent dyes that stain mitochondria. As shown in FIG. 3, strong fluorescence from EGFP was observed in mitochondria. These results suggest that dRmit is normally expressed and is localized in mitochondria of S. cerevisiae . This was distinguished from dRcyt expressing dR in the cytoplasm of yeast.
（実験例２）S. cerevisiae BY4741形質転換体の増殖
本実験例ではdRmitおよびdRcytについて、各種ストレスを与えて培養したときの増殖能を確認した（図４Ａ，Ｂ，Ｃ）。各培養は、原則として10μMのtrans-レチナールを含むSD培地中で、dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、30℃、撹拌175 rpmの好気条件で24～96時間行なった。 (Experimental example 2) Proliferation of S. cerevisiae BY4741 transformant In this experimental example, dRmit and dRcyt were confirmed to proliferate when cultured under various stresses (FIGS. 4A, B, and C). Each culture is performed in SD medium containing 10 μM trans-retinal in principle under conditions of light irradiation of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) under aerobic conditions of 30 ° C. and stirring of 175 rpm. Performed for ~ 96 hours.
本実験例ではdRmitおよびdRcytについて、各種ストレスを与えて培養したときの増殖能を確認した（図４Ａ，Ｂ，Ｃ）。各培養は、原則として10μMのtrans-レチナールを含むSD培地中で、dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、30℃、撹拌175 rpmの好気条件で24～96時間行なった。 (Experimental example 2) Proliferation of S. cerevisiae BY4741 transformant In this experimental example, dRmit and dRcyt were confirmed to proliferate when cultured under various stresses (FIGS. 4A, B, and C). Each culture is performed in SD medium containing 10 μM trans-retinal in principle under conditions of light irradiation of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) under aerobic conditions of 30 ° C. and stirring of 175 rpm. Performed for ~ 96 hours.
１）各種光照射強度条件による培養
dRmitについて、各種光照射強度条件で培養したときの増殖を確認した。光の照射は、 darkness (=0μmol m-2 s-1), dim light (=0.04μmol m-2 s-1) およびbright light (=100μmol m-2 s-1)とした。増殖度は培養液の菌体濃度（OD600）測定値より確認した。その結果、各種光照射強度の違いによるdRmitの増殖度に違いは殆ど認められなかった（図４Ａ）。 1) Culture under various light irradiation intensity conditions For dRmit, proliferation was confirmed when cultured under various light irradiation intensity conditions. The light irradiation was darkness (= 0 μmol m −2 s −1 ), dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) and bright light (= 100 μmol m −2 s −1 ). The degree of proliferation was confirmed from the measured cell concentration (OD 600 ) of the culture solution. As a result, almost no difference was observed in the degree of proliferation of dRmit due to the difference in various light irradiation intensities (FIG. 4A).
dRmitについて、各種光照射強度条件で培養したときの増殖を確認した。光の照射は、 darkness (=0μmol m-2 s-1), dim light (=0.04μmol m-2 s-1) およびbright light (=100μmol m-2 s-1)とした。増殖度は培養液の菌体濃度（OD600）測定値より確認した。その結果、各種光照射強度の違いによるdRmitの増殖度に違いは殆ど認められなかった（図４Ａ）。 1) Culture under various light irradiation intensity conditions For dRmit, proliferation was confirmed when cultured under various light irradiation intensity conditions. The light irradiation was darkness (= 0 μmol m −2 s −1 ), dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) and bright light (= 100 μmol m −2 s −1 ). The degree of proliferation was confirmed from the measured cell concentration (OD 600 ) of the culture solution. As a result, almost no difference was observed in the degree of proliferation of dRmit due to the difference in various light irradiation intensities (FIG. 4A).
２）好気条件による培養
dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、好気条件（撹拌175 rpm）によりdRcytおよびdRmitの培養を行った。その結果、dRcytおよびdRmitの増殖に違いは殆ど認められなかった（図４Ｂ）。 2) Culture under aerobic conditions dRcyt and dRmit were cultured under aerobic conditions (stirring 175 rpm) under light irradiation conditions of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ). As a result, almost no difference was observed in the proliferation of dRcyt and dRmit (FIG. 4B).
dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、好気条件（撹拌175 rpm）によりdRcytおよびdRmitの培養を行った。その結果、dRcytおよびdRmitの増殖に違いは殆ど認められなかった（図４Ｂ）。 2) Culture under aerobic conditions dRcyt and dRmit were cultured under aerobic conditions (stirring 175 rpm) under light irradiation conditions of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ). As a result, almost no difference was observed in the proliferation of dRcyt and dRmit (FIG. 4B).
