WO2015170362A1 - 微生物の検査方法 - Google Patents

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WO2015170362A1
WO2015170362A1 PCT/JP2014/002422 JP2014002422W WO2015170362A1 WO 2015170362 A1 WO2015170362 A1 WO 2015170362A1 JP 2014002422 W JP2014002422 W JP 2014002422W WO 2015170362 A1 WO2015170362 A1 WO 2015170362A1
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microorganism
microorganisms
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detected
nucleic acid
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淳憲 一色
真実 小梶
卓 田辺
充裕 吉田
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Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Original Assignee
Toyo Seikan Group Holdings Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to an inspection method for confirming the presence or absence of microorganisms in the environment.
  • an identification method using DNA has been carried out for mold inspection. For example, after culturing a sample collected from the environment, DNA is extracted from the cultured cells, the target region is amplified by the PCR (polymerase chain reaction) method, and the amplification product is analyzed to remove mold in the sample. Identification has been done.
  • Methods for analyzing amplification products include, for example, analysis of amplification product size by electrophoresis, and identification of molds present in a sample using a DNA chip on which a probe that binds complementary to the amplification product is immobilized. And the like have been proposed (see Patent Documents 2 and 3).
  • two or more samples are obtained from a population of organisms, DNA is extracted, a reaction solution containing DNA, a target gene-specific primer, and a control gene-specific primer is prepared and subjected to quantitative PCR. Measure the amount of each amplification product, determine the proportion of heterogeneous individuals in the population based on the amount of amplification product, and determine the reliability of the proportion by statistical processing.
  • a measuring method has been proposed (see Patent Document 4).
  • the method for determining the proportion of heterogeneous individuals in a population based on the amount of amplification product is effective when the size of the amplification target region differs greatly among individuals, but the size of the amplification target region is large. If there is not enough difference, there is a problem that it cannot be used effectively.
  • the same region in DNA is often used as an amplification target region for a plurality of types of microorganisms. At this time, depending on the microorganisms to be inspected, the sizes of the respective amplification target regions may not differ so much between different types.
  • the present inventors have intensively studied, and in examining microorganisms using DNA, even if the size of the amplification target region between the types of microorganisms is not so different, it is possible to easily determine the dominant species of microorganisms in the environment. Found a possible way.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and detects microorganisms included in a set for each set. When two or more types of microorganisms are detected, each microorganism for the total number of sets is detected for each detected microorganism. It is an object of the present invention to provide a microorganism testing method that can determine the dominant species of microorganisms in the environment by calculating the ratio of the number of aggregates in which detection is detected.
  • the method for examining microorganisms of the present invention comprises a culture step of collecting a sample from the environment, culturing the microorganism contained in the obtained sample in a medium, and cultivating the microorganism to produce a colony.
  • the formed colonies are divided into two or more sets, and the nucleic acid extraction step for extracting the nucleic acid of the microorganisms included in the set for each set, and the region to be amplified using the extracted nucleic acids
  • a nucleic acid amplification step for amplifying a nucleic acid fragment containing a nucleic acid, a microorganism detection step for detecting a microorganism contained in each set using the amplified nucleic acid fragment, and two or more microorganisms detected in the microorganism detection step In addition, for each detected microorganism, the ratio of the number of sets in which each microorganism was detected to the total number of sets, which is the total number of sets of two or more, was calculated, whereby the superiority of microorganisms in the environment was calculated. There as a method having a predominant type determination step of determining the species.
  • test result use chip number 4 for confirming the effect of the test method of the microorganisms which concern on embodiment of this invention. It is a figure which shows the test result (the number of used chips
  • microorganisms included in a set are detected for each set, and when two or more types of microorganisms are detected, each microorganism for the total number of sets is detected for each detected microorganism. It is characterized by determining the dominant species of microorganisms in the environment by calculating the ratio of the number of aggregates.
  • the method includes (a) a microorganism culture step, (b) a nucleic acid extraction step, (c) a nucleic acid amplification step, (d) a microorganism detection step, and (e) a dominant species determination step as follows. preferable.
  • a Microbial culture step This is a step of collecting a sample from the environment and culturing a microorganism contained in the obtained sample in a medium.
  • “In the environment” includes indoor and outdoor air, liquid, and other inspection objects in environmental inspection, food inspection, epidemiological environmental inspection, clinical test, livestock hygiene and the like. In addition, inspection objects such as food and drink and various instruments are also included.
  • the “microorganism” includes bacteria such as bacteria in addition to fungi such as mold and yeast, and the microorganism testing method of this embodiment can be applied as long as it is a microorganism that forms a colony. .
  • a method for collecting a sample from the environment is not particularly limited.
  • air in an environment to be inspected can be collected using an air sampler or the like.
  • the method for culturing microorganisms is not particularly limited, but the collected sample can be sprayed on a dedicated medium, and molds and the like contained in the sample can be cultured on an agar medium or the like.
  • a mold culture condition it is preferable to stand at 25 ° C. in a dark place for 65 hours or more.
  • (B) Nucleic Acid Extraction Step when two or more colonies are formed by culturing microorganisms, the formed colonies are divided into two or more sets, and the nucleic acid of the microorganism is extracted for each set. When a large number of colonies are formed, it is preferable to divide them into groups of about 2 to 7 colonies. When only one colony is included in one set, the accuracy of determining the dominant species in the microorganism to be examined is 100%, but the number of samples is too large and the experiment becomes complicated. In addition, as the number of colonies in one set increases, the possibility that a single set includes a plurality of types of microorganisms increases.
  • the primer used for PCR does not function effectively, and the probe used for the DNA chip does not function effectively, or a non-specific product inhibits binding of the target product.
  • the number of colonies in one set is more preferably 4 or 5.
  • the detected microorganisms can be determined as the dominant species, but when the sample includes a plurality of microorganisms, the detected microorganisms cannot be compared.
  • the number is preferably 2 or more.
  • the method for extracting nucleic acid from the microorganism is not particularly limited, and can be performed as follows, for example. Collecting colonies of various types of microorganisms generated in the medium for each assembly, placing them in a vial containing ⁇ 0.5mm zirconia beads, freezing the samples by immersion in liquid nitrogen, and using a shaking device Crush the microbial cells. Nucleic acids can be extracted from the microbial cell disruption obtained by the CTAB method (Cetyl trimethyl ammonium bromide) or a DNA extraction apparatus.
  • CTAB method Cetyl trimethyl ammonium bromide
  • nucleic acid amplification step In this step, a nucleic acid fragment containing a target region (amplification target region) is amplified using the extracted nucleic acid.
  • Target region (amplification target region) means a target region to be amplified by a PCR (polymerase chain reaction) method or the like.
  • Nucleic acid fragment means a part of DNA or the like that is amplified using a primer set by PCR or the like.
  • the method for amplifying the nucleic acid fragment is not particularly limited, but the PCR method can be suitably used.
  • a target region is amplified using a PCR reaction solution containing a primer set for amplifying the target region.
  • a general thermal cycler or the like can be used as the PCR apparatus.
  • the target region of the microorganism can be suitably amplified by performing PCR under the following reaction conditions, for example. (A) 95 ° C. for 10 minutes, (b) 95 ° C. (DNA denaturation step) for 30 seconds, (c) 56 ° C. (annealing step) for 30 seconds, (d) 72 ° C. (DNA synthesis step) for 60 seconds ((b) to (D) 40 cycles), (e) 72 ° C. 10 minutes
  • PCR reaction solution it is preferable to use, for example, one having the following composition. That is, nucleic acid synthesis substrate (dNTPmixture (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)), primer set, nucleic acid synthase (Nova Taq HotStart DNA polymerase, etc.), fluorescent labeling reagent (Cy5-dCTP, etc.), sample genomic DNA, buffer solution , And a PCR reaction solution containing water as the remaining component can be preferably used.
