WO2015163622A1 - 항암치료용 pH 민감성 및 생환원성 폴리머-바이러스 복합체 - Google Patents

항암치료용 pH 민감성 및 생환원성 폴리머-바이러스 복합체 Download PDF

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virus
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윤채옥
카살라다야난다
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한양대학교 산학협력단
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    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10042—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule

Definitions

  • the present invention was made by the task number 2013050188 under the support of the Ministry of Science, ICT and Future Planning, and the research management specialized agency of the project was the Korea Research Foundation.
  • the present invention was made by the task number 2013065203 under the support of the Ministry of Science, ICT and Future Planning, and the research management specialized organization of the project was the Korea Research Foundation, and the research project name was "Science field basic research project / medium researcher support project / leap research ", The research project name is” Development of nano-material hybrid gene transporter for selective tumor control ".
  • the host institution is Hanyang University Industry-University Cooperation Group research period from 2013. 09. 01 ⁇ 2014. 8. 31.
  • This patent application claims priority to Korean Patent Application No. 10—2014-0048146 filed with the Korean Patent Office on April 22, 2014, the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • the present invention provides a pH-sensitive and bioreducible polymer-viral complex, a pH-sensitive and bioreducible polymer, and a pharmaceutical composition comprising the polymer-virus complex, which can effectively destroy tumor cells by increasing the transduction efficiency of the virus. It is about.
  • oncolytic adenovirus has been suggested as a therapeutic strategy for cancer because of its various biochemical benefits (1-4).
  • These oncolytic adenoviruses are, first, cancer-specific; Protective mechanisms against viral replication present in normal cells such as endogenous tumor suppressor proteins (p53, pRb, pl2ARF, etc.) do not function in cancer cells, which establishes the adenovirus's selectivity for tumors (5).
  • Adenovirus not only destroys the host directly at the end of the lytic life cycle, but also spreads the progeny of the virus, which also infects and subsequently destroys neighboring tumor cells (6, 7).
  • Adeviruses are one of the most effective viral vectors for gene therapy, as well as oncolytic properties. Adenoviruses have high gene transfer efficiency, effective nucleic acid entry mechanisms and titers in dividing and non-dividing cells. As a result, various clinical trials have been successfully reported using topical administration of adenovirus for oncogene therapy (9-11).
  • adenoviruses face many challenges in realizing maximum therapeutic effects in systemic administration.
  • Adenoviruses are removed from blood vessels through three major immunological barriers when delivered systemically: 1) innate immune response induced by macrophages and dendritic cells, and 2) adaptation by neutralization of anti-adenovirus antibodies. Immune response, 3) recruitment of viral particles by Kupper cells. Three immunological barriers cause acute liver toxicity and infection of hepatocytes.
  • adenoviruses interact with blood vessels and red blood cells, which cause toxicity and other possible side effects.
  • CAR coxsacki and adenovi rus receptor
  • the transduction efficiency of adenoviruses is severely limited by the expression levels of the coxsacki and adenovi rus receptor (CAR) in tumor cells as well as in immunological barriers.
  • CAR is a 46 kDa endothelial protein that acts as the primary gateway for adenovirus to enter target cells.
  • the penton base of adenovirus interacts with ⁇ v ⁇ 3 and ⁇
  • the therapeutic effect of intratumoral and systemic administration of adenovirus may be compromised by the low expression level of CAR in tumor cells because of this dependency.
  • Nonviral systems have unique advantages such as low immunogenicity, effective regeneration and simple quality control procedures. This advantage compensates for the limitation of the viral vectors described above.
  • various adenovirus nanocomposites have been developed to minimize targeting efficiency while minimizing harmful side effects (17, 18).
  • PEG polyethylene glycol
  • Polyethyleneglycolation of adenoviruses has also demonstrated that not only reduces the innate immune response to adenoviruses, but also prevents host antibodies from neutralizing adenoviruses (19).
  • Adenovirus encapsulation with cationic polymers is another effective strategy to overcome CAR dependence and immunological barriers. Since both cell membranes and adenoviruses are negatively charged, the positive charge of the polymer not only allows ionic interactions between the polymer and the virus, but also facilitates the entry of the virus into host cells using electrostatic interactions. . To address this problem, poly (ethylimine) (PEI) and poly (L-lysine) (PLL) have become the standard 22 cationic polymers used to improve the transduction efficiency of adenovirus and DNA delivery. . However, this polymer-coated adenovirus still remains unstable in terms of tumor selectivity due to nonspecific uptake by positive charges (20, 21).
