WO2015167246A1 - Ａｍｐｋ 억제기능에 기반한 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 및 방법 - Google Patents

Ａｍｐｋ 억제기능에 기반한 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 및 방법 Download PDF

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박황서
엄재원
고재영
김태윤
서보라
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세종대학교 산학협력단
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    • C07D209/20—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals substituted additionally by nitrogen atoms, e.g. tryptophane

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceutical compositions and methods for treating stroke, and more particularly, to pharmaceutical compositions and methods for treating stroke based on AMPK inhibitory function.
  • Stroke is a collective term for local neurological symptoms that are suddenly caused by cerebral blood flow abnormalities.
  • the brain takes up only 2% of its body weight by weight, but the blood flow to the brain is 15% of cardiac output and 20% of the body's oxygen consumption.
  • the brain uses only glucose as an energy source, so necrosis easily occurs even if the energy supply is interrupted for a while. Therefore, abnormalities in cerebral blood flow are closely related to brain damage.
  • Brain damage caused by stroke includes various toxic mechanisms such as excitotoxicity, oxidative stress, apoptosis and zinc neurotoxicity. Excavation is necessary.
  • Cerebral ischemia-reperfusion injury requires an objective evaluation system, such as an in vitro model or an animal model, for drug development and effectiveness evaluation based on a variety of complex neuronal cell death mechanisms. This preclinical study is so limited that it is likely to cause side effects in clinical trials. In particular, many clinical studies have been conducted, especially NMDA antagonists, but all have failed.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 1283416 discloses a neuroprotective method in which AMPK inhibitor Compound C or FAS inhibitor C75 is administered to ischemic mice to significantly reduce the size of infarcts so that function is preserved after stroke or ischemic injury.
  • the present invention is to solve various problems, including the above problems, it is an object of the present invention to provide a new stroke treatment based on the AMPK inhibitory function effective for various mechanisms of stroke.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • a pharmaceutical composition for treating stroke which contains a compound having the following structural formula as an active ingredient:
  • a method of treating stroke comprising administering to a subject with a compound having the structure:
  • FIG. 1 is a photograph showing that neurotoxicity was increased after zinc treatment in cultured cerebral cortical neurons (A) and the degree of cytotoxicity after treatment with Compound C (+ Cpd C), an AMPK inhibitor, through TUNEL staining and LDH assay. Quantified graphs (B and C).
  • FIG. 2 is a Western blot photograph (A) and an enzyme activity assay (B) graph confirming that AMPK activity is increased after zinc treatment in cultured cerebral cortical neurons.
  • FIG. 3 shows Western blot photographs (A) and AMPK inhibitor Compound C (+ Cpd C), which showed increased expression of apoptosis promoting gene and caspase-3 activity after zinc treatment in cultured cerebral cortical neurons.
  • Western blot photograph (B) shows that both increase and caspase-3 activity was decreased.
  • Figure 4 is the purchase of the AMPK activity assay kit (CycLex, Japan) and recombinant AMPK ( ⁇ 2 / ⁇ 1 / ⁇ 1; CycLex, Japan) to measure the enzyme activity and compared to the compound C effect 40 showing a similar or stronger inhibitory effect It is a graph which selected two candidate compounds.
  • 5 is a graph showing the inhibition of apoptosis by inducing various neurotoxicity in cultured cerebral cortical neurons, treating 7 selected compounds and quantifying the degree of apoptosis by LDH assay.
  • FIG. 6 is a graph illustrating brain injury inhibition effect by intravitreal administration of drug # 35 finally selected in an animal model of stroke and a photograph of brain tissue sections comparing the degree of brain damage of a test animal with a control group.
  • FIG. 7 is a graph showing the brain damage inhibitory effect by intravenously administering drug # 35, which was finally recorded in the animal model of stroke, and a brain tissue section comparing the degree of brain damage of the experimental animal with the control group.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of the acute toxicity test by administering the final selected drug # 35 to the rat and extracting the spleen (A), liver (B) and kidney (C).
  • AMP-activated protein kinase is a heterotrimeric protein consisting of a catalyst ⁇ subunit ( ⁇ 1 or ⁇ 2), and two regulatory subunits ( ⁇ and ⁇ ). AMPK is phosphorylated and activated at low cellular energy levels, and then regulates cell metabolism to restore gene levels over time by regulating gene expression over time. Increasing the AMP / ATP ratio, changing the cell pH and redox state, and increasing the creatine / phosphocreatin ratio are known to activate AMPK.
  • a pharmaceutical composition for treating stroke containing a compound having the following structural formula as an active ingredient:
  • the compound IUPAC name is N- [2- [2- (1H-indol-3-yl) ethylamino] -2-oxoethyl] -3-phenyl-2,1-benzoxazole-5-carboxamide, wherein the compound is AMPK ( AMP-activated protein kinase) inhibits the enzyme activity to provide a neuroprotective effect, the AMPK enzyme has ⁇ 2 subunit kinase enzyme activity.
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • the stroke can be a hemorrhagic stroke, an ischemic stroke, and a metal toxicity stroke.
  • the metal may be lead, mercury, manganese, arsenic, thallium, iron, zinc, cadmium, bismuth, or tin ( tin).
  • the ischemic stroke may be a stroke caused by excitatory neuronal death or oxidative neuronal death.
  • the most widely known neuronal cell death mechanism is cerebral ischemia.
  • the present invention is the first use of the compound as a medicament.
  • the inventors have found that the compound is lead, mercury, manganese, arsenic, thallium, iron, zinc, cadmium, bismuth. And the present invention has been completed by demonstrating that it is effective in the treatment of stroke caused by various neurotoxicity as well as stroke caused by neurotoxicity of various metals such as tin (tin).
  • the medicament may be used for the treatment of stroke.
  • a method of treating stroke comprising administering to a subject with a compound having the structure:
  • the administration may be oral or parenteral administration selected from the group consisting of intravenous injection, subcutaneous injection, intracerebroventricular injection, intracerebrospinal fluid injection, intramuscular injection and transdermal absorption.
  • the effective amount of the compound in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the type of affected part, the site of application, the number of treatments, the treatment time, the dosage form, the condition of the patient, the type of supplement, and the like.
  • the amount used is not particularly limited, but may be 0.01 ⁇ g / kg / day to 10 mg / kg / day.
  • the said daily amount may be administered once a day or divided into 2-3 times a day at appropriate intervals, or may be administered intermittently at several days intervals.
  • the compound may be contained at 0.1-100% by weight based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the preparation of the pharmaceutical compositions may be used as additives for the preparation of solids or liquids.
  • the additive for preparation may be either organic or inorganic.
  • excipients include lactose, sucrose, white sugar, glucose, cornstarch, starch, talc, sorbet, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate and silicon dioxide.
  • binder for example, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, Dextrin, pectin, and the like.
  • the lubricant include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, hardened vegetable oil, and the like.