  • dNTPmixture dCTP, dATP, dTTP, dGTP
  • primer set primer set
  • nucleic acid synthase Nova Taq HotStart DNA polymerase, etc.
  • fluorescent labeling reagent Cy5-dCTP, etc.
  • sample genomic DNA sample genomic DNA
  • buffer solution a PCR reaction solution containing water as the remaining component
  • Ampdirect (R) manufactured by Shimadzu Corporation
  • R Ampdirect
  • DNA fragments can be amplified using the ITS region and / or ⁇ -tubulin gene in mold genomic DNA as a target region.
  • a primer set for amplifying the ITS region a primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1: forward primer, SEQ ID NO: 2: reverse primer) can be used.
  • a primer set for amplifying the ⁇ -tubulin gene a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 3: forward primer, SEQ ID NO: 4: reverse primer) is used. it can.
  • (D) Microorganism detection step In this step, the amplified nucleic acid fragments are used to detect the microorganisms contained in the set for each set.
  • the amplified nucleic acid fragments are used to detect the microorganisms contained in the set for each set.
  • a method for detecting microorganisms a method for determining the type of microorganism by binding the amplification product to a corresponding probe using a DNA chip (carrier for microorganism testing) and detecting the fluorescent label of the amplification product are preferably used. This is because according to this method, the sequence of the amplification product is recognized, whereby each microorganism is more accurately identified.
  • a probe selected from a target region in the genomic DNA of a microorganism to be examined is immobilized in advance on a DNA chip.
  • Each probe can hybridize only with the corresponding amplification product derived from the microorganism to be examined, thereby making it possible to specifically detect the microorganism to be examined.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 can be suitably used as a probe selected from the ITS region.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 can be preferably used as the probe selected from the ⁇ tubulin gene.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 can be preferably used as the probe selected from the ITS region, and selected from the ⁇ -tubulin gene.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be preferably used.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 can be preferably used as the probe selected from the ITS region, and selected from the ⁇ tubulin gene.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 can be preferably used as the probe.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 can be preferably used as the probe selected from the ITS region, and selected from the ⁇ tubulin gene.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 can be preferably used as the probe.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 can be suitably used as the probe selected from the ITS region.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 can be suitably used as the probe selected from the ITS region.
  • both the ITS region and the probe selected from the ⁇ -tubulin gene were used, and the mold was only obtained when a positive reaction was obtained in both of them. It is preferable to determine that has been detected. This is because it is possible to prevent erroneous judgment based on a false positive reaction for these molds.
  • Penicillium spp. It is preferable to determine that the mold is present when a positive reaction is obtained in at least one of the probes selected from the ITS region or the ⁇ -tubulin gene.
  • Penicillium spp. Include molds that can only be detected by one of the probes selected from the ITS region or the probe selected from the ⁇ -tubulin gene used to detect Penicillium spp. This is because the specificity of each probe is high, and it is possible to detect mold of Penicillium spp. Without causing a false positive reaction.
  • the mold is present when a positive reaction is obtained with a probe selected only from the ITS region. This is because probes selected from the ITS region of these molds have high specificity, and these molds can be detected without causing false positive reactions.
  • a DNA chip that can be used in the microorganism testing method of the present embodiment can be manufactured by an existing general method using probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 14.
  • the probe when an affixed type DNA chip is produced, the probe can be immobilized on a glass substrate by a DNA spotter and a spot corresponding to each probe can be formed.
  • a synthetic DNA chip when a synthetic DNA chip is produced, it can be produced by synthesizing a single-stranded oligo DNA having the above sequence on a glass substrate by a photolithography technique.
  • the substrate is not limited to glass, and a plastic substrate, a silicon wafer, or the like can also be used.
  • the shape of the substrate is not limited to a flat plate shape, and may be various three-dimensional shapes, and a substrate having a functional group introduced so that a chemical reaction can be performed on the surface can be used. .
  • the amplification product obtained in the nucleic acid amplification step is dropped onto the DNA chip thus obtained, and the amplification product is hybridized to the probe immobilized on the DNA chip. Then, by detecting the label of the hybridized amplification product, it is possible to identify the microorganism to be examined that exists in the environment.
  • the detection of the label can be performed using a general label detection device such as a fluorescence scanning device, for example, by measuring the fluorescence intensity of the fluorescent label in the amplification product using BIOSHOT manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd. be able to.
  • the measurement result is preferably obtained as an S / N ratio value (Signal to Noise ratio, (median fluorescence intensity value ⁇ background value) ⁇ background value).
  • the label is not limited to fluorescence, and other labels can also be used.
  • each of the detected microorganisms is detected with respect to the total number of sets, which is the total number of sets of two or more. This is a step of determining the dominant species of microorganisms in the environment by calculating the ratio of the number of aggregates.
  • fungus A and fungus B are detected from set 1
  • fungus A and fungus B are detected from set 2
  • fungus A and fungus C are set from set 3.
  • the ratio of the number of sets detected for each fungus is calculated.
  • the ratio of fungus A is 3/3, which is 100.0%
  • the ratio of fungus B is 2/3, which is 66.7%
  • the ratio of fungus C is 1/3, which is 33.3%.
  • the first dominant species is determined as A
  • the second dominant species is determined as B
  • the third dominant species is determined as C.
  • the dominant species when the number of colonies generated in the medium is small, or when the inspector has a high ability of identifying the form, the dominant species may be determined without performing the separation culture. In such a case, the dominant species can be determined without using the microorganism testing method of the present embodiment. Further, according to the determination of the dominant species in the microorganism testing method of the present embodiment, the method of collecting colonies from the culture medium in which the microorganisms are cultured into each group may affect the determination result.
  • the microorganisms present in the environment may vary greatly depending on the environment.
  • the probe of the dominant species in the tested environment is immobilized on the DNA chip used in the microorganism testing method of this embodiment. It may not be. Therefore, the microorganism inspection method of the present embodiment is not a classification that can completely detect the dominant species of microorganisms in all environments. Even if many probes of microorganisms that are likely to be detected are immobilized on the DNA chip, there is a possibility that other microorganisms are dominant species depending on the environment.
  • microorganism testing method of the present embodiment considering the practical use of the microorganism testing method of the present embodiment, these are not so problematic. That is, according to the microorganism testing method of the present embodiment, it is generally assumed that the microorganism is often used in a similar environment, and the dominant species can be determined almost appropriately in the microorganism to be tested. The ability to easily determine the dominant species in this way is very effective in view of the enormous effort, time, and cost of the conventional morphological observation method. In addition, the accuracy of determining the dominant species can be increased by increasing the number of sets.
  • the microorganism testing method of this embodiment when all the microorganisms of each colony generated in the culture medium are microorganisms to be examined, if the total number of colonies is the same as the number of colonies, the dominant species is theoretically complete. (Except for exceptional cases such as cases where there is a failure to collect microorganisms at the time of sample collection from the environment, or cases where culture has failed). However, when the number of colonies is large, it is desirable to reduce the number of aggregates from the viewpoint of labor, time, and cost reduction.