  • these cationic polymers cause severe cytotoxicity due to the strong absorption of non-degradable and negatively charged cell membranes and positively charged polymers in in-vivo, and this cytotoxicity is due to tritoxicity mediated by PEI and PLL. (See in vitro cytotoxicity test of polycations: effect of PLL on cell viability and hemolysis).
  • hypoxia induces two typical biological reactions, namely the stabilization and accelerated bioreducible response of hypoxia inducible factor-1.
  • hypoxia is a diseased state, suggesting that tissue in this state has a significant negative impact on gene therapy as well as chemotherapy of chemotherapy to deprive oxygen supply.
  • lactic acid accumulates in the environment of extracellular cells, which eventually become acidic compared to normal physiological pH (7.4).
  • numerous stimulus sensitive polymers have been developed and their working mechanism is based on the polymer's chemical structure. Poly ⁇ with acidic or basic groups, for example, appear to react with the pH solution.
  • the inventors have designed and synthesized a pH sensitive polymer (mPEG-PiP-CBAKCBA) with bioreducible disulfide bonds in the polymer backbone, and furthermore, as a result of studying transduction efficiency and Ad-CBA cell uptake in vitro, pH sensitivity and The present invention has been completed by confirming that the bioreducible polymer-virus complex has an excellent effect of anticancer treatment.
  • mPEG-PiP-CBAKCBA pH sensitive polymer
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for anticancer treatment comprising a polymer-virus complex.
  • Still another object of the present invention is to provide a bioreducible portion comprising (i) escapable port ion from i mmune reactions, (ii) chargeable port ion and (iii) disulfide bonds.
  • a bioreducible portion comprising (i) escapable port ion from i mmune reactions, (ii) chargeable port ion and (iii) disulfide bonds.
  • a pH sensitive and bioreducible polymer comprising a).
  • an anticancer treatment method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of a polymer-virus complex.
  • the invention provides a bioreducible moiety comprising (i) escapable port ion from immune reactions, (ii) a chargeable moiety and (iii) disulfide bonds
  • a pH-sensitive and bioreducible polymer comprising bioreducible port ions provides a polymer-viral complex that is bound to the surface of the virus.
  • the polymer used in the composite of the present invention is prepared to include three sites. And the three sites each comprise (i) an escapable port ion from immune reactions, (ii) a chargeable port ion and (iii) a bioreducible portion, including disulfide bonds. It includes.
  • the immune response avoidance site acts to allow the virus to which the polymer binds to avoid immune response (including cellular immune response and humoral immune response) in vivo.
  • Substances that can be used in the immune response avoidance site are, in particular, polymers that can avoid in vivo immune response (including cellular and humoral immune responses), and more specifically, PEG (polyethylene glycol), poly Alkylene oxides [eg, polyoxyethylene, polyoxypropylene or copolymers thereof (eg, polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer)], polyphenylene oxide, PEG and polyalkylene oxide.
  • Copolymers poly (methoxyethyl methacrylate), poly (methacryloyl phosphatidylcholine), perfluorinated polyethers, textanes or polyvinylpyridones, more specifically PEG, polyalkylene oxides or PEG And a copolymer of polyalkylene oxide, and more particularly PEG.
  • the chargable port ion of the polymer used in the present invention imparts a charge (e.g., positive charge) to the polymer at a pH in vivo, specifically at a neutral pH, thereby causing the surface of the virus (e.g., the negative charge surface of the adenovirus). To bond by ionic interaction.
  • the chargeable portion includes a substance that gives a positive or negative charge to the polymer, for example, a carboxylate group when a negative charge is given, a substance having a tertiary amine group or an amino group when a positive charge is given, Can be used.
  • Bioreducible moieties containing disulfide bonds include any material including disulfide bonds.
  • the bioreducible moiety is reduced in an acidic environment in vivo to convert disulfide bonds to sulfhydryl groups, resulting in the breakdown of the polymer structure, which eventually releases the bound virus.
  • Viruses used in the polymer-virus complex include any virus and specifically include a virus used as a gene therapy agent, for example:
  • Adenoviruses are widely used as gene transfer vectors due to their medium genome size, ease of manipulation, high titers, wide range of target cells and excellent infectivity. Both ends of the genome contain 100-200 bp of inverted terminal repeat (ITR), which is an essential cis element for DNA replication and packaging.
  • ITR inverted terminal repeat
  • the genome El region (E1A and E1B) encodes proteins that regulate transcription and transcription of host cell genes.