  • coloring agent if it is normally permitted to add to a pharmaceutical, all can be used. These tablets and granules can be appropriately coated according to sugar, gelatin coating, and other needs. Moreover, preservatives, antioxidants, etc. can be added as needed.
  • compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art (e.g., Remington's Pharmaceutical Science, New Edition; Mac Publishing Company, Easton PA), and the form of the formulation is not particularly limited. . These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15 th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour), a prescription generally known for all pharmaceutical chemistries.
  • the compound may be administered orally or parenterally, and preferably, by parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intracerebroventricular injection, intracerebrospinal fluid injection Intramuscular injection, intraperitoneal injection, and the like.
  • the effective amount of the compound in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the type of affected part, the site of application, the number of treatments, the treatment time, the dosage form, the condition of the patient, the type of supplement, and the like.
  • the amount used is not particularly limited, but may be 0.01 ⁇ g / kg / day to 10 mg / kg / day.
  • the said daily amount may be administered once a day or divided into 2-3 times a day at appropriate intervals, or may be administered intermittently at several days intervals.
  • the compound may be contained at 0.1-100% by weight based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the preparation of the pharmaceutical compositions may be used as additives for the preparation of solids or liquids.
  • the additive for preparation may be either organic or inorganic.
  • excipients include lactose, sucrose, white sugar, glucose, cornstarch, starch, talc, sorbet, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate and silicon dioxide.
  • binder for example, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, Dextrin, pectin, and the like.
  • the lubricant include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, hardened vegetable oil, and the like.
  • coloring agent if it is normally permitted to add to a pharmaceutical, all can be used. These tablets and granules can be appropriately coated according to sugar, gelatin coating, and other needs. Moreover, preservatives, antioxidants, etc. can be added as needed.
  • compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art (e.g., Remington's Pharmaceutical Science, New Edition; Mac Publishing Company, Easton PA), and the form of the formulation is not particularly limited. . These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15 th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour), a prescription generally known for all pharmaceutical chemistries.
  • the compound may be administered orally or parenterally, and preferably, by parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intracerebroventricular injection, intracerebrospinal fluid injection Intramuscular injection, intraperitoneal injection, and the like.
  • the mouse cerebral cortical neurons used in the present invention were extracted and cultured from the brains of mouse embryos and added Dulbecco's modified Eagle's mediuM (DMEM, Gibco, Grand Island, NY) to which 5% fetal bovine serum (FBS) and 5% horse serum (HS) were added. , US) was incubated at 95% humidity, 5% CO 2 and 37 °C temperature conditions. The cells were grown to a density of 2 ⁇ 10 4 cells in 24-well tissue culture plates for activation and differentiation of the cells and cultured in DMEM medium without FBS and HS before treatment with zinc and compounds.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's mediuM
  • FBS fetal bovine serum
  • HS horse serum
  • Zinc toxicity is one of the representative causes of stroke, and it was confirmed that zinc toxicity induced in the cultured cerebral cortical neurons reduced toxicity following treatment with AMPK inhibitor.
  • the cultured cerebral cortical neurons according to an embodiment of the present invention treated with 300 uM of zinc (ZnCl 2 ) for 10 minutes and then removed and cytotoxicity (Cytotoxicity) after 10 hours TUNEL staining or LDH (Lactate Dehydrogenase) ) Observed through analysis.
  • the cells were treated with Compound C (+ Cpd C, Tocris), an AMPK inhibitor, at 20 ⁇ M and then neurotoxicity was observed.
  • TUNEL staining confirmed that neurotoxicity was increased after zinc treatment in cerebral cortical neurons (Fig. 1A).
  • the cytotoxicity was quantified by TUNEL staining and LDH analysis and treated with Compound C (+ Cpd C), an AMPK inhibitor. It was confirmed that zinc neurotoxicity was significantly reduced (FIGS. 1B and 1C).
  • the cultured cerebral cortical neurons were treated with 300 ⁇ M of zinc (ZnCl 2 ) for 10 minutes and then removed. After 0.5, 1, 2, 4, and 6 hours, the cell samples were loaded on polyacrylamide gels with protein leather and protein Isolate according to size. The antibody was then processed, washed and read.
  • zinc toxicity was induced by treating cerebral cortical neurons with 300 ⁇ M of zinc (ZnCl 2 ) for 2, 3, 4, 5 and 6 hours.
  • the protein of each sample was isolated and subjected to Western blot, and the relationship between zinc toxicity and apoptosis was confirmed by treatment with Compound C (+ Cpd C), an AMPK inhibitor, at 20 ⁇ M.
  • AMPK activity is related to the zinc toxicity mechanism, and other studies have reported an increase in AMPK activity and Bim expression in the excitatory toxicity mechanism.
  • the AMPK enzyme is an enzyme in which three subunits of ⁇ , ⁇ and ⁇ form a complex structure, and the alpha subunit has kinase enzymatic activity.
  • Previous studies have shown that AMPK alpha2 significantly inhibits neurotoxicity caused by ischemia in knock-out mice, unlike alpha1. Therefore, in the present invention, candidate chemicals capable of inhibiting AMPK enzyme activity by targeting alpha2 were selected through structure-based virtual screening, and finally 208 candidate compounds were selected.
  • Example 4-1 The 208 compounds selected in Example 4-1 were obtained from a compound library manufacturer (Interbioscreen, Russia) and subjected to secondary screening through observation of their inhibitory effect on AMPK enzyme activity.
  • AMPK enzyme activity was measured using AMPK activity assay kit (CycLex, Japan) and recombinant AMPK ( ⁇ 2 / ⁇ 1 / ⁇ 1; CycLex, Japan).
  • AMPK activity assay kit CycLex, Japan
  • recombinant AMPK ⁇ 2 / ⁇ 1 / ⁇ 1; CycLex, Japan
  • 40 drugs showed a similar or better inhibitory effect than compound C at 10 ⁇ M (Table 1 ).
  • the 40 drugs are shown in Table 1 below.
  • the neuroprotective effect was observed by treating each of the 40 selected drugs with zinc at 12 hr after treating and removing 400 ⁇ M of zinc for 10 minutes to cultured cerebral cortical neurons.
  • the degree of death of the cells was quantified by LDH analysis, and each effect was expressed as an average value, and four separate experiments were performed for each of the selected drugs (FIG. 4).
  • the neuroprotective effect was observed by treating each of the 40 selected drugs with zinc at 12 hr after treating and removing 400 uM of zinc for 10 minutes in cultured cerebral cortical neurons.
  • the degree of death of the cells was quantified by LDH analysis, and each effect was expressed as an average value, and four separate experiments were performed for each of the selected drugs (FIG. 4).
