WO2015167365A1 - Способ определения повышенного уровня аутоантител к плазминогену человека и продуктам его деградации и диагностическая тест-система для его осуществления - Google Patents

Способ определения повышенного уровня аутоантител к плазминогену человека и продуктам его деградации и диагностическая тест-система для его осуществления Download PDF

Info

Publication number
WO2015167365A1
WO2015167365A1 PCT/RU2015/000271 RU2015000271W WO2015167365A1 WO 2015167365 A1 WO2015167365 A1 WO 2015167365A1 RU 2015000271 W RU2015000271 W RU 2015000271W WO 2015167365 A1 WO2015167365 A1 WO 2015167365A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plasminogen
autoantibodies
samples
hcl
tris
Prior art date
Application number
PCT/RU2015/000271
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Евгений Иосифович ГОУФМАН
Василий Николаевич ЯКОВЛЕВ
Алексей Алексеевич КАНАНЕВ
Рустам Раисович СУЛЕЙМАНОВ
Original Assignee
Евгений Иосифович ГОУФМАН
Василий Николаевич ЯКОВЛЕВ
Алексей Алексеевич КАНАНЕВ
Рустам Раисович СУЛЕЙМАНОВ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Евгений Иосифович ГОУФМАН, Василий Николаевич ЯКОВЛЕВ, Алексей Алексеевич КАНАНЕВ, Рустам Раисович СУЛЕЙМАНОВ filed Critical Евгений Иосифович ГОУФМАН
Publication of WO2015167365A1 publication Critical patent/WO2015167365A1/ru