  • the following example shows that the dominant species can be confirmed if the number of sets is 2 or more, and in the sample if the number of sets is 4 or more. It was also shown that the approximate order of superiority of the dominant species can be confirmed when multiple organisms to be tested are included in
  • microorganism testing method of the present embodiment it is possible to quickly and easily confirm the dominant species of microorganisms in the environment.
  • Each group of colonies was placed in a vial containing ⁇ 0.5 mm zirconia beads, immersed in liquid nitrogen to freeze the sample, and then mold cells in the colonies were crushed using a shaking device.
  • mold genomic DNA was extracted by a DNA extraction apparatus.
  • the ITS region of each mold and the ⁇ -tubulin gene were simultaneously amplified by PCR.
  • the forward primer (F primer) consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer (R primer) consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 shown in FIG. 1 were used as the ITS region amplification primer set.
  • a primer set for amplifying ⁇ -tubulin gene a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 shown in the same figure were used.
  • all synthesized by Operon Technology Co., Ltd. were used.
  • Ampdirect (R) (manufactured by Shimadzu Corporation) was used for each of samples A to J, and 20 ⁇ l of the following composition was prepared. 1. Ampdirect (G / Crich) 4.0 ⁇ l 2. Ampdirect (addition-4) 4.0 ⁇ l 3. dNTPmix 1.0 ⁇ l 4). Cy-5dCTP 0.2 ⁇ l 5. ITS1-Fw primer (2.5 ⁇ M) (SEQ ID NO: 1) 1.0 ⁇ l 6). ITS1-Rv primer (2.5 ⁇ M) (SEQ ID NO: 2) 1.0 ⁇ l 7). BtF primer (10 ⁇ M) (SEQ ID NO: 3) 1.0 ⁇ l 8). BtR primer (10 ⁇ M) (SEQ ID NO: 4) 1.0 ⁇ l 9. Template DNA (each sample A to J) 1.0 ⁇ l 10. NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2 ⁇ l 11. Water (water until 20.0 ⁇ l total)
  • DNA was amplified by the nucleic acid amplification apparatus (TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (R) Gradient Takara Bio Inc.) using the above PCR reaction solutions under the following conditions.
  • A 95 ° C for 10 minutes
  • b 95 ° C for 30 seconds
  • c 56 ° C for 30 seconds
  • d 72 ° C for 60 seconds
  • E 72 ° C 10 minutes
  • the PCR amplification product was mixed with a buffer (3 ⁇ SSC citrate-saline + 0.3% SDS) and heated at 94 ° C. for 5 minutes. It was dripped in. The DNA chip was allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour, and the PCR product that did not hybridize using the buffer solution was washed away from the DNA chip.
  • a buffer 3 ⁇ SSC citrate-saline + 0.3% SDS
  • the fluorescence intensity in each probe was measured by applying the DNA chip to a label detection device (GenePix4100A Molecular Devices), and the S / N ratio value was calculated.
  • a label detection device GenePix4100A Molecular Devices
  • both S / B of the probe selected from the ITS region and the probe selected from the ⁇ -tubulin gene are used.
  • a positive determination was made when the N ratio value was 3 or more.
  • Penicillium is determined to be positive when the S / N ratio value of at least one of the probe selected from the ITS region and the probe selected from the ⁇ -tubulin gene is 3 or more. did.
  • Cladosporium spp Were determined to be positive when the S / N ratio value of the probe selected from the ITS region was 3 or more.
  • a forward primer having a base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a reverse primer having a base sequence shown in SEQ ID NO: 16 are used as a primer set
  • TAKARA ExTaq polymerase is used as a nucleic acid synthesizing enzyme
  • a nucleic acid amplification device is used.
  • the TaKaRa PCR Thermal Cycler (R) Gradient manufactured by Takara Bio Inc.
  • the ITS1 region in each mold genome was amplified in the same manner as the PCR conditions described above.
  • Each amplification product and the above primer set (primer set for sequencing) were outsourced to Takara Bio Inc., and DNA sequence analysis was performed with a DNA sequencer to confirm the type of mold corresponding to each amplification product. The results are shown in FIGS.
  • the dominant species and the rank order of the dominant species can be determined with high accuracy in a microorganism to be examined by a simple method.
  • sample B From sample B, four types of microorganisms, Mycosphaerella crystallina, Xylariales sp., Artrinium sp., And Leptosphaerulina chartaru, were detected in addition to Cladosporium and Penicillium.
  • the probes for detecting these four types of microorganisms are not immobilized on the DNA chip used in the microorganism testing method of this embodiment, and these are microorganisms that are not tested in this test.
  • the dominant species in the sample B determined by the microorganism testing method of the present embodiment was the first genus Cladosporium and the second genus Penicillium.
  • the dominant species and the rank order of the dominant species can be determined with high accuracy in a microorganism to be examined by a simple method.
  • Sample C was analyzed by DNA sequence analysis, in addition to Cladosporium and Penicillium, Arthrinium sp., Periconia macrospinosa, Toxicocladosporium irritans, Dothideomycete sp., Phoma sp., Pleosporales sp., And Unknown (unknown type) 7 types of microorganisms were detected. Probes for detecting these seven types of microorganisms are not immobilized on the DNA chip used in the microorganism testing method of this embodiment, and these are microorganisms that are not tested in this test.
  • the dominant species in the sample C determined by the microorganism testing method of the present embodiment the first was the genus Cladosporium and the second was the genus Penicillium.
  • the actual first dominant species was Cladosporium, and the actual second dominant species was Penicillium. Therefore, it can be seen from this result that the dominant species and the rank order of the dominant species can be determined with high accuracy in a microorganism to be examined by a simple method.
  • Sample D was analyzed by DNA sequence analysis, and in addition to Cladosporium spp, Penicillium spp, and Eurotium spp., Four types of Unknown (unknown types), Pleosporales sp., Diaporthe sp. Of microorganisms were detected.
  • the probes for detecting these four types of microorganisms are not immobilized on the DNA chip used in the microorganism testing method of this embodiment, and these are microorganisms that are not tested in this test.
  • the dominant species in the sample D determined by the microorganism testing method of the present embodiment was Cladosporium genus in the first and Penicillium and Eurotium in the second.
  • the actual first dominant species is Cladosporium
  • the actual second dominant species is Penicillium
  • the actual third The dominant species was Eurotium. Therefore, it can be seen from this result that the dominant species can be determined with high accuracy in a microorganism to be examined by a simple method. It can also be seen that the order of superiority can be determined to some extent.
  • the dominant species and the rank order of the dominant species can be determined with high accuracy in a microorganism to be examined by a simple method.
  • sample F was analyzed by DNA sequence analysis, as well as Leptosphaerulina chartarum, Leptosphaeria sp., Sclerotinia sclerotiorum, Creosphaeria sassafrans, Fungal endophyte sp. 6 types of microorganisms of unknown type) were detected. Probes for detecting these six types of microorganisms are not immobilized on the DNA chip used in the microorganism testing method of the present embodiment, and these are microorganisms that are not tested in this test.
  • the dominant species in the sample F determined by the microorganism testing method of the present embodiment were Aspergillus bargecolor bacteria first, and Cladosporium sp. And Aspergillus penicilliosides.
  • the actual first dominant species is Aspergillus bargecolor
  • the actual second dominant species is Cladosporium
  • the actual third The second dominant species was Aspergillus penicilliosides. Therefore, it can be seen from this result that the dominant species can be determined with high accuracy in a microorganism to be examined by a simple method. It can also be seen that the order of superiority can be determined to some extent.
