RU2676258C2 - Способ определения содержания продуктов протеолиза MUC1 и диагностическая тест-система для его осуществления - Google Patents
Способ определения содержания продуктов протеолиза MUC1 и диагностическая тест-система для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2676258C2 RU2676258C2 RU2016150637A RU2016150637A RU2676258C2 RU 2676258 C2 RU2676258 C2 RU 2676258C2 RU 2016150637 A RU2016150637 A RU 2016150637A RU 2016150637 A RU2016150637 A RU 2016150637A RU 2676258 C2 RU2676258 C2 RU 2676258C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- terminal lysine
- muc
- plasminogen
- muc1
- seq
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title description 6
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 title 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 87
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 77
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 72
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 69
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 44
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 35
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 21
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 15
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 15
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 claims description 7
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 claims description 7
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 68
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 44
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 43
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 26
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 20
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 14
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 13
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 13
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 13
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 12
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 6
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 6
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 6
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 6
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 6
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 6
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 6
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 5
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 5
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 150000002669 lysines Chemical group 0.000 description 4
- 108010087750 lysyl-plasminogen Proteins 0.000 description 4
- 108010015052 miniplasmin Proteins 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 3
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010251 cutis laxa Diseases 0.000 description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 102000032628 PAR-2 Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010070503 PAR-2 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 2
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001567 anti-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108010068982 microplasmin Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 108010049112 miniplasminogen Proteins 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000008756 pathogenetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010016700 plasminogen kringle 5 Proteins 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004647 pro-inflammatory pathway Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 108010008054 testis specific phosphoglycerate kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108010036927 trypsin-like serine protease Proteins 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин в жидкости, при котором приводят в контакт исследуемую жидкость с тест-системой для выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, которая включает по крайней мере выбранную одну из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20. Система содержит меченые моноклональные антитела к MUC-1 и твердый носитель с прикрепленными к нему одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, или прикрепленные к носителю моноклональные антитела к MUC-1 и меченные одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20. При превышении порогового уровня оптической плотности, определенного у жидкости, не имеющей MUC-1 с С-концевым лизином, определяют в исследуемой жидкости повышенное содержание продуктов протеолиза MUC-1, имеющего С-концевой лизин. Изобретение обеспечивает выявление субъекта, имеющего повышенный уровень MUC-1 c C-концевым лизином, способным связываться с плазминогеном или его фрагментами. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины и иммунологии и предназначено для иммунологической диагностики, включающей применение как нативной молекулы, так и пептидных последовательностей фрагментов плазминогена, которые могут быть использованы в качестве универсальной системы детекции продуктов протеолиза MUC1 с образованием на COOH-концах пептидной цепи лизина (C-концевой лизин), а также для проведения анализа с целью выявления у человека заболеваний, ассоциированных с повышенной концентрацией продуктов протеолиза MUC1 с лизином на COOH-конце пептидной цепи.
Терминология
Технические и научные термины, использованные в описании изобретения, имеют тот же смысл и значение, которые обычно применяются в соответствующих областях науки и техники.
Термин "антиген", используемый в изобретении, относится к молекуле MUC1 с лизином на COOH-конце пептидной цепи, способным связываться с антителами.
Термин "детектор" относится к пептидной последовательности, способной связываться с C-концевым лизином MUC1 образовавшимся после протеолиза.
Термин "крингл" относится к белковому домену, имеющему структуру, стабилизированную тремя дисульфидными связями.
Термин "домен" относится к участку белка, характеризующемуся определенными структурными или функциональными свойствами.
Термин "анализ" относится к методам выявления высокомолекулярных соединений и включает в себя стадии: (а) стадию контактирования антигена с биологическим образцом при условиях, подходящих для образования комплексов антиген-антитело; и (б) стадию детекции указанных комплексов.
Термин «маркер» относится к высокомолекулярным соединениям определенной структуры, выявление которых в образцах тканей человека ассоциировано с определенным спектром заболеваний.
Термин «эпитоп» в настоящем изобретении относится к участку белковой молекулы, который способен образовать связь с антителом.
Термин «лиганд» в настоящем изобретении относится к белковой молекуле, которая способна образовать нековалентную связь с C-концевым лизином MUC1.
Термин «субъект» в настоящем изобретении относится к человеку, от которого была получена сыворотка крови для проведения анализа.
Термин «диагностический тест» представляет собой определение диагностического показателя с помощью конкретного лабораторного метода, аналитические параметры которого остаются на постоянном уровне.
Уровень техники
Необходимость поиска новых маркеров для проведения диагностики заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем протеолитической активности в организме, в частности, при возникновении онкологических процессов на наиболее ранних сроках не вызывает сомнений. Известно, что развитие опухоли сопровождается высоким уровнем протеолиза (Al-Majid S., Waters Н. The biological mechanisms of cancer-related skeletal muscle wasting: the role of progressive resistance exercise // Biol. Res. Nurs. 2008. Vol. 10, №1. P. 7-20). Сегодня протеазы рассматривают, как один из факторов канцерогенеза (Bashir Т., Pagano М. Aberrant ubiquitin-mediated proteolysis of cell cycle regulatory proteins and oncogenesis // Adv. Cancer. Res. 2003. Vol. 88. P. 101-144;). В протекании процессов канцерогенеза установлено участие всех типов протеаз, под действием которых усиливается пролиферация, инвазия и метастазирование клеток опухоли (Чилингиров Р.Х. Влияние ингибиторов протеолиза на некоторые бактериальные возбудители и течение гнойно-воспалительного процесса // Пат. физиол. и эксперим. терапия. 1997. №3. С. 37-39; K. Proteinase-activated receptor 2 (PAR-2) in gastrointestinal and pancreatic pathophysiology, inflammation and neoplasia // Scand. J. Gastroenterol. 2008. Vol. 43, №8. P. 902-909), но наибольший вклад в этот процесс вносят сериновые протеазы (Zorio Е., J., F., L.A., R., A. Fibrinolysis: the key to new pathogenetic mechanisms // Curr. Med. Chem. 2008. Vol. 15, №9. P. 923-929). Мишенями сериновых протеаз в основном являются пептидные связи, образованные остатками положительно заряженных аминокислот, лизина и аргинина, а также эфиры и амиды этих аминокислот (Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. Под ред. Курганова Б.И. Москва: «Мир», 1980. 432 с). В настоящее время опубликован ряд работ, показывающих, что продукты протеолитической активности могут служить универсальными маркерами, обнаружение которых у человека может быть ассоциировано с различными аутоиммунными и онкологическими процессами. Так, например, согласно работам Robert Jordan et al. (патент US 08501907), повышенное содержание продуктов протеолиза иммуноглобулинов может служить маркером наличия аутоиммунного или онкологического заболевания.