  • the E2 regions (E2A and E2B) encode proteins that are involved in viral DNA replication.
  • the decorin gene of the present invention is preferably inserted into the deleted E1 region (E1A region and / or E1B region, preferably the E1B region) or the E3 region, more preferably the deleted E3 region.
  • the target nucleotide sequence to be transported into the cell is preferably inserted into the deleted E1 region (E1A region and / or E1B region, preferably E1B region) or E3 region, more preferably inserted into the deleted E1 region do.
  • the term "deletion" as used herein in connection with a viral genome sequence has the meaning including not only a complete deletion of the sequence, but also a partial deletion.
  • adenovirus can pack up to about 105% of the wild-type genome, approximately 2 kb can be additionally packaged (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987)).
  • the above-described foreign sequence inserted into the adenovirus may additionally bind to the genome of the adenovirus.
  • Adenoviruses have 42 different serotypes and subgroups of A-F. Of these, adenovirus type 5 belonging to subgroup C is the most preferred starting material for obtaining the adenovirus vector of the present invention. Biochemical and genetic information for adenovirus type 5 is well known. Foreign genes carried by adenoviruses replicate in the same way as episomes, and have very low genetic toxicity to host cells. Therefore, gene therapy using the adenovirus gene delivery system of the present invention is considered to be very safe. ⁇ . Retrovirus
  • Retroviruses are widely used as gene transfer vectors because they insert their genes into the host genome, carry large amounts of foreign genetic material, and have a broad spectrum of cells that can infect them.
  • the decorin gene and the desired nucleotide sequence to be transported are inserted into the retroviral genome instead of the sequence of the retrovirus to produce a nonreplicating virus.
  • a packaging cell line containing the gag, pol and env genes but no LTR (long terminal repeat) and ⁇ sequences is constructed (Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983)).
  • Viruses are lined up with media (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors- ' A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 ( 1988).
  • the medium containing the recombinant retrovirus is collected, concentrated and used as a gene delivery system.
  • VI LV Variants of the virus
  • EPO erythropoietin
  • the gene delivery system of the present invention can also be prepared according to this second generation retroviral vector construction strategy.
  • Adeno-associated virus is suitable as the gene delivery system of the present invention because it can infect non-dividing cells and has the ability to infect various kinds of cells. Details of the manufacture and use of AAV vectors are disclosed in detail in US Pat. Nos. 5,139,941 and 4,797,368.
  • the MV virus is a plasmid (McLaughlin et al., J. Virol., 62) comprising a gene sequence of interest (decorine gene and target nucleotide sequence to be carried) with two MV terminal repeats located next to it. 1963-1973 (1988); and Samulski et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989) and expression plasmids (McCarty et al., J. Virol) comprising wild type MV coding sequences without terminal repeats. 65: 2936-2945 (1991).
  • viral vectors can also be used in the present invention.
  • Vaccinia virus Panhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10: 649-657 (1999); Ridgeway, "Mammal i an expression vectors," In: Vectors '' A survey of molecular cloning vectors and their uses.Rodrigo and Denhardt, eds.Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichvval and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes, "In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer.
  • virus used in the present invention may further comprise the following therapeutic genes:
  • antigenic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed in a target cell to produce cell surface antigenic proteins that can be recognized by the immune system.
  • antigenic genes include carcinoembryonic antigen (CEA) and prostate specific ant i gen (PSA), ⁇ -feto protein (AFP), p53 (WO 94/02167).
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • PSA prostate specific ant i gen
  • AFP ⁇ -feto protein
  • p53 WO 94/02167
  • cytotoxic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed in a cell and exhibits a toxic effect.
  • examples of such cytotoxic genes include nucleotide sequences encoding Pseudomonas exotoxin, lysine toxin, diphtheria toxin and the like.
  • cytostatic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed intracellularly and stops the cell cycle during the cell cycle.
  • cell proliferation inhibitory genes include p21, retinoblastoma gene, E2F-Rb fusion protein gene, genes encoding cyclin-dependent kinase inhibitors (eg, pl6, pl5, pl8 and pl9), growth stop specific homeo Growth arrest specific homeobox (GAX) genes (W0 97/16459 and TO 96/30385), and the like.
  • cytokines eg Interferon-alpha, -beta, -delta and -gamma
  • interleukins e.g., IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-19 and IL-20
  • genes encoding colony stimulating factors eg, GM-CSF and G-CSF
  • chemokine groups monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), monocyte chemotactic protein 2 (MCP-2), monocytes
  • tissue plasminogen activator tPA
  • urokinase urokinase
  • LAL lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-like lipid-containing lipid-derived lipid lipid-phosphate, and others.