  • Phaeosphaeriopsis sp. was detected in addition to Cladosporium and Penicillium by DNA sequence analysis.
  • the probe for detecting this microorganism is not immobilized on the DNA chip used in the microorganism testing method of the present embodiment, and this is a microorganism that is not subject to testing in this test.
  • the dominant species in the sample G determined by the microorganism testing method of the present embodiment the first was Cladosporium and the second was Penicillium.
  • the actual first dominant species was Cladosporium sp.
  • the actual second dominant species was Phaeosphaeriopsis sp.
  • the genus was the actual third dominant species.
  • Phaeosphaeriopsis sp. Is a non-tested microorganism in this test, and the test species Cladosporium and Penicillium were detected as the actual first and actual third dominant species, respectively. ing. Therefore, it can be seen from this result that the dominant species and the rank order of the dominant species can be determined with high accuracy in a microorganism to be examined by a simple method.
  • Pleosporales sp. was detected from sample H by DNA sequence analysis.
  • the probe for detecting this microorganism is not immobilized on the DNA chip used in the microorganism testing method of the present embodiment, and this is a microorganism that is not subject to testing in this test.
  • the dominant species in sample H determined by the microorganism testing method of the present embodiment was Cladosporium sp.
  • the actual first dominant species was Cladosporium
  • the actual second dominant species was Pleosporales sp. Therefore, it can be seen from this result that the dominant species can be determined with high accuracy in a microorganism to be examined by a simple method.
  • sample J From sample J, Aspergillus penicilliosides and Cladosporium were detected by DNA sequence analysis.
  • the dominant species in Sample J determined by the microorganism testing method of the present embodiment were Aspergillus penicilliosides and Cladosporium.
  • the actual first dominant species was Aspergillus penicillioides
  • the actual second dominant species was Cladosporium.
  • Sample J uses only one chip, so if multiple microorganisms are present, the difference between these dominant species cannot be determined, but the actual dominant species is identified in the microorganism to be tested. I can do it.
  • the dominant species can be determined with high accuracy by a simple method.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and it goes without saying that various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • components other than the ITS region amplification primer set and ⁇ -tubulin gene amplification primer set in the PCR reaction solution of the above test can be appropriately changed.
  • the present invention quickly and easily detects the types of microorganisms and the dominant species in environmental inspections, food inspections, epidemiological environmental inspections, clinical tests, livestock hygiene, etc., when performing inspections to confirm the presence or absence of microorganisms in the environment. In some cases, it can be suitably used.

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Abstract

【課題】　環境中における微生物の存否を確認する検査において、微生物の優勢種を簡易かつ迅速に検出することを可能とする。 【解決手段】　環境中から試料を採取して、得られた試料に含まれる微生物を培地にて培養する工程と、微生物を培養することでコロニーが２以上形成された場合に、これら形成されたコロニーを２以上の集合に分けて、集合毎に集合に含まれる微生物の核酸を抽出する工程と、抽出した核酸を用いて増幅対象領域を含む核酸断片を増幅させる工程と、増幅された核酸断片を用いて、集合毎に集合に含まれる微生物を検出する工程と、微生物検出工程において２種類以上の微生物が検出された場合に、検出された微生物毎に、２以上の集合の総数である全集合数に対する、それぞれの微生物が検出された集合数の割合を算出することにより、環境中における微生物の優勢種を判定する工程を有する微生物の検査方法とする。

Description

微生物の検査方法
　本発明は、環境中における微生物の存否等を確認するための検査方法に関する。
　近年、食品製造現場や臨床現場、文化財保護環境等において、カビや細菌などの微生物が存在するか否かを検査して、環境の安全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
　例えば、カビの検査では、一般的に、環境中から試料を採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法（培養法）が行われている（特許文献１参照）。
　しかしながら、この方法では、カビ種ごとに分離培養することが必要であるため、検査工程が煩雑になるという問題があった。また、培養に長期間を要するため、例えばヒトが生活する屋内の検査や食物の検査など、迅速性が要求される検査には不向きであった。さらに、形態的特徴を表す胞子が形成されないと同定ができず、労力が無駄になってしまう場合があるという問題もあった。
　また、最近は、カビの検査においてＤＮＡを用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取した試料を培養した後、培養細胞からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりターゲット領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、試料中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、例えば電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、試料中に存在するカビを同定する方法などが提案されている（特許文献２，３参照）。
特開２００７－１９５４５４号公報 特開２００８－２７８８４８号公報 特開２００８－２７８８６１号公報 特開２００１－２３８７００号公報
　しかしながら、このようなＤＮＡを用いた同定法によれば、環境中における微生物の存否を確認することはできるが、その環境中において、どの微生物が優勢種であるのかまでは確認することができなかった。
　また、特許文献１に記載のように、菌種ごとに分離培養を行って、形態的特徴の観察に基づきカビを同定する方法によれば、同定されたカビの個数を数えることにより、各カビの存在割合を把握することができるため、どのカビが優勢種であるかを確認することが可能である。しかしながら、この方法は、優勢種の確認に長期間を要するため、ヒトが生活する屋内の検査や食物の検査などの迅速な対応が望まれる検査には不向きであった。
　ここで、生物集団等から２個以上の試料を得てＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ、標的遺伝子特異的プライマー、およびコントロール遺伝子特異的プライマーを含有する反応液を調製して、定量的ＰＣＲに供して各増幅産物の量を測定し、増幅産物の量に基づき生物集団中の異種個体の存在割合を決定し、存在割合の信頼度を統計処理によって決定する生物集団中の異種個体の存在割合の定量的測定方法が提案されている（特許文献４参照）。
　しかしながら、このような増幅産物の量に基づき生物集団中の異種個体の存在割合を決定する方法では、個体間の増幅対象領域のサイズが大きく異なる場合には有効であるものの、増幅対象領域のサイズに十分な違いがない場合には有効に用いることができないという問題があった。
　例えば、ＤＮＡを用いた微生物の検査では、複数種類の微生物について、ＤＮＡにおける同一領域を増幅対象領域とする場合が多い。このとき、検査対象の微生物によっては、異なる種類間において、それぞれの増幅対象領域のサイズがあまり違わないことがある。このような場合には、例えば電気泳動によって増幅産物の量を分析しても、複数種類の微生物由来の増幅産物が１つのバンドに入ってしまうため、各微生物の存在割合を決定することは困難であり、環境中における微生物の優勢種を判定することはできなかった。
　そこで、本発明者らは鋭意研究し、ＤＮＡを用いた微生物の検査にあたり、微生物の種類間の増幅対象領域のサイズがあまり違わない場合でも、環境中における微生物の優勢種を簡易に判定することが可能な方法を見いだした。