  • ⁇ M in cortical neurons in cultured mouse NMDA 50 ⁇ M FeCl 2, 100 ⁇ M H 2 O 2, 2 ⁇ M TPEN (N, N, N ', N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine, Sigma), 500 nM storosporine (Abchem) and 10 ⁇ M etoposide (Sigma) were treated respectively to induce cytotoxicity, and then the selected seven compounds were treated at a concentration of 20 ⁇ M to inhibit apoptosis The effect was observed and the degree of cell death was quantified by LDH assay.
  • the neurotoxicity model used includes excitatory toxicity, oxidative damage, and apoptosis, which are thought to be the cause of stroke.
  • TPEN is a zinc chelator and is known to induce typical apoptosis in neurons.
  • Storosporin is one of the representative apoptosis inducing enzymes as a kinase inhibitor and etoposide is DNA. It is a drug known to cause cell death due to damage.
  • Example 4-4 In order to check whether the compound # 35, which was finally selected in Example 4-4, was effective in an actual animal model, the compound was treated with a stroke model animal that caused brain injury, and then whether the brain damage inhibitory effect was observed was examined. .
  • 'MCAO' middle cerebral artery occlusion
  • SD rats 8-9 weeks old.
  • CBF was measured using laser Doppler flowmetry at 30 minutes before MCAO and 10 minutes after closure (Table 3).
  • the final screened AMPK inhibitor candidate compound # 35 100 ng in 4 ⁇ l or vehicle (10% DMSO) was injected in a ventricular injection of 0.8 mm rear and 1.2 mm lateral to 3.8 mm deep 15 minutes before MCAO. intracerebroventricular injection). After that, the degree of motor deficit of the rat was evaluated.
  • Compound # 35 the final candidate compound discovered through the present invention, significantly suppresses brain damage due to permanent middle cerebral artery occulusion, which is one of the stroke animal models (FIG. 6). ).
  • Table 3 there was no dead animals in both the control group and the experimental group, and analysis of the degree of motor deficiency showed that the compound # 35 administration group of the present invention improved the degree of motor deficiency even though it was weak.
  • 'BBB' blood brain barrier
  • 'DDS' drug delivery system
  • intracerebroventricular injection in which the drug is directly administered to the ventricle as in Example 5-1, may be used.
  • a compound that has been found to have a stroke treatment effect in actual stroke treatment the same drug should be shown even when administered by a less invasive general administration method such as intravenous injection.
  • the present inventors injected the same model of stroke with the same infarction-induced infarction as in Example 5-1, and analyzed the tissues of the infarct site and Behavioral analysis was performed.
  • Example 5-1 20 ⁇ g / kg of Compound # 35 dissolved in DMSO alone or DMSO, which is a carrier, as a control in 15 minutes before MCAO in a permanent middle cerebral artery infarction (MCA) model mouse prepared in the same manner as in Example 5-1. Each dose was administered intravenously through the tail vein.
  • the cerebral blood flow (CBF) was measured at 30 minutes before MCAO and 10 minutes after MCAO using laser Doppler flowmetry, and the weight of experimental animals was measured 24 hours after MCAO induction.
  • CBF cerebral blood flow
  • Example 5-1 immediately after the weight measurement, as in Example 5-1 by extracting the brain of the experimental animal and stained with 2% 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) and then preparing a brain tissue section, The extent of infarct site was analyzed (FIG. 7).
  • TTC 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride
  • the final screened compound # 35 was injected into rats and observed acute toxicity results.
  • AMPK enzyme plays an important role in zinc toxicity, which is considered to be one of the causes of stroke, and has been screened several times in a new compound candidate group that inhibits AMPK enzyme activity.
  • the final screening of Compound # 35 which was shown to be effective in the treatment of animal models of stroke, significantly inhibited brain damage, and thus could be used as a new stroke treatment based on AMPK inhibitory function.
  • the compounds of the present invention are effective in treating strokes caused by various neurotoxicities without significant side effects, they may be usefully used in the development of therapeutic agents for various degenerative brain diseases including stroke.

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Abstract

본 발명은 뇌졸중의 주요 원인인 아연신경독성의 AMPK 활성을 억제하는 새로운 화합물을 처리하여 뇌졸중 치료하는 새로운 뇌졸중 치료용 조성물을 제공한다.

Description

ＡＭＰＫ 억제기능에 기반한 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 및 방법
본 발명은 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 AMPK 억제기능에 기반한 새로운 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 및 방법에 관한 것이다.
뇌졸중(stroke)은 뇌혈류 이상으로 인해 갑작스레 유발된 국소적인 신경학적 증상을 통칭하는 말이다. 뇌는 몸 전체에서 무게로는 체중의 2%만 차지하지만, 뇌로 가는 혈류량은 심박출량의 15%, 산소 소모량은 몸 전체 산소 소모량의 20%나 된다. 게다가 뇌는 에너지원으로 포도당만을 사용하므로 에너지 공급이 잠시만 중단되어도 쉽게 괴사가 일어난다. 따라서 뇌혈류의 이상은 뇌손상과 밀접한 관련이 있다. 뇌졸중에 의한 뇌손상은 흥분독성(excitotoxicity), 산화성손상(oxidative stress), 아폽토시스(apoptosis) 및 아연독성(zinc neurotoxicity) 등의 다양한 독성기전을 포함하고 있어 뇌손상을 막기 위해서는 다양한 신경독성에 모두 효과적인 약물의 발굴이 필요하다.
현재, 뇌졸중 치료를 위한 많은 연구가 진행되었으나 아직까지 뚜렷한 치료제 개발이 되고 있지 않다. 뇌허혈-재관류 손상은 여러 가지 복잡한 신경세포사 기전에 입각한 약물 개발 및 효과 평가를 위해 시험관내 모델이나 동물 모델과 같은 객관적인 평가 시스템이 필요하나 약물치료에 다른 생체 징후의 변화나 부작용을 평가할 수 있는 방법이 전임상 연구에서는 매우 제한적이어서 임상 시험 시 부작용으로 인한 실패를 초래할 가능성이 높다. 특히 NMDA 길항제(antagonist)를 중심으로 많은 임상연구들이 진행되었으나 모두 실패하였다.