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9

Definitions

  • a method for determining an increased level of autoantibodies to human plasminogen and its degradation products and a diagnostic test system for its implementation is a method for determining an increased level of autoantibodies to human plasminogen and its degradation products and a diagnostic test system for its implementation.
  • the group of inventions relates to the field of medicine and immunology.
  • the group of inventions relates to methods for immunological diagnostics, including the use of peptide sequences of plasminogen fragments, which can be used as a universal antigenic marker during immunoassay to detect diseases associated with an increased level of plasminogen autoantibodies in humans.
  • the group of inventions also relates to a diagnostic test system containing the indicated peptide sequences as antigen.
  • antigen refers to proteins or fragments thereof capable of binding to antibodies.
  • kidney refers to a protein domain having a structure stabilized by three disulfide bonds.
  • domain refers to a portion of a protein characterized by certain structural or functional properties.
  • immunoassay refers to methods for detecting macromolecular compounds, comprising the steps of: (a) a step of contacting the antigen with a biological sample under conditions suitable for the formation of antigen-antibody complexes; and (b) a step for detecting said complexes.
  • marker refers to macromolecular compounds of a specific structure, the detection of which in human tissue samples is associated with a specific spectrum of diseases.
  • epitope in the present invention refers to a portion of a protein molecule that is capable of forming a bond with an antibody.
  • human antibody refers to an antibody having an amino acid sequence that corresponds to the amino acid sequence of an antibody produced by a person.
  • autoantibodies autoaggressive antibodies, autologous antibodies
  • autoantigens that is, with antigens of their own body.
  • diagnostic test is a definition of a diagnostic indicator using a specific laboratory method, the analytical parameters of which remain at a constant level.
  • Plasminogen is an inactive precursor of the main fibrinolysis enzyme, plasmin, found in many body fluids, some tissues and blood components. Plasmin belongs to endopeptidases - trypsin-like serine proteases. The physiological effect of plasmin is aimed at maintaining the balance of the blood coagulation system. Plasmin is usually obtained from plasminogen by its activation by streptokinase, urokinase. The plasminogen / plasmin system is actively involved not only in the processes of fibrinolysis, but is also closely associated with angiogenesis.
  • plasmin plasmin
  • plasmin plasmin
  • the native plasminogen (plasmin) molecule is functionally significant, but also the whole spectrum of its degradation products. Enzymatically degraded forms of plasmin in their effect on low molecular weight substrates even surpass the whole molecule (Yu.G. Klys, N.V. Zaitseva, A.I. Kizim, SV. Rope, Proteolytic derivatives of plasminogen in the development of malignant neoplasms, Oncology, T 12, 2010).
  • Determination of the level of antibodies, including autoantibodies in tissue samples obtained from humans are usually performed by immunoassay, for example, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • immunoassay for example, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • Solid phase ELISA was proposed in 1971.
  • the basic principles of solid-phase ELISA, regardless of modification, are as follows:
  • test sample is incubated.
  • wells with positive control standard reagents.
  • immune complexes are formed on the surface of the solid phase. Unbound components are removed by washing.
  • the level of autoantibodies is determined using indirect ELISA.
  • This variant of ELISA is usually used to detect specific antibodies.
  • Standard antigen is adsorbed in the wells of the panels and incubated with samples of serum or other biological material obtained from the patient (cerebrospinal fluid, saliva, etc.).
  • Specific antibodies bound to the solid phase antigen are detected using an antiglobulin conjugate.
  • different antiglobulin reagents are used that detect antibodies of all isotypes, or specific to individual classes and subclasses of immunoglobulins.
  • the main advantage of the method is the versatility of the conjugate. The same conjugate can serve to detect human antibodies to a wide variety of antigens in any sample.
  • the reaction is methodically simple.
  • the antigen is adsorbed on the solid phase, then washed from unbound components.
  • test material is introduced into the wells, incubated, and then a washing procedure is performed. In parallel, samples with positive and negative controls are placed.
  • the method is highly specific and sensitive. It allows you to identify nanogram amounts of antibodies in the sera of the studied patients.
  • Autoantibodies to plasminogen or its fragments are a diagnostic sign of diseases associated with an increased level of autoantibodies to plasminogen.
  • the inventors have suggested that as a result of chronic inflammation, certain plasminogen derivatives may form in the tissue.
  • certain peptides are formed in the zone of chronic inflammation of the cell, to the appearance of which the human body responds by the production of autoantibodies.
  • These autoantibodies can have an inhibitory effect on angiostatin and other plasminogen derivatives, and thus shift the balance in favor of the angiogenic system, and an excessive vascular network is one of the conditions leading to the emergence of a pathological process, including rapid development tumors.
  • the same autoantibodies can have an inhibitory effect on plasmin activity, thereby enhancing blood coagulation.
  • the experiments carried out by the inventors showed that the immunoglobulins they found are human antibodies against their own plasminogen and various products of its degradation, in particular angiostatin.
  • an increase in the titer of autoantibodies to plasminogen or products of its degradation in plasma is a marker of diseases associated with an increased level of autoantibodies to plasminogen, and measuring the level of these autoantibodies in blood plasma can be used as a diagnostic sign of a developing pathological process.
  • plasminogen autoantibodies are polyclonal and the plasminogen molecule contains many epitopes to which autoantibodies can be generated
  • the inventors propose to use various parts of the plasminogen molecule to determine the titer of autoantibodies.
  • original compositions of buffer solutions which include urea, isopropanol, dimethyl sulfoxide, were first used for the first time.
  • the inventors disclose a new method for determining the level of autoantibodies to plasminogen or its fragments in the blood, which is a diagnostic test system for identifying a subject with a high content of autoantibodies to plasminogen or its fragments, including a sample dilution buffer, an incubation buffer, including organic components, solid a carrier, an antigen representing a full-sized plasminogen or a fragment thereof containing at least one kringle, and a control sample K, wherein the composition of the buffer includes at least 2 components selected from the group: Tris-HCl, Urea, isopropanol, dimethyl sulfoxide.
  • composition of the incubation buffer in the claimed test system is selected from groups ae:
  • the plasminogen fragment in the claimed test system is selected from the list: full-sized plasminogen, Lys-plasminogen, heavy uenb (Glu-H), heavy chain (Lys-H), Kl ⁇ (Tyr80-Ala440), KlKl ⁇ l (Asn60- Pro447), Kl ⁇ l (Lys78-Pro447), Kl- (Lys78-Pro446), Kl- (Lys78-Lys468), Kl-4,5 (Lys78-Arg530.
  • control sample K in the claimed test system is a sample taken from a healthy subject.
  • plasminogen fragments for the detection of autoantibodies are selected from the list: Lys plasminogen, heavy chain (Glu-H), heavy chain (Lys-H), light chain (b), K1-4 (Tyr80-Ala440), Kl-3 (Tyr80 -Val338), Kl-3 (Tyr80-Val354), Kl ⁇ (Asn60-Pro447), Kl-4 (Lys78-Pro447), Kl ⁇ (Lys78-Pro446), Kl-4 (Lys78-Lys468), Kl ⁇ , 5 (Lys78-Arg530).
  • the detection of autoantibodies is carried out using an enzyme immunoassay.
  • the excess of the level of autoantibodies over the control sample K by more than 30% is an indicator of the presence of a pathological process in the subject.
  • the excess of the level of autoantibodies over the control sample K by more than 30% is an indicator of the risk of development of the oncological process in the subject.
  • the claimed test system is used to identify the risk of development of an oncological process in a subject.
  • the number of bound autoantibodies can be determined by any of the currently known detection methods: colorimetric (enzymatic), fluorescent, or conductometric (using electrical conductivity).
  • the method allows you to use the claimed diagnostic test system to identify a subject having an elevated level of autoantibodies to plasminogen or its fragments.
  • the subject under study compares the level of autoantibodies determined for him with the level of autoantibodies found in the control sample obtained from a healthy donor (s).
  • plasminogen is a glycoprotein whose molecule contains 791 amino acid residues and 24 disulfide bridges.
  • a protein consists of one polypeptide chain, where the robrough-terminal amino acid is glutamine, and C is the terminal asparagine.
  • the composition of the molecule includes 2% - 3% of carbohydrates localized in the heavy chain. Oligosaccharides are attached to Asp288 and Tre345. When plasminogen is activated, the peptide bond Arg560-Val561 is cleaved and two chains are formed, light and heavy, connected by disulfide bonds.
  • Kringles of the heavy chain are designated K1, K2, KZ, K4, K5.
  • Lysine binding sites play an important role in the interactions between plasmin (plasminogen) and fibrin, as well as plasmin and its inhibitor, a2-AP (antiplasmin). Any of the plasminogen fragments containing kringle, regardless of whether it is a product of natural cleavage in the human body or obtained as a result of in vitro cleavage of plasminogen (for example, as a result of enzymatic action), can be used to detect autoantibodies.
  • plasminogen a full-sized plasminogen molecule can also be used.
  • Full-sized plasminogen and various products of its cleavage: light or heavy chain, and any of the fragments containing kringle can be used as an antigen to create an enzyme-linked immunosorbent assay that determines the titer of autoantibodies of classes IgG, IgA and IgM to human plasminogen and its parts in samples human blood plasma.
  • antigens are derivatives of native Glu plasminogen, or can be obtained using genetic engineering methods by synthesizing a recombinant peptide in eukaryotic or bacterial expression systems.
  • Recombinant antigens correspond to the amino acid sequence of human plasminogen.
  • the antigen for the implementation of the diagnostic method disclosed in the invention in addition to the full-sized plasminogen, can also be its following fragments: Lys-plasminogen, heavy chain (Glu-H), heavy chain (Lys-H), light chain (b), Kl ⁇ t (Tyr80-Ala440), Kl-3 (Tyr80-Val338), Kl-3 (Tyr80-Val354), Kl ⁇ (Asn60-Pro447), Kl- (Lys78-Pro447), Kl-4 (Lys78-Pro446) , Kl-4 (Lys78-Lys468), Kl-4,5 (Lys78-Arg530), mini-plasmin, as well as any combination thereof.
  • plasminogen or its fragments can be used as antigens to determine the titer of human autoantibodies in the formulation of an enzyme-linked immunosorbent assay, where the sample is a plasma sample human blood, and the result of this reaction can be used as a significant diagnostic sign to detect the presence of a pathological process in the studied subject.
  • the authors first applied a method for processing plasma samples using urea, isopropanol, dimethyl sulfoxide, and caprylic acid in the incubation buffer, which can improve the sensitivity of the method, i.e. increase the number of detected positive samples, compared with the methods used previously, where the buffer solution for incubation did not contain the proposed components.
  • the diagnostic method disclosed in the present invention is based on the use of strictly defined polypeptides and the use of specific components in the incubation buffer, it is obvious to a person skilled in the art that other proteins and peptides having these amino acid sequences can be used in a similar way , as well as any combination of the proposed components in the composition of the incubation buffer, identical to those disclosed in the invention.
  • any polypeptides having a significant level of homology (90% and higher) with the claimed polypeptides can be used as antigens of the present invention, since the replacement of individual amino acids that does not change the spatial structure of kringle is not an obstacle to the formation of an antigen complex - an antibody.
  • Table 1 shows the description of various polypeptides - plasminogen derivatives that form kringles, which can be used to formulate an enzyme-linked immunosorbent reaction with samples of human blood plasma to detect autoantibodies.
  • Table 1. Fragments of plasminogen forming kringle structures.
  • Val 442 - Asn 791 (40) 38 ini-plasmin SEQID NO: 20 Table 2 shows the various organic components in the composition of the main buffer used for primary processing of plasma samples.
  • composition of the main incubation buffer 0.15 M Tris-HCl pH 8.8.
  • FIG. 1 The primary structure of human plasminogen.
  • Black arrows show the cleavage site of peptide bonds: (a) cleavage of the signal peptide — required for the formation of the native form of Glu plasminogen; (B) cleavage of the activation peptide (Glu'-Lys 77 ) and conversion of Glu-plasminogen to Lb 78 -plasminogen or Glu-plasmin to Lys 78 -plasmin; (c) cleavage of the Arg 561- Val 562 peptide bond and conversion of plasminogen to plasmin.
  • White arrows indicate the boundaries of introns in the nucleotide sequence of the human plasminogen gene.
  • Triangles indicate the attachment sites of ⁇ -linked oligosaccharides at position 289 and O-linked glycans at position 346.
  • the His “catalytic triads, Asp 040 , and Ser ', are indicated by an asterisk (*).
  • Disulfide bonds are indicated by a solid line.
  • Plasminogen and its fragments disclosed in the present invention were obtained either by genetic engineering or purified from blood plasma and used as antigens to create kits for immunoassay analysis to determine the level of autoantibodies of class IgG, IgA, IgM to plasminogen or its fragments in the blood of patients with various forms of malignant tumors or autoimmune diseases confirmed by alternative diagnostic methods.
  • the principle of the method is the activation of plasminogen into plasmin, followed by restoration of SS bonds between the heavy and light chains under conditions excluding autolysis, and the isolation of fragments by affinity chromatography on Lys-Sepharose 4B.
  • Urokinase breaks the activation link Arg 561 -Val 562 in plasminogen.
  • the resulting plasmin breaks the 77-78 bond and the ⁇ -terminal peptide is cleaved (1-77).
  • Mercaptoethanol reduces the bonds of Cys 55 8-Cys 5 66 and Cys 54 8-Cys 666 , connecting the heavy and light chains.
  • the first stage the allocation of a sufficient amount of Glu-Pg from blood plasma.
  • Glu-plasminogen was removed from frozen donated human blood plasma using affinity chromatography on Lys-sepharose 4B at 4 ° C and pH 8.0.
  • Blood plasma was thawed in the presence of aprotinin, centrifuged for 30 min at 4 ° C and diluted 2 times with 0.02 M K-phosphate buffer, pH 8.0, containing 20 KIU / ml aprotinin.
  • the prepared plasma was applied to a Lys-Sepharose 4B column, equilibrated with 0.1 M K-phosphate buffer, pH 8.0, containing 20 KIU / ml aprotinin.
  • the precipitate was left at 4 ° C for 18-24 hours, after which it was separated by centrifugation and dissolved in 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, to a concentration of about 1.5 -2.0 mg / ml.
  • Purified Glu-Pg was dialyzed at 4 ° C. against water (pH 8.0) and lyophilized.
  • the second stage obtaining double-stranded plasmin by activation of single-chain Glu-Pg urokinase (Wakamoto Pharmaceutical Co. Ltd. (Korea).