  • tPA tissue plasminogen activator
  • urokinase urokinase
  • LAL LAL generating genes that provide a sustained thrombotic effect to prevent cholesterol hyperemia.
  • polynucleotides are known for treating cystic fibrosis, adenosine deaminase deficiency, and viruses such as AIDS, malignant and inflammatory diseases and conditions.
  • pro-apoptotic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed and induces programmed cell death.
  • pro-apoptotic genes include p53, adenovirus E3- 11.6. K (derived from Ad2 and Ad5) or adenovirus E3-10.5K (derived from Ad), adenovirus E4 gene, Fas ligand, TNF-, TRAIL, P 53 pathway gene and genes encoding caspases are included.
  • anti-angiogenic gene refers to a nucleotide sequence that is expressed and releases an anti-angiogenic factor extracellularly.
  • Anti-angiogenic factors include angiostatin, inhibitors of vascular endothelial growth factor (VEGF) such as Tie 2 (PNAS, 1998 # 95,8795-800), endostatin and the like.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the present invention is directed to a therapeutically effective amount of the above-described polymer-virus complex of the present invention; And (b) provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier. Since the pharmaceutical composition of the present invention uses the above-described polymer-virus complex as an active ingredient, the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • polymer-virus complex of the present invention can be used for the treatment of various diseases, but is particularly useful for anticancer treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used for various diseases or diseases related to tumors such as gastric cancer, lung cancer, breast cancer, Ovarian Cancer, Liver Cancer, Bronchial Cancer. It can be used to treat nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer and cervical cancer. Terminology herein
  • Treatment includes (i) prevention of tumor cell formation; (H) inhibition of a disease or condition associated with the tumor following removal of the tumor cells; And (m) alleviation of a disease or disorder associated with a tumor following removal of tumor cells.
  • therapeutically effective amount herein means an amount sufficient to achieve the pharmacological effect described above.
  • compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, phosphate chalcum, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenteral, and may be administered using, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or topical administration.
  • Intraperitoneal administration in ovarian cancer and in the portal vein in liver cancer can be administered by infusion method, in the case of breast cancer can be directly injected into the tumor mass, in the case of colon cancer by direct injection into the enema
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction response.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a polymer-virus complex of IX 10 5-1 X 10 15 pfu / i, and typically 1 X 10 10 pfu is injected for two weeks once every two days.
  • compositions of the present invention are prepared in unit dosage form by being formulated using pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of axes, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • compositions of the present invention may be used as a single therapy, but may also be used in combination with other conventional chemotherapy or radiation therapy, and when the combination therapy is performed, cancer treatment may be more effectively performed.
  • Chemotherapeutic agents that can be used with the compositions of the present invention are cisplatin, carboplatin, procarbazine, dechlorermechlorethamine, cyclophosphamide ( cyclophosphamide, ifosf amide, melphalan, chlorabusil
  • Radiation therapy that can be used with the composition of the present invention is X-ray irradiation, Y-ray irradiation, and the like.
  • the invention provides a bioreducible moiety comprising (i) escapable port ion from immune reactions, (ii) a chargable portion and (iii) disulfide bonds.
  • pH sensitive and bioreducible polymers, including bioreducible port ions, provide polymers capable of binding to the surface of a virus.
  • the polymer that can be bound to the surface of the virus of the present invention is defined by the formula (1) as follows, since it is used as an active ingredient of the above-described polymer-virus complex, the common content between the two in order to avoid excessive complexity of the present specification And the description thereof are omitted.
  • the present invention provides a method for anticancer treatment comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the polymer-virus complex of the present invention.
  • the anticancer treatment method of the present invention corresponds to a method of using a polymer-virus complex or an anticancer composition using the same, which is another embodiment of the present invention. Therefore, the overlapping description will be omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the cancer in the anticancer treatment method is any one selected from the group consisting of gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer and cervical cancer. . ⁇ Effects of the Invention ⁇
  • the present invention provides a PH sensitive and bioreducible polymer-virus complex, a pH sensitive and bioreducible polymer, and a pharmaceutical composition for anticancer treatment comprising the polymer-complex.
  • the polymer-virus complexes of the present invention are effective in absorbing into tissue or tumor cells and Through the immune avoidance mechanism, it can be usefully used as an anticancer agent that can destroy tumor cells more effectively by increasing the transduction efficiency of adenovirus.