대한민국 공개특허 제1283416호는 AMPK 저해제 화합물 C 또는 FAS 저해제 C75를 허혈성 마우스에 투여하여 경색부의 크기를 유의하게 감소시켜 뇌졸중 또는 허혈성 상해 후 기능이 보존 되게 하는 신경보호 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나, 상기 선행기술의 경우 허혈 모델 동물에 대하여만 뇌신경보호 효과를 입증한 것으로서 허혈이 아닌 다른 기전에 의한 뇌졸중에 대한 치료효과까지 보증하는 것은 아니다. 본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 다양한 기전에 의한 뇌졸중에 효과적인 AMPK 억제기능에 기반한 새로운 뇌졸중 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일관점에 따르면, 하기 구조식을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물이 제공된다:
Figure PCTKR2015004303-appb-I000001
.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 의약으로 사용되기 위한 하기 구조식을 갖는 화합물이 제공된다:
Figure PCTKR2015004303-appb-I000002
.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 뇌졸중의 치료에 사용되기 위한 하기 구조식을 갖는 화합물이 제공된다:
Figure PCTKR2015004303-appb-I000003
.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기 구조식을 갖는 화합물을 뇌졸중에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중의 치료방법이 제공된다:
Figure PCTKR2015004303-appb-I000004
.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 뇌졸중의 주요 원인인 아연신경독성의 AMPK 활성을 억제하는 새로운 화합물을 처리하여 뇌졸중 치료효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 배양된 대뇌피질 신경세포에 아연처리 후 신경독성이 증가되었음을 TUNEL 염색으로 확인한 사진(A)과 AMPK 억제제인 Compound C (+Cpd C) 처리 후 세포독성 정도를 TUNEL 염색과 LDH assay를 통해 정량화한 그래프이다(B 및 C).
도 2는 배양된 대뇌피질 신경세포에 아연처리 후 AMPK 활성이 증가됨을 확인한 Western blot 사진(A)과 enzyme activity assay(B) 그래프이다.
도 3은 배양된 대뇌피질 신경세포에 아연처리 후 아폽토시스 촉진 유전자인 Bim의 발현증가와 caspase-3 활성을 관찰한 Western blot 사진(A)과 AMPK 억제제인 Compound C (+Cpd C) 처리 후 Bim 발현증가와 caspase-3 활성이 모두 감소된 것을 확인한 Western blot 사진(B)이다.
도 4는 AMPK activity assay kit(CycLex, Japan)와 recombinant AMPK (α2/β1/γ1; CycLex, Japan)를 구입하여 효소활성을 측정하고 compound C 효과와 비교하여 비슷하거나 좀 더 강한 억제효과를 나타내는 40개의 후보 화합물을 선별한 그래프이다.
도 5는 배양된 대뇌피질 신경세포에 다양한 신경독성을 유발한 뒤, 선별된 7개의 화합물을 처리하고 아폽토시스 정도를 LDH assay를 통해 정량화하여 아폽토시스 억제 여부를 관찰한 그래프이다.
도 6은 뇌졸중 동물모델에 최종 선별된 약물 #35를 뇌실내투여하여 뇌손상 억제효과를 관찰한 그래프와 실험동물의 뇌손상 정도를 대조군과 비교한 뇌조직절편을 촬영한 사진이다.
도 7은 뇌졸중 동물모델에 최종 서별된 약물 #35를 정맥투여하여 뇌손상 억제효과를 관찰한 그래프와 실험동물의 뇌손상 정도를 대조군과 비교한 뇌조직절편을 촬영한 사진이다.
도 8은 최종 선별된 약물 #35를 랫트에 투여하고 비장(A), 간(B) 및 신장(C)을 적출하여 급성 독성 테스트 결과를 나타낸 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "AMPK(AMP-activated protein kinase)"는 촉매 α 서브유닛(α1 또는 α2), 및 2개의 조절 서브유닛(β 및 γ)으로 구성된 헤테로삼량체 단백질이다. AMPK는 세포 에너지 수준이 낮을 때 인산화되고 활성화되며 다시 세포 대사 작용을 조절하여 유전자 발현을 장기간에 걸쳐 조절하여 ATP의 수준을 회복한다. AMP/ATP 비의 증가, 세포 pH 및 산화 환원 상태의 변화 및 크레아틴/포스포크레아틴 비의 증가가 AMPK를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 구조식을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물이 제공된다:
Figure PCTKR2015004303-appb-I000005
.
상기 화합물 IUPAC 명칭은 N-[2-[2-(1H-indol-3-yl)ethylamino]-2-oxoethyl]-3-phenyl-2,1-benzoxazole-5-carboxamide으로서, 상기 화합물은 AMPK(AMP-activated protein kinase) 효소 활성을 억제하여 신경보호 효과를 제공하며, 상기 AMPK 효소는 α2 서브유닛이 키나아제 효소활성 가지고 있다.
상기 뇌졸중은 출혈성(hemorrhagic) 뇌졸중, 허혈성(ischemic) 뇌졸중 및 금속 독성(metal toxicity) 뇌졸중일 수 있다.
상기 금속은 납(lead), 수은(mercury), 망간(manganese), 비소(arsenic), 탈륨(thallium), 철(iron), 아연(zinc), 카드뮴(cadmium), 비스무스(bismuth) 또는 주석(tin)일 수 있다.
상기 허혈성 뇌졸중은 흥분성 신경세포사 또는 산화성 신경세포사에 의해 유발되는 뇌졸중일 수 있다. 지금까지 가장 널리 알려진 뇌허혈에 의한 신경세포사 기전으로는 2가지가 있다. 하나는 뇌허혈에 의해서 세포바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포 내로 유입되어 결국 과도한 세포 내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전(Kang, T. C. et al., J. Neurocytol., 30: 945-955, 2001)이고, 다른 하나는 허혈-재관류시에 갑작스러운 산소 공급으로 인한 생체 내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사이다(Won, M. H. et al., BrainRes., 836: 70-78, 1999; Sub, A. Y. and Chen, Y. M., J. Biomed. Sci., 5: 401-414, 1998; Flowers, F. and Zimmerman, J. J., New Horiz. 6: 169-180, 1998).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 의약으로 사용되기 위한 하기 구조식을 갖는 화합물이 제공된다:
Figure PCTKR2015004303-appb-I000006
.
본 발명에서 사용된 상기 화합물은 그 구조는 공지되어 있으나, 그의 특별한 의약적 용도가 알려진 바 없어, 본 발명이 상기 화합물의 의약으로서의 용도로서는 최초의 것이다. 본 발명자들은 상기 화합물이 납(lead), 수은(mercury), 망간(manganese), 비소(arsenic), 탈륨(thallium), 철(iron), 아연(zinc), 카드뮴(cadmium), 비스무스(bismuth) 및 주석(tin) 등의 각종 금속에 의한 신경독성에 의해 유발되는 뇌졸중은 물론 다양한 신경독성에 의해 유발되는 뇌졸중의 치료에 효과적임을 입증함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 상기 화합물에 있어서, 상기 의약은 뇌졸중의 치료에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 하기 구조식을 갖는 화합물을 뇌졸중에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중의 치료방법이 제공된다:
Figure PCTKR2015004303-appb-I000007
.
상기 투여는 경구 투여 또는 정맥내 주입, 피하주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 경피흡수로 구성되는 군으로부터 선택되는 비경구 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물의 유효량은 환자의 환부의 종류,적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일 간격으로 간헐 투여해도 된다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.
부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의, 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물의 유효량은 환자의 환부의 종류,적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일 간격으로 간헐 투여해도 된다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.