В работе Peter C. Harpel et al (The J. of biological chemistry Vol. 264, No. 1, Iseue of January 5, pp. 616-624, 1989), представлены данные о специфическом протеолизе иммуноглобулинов плазмином. При этом часть молекулы иммуноглобулина после расщепления специфически может взаимодействовать с молекулой плазминогена благодаря наличию С-концевого лизина. Плазмин обычно получается из плазминогена путем его активации стрептокиназой или урокиназой. Плазмин относится к эндопептидазам - сериновым протеазам трипсиноподобного действия. Известно, что плазмин обладает фибринолитической активностью посредством связывания с C-концевыми лизиновыми остатками фибрина и дальнейшим протеолизом нитей фибрина, предотвращая образование сгустка. Участие C-концевых лизинов бактериальных белков в связывании с плазминогеном было продемонстрировано в работе Marco Candela et al., (Binding of Human Plasminogen to Bifidobacterium, Journal of bacteriology, Aug. 2007, p. 5929-5936). В этой работе белки, которые связывались с плазминогеном, подвергались обработке карбоксипептидазой В, которая специфически отщепляет только C-концевые лизин и аргинин. После такой обработки, белки теряли способность связываться с плазминогеном, что указывает на исключительное участие C-концевых лизинов в связывании с плазминогеном и его крингловыми фрагментами. Система плазминоген/плазмин принимает активное участие не только в процессах фибринолиза, но и тесно связана с ангиогенезом и канцерогенезом. Функционально значима не только нативная молекула плазминогена (плазмина), но и целый спектр продуктов ее деградации. Ферментативно деградированные формы плазминогена по своему действию на низкомолекулярные субстраты могут превосходить цельную молекулу (Ю.Г. Клысь, Н.В. Зайцева, А.И. Кизим, С.В. Веревка, Протеолитические производные плазминогена при развитии злокачественных новообразований, Онкология, Т 12, №1, 2010). Описаны варианты существования кринглов плазминогена в плазме: K1-3; K2-3; K1-4; K1-4,85; K1-5 (Perri S, Martineau D, Francois M, et al. Plasminogen kringle 5 blocks tumor progression by antiangiogenic and proinflammatory pathways. Mol Cancer Ther 2007; 6: 441-449). Известно, что все кринглы, а также их комбинации, принимают активное участие в ангиогенезе и онкогенезе. Кроме того, они имеют лизин-связывающие сайты (за исключением 3-го крингла). Наиболее изучена функциональная активность первых четырех кринглов (К1-4). Последовательность из этих кринглов представляет ангиостатин (Francis J. Castellino, Victoria A. Ploplis, Structure and function of the plasminogen/plasmin system, Thromb Haemost 2005; 93: 647-54; C. Boccaccio and Paolo M. Comoglio Cancer Res 2005; 65(19): 8579-82; Rijken DC, Lijnen HR. New insights into the molecular mechanisms of the fibrinolytic system. J Thromb Haemost 2009; 7: 4-13). Активация сериновых протеаз, которые являются основными участниками процессов протеолиза в области опухоли, приводит к увеличению количества продуктов распада белков, имеющих как было описано выше, С-концевой лизин. Поскольку сама молекула плазминогена/плазмина, а также ее фрагменты имеют лизин-связывающие сайты, они могут связываться с продуктами деградации сериновых протеаз и служить детектором для исследования концентрации этих продуктов в циркуляции, что может отражать как начало самого процесса канцерогенеза, так и его активность. Такой детектор обладает универсальностью по сравнению с предлагаемыми способами детекции продуктов деградации, которые требуют для этого анализа моноклональных антител, получаемых на каждый продукт протеолиза. Определение уровня продуктов протеолиза в образцах плазмы человека и животных можно проводить с помощью иммуноанализа, например иммуноферментного анализа (ИФА) где в качестве детектора используется молекула плазминогена или ее фрагменты.
Муцин 1 (MUC1), высокомолекулярный мембранно-связанный гликопротеид, относят к опухоль-ассоциированным антигенам. Повышенная, по сравнению с нормальным эпителием, экспрессия MUC1 характерна для клеток большинства эпителиальных злокачественных новообразований человека. В частности, при раке молочной железы (РМЖ) и аденокарциноме легкого сверхэкспрессия MUC1 наблюдается более чем в 90% случаев. При РМЖ, раке легкого и ряде других злокачественных опухолей повышенный уровень онкомаркера СА15-3 (MUC1) в сыворотке крови коррелирует с прогрессированием заболевания, но не обладает достаточной специфичностью и чувствительностью для ранней диагностики рака или индивидуального прогноза у онкологических больных. Молекула MUC1 имеет в своем составе аминокислотную последовательность Lys1093-Phe1094 (Рис. 1), которая может расщепляться плазмином с образованием С-концевого лизина. Авторы предложили метод определения продукта протеолиза молекулы MUC1 с С-концевым лизином на основе использования моноклональных антител к этим продуктам и способности плазминогена и его производных связываться с С-концевым лизином пептидной цепи.
В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:
1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.
2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец и контроли сравнения. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием.
3. При добавлении конъюгата антитело-фермент(метка) или антиген-фермент(метка) он связывается с комплементарным участком антигена(антитела) на твердой фазе. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции или проявлению флюоресценции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания или флуоресценции можно оценить визуально или по оптической плотности.
Уровень содержания исследуемых антигенов определяют при помощи непрямого ИФА. В лунках панелей адсорбируют антитела против искомых белков (антигенов) и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антигены, связавшиеся с антителами на твердой фазе, выявляют с помощью вторых антител к другому эпитопу антигена конъюгированных с ферментом или флуоресцентной меткой. Также может использоваться конюгат моноклональных антител ко вторым антителам. В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов. Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Реакция методически проста.
Основные этапы непрямого ИФА для определения наличия специфического антигена (или антитела) в исследуемом образце:
1. Антиген, лиганд (антитело) адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от не связавшихся компонентов.
2. Блокируют свободные места связывания. Отмывают.
3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят процедуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями.
4. Добавляют вторые антитела с конюгатом (или антиглобулиновый конъюгат) в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от не связавшихся компонентов.
5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор.
6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере.
При оптимальных условиях проведения анализа метод является высокоспецифичным и чувствительным. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антигена (антител) в сыворотках (плазме) исследуемых больных.
Таким образом, нами был разработан метод и тест-система на его основе для детекции молекулы MUC1 с С-концевым лизином. В заявленном изобретении для проведения иммуноанализа в качестве антигенов и детекторов наряду с полноразмерным плазминогеном были использованы фрагменты плазминогена определенной структуры.
Раскрытие изобретения
Повышенный уровень концентрации MUC1 с С-концевым лизином, способного связываться с плазминогеном или его фрагментами, являются диагностическим признаком заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем концентрации MUC1 с С-концевым лизином.
Авторы изобретения предположили, что в области хронического воспаления, которое наблюдается при опухолевом процессе, происходит активация сериновых протеаз, что приводит к увеличению продуктов распада белков с С-концевым лизином. Эти продукты протеолиза выходят в кровь и их количество можно определить при помощи анализа крови. Эксперименты, проведенные авторами изобретения, показали, что продукты протеолиза с С-концевым лизином можно обнаружить с помощью плазминогена или его фрагментов.
Таким образом, повышение титра MUC1 с С-концевым лизином в сыворотке крови больных субъектов или плазме по сравнению со здоровыми является маркером заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем MUC1 с С-концевым лизином и измерение содержания уровня данного гликопротеида в сыворотке крови может использоваться в качестве диагностического признака развивающегося патологического процесса.