　本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、集合毎に集合に含まれる微生物を検出し、２種類以上の微生物が検出された場合、検出された微生物毎に、全集合数に対する各微生物が検出された集合数の割合を算出することにより、環境中における微生物の優勢種を判定することが可能な微生物の検査方法の提供を目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の微生物の検査方法は、環境中から試料を採取して、得られた試料に含まれる微生物を培地にて培養する培養工程と、微生物を培養することでコロニーが２以上形成された場合に、これら形成されたコロニーを２以上の集合に分けて、集合毎に集合に含まれる微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程と、抽出した核酸を用いて増幅対象領域を含む核酸断片を増幅させる核酸増幅工程と、増幅された核酸断片を用いて、集合毎に集合に含まれる微生物を検出する微生物検出工程と、微生物検出工程において２以上の微生物が検出された場合に、検出された微生物毎に、２以上の集合の総数である全集合数に対する、それぞれの微生物が検出された集合数の割合を算出することにより、環境中における微生物の優勢種を判定する優勢種判定工程とを有する方法としてある。
　本発明によれば、環境中における微生物の優勢種を簡易に判定することが可能となる。
本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験で用いたプライマーセットの塩基配列を示す図である。 本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験で用いたプローブの塩基配列を示す図である。 本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験において、ＩＴＳ領域の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析するために用いたシーケンス用プライマーセットの塩基配列を示す図である。 本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験結果（使用チップ数５，６）を示す図である。 本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験結果（使用チップ数４）を示す図である。 本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験結果（使用チップ数１，２）を示す図である。
　以下、本発明の微生物の検査方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、この実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
［微生物の検査方法］
　本実施形態の微生物の検査方法は、集合毎に集合に含まれる微生物を検出し、２種類以上の微生物が検出された場合、検出された微生物毎に、全集合数に対する各微生物が検出された集合数の割合を算出することにより、環境中における微生物の優勢種を判定することを特徴とする。
　具体的には、以下のように、（ａ）微生物培養工程、（ｂ）核酸抽出工程、（ｃ）核酸増幅工程、（ｄ）微生物検出工程、（ｅ）優勢種判定工程を含むものとすることが好ましい。
（ａ）微生物培養工程
　環境中から試料を採取して、得られた試料に含まれる微生物を培地にて培養する工程である。
　「環境中」には、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生等における室内及び屋外の空気、液体、その他の検査対象が含まれる。また、飲食品や各種器具等の検査対象物も含まれる。
　「微生物」には、カビや酵母などの真菌類の他、バクテリアなどの細菌類も含まれ、コロニーを形成する微生物であれば、本実施形態の微生物の検査方法を適用することが可能である。
　環境中から試料を採取する方法としては、特に限定されないが、例えば、エアーサンプラーなどを用いて、検査対象の環境中の空気等を採取することができる。
　また、微生物の培養方法も特に限定されないが、採取した試料を専用培地に吹き付けて、試料に含まれるカビなどを寒天培地等で培養することができる。カビの培養条件としては、２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。
（ｂ）核酸抽出工程
　微生物を培養することでコロニーが２以上形成された場合に、これら形成されたコロニーを２以上の集合に分けて、当該集合毎に微生物の核酸を抽出する工程である。
　コロニーが多数形成された場合には、２～７コロニー程度ずつの集合に分けることが好ましい。１つの集合に１コロニーのみ含める場合、検査対象の微生物内における優勢種判定の精度は１００％になるが、サンプル数が多すぎて実験が煩雑になる。また、１つの集合におけるコロニー数を増やすほど、１つの集合に複数種類の微生物が含まれる可能性が高くなるが、ＰＣＲにより同時に増幅する種類数が増えるほど、非特異産物が増幅されるリスクが高くなるのでＰＣＲに用いるプライマーが有効に機能しなくなり、ＤＮＡチップに用いるプローブが有効に機能しない、あるいは非特異産物が目的産物の結合を阻害することになる。このような観点から１つの集合におけるコロニー数は、４又は５とすることがより好ましい。
　また、集合数が１の場合には、検出された微生物を優勢種と判定することはできるものの、試料に複数の微生物が含まれる場合、検出された微生物間での比較が行えないため、集合数は２以上にすることが好ましい。さらに、集合数を４以上にすれば、試料に検査対象の微生物が数種類含まれる場合に、それらの優勢順位もある程度判定できるため、より好ましい。
　微生物から核酸を抽出する方法としては、特に限定されないが、例えば次のように行うことができる。集合毎に、培地に生じた様々な種類の微生物のコロニーを一括して採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて微生物の細胞を破砕する。そして、得られた微生物の細胞の破砕物から、ＣＴＡＢ法（Cetyl　trimethyl　ammonium　bromide）やＤＮＡ抽出装置により、核酸を抽出することができる。
（ｃ）核酸増幅工程
　抽出した核酸を用いて、標的領域（増幅対象領域）を含む核酸断片を増幅させる工程である。
　「標的領域（増幅対象領域）」とは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などによって増幅させるターゲット領域を意味する。
　「核酸断片」とは、ＰＣＲ法などにより、プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ等の一部分を意味する。
　核酸断片を増幅する方法としては、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
　本実施形態の微生物の検査方法において、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、微生物の標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃　１０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）　３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）　３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）　６０秒（（ｂ）～（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃　１０分
　ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ　Ｔａｑ　ＨｏｔＳｔａｒｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５－ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。
　本実施形態では、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβチューブリン遺伝子を標的領域として、ＤＮＡ断片の増幅を行うことができる。
　このとき、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとしては、図１に示す配列番号１及び２の塩基配列からなるもの（配列番号１：フォワードプライマー、配列番号２：リバースプライマー）を用いることができる。
　また、βチューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとしては、図１に示す配列番号３及び４の塩基配列からなるもの（配列番号３：フォワードプライマー、配列番号４：リバースプライマー）を用いることができる。
（ｄ）微生物検出工程
　増幅された核酸断片を用いて、集合毎に集合に含まれる微生物を検出する工程である。
　微生物の検査にあたっては、標的領域のサイズがあまり違わない複数種類の微生物を同時に増幅させ、その増幅産物にもとづき各微生物を識別することが必要となる場合がある。このため、微生物を検出する方法としては、ＤＮＡチップ（微生物検査用担体）を用いて増幅産物を対応するプローブに結合させ、増幅産物の蛍光標識を検出することにより、微生物の種類を判定する方法が、好適に用いられる。この方法によれば、増幅産物の配列が認識されることにより、各微生物の識別がより正確に行われるためである。
　具体的には、検査対象の微生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域から選択したプローブを、ＤＮＡチップ上に予め固定化させておく。プローブは、それぞれ対応する検査対象の微生物由来の増幅産物とのみハイブリダイズでき、それによって検査対象の微生物を特異的に検出可能にすることができる。
　例えば、図２に示すように、ユーロチウム属菌（Eurotium　sp.）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号５に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができ、βチューブリン遺伝子から選択されたプローブとして、配列番号６に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
　また、アスペルギルス　ペニシリオイデス菌（Aspergillus　penicillioides）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号７に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができ、βチューブリン遺伝子から選択されたプローブとして、配列番号８に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
　また、アスペルギルス　バージカラー菌（Aspergillus　versicolor）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号９に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができ、βチューブリン遺伝子から選択されたプローブとして、配列番号１０に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
　また、ペニシリウム属菌（Penicillium　sp.）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号１１に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができ、βチューブリン遺伝子から選択されたプローブとして、配列番号１２に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
　また、フザリウム属菌（Fusarium　sp.）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号１３に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
　また、クラドスポリウム属菌（Cladosporium　sp.）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号１４に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
　ユーロチウム属菌、アスペルギルス　ペニシリオイデス菌、及びアスペルギルス　バージカラー菌については、ＩＴＳ領域及びβ－チューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方を用いて、これらの両方において陽性反応が得られた場合のみに当該カビが検出されたと判定することが好ましい。これらのカビについては、このようにすることで、偽陽性反応にもとづく過誤判断を防止することが可能なためである。