３）嫌気的条件による培養
培養液中の酸素の代わりにN2を密閉した培養容器に充填させ、dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、嫌気的条件によりdRcytおよびdRmitの培養を行った。
その結果、dRcytおよびdRmitの増殖に違いは殆ど認められなかった（図４Ｃ）。 3) Cultivation under anaerobic conditions N 2 instead of oxygen in the culture solution is filled into a sealed culture vessel, and dim light (= 0.04μmol m -2 s -1 ) is applied under anaerobic conditions. dRcyt and dRmit were cultured.
As a result, almost no difference was observed in the proliferation of dRcyt and dRmit (FIG. 4C).
培養液中の酸素の代わりにN2を密閉した培養容器に充填させ、dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、嫌気的条件によりdRcytおよびdRmitの培養を行った。
その結果、dRcytおよびdRmitの増殖に違いは殆ど認められなかった（図４Ｃ）。 3) Cultivation under anaerobic conditions N 2 instead of oxygen in the culture solution is filled into a sealed culture vessel, and dim light (= 0.04μmol m -2 s -1 ) is applied under anaerobic conditions. dRcyt and dRmit were cultured.
As a result, almost no difference was observed in the proliferation of dRcyt and dRmit (FIG. 4C).
（実験例３）S. cerevisiae BY4741形質転換体の増殖（２）
本実験例では、dRmitおよびdRcytについて、ミトコンドリア呼吸鎖酵素阻害剤を加えた条件下で培養したときの増殖能を確認した。ミトコンドリア呼吸系におけるプロトンポンプ阻害剤であるアンチマイシンＡ（antimycin A）または、F0F1-ATP合成酵素阻害剤であるCCCP（carbonylcyanide-mchlorophenylhydrazone）若しくはDCCD（N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide）の存在下で培養したときの増殖能を確認した。dRmitおよびdRcytの培養は、10μMのtrans-レチナールを含むSD培地中で、dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、30℃、撹拌175 rpmの条件で24時間行なった。増殖度は、EnVision Multilabel Reader 2104（PerkinElmer社）を用いて培養液の菌体濃度（OD600）より確認した。 (Experimental example 3) Growth of S. cerevisiae BY4741 transformant (2)
In this experimental example, dRmit and dRcyt were confirmed to have proliferative ability when cultured under conditions where a mitochondrial respiratory chain enzyme inhibitor was added. In the presence of antimycin A, a proton pump inhibitor in the mitochondrial respiratory system, CCCP (carbonylcyanide-mchlorophenylhydrazone) or DCCD (N, N'-Dicyclohexylcarbodiimide), an F 0 F 1 -ATP synthase inhibitor Proliferation ability when cultured in dRmit and dRcyt were cultured in SD medium containing 10 μM trans-retinal under light irradiation conditions of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) at 30 ° C. and 175 rpm for 24 hours. I did it. The degree of proliferation was confirmed from the bacterial cell concentration (OD 600 ) of the culture solution using EnVision Multilabel Reader 2104 (PerkinElmer).
本実験例では、dRmitおよびdRcytについて、ミトコンドリア呼吸鎖酵素阻害剤を加えた条件下で培養したときの増殖能を確認した。ミトコンドリア呼吸系におけるプロトンポンプ阻害剤であるアンチマイシンＡ（antimycin A）または、F0F1-ATP合成酵素阻害剤であるCCCP（carbonylcyanide-mchlorophenylhydrazone）若しくはDCCD（N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide）の存在下で培養したときの増殖能を確認した。dRmitおよびdRcytの培養は、10μMのtrans-レチナールを含むSD培地中で、dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、30℃、撹拌175 rpmの条件で24時間行なった。増殖度は、EnVision Multilabel Reader 2104（PerkinElmer社）を用いて培養液の菌体濃度（OD600）より確認した。 (Experimental example 3) Growth of S. cerevisiae BY4741 transformant (2)
In this experimental example, dRmit and dRcyt were confirmed to have proliferative ability when cultured under conditions where a mitochondrial respiratory chain enzyme inhibitor was added. In the presence of antimycin A, a proton pump inhibitor in the mitochondrial respiratory system, CCCP (carbonylcyanide-mchlorophenylhydrazone) or DCCD (N, N'-Dicyclohexylcarbodiimide), an F 0 F 1 -ATP synthase inhibitor Proliferation ability when cultured in dRmit and dRcyt were cultured in SD medium containing 10 μM trans-retinal under light irradiation conditions of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) at 30 ° C. and 175 rpm for 24 hours. I did it. The degree of proliferation was confirmed from the bacterial cell concentration (OD 600 ) of the culture solution using EnVision Multilabel Reader 2104 (PerkinElmer).