В настоящее время в опубликованных источниках отсутствуют какие-либо данные об использовании предложенного метода детекции концентрации MUC1 с С-концевым лизином.
Авторы изобретения раскрывают новый способ определения уровня MUC1 с С-концевым лизином в крови, представляющий собой диагностическую тест-систему для выявления субъекта с повышенным содержанием протеолитического фрагмента MUC1 с С-концевым лизином способным связываться с плазминогеном или его фрагментами, включающую твердый носитель, антиген или детектор представляющие собой полноразмерный плазминоген или его фрагмент, содержащий по меньшей мере один крингл и контрольную пробу К.
При этом фрагмент плазминогена в заявленной тест-системе выбран из списка представленном в таблице 1. При этом контрольной пробой К в заявленной тест-системе является проба, взятая у здорового субъекта.
При осуществлении способа определения уровня MUC1 с С-концевым лизином в крови с использованием заявленной тест-системы, фрагменты плазминогена выбраны из списка представленного в таблице 1. При этом выявление MUC1 с С-концевым лизином проводят при помощи иммунной реакции с последующей детекцией колориметрическим, флуоресцентным или кондуктометрическим методами.
При этом превышение значения уровня MUC1 с С-концевым лизином в исследуемой пробе по сравнению с контрольной пробой К более чем на 30% является показателем наличия у субъекта патологического процесса.
Патологическим процессом является рак легких или наличие метастазов в легких при раке простаты
Способ позволяет использовать заявленную диагностическую тест-систему для выявления субъекта, имеющего повышенный уровень MUC1 с С-концевым лизином способного связываться с плазминогеном или его фрагментами. Для того, чтобы диагностировать повышенный по сравнению с нормальным уровнем MUC1 с С-концевым лизином у исследуемого субъекта, проводят сравнение полученного для него уровня MUC1 с С-концевым лизином с уровнем, обнаруживаемом в контрольном образце, полученном от здорового субъекта (доноров).
Способ включает выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин в жидкости, при котором приводят в контакт исследуемую жидкость с тест-системой для выявления продуктов протеолиза MUC-1 имеющих С-концевой лизин, которая включает по крайней мере выбранную одну из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4 6-20, система содержит твердый носитель с прикрепленными к нему одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20 и меченные моноклональные антитела к MUC-1 или прикрепленные е носителю моноклональные антитела к MUC-1 и меченные одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, при превышении порогового уровня оптической плотности определенного у жидкости не имеющей MUC-1 с С-концевым лизином, определяют в исследуемой жидкости повышенное содержание продуктов протеолиза MUC-1 имеющего С-концевой лизин.
Лиганды и детекторы для проведения иммуноанализа
По своей химической природе плазминоген является гликопротеином, молекула которого содержит 791 аминокислотных остатков и 24 дисульфидных мостика. Белок состоит из одной полипептидной цепи, где N-концевой аминокислотой является глютамин, С - концевой аспарагин. В состав молекулы входит 2%-3% углеводов, локализованных в тяжелой цепи. Олигосахариды присоединяются к Асп288 и Тре345. При активации плазминогена, происходит расщепление пептидной связи Арг560-Вал561 и образуются две цепи, легкая и тяжелая, соединенные дисульфидными связями. В легкой цепи (Вал561-Асн790) находится активный протеазный центр, включающий аминокислотную последовательность: серии, гистидин, аспарагин. В тяжелой цепи плазминогена (Лиз78-Арг560) имеется 5 близких по аминокислотной последовательности петлеобразных участка - доменов или кринглов, которые представляют собой компактные структуры глобулярного типа с хорошо выраженным гидрофобным ядром. Подобные структуры принимают участие в осуществлении белковых взаимодействий в процессе свертывания крови. Кринглы тяжелой цепи обозначаются К1, К2, К3, К4, К5. В доменах К1-5 локализованы специфические участки, обладающие сильным сродством к лизину, ε-аминокапроновой кислоты, парааминобензойной кислоте и другим ω - карбоновым аминокислотам, обладающими антифибринолитическими свойствами. Лизинсвязывающие участки (ЛСУ) играют важную роль во взаимодействиях между плазмином (плазминогеном) и фибрином, а также плазмином и его ингибитором - (антиплазмин). Любой из фрагментов плазминогена, содержащий крингл, независимо от того, является ли он продуктом естественного расщепления в организме человека или получен в результате расщепления плазминогена in vitro (например, в результате ферментативного воздействия), может быть использован для выявления MUC1 с С-концевым лизином.
Для определения титра MUC1 с С-концевым лизином при различных заболеваниях, связанных с накоплением его в циркуляции, в качестве детектора, помимо фрагментов плазминогена, может использоваться также полноразмерная молекула плазминогена.
Полноразмерный плазминоген и различные продукты его расщепления: тяжелая цепь и любой из фрагментов, содержащий крингл, могут быть использованы в качестве лиганда иммобилизованного на твердой фазе для детекции MUC1 с С-концевым лизином в образцах плазмы и сыворотки крови человека.
Лиганды и детекторы являются или нативная молекула Glu-плазминогена или протеолитические производные нативного Glu-плазминогена, либо производные молекулы Glu-плазминогена полученные с помощью генно-инженерных методов, путем синтеза рекомбинантного пептида в эукариотических или бактериальных системах экспрессии. Рекомбинантные лиганды и детекторы соответствуют аминокислотной последовательности аналогичных участков Glu-плазминогена. В частности, лигандом и детектором для осуществления раскрытого в изобретении способа диагностики, кроме полноразмерного плазминогена, могут являться также фрагменты представленные в таблице 1.
Авторы изобретения впервые обнаружили и экспериментально подтвердили, что плазминоген или его фрагменты могут быть использованы в качестве лигандов и детекторов для определения титра MUC1 с С-концевым лизином при постановке иммуноферментной реакции, где исследуемым образцом является образец сываротки крови человека и результат данной реакции может быть использован в качестве значимого диагностического признака для выявления наличия патологического процесса у исследуемого субъекта.
Несмотря на то, что раскрытый в настоящем изобретении способ определения основан на использовании в качестве детектора строго определенных полипептидов, квалифицированному специалисту в данной области техники очевидно, что аналогичным образом могут быть использованы и другие белки и пептиды, имеющие в своем составе идентичные аминокислотные последовательности представленные в таблице 1.
Специалисту очевидно также, что в качестве антигенов и детекторов по настоящему изобретению могут быть использованы любые полипептиды, обладающие значительным уровнем гомологии (80% и выше) с заявленными полипептидами представленные в таблице 1, так как замена отдельных аминокислот, не изменяющая пространственной структуры крингла, не является препятствием для детекции MUC1 с С-концевым лизином.
В таблице 1 приведено описание различных полипептидов - производных плазминогена, формирующих кринглы, которые могут быть использованы для постановки иммуноферментной реакции с образцами сыворотки крови человека для выявления MUC1 с С-концевым лизином.
В таблице 2 приведены стадии заболевания, при которых тестировались образцы сыворотки.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Первичная структура плазминогена человека.