  • Glu-Pg 5 mg / ml
  • Tris-HCl buffer, pH 8 8 containing 0.02 M L-lysine, 0.15 M NaCl, 20% glycerol and 6000 KIU / ml aprotinin
  • urokinase was added to a final concentration of 600 IU / ml and incubated for 4 hours at 37 ° C.
  • Pg to plasmin was controlled by growth to the maximum hydrolysis rate of a specific plasmin substrate S-2251 (HD-Val-Leu-Lys p-nitroanilide, Sigma, USA) in samples taken from the reaction mixture.
  • the third stage the restoration of SS-bonds between the heavy and light chains of plasmin.
  • mercaptoethanol was added to a final concentration of 0.25 ha and incubated in a stream of nitrogen in the dark for 20 minutes.
  • the free SH groups formed were blocked by incubating the reaction mixture with a freshly prepared solution of iodoacetic acid in 0.1 M Na-phosphate buffer, pH 8.0 (final concentration 0.315 M) and incubated for 20 minutes.
  • Fourth step separation of the heavy and light chains of plasmin by chromatography on a column with Lys-Sepharose 4B.
  • the reaction mixture was diluted to a concentration of 1 mg / ml with 0.1 M Na-phosphate buffer, pH 8.0, containing 20 KIU / ml aprotinin and applied to a Lys-Sepharose 4B column equilibrated with the same buffer. Chromatography was performed at 25 ° C.
  • the plasmin heavy chain containing kringles of 1-5 and 30 amino acid residues of the connecting peptide is adsorbed on an affinity carrier, and the light chain is not adsorbed and is eluted with a balancing buffer.
  • the heavy chain (M r ⁇ 56-57 kDa) was eluted with a 0.2 M solution of 6- aminocaproic acid in 0.1 M Na-phosphate buffer, pH 8.0.
  • the combined fractions were dialyzed against water ( ⁇ pH 8.0) and freeze-dried. If necessary, the preparation was dissolved in 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.4 and further purified by gel filtration on a Sephadex G-75 column (1.65 x 80 cm).
  • the combined protein peak fractions were dialyzed against water, pH 8.0, and lyophilized.
  • the purity and molecular weight of the preparations was evaluated by electrophoresis in 12% PAAG in the presence of 0.1% SDS.
  • the lack of amidase activity (according to S-2251) before and after incubation of its solution with streptokinase indicated that the heavy chain does not contain trace concentrations of mini-plasminogen that might not be detected by electrophoresis.
  • Lys-plasminogen (Lys 78-Asn 791) and the Heavy chain (Lys-H Lys 78 - Arg 561 ) was carried out by the same method, only without the addition of an inhibitor, aprotinin.
  • Miniplasmin includes K5 and plasmin light chain. Its sequence starts from Val 442 to Asn 791
  • Glu plasminogen (10 mg / ml) was activated with urokinase (bOOME / ml) in 0.05 M phosphate buffer, pH 9.0, containing 0.02 M L-lysine and 0.1 M NaCL, at 37 °.
  • the completeness of the conversion of plasminogen to plasmin was controlled by increasing the amidase activity of the solution to a maximum value.
  • the reaction mixture was diluted 5 times with a buffer containing 0.1 M phosphate buffer, pH 8.0 and 40 Kg / ml aprotinin, and applied to a Lys-Sepharose 4B column equilibrated with the same buffer. After the release of micro-plasmin, sorbed angiostatin K1-4.5 was eluted from the column with a 0.2 M solution of 6-aminocaproic acid in 0.1 M phosphate buffer, pH 8.0 and 40 KS / ml aprotinin, dialyzed against water and lyophilized. The purity of the drug was checked using SDS-PAGE electrophoresis in 12% gel.
  • K 1 - 4,5 can be a natural product, including kringles 1 ⁇ 1 plus 85% K5, (Lys 78 -Arg 530 ). Plasmin is converted into K1-4.5 in two stages. First, plasminogen passes into plasmin, then plasmin undergoes autoproteolysis of the inner loop 5 of kringle. Autoproteolysis can be caused by free sulfhydryl donors or an alkaline environment. In addition, such degradation of plasmin occurs when a concentrated growth medium of HT 1080 cells is added to the substrate, as well as a number of other cultured tumor cells. This process involves plasmin reductase, which is contained in the growth medium of tumor cells (Paul Stathakis, Angelina J.
  • Kringles Kl-4 (Tyr 80 -Ala 440 ) and Kl-3 (Tyr 80 -Val 338 ) K4-5 (Val 355 - Phe 546 ) were obtained by hydrolysis of Glu-plasminogen elastase according to the method described in Cao Y. , Ji RW, Davidson D., Schaller J., Marti D., Sohndel S., McCanse SG, CTReilly MS, Llinas M., and Folkman J. (1996) J. Biol. Chem., 271, 29461-29467.
  • Glu plasminogen was incubated with elastase at a ratio of 50: 1 (M / M) in a buffer containing 0.05 M Tris-HCl, pH 8.5, 0.5 M NaCl and 200 KS aprotinin, for 5 hours at room temperature.
  • the elastolysis reaction was stopped by three times the addition of PMFS to maintain its concentration of 1 mM for 40-50 minutes.
  • gel filtration of the mixture was carried out on a Sephadex G-75 column to separate low and high molecular weight impurities.
  • the protein fractions of the second peak containing K1-3, K1-4, K4-5 and Miniplasmin were applied to an affinity column with Lys-Sepharose 4B, balanced with a buffer with 0.05 M Tris-HCl, pH 8.5 and 0.15 M NaCl .
  • the sorbed K1-3, K1-4, and K4-5 fragments were eluted with a solution of 0.2 M 6-aminocaproic acid in the same buffer, dialyzed against a buffer containing 0.02 M Tris-HCl, pH 8.0 and applied to a heparin agarose column equilibrated with the same buffer.
  • K1-3 fragment was eluted with a solution of 0.25 M KCl in the same buffer. The resulting K1-3 fragment was dialyzed against water and lyophilized. K 1-4 and K4-5 were separated by gel filtration on a Sephadex G-75 column.
  • Kringles K1- (Lys 78 -Pro 446 ) and Kl-4 (Lys 78- Lys 468 ) were obtained according to the method of Patterson, B. C. and Sang, Q. A. (1997) J.Biol.Chem. 272, 28823-28825 using metalloproteinases.
  • Kringle Kl- (Asn 60 -Pro 447 ) was obtained by the method of Lijnen, N. R., Ugwu, F., Bini, A., and Collen, D. (1998) Biochemistry 37, 4699-4702 using metalloproteinases.
  • Full-sized plasminogen or fragments containing at least one kringle were used as antigens for enzyme immunoassay.
  • the various types of antigens used in the enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis are listed in table. 1. Their primary amino acid sequence is listed in the sequence listing.
  • the antigen was diluted in 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6 at a maximum concentration of 5 ⁇ g / ml for molecules with a molecular weight of more than 25 kD and 10 ⁇ g / ml for molecules with a molecular weight of less than 25 kD.
  • Antigen dilution data was used to determine all types of immunoglobulins.
  • PBS phosphate buffered saline, phosphate saline
  • Substrate buffer solution (pH 4.3): 31 mM citric acid, 0.05 N NaOH, ZM H202 TMB solution: 5mM 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine in 70% DMSO
  • Chromogenic substrate (prepared before use): mix 4 parts of substrate buffer solution and one part of TMB solution.
  • antigen was preliminarily immobilized.
  • Various types of carriers can be used to immobilize the antigen, for example nitrocellulose, glass beads or other particles capable of adsorbing proteins, immunological strips or plates.
  • 100 ⁇ l of antigen solution was added to each well. Incubation was carried out for 14-16 hours at 4 ° C in a humid chamber. The contents of the wells were removed by shaking, then the plate was washed twice with a solution containing a single PBS with 0.05% Tweeen-20, 200 ⁇ l / well to remove unbound antigen.
  • BSA bovine serum albumin
  • the incubation buffer used which included the proposed components (urea, isopropanol, dimethyl sulfoxide, caprylic acid) in the claimed combinations (N ° l-5), allowed the final dilution of the plasma sample to be used up to 1000 times.
  • Test and control plasma samples were diluted 100 times with incubation buffer, incubated for 1 hour at 37 ° C and then diluted with dilution buffer (0.1 M Tris-HCl with 0.05% Tween-20 pH 8.0) 10 times, after that, 100 ⁇ l was added to the corresponding wells of the plate and incubated for 1 hour at 37 ° C. After incubation, the contents of the wells were removed, the tablet washed 4 times with washing solution (PBS with 0.05% Tween-20), each time carefully removing the contents of the wells.
  • dilution buffer 0.1 M Tris-HCl with 0.05% Tween-20 pH 8.0
  • Plasma samples of patients were taken from the ulnar vein with the help of vacuiners with EDTA. Then the samples were centrifuged at a speed of 3000 rpm for 15 minutes Plasma was poured into 100 ⁇ l tubes, frozen and stored at -40 ° C.
  • the control group consisted of plasma samples taken from 30 healthy men and 30 healthy women at the blood transfusion station. Each sample was negative in tests for hepatitis A, B, C, HIV viruses, as well as tuberculosis and syphilis.
  • the level of IgG class autoantibodies in the control samples was measured using an enzyme immunoassay according to the described procedure. Dilution of control plasma samples was selected so that the optical density was not more than 0.2.
  • Example 1 Detection of IgG autoantibodies in prostate cancer.
  • the diagnoses of patients with prostate cancer were established on the basis of the following indicators: a clinical examination with morphological confirmation of the diagnosis and oncological markers (PSA). In total, this group included 30 patients.
  • the number of positive samples in patients with prostate cancer was 21 out of 30 samples for IgG, if the incubation buffer was used without the proposed components.
  • the dilution of samples in this case was 1: 100 Using BI N ° l, 2, 3, 4, 5, the number of positive samples in patients with prostate cancer was 29 out of 30 samples for IgG, and the final dilution was 1: 1000. 78 530
  • the number of positive samples in patients with prostate cancer was 21 out of 30 samples for IgG if an incubation buffer without the proposed components was used. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with prostate cancer was 29 out of 30 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • the diagnoses of patients with lung cancer were established on the basis of the following indicators: clinical examination with morphological confirmation of the diagnosis. In total, this group included 20 patients.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 13 of 20 samples for IgG, if an incubation buffer was used without the proposed components. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • BI N ° l, 2, 3, 4, 5 the number of positive samples in patients with cancer
  • fragment K 1-4.5 (Lys-Arg) as an antigen in ELISA
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 12 out of 20 samples for IgG if an incubation buffer without the proposed components was used. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 20 out of 20 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 1 1 out of 20 samples for IgG, if the incubation buffer was used without the proposed components. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 20 out of 20 samples for IgG.
  • the final dilution was 1: 1000.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 1 1 out of 20 samples for IgG if an incubation buffer without the proposed components was used. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 20 out of 20 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • fragment K 1-4 (Lys 78 -Pro 447 ) as an antigen in ELISA
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 1 1 out of 20 samples for IgG if an incubation buffer without the proposed components was used. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 20 out of 20 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • fragment K 1-4 (Lys 78 -Pro 446 ) as an antigen in ELISA
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 1 1 out 20 samples for IgG, if an incubation buffer was used without the proposed components. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 20 out of 20 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 1 1 out of 20 samples for IgG, if the incubation buffer was used without the proposed components. Dilution of samples in this case was 1: 100. When using BI Nal, 2, 3, 4, 5, the number of positive samples in patients with lung cancer was 20 out of 20 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 1 1 out of 20 samples for IgG if an incubation buffer without the proposed components was used. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with lung cancer was 20 out of 20 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • the diagnoses of patients with breast cancer were established on the basis of the following indicators: clinical examination with morphological confirmation of the diagnosis and oncological markers (CA 15-3). In total, this group included 40 patients.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay of samples taken from patients with breast cancer and a control sample was carried out according to the described method. Samples that had an optical density in ELISA, 30% or more higher than the optical density of the control sample were considered positive.
  • the number of positive samples in patients with breast cancer was 24 out of 40 samples for IgG, if the incubation buffer was used without the proposed components. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with breast cancer was 39 of 40 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • the number of positive samples in patients with breast cancer was 24 out of 40 samples for IgG if an incubation buffer without the proposed components was used. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with breast cancer was 39 out of 40 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • the diagnoses of patients with ovarian cancer were established on the basis of the following indicators: clinical examination with morphological confirmation of the diagnosis and on the basis of cancer markers (CA 125). In total, this group included 1 1 patients.
  • the number of positive samples in patients with ovarian cancer was 6 out of 11 samples for IgG, if an incubation buffer without the proposed components was used. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with ovarian cancer was 1 1 out of 1 1 samples for IgG. The final dilution was 1: 1000.
  • the number of positive samples in patients with ovarian cancer was 6 out of 1 1 samples for IgG, if an incubation buffer was used without the proposed components. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with ovarian cancer was 1 1 out of 1 1 samples for IgG.
  • the final dilution was 1: 1000.
  • the number of positive samples in patients with ovarian cancer was 6 out of 11 samples for IgG if an incubation buffer without the proposed components was used. Dilution of samples in this case was 1: 100.
  • the number of positive samples in patients with ovarian cancer was 1 1 out of 1 1 samples for IgG.
  • the final dilution was 1: 1 LLC.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Диагностическая тест-система для выявления субъекта с повышенным содержанием аутоантител к плазминогену или его фрагментам, включающая буфер для разведения образца, буфер для инкубации, включающий органические компоненты, твердый носитель, антиген, представляющий собой полноразмерный плазминоген или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один крингл, и контрольную пробу К, при этом состав буфера включает по меньшей мере 2 компонента, выбранных из группы: Трис-HCl, Мочевина, изопропанол, диметилсульфоксид. 2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что состав буфера для инкубации выбирается из групп a-e. a 0,15 М Трис-HCl pH 8,8, 1М Мочевина, 10% изопропанол; b 0,15 М Трис-HCl pH 8,8, 10% диметилсульфоксид, 10% изопропанол; с 0,15 М Трис-HCl pH 8,8, 1М Мочевина,10% диметилсульфоксид, 10% изопропанол; d 0,15 М Трис-HCl pH 8,8, 1М Мочевина, 10% диметилсульфоксид; е 0,15 М Трис-HCl pH 8,8, 1М Мочевина, 10% диметилсульфоксид, 5% изопропанол. Фрагмент плазминогена выбран из списка: полноразмерный плазминоген, Lys-плазминоген, тяжелая цепь(Glu-Н), тяжелая цепь (Lys-H), K1-4(Tyr80-Ala440), K1K1-4(Asn60-Pro447), K1-4(Lys78-Pro447), K1-4(Lys78-Pro446), K1-4(Lys78-Lys468), K1-4,5(Lys78-Arg530). Способ выявления субъекта с повышенным содержанием аутоантител к плазминогену или его фрагментам включает использование вышеизложенной тест-системы. Применение указанной тест-системы предусмотрено для выявления риска развития у субъекта онкологического процесса.