その結果、アンチマイシンＡ存在下 (0～0.4 mM)で培養した場合は、dRcytに比べてdRmitはアンチマイシンＡによる増殖阻害の影響が軽減されることが確認された（図５Ａ）。一方、CCCP存在下 (0～0.4 mM) 若しくはDCCD存在下 (0～0.4 mM) で培養した場合には、何れの細胞も増殖が抑制されたことが確認された（図５Ｂ，Ｃ）。このことより、dRmitは光駆動によりミトコンドリア呼吸系におけるプロトンポンプの作用を補強しうることが確認された。一方、プロトン濃度勾配をATPに変換するF0F1-ATP合成酵素はdRmitの増殖にも必要であることが確認された。
As a result, when cultured in the presence of antimycin A (0 to 0.4 mM), it was confirmed that dRmit reduces the effect of growth inhibition by antimycin A compared to dRcyt (FIG. 5A). On the other hand, when cultured in the presence of CCCP (0 to 0.4 mM) or in the presence of DCCD (0 to 0.4 mM), it was confirmed that all the cells were inhibited from growing (FIGS. 5B and 5C). From this, it was confirmed that dRmit can reinforce the action of the proton pump in the mitochondrial respiratory system by light drive. On the other hand, it was confirmed that F 0 F 1 -ATP synthase that converts the proton concentration gradient to ATP is also necessary for dRmit growth.
（実験例４）S. cerevisiae BY4741形質転換体のミトコンドリア内ATP濃度
本実験例では、dRmitおよびdRcytについて、ミトコンドリア内のATP濃度を確認した。ミトコンドリア内でのATP産生経路は図１に示す通りである。
dRmitおよびdRcytの培養は、10μMのtrans-レチナールを含むSD培地中で、dim light (=0.04μmol m-2 s-1) の光照射条件にて、30℃、撹拌175 rpmの条件で24時間行なった。その後1.2 mg/gの湿細胞重量当たりZymolyase-20T（生化学工業）で酵母の細胞壁を消化した後で一晩を30℃で処理し、遠心分離により上清を除去しペレットを得た。ペレットをさらに界面活性剤1-O-n-octyl-β-D-glucopyranoside (2%) を加え、室温で一晩おいた。得られたサンプルをさらに遠心分離操作を行い上清から細胞抽出液を得、ATP測定用サンプルとした。ATP量は、市販のATP測定キット（プロメガ社）を用いてルシフェラーゼ発光法で測定した。 (Experimental Example 4) Mitochondrial ATP concentration of S. cerevisiae BY4741 transformant In this experimental example, the ATP concentration in mitochondria was confirmed for dRmit and dRcyt. The ATP production pathway in mitochondria is as shown in FIG.
dRmit and dRcyt were cultured in SD medium containing 10 μM trans-retinal for 24 hours under the conditions of light irradiation of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) at 30 ° C. and stirring at 175 rpm. I did it. Thereafter, the yeast cell wall was digested with Zymolyase-20T (Seikagaku Corporation) per 1.2 mg / g wet cell weight, and then treated overnight at 30 ° C., and the supernatant was removed by centrifugation to obtain a pellet. The pellet was further added with the surfactant 1-On-octyl-β-D-glucopyranoside (2%) and left overnight at room temperature. The obtained sample was further centrifuged to obtain a cell extract from the supernatant, which was used as a sample for ATP measurement. The amount of ATP was measured by a luciferase luminescence method using a commercially available ATP measurement kit (Promega).