Черными стрелками показано место расщепления пептидных связей: (а) отщепление сигнального пептида - требуется для образования нативной формы Glu-плазминогена; (b) отщепление активационного пептида (Glu'-Lys77) и превращение Glu-плазминогена в Lys78-плазминоген или Glu-плазмина в Lys78-плазмин; (с) расщепление пептидной связи Arg561-Val562 и превращение плазминогена в плазмин.
Белыми стрелками показаны границы интронов в нуклеотидной последовательности гена плазминогена человека. Треугольники обозначают места прикрепления N-связанных олигосахаридов в положении 289 и О-связанных гликанов в позиции 346. Каталитические триады His603, Asp646, и Ser741, обозначены звездочкой (*). Дисульфидные связи обозначены сплошной линией.
Фиг 2. Аминокислотная последовательность молекулы MUC1.
alanine-ala-A; arginine-arg-R; asparagine-asn-N; aspartic acid-asp-D; cysteine-cys-C; glutamine-gln-Q; glutamic acid-glu-E; glycine-gly-G; histidine-his-H; isoleucine-ile-I; leucine-leu-L; lysine-lys-K; methionine-met-M; phenylalanine-phe-F; proline-pro-P; serine-ser-S; threonine-thr-T; tryptophan-trp-W; tyrosine-tyr-Y; valine-val-V.
Осуществление изобретения
Плазминоген и его фрагменты, раскрытые в настоящем изобретении (табл. 1), были получены либо генно-инженерным способом, либо очищены из плазмы крови и использованы в качестве антигенов и детекторов для создания наборов для иммунного анализа при определении титра MUC1 с С-концевым лизином в крови пациентов с различными патологиями в том числе онкологическими заболеваниями.
Выделение лигандов для проведения иммуноанализа
Получение Тяжелой цепи (Glu-H) Glu1-Arg561 и Легкой цепи (L) Val562-Asn791 цепи плазминогена.
Принцип метода состоит в активации плазминогена в плазмин с последующим восстановлении S-S-связей между тяжелой и легкой цепями в условиях, исключающих автолиз, и выделении фрагментов аффинной хроматографией на Lys-Сефарозе 4В. Урокиназа разрывает активационную связь Arg561-Val562 в плазминогене. Образующийся плазмин разрывает связь 77-78 и отщепляется N-терминальный пептид (1-77). Меркаптоэтанол восстанавливает связи Cys558-Cys566 и Cys548-Cys666, соединяющие тяжелую и легкую цепи.
Первый этап: выделение достаточного количества Glu-Pg из плазмы крови. Glu-Плазминоген выделяли из замороженной донорской плазмы крови человека с помощью аффинной хроматографии на Lys-сефарозе 4В при 4°C и рН 8,0. Плазму крови размораживали в присутствии апротинина, центрифугировали 30 min при 4°C и разбавляли в 2 раза 0,02 М К-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин. Подготовленную плазму наносили на колонку с Lys-сефарозой 4В, уравновешенную 0,1 М К-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин. Колонку промывали от не связавшихся белков 0,3 М К-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин, в течение ночи под свободным протоком до А280=0,05-0,01. Сорбированный Glu-Pg элюировали раствором 0,2 М 6-аминокапроновой кислоты 0,1 М К-фосфатном буфере, рН 8,0, содержавшем 20 KIU/ml апротинин. Фракции, содержавшие белок, объединяли и подвергали дополнительной очистке осаждением (NH4)2SO4 (0,31 g/ml раствора белка). Осадок оставляли при 4°C на 18-24 часа, после чего отделяли центрифугированием и растворяли в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,0 до концентрации порядка 1,5-2,0 mg/ml. Очищенный Glu-Pg диализовали при 4°C против воды (рН 8,0) и лиофилизировали.
Второй этап: получение двухцепочечного плазмина путем активации одноцепочечного Glu-Pg урокиназой (фирмы "Wakamoto Pharmaceutical Co. Ltd." (Корея). К раствору Glu-Pg (5 mg/ml) в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,8, содержавшем 0,02 М L-лизин, 0,15 М NaCl, 20% глицерин и 6000 KIU/ml апротинина, добавляли урокиназу до конечной концентрации 600 IU/ml и инкубировали 4 часа при 37°C. Полноту превращения Glu-Pg в плазмин контролировали по росту до максимального значения скорости гидролиза специфического субстрата плазмина S-2251 (HD-Val-Leu-Lys p-nitroanilide, "Sigma", США) в пробах, отобранных из реакционной смеси.
Третий этап: восстановление S-S-связей между тяжелой и легкой цепями плазмина. К полученному раствору плазмина добавляли меркаптоэтанол до конечной концентрации 0,25 mM и инкубировали в токе азота в темноте в течение 20 мин. Образовавшиеся свободные SH-группы блокировали, инкубируя реакционную смесь со свежеприготовленным раствором йодоуксусной кислоты в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 8,0 (конечная концентрация 0,315 М) и инкубировали 20 мин.
Четвертый этап: разделение тяжелой и легкой цепей плазмина хроматографией на колонке с Lys-Сефарозе 4В. Реакционную смесь разбавляли до концентрации 1 мг/мл 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин и наносили на колонку с Lys-Сефарозой 4В, уравновешенную тем же буфером. Хроматографию проводили при 25°C. Тяжелая цепь плазмина, содержащая кринглы 1-5 и 30 аминокислотных остатков соединительного пептида, сорбируется на аффинном носителе, а легкая цепь не сорбируется и элюируется уравновешивающим буфером Тяжелую цепь (Mr ~ 56-57 kDa) элюировали раствором 0,2 М раствором 6-аминокапроновой кислоты в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 8,0. Объединенные фракции диализовали против воды (~ рН 8,0) и высушивали лиофильно. При необходимости препарат растворяли в 0,05М Трис-HCl буфере, pH7,4 и дополнительно очищали с помощью гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-75 (1,65×80 cm). Объединенные фракции белкового пика диализовали против воды рН 8,0 и лиофилизировали.
Чистоту и молекулярную массу препаратов оценивали методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии 0,1% SDS. Кроме того, отсутствие амидазной активности (по S-2251) до и после инкубации ее раствора со стрептокиназой свидетельствовало, что тяжелая цепь не содержит следовых концентраций мини-плазминогена, которые могли не обнаружиться при электрофорезе.
Получение Lys-плазминогена (Lys78-Asn791) и Тяжелой цепи (Lys-H Lys78-Arg561) проводили тем же самым методом, только без добавления ингибитора - апротинина.
Получение миниплазмина (Val442-Asn791) Миниплазмин включает в себя К5 и легкую цепь плазмина. Его последовательность начинается от Val442 и до Asn791 включительно. Получается он при эластолизе Lys-плазминогена (Lys78-Asn791) дальнейшей доочисткой гель-фильтрацией на сефодексе G-75.