Description

Способ определения повышенного уровня аутоантител к плазминогену человека и продуктам его деградации и диагностическая тест-система для его осуществления.
Область техники
Группа изобретений относится к области медицины и иммунологии. В частности, группа изобретений относится к способам иммунологической диагностики, включающим применение пептидных последовательностей фрагментов плазминогена, которые могут быть использованы в качестве универсального антигенного маркера при проведении иммуноализа для выявления у человека заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем аутоантител к плазминогену. Группа изобретений касается также диагностической тест-системы, содержащей в качестве антигена указанные пептидные последовательности.
Терминология
Технические и научные термины, использованные в описании изобретения, имеют тот же смысл и значение, которые обычно применяются в соответствующих областях науки и техники.
Термин "антиген", используемый в изобретении, относится к белкам или их фрагментам, способным связываться с антителами.
Термин "крингл" относится к белковому домену, имеющему структуру, стабилизированную тремя дисульфидными связями.
Термин "домен" относится к участку белка, характеризующемуся определенными структурными или функциональными свойствами.
Термин "иммуноанализ" относится к методам выявления высокомолекулярных соединений, включающий в себя стадии: (а) стадию контактирования антигена с биологическим образцом при условиях, подходящих для образования комплексов антиген-антитело; и (б) стадию детекции указанных комплексов. Термин «маркер» относится к высокомолекулярным соединениям определенной структуры, выявление которых в образцах тканей человека ассоциировано с определенным спектром заболеваний.
Термин «эпитоп» в настоящем изобретении относится к участку белковой молекулы, который способен образовать связь с антителом.
Термин «антитело человека» относится к антителу, обладающему аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого человеком.
Термин «аутоантитела» (аутоагрессивные антитела, аутологичные антитела)— антитела, способные взаимодействовать с аутоантигенами, то есть с антигенами собственного организма.
Термин «диагностический тест» представляет собой определение диагностического показателя с помощью конкретного лабораторного метода, аналитические параметры которого остаются на постоянном уровне.
Уровень техники
Необходимость поиска новых маркеров для проведения диагностики заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем аутоантител к плазминогену, в частности онкологических, на наиболее ранних сроках не вызывает сомнений. В настоящее время опубликован ряд работ, показывающих, что существуют так называемые универсальные маркеры, обнаружение которых у человека может быть ассоциировано с данными видами нарушений или риском их развития (см., например, Anna Е Prizment at al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. Feb 201 1 ; 20(2): 297-307). Так, например, согласно работам Фолкмана, нормальное ' развитие организма происходит при балансе ангиогенной и антиангиогенной систем. Известно, что опухолевая ткань содержит значительно больше сосудов и капилляров, чем окружающая здоровая ткань. По этим сосудам к быстро растущим опухолевым клеткам поступают питательные вещества и кислород, необходимые им для деления. (Folkman J. ngiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med 1995;1 :27-31. Folkman J. Tumor angiogenesis. Adv Cancer Res 1985; 43:175-203). Также известно, что раковые клетки в минимальном транзиторном количестве всегда присутствуют в организме и если возникают условия подходящие для их развития (достаточное количество сосудов, соответствующее микроокружение, и их объём превышает 2 mm ), то опухоль начинает быстро развиваться, при этом образуется очаг воспаления. Обзор механизмов ангиогенеза и его участия в опухолеобразовании дан в публикации РСТ WO 95/29242.
Плазминоген - неактивный предшественник основного фермента фибринолиза, плазмина, обнаружен во многих биологических жидкостях организма, некоторых тканях и компонентах крови. Плазмин относится к эндопептидазам - сериновым протеазам трипсиноподобного действия. Физиологическое действие плазмина направлено на поддержание баланса системы свертываемости крови. Плазмин обычно получают из плазминогена путём его активации стрептокиназой, урокиназой. Система плазминоген/плазмин принимает активное участие не только в процессах фибринолиза, но и тесно связанна с ангиогенезом.
Функционально значима не только нативная молекула плазминогена (плазмина), но и целый спектр продуктов её деградации. Ферментативно деградированные формы плазмина по своему действию на низкомолекулярные субстраты даже превосходят цельную молекулу (Ю.Г. Клысь, Н.В. Зайцева, А.И. Кизим, СВ. Веревка, Протеолитические производные плазминогена при развитии злокачественных новообразований, Онкология, Т 12, 2010).
Описаны варианты существования этих кринглов в плазме: К1-3; К2-3; К1-4; Kl-4,85; К1 -5 и отдельные кринглы (Perri S, Martineau D, Francois M, et al. Plasminogen kringle 5 blocks tumor progression by antiangiogenic and proinflammatory pathways. Mol Cancer Ther 2007; 6: 441-9). Известно, что все кринглы, а также их комбинации, принимают активное участие в ангиогенезе и онкогенезе. Наиболее изучена функциональная активность первых четырёх кринглов (К 1-4). Последовательность из этих кринглов представляет ангиостатин (Francis J. Castellino, Victoria A. Ploplis, Structure and function of the plasminogen/plasmin system, Thromb Haemost 2005; 93: 647-54; C. Boccaccio and Paolo M. Comoglio Cancer Res 2005; 65(19): 8579-82; Rijken DC, Lijnen HR. New insights into the molecular mechanisms of the fibrinolytic system. J Thromb Haemost 2009; 7: 4-13).
Определение уровня антител, в т.ч. аутоантител в образцах ткани, полученных от человека, обычно проводятся помощью иммуноанализа, наприер иммуноферментного анализа (ИФА).
В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:
1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.
2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем - стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.
3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.
Обычно уровень аутоантител определяют при помощи непрямого ИФА. Этот вариант ИФА используют обычно для выявления специфических антител. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата. В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов. Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител человека к самым разным антигенам в любых образцах. Реакция методически проста.
Основные этапы непрямого ИФА для определения наличия антител в исследуемом образце:
1. Антиген адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от несвязавшихся компонентов.
2. Блокируют свободные места связывания. Отмывают.
3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят процедуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями.
4. Добавляют антиглобулиновый конъюгат в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от несвязавшихся компонентов.
5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор.
6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере.
При оптимальных условиях проведения анализа метод является высокоспецифичным и чувствительным. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антител в сыворотках исследуемых больных.
Однако в существующих методах иммуноферметного анализа, предназначенных для определения титра аутоантител, существует ограничение, связанное с присутствием самого антигена в пробе. При достаточно высокой концентрации антигена в циркуляции, количество определяемых аутоантител может быть минимальным, и результаты становятся ложноотрицательными. Исследование свойств связывания комплекса антиген-антитело показало, что использование различных органических растворителей позволяет повысить чувствительность реакции (Mohd. Rehan, Hina Younus , Int. J. of Biol. Macromolecules, Effect of organic solvents on the conformation ant interaction of catalase and anticatalase antibodies).
Однако в современных работах по исследованию уровня аутоантител к плазминогену с помощью ИФА, первичную обработку плазмы и сыворотки крови проводят без использования органических растворителей. Так, при оценке уровня аутоантител к плазминогену с использованием иммуноферментного анализа образцы плазмы разводили от 1/10 до 1/100 раз в фосфатном буфере с 0,05% Tween 20 и добавлением от 0,3% до 1% желатина или БСА. (Stefanescu М., et all, Arch.Roum.Pathol.Exp.Microbiol., 1989,48, 47-53 ; C.Bu et all, Clin. Exp.Immunology, 2007, 149,31-39).
В отличие от методов, применяемых на сегодняшний день для детекции аутоантител к плазминогену, в заявленном изобретении для проведения иммуноанализа в качестве антигенов наряду с полноразмерным белком были использованы фрагменты плазминогена определенной структуры. Также для детекции аутоантител к плазминогену применялись органические компоненты в составе буферных систем, позволяющие существенно повысить чувствительность диагностической тест-системы.
Раскрытие изобретения.
Аутоантитела к плазминогену или его фрагментам являются диагностическим признаком заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем аутоантител к плазминогену.
Авторы изобретения предположили, что в результате хронического воспаления в ткани могут образовываться определенные производные плазминогена. Авторы изобретения предположили, что в зоне хронического воспаления клетки образовываются определенные пептиды, на появление которых организм человека отвечает выработкой аутоантител. Эти аутоантитела, в свою очередь, могут оказывать ингибирующие действие на ангиостатин и другие производные плазминогена, и таким образом смещают баланс в пользу ангиогенной системы, а избыточная сосудистая сеть и является одним из условий, приводящих к возникновению патологического процесса, в том числе и быстрому развитию опухоли. Эти же аутоантитела могут оказывать ингибирующее действие на активность плазмина, тем самым усиливать свертываемость крови.
Эксперименты, проведенные авторами изобретения, показали, что обнаруженные ими иммуноглобулины являются антителами человека против собственного плазминогена и различных продуктов его деградации, в частности ангиостатина.
Таким образом, повышение титра аутоантител к плазминогену или продуктам его деградации в плазме является маркером заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем аутоантител к плазминогену, и измерение содержания уровня данных аутоантител в плазме крови может использоваться в качестве диагностического признака развивающегося патологического процесса.
Поскольку аутоантитела к плазминогену являются поликлональными, и молекула плазминогена содержит множество эпитопов, к которым могут быть выработаны аутоантитела, авторы изобретения предлагают использовать различные части молекулы плазминогена для определения титра аутоантител. Для повышения чувствительности метода определения титра аутоантител к плазминогену и его производных впервые были впервые использованы оригинальные составы буферных растворов, которые включают мочевину, изопропанол, диметилсульфоксид.
В настоящее время в опубликованных источниках отсутствуют какие-либо данные об использовании предложенных компонентов в составе буфера для инкубации образцов плазмы в известных методах определения уровня аутоантител.
Авторы изобретения раскрывают новый способ определения уровня аутоантител к плазминогену или его фрагментам в крови, представляюший собой диагностическую тест-систему для выявления субъекта с повышенным содержанием аутоантител к плазминогену или его фрагментам, включающую буфер для разведения образца, буфер для инкубации, включающий органические компоненты, твердый носитель, антиген, представляющий собой полноразмерный плазминоген или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один крингл, и контрольную пробу К, при этом состав буфера включает по меньшей мере 2 компонента, выбранных из группы: Трис-HCl, Мочевина, изопропанол, диметилсульфоксид.
Состав буфера для инкубации в заявленной тест-системе выбирается из групп а-е:
а. 0, 15 М Трис-HCl рН 8,8, 1 М Мочевина, 10% изопропанол;
b. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 10% диметилсульфоксид, 10% изопропанол; c. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина, 10% диметилсульфоксид;
d. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина ,10% диметилсульфоксид, 10% изопропанол;
е. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина ,10% диметилсульфоксид, 5% изопропанол.
При этом фрагмент плазминогена в заявленной тест-системе выбран из списка: полноразмерный плазминоген, Lys-плазминоген, тяжелая uenb(Glu-H), тяжелая цепь (Lys-H), Kl^(Tyr80-Ala440),KlKl^l(Asn60-Pro447), Kl^l(Lys78- Pro447), Kl- (Lys78-Pro446), Kl- (Lys78-Lys468), Kl-4,5(Lys78-Arg530.
При этом контрольной пробой К в заявленной тест-системе является проба, взятая у здорового субъекта.
При осуществлении способа определения уровня аутоантител к плазминогену или его фрагментам в крови с использованием заявленной тест- системы фрагменты плазминогена для выявления аутоантител выбраны из списка: Lys-плазминоген, тяжелая цепь (Glu-H), тяжелая цепь (Lys-H), легкая цепь(Ь), К1- 4(Tyr80-Ala440),Kl-3(Tyr80-Val338), Kl-3(Tyr80-Val354), Kl^(Asn60-Pro447), Kl-4(Lys78-Pro447), Kl^(Lys78-Pro446), Kl-4(Lys78-Lys468), Kl^,5(Lys78- Arg530).
При этом выявление аутоантител проводят при помощи иммуноферментной реакции.
При этом превышение уровня аутоантител над контрольной пробой К более чем на 30 % является показателем наличия у субъекта патологического процесса.
При этом превышение уровня аутоантител над контрольной пробой К более чем на 30 % является показателем риска развития у субъекта онкологического процесса.
Заявленную тест-систему применяют для выявления риска развития у субъекта онкологического процесса.
Количество связавшихся аутоантител может быть определено любыми методами детекции, известными в настоящее время: колориметрическим (ферментным), флуоресцентным, или кондуктометрическим (использование электрической проводимости).
Способ позволяет использовать заявленную диагностическую тест-систему для выявления субъекта, имеющего повышенный уровень аутоантител к плазминогену или его фрагментам. Для того, чтобы диагностировать повышенный по сравнению с нормальным уровень аутоантел у исследуемого субъекта, проводят сравнение определенного для него уровня аутоантител с уровнем аутоантител, обнаруживаемом в контрольном образце, полученном от здорового донора (доноров).
Таким образом, авторы усматривают технический результат в достижении необходимой степени диссоциации комплекса антиген-аутоантитело, пристутствующего в образце, взятом у субъекта, а также в изменении конформации антител за счет использования буфера для инкубации, содержащего органические компоненты в раскрытых соотношениях, что в свою очередь позволяет существенно повысить чувствительность метода определения уровня аутоантител к плазминогену.
Антиген для проведения иммуноанализа
По своей химической природе плазминоген является гликопротеином, молекула которого содержит 791 аминокислотных остатков и 24 дисульфидных мостика. Белок состоит из одной полипептидной цепи, где Ν-концевой аминокислотой является глютамин, С - концевой аспарагин. В состав молекулы входит 2% - 3% углеводов, локализованных в тяжёлой цепи. Олигосахариды присоединяются к Асп288 и Тре345. При активации плазминогена, происходит расщепление пептидной связи Арг560-Вал561 и образуются две цепи, легкая и тяжелая, соединенные дисульфидными связями. В лёгкой цепи (Вал561 - Асн790) находится активный протеазный центр, включающий аминокислотную последовательность: серии, гистидин, аспарагин. В тяжёлой цепи плазмина (Лиз78 - Арг560) имеется 5 близких по аминокислотной последовательности петлеобразных участка - доменов или кринглов, которые представляют собой компактные структуры глобулярного типа с хорошо выраженным гидрофобным ядром. Подобные структуры принимают участие в осуществлении белковых взаимодействий в процессе свертывания крови. Кринглы тяжёлой цепи обозначаются К1, К2, КЗ, К4, К5. В доменах К 1-4 локализованы специфические участки, обладающие сильным сродством к лизину, ε-аминокапроновой кислоты, парааминобензойной кислоте и другим со - карбоновым аминокислотам, обладающими антифибринолитическими свойствами. Лизинсвязывающие участки (ЛСУ) играют важную роль во взаимодействиях между плазмином (плазминогеном) и фибрином, а также плазмином и его ингибитором - а2-АП (антиплазмин). Любой из фрагментов плазминогена, содержащий крингл, независимо от того, является ли он продуктом естественного расщепления в организме человека или получен в результате расщепления плазминогена in vitro (например, в результате ферментативного воздействия), может быть использован для выявления аутоантител.
Для определения титра аутоантител при различных заболеваниях, связанных с накоплением аутоанител к плазминогену или его фрагментам в качестве лиганда, помимо содержащих крингл фрагментов расщепления плазминогена, может использоваться также полноразмерная молекула плазминогена.
Полноразмерный плазминоген и различные продукты его расщепления: легкая или тяжелая цепь, и любой из фрагментов, содержащий крингл, могут быть использованы в качестве антигена для создания набора иммуноферментного анализа, определяющего титр аутоантител классов IgG, IgA и IgM к плазминогену человека и его частей в образцах плазмы крови человека.
Данные антигены являются производными нативного Glu-плазминогена, либо могут быть получены с помощью генно-инженерных методов, путем синтеза рекомбинантного пептида в эукариотических или бактериальных системах экспрессии.
Рекомбинантные антигены соответствуют аминокислотной последовательности плазминогена человека. В частности, антигеном для осуществления раскрытого в изобретении способа диагностики, кроме полноразмерного плазминогена, могут являться также его следующие фрагменты: Lys-плазминоген, тяжелая цепь (Glu-H), тяжелая цепь (Lys-H), легкая цепь(Ь), Kl^t(Tyr80-Ala440),Kl-3(Tyr80-Val338), Kl-3(Tyr80-Val354), Kl^(Asn60- Pro447), Kl- (Lys78-Pro447), Kl-4(Lys78-Pro446), Kl-4(Lys78-Lys468), Kl- 4,5(Lys78-Arg530), мини-плазмин, а также любые их сочетания.
Авторы изобретения впервые обнаружили и экспериментально подтвердили, что плазминоген или его фрагменты могут быть использованы в качестве антигенов для определения титра аутоантител человека при постановке иммуноферментной реакции, где исследуемым образцом является образец плазмы крови человека, и результат данной реакции может быть использован в качестве значимого диагностического признака для выявления наличия патологического процесса у исследуемого субъекта.
Авторы впервые применили способ обработки образцов плазмы с использованием мочевины, изопропанола, диметилсульфоксида и каприловой кислоты в составе буфера инкубации, который позволяет улучшить чувствительность метода, т.е. увеличить количество обнаруженных позитивных образцов, по сравнению с методами, используемыми ранее, где буферный раствор для инкубации не имел в своем составе предложенных компонентов.
Так как раскрытый в настоящем изобретении способ диагностики основан на использовании строго определенных полипептидов и использовании специфических компонентов в составе буфера инкубации, квалифицированному специалисту в данной области техники очевидно, что аналогичным образом могут быть использованы и другие белки и пептиды, имеющие в своем составе данные аминокислотные последовательности, а также любые сочетания предложенных компонентов в составе буфера инкубации, идентичные раскрытым в изобретении.
Специалисту очевидно также, что в качестве антигенов по настоящему изобретению могут быть использованы любые полипептиды, обладающие значительным уровнем гомологии (90% и выше) с заявленными полипептидами, так как замена отдельных аминокислот, не изменяющая пространственной структуры крингла, не является препятствием для образования комплекса антиген- антитело.
В таблице 1 приведено описание различных полипептидов - производных плазминогена, формирующих кринглы, которые могут быть использованы для постановки иммуноферментной реакции с образцами плазмы крови человека для выявления аутоантител. Таблица 1. Фрагменты плазминогена, формирующие крингловые структуры.
Пептидная цепь Масса, kDa Кринглы
Glu^Asn791 98 Glu -Плазминоген SEQID NO : 1
Lys78-Asn791 83,5-84 Lys-Плаз иноген SEQIDNO:2
Glu1- Arg561 65 Тяжелая цепь (Glu-H) SEQID NO :3
Lys78-Arg561 59 Тяжелая цепь (Lys-H) SEQID NO: 4
Val562-Asn791 25(26,3) Легкая цепь(1.) SEQID NO : 5
Tyr80-Ala440 51-54 К1-4(Туг80-А1а440) SEQID NO: 6
Tyr80-Val338 41 Kl-3(Tyr80-Val338 ) SEQID NO : 7
Tyr80-Val354 44 Kl-3(Tyr80-Val354) SEQID NO : 8
Asn60-Pro447 55 Kl-4(Asn60-Pro447) SEQID NO : 9
Lys78-Pro447 58 Kl-4(Lys78-Pro447) SEQID NO : 10
Lys78-Pro446 58 Kl-4 (Lys78-Pro446) SEQID NO: 11
Lys78-Lys468 61 Kl-4(Lys78-Lys468) SEQID NO : 12
Lys78-Arg530 66,60,57 Kl-4,5 (Lys78-Arg530) SEQID NO : 13
Val355 -Phe546 K4-5(Val355 -Phe546) SEQID NO : 14
Tyr80- Glu164 9,81 Kl(Tyr80-Glu164) SEQID NO : 15
Cys165-Val338 K2-3(Cys165-Val338) SEQID NO : 16
Val354-Ala440 10-12 K4(Val354- Ala440) SEQID NO : 17
Ser441- Fhe546 12 K5(Ser441- Fhe546) SEQID NO : 18
Val442- Arg561 K5(Val442-Arg561) SEQID NO : 19
Val442- Asn791 (40) 38 ини-плазмин SEQID NO : 20 В Таблице 2 приведены различные органические компоненты в составе основного буфера, использованного для первичной обработки образцов плазмы.
Состав основного буфера инкубации: 0,15 М Трис-HCl рН 8,8.
Таблица 2
Figure imgf000016_0001
Итоговый состав буферов:
1. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, Ш Мочевина, 10% изопропанол;
2. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 10% диметилсульфоксид, 10% изопропанол;
3. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина ,10%) диметилсульфоксид, 10% изопропанол;
4. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина, 10%> диметилсульфоксид;
5. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина, 10%> диметилсульфоксид, 5% изопропанол.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Первичная структура плазминогена человека.
Черными стрелками показано место расщепления пептидных связей: (а) отщепление сигнального пептида— требуется для образования нативной формы Glu-плазминогена; (Ь) отщепление активационного пептида (Glu'-Lys77) и превращение Glu-плазминогена в Ьуз78-плазминоген или Glu-плазмина в Lys78- плазмин; (с) расщепление пептидной связи Arg561-Val562 и превращение плазминогена в плазмин.
Белыми стрелками показаны границы интронов в нуклеотидной последовательности гена плазминогена человека. Треугольники обозначают места прикрепления Ν-связанных олигосахаридов в положении 289 и О-связанных гликанов в позиции 346. Каталитические триады His" , Asp040, и Ser' , обозначены звездочкой (*). Дисульфидные связи обозначены сплошной линией. alanine— ala— A; arginine— arg— R; asparagine— asn— N; aspartic acid— asp— D; cysteine— cys— C; glutamine— gin— Q; glutamic acid— glu— E; glycine— gly— G; histidine— his— H; isoleucine— ile— I; leucine— leu— L; lysine— lys— K; methionine— met— M; phenylalanine— phe— F; proline— pro— P; serine— ser— S; threonine— thr— T; tryptophan— trp— W; tyrosine— tyr— Y; valine— val— V.
Фиг 2. Схема получения тяжелой (К1-5+30г) и легкой цепей (микро- плазмина) Glu-плазминогена.
Осуществление изобретения
Плазминоген и его фрагменты, раскрытые в настоящем изобретении (табл. 1), были получены либо генноинженерным способом, либо очищены из плазмы крови и использованы в качестве антигенов для создания наборов для иммунофермёнтного анализа для определения уровня аутоантител класса IgG , IgA , IgM к плазминогену или его фрагментам в крови пациентов с различными формами злокачественных опухолей или аутоиммунными заболеваниями, подтвержденных альтернативными методами диагностики.
Выделение антигенов для проведения иммуноанализа
Получение Тяжелой цепи (Glu-H ) Glu1- Arg561 и Легкой цепи (L) Val - Asn 791 цепи плазминогена.
Принцип метода состоит в активации плазминогена в плазмин с последующим восстановлении S-S-связей между тяжелой и легкой цепями в условиях, исключающих автолиз, и выделении фрагментов аффинной хроматографией на Lys-Сефарозе 4В. Урокиназа разрывает активационную связь Arg561-Val562 в плазминогене. Образующийся плазмин разрывает связь 77-78 и отщепляется Ν-терминальный пептид (1-77). Меркаптоэтанол восстанавливает связи Cys558-Cys566 и Cys548-Cys666, соединяющие тяжелую и легкую цепи.