부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의, 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
일반적 방법
대뇌피질 신경세포(Cerebral Cortex Neurons) 배양
본 발명에서 사용한 마우스 대뇌피질 신경세포는 마우스 배아의 뇌로부터 추출 배양하여 5% 우태아혈청(FBS)과 5% 마혈청(HS)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's mediuM(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, US)을 이용하여 95% 습도, 5% CO2 및 37℃ 온도 조건에서 배양하였다. 상기 세포의 활성화와 분화를 위해 24-well 조직 배양 플레이트에서 2 x104 세포의 밀도로 증식하였고 아연 및 화합물을 처리하기 전에는 FBS와 HS가 없는 DMEM 배지에서 배양하였다.
실시예 1: AMPK 억제제에 의한 세포독성 감소확인
아연독성(Zinc toxicity)은 뇌졸중의 대표적인 원인기전 중 하나로서, 상기 배양된 대뇌피질 신경세포에서 유발된 아연독성이 AMPK 억제제 처리에 따른 독성 감소여부를 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 배양된 대뇌피질 신경세포에 300 uM의 아연(ZnCl2)을 10분간 처리한 후 제거하고 10시간 후에 세포독성(Cytotoxicity)을 TUNEL 염색 또는 LDH(Lactate Dehydrogenase) 분석을 통해 관찰하였다. 또한 상기 세포에 AMPK 억제제인 Compound C(+Cpd C, Tocris)를 20 μM로 처리한 후 신경독성 감소를 관찰하였다.
그 결과, 대뇌피질 신경세포에 아연 처리 후 신경독성이 증가되었음을 TUNEL 염색으로 확인하였고(도 1A) 세포독성 정도를 TUNEL 염색과 LDH 분석을 통해 정량화하고 AMPK 억제제인 Compound C(+Cpd C) 처리에 의해 아연신경독성이 현저히 감소했음을 확인하였다(도 1B 및 1C).
실시예 2: 아연처리 후 AMPK 활성 관찰
아연독성과 AMPK 효소 활성간의 상관관계를 파악하고자 대뇌피질 신경세포에 아연 처리 후 AMPK 활성을 웨스턴 블랏과 효소활성 분석을 통해 관찰하였다.
2-1: 웨스턴 블랏(Western blot)
배양된 대뇌피질 신경세포에 300 μM의 아연(ZnCl2)을 10분간 처리한 후 제거하고 0.5, 1, 2, 4, 6시간 후에 상기 세포 샘플을 단백질 레더와 함께 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하고 단백질 크기에 따라 분리하였다. 그 후, 항체를 처리하고 세척한 뒤 판독하였다.
그 결과, 아연처리 후 30분 후부터 AMPK alpha-1과 alpha-2의 트레오닌 잔기(threonine residue)에 인산화됨이 관찰되었는데 이는 AMPK 활성(phosphorylated AMPK)을 의미한다. 그러나 다른 세린 잔기(serine residue)의 인산화는 관찰되지 않았다(도 2A).
2-2: 효소활성 분석(enzyme activity assay)
대뇌피질 신경세포에 상기와 같은 조건으로 아연을 처리한 후 0.5, 1, 2, 4 및 6시간 경과에 따라 각각 단백질 추출물을 얻어 AMPK activity assay kit(CycLex, Japan)를 이용하여 효소활성을 측정하였다.
그 결과, 아연 처리에 따른 AMPK 효소의 활성은 시간 의존적(Time-dependent) 으로 증가하는 것을 관찰하였다(도 2B).
실시예 3: AMPK 활성억제를 통한 아연독성 억제
대뇌피질 신경세포에 아연을 처리하여 AMPK 효소 활성이 증가하는 것이 세포사멸(apoptosis)과 관련이 있는지 관찰하였다.
구체적으로, 대뇌피질 신경세포에 300 μM의 아연(ZnCl2)을 2, 3, 4, 5 및 6시간 동안 처리하여 아연독성을 유발하였다. 상기 각 샘플의 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏을 실시하였고 AMPK 억제제인 Compound C(+Cpd C)를 20 μM로 처리하여 아연독성과 아폽토시스와의 관계를 확인하였다.
그 결과, 아연 처리 후 3시간 이후부터 BH3-only Bcl family 중에 하나인 아폽토시스 촉진 단백질(pro-apoptotic protein)인 Bim의 발현 증가가 관찰되었고caspase-3 활성도 관찰할 수 있었다(도 3A). 그러나 아연독성에 의한 Bim의 증가와 caspase-3 활성 증가가 AMPK 억제제인 compound C 처리에 의해 모두 감소된 것을 확인하였다(도 3B). 그러므로 AMPK 효소는 아연독성 기전에서 아폽토시스(apoptosis)와 관련되어 있으며 AMPK 효소의 활성억제는 아연독성에 의한 아폽토시스를 억제하는 것을 의미한다.
실시예 4: AMPK 활성억제 화합물 스크리닝 및 억제효과 확인
4-1: 구조기반 가상 스크리닝(Structure-based virtual screening)
AMPK 활성억제제로 작용할 가능성이 있는 화합물을 대상으로 1차 스크리닝을 실시하였다.
구체적으로, 상기 선행연구를 통해 AMPK 활성이 아연독성 기전에 관련되어 있음을 확인하였고, 다른 연구논문에서도 흥분독성 기전에서 AMPK 활성 및 Bim 발현 증가가 보고되었다. AMPK 효소는 α, β 및 γ 3개의 서브유닛이 복합구조를 이루어 작용하는 효소로, 이중 alpha 서브유닛이 키나아제 효소활성을 가지고 있다. 기존의 연구결과에서 AMPK alpha2가 alpha1과 달리 넉-아웃 마우스(knock-out mice)에서 허혈(ischemia)에 의한 신경독성을 현저히 억제한다고 보고하였다. 따라서 본 발명은 alpha2를 타겟으로 하여 AMPK 효소활성을 억제할 가능성이 있는 후보 케미컬(chemicals)을 구조기반 가상 스크리닝(Structure-based virtual screening)을 통해 선별하였고 결론적으로 208개의 후보 화합물이 선별되었다.
4-2: AMPK 효소활성 분석(AMPK enzyme activity assay)
상기 실시예 4-1에서 선별된 화합물 208개를 화합물 라이브러리 제조회사(Interbioscreen, Russia)로부터 입수하여 이들의 AMPK 효소활성 억제효과 관찰을 통해 2차 스크리닝을 실시하였다.
구체적으로, AMPK 효소활성은 AMPK activity assay kit(CycLex, Japan)와 recombinant AMPK(α2/β1/γ1; CycLex, Japan)를 이용하여 측정하였다. 상기 선별된 208개의 화합물과 기존에 잘 알려진 AMPK 억제제 compound C의 AMPK 효소활성 억제 효과를 측정한 결과, 40개의 약물이 10 μM에서 compound C와 비슷하거나 더 좋은 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다(표 1). 상기 40개의 약물을 하기 표 1에 표시하였다.