本実験例では、dRmitおよびdRcytについて、ミトコンドリア内のATP濃度を確認した。ミトコンドリア内でのATP産生経路は図１に示す通りである。
dRmitおよびdRcytの培養は、10μMのtrans-レチナールを含むSD培地中で、dim light (=0.04μmol m-2 s-1) の光照射条件にて、30℃、撹拌175 rpmの条件で24時間行なった。その後1.2 mg/gの湿細胞重量当たりZymolyase-20T（生化学工業）で酵母の細胞壁を消化した後で一晩を30℃で処理し、遠心分離により上清を除去しペレットを得た。ペレットをさらに界面活性剤1-O-n-octyl-β-D-glucopyranoside (2%) を加え、室温で一晩おいた。得られたサンプルをさらに遠心分離操作を行い上清から細胞抽出液を得、ATP測定用サンプルとした。ATP量は、市販のATP測定キット（プロメガ社）を用いてルシフェラーゼ発光法で測定した。 (Experimental Example 4) Mitochondrial ATP concentration of S. cerevisiae BY4741 transformant In this experimental example, the ATP concentration in mitochondria was confirmed for dRmit and dRcyt. The ATP production pathway in mitochondria is as shown in FIG.
dRmit and dRcyt were cultured in SD medium containing 10 μM trans-retinal for 24 hours under the conditions of light irradiation of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) at 30 ° C. and stirring at 175 rpm. I did it. Thereafter, the yeast cell wall was digested with Zymolyase-20T (Seikagaku Corporation) per 1.2 mg / g wet cell weight, and then treated overnight at 30 ° C., and the supernatant was removed by centrifugation to obtain a pellet. The pellet was further added with the surfactant 1-On-octyl-β-D-glucopyranoside (2%) and left overnight at room temperature. The obtained sample was further centrifuged to obtain a cell extract from the supernatant, which was used as a sample for ATP measurement. The amount of ATP was measured by a luciferase luminescence method using a commercially available ATP measurement kit (Promega).
その結果、dRmitではdRcytに比べて、約1.5培のATP濃度があることが確認された（図６）。この結果より、dRをミトコンドリアに導入することで、細胞内のATP濃度が上昇することが確認され、dRmitは光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母としての性質を備えていることが確認された。
As a result, it was confirmed that dRmit had an ATP concentration of about 1.5 cultures compared to dRcyt (FIG. 6). From this result, it was confirmed that introduction of dR into mitochondria increased the intracellular ATP concentration, and dRmit was confirmed to have properties as a light-driven high-energy Saccharomyces sub-yeast.
（実験例５）S. cerevisiae BY4741形質転換体のグルタチオンの産生
本実験例では、10μMのtrans-レチナールを含むSD培地中で、dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、30℃、撹拌175 rpmの条件で培養したdRmitおよびdRcytについて、グルタチオン（GSH）の産生能を確認した。細胞内のグルタミン酸塩（glutamate）からGSHの産生経路は図２に示す通りであり、GSHの産生量は、グルタミン酸塩濃度、システイン濃度、グリシン濃度およびATP濃度に依存する。 (Experimental Example 5) Production of glutathione of S. cerevisiae BY4741 transformant In this experimental example, light irradiation conditions of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) in SD medium containing 10 μM trans-retinal were used. Then, glutathione (GSH) production ability was confirmed for dRmit and dRcyt cultured under conditions of 30 ° C. and stirring at 175 rpm. The production pathway of GSH from intracellular glutamate is as shown in FIG. 2, and the production amount of GSH depends on the glutamate concentration, cysteine concentration, glycine concentration and ATP concentration.
本実験例では、10μMのtrans-レチナールを含むSD培地中で、dim light (=0.04μmol m-2 s-1)の光照射条件にて、30℃、撹拌175 rpmの条件で培養したdRmitおよびdRcytについて、グルタチオン（GSH）の産生能を確認した。細胞内のグルタミン酸塩（glutamate）からGSHの産生経路は図２に示す通りであり、GSHの産生量は、グルタミン酸塩濃度、システイン濃度、グリシン濃度およびATP濃度に依存する。 (Experimental Example 5) Production of glutathione of S. cerevisiae BY4741 transformant In this experimental example, light irradiation conditions of dim light (= 0.04 μmol m −2 s −1 ) in SD medium containing 10 μM trans-retinal were used. Then, glutathione (GSH) production ability was confirmed for dRmit and dRcyt cultured under conditions of 30 ° C. and stirring at 175 rpm. The production pathway of GSH from intracellular glutamate is as shown in FIG. 2, and the production amount of GSH depends on the glutamate concentration, cysteine concentration, glycine concentration and ATP concentration.