Получение крингла K1-4,5 (Lys78-Arg530) проводили по методике, описанной в работе Cao R., Wu H.L., Veitonmaki N., Linden P., Farnedo J., Shi C.Y., and Cao Y. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5728-5733, с некоторыми модификациями. Glu-плазминоген (10 мг/мл) активировали урокиназой (600 МЕ/мл) в 0,05 М фосфатном буфере рН 9,0, содержащем 0,02 М L-лизин и 0,1 М NaCL, при 37°C. Полноту превращения плазминогена в плазмин контролировали по увеличению амидазной активности раствора до максимального значения. К раствору плазмина добавляли равный объем 0.2 М глицеринового буфера, рН 12,0 и инкубировали в течение 18 ч при 25°C и конечном значении рН 10,5. Реакционную смесь разбавляли в 5 раз буфером, содержащим 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0 и 40 KIU/мл апротинина, и наносили на колонку с Lys-сефарозой 4 В, уравновешенную тем же буфером. После выхода микро-плазмина, сорбированный ангиостатин К1-4,5 элюировали с колонки 0,2 М раствором 6-аминокапроновой кислоты в 0,1 М фосфатный буфер, рН 8,0 и 40 KIU/мл апротинина, диализовали против воды и лиофилизировали. Чистоту препарата проверяли с помощью SDS-ПААГ-электрофореза в 12%-ном геле. Кроме того К 1-4,5 может быть естественным продуктом, включающим кринглы 1-4 плюс 85% К5, (Lys78-Arg530). Плазмин превращается в К1-4,5 в две стадии. Сначала плазминоген переходит в плазмин, затем плазмин подвергается аутопротеолизу внутренней петли 5 крингла. Аутопротеолиз может быть вызван свободными сульфгидрильными донорами или щелочной средой. Кроме того такая деградация плазмина происходит при добавлении к субстрату концентрированной ростовой среды клеток НТ 1080, а также ряда других культивированных опухолевых клеток. В этот процесс вовлечена плазмин-редуктаза, которая содержится в ростовой среде опухолевых клеток (Paul Stathakis, Angelina J. Lay, Melinda Fitzgerald, Christian Schlieker, Lisa J. Matthias and Philip J. Hogg, Angiostatin Formation Involves Disulfide Bond Reduction and Proteolysis in Kringle 5 of Plasmin, J. Biol. Chem. Vol. 274, No. 13, Issue of March 26, pp. 8910-8916, 1999; Soff G. A. Angiostatin and angiostatin-related proteins, Cancer Metastasis Rev., 19: 97-107, 2000; Hao Wang, Ryan Schultz, Jerome Hong, Deborah L. Cundiff, Keyi Jiang, and Gerald A. Soff, Cell Surface-Dependent Generation of Angiostatin4.5, Cancer Res January 1, 2004 64; 162).
Получение кринглов K1-4(Tyr80-Ala440) и K1-3(Tyr80-Val338) К4-5(Val355-Phe546) проводили при помощи гидролиза Glu-плазминогена эластазой по методу, описанному в работах Cao Y., Ji R. W., Davidson D., Schaller J., Marti D., Sohndel S., McCanse S. G., M. S., Llinas M., and Folkman J. (1996) J. Biol. Chem., 271, 29461-29467. Glu-плазминоген инкубировали с эластазой при соотношении 50:1 (М/М) в буфере содержащем 0,05 М Трис-HCl, рН 8,5, 0,5 М NaCl и 200 KIU апротинина, в течение 5 часов при комнатной температуре. Реакцию эластолиза останавливали трехкратным добавлением PMFS для поддержания его концентрации 1 мМ в течение 40-50 мин. Затем проводили гель-фильтрацию смеси на колонке с сефадексом G-75 для отделения низко- и высокомолекулярных примесей. Белковые фракции второго пика содержащего К1-3, К1-4, К4-5 и Миниплазмин, наносили на аффинную колонку с Lys-сефарозой 4В, уравновешенную буфером с 0,05 М Трис-HCl, рН 8,5 и 0,15 М NaCl. После выхода миниплазмина, который не сорбируется на носителе, сорбированные фрагменты К1-3, К1-4 и К4-5 элюировали раствором 0,2 М 6-аминокапроновой кислоты в том же буфере, диализовали против буфера содержащего 0,02 М Трис-HCl, рН 8,0 и наносили на колонку с гепарин-агарозой, уравновешенной тем же буфером. После элюции не связавшегося с носителем фрагмента К1-4 и К4-5 уравновешивающим буфером, фрагмент К1-3 элюировали раствором 0,25 М KCl в том же буфере. Полученные фрагмент К1-3 диализовали против воды и лиофилизовали. К1-4 и К4-5 разделяли с помощью гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-75.
Получение кринглов K5(Ser449(Pro452)-Fhe546), K1-3(Tyr80-Val338), К-4 (Val335-Ala440) согласно работе Cao, Y., Chen, A., An, S. S. A., Ji, R. W., Davidson, D., and Llinas, M. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22924-22928). Использовался метод ограниченного эластолиза Lys-Плазминогена (Lys78-Asn791). После обработки эластазой смесь наносили на колонку Mono-S (Bio-Rad) уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ NaOAc, рН 5.0. Связавшиеся фрагменты градиентно элюировали буфером, содержащем 20 мМ NaOAc, 1 М KCl, рН 5.0. Были использованы градиент 0-20%, 20-50%, 50-70%, и 70-100%. К-5 сходил при 50% градиенте. По этой же схеме, но в другом градиенте получили К-4 (Val335-Ala440) крингл и крингл K1-3(Tyr80-Val354).
Кринглы K1-4 (Lys78-Pro446) и K1-4(Lys78-Lys468) получались согласно методу Patterson, В. С. and Sang, Q. А. (1997) J. Biol. Chem. 272, 28823-28825 с использованием металлопротеиназ.
Крингл K1-4(Asn60-Pro447) получен по методу Lijnen, Н. R., Ugwu, F., Bini, A., and Collen, D. (1998) Biochemistry 37, 4699-4702 с использованием металлопротеиназ.
Потенциальным источником для получения однородного образца антигена в препаративных количествах является женское молоко, в котором MUC1 содержится как в мембранах жировых глобул, так и в растворимой его фракции в виде секреторной формы.
MUC1 был выделен из сыворотки женского молока последовательной очисткой методами иммуноаффинной хроматографией на сефарозе 4В с иммобилизованными мышиными моноклональными антителами к MUC1 ("Диатех-М», Москва) и гель-фильтрацией на колонке с Сефакрил-200 («Сигма», США).
Изготовление диагностической тест-системы для определения титра MUC1 с С-концевым лизином с помощью иммуноферментного анализа.
Были изготовлены два типа диагностической системы-прямой и обратный.
При изготовлении прямой диагностической системы в качестве лигандов для посадки на твердую фазу использовались полноразмерный плазминоген или его фрагменты, содержащие хотя бы один крингл представленные в таблице 1. Их первичная аминокислотная последовательность приведена в перечне последовательностей.
Лиганд разводили в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,6 в максимальной концентрации 5 мкг/мл для молекул с молекулярным весом более 25 кД и 10 мкг/мл для молекул с молекулярным весом менее 25 кД. Данные разведения лиганда использовались для определения всех видов иммуноглобулинов.