표 1
Compound ID Mean (% remaining activity) SEM Compound ID Mean (% remaining activity) SEM
#1 -1.2626 1.768 #22 -0.5291 0.000
#2 -1.7934 0.072 #23 1.0582 0.000
#3 -0.9684 0.036 #24 5.0505 5.051
#4 5.5556 0.265 #25 -0.1793 0.538
#5 4.2328 0.529 #26 -1.2554 0.036
#6 2.3810 0.794 #27 5.8201 0.000
#7 3.4392 0.265 #28 3.9683 1.852
#8 -0.2152 0.215 #29 0.0000 0.000
#9 0.5739 0.359 #30 1.0000 0.667
#10 -0.3945 0.179 #31 0.3641 0.850
#11 5.2910 0.529 #32 0.1257 0.126
#12 -1.3245 0.662 #33 2.9801 2.980
#13 -0.9684 0.681 #34 0.3143 0.566
#14 -0.1435 0.000 #35 0.1214 0.121
#15 5.0265 0.265 #36 0.2514 0.126
#16 6.3492 0.529 #37 7.3333 1.000
#17 2.9101 0.265 #38 5.6667 4.667
#18 2.9053 0.681 #39 1.667 3.333
#19 4.3400 1.614 #40 3.6667 0.000
#20 -1.7575 0.036 Compound C 5.3000 0.760
#21 0.8967 0.251
4-3: 아연독성 억제효과 관찰
상기 실시예 4-2에서 선별된 화합물 40 개의 아연 신경독성 억제효과 관찰을 통해 3차 스크리닝을 실시하였다.
구체적으로, 배양된 마우스의 대뇌피질 신경세포에 400 μM의 아연을 10분간 처리하고 제거한 후 12시간이 경과한 시점에서 상기 선별한 40개의 약물들을 각각 아연과 함께 처리하여 신경보호효과를 관찰하였다. 상기 세포의 사멸 정도는 LDH 분석을 통해 정량화하였는데 각각의 효과를 평균하여 수치로 나타내었고 선별된 각각의 약물들에 대해 별도의 실험을 4회 수행하였다(도 4).
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 일부 화합물은 아연독성에 의한 세포사멸을 억제하였는데, 표 2에 나타난 바와 같이 이 중 7개의 화합물(#6, #11, #14, #17, #28, #35 및 #37)이 아연독성을 유의하게 억제하는 것으로 확인되었다.
상기 실시예 4-2에서 선별된 화합물 40 개의 아연 신경독성 억제효과 관찰을 통해 3차 스크리닝을 실시하였다.
구체적으로, 배양된 마우스의 대뇌피질 신경세포에 400 uM의 아연을 10분간 처리하고 제거한 후 12시간이 경과한 시점에서 상기 선별한 40개의 약물들을 각각 아연과 함께 처리하여 신경보호효과를 관찰하였다. 상기 세포의 사멸 정도는 LDH 분석을 통해 정량화하였는데 각각의 효과를 평균하여 수치로 나타내었고 선별된 각각의 약물들에 대해 별도의 실험을 4회 수행하였다(도 4).
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 일부 화합물은 아연독성에 의한 세포사멸을 억제하였는데, 표 2에 나타난 바와 같이 이 중 7개의 화합물(#6, #11, #14, #17, #28, #35 및 #37)이 아연독성을 유의하게 억제하는 것으로 확인되었다.
표 2
Compound ID 유의성 Compound ID 유의성
#1 0.5487 #22 0.0200
#2 0.8483 #23 0.8757
#3 0.5597 #24 0.8699
#4 0.0283 #25 0.4870
#5 0.9326 #26 0.6624
#6 0.0278 #27 0.3030
#7 0.0003 #28 0.0008
#8 0.0001 #29 0.1137
#9 0.8649 #30 0.2142
#10 0.1253 #31 0.1777
#11 0.0311 #32 0.7276
#12 0.0000 #33 0.2386
#13 0.4384 #34 0.1043
#14 0.0220 #35 0.0016
#15 0.2378 #36 0.0381
#16 0.2488 #37 0.0290
#17 0.0048 #38 0.3225
#18 0.3961 #39 0.0027
#19 0.7590 #40 0.0390
#20 0.8889 Compound C 0.0003
#21 0.6141
4-4: 다양한 신경독성에 대한 억제효과 관찰
상기 실시예 4-3에서 선별한 7개 화합물의 신경독성 억제효과 관찰을 통해 4차 스크리닝을 실시하였다.
구체적으로, 배양된 마우스의 대뇌피질 신경세포에 50 μM NMDA, 50 μM FeCl2, 100 μM H2O2, 2 μM TPEN(N,N,N',N'-tetrakis(2-pyridylmethyl) ethylenediamine, Sigma), 500 nM 스토로스포린(staurosporine, Abchem) 및 10 μM 에토포사이드(etoposide, Sigma)를 각각 처리 하여 세포독성을 유발한 후 상기 선별된 7개 화합물을 20 μM의 농도로 처리하여 세포사멸 억제 효과를 관찰하였고 세포사멸 정도는 LDH assay를 통해 정량화하였다. 상기 사용한 신경독성 모델은 뇌졸중의 원인기전으로 생각되는 흥분독성, 산화성 손상 및 세포사멸(apoptosis) 등이 포함되어 있는데 그 중 흥분독성 모델로는 NMDA를 처리하였고, 산화성손상 모델로는 철(iron) 독성과 H2O2 독성 모델을 사용하였으며, 세포사멸 모델로는 TPEN, 스토로스포린(staurosporine) 및 에토포사이드(etoposide) 독성모델을 이용하였다. 상기 TPEN은 아연 킬레이터(zinc chelator)로 신경세포에서 전형적인 세포사멸을 유발하는 것으로 잘 알려져 있고, 스토로스포린은 효소활성 억제제(kinase inhibitor)로 역시 대표적인 세포사멸 유발물질 중 하나이며 에토포사이드는 DNA 손상으로 인한 세포사멸을 유발한다고 알려진 약물이다.
그 결과, 상기 선별된 7개의 약물을 함께 처리하여 신경독성 감소에 따른 신경보호 효과를 관찰하였는데 특히, 화합물 #35 및 화합물 #28이 모든 독성에 억제효과를 나타냄을 알 수 있었다(도 5). 화합물 #35의 경우, 세포사멸 모델 중에 스토로스포린 독성만 억제하지 못하였으나 이는 스토로스포린이 유발하는 독성기전과 관련된 것으로, 다른 2개의 세포사멸 모델에 효과가 있는 것으로 확인되었으므로 최종 화합물로 선별하였다. 라이브러리 구입처로부터 상기 화합물 #35는 하기와 같은 구조를 갖는 N-[2-[2-(1H-indol-3-yl)ethylamino]-2-oxoethyl]-3-phenyl-2,1-benzoxazole-5-carboxamide임을 확인하였다:
Figure PCTKR2015004303-appb-I000008
.