  • La is a schematic representation of the synthesis of pH and bioreducible polymers (CBA).
  • Lb shows the 3 ⁇ 4NMR spectrum of the CBA polymer at CBA polymerrin D 2 0.
  • Figure lc shows the hypothesis of Ad / CBA complex accumulation at the tumor site and Ad release from the polymer under microenvironment.
  • Id is a diagram evaluating the cytotoxicity of CBA polymers in MCF-7 cells by MTT assay.
  • FIG. Le is a plot of zeta potential values (niV) of CBA coated with Ad at various concentrations, 1 ⁇ 10 10 VP in 1 mL PBS and CBA polymer at room temperature (CBA polymer concentration. Repeated three times and expressed as mean ⁇ SD).
  • FIG. 2 is a TEM image of naked Ad (FIG. 2A) and an Ad-CBA complex. Ad and Ad-CBA were incubated for 30 minutes with PBS at pH 7.4 (FIG. 2B) and pH 6.0 (FIG. 2C).
  • FIG. 3 shows that the optimal conditions for the formation of the Ad-CBA complex are determined by the pH dependent gene transfer efficiency and the gel delay effect of the Ad-CBA complex.
  • 3A shows fluorescence images of cells treated with Ad-CBA complexes at various concentrations of CBA.
  • MOI 20 J343) FIG. 3A
  • M0I 200 FIG. 3B
  • U343 and MCF mot cells transduced with naked type Ad or Ad / CBA complexes (0.05, 0.1, 0.25 and 0.5 mg / mL) It is also.
  • concentrations of CBA poly were used to represent the gel delay assay of the Ad-CBA complex.
  • FIG. 4a is in the presence and absence of a CAR protein specific protein (0.2, 2 yg / ml) Figure showing transduction into U343 cells using Ad and Ad-CBA. Naked Ad and Ad-CBA were added at MOI 20. 48 hours after transduction, cells were analyzed by flow cytometry for GFP expression. The data are representative of three independent refute experiments (mean standard error, *** P ⁇ 0.01 vs untreated group).
  • FIG. 4B shows the cellular uptake mechanism of the indicated concentration of the naked Ad or Ad-CBA complex. To confirm, cells were pretreated for 30 minutes at the indicated concentrations. Naked Ad or Ad-CBA was then added in the presence or absence of the inhibitor for an additional 2 hours.
  • Ad or Ad-CBA was then removed, replaced with fresh medium and incubated for 24 hours.
  • GFP expression was observed by fluorescence microscopy and flow cytometry (Basic magnification: 100. Bars represent mean ⁇ standard error, * P ⁇ 0.05 and ** P ⁇ 0.01 vs untreated group).
  • FIG. 5 is a diagram showing the evaluation of Ad— CBA Enzosome escape.
  • U343 and MCF cells were preincubated with BF-al for 1 hour at 4 ° C. Naked Ad and Ad-CBA were added at M0I 20 or 200, respectively. 48 hours after transduction, cells were analyzed for GFP expression by flow cytometry. Data was performed in three independent replicates, with bars representing mean ⁇ standard error, * P ⁇ 0.05 and ** PO. 01 non-processing group.
  • Figure 6 shows the quantification of the VEGF and anti-cancer effects of RdB / shVEGF-CBA.
  • 6A treated U343 cells with PBS, dB / shVEGF or RdB / shVEGF-CBA complex at 1 and 10 M0I. 24 hours after infection with ELI SA, the VEGF concentration was measured.
  • 6B treated U343 and MCF7 cells with PBS, RdB / shVEGF, or RdB / shVEGF-CBA complex. After 48 hours, cell viability was assessed by MT assay. Untreated groups were set at 100%. Data is mean and standard deviation of three replicates. Bars represent mean ⁇ standard error 5, *** P ⁇ 0. 001, naked RdB / shVEGF-treatment group).
  • FIG. 7 is a diagram showing the strong anti-angiogenic and anti-tumor effect of dB / shVEGF-CBA.
  • FIG. 7A shows immunohistochemical staining of Matrigel plug sections with anti-CD31 antibody (base magnification: x200, bar is mean ⁇ *, *** P ⁇ 0.01, pH 7 per SE group). 4 to RdB / shVEGF or RdB / shVEGF- CBA).
  • Figure 7b is a diagram showing the anticancer therapeutic effect of the naked type Ad or Ad-CBA complex in U87 xenograft transplanted U87 glioblastoma of nude mice through intratumoral injection.