Первый этап: выделение достаточного количества Glu-Pg из плазмы крови. Glu-Плазминоген вьщеляли из замороженной донорской плазмы крови человека с помощью аффинной хроматографии на Lys-сефарозе 4В при 4°С и рН 8,0. Плазму крови размораживали в присутствии апротинина, центрифугировали 30 min при 4°С и разбавляли в 2 раза 0,02 М К-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин. Подготовленную плазму наносили на колонку с Lys-сефарозой 4В , уравновешенную 0,1 М К-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин. Колонку промывали от несвязавшихся белков 0,3 М К- фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин, в течение ночи под свободным протоком до А28о = 0,05-0,01. Сорбированный Glu-Pg элюировали раствором 0,2 М 6-аминокапроновой кислоты 0,1 М К-фосфатном буфере, рН 8,0, содержавшем 20 KIU/ml апротинин. Фракции, содержавшие белок, объединяли и подвергали дополнительной очистке осаждением (NH4)2S04 (0,31 g/ml раствора белка). Осадок оставляли при 4°С на 18-24 часа, после чего отделяли центрифугированием и растворяли в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,0 до концентрации порядка 1,5 -2,0 mg/ml. Очищенный Glu-Pg диализовали при 4°С против воды (рН 8,0) и лиофилизировали.
Второй этап: получение двухцепочечного плазмина путем активации одноцепочечного Glu-Pg урокиназой (фирмы "Wakamoto Pharmaceutical Co. Ltd." (Корея). К раствору Glu-Pg (5 mg/ml) в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,8, содержавшем 0,02 М L- лизин, 0,15 М NaCl, 20 % глицерин и 6000 KIU/ml апротинина , добавляли урокиназу до конечной концентрации 600 IU/ml и инкубировали 4 часа при 37°С. Полноту превращения Glu-Pg в плазмин контролировали по росту до максимального значения скорости гидролиза специфического субстрата плазмина S-2251 (HD-Val-Leu-Lys p-nitroanilide, "Sigma", США) в пробах, отобранных из реакционной смеси.
Третий этап: восстановление S-S-связей между тяжелой и легкой цепями плазмина. К полученному раствору плазмина добавляли меркаптоэтанол до конечной концентрации 0,25 гаМ и инкубировали в токе азота в темноте в течение 20 мин. Образовавшиеся свободные SH-группы блокировали, инкубируя реакционную смесь со свежеприготовленным раствором йодоуксусной кислоты в 0,1 M Na-фосфатном буфере, рН 8,0 (конечная концентрация 0,315 М) и инкубировали 20 мин.
Четвертый этап: разделение тяжелой и легкой цепей плазмина хроматографией на колонке с Lys-Сефарозе 4В. Реакционную смесь разбавляли до концентрации 1 мг/мл 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин и наносили на колонку с Lys-Сефарозой 4В, уравновешенную тем же буфером. Хроматографию проводили при 25°С. Тяжелая цепь плазмина, содержащая кринглы 1-5 и 30 аминокислотных остатков соединительного пептида, сорбируется на аффинном носителе, а легкая цепь не сорбируется и элюируется уравновешивающим буфером Тяжелую цепь (Mr ~ 56-57 kDa) элюировали раствором 0,2 М раствором 6-аминокапроновой кислоты в 0,1 М Na- фосфатном буфере, рН 8,0 . Объединенные фракции диализовали против воды (~ рН 8,0) и высушивали лиофильно. При необходимости препарат растворяли в 0,05М Трис-HCl буфере, рН7,4 и дополнительно очищали с помощью гель- фильтрации на колонке с Сефадексом G-75 (1,65x80 cm). Объединенные фракции белкового пика диализовали против воды рН 8,0 и лиофилизировали.
Чистоту и молекулярную массу препаратов оценивали методом электрофореза в 12 % ПААГ в присутствии 0,1% SDS. Кроме того, отсутствие амидазной активности (по S-2251) до и после инкубации ее раствора со стрептокиназой свидетельствовало, что тяжелая цепь не содержит следовых концентраций мини-плазминогена, которые могли не обнаружиться при электрофорезе.
Получение Lys-плазминогена (Lys 78 -Asn 791 ) и Тяжелой цепи (Lys-H Lys 78 - Arg561) проводили тем же самым методом, только без добавления ингибитора - апротинина.
Получение миниплазмина (Val442- Asn791) Миниплазмин включает в себя К5 и лёгкую цепь плазмина. Его последовательность начинается от Val442 и до Asn791
78 791 включительно. Получается он при эластолизе Lys-плазминогена (Lys -Asn ) дальнейшей доочисткой гель-фильтрацией на сефодексе G-75. Получение крингла Kl^t,5 (Lys78-Arg530) проводили по методике, описанной в работе Cao R.,Wu H.L., Veitonmaki N., Linden P., Famedo J., Shi C.Y., and Cao Y. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,. 96, 5728-5733., с некоторыми модификациями. Glu-плазминоген (10 мг/ мл) активировали урокиназой (бООМЕ/мл) в 0,05 М фосфатном буфере рН 9,0, содержащем 0,02 М L-лизин и 0,1 М NaCL, при 37°. Полноту превращения плазминогена в плазмин контролировали по увеличению амидазной активности раствора до максимального значения. К раствору плазмина добавляли равный объём 0.2 М глицеринового буфера, рН 12,0 и инкубировали в течение 18 ч при 25° и конечном значении рН 10,5. Реакционную смесь разбавляли в 5 раз буфером, содержащим 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0 и 40 КШ/мл апротинина, и наносили на колонку с Lys-сефарозой 4В, уравновешенную тем же буфером. После выхода микро-плазмина, сорбированный ангиостатин К1-4,5 элюировали с колонки 0,2 М раствором 6- аминокапроновой кислоты в 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0 и 40 КШ/мл апротинина, диализовали против воды и лиофилизировали. Чистоту препарата проверяли с помощью SDS-ПААГ-электрофореза в 12%-ном геле. Кроме того К 1 - 4,5 может быть естественным продуктом, включающим кринглы 1^1 плюс 85% К5, (Lys78-Arg530) . Плазмин превращается в К1-4,5 в две стадии. Сначала плазминоген переходит в плазмин, затем плазмин подвергается аутопротеолизу внутренней петли 5 крингла. Аутопротеолиз может быть вызван свободными сульфгидрильными донорами или щелочной средой. Кроме того такая деградация плазмина происходит при добавлении к субстрату концентрированной ростовой среды клеток НТ 1080, а также ряда других культивированных опухолевых клеток. В этот процесс вовлечена плазмин-редуктаза, которая содержится в ростовой среде опухолевых клеток (Paul Stathakis, Angelina J. Lay, Melinda Fitzgerald, Christian Schlieker, Lisa J. Matthias and Philip J. Hogg, Angiostatin Formation Involves Disulfide Bond Reduction and Proteolysis in Kringle 5 of Plasmin, J. Biol. Chem. Vol. 274, No. 13, Issue of March 26, pp. 8910-8916, 1999; Soff G. A. Angiostatin and angiostatin-related proteins, Cancer Metastasis Rev., 19: 97-107, 2000; Hao Wang, Ryan Schultz, Jerome Hong, Deborah L. Cundiff, Keyi Jiang, and Gerald A. Soff, Cell Surface-Dependent Generation of Angiostatin4.5, Cancer Res January 1, 2004 64; 162).
Получение кринглов Kl-4(Tyr80-Ala440) и Kl-3(Tyr80-Val338) K4-5(Val355 - Phe546) проводили при помощи гидролиза Glu-плазминогена эластазой по методу, описанному в работах Cao Y., Ji R. W., Davidson D., Schaller J., Marti D., Sohndel S., McCanse S. G., CTReilly M. S., Llinas M., and Folkman J. (1996) J. Biol. Chem., 271 , 29461-29467 . Glu-плазминоген инкубировали с эластазой при соотношении 50: 1 (М/М) в буфере содержащем 0,05 М Трис-HCl, рН 8,5, 0,5 М NaCl и 200 КШ апротинина, в течение 5 часов при комнатной температуре. Реакцию эластолиза останавливали трёхкратным добавлением PMFS для поддержания его концентрации 1мМ в течение 40-50 мин. Затем проводили гель-фильтрацию смеси на колонке с сефадексом G-75 для отделения низко- и высокомолекулярных примесей. Белковые фракции второго пика содержащего К1-3, К1-4, К4-5 и Миниплазмин, наносили на аффинную колонку с Lys-сефарозой 4В, уравновешенную буфером с 0,05 М Трис-HCl, рН 8,5 и 0,15 М NaCl. После выхода миниплазмина, который не сорбируется на носителе, сорбированные фрагменты К1-3 , К1-4 и К4-5 элюировали раствором 0,2 М 6-аминокапроновой кислоты в том же буфере, диализовали против буфера содержащего 0,02 М Трис-HCl, рН 8,0 и наносили на колонку с гепарин-агарозой, уравновешенной тем же буфером. После элюции несвязавшегося с носителем фрагмента К 1-4 и К4-5 уравновешивающим буфером, фрагмент К1-3 элюировали раствором 0,25 М КС1 в том же буфере. Полученные фрагмент К1-3 диализовали против воды и лиофилизовали. К 1-4 и К4-5 разделяли с помощью гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-75.
Получение кринглов K5(Ser449(Pro452)- Fhe546), Kl-3(Tyr80-Val338), К-4 (Val335-
Figure imgf000021_0001
работе Cao, Y., Chen, A., An, S. S. A., Ji, R. W., Davidson, D., and Llinas, M. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22924-22928). Использовался метод ограниченного эластолиза Lys-Плазминогена (Lys78-Asn791 ) . После обработки эластазой смесь наносили на колонку Mono-S (Bio-Rad) уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ NaOAc, рН 5.0. Связавшиеся фрагменты градиентно элюировали буфером, содержащем 20 мМ NaOAc, 1 М КС1, рН 5.0. Были использованы градиент 0-20%, 20-50%, 50-70%, и 70-100%. К-5 сходил при 50% градиенте. По этой же схеме, но в другом градиенте получили К-4 (Val335- Ala440-1 крингл и крингл Kl-3(Tyr80-Val354)
Кринглы К1- (Lys78-Pro446) и Kl-4(Lys78-Lys468) получались согласно методу Patterson, В. С. and Sang, Q. А. (1997) J.Biol.Chem. 272, 28823-28825 с использованием металлопротеиназ.
Крингл Kl- (Asn60-Pro447) получен по методу Lijnen, Н. R., Ugwu, F., Bini, A., and Collen, D. (1998) Biochemistry 37, 4699-4702 с использованием металлопротеиназ.
Изготовление диагностической тест-системы для иммуноферментного определения аутоантител.
В качестве антигенов для иммуноферментного определения аутоантител использовались полноразмерный плазминоген или его фрагменты, содержащие хотя бы один крингл. Различные виды антигенов, использованные в иммуноферментном анализе для проведения диагностики, перечислены в табл. 1. Их первичная аминокислотная последовательность приведена в перечне последовательностей .
Антиген разводили в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,6 в максимальной концентрации 5 мкг/мл для молекул с молекулярным весом более 25 кД и 10 мкг/мл для молекул с молекулярным весом менее 25 кД. Данные разведения антигена использовались для определения всех видов иммуноглобулинов .
PBS (phosphate buffered saline, фосфатный солевой раствор):
0,14М NaCl; 0,003М КС1; 0,005М Na2HP04; 0,002М КН2Р04
Приготовление 1л 10х PBS:
80r - NaCl 2г - КС1 18r - Na2HP04 2г - КН2Р04
Субстратный буферный раствор (рН 4,3): 31мМ лимонная кислота, 0,05н NaOH, ЗмМ Н202 Раствор ТМБ: 5мМ 3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 70% ДМСО
Субстрат-хромогенный раствор (готовится перед употреблением): смешать 4 части субстратного буферного раствора и одну часть раствора ТМБ.
При создании набора для иммуноферментного анализа проводили предварительную иммобилизацию антигена. Для иммобилизации антигена могут быть использованы различные виды носителей, например нитроцеллюлоза, стеклянные бусы или другие частицы, способные сорбировать белки, иммунологические стрипы или планшеты. На иммунологический планшет в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора антигена. Инкубация проводилась в течение 14-16 часов при 4°С во влажной камере. Содержимое лунок удаляли путём вытряхивания, затем планшет дважды промывали раствором, содержащим однократный PBS с 0,05% Tweeen-20, по 200 мкл/на лунку для удаления несвязавшегося антигена. В качестве блокирующего раствора использовали 1% раствор бычьего сывороточног альбумина(БСА) в PBS, по 200 мкл/лунка с инкубацией в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре. После окончания инкубации блокирующую жидкость удаляли, планшет сушили в течение ночи при комнатной температуре и затем использовали в дальнейшей работе.
Для увеличения чувствительности и специфичности метода использовали целый ряд компонентов в составе буфера инкубации, которые представлены в таблице 2.
Используемый буфер инкубации, в состав которого входили предложенные компоненты (мочевина, изопропанол, диметилсульфоксид, каприловая кислота) в заявленных сочетаниях (N°l-5), позволял использовать конечное разведение образца плазмы до 1000 раз.
Исследуемые и контрольные образцы плазмы крови разводили в 100 раз буфером для инкубации, инкубировали 1 час при 37°С и затем разводили разводящим буфером (0,1М Трис-HCl с 0,05% Tween-20 рН 8,0) в 10 раз, после этого вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали 1 час при 37°С. После окончания инкубации содержимое лунок удаляли, планшет промывали 4 раза промывочным раствором (PBS с 0,05% Tween-20), каждый раз тщательно удаляя содержимое лунок. Рабочее разведение коньюгата в PBS с 0,5%> БСА (для определения IgG, IgA, IgM в качестве коньюгата использовали соответственно Mab Fc IgG-peroxidase, Mab Fc IgA-peroxidase, Mab IgM- peroxidase) вносили в соответствующие лунки планшета по 100 мкл/лунка и снова инкубировали 1 час при 37°С. Несвязавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили по 100 мкл субстрат-хромогенного раствора и инкубировали 15 минут при 37°С. Реакцию останавливали, внося во все используемые лунки по 100 мкл стоп-раствора (2М H2S04). Фотометрию проводили на фотометре вертикального сканирования «УНИПЛАН» (фирма «ПИКОН», Россия) с длиной волны 450 нм.