GSHの測定のために、培養24時間目および96時間目の培養物を得、遠心分離により発酵ブロスを除去した細胞懸濁液について、EnVision Multilabel Reader 2104（PerkinElmer社）を用いて当該細胞懸濁液の菌体濃度（OD600）を測定し、0.5になるよう蒸留水を用いて調整した。次いで、細胞懸濁液を5分間95℃で加熱し、遠心分離により細胞破砕物を除去し、GSH濃度を解析した。GSH量は、市販のGSH測定キット（同仁化学社）を用いてDTNB (5-5'-dithiobis[2-nitrobenzoic acid])による呈色法で測定した。
ATPの測定は、培養24時間目および96時間目の培養物を得、実験例４と同様に行った。
グルコース濃度は、培養24時間目および96時間目の培養物を得、遠心分離を行い、沈殿を除去し、市販のキットGlucose C-II Test Kit（和光純薬）を用いて測定した。 For the measurement of GSH, cell suspensions obtained by culturing at 24 hours and 96 hours, and removing the fermentation broth by centrifugation were suspended using EnVision Multilabel Reader 2104 (PerkinElmer). The bacterial cell concentration (OD 600 ) of the liquid was measured and adjusted with distilled water to 0.5. The cell suspension was then heated at 95 ° C. for 5 minutes, cell debris was removed by centrifugation, and the GSH concentration was analyzed. The amount of GSH was measured by a coloration method using DTNB (5-5′-dithiobis [2-nitrobenzoic acid]) using a commercially available GSH measurement kit (Dojin Chemical Co., Ltd.).
ATP was measured in the same manner as in Experimental Example 4 after obtaining cultures at 24 hours and 96 hours in culture.
The glucose concentration was measured using a commercially available kit Glucose C-II Test Kit (Wako Pure Chemical Industries) after obtaining cultures at 24 hours and 96 hours after culture, centrifuging, removing the precipitate.
ATPの測定は、培養24時間目および96時間目の培養物を得、実験例４と同様に行った。
グルコース濃度は、培養24時間目および96時間目の培養物を得、遠心分離を行い、沈殿を除去し、市販のキットGlucose C-II Test Kit（和光純薬）を用いて測定した。 For the measurement of GSH, cell suspensions obtained by culturing at 24 hours and 96 hours, and removing the fermentation broth by centrifugation were suspended using EnVision Multilabel Reader 2104 (PerkinElmer). The bacterial cell concentration (OD 600 ) of the liquid was measured and adjusted with distilled water to 0.5. The cell suspension was then heated at 95 ° C. for 5 minutes, cell debris was removed by centrifugation, and the GSH concentration was analyzed. The amount of GSH was measured by a coloration method using DTNB (5-5′-dithiobis [2-nitrobenzoic acid]) using a commercially available GSH measurement kit (Dojin Chemical Co., Ltd.).
ATP was measured in the same manner as in Experimental Example 4 after obtaining cultures at 24 hours and 96 hours in culture.
The glucose concentration was measured using a commercially available kit Glucose C-II Test Kit (Wako Pure Chemical Industries) after obtaining cultures at 24 hours and 96 hours after culture, centrifuging, removing the precipitate.
上記測定の結果、培養96時間目においてdRmitでのGSH濃度はdRcytでのGSH濃度に比べて2倍以上であり（図７Ａ）、ATP量についてはdRmitでの濃度はdRcytでの濃度に比べて1.5倍以上程度であった（図７Ｂ）。グルコースの消費はdRmitおよびdRcytでほぼ同様であり、培養96時間目では完全に消費されていた（図７Ｃ）。このことから、dRmitはATPおよびグルコースの消費に比べて、効率的にGSHを産生していると考えられた。
As a result of the above measurement, the GSH concentration at dRmit was more than twice as high as that at dRcyt at 96 hours of culture (FIG. 7A). As for the amount of ATP, the concentration at dRmit was higher than that at dRcyt. It was about 1.5 times or more (FIG. 7B). The glucose consumption was almost the same for dRmit and dRcyt, and was completely consumed at 96 hours of culture (FIG. 7C). This suggests that dRmit produces GSH more efficiently than ATP and glucose consumption.