PBS (phosphate buffered saline, фосфатный солевой раствор):
0,14М NaCl; 0,003М KCl; 0,005М Na2HPO4; 0,002М KH2PO4
Приготовление 1 л 10x PBS:
80 г - NaCl 2 г - KCl 18 г - Na2HPO4 2 г - KH2PO4
Субстратный буферный раствор (рН 4,3): 31 мМ лимонная кислота, 0,05 н. NaOH, 3 мМ H2O2
Раствор ТМБ: 5 мМ 3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 70% ДМСО
Субстрат-хромогенный раствор (готовится перед употреблением): смешать 4 части субстратного буферного раствора и одну часть раствора ТМБ.
При создании набора для иммуноферментного анализа проводили предварительную иммобилизацию лиганда. Для иммобилизации лиганда могут быть использованы различные виды носителей, например ацетатцеллюлоза, стеклянные бусы или другие частицы, способные сорбировать белки, иммунологические пластиковые стрипы или планшеты.
На иммунологический планшет (Costar) в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора лиганда. Инкубация проводилась в течение 14-16 часов при 4°C во влажной камере. Содержимое лунок удаляли путем вытряхивания, затем планшет дважды промывали раствором, содержащим однократный PBS с 0,05% Tweeen-20, по 200 мкл/на лунку для удаления не связавшегося лиганда. В качестве блокирующего раствора использовали 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS, по 200 мкл/лунка с инкубацией в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре. После окончания инкубации блокирующую жидкость удаляли, планшет сушили в течение ночи при комнатной температуре и затем использовали в дальнейшей работе.
Исследуемые и контрольные образцы плазмы крови разводили в 10 раз буфером для инкубации (1% раствор бычьего сывороточного альбумина в PBS), после этого вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали 1 час при 37°C. После окончания инкубации содержимое лунок удаляли, планшет промывали 4 раза промывочным раствором (PBS с 0,05% Tween-20), каждый раз тщательно удаляя содержимое лунок. Рабочее разведение раствора коньюгата мышиных моноклональных антител к MUC1 с пероксидазой хрена («Диатех-М», Москва) в PBS с 0,5% БСА вносили в соответствующие лунки планшета по 100 мкл/лунка и снова инкубировали 1 час при 37°C. Не связавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили по 100 мкл субстрат-хромогенного раствора и инкубировали 15 минут при 37°C. Реакцию останавливали, внося во все используемые лунки по 100 мкл стоп-раствора (2М H2SO4). Фотометрию проводили на фотометре вертикального сканирования «УНИПЛАН» (фирма «ПИКОН», Россия) с длиной волны 450 нм.
При изготовлении обратной диагностической системы в качестве детектора для иммуноферментного определения титра MUC1 с С-концевым лизином использовались полноразмерный меченный плазминоген или его фрагменты, содержащие хотя бы один крингл перечислены в табл.1. Их первичная аминокислотная последовательность приведена в перечне последовательностей. При создании обратной диагностической системы проводили предварительную иммобилизацию моноклональных мышиных иммуноглобулинов к MUC1 («Диатех-М», Москва). Для иммобилизации моноклональных мышиных иммуноглобулинов могут быть использованы различные виды носителей, например нитроцеллюлоза, стеклянные бусы или другие частицы, способные сорбировать белки, иммунологические стрипы или планшеты. На иммунологический планшет (Costar) в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора (5 мкг/мл) моноклональных мышиных иммуноглобулинов к MUC1. Инкубация проводилась в течение 14-16 часов при 4°C во влажной камере. Содержимое лунок удаляли путем вытряхивания, затем планшет дважды промывали раствором, содержащим однократный PBS с 0,05% Tweeen-20, по 200 мкл/на лунку для удаления не связавшегося антигена. В качестве блокирующего раствора использовали 1% раствор бычьего сывороточного альбумина в PBS, по 200 мкл/лунка с инкубацией в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре. После окончания инкубации блокирующую жидкость удаляли, планшет сушили в течение ночи при комнатной температуре и затем использовали в дальнейшей работе. Полноразмерный плазминоген или его фрагменты, содержащие хотя бы один крингл подвергались процедуре биотинилирования 10 мг-биотинилирующего реактива, Biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester (Sigma B-2643), растворили в 0,5 мл диметилформамида. Плазминоген или его фрагмент растворяли в 0,1М фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 1 мг/мл. К 1 мл этого раствора добавили 5 мкл биотинилирующего реактива в диметилформамиде. Инкубировали 1 час при комнатной температуре на шейкере. Добавили раствор апротинина до конечной концентрации 20 МЕ/мл, перенесли раствор в диализный мешок (4000 Да) и оставили на ночь на диализ против 0,01 М фосфатного буфера с 20 МЕ/мл апротинина, при 4°C. Полученный раствор конъюгата с биотином разбавили в 2 раза глицерином и заморозили.
Получение MUC1 с С-концевым лизином достигалось при помощи протеолитической реакции нативного MUC1 с плазмином. Для это MUC1, выделенный из молока в объеме 1 мл и концентрации 100 мкг/мл в PBS был добавлен к 1 мл плазмина 100 мкг/мл в PBS. Смесь инкубировали 12 часов при 37°C. Реакцию остановили добавлением 200 ед. апротинина в 20 мкл. Полученный раствор заморозили на -20°C до дальнейшего использования. Плазмин был получен при активации Lys-Плазминогена (Seq.2) 100 мкг/мл с помощью урокиназы 100 ед.
Для доказательства участия С-концевых лизинов MUC1 в связывании с плазминогеном образцы сыворотки после 1/10 были инкубированы с карбоксипептидазой В («Sigma-Aldrich»). 90 мкл образца и 10 мкл карбоксипептидазы В в PBS. После 1 инкубации в течение 3 часов при 37°C с карбоксипептидазой В, ферментативная реакция была остановлена 1,10-Phenathroline («Sigma-Aldrich») и образцы использовались для ИФА.
Проведение иммуноферментного детектирования титра MUC1 с С-концевым лизином способных связываться с плазминогеном или его фрагментами
Образцы сыворотки крови больных забирали из локтевой вены с помощью вакутейнеров. Затем образцы центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течении 15 мин. Сыворотку разливали в пробирки по 100 мкл, замораживали и хранили при температуре -40°C.
Контрольную группу составляли образцы сыворотки, взятые от 5 здоровых доноров.. Каждый образец был отрицателен в тестах на гепатиты А, В, С, вирусы ВИЧ, а также туберкулез и сифилис.
Уровень титра MUC1 с С-концевым лизином в контрольных образцах измерялся при помощи прямого и обратного иммуноферментного набора, согласно описанной методике. Разведение контрольных образцов плазмы подбиралось таким образом, чтобы оптическая плотность была не более 0,3.
При проведении прямого иммуноферментного анализа опытным путем установлено конечное разведение для проб - 1/10, которое в дальнейшем использовалось для анализа всех проб. В качестве лиганда использовалась как целая молекула плазминогена, так и ее фрагменты. Для точности измерения, уровня MUC1 с С-концевым лизином каждая проба анализировалась в дубле. После измерения 5 контрольных проб, был вычислен средний уровень оптической плотности.