Проведение иммуноферментного детектирования аутоантител к плазминогену или его фрагментам
Образцы крови больных забирали из локтевой вены с помощью вакутейнеров с ЭДТА. Затем образцы центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течении 15 мин. Плазму разливали в пробирки по 100 мкл., замораживали и хранили при температуре -40°.
Контрольную группу составляли образцы плазмы, взятые от 30 здоровых мужчин и 30 здоровых женщин на станции переливания крови. Каждый образец был отрицателен в тестах на гепатиты А, В, С, вирусы ВИЧ, а также туберкулез и сифилис.
Уровень аутоантител класса IgG в контрольных образцах измерялся при помощи иммуноферментного набора, согласно описанной методике. Разведение контрольных образцов плазмы подбиралось таким образом, чтобы оптическая плотность была не более 0,2 .
При проведении иммуноферментного анализа контрольных проб опытным путем установлено конечное разведение 1/1000, которое в дальнейшем использовалось для анализа всех проб. В качестве антигена использовалась как целая молекула, так и её фрагменты. Для точности измерения, уровень аутоантител в каждой пробе проверяли в дубле. После измерения 30 мужских и 30 женских контрольных проб, был вычислен средний уровень оптической плотности для каждой контрольной группы, используемой для тестирования различных фрагментов или полной молекулы плазминогена в качестве лиганда.
Иммуноферментный тест контрольных проб проводился с каждым отдельно взятым антигеном. Количество проб выше среднего значения не более чем на 20% в мужской группе было в пределах от 2% до 5%, а в женской от 3% до 6% при тестировании со всеми исследуемыми антигенами. Для сравнительного исследования контрольной группы с образцами проб больных раком, из контрольной группы были взяты 5 образцов с показателями оптической плотности, отличающихся не более 5% от среднего. Эти 5 проб были объединены в одну пулированную пробу - контрольную пробу (К), использованную в качестве эталона уровня аутоантител к плазминогену. Пробы К были разными при исследовании аутоантител класса IgG . Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в тесте, превышающие более чем на 30% оптическую плотность контрольной пробы. Данное пороговое значение позволяет исключить получение ложноположительных результатов, т.е. ошибочно отнести человека к группе больных или подверженных риску заболевания.
Для оценки эффективности использования различных фрагментов плазминогена и различного сочетания предложенных компонентов (мочевина, изопропанол, диметилсульфоксид, каприловая кислота) в составе буфера инкубации при исследовании уровня аутоантител были использованы образцы плазмы крови больных с различными формами злокачественных опухолей. Для данных больных в примерах показаны результаты применения различных антигенов в тест-системах, направленных на выявление аутоантител типа IgG .
Примеры
При использовании основного буфера инкубации без предложенных компонентов (мочевина, изопропанол, диметилсульфоксид), разведение проб было лишь 1 : 100, а при конечном разведении 1 : 1000 различий между контрольной пробой и пробой от больного не было и значения оптической плотности были на уровне фона. При использовании буферов инкубации с предложенными компонентами (таблица 2) во всех случаях наблюдались различия между контрольной пробой и исследуемой при конечном разведении 1 : 1000.
Пример 1. Выявление аутоантител IgG при раке простаты.
Диагнозы больных с раком простаты были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических маркёров (ПСА). Всего в эту группу входило 30 больных.
Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб взятых у больных раком простаты и контрольного образца проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА, более чем на 30% превышающие оптическую плотность контрольной пробы.
Результаты:
При использовании в качестве антигена Glu-плазминогена в ИФА, количество положительных проб у больных раком простаты составляло 21 из 30 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании буфера инкубации (БИ) N°l, 2, 3, 4, 5 количество положительных проб у больных раком простаты составляло 29 из 30 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена тяжелой цепи (Glu1- Arg" 61) в ИФА, количество положительных проб у больных раком простаты составляло 21 из 30 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l , 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком простаты составляло 29 из 30 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000. 78 530
При использовании в качестве антигена фрагмента К 1-4,5 (Lys -Arg ) в ИФА, количество положительных проб у больных раком простаты составляло 21 из 30 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ JSfol , 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком простаты составляло 29 из 30 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена фрагмента Kl^(Tyr80-Asn440) в ИФА, количество положительных проб у больных раком простаты составляло 21 из 30 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком простаты составляло 29 из 30 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
Пример 2. Диагностика рака лёгких
Диагнозы больных с раком лёгких были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза. Всего в эту группу входило 20 больных.
Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб взятых у больных раком лёгких и контрольного образца проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА, на 30% и более превышающие оптическую плотность контрольной пробы.
Результаты.
При использовании в качестве антигена Glu-плазминогена в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 13 из 20 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l , 2, 3, 4, количество положительных проб у больных раком простаты составляло 20 из 20 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена тяжелой цепи (Glu1- Arg561) в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 13 из 20 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком
78 530
При использовании в качестве антигена фрагмента К 1-4,5 (Lys -Arg ) в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 12 из 20 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком легких составляло 20 из 20 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена фрагмента Kl^(Tyr80-Asn440) в
ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 1 1 из 20 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l , 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком легких составляло 20 из 20 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена фрагмента Kl-4(Asn60-Pro447) в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 1 1 из 20 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком легких составляло 20 из 20 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена фрагмента К 1-4 (Lys78-Pro447) в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 1 1 из 20 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком легких составляло 20 из 20 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена фрагмента К 1-4 (Lys78-Pro446) в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 1 1 из 20 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5 количество положительных проб у больных раком легких составляло 20 из 20 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
78 468 При использовании в качестве антигена фрагмента К 1-4 (Lys -Lys ) в
ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 1 1 из 20 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ Nal, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком легких составляло 20 из 20 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена фрагмента Kl^ (Leu74-Leu451) в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 1 1 из 20 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 :100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком легких составляло 20 из 20 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
Пример 3. Диагностика рака молочной железы
Диагнозы больных с раком молочных желёз были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических маркёров (СА 15-3). Всего в эту группу входило 40 больных.
Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб, взятых у больных раком молочных желёз и контрольного образца, проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА, на 30% и более превышающие оптическую плотность контрольной пробы.
Результаты.
При использовании в качестве антигена Glu-плазминогена в ИФА, количество положительных проб у больных раком молочной железы составляло 24 из 40 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l , 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком молочной железы составляло 39 из 40 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена тяжелой цепи (Glu1- Arg561) в ИФА, количество положительных проб у больных раком молочной железы составляло 24 из 40 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N«l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком молочной железы составляло 39 из 40 проб для IgG. Конечное разведение составляло ООО.При использовании в качестве антигена фрагмента К1-^,5 (Lys78-Arg530) в ИФА, количество положительных проб у больных раком молочной железы составляло 24 из 40 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком молочной железы составляло 39 из 40 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 :1000.
При использовании в качестве антигена фрагмента Kl^l(Tyr80-Asn440) в ИФА, количество положительных проб у больных раком молочной железы составляло 24 из 40 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком молочной железы составляло 39 из 40 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
Пример 4. Диагностика рака яичника
Диагнозы больных с раком яичника были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических маркёров (СА 125). Всего в эту группу входило 1 1 больных.
Иммуноферментный анализ образцов проб, взятых у больных раком яичника, и контрольной пробы проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА на 30% и более оптической плотности контрольной пробы.
Результаты.
При использовании в качестве антигена Glu-плазминогена в ИФА, количество положительных проб у больных раком яичника составляло 6 из 11 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5, количество положительных проб у больных раком яичника составляло 1 1 из 1 1 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена тяжелой цепи (Glu1- Arg561) в ИФА, количество положительных проб у больных раком яичника составляло 6 из 11 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 :100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5 количество положительных проб у больных раком яичника составляло 1 1 из 11 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
78 530 При использовании в качестве антигена фрагмента К 1-4, 5 (Lys -Arg ) в
ИФА, количество положительных проб у больных раком яичника составляло 6 из 1 1 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5 количество положительных проб у больных раком яичника составляло 1 1 из 1 1 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1000.
При использовании в качестве антигена фрагмента Kl^t(Tyr80-Asn440) в ИФА количество положительных проб у больных раком яичника составляло 6 из 11 проб для IgG, если применялся буфер инкубации без предложенных компонентов. Разведение проб в этом случае было 1 : 100. При использовании БИ N°l, 2, 3, 4, 5 количество положительных проб у больных раком яичника составляло 1 1 из 1 1 проб для IgG. Конечное разведение составляло 1 : 1 ООО.
Приведенные примеры также подтверждают, что различия в концентрации аутоантител между контрольными образцами и с патологией выявляются при использовании в составе буфера инкубации предложенных компонентов эффективнее и с большей частотой определения положительных проб по сравнению с использованием буфера инкубации без присутствия этих компонентов.