（実施例２）S. cerevisiae BY4741形質転換体のトレハロースおよびコハク酸の産生
実施例１で作製したS. cerevisiae 形質転換体について、トレハロースおよびコハク酸の産生量を確認した。上記の実験例５では、試験管において5 mLの培養液内で「dRcyt」および「dRmit」を各々培養したのに対し、本実施例では500 mL用量の坂口フラスコ内で50 mLの培養液内で「dRcyt」および「dRmit」を各々培養した。本実施例では、「dRcyt」はコントロールとし、「dRmit」を「dR+」とした。培養液の量が異なる以外は、培養液、細胞密度、光照射条件、温度等の培養条件は実験例と同手法により行った。 (Example 2) Production of trehalose and succinic acid by S. cerevisiae BY4741 transformant About the S. cerevisiae transformant prepared in Example 1, the production amounts of trehalose and succinic acid were confirmed. In Experimental Example 5 above, “dRcyt” and “dRmit” were each cultured in a 5 mL culture solution in a test tube, whereas in this example, in a 50 mL culture solution in a 500 mL dose Sakaguchi flask. “DRcyt” and “dRmit” were cultured respectively. In this example, “dRcyt” was a control, and “dRmit” was “dR + ”. The culture conditions such as the culture solution, cell density, light irradiation conditions, and temperature were the same as those in the experimental examples except that the amount of the culture solution was different.
実施例１で作製したS. cerevisiae 形質転換体について、トレハロースおよびコハク酸の産生量を確認した。上記の実験例５では、試験管において5 mLの培養液内で「dRcyt」および「dRmit」を各々培養したのに対し、本実施例では500 mL用量の坂口フラスコ内で50 mLの培養液内で「dRcyt」および「dRmit」を各々培養した。本実施例では、「dRcyt」はコントロールとし、「dRmit」を「dR+」とした。培養液の量が異なる以外は、培養液、細胞密度、光照射条件、温度等の培養条件は実験例と同手法により行った。 (Example 2) Production of trehalose and succinic acid by S. cerevisiae BY4741 transformant About the S. cerevisiae transformant prepared in Example 1, the production amounts of trehalose and succinic acid were confirmed. In Experimental Example 5 above, “dRcyt” and “dRmit” were each cultured in a 5 mL culture solution in a test tube, whereas in this example, in a 50 mL culture solution in a 500 mL dose Sakaguchi flask. “DRcyt” and “dRmit” were cultured respectively. In this example, “dRcyt” was a control, and “dRmit” was “dR + ”. The culture conditions such as the culture solution, cell density, light irradiation conditions, and temperature were the same as those in the experimental examples except that the amount of the culture solution was different.
培養24時間目のコントロールでの産生量を100とし、各々について48時間及び72時間培養したときのトレハロースおよびコハク酸の産生量を測定した。菌の処理方法およびトレハロースの産生量およびコハク酸の産生量は、J. Biosci Bioeng. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22280965#> Vol.113, pp. 665-673 (2011))の方法に従った。
The production amount in the control at the 24th hour of culture was defined as 100, and the production amounts of trehalose and succinic acid when cultured for 48 hours and 72 hours for each were measured. The method of treating the fungus and the production amount of trehalose and the production amount of succinic acid are described in J. Biosci Bioeng. <Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22280965#> Vol.113, pp. 665- 673 (2011)).
その結果、トレハロースについては、培養72時間目においてコントロールと比較してdR+では500倍近くの産生量の増加が確認された（図８）。また、コハク酸についてはコントロールの産生量が培養時間の経過とともに減少しているのに対し、dR+では培養24時間目よりも48時間目の方が高い産生量を示し、培養72時間目でも産生量の減少はほとんど認められなかった（図８）。
As a result, with respect to trehalose, an increase in production of nearly 500-fold was confirmed for dR + at 72 hours in culture compared to the control (FIG. 8). In addition, for succinic acid, the production amount of the control decreased with the passage of the culture time, whereas dR + showed a higher production amount at 48 hours than at 24 hours of culture, and even at 72 hours of culture. Little decrease in production was observed (FIG. 8).
以上詳述したように、本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母によれば、ミトコンドリアに局在しないロドプシンを組み込んだサッカロミセス亜門酵母と比較して、細胞内のATP濃度は約２倍に高まった。また、産生されたグルタチオンの濃度についても同様に約２倍に高まった。これらの結果より、本発明の方法により作製された光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母が、光駆動高エネルギー宿主細胞として利用可能である。
As described above in detail, according to the light-driven high-energy Saccharomyces sub-yeast of the present invention, the intracellular ATP concentration is about twice that of Saccharomyces sub-yeast that incorporates rhodopsin not localized in mitochondria. It has risen. Similarly, the concentration of glutathione produced also increased approximately twice. From these results, the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast produced by the method of the present invention can be used as a light-driven high-energy host cell.