　ペニシリウム属菌については、少なくともＩＴＳ領域又はβ－チューブリン遺伝子から選択されたプローブのいずれかにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することが好ましい。ペニシリウム属菌には、本実施形態においてペニシリウム属菌を検出するために用いられるＩＴＳ領域から選択されたプローブ又はβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの一方でしか検出できない種類のカビが含まれるが、それぞれのプローブの特異性は高く、偽陽性反応を生じることなくペニシリウム属菌のカビを検出することが可能なためである。
　フザリウム属菌、及びクラドスポリウム属菌については、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することが好ましい。これらのカビのＩＴＳ領域から選択されたプローブは特異性が高く、偽陽性反応を生じることなくこれらのカビをそれぞれ検出することが可能なためである。
　本実施形態の微生物の検査方法において使用可能なＤＮＡチップは、配列番号５～１４に示す塩基配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
　例えば、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
　このようにして得られたＤＮＡチップに、核酸増幅工程で得られた増幅産物を滴下し、増幅産物をＤＮＡチップに固定化されたプローブにハイブリダイズさせる。そして、ハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することにより、環境中に存在している検査対象の微生物を特定することができる。
　標識の検出は、蛍光スキャニング装置などの一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴを用いて、増幅産物における蛍光標識の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal　to　Noise　ratio，（メディアン蛍光強度値－バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）として得ることが好ましい。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
（ｅ）優勢種判定工程
　微生物検出工程において２種類以上の微生物が検出された場合に、検出された微生物毎に、２以上の集合の総数である全集合数に対する、それぞれの微生物が検出された集合数の割合を算出することにより、環境中における微生物の優勢種を判定する工程である。
　具体的には、例えば全集合数を３とした場合であって、集合１から真菌Ａと真菌Ｂが検出され、集合２から真菌Ａと真菌Ｂが検出され、集合３から真菌Ａと真菌Ｃが検出された場合に、真菌毎に検出された集合数の割合を算出する。このとき、真菌Ａの割合は３／３で１００．０％となり、真菌Ｂの割合は２／３で６６．７％となり、真菌Ｃの割合は１／３で３３．３％となる。この結果、第一番目の優勢種はＡと判定され、第二番目の優勢種はＢと判定され、第三番目の優勢種はＣと判定される。
　このとき、仮にコロニー数が１５で、これらを全て分離培養して、１個体ずつ形態観察法による同定を行った場合、例えば真菌Ａが９個、真菌Ｂが４個、真菌Ｃが２個検出されると、それぞれの存在割合は、真菌Ａが６０．０％、真菌Ｂが２６．７％、真菌Ｃが１３．３％と正確に算出することができる。
　しかしながら、この形態観察法による同定では、膨大な手間、時間、及びコストが必要になるという問題があった。また、その問題は、コロニー数が増加すればするほど膨大なものとなっていた。
　ところで、そもそも培地に生じたコロニーの数が少ない場合や、検査者が高度な形態同定能力を有しているような場合には、分離培養を行わずに優勢種を判定できる場合がある。このような場合には、本実施形態の微生物の検査方法を用いなくとも優勢種を判定することができる。
　また、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定によれば、微生物を培養した培地から各集合へのコロニーの集め方が、判定結果に影響を与える可能性はある。
　さらに、環境中に存在する微生物は、その環境によって大きく相違する場合があるところ、本実施形態の微生物の検査方法で使用するＤＮＡチップに、検査した環境中における優勢種のプローブが固定化されていない場合もあり得る。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法により、あらゆる環境中の微生物の優勢種を完全に正確に検出できる分けではない。検出される可能性が高い微生物のプローブをＤＮＡチップに数多く固定化しておいたとしても、環境によってはそれ以外の微生物が優勢種である可能性は存在する。
　しかしながら、本実施形態の微生物の検査方法の現実的な使用を考慮すれば、これらはあまり問題にはならない。
　すなわち、本実施形態の微生物の検査方法によれば、通常は、類似した環境下での使用が多く想定され、検査対象の微生物内において優勢種をほぼ適切に判定することができる。そして、このように優勢種を簡単に判定できることは、従来の形態観察法による膨大な手間、時間、及びコストを考慮すると、大変有効なものである。また、優勢種の判定の精度は、集合数を増加させることにより、高めることができる。
　ここで、本実施形態の微生物の検査方法において、培地に生じた各コロニーの微生物が全て検査対象の微生物である場合、全集合数をコロニー数と同じにすれば、理論上、優勢種を完全に正確に判定できる（環境中からの試料の採取時点で微生物の採取漏れがあるケースや培養に失敗したケースなどの例外的なケースを除く。）。
　しかしながら、コロニー数が多い場合、集合数を減らすことが、手間、時間、及びコスト低減の観点から望ましい。
　そこで、以下の実施例により、本実施形態の微生物の検査方法の効果を確認した結果、集合数が２以上であれば優勢種を確認できることが示され、集合数が４以上であれば試料中に検査対象の微生物が複数含まれている場合に、優勢種のおおよその優勢の順位を確認できることも示された。
　このように本実施形態の微生物の検査方法によれば、環境中における微生物の優勢種を迅速かつ簡易に確認することが可能となる。
　以下、本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の有効性を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
［本実施形態の微生物の検査方法による優勢種の判定］
（ａ）微生物培養工程
　まず、施設環境から野生カビを採取し、これを検出対象カビとして使用した。具体的には、エアーサンプラーを用いて各種施設環境内の空気を採取し、これをサンプルＡ～Ｊの各培地に吹き付けて培養した。培養は、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。Ａ～Ｊの各培地には、いずれもＭ４０Ｙ培地を使用した。
（ｂ）核酸抽出工程
　次に、サンプルごとに、培地に生じた様々な種類のカビの各コロニーの一部を、最大で５コロニー以下のグループ（集合）になるように、全てのコロニーを各グループに分けて、それぞれのカビをグループ毎に一括して採取した。
　具体的には、図４に示すように、サンプルＡには２９コロニーが生じていた。このため、サンプルＡにおけるグループは、５コロニーのグループが５個、４コロニーのグループが１個の合計６個（全集合数は６）とした。
　また、同図に示すように、サンプルＢには２２コロニーが生じていた。このため、サンプルＢにおけるグループは、５コロニーのグループが２個、４コロニーのグループが３個の合計５個（全集合数は５）とした。
　また、同図に示すように、サンプルＣには２１コロニーが生じていた。このため、サンプルＣにおけるグループは、５コロニーのグループが３個、４コロニーのグループが１個、２コロニーのグループが１個の合計５個（全集合数は５）とした。
　さらに、図５に示すように、サンプルＤには２０コロニーが生じていた。このため、サンプルＤにおけるグループは、５コロニーのグループが４個の合計４個（全集合数は４）とした。
　また、同図に示すように、サンプルＥには１９コロニーが生じていた。このため、サンプルＥにおけるグループは、５コロニーのグループが３個、４コロニーのグループが１個の合計４個（全集合数は４）とした。
　また、同図に示すように、サンプルＦには１８コロニーが生じていた。このため、サンプルＦにおけるグループは、５コロニーのグループが３個、３コロニーのグループが１個の合計４個（全集合数は４）とした。
　さらに、図６に示すように、サンプルＧには９コロニーが生じていた。このため、サンプルＧにおけるグループは、５コロニーのグループが１個、４コロニーのグループが１個の合計２個（全集合数は２）とした。
　また、同図に示すように、サンプルＨには６コロニーが生じていた。このため、サンプルＨにおけるグループは、５コロニーのグループが１個、１コロニーのグループが１個の合計２個（全集合数は２）とした。
　また、同図に示すように、サンプルＩには３コロニーが生じていた。このため、サンプルＩにおけるグループは、３コロニーのグループが１個の合計１個（全集合数は１）とした。
　また、同図に示すように、サンプルＪには３コロニーが生じていた。このため、サンプルＪにおけるグループは、３コロニーのグループが１個の合計１個（全集合数は１）とした。
　それぞれのグループのコロニーを、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、コロニーにおけるカビの細胞を破砕した。そして、グループ毎に、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出した。
（ｃ）核酸増幅工程
　次いで、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子とを同時に増幅した。
　このとき、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図１に示す配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆプライマー）及び配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー（Ｒプライマー）を用いた。また、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、同図に示す配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。なお、いずれもオペロンテクノロジー株式会社により合成したものを使用した。
　また、ＰＣＲ用反応液として、サンプルＡ～Ｊのそれぞれについて、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)　4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)　4.0μl
３．dNTPmix　1.0μl
４．Cy-5dCTP　0.2μl
５．ITS1-Fw　primer(2.5μM)（配列番号１）　1.0μl
６．ITS1-Rv　primer(2.5μM)（配列番号２）　1.0μl
７．BtF　primer(10μM)（配列番号３）　1.0μl
８．BtR　primer(10μM)（配列番号４）　1.0μl
９．Template　DNA（サンプルＡ～Ｊ毎にそれぞれ）　1.0μl
１０．NovaTaq　HotStart　DNA　polymerase　0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
　上記各ＰＣＲ用反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（Ｒ）　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃　１０分
（b）９５℃　３０秒
（c）５６℃　３０秒
（d）７２℃　６０秒（（b）～（d）を４０サイクル）
（e）７２℃　１０分
（ｄ）微生物検出工程
　ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図２に示される、以下の全てのプローブを固定化したものを使用した。以下において、（ＩＴＳ）はＩＴＳ領域から選択されたプローブを示し、（β）はβチューブリン遺伝子から選択されたプローブを示している。
（１）ユーロチウム属菌用　配列番号５（ＩＴＳ），配列番号６（β）
（２）アスペルギルス　ペニシリオイデス菌用　配列番号７（ＩＴＳ），配列番号８（β）
（３）アスペルギルス　バージカラー菌用　配列番号９（ＩＴＳ），配列番号１０（β）