실시예 5: 뇌졸중 동물모델에서 뇌손상 억제효과 관찰
5-1: 뇌실내 투여 실험
상기 실시예 4-4에서 최종 선별된 화합물인 #35가 실제 동물 모델에서도 효과적인지 확인하기 위해 상기 화합물을 뇌손상을 유발한 뇌졸중 모델 동물에 처리한 후, 뇌손상 억제효과가 나타나는지 여부를 조사하였다.
구체적으로, 8-9 주령이 된 수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트(rat)를 이용하여 영구 중뇌동맥 폐쇄(middle cerebral artery occlusion, 이하, 'MCAO'라 약칭함) 모델을 제작하였다. MCAO 전 30분 및 폐쇄 후 10분경과 시점에서 레이저 도플러 혈류측정기(Laser-Doppler flowmetry)를 이용하여 대뇌 혈류(CBF)를 측정하였다(표 3). 상기 최종 선별된 AMPK 억제제 후보 화합물인 #35(4 μl 내 100 ng) 또는 비히클(10% DMSO)을 MCAO 전 15분에 3.8 mm 깊이로 0.8 mm 후면 및 브레그마의 측면 1.2 mm의 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection)하였다. 이 후, 상기 랫트의 운동 결핍(motor deficit) 정도를 평가 하였는데 평가의 기준(Longa et al., 1989)은 결핍을 나타내지 않는 것은 정상(Normal, 0점), 수직으로 정지할 때 앞발 연장의 실패는 경증(mild, 1점), 반대쪽으로 회전하는 것은 보통(moderate, 2점) 및 회전 손실(loss of circling) 또는 정확한 반사작용은 심각한 결핍(severe deficit, 3점), 아무런 반응이 없는 경우에는 무반응(no response, 4점), 그리고 실험동무이 죽은 경우에는 사망(death, 5점)으로 분류하였다. 또한, 상기 랫트 모델에 허혈(ischemia)을 유도 후 24시간 경과한 시점에서 뇌를 수득하였고 2% 2,3,5-triphenyl tetrazoliuM chloride(TTC)로 염색하여 뇌경색(cerebral infarction) 정도를 측정하였다. 아울러, MCAO 후 24시간 경과 후 실험 동물의 몸무게를 측정한 다음, 뇌를 적출하여 2% 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride(TTC)로 염색한 후 뇌조직 절편을 제조함으로써 뇌경색 정도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명을 통해 발굴된 최종 후보 화합물인 화합물 #35이 뇌졸중 동물모델 중 하나인 영구 중뇌동맥 폐쇄(permanent middle cerebral artery occulusion)에 따른 뇌손상을 현저하게 억제시킴을 최종 확인하였다(도 6). 아울러, 표 3에 나타난 바와 같이, 사망한 실험동물은 대조군 및 실험군 모두 없었고, 운동결핍 정도에 대한 분석 결과 본원발명의 화합물 #35 투여군이 미약하나마 운동결핍 정도가 개선되는 것으로 나타났다.
표 3
Veh 화합물 #35
CBF(% of baseline) 36.9±2.5 38.4±2.4
Weight reduction(g) 48.8±2.9 40.0±3.5
Motor deficit 2.1±0.3 2.0±0.0
Mortality(%) 0/6(0%) 0/4(0%)
5-2: 정맥투여 분석
뇌를 표적으로 하는 약물의 경우 가장 큰 문제점은 이들 약물이 혈뇌장벽(blood brain barrier, 이하, 'BBB'라 약칭함)를 통과하지 못할 경우, 실제 치료제로 개발이 어렵다는 점이다. 이를 해결하기 위해, BBB를 통과할 수 있는 약물전달체(drug delivery system, 이하, 'DDS'라 약칭함)와 결합시켜 해당 약물을 전달하는 시도도 이루어지고 있다. 대안으로는 이런 약물을 상기 실시예 5-1가 같이 직접 뇌실내에 투여하는 뇌실내 투여(intracerebroventricular injection)를 이용하기도 하는데, 매우 침습적인 방법이기 때문에 긴급상황이 아니고서는 그 사용이 제한적이다. 따라서, 뇌졸중 치료효과가 있는 것으로 규명된 화합물을 실제 뇌졸중 치료에 활용하기 위해서는 정맥주사와 같은 덜 침습적인 일반적인 투여방법으로 투여하더라도 동일한 약효가 나타나야 한다.
이에 본 발명자들은 상기 화합물 #35가 실제 정맥주사에서도 동일한 효과가 나타는지 확인하기 위해 실시예 5-1과 동일한 경색 유발에 의한 뇌졸중 모델 마우스에 꼬리정맥을 통해 주입한 후, 경색 부위의 조직 분석 및 행동학적 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5-1와 동일한 방법으로 제조된 영구 중뇌 동맥 경색(MCA) 모델 마우스에 MCAO 전 15분에 대조군으로 담체인 DMSO만을 또는 DMSO에 용해된 상기 화합물 #35을 20 μg/kg의 투여량으로 각각 꼬리정맥을 통해 정맥주사하였다. 그리고 MCAO 전 30분 및 MCAO 후 10분 경과 시점에서 레이저 도플러 혈류측정기(Laser-Doppler flowmetry)를 이용하여 대뇌 혈류(CBF)를 측정하였고, MCAO 유도후 24시간 경과 후 실험동물의 몸무게를 측정하였으며(표 3), 몸무게 측정 바로 직후에 실시예 5-1과 마찬가지로 해당 실험동물의 뇌를 적출한 다음 2% 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride(TTC)로 염색한 후 뇌조직 절편을 제조함으로써, 경색 부위의 정도를 분석하였다(도 7).
그 결과 표 4 및 도 7에 나타난 바와 같이, 본발명의 화합물 #35를 정맥주사로 투여한 실험동물의 경색부위가 현저하게 감소하였을뿐만 아니라, 운동결핍도 대폭 개선시켰음을 알 수 있었다. 본발명의 화합물 #35의 투여에 따른 혈류량이나 체중의 변화도 감지되지 않았다.
표 4
Veh 화합물 #35
CBF(% of baseline) 34.0±3.8 34.7±2.4
Weight reduction(g) 39.7±2.2 38.7±2.6
Motor deficit 2.4±0.3 1.9±0.1
Mortality(%) 0/5(0%) 0/5(0%)
실시예 6: 급성 독성 테스트(Acute toxicity test)
상기 최종 선별된 화합물인 #35을 랫트에 주입하고 급성 독성 결과를 관찰하였다.
구체적으로, 8-9 주령된 수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트에 상기 최종 선별된 AMPK 억제제 후보 화합물인 화합물 #35을 랫트 1 마리 당 100 μg/kg 또는 비히클(10% DMSO)을 정맥내 주입(intravenous injection)하였고 이를 4회 반복하였다.