本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の代謝産物として得られるグルタチオンは、活性酵素の消去作用、解毒作用など生体にとって重要な化合物であり、医薬品、食品、化粧品、農業用途で注目されている。本発明の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母によれば、グルタチオンに限らず、ATPのエネルギーを要する生体触媒反応は多種存在する為、様々なATP駆動プロセスに利用可能である。また、細胞内ATP濃度の高まりは、細胞の生育速度や最終密度の増加、酵素量の増加や代謝全体の改善などが期待できる。光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母はATP駆動プロセスに限らず様々な有用物質生産への利用が可能な普遍的な物質生産宿主になり得る。
Glutathione obtained as a metabolite of the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention is an important compound for living organisms such as an erasing action and a detoxifying action of an active enzyme, and has attracted attention in pharmaceuticals, foods, cosmetics and agricultural applications. . According to the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast of the present invention, not only glutathione but also various biocatalytic reactions that require ATP energy can be used in various ATP-driven processes. In addition, an increase in intracellular ATP concentration can be expected to increase the growth rate and final density of cells, increase the amount of enzyme, and improve the overall metabolism. Light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast can be a universal material production host that can be used not only for ATP-driven processes but also for production of various useful materials.
Claims (18)
- ロドプシンをコードする核酸およびミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸をサッカロミセス亜門酵母に導入することを特徴とする光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。 A method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast, comprising introducing a nucleic acid encoding rhodopsin and a nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal into Saccharomyces saccharomyces yeast.
- ロドプシンが、デルタロドプシン、バクテリオロドプシン、センサリーロドプシンI、センサリーロドプシンII、プロテオロドプシン、チャンネルロドプシンI、チャンネルロドプシンII、ハロロドプシン、キサントロドプシン、ナトリウムポンプ型ロドプシンから選択されるいずれかのロドプシンである、請求項１に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。 Rhodopsin is any rhodopsin selected from deltarhodopsin, bacteriorhodopsin, sensory rhodopsin I, sensory rhodopsin II, proteorhodopsin, channelrhodopsin I, channelrhodopsin II, halorhodopsin, xanthrhodopsin, sodium pump rhodopsin The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to claim 1.
- ロドプシンが、デルタロドプシンである、請求項２に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。 The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to claim 2, wherein the rhodopsin is deltarhodopsin.
- デルタロドプシンが、ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンである、請求項３に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。 The method for producing a light-driven, high-energy Saccharomyces subtrophic yeast according to claim 3, wherein the deltarhodopsin is deltarhodopsin derived from Halotherigena tacummenica.
- ミトコンドリア局在化シグナルが、5-アミノレブリン酸シンターゼ由来のシグナルである、請求項１～４のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。 The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of claims 1 to 4, wherein the mitochondrial localization signal is a signal derived from 5-aminolevulinate synthase.
- 以下の工程を含む、請求項４または５に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法：
１）ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンをコードする核酸と5-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
２）上記１）の核酸が組み込まれたサッカロミセス亜門酵母を培養する工程。 The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to claim 4 or 5, comprising the following steps:
1) a step of introducing a nucleic acid encoding a deltarhodopsin derived from Halotherigena turkmenica and a nucleic acid encoding a 5-aminolevulinate synthase into Saccharomyces submonas yeast;
2) A step of culturing Saccharomyces subtilis yeast in which the nucleic acid of 1) above is incorporated. - 以下の工程を含む、請求項４または５に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法：
１）ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンをコードする核酸を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
２）さらに、5-アミノレブリン酸シンターゼをコードする核酸を、サッカロミセス亜門酵母に導入する工程；
３）上記１）および２）の核酸が組み込まれたサッカロミセス亜門酵母を培養する工程。 The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to claim 4 or 5, comprising the following steps:
1) a step of introducing a nucleic acid encoding deltarhodopsin derived from Halotherigena turkmenica into Saccharomyces subtrophic yeast;
2) Furthermore, a step of introducing a nucleic acid encoding 5-aminolevulinate synthase into Saccharomyces subyeast;
3) A step of culturing Saccharomyces subtilis yeast in which the nucleic acids of 1) and 2) are incorporated. - サッカロミセス亜門酵母が、サッカロミセス・セレビシエである、請求項１～７のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母の作製方法。 The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of claims 1 to 7, wherein the Saccharomyces saccharomyces yeast is Saccharomyces cerevisiae.