  • Subcutaneous tumors transplanted from U87 cells were treated with PBS, RdB / shVEGF (5 ⁇ 10 9 VP) or RdB / shVEGF-CBA (5 ⁇ 10 9 VP) complexes. Tumor volume was measured every 2 days after treatment as follows. Bars represent mean ⁇ standard error. , *** p ⁇ 0. 001, naked RdB / shVEGF-treatment group).
  • 8 is a diagram showing the evaluation of the immune response and hepatotoxicity of Ad-CBA.
  • 8A is a diagram showing the transduction of anti-inflammatory cytokine IL-6.
  • FIG. 9 is a diagram showing the anticancer treatment effect of the naked type Ad or Ad-CBA complex in U87 glioblastoma tumor xenografts in nude mice via intravenous (IV) injection.
  • Subcutaneous tumors transplanted from 1187 cells were treated with PBS, RdB / shVEGF (2 ⁇ 10 10 VP) or RdB / shVEGF-CBA (2 ⁇ 10 10 VP).
  • Arrows indicate administration of the therapeutic amount.
  • the experimental results are expressed as mean ⁇ RdB / shVEGF-treated group).
  • Figure 11 shows the results of measuring the average size distribution before and after the treatment of the Ad-CBA complex with DTT by DLS.
  • the cell lines used in the experiments of the present invention were added to Dulbecco's modified Eagle's medi ⁇ (DMEM; GIBCO-BRL, Grand Island, NY) by adding 10% fetal bovine serum (FBS) (GIBCO-BRL) at 37 ° C, 5% C0. 2 were incubated in a dry atmosphere.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medi ⁇
  • FBS fetal bovine serum
  • Human embryonic kidney cell lines (HEK293), human brain tumor cell lines (U343, U87) and human breast cancer tumor cell lines expressing the Ad El region were purchased from American Type Culture Collect ion (ATCC, Manassas, VA).
  • ATCC Manassas, VA
  • the efficiency of adenovirus gene transfer in vitro was examined using GFP express non-replicating Ad (dEl / GFP) (25).
  • RdB / shVEGF replicable Ad mutated at the E1A site and deleted at the E1B site was characterized by the previous dEl / GFP, RdB / shVEGF was propagated in HEK293 cells and purified by CsCl concentration gradient method (25 ). The number of viral particles (VP) was calculated where one absorbance unit at 0D 260 is equivalent to 10 12 VP / mL. Purified virus was stored until use at -80 ° C.
  • H sensitive polymers were synthesized via Michael reaction type polymerization (24).
  • the morphology of the naked Ad and Ad-CBA complexes was incubated for 30 minutes in PBS (7.4 and 6.0) at various pH conditions and analyzed by TEM (JEM-2000EX11, JEPL, Nikon Tokyo, Japan) at 200 kV.
  • U343 cells were plated at 12 ⁇ -plates at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / well. After 24 hours, cells were incubated for 1 hour at 4 ° C in FBS-FREE DMEM containing PBS or fiber protein (0.2 and 2 mg / mL).
  • U343 and MCF7 cell lines were: a) chlorpromazine (0.2 and 1 yM) (a clathrin—mediated endocytosis inhibitor), b) Genistein (1.25 ac 5 u M) (a caveol in-medi ated endocytosis inhibitor), c Pretreatment with NH 4 CI (0.5 and 1 M) (a macropinocytosi s inhibitor), or d) Baf i lomycin Al (a endosomal escape inhibitor) for 30 minutes at pH 6.0 and 7.4. Naked Ad or Ad—CBA complexes were added for an additional 2 hours in the presence or absence of the inhibitor. The cells were then washed with PBS and replaced with DMEM containing 5% PBS. Cells incubated for 48 hours were observed by fluorescence microscopy. GFP expression was quantified by flow cytometry and analyzed using CellQuest software. 9. VEGF Quantification
  • Human VEGF-A was quantified using human VEGF Quantikine Immunoassay kit (R & D Systems, Minnneapol s, MN) according to the manual. Standard curves were established using serial dilutions of conventional amounts of purified recombinant human VEGF-A.