Claims

Формула изобретения
1. Диагностическая тест-система для выявления субъекта с повышенным содержанием аутоантител к плазминогену или его фрагментам, включающая буфер для разведения образца, буфер для инкубации, включающий органические компоненты, твердый носитель, антиген, представляющий собой полноразмерный плазминоген или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один крингл, и контрольную пробу К, при этом состав буфера включает по меньшей мере 2 компонента, выбранных из группы: Трис-HCl, Мочевина, изопропанол, диметилсульфоксид.
2. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что состав буфера для инкубации выбирается из групп а-е.
a. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина, 10% изопропанол;
b. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 10% диметилсульфоксид, 10% изопропанол;
с. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина ,10% диметилсульфоксид,
10%) изопропанол ;
d. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина, 10% диметилсульфоксид; e. 0,15 М Трис-HCl рН 8,8, 1М Мочевина, 10% диметилсульфоксид, 5% изопропанол.
3. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что фрагмент плазминогена выбран из списка: полноразмерный плазминоген, Lys-плазминоген, тяжелая nenb(Glu-H), тяжелая цепь (Lys-H), Kl^(Tyr80-Ala440),KlKl^l(Asn60-Pro447), Kl-4(Lys78- Pro447), Kl^l(Lys78-Pro446), Kl^l(Lys78-Lys468), Kl- ,5(Lys78-Arg530).
4. Тест-система по любому из п. п. 1-3, отличающаяся тем, что контрольной пробой К является проба, взятая у здорового субъекта.
5. Способ выявления субъекта с повышенным содержанием аутоантител к плазминогену или его фрагментам, включающий использование тест-системы по п.1.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что фрагменты плазминогена для выявления аутоантител выбраны из списка: Lys-плазминоген, тяжелая цепь (Glu-H), тяжелая цепь (Lys-H), легкая цепь(Ь), Kl^(Tyr80-Ala440),Kl-3(Tyr80-Val338), К1- 3(Tyr80-Val354), Kl-4(Asn60-Pro447), Kl-4(Lys78-Pro447), Kl-4(Lys78-Pro446), Kl-4(Lys78-Lys468), Kl^l,5(Lys78-Arg530).
7. Способ по n. 5, отличающийся тем, что выявление аутоантител проводят при помощи иммуноферментной реакции.
8. Способ по п.п. 5-7, отличающийся тем, что превышение уровня аутоантител над контрольной пробой К более чем на 30 % является показателем наличия у субъекта патологического процесса.
9. Способ по п.п. 5-7, отличающийся тем, что превышение уровня аутоантител над контрольной пробой К более чем на 30 % является показателем риска развития у субъекта онкологического процесса.
10. Применение тест-системы по любому из п.п.1-3 для выявления риска развития у субъекта онкологического процесса.
PCT/RU2015/000271 2014-04-29 2015-04-27 Способ определения повышенного уровня аутоантител к плазминогену человека и продуктам его деградации и диагностическая тест-система для его осуществления WO2015167365A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014117186 2014-04-29
RU2014117186/15A RU2597783C2 (ru) 2014-04-29 2014-04-29 Способ определения повышенного уровня аутоантител к плазминогену человека и продуктам его деградации и диагностическая тест-система для его осуществления

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015167365A1 true WO2015167365A1 (ru) 2015-11-05

Family

ID=54358959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2015/000271 WO2015167365A1 (ru) 2014-04-29 2015-04-27 Способ определения повышенного уровня аутоантител к плазминогену человека и продуктам его деградации и диагностическая тест-система для его осуществления

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2597783C2 (ru)
WO (1) WO2015167365A1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2522231C1 (ru) * 2012-11-14 2014-07-10 Евгений Иосифович Гоуфман Способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2780161B1 (fr) * 1998-06-17 2000-09-29 Centre Nat Rech Scient Procede de diagnostic precoce du cancer base sur la recherche d'auto-anticorps diriges contre la proteine csk et trousse pour sa mise en oeuvre

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2522231C1 (ru) * 2012-11-14 2014-07-10 Евгений Иосифович Гоуфман Способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHAN-RONG-SHI ET AL.: "Use of pH 9.5 Tris-HCI buffer containing 5% urea for antigen retrieval immunohistochemistry.", BIOTECHNIC & HISTOCHEMISTRY, vol. 71, no. 4, 1996, pages 190 - 196, XP008176145, DOI: doi:10.3109/10520299609117158 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2014117186A (ru) 2015-11-10
RU2597783C2 (ru) 2016-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2522231C1 (ru) Способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления
JP2669566B2 (ja) 遊離及び複合体形成した前立腺特異的抗原（ｐｓａ）の分析
US7863009B2 (en) Mutants of the factor VII-activating protease and detection methods using specific antibodies
JP2008509379A (ja) 活性化可能な遊離型ｐｓａの検出方法、並びに、前立腺の良性病状及び前立腺ガンの診断におけるその使用
Ostapchenko et al. Enzyme electrophoresis method in analysis of active components of haemostasis system
Montes et al. Development and clinical application of a new ELISA assay to determine plasmin–α2‐antiplasmin complexes in plasma
AU655918B2 (en) Immunoassays for and monoclonal antibodies to prothrombin activation peptides and their degradation products
AU2006205700A1 (en) Forms of factor XIIa
EP1962091B1 (en) Methods and kits for detecting and measuring ADAMTS13/FX1 complexes
RU2597783C2 (ru) Способ определения повышенного уровня аутоантител к плазминогену человека и продуктам его деградации и диагностическая тест-система для его осуществления
RU2597782C1 (ru) Способ определения содержания продуктов протеолиза в плазме крови и диагностическая тест-система для его осуществления
RU2676258C2 (ru) Способ определения содержания продуктов протеолиза MUC1 и диагностическая тест-система для его осуществления
US12025616B2 (en) Method and composition for detection of proteolytic products and diagnosis of malignant neoplastic disease
Kapustianenko Polyclonal antibodies against human plasminogen kringle 5
US20220187303A1 (en) Method and composition for detection of proteolytic products and diagnosis of malignant neoplastic disease
KR100583537B1 (ko) 활성화된 응고 인자 ｖｉｉ에 특이적인 모노클로날 항체 및 이의 용도
US20190383816A1 (en) Method and composition for detection of proteolytic products and diagnosis of malignant neoplastic disease
Mirshahi et al. A monoclonal antibody directed against an epitope in the NH2-terminal region of native human plasminogen induces a modification of its functional properties
Tessmer et al. Biological activity of prostate‐specific antigen isolated by sodium dodecyl sulfate‐polyacrylamide gel electrophoresis and electroelution
JP5640271B2 (ja) 新規ペプチド及びその使用
Oda et al. Analysis of the ternary complex formation of human urokinase with the separated two domains of its receptor
Roka-Moya et al. Study of the sites of plasminogen molecule which are responsible for inhibitory effect of Lys-plasminogen on platelet aggregation
Daub The Role of N-Linked Glycosylation on Human Fibrinogen: A Structure-Function Analysis Utilizing Affinity and High-Performance Liquid Chromatography
Dahl et al. Functional measurement of t-PA in plasma using a bead immuno chromogenic assay (BICA)
Carroll Impact of biotechnology on the diagnostics of thrombotic disorders

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15785549

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15785549

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1