- 請求項１～８のいずれかに記載の作製方法により作製された光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。 A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast produced by the production method according to any one of claims 1 to 8.
- デルタロドプシンをコードする核酸と、ミトコンドリア局在化シグナルをコードする核酸が組み込まれてなる光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。 A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast comprising a nucleic acid encoding deltarhodopsin and a nucleic acid encoding a mitochondrial localization signal.
- サッカロミセス亜門酵母に組み込まれたデルタロドプシンをコードする核酸に基づき、当該サッカロミセス亜門酵母のミトコンドリアにデルタロドプシンが発現していることを特徴とする、光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。 A light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast, characterized in that deltarhodopsin is expressed in mitochondria of the Saccharomyces saccharomyces yeast based on a nucleic acid encoding deltarhodopsin incorporated into Saccharomyces saccharomyces yeast.
- デルタロドプシンが、ハロテリジェナ・タークメニカ由来のデルタロドプシンである、請求項１０または１１に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。 The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to claim 10 or 11, wherein the deltarhodopsin is a deltarhodopsin derived from Halotherigena tacummenica.
- ミトコンドリア局在化シグナルが、5-アミノレブリン酸シンターゼ由来のシグナルである、請求項１０～１２のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。 The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of claims 10 to 12, wherein the mitochondrial localization signal is a signal derived from 5-aminolevulinate synthase.
- サッカロミセス亜門酵母が、サッカロミセス・セレビシエである、請求項１０～１３のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母。 The light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of claims 10 to 13, wherein the Saccharomyces saccharomyces yeast is Saccharomyces cerevisiae.
- 請求項９～１４のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を培養することを特徴とする、ATPの産生方法。 A method for producing ATP, comprising culturing the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast according to any one of claims 9 to 14.
- 請求項１５に記載のATPの産生方法により得られるATPを利用することを特徴とする当該光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母代謝産物の産生方法。 A method for producing the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast metabolite, characterized in that ATP obtained by the ATP production method according to claim 15 is used.
- 光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母代謝産物が、グルタチオン、トレハロースおよび／またはコハク酸である請求項１６に記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母代謝産物の産生方法。 The method for producing a light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast metabolite according to claim 16, wherein the light-driven high-energy Saccharomyces subtrophic yeast metabolite is glutathione, trehalose and / or succinic acid.
- 請求項９～１４のいずれかに記載の光駆動高エネルギーサッカロミセス亜門酵母を宿主とし、所望のタンパク質をコードする遺伝子を組込み、培養することを特徴とする所望のタンパク質の製造方法。 A method for producing a desired protein, comprising using the light-driven high-energy Saccharomyces saccharomyces yeast according to any one of claims 9 to 14 as a host, incorporating and culturing a gene encoding the desired protein.
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JP2002510965A (en) * | 1997-03-17 | 2002-04-09 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Polypeptide synthesis in respiratory-deficient cells |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002510965A (en) * | 1997-03-17 | 2002-04-09 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Polypeptide synthesis in respiratory-deficient cells |
| US20090191599A1 (en) * | 2007-09-10 | 2009-07-30 | Joule Biotechnologies, Inc. | Engineered light-harvesting organisms |
| US20110256605A1 (en) * | 2010-03-12 | 2011-10-20 | The Regents Of The University Of California, A California Corporation | Cells with non-natural physiologies derived by expressing light-powered proton pumps in one or more membranes |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ABSTRACTS OF THE ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR BIOTECHNOLOGY, vol. 66, 5 August 2014 (2014-08-05), Japan, pages 252 * |
| JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE, vol. 53, no. 6, 1995, pages 37 - 44 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020050113A1 (en) * | 2018-09-03 | 2020-03-12 | 静岡県公立大学法人 | Method for manufacturing useful substance through use of fermentation process |
| JPWO2020050113A1 (en) * | 2018-09-03 | 2021-08-26 | 静岡県公立大学法人 | Method of manufacturing useful substances by using fermentation process |
| WO2022044979A1 (en) * | 2020-08-24 | 2022-03-03 | 静岡県公立大学法人 | Exogenous opsin and cells expressing said rhodopsin |
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