Исследуемые и контрольные образцы сыворотки крови разводили в 10 раз буфером для инкубации, после этого вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали 1 час при 37°C. После окончания инкубации содержимое лунок удаляли, планшет промывали 4 раза промывочным раствором (PBS с 0,05% Tween-20), каждый раз тщательно удаляя содержимое лунок. Рабочее разведение раствора конъюгата мышиных моноклональных антител к MUC1 с пероксидазой хрена («Диатех-М», Москва) в PBS с 0,5% БСА вносили в соответствующие лунки планшета по 100 мкл/лунка и снова инкубировали 1 час при 37°C. Не связавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили по 100 мкл субстрат-хромогенного раствора и инкубировали 15 минут при 37°C. Реакцию останавливали внесением во все используемые лунки по 100 мкл стоп-раствора (2М H2SO4).
Фотометрию проводили на фотометре вертикального сканирования «УНИПЛАН» (фирма «ПИКОН», Россия) с длиной волны 450 нм.
При проведении обратного иммуноферментного анализа опытным путем установлено конечное разведение для проб - 1/10, которое в дальнейшем использовалось для анализа всех проб. В качестве детектора использовалась как целая биотинилированная молекула плазминогена так и ее биотинилированные фрагменты. Для точности измерения, уровня MUC1 с С-концевым лизином каждая проба анализировалась в дубле. После измерения 5 контрольных проб, был вычислен средний уровень оптической плотности.
Использовались планшеты с адсорбированными мышиными моноклональными антителами против MUC1 («Диатех-М», Россия).
Исследуемые и контрольные образцы плазмы крови разводили в 10 раз буфером, после этого вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали 1 час при 37°C. После окончания инкубации содержимое лунок удаляли, планшет промывали 4 раза промывочным раствором (PBS с 0,05% Tween-20), каждый раз тщательно удаляя содержимое лунок. Рабочее разведение коньюгата плазминогена с биотином или его фрагментов с биотином в PBS с 0,5% БСА вносили в соответствующие лунки планшета по 100 мкл/лунка и снова инкубировали 1 час при 37°C. Не связавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили 100 мкл раствора коньюгата стрептавидин-пероксидаза и инкубировали 30 мин при 37°C. Не связавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили по 100 мкл субстрат-хромогенного раствора и инкубировали 15 минут при 37°C. Реакцию останавливали, внося во все используемые лунки по 100 мкл стоп-раствора (2М H2SO4).
Фотометрию проводили на фотометре вертикального сканирования «УНИПЛАН» (фирма «ПИКОН», Россия) с длиной волны 450 нм.
Прямой и обратный иммуноферментный тест контрольных проб проводился с каждым отдельно взятым антигеном и биотинилированным детектором. Для сравнительного исследования в качестве контрольного образца из контрольной группы были взяты 5 образцов с показателями оптической плотности, отличающихся не более 5% от среднего. Эти 5 проб были объединены в одну пулированную пробу - контрольную пробу (К), использованную в качестве эталона нормального уровня титра MUC1 с С-концевым лизином. Положительными считались пробы, с оптической плотностью, превышавшую более чем на 30% оптическую плотность контрольной пробы. Данное пороговое значение позволяет исключить получение ложноположительных результатов, т.е. ошибочно отнести человека к группе больных или подверженных риску заболевания.
При исследовании уровня титра MUC1 с С-концевым лизином были использованы образцы сыворотки крови больных с раком легких и воспалительными заболеваниями. Для данных больных в примерах показаны результаты применения различных антигенов и детекторов в тест-системах, направленных на выявление повышенного титра MUC1 с С-концевым лизином.
Для доказательства участия С-концевых лизинов MUC1 в связывании с плазминогеном образцы сыворотки были разведены в 10 раз и инкубированы с карбоксипептидазой В («Sigma-Aldrich»).. К 90 мкл пробы в разведении 1/10 добавили 10 мкл раствора карбоксипептидазы В (5 мг/мл) в 0,01М фосфатном буфере рН7,4. Инкубировали 3 часа при 37°C. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 6 мкл раствора 1,10-фенантролина в метаноле (180 мг/мл). По 100 мкл образца использовали для тестирования в иммуноферментном тесте на выявление повышенного титра MUC1 с С-концевым лизином. Также исследовали образец полученного MUC1 с С-концевым лизином после протеолиза плазмином, при инкубации MUC1 и плазмина, как было описано. Сравнивались образцы MUC1 до и после инкубации с плазмином, а также после обработки карбоксипептидазой В, как было описано.
Примеры
Пример 1
В процессе проведения прямого и обратного иммуноферментного анализа образца полученного MUC1 с С-концевым лизином после протеолиза плазмином in vitro в сравнении с MUC1 без добавления плазмина была выявлена значительная разница полученной оптической плотности. Так образец MUC1 без добавления плазмина показывал оптическую плотность 0,2-0,3, в то время как образец MUC1 после инкубации с плазмином in vitro имел оптическую плотность 1,1-1.9, в зависимости от выбранного антигена или лиганда представленного в Таблице 1. Это объясняется накоплением производного MUC1 с С-концевым лизином после протеолиза. После обработки исследуемых проб MUC1 (с добавлением плазмина и без) карбоксипептидазой В, различия между пробами MUC1 с добавлением плазмина и без исчезали. Что свидетельствует об участии С-концевого лизина молекулы MUC1 после протеолиза плазмином в связывании с целой молекулой плазминогена, так и ее фрагментами (SEQ ID NO 1-4, SEQ ID NO 6-13 и SEQ ID NO 18 - SEQ ID NO 20) Таблица 1.
Пример 2. Выявление связывания MUC1 с С-концевым лизином прямым тестом при раке легких.
Диагнозы больных с раком легких были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических маркеров. Всего в эту группу входило 10 больных. (Таблица 2)
Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб взятых у больных раком легких и контрольного образца проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА, более чем на 30% превышающие оптическую плотность контрольной пробы.
Результаты:
При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 8 из 10.
При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 6 из 10 После обработки проб карбоксипептидазой В, различий между контрольными пробами и раковыми пробами не было.
Пример 3. Выявление связывания MUC1 с С-концевым лизином обратным тестом при раке легких.
Диагнозы больных с раком легких были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических маркеров. Всего в эту группу входило 10 больных. (Таблица 2)
Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб взятых у больных раком легких и контрольного образца проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА, более чем на 30% превышающие оптическую плотность контрольной пробы.
Результаты:
При использовании в качестве детектора биотинилированных последовательностей SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 8 из 10, После обработки проб карбоксипептидазой В, различий между контрольными пробами и раковыми пробами не было.
При использовании в качестве в качестве детектора биотинилированных последовательностей SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 в ИФА, количество положительных проб у больных раком легких составляло 6 из 10. После обработки проб карбоксипептидазой В, различий между контрольными пробами и раковыми пробами не было.
Пример 4. Выявление связывания MUC1 с С-концевым лизином обратным тестом при раке простаты с метастазами в легкие. (Таблица 2)
Диагнозы больных с раком простаты с метастазами в легкие были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических маркеров. Всего в эту группу входило 6 больных.
При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 в ИФА, количество положительных проб у больных раком простаты с метастазами в легкие составляло 5 из 6.
При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20 в ИФА, количество положительных проб у больных раком простаты с метастазами в легкие составляло 3 из 6. После обработки проб карбоксипептидазой В, различий между контрольными пробами и раковыми пробами не было.