（４）ペニシリウム属菌用　配列番号１１（ＩＴＳ），配列番号１２（β）
（５）フザリウム属菌用　配列番号１３（ＩＴＳ）
（６）クラドスポリウム属菌用　配列番号１４（ＩＴＳ）
　次に、サンプルＡ～Ｊのそれぞれについて、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸－生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記ＤＮＡチップに滴下した。
　このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
　次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（GenePix4100A　Molecular　Devices社製）にかけて、各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を算出した。
　ここで、（１）ユーロチウム属菌、（２）アスペルギルス　ペニシリオイデス菌、及び（３）アスペルギルス　バージカラー菌については、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方のＳ／Ｎ比値が３以上を示した場合に陽性と判定した。
　また、（４）ペニシリウム属菌については、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方のＳ／Ｎ比値が３以上を示した場合に陽性と判定した。
　また、（５）フザリウム属菌、及び（６）クラドスポリウム属菌については、ＩＴＳ領域から選択されたプローブのＳ／Ｎ比値が３以上を示した場合に陽性と判定した。
（ｅ）優勢種判定工程
　その結果、図４に示すように、サンプルＡにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が５グループで検出され（陽性を示したチップ数５枚）、ペニシリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は６枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数５÷全集合数６＝８３．３％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数６＝１６．７％である。
　よって、サンプルＡの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であると判定される。
　同様に、サンプルＢにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が５グループで検出され（陽性を示したチップ数５枚）、ペニシリウム属菌が２グループで検出された（陽性を示したチップ数２枚）。使用したチップ数は５枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数５÷全集合数５＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数５＝４０．０％である。
　よって、サンプルＢの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であると判定される。
　同様に、サンプルＣにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が５グループで検出され（陽性を示したチップ数５枚）、ペニシリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は５枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数５÷全集合数５＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数５＝２０．０％である。
　よって、サンプルＣの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であると判定される。
　同様に、サンプルＤにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が４グループで検出され（陽性を示したチップ数４枚）、ペニシリウム属菌が２グループで検出され（陽性を示したチップ数２枚）、ユーロチウム属菌が２グループで検出された（陽性を示したチップ数２枚）。使用したチップ数は４枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数４÷全集合数４＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％であり、ユーロチウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％である。
　よって、サンプルＤの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌とユーロチウム属菌であると判定される。
　同様に、サンプルＥにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が４グループで検出され（陽性を示したチップ数４枚）、ペニシリウム属菌が２グループで検出され（陽性を示したチップ数２枚）、フザリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は４枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数４÷全集合数４＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％であり、フザリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数４＝２５．０％である。
　よって、サンプルＥの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であり、第三番目がフザリウム属菌であると判定される。
　同様に、サンプルＦにおけるグループでは、アスペルギルス　バージカラー菌が３グループで検出され（陽性を示したチップ数３枚）、クラドスポリウム属菌が２グループで検出され（陽性を示したチップ数２枚）、アスペルギルス　ペニシリオイデス菌が２グループで検出された（陽性を示したチップ数２枚）。使用したチップ数は４枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、アスペルギルス　バージカラー菌の集合数の割合は、検出された集合数３÷全集合数４＝７５．０％であり、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％であり、アスペルギルス　ペニシリオイデス菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％である。
　よって、サンプルＦの優勢種は、第一番目がアスペルギルス　バージカラー菌であり、第二番目がクラドスポリウム属菌とアスペルギルス　ペニシリオイデス菌であると判定される。
　同様に、サンプルＧにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が２グループで検出され（陽性を示したチップ数２枚）、ペニシリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は２枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数２＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数２＝５０．０％である。
　よって、サンプルＧの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であると判定される。
　同様に、サンプルＨにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が２グループで検出された（陽性を示したチップ数２枚）。使用したチップ数は２枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数２＝１００．０％である。
　よって、サンプルＨの優勢種は、クラドスポリウム属菌であると判定される。
　同様に、サンプルＩにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は１枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数１＝１００．０％である。
　よって、サンプルＩの優勢種は、クラドスポリウム属菌であると判定される。
　同様に、サンプルＪにおけるグループでは、アスペルギルス　ペニシリオイデス菌が１グループで検出され（陽性を示したチップ数１枚）、クラドスポリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は１枚である。
　したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、アスペルギルス　ペニシリオイデス菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数１＝１００．０％であり、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数１＝１００．０％である。
　よって、サンプルＪの優勢種は、アスペルギルス　ペニシリオイデス菌とクラドスポリウム属菌であると判定される。
［ＤＮＡ配列解析による優勢種の確認］
　上記サンプルＡ～Ｊごとに、培地に生じた様々な種類のカビの各コロニーの一部を個別に採取し、それぞれ２５℃の暗所で７～１０日間分離培養した。Ａ～Ｊの各培地には、いずれもＭ４０Ｙ培地を使用した。
　そして、分離培養された各コロニーのカビをＤＮＡ配列解析に供して、その菌種を確認した。
　具体的には、プライマーセットとして配列番号１５に示す塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号１６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを使用し、核酸合成酵素としてＴＡＫＡＲＡ　ＥｘＴａｑポリメラーゼを使用し、核酸増幅装置としてＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、その他の条件は上述のＰＣＲ条件と同様にして、各カビのゲノムにおけるＩＴＳ１領域を増幅した。
　そして、それぞれの増幅産物と、上記プライマーセット（シーケンス用プライマーセット）をタカラバイオ株式会社に委託して、ＤＮＡシーケンサーによりＤＮＡ配列解析を行い、それぞれの増幅産物に対応するカビの種類を確認した。その結果を、図４～６に示す。
［試験結果］
　サンプルＡからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌の他に、Xylariales　sp.、Diaporthe　sp.、Pleosporales　sp.、及びStereum　hirsutumの４種類の微生物が検出された。これら４種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＡにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌であった。
　一方、ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＡにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種は、Xylariales　spであった。
　しかしながら、これは本試験において検査対象外の微生物であり、検査対象としていたクラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌は、それぞれ実際の第二番目、実際の第三番目の優勢種として検出されている。
　したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。
　サンプルＢからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌の他に、Mycosphaerella　crystallina、Xylariales　sp.、Artrinium　sp.、及びLeptosphaerulina　chartaruの４種類の微生物が検出された。これら４種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＢにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌であった。
　ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＢにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はペニシリウム属菌であった。
　したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。
　サンプルＣからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌の他に、Arthrinium　sp.、Periconia　macrospinosa、Toxicocladosporium　irritans、Dothideomycete　sp.、Phoma　sp.、Pleosporales　sp.、及びUnknown（種類不明のもの）の７種類の微生物が検出された。これら７種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＣにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌であった。
　ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＣにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はペニシリウム属菌であった。
　したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。
　サンプルＤからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌、ペニシリウム属菌、及びユーロチウム属菌の他に、Unknown（種類不明のもの）、Pleosporales　sp.、Diaporthe　sp.、及びAureobasidium　pullulansの４種類の微生物が検出された。これら４種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＤにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌とユーロチウム属菌であった。
　ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＤにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はペニシリウム属菌であり、実際の第三番目の優勢種はユーロチウム属菌であった。
　したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定できていることがわかる。また、その優勢の順位もある程度判定できていることがわかる。
　サンプルＥからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌、ペニシリウム属菌、及びフザリウム属菌の他に、Leptosphaeria　sp.、Unknown（種類不明のもの）の２種類の微生物が検出された。これら２種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＥにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌、第三番目がフザリウム属菌であった。
　ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＥにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はペニシリウム属菌であり、実際の第三番目の優勢種はフザリウム属菌であった。
　したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。
　サンプルＦからは、ＤＮＡ配列解析により、アスペルギルス　バージカラー菌、クラドスポリウム属菌、及びアスペルギルス　ペニシリオイデス菌の他に、Leptosphaerulina　chartarum、Leptosphaeria　sp.、Sclerotinia　sclerotiorum、Creosphaeria　sassafrans、Fungal　endophyte sp.、及びUnknown（種類不明のもの）の６種類の微生物が検出された。これら６種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＦにおける優勢種は、第一番目がアスペルギルス　バージカラー菌、第二番目がクラドスポリウム属菌とアスペルギルス　ペニシリオイデス菌であった。
　ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＦにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はアスペルギルス　バージカラー菌であり、実際の第二番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第三番目の優勢種はアスペルギルス　ペニシリオイデス菌であった。
　したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定できていることがわかる。また、その優勢の順位もある程度判定できていることがわかる。
　サンプルＧからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌の他に、Phaeosphaeriopsis　sp.が検出された。この微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これは本試験において検査対象外の微生物となっている。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＧにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌であった。
　一方、ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＧにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であったが、実際の第二番目の優勢種はPhaeosphaeriopsis　sp.であり、ペニシリウム属菌は実際の第三番目の優勢種であった。
　しかしながら、Phaeosphaeriopsis　sp.は本試験において検査対象外の微生物であり、検査対象としていたクラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌は、それぞれ実際の第一番目、実際の第三番目の優勢種として検出されている。
　したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。
　サンプルＨからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌の他に、Pleosporales　sp.が検出された。この微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これは本試験において検査対象外の微生物となっている。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＨにおける優勢種は、クラドスポリウム属菌であった。
　ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＨにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はPleosporales　sp.であった。
　したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定できていることがわかる。
　サンプルＩからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌の他に、Alternaria　alternataが検出された。この微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＩにおける優勢種は、クラドスポリウム属菌であった。
　ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＩにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はAlternaria　alternataであった。
　したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定できていることがわかる。
　サンプルＪからは、ＤＮＡ配列解析により、アスペルギルス　ペニシリオイデス菌とクラドスポリウム属菌が検出された。
　本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＪにおける優勢種は、アスペルギルス　ペニシリオイデス菌とクラドスポリウム属菌であった。
　ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＪにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はアスペルギルス　ペニシリオイデス菌であり、実際の第二番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であった。
　サンプルＪは、使用したチップ数が１枚であるため、複数の微生物が存在している場合、これらの優勢種の違いは判定できないが、検査対象とする微生物内において、実際の優勢種を特定することはできている。
　以上の通り、本実施形態の微生物の検査方法によれば、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定することが可能になっている。
　本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、上記の試験のＰＣＲ用反応液におけるＩＴＳ領域増幅用プライマーセット及びβ－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセット以外の成分については、適宜変更することができる。また、上記のようなＤＮＡチップを用いて蛍光検出を行うのではなく、電流検出方式など他の検出方式のＤＮＡチップにより、プローブにハイブリダイズした増幅産物を検出することなども可能である。
　本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生等において、環境中の微生物の存否を確認する検査を行うにあたり、微生物の種類と優勢種を迅速かつ簡易に検出する場合に、好適に利用することが可能である。

Claims (4)

  1. 　環境中から試料を採取して、得られた試料に含まれる微生物を培地にて培養する培養工程と、
    　前記微生物を培養することでコロニーが２以上形成された場合に、これら形成されたコロニーを２以上の集合に分けて、前記集合毎に前記集合に含まれる前記微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程と、
    　抽出した核酸を用いて増幅対象領域を含む核酸断片を増幅させる核酸増幅工程と、
    　増幅された核酸断片を用いて、前記集合毎に前記集合に含まれる前記微生物を検出する微生物検出工程と、
    　前記微生物検出工程において２種類以上の微生物が検出された場合に、検出された前記微生物毎に、前記２以上の集合の総数である全集合数に対する、それぞれの微生物が検出された集合数の割合を算出することにより、前記環境中における微生物の優勢種を判定する優勢種判定工程と、を有する
    　ことを特徴とする微生物の検査方法。
  2. 　前記微生物を培養することでコロニーが４以上形成された場合に、前記核酸抽出工程において、これら形成されたコロニーを４以上の集合に分けて、前記集合毎に前記集合に含まれる前記微生物の核酸を抽出することを特徴とする請求項１記載の微生物の検査方法。
  3. 　前記微生物が、カビ、酵母、又はバクテリアであることを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の検査方法。
  4. 　前記微生物検出工程において、前記増幅された核酸断片と相補的に結合する、前記微生物を検出するためのプローブが固定化された担体を用いて、前記集合毎に前記集合に含まれる前記微生物の種類を判定することを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の微生物の検査方法。
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