  • cells were dispensed in medium containing 5% FBS in 6-well plates. When the cells reached a density of 50%, the cells were infected at 1 and 10 M0I with RdB / shVEGF and RdB / shVEGF-CBA (pH 7.4, 6.0) and the secreted VEGF was measured by ELISA kit. 10. MTT Assay
  • MCF7 cells (2 ⁇ 10 5 ) were aliquoted into 6-well plates and infected with RdB / shVEGF or RdB / shVEGF-CBA in pH 7.4 or pH 6.0 PBS. After 6 hours, treated cells were obtained after trypsin treatment and washed three times with 5 ml of HBSS complete solution. The cells were then mixed with 60 l of cold Matrigel and injected into the subcutaneous space above the lateral area of the nu / nu mouse of the male athymus with a 1 tnL syringe. The injected Matrigel rapidly formed a single, solid gel plug.
  • Matrigel Polg was fixed using a zinc fixative solution immersed in paraffin. These slices were treated with purified monoclonal rat anti-mouse CD31 (platelet / endothelial cell adhesion molecule ' 1; BD biosciences Pharmingen, San Diego, CA. city and state) and then with goat anti-rat-IgG-HRP. . All slides were counterstained with Meyer's hematoxylin.
  • mice with U87 tumors were tailed using PBS, RdB / shVEGF (2 ⁇ 10 10 VP / 200 ⁇ ) and RdB / shVEGF-CBA (2xi0 10 VP / 20 (hjL)).
  • Tumor growth was calculated by measuring the length (L) and width (W) of the tumor three times a week using a caliper, respectively, The tumor volume was calculated according to the following formula.
  • Tumor volume 0.523 LW 2
  • the average size distribution of the Ad-CBA complex was measured by DLS analyzer before and after treatment with DTT (5 mM) at 37 ° C. for 2 hours.
  • CBA pH sensitive and bioreducible polymers
  • FIG. 2 shows optical micrographs of the naked type Ad and Ad-CBA complexes at a CBA concentration of 0.5 mg / ml, pH 7.4 and pH 6. 0.
  • FIG. Naked Ad exhibits the icosahedron shape of the virus particles (FIG. 2A) as well as the characteristic nucleus structure.
  • FIG. 2 ⁇ we observed a tendency for Ad particles to be surrounded by “tens ile chunks” of CBA polymers. Induce recruitment. This observation suggests that cationic CBA polymers trap and connect other particles to negatively charged viruses (18, 27, 28).
  • Genistein treatment had no inhibitory effect on the uptake of the naked type Ad and Ad-CBA complexes at the same pH. This indicates that all three groups do not utilize carveolin-mediated endocytosis.
  • treatment of NH 4 C1 indicated that macropinocytosis is the major endocytosis pathway for Ad-CBA (pH 6.0).
  • the decrease in GFP expression of Ad-CBA (Ph 6.0) was statistically significant, whereas the decrease in naked Ad and Ad-CBA (pH 7.4) was not statistically significant (FIG. 4C).
  • Bafilomaycin (Bf-A) is a vacuole H + ATPase that prevents the acidification of Ad, which is an important factor for the escape of the virus from the endosome.
  • Ad-CBA vacuole H + ATPase that prevents the acidification of Ad, which is an important factor for the escape of the virus from the endosome.
  • Ad-CBA at ⁇ ) ⁇ 6.0 showed higher transduction efficiency than the naked Ad and Ad-CBA groups in CAR (+) and CAR (-) cell lines (pH 7.4).
  • the relatively normalized GFP expression levels of both cell lines were abrupt at the transduction levels of Ad-CBA (pH 6.0) when treated with Bf-A.
  • the present inventors attempted to verify the oncolytic effect of Ad (RdB / shVEGF- ⁇ CBA in both CAR (+) and CAR (-)
  • the inventors of the present invention are naked RdB / shVEGF, RdB / shVEGF-CBA (pH 7 .4) or U343 and f7 cells were infected with RdB / shVEGF_CBA (pH 6.0) for 48 h and each group was analyzed via a ⁇ assay. Anti-cancer to varying degrees at both pH in the U343 cell line due to the accelerated uptake of Activity was shown (FIG. 6B).
  • RdB / shVEGF-CBA (pH 6.0) still showed the most significant tumor killing effect compared to the naked RdB / shVEGF or RdB / shVEGF-CBA (pH 7.4) groups (p ⁇ 0.01). .
  • the present inventors attempted to confirm that the hi vitro therapeutic effect of RdB / shVEGF-CBA was also interpreted as in w> o based on the in vitro experimental results of the therapeutic effect of RdB / shVEGF—CBA.
  • the inventors evaluated the antiangiogenic effects of RdB / shVEGF-CBA through the Matrigel plug assay. MCF7 cells were infected with naked RdB / shVEGF or RdB / shVEGF-CBA treated with PBS at pH 7.4 or pH 6.0, mixed with cold matrigel and injected into the subcutaneous space of the lateral area. Matrigel plugs were dissected after 14 days and analyzed for vascular quantification of each group.