그 결과, 24시간 경과 후에도 죽는 랫트는 발견되지 않았고 랫트를 희생시켜 간, 비장 및 신장 장기들을 적출하여 무게를 측정하였고, 상기 랫트의 혈액을 채취하여 WBC, RBC, BUN, AST, ALT, CREA 및 GLU 등의 지표 결과를 확인하였으나 대조군과 비교하여 대부분의 지표가 정상으로 나타났으며 눈에 띄는 독성을 관찰되지 않았다(도 8). 상기 지표에 대한 결과를 하기 표 5에 표시하였다.
표 5
정상 범위 Veh(n=4) AMPK 억제제(n=4)
WBCB(x103 cell/uL) 6.6 - 12.6 10.5±3.5 9.9±2.5
RBC(x103 cell/uL) 6.8 - 9.8 6.7±0.5 6.4±0.3
BUN(mg/dL) 5 - 21 16.9±2.0 15.2±1.8
AST(U/L) 45.7 - 80.8 64.2±5.0 91.2±15.3
ALT(U/L) 17.5 - 30.2 38.9±0.4 40.2±5.0
CREA(mg/dL) 0.2 - 0.8 0.4±0.1 0.4±0.0
GLU(mg/dL) 50 - 135 175.5±26.5 162.1±13.2
상기 결과들을 종합해보면, AMPK 효소가 뇌졸중의 원인기전 중 하나로 생각되는 아연독성에 중요한 역할을 하고 있음을 발견하여 AMPK 효소 활성을 억제기능을 가지고 있는 새로운 화합물 후보군에서 여러 차례 스크리닝을 실시하여 탁월한 아연독성에 효과를 보인 화합물 #35을 최종 선별하고 뇌졸중 동물모델에 처리한 결과 현저하게 뇌손상을 억제됨을 확인하였으므로 AMPK 억제기능에 기반한 새로운 뇌졸중 치료제로 활용 가능하다.
본 발명의 화합물은 큰 부작용 없이 각종 신경독성에 의해 유발되는 뇌졸중의 치료에 효과적이기 때문에, 뇌졸중을 포함하는 각종 퇴행성 뇌질환의 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 하기 구조식을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물:
    Figure PCTKR2015004303-appb-I000009
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 뇌졸중은 출혈성(hemorrhagic) 뇌졸중, 허혈성(ischemic) 뇌졸중 또는 금속 독성(metal toxicity) 뇌졸중인 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 금속은 납(lead), 수은(mercury), 망간(manganese), 비소(arsenic), 탈륨(thallium), 철(iron), 아연(zinc), 카드뮴(cadmium), 비스무스(bismuth) 또는 주석(tin)인 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 허혈성 뇌졸중은 흥분성 신경세포사 또는 산화성 신경세포사에 의해 유발되는 것인, 약학적 조성물.
  5. 의약으로 사용되기 위한 하기 구조식을 갖는 화합물:
    Figure PCTKR2015004303-appb-I000010
    .
  6. 제5항에 있어서,
    상기 의약은 뇌졸중의 치료에 사용되는 것인, 화합물..
  7. 하기 구조식을 갖는 화합물을 뇌졸중에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중의 치료방법:
    Figure PCTKR2015004303-appb-I000011
    .
  8. 제7항에 있어서,
    상기 투여는 경구 투여 또는 정맥내 주입, 피하주입, 근육내 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 경피흡수로 구성되는 군으로부터 선택되는 비경구 투여인 뇌졸중의 치료방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3498277A4 (en) * 2016-08-09 2020-03-25 Industry Academy Cooperation Foundation Of Sejong University PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF VASCULAR ACCIDENT BASED ON INHIBITION OF AMPK

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101746199B1 (ko) * 2016-07-04 2017-06-13 기초과학연구원 질소 함유 헤테로아릴 유도체 및 GSK3β 저해제로서의 이의 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060120694A (ko) * 2003-12-22 2006-11-27 메모리 파마슈티칼스 코포레이션 인돌, 1ｈ-인다졸, 1,2-벤즈이속사졸 및1,2-벤즈이소티아졸, 및 이들의 제법 및 용도
KR20080048550A (ko) * 2005-09-23 2008-06-02 메모리 파마슈티칼스 코포레이션 인다졸, 벤조티아졸, 벤조이소티아졸, 벤즈이속사졸,피라졸로피리딘, 이소티아졸로피리딘, 및 이들의 제법 및용도
KR20120078756A (ko) * 2004-03-24 2012-07-10 더 존스 홉킨스 유니버시티 Ａｍｐ-활성화 단백질 키나아제의 약리학적 저해에 의한 신규한 신경보호 방법
KR20120120416A (ko) * 2010-02-11 2012-11-01 벤더르빌트 유니버시티 Ｍｇｌｕｒ4 알로스테릭 강화제로서 벤즈이속사졸 및 아자벤즈이속사졸, 조성물, 및 신경 기능이상을 치료하는 방법
KR20130128460A (ko) * 2011-02-25 2013-11-26 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항당뇨병제로서 유용한 신규 시클릭 아자벤즈이미다졸 유도체

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060120694A (ko) * 2003-12-22 2006-11-27 메모리 파마슈티칼스 코포레이션 인돌, 1ｈ-인다졸, 1,2-벤즈이속사졸 및1,2-벤즈이소티아졸, 및 이들의 제법 및 용도
KR20120078756A (ko) * 2004-03-24 2012-07-10 더 존스 홉킨스 유니버시티 Ａｍｐ-활성화 단백질 키나아제의 약리학적 저해에 의한 신규한 신경보호 방법
KR20080048550A (ko) * 2005-09-23 2008-06-02 메모리 파마슈티칼스 코포레이션 인다졸, 벤조티아졸, 벤조이소티아졸, 벤즈이속사졸,피라졸로피리딘, 이소티아졸로피리딘, 및 이들의 제법 및용도
KR20120120416A (ko) * 2010-02-11 2012-11-01 벤더르빌트 유니버시티 Ｍｇｌｕｒ4 알로스테릭 강화제로서 벤즈이속사졸 및 아자벤즈이속사졸, 조성물, 및 신경 기능이상을 치료하는 방법
KR20130128460A (ko) * 2011-02-25 2013-11-26 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 항당뇨병제로서 유용한 신규 시클릭 아자벤즈이미다졸 유도체

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PubChem 13 November 2007 (2007-11-13), Database accession no. 17592753 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3498277A4 (en) * 2016-08-09 2020-03-25 Industry Academy Cooperation Foundation Of Sejong University PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF VASCULAR ACCIDENT BASED ON INHIBITION OF AMPK
EP3498277B1 (en) * 2016-08-09 2021-10-06 Zincure Corp. Pharmaceutical composition for stroke treatment based on ampk inhibition

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