Пример 5. Выявление связывания MUC1 с С-концевым лизином обратным тестом при туберкулезе. (Таблица 2)
Диагноз у больных туберкулез был установлен на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением поставленного диагноза. Всего в эту группу входило 5 больных.
Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб взятых у больных туберкулезом и контрольного образца проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА, более чем на 30% превышающие оптическую плотность контрольной пробы.
При использовании в качестве антигена последовательности SEQ ID NO 1-4, SEQ ID NO 6-20 не было выявлено различий между больными туберкулезом и контрольными пробами.
Таблица 2: Стадии заболевания, при которых образцы сывротки исследовались на наличие MUC1 с С-концевым лизином Группа с раком легких
Группа с раком предстательной железы с метастазами в легких
Группа с туберкулезом
Перечень последовательностей
Claims (5)
1. Способ выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин в жидкости, при котором приводят в контакт исследуемую жидкость с тест-системой для выявления продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, которая включает по крайней мере выбранную одну из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, система содержит твердый носитель с прикрепленными к нему одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, и меченые моноклональные антитела к MUC-1 или прикрепленные к носителю моноклональные антитела к MUC-1 и меченные одной из: полноразмерная молекула плазминогена, ее фрагмент, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1-4, 6-20, при превышении порогового уровня оптической плотности, определенного у жидкости, не имеющей MUC-1 с С-концевым лизином, определяют в исследуемой жидкости повышенное содержание продуктов протеолиза MUC-1, имеющего С-концевой лизин.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жидкостью является сыворотка крови, взятой от субъекта, и что превышение в ней уровня продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, над пороговым уровнем более чем на 30% является показателем наличия у субъекта патологического процесса.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жидкостью является сыворотка крови, взятой от субъекта, и что превышение в ней уровня продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, над пороговым уровнем более чем на 30% является показателем наличия у субъекта риска развития патологического процесса.
4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что выявление продуктов протеолиза MUC-1, имеющих С-концевой лизин, проводят при помощи иммуноферментной реакции.
5. Способ по пп. 2, 3, отличающийся тем, что патологическим процессом является рак легких или наличие метастазов в легких при раке простаты.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016150637A RU2676258C2 (ru) | 2016-12-22 | 2016-12-22 | Способ определения содержания продуктов протеолиза MUC1 и диагностическая тест-система для его осуществления |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016150637A RU2676258C2 (ru) | 2016-12-22 | 2016-12-22 | Способ определения содержания продуктов протеолиза MUC1 и диагностическая тест-система для его осуществления |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016150637A RU2016150637A (ru) | 2018-06-25 |
RU2016150637A3 RU2016150637A3 (ru) | 2018-06-25 |
RU2676258C2 true RU2676258C2 (ru) | 2018-12-27 |
Family
ID=62713150
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016150637A RU2676258C2 (ru) | 2016-12-22 | 2016-12-22 | Способ определения содержания продуктов протеолиза MUC1 и диагностическая тест-система для его осуществления |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2676258C2 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106248941A (zh) * | 2016-07-14 | 2016-12-21 | 济南大学 | 一种灵敏检测小肽muc1的方法 |
-
2016
- 2016-12-22 RU RU2016150637A patent/RU2676258C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106248941A (zh) * | 2016-07-14 | 2016-12-21 | 济南大学 | 一种灵敏检测小肽muc1的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
HANISCH FG., Design of a MUC1-based cancer vaccine.Biochem Soc Trans. 2005 Aug;33(Pt 4):705-8. * |
JULIAN J., et al., MUC1 is a substrate for gamma-secretase.J Cell Biochem. 2009 Nov 1;108(4):802-15. doi: 10.1002/jcb.22292. * |
JULIAN J., et al., MUC1 is a substrate for gamma-secretase.J Cell Biochem. 2009 Nov 1;108(4):802-15. doi: 10.1002/jcb.22292. HANISCH FG., Design of a MUC1-based cancer vaccine.Biochem Soc Trans. 2005 Aug;33(Pt 4):705-8. LEVITIN F., et al., The MUC1 SEA module is a self-cleaving domain.J Biol Chem. 2005 Sep 30;280(39):33374-86. Epub 2005 Jun 29. * |
LEVITIN F., et al., The MUC1 SEA module is a self-cleaving domain.J Biol Chem. 2005 Sep 30;280(39):33374-86. Epub 2005 Jun 29. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2016150637A (ru) | 2018-06-25 |
RU2016150637A3 (ru) | 2018-06-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2522231C1 (ru) | Способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления | |
EP0540573B2 (en) | Assay of free and complexed prostate-specific antigen (psa) | |
Heene et al. | Adsorption of fibrinogen derivatives on insolubilized fibrinogen and fibrinmonomer | |
Wittenborn et al. | Characteristics and biological variations of M-ficolin, a pattern recognition molecule, in plasma | |
KR102549704B1 (ko) | Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법 | |
Montes et al. | Development and clinical application of a new ELISA assay to determine plasmin–α2‐antiplasmin complexes in plasma | |
ES2366043T3 (es) | Procedimiento para analizar inmunológicamente el producto de la degradación con plasmina de la fibrina estabilizada. | |
AU655918B2 (en) | Immunoassays for and monoclonal antibodies to prothrombin activation peptides and their degradation products | |
Jung et al. | Different stability of free and complexed prostate-specific antigen in serum in relation to specimen handling and storage conditions | |
Ohnishi et al. | Development of highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assays for hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF): determination of HGF/SF in serum and urine from normal human subjects | |
AU2006205700A1 (en) | Forms of factor XIIa | |
JP5618831B2 (ja) | 修飾抗ヘパリン/pf4複合体抗体及びhit抗体標準品 | |
RU2597782C1 (ru) | Способ определения содержания продуктов протеолиза в плазме крови и диагностическая тест-система для его осуществления | |
RU2676258C2 (ru) | Способ определения содержания продуктов протеолиза MUC1 и диагностическая тест-система для его осуществления | |
Caliceti et al. | Effects of monomethoxypoly (ethylene glycol) modification of ribonuclease on antibody recognition, substrate accessibility and conformational stability | |
KR19990008444A (ko) | 전립선 암을 진단하는 방법 | |
RU2597783C2 (ru) | Способ определения повышенного уровня аутоантител к плазминогену человека и продуктам его деградации и диагностическая тест-система для его осуществления | |
US12025616B2 (en) | Method and composition for detection of proteolytic products and diagnosis of malignant neoplastic disease | |
JPH05203579A (ja) | 被分析物の濁度分析または比朧分析のための方法および試薬 | |
US20190383816A1 (en) | Method and composition for detection of proteolytic products and diagnosis of malignant neoplastic disease | |
Heidtmann et al. | Assay of complexed alpha 1-antichymotrypsin in plasma | |
Tessmer et al. | Biological activity of prostate‐specific antigen isolated by sodium dodecyl sulfate‐polyacrylamide gel electrophoresis and electroelution | |
Amiral et al. | Determination of protein C by an immunoenzymatic assay | |
Dahl et al. | Functional measurement of t-PA in plasma using a bead immuno chromogenic assay (BICA) | |
JPH06145196A (ja) | 癌細胞が分泌する蛋白質 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181223 |