  • RdB / shVEGF and RdB / shVEGF-CBA showed minimal decrease in blood vessel levels, whereas the RdB / shVEGF-CBA (pH 6.0) group showed a sharply decreased angiogenesis. (FIG. 7A).
  • BALB / C mice were injected intravenously with 1 ⁇ 10 10 VP of PBS, naked type Ad, CBA or Ad-CBA and after 7 days mouse sera were obtained and analyzed for IL-6 ELISA.
  • naked Ad dramatically increased serum IL-6 levels compared to the PBS counterpart.
  • intravenous treatment of CBA showed serum IL-6 levels nearly identical to those of the PBS group, demonstrating the biocompatibility of CBA in systemic administration.
  • CBA encapsulation of Ad particles led to a significant decrease in serum IL-6 levels of Ad-CBA, confirming the ability of CBA to protect Ad particles from innate immunity.
  • Ad-CBA reduced serum IL-6 and ALT / AST levels through the immune evasion properties of CBA.
  • mice with U87 xenograft tumors were established to evaluate the anticancer effect of RdB / shVEGF-CBA in systemic administration and were treated over 27 days with PBS, naked Ad or Ad-CBA.
  • tumor growth was significantly inhibited in RdB / shVEGF—CBA compared to the RdB / shVEGF group (P ⁇ 0.01).
  • the antitumor activity of naked RdB / shVEGF was minimized due to the presence of an immune response that eliminates naked AD in systemic administration.
  • the mean tumor size was 2144 cm 167, 1777 cm 484, 752 cm 35 ⁇ 3 , respectively.
  • Tumor growth inhibition comparable to RdB / shVEGF and RdB / shVEGF—CBA groups was 17. 1% and 65..
  • the experimental results not only confirmed the immune evasion effect of CBA through the encapsulation of Ad particles, but also demonstrated the effectiveness of the anticancer activity of RdB / shVEGF-CBA, which revealed the therapeutic potential in the systemic administration of RdB / shVEGF-CBA. .
  • the colloidal stability of Ad—CBA nanocomposites in PBS buffer was measured at room temperature for 24 hours. As shown in FIG. 10, the average size of the Ad-CBA nanocomposites did not change significantly over 24 hours, meaning that the CBA cationic polymer-coated Ads showed good colloidal stability. ) was tested for reducibility of CBA. Particle sizes of uncoated Ad and Ad-CBA composites treated with or without ⁇ were measured by DLS analyzer. As shown in FIG. 11, the size of the uncoated Ad did not change by DTT treatment. However, the average size of PPCBA coated Ad complex was significantly decreased after DTT treatment, and approached the size of uncoated Ad.
  • Ad-CBA intracellular entry mechanism of Ad-CBA revealed that uptake of Ad-CBA through the macropinocytic pathway differs from naked Ad.
  • cytotoxic effect data showed that Ad-CBA polymers were significantly higher than naked Ad and CBA polymers because Ad-coated polymers had a strong binding affinity for cells and increased cellular uptake of the complex.
  • the therapeutic effect of Ad-CBA was not only increased in vitro, but also in vivo and intravenous in vivo models showed significantly increased therapeutic effects compared to naked ' Ad.
  • Oncolytic virotherapy molecular targets in tumor-select ive replication and carrier cell ⁇ mediated delivery of oncolytic viruses. Biochimica et biophysica acta. 2008, 1785: 217-31.

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Abstract

본 발명은 바이러스의 형질도입 효율성을 높임으로써 보다 효과적으로 종양 세포를 파괴할 수 있는 pH 민감성 및 생환원성 폴리머-바이러스 복합체, pH 민감성 및 생환원성 폴리머, 및 상기 폴리머-바이러스 복합체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
항암치료용 pH 민감성 및 생환원성 폴리머-바이러스 복합체 【기술분야】
본 발명은 대한민국 미래창조과학부의 지원 하에서 과제번호 2013050188 에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 (재)한국연구재단, 연구사업명은
"과학기술국제화사업 /국제공동연구사업 /글로벌연구실 (GRL) "
연구과제명은 "전이 암 진단 /치료용 지능형 암세포살상 유전자 약물 전달 시스템의 개발" ， 주관기관은 한양대학교 산학협력단, 연구기간은 2013. 09. 01 ~ 2014. 08. 31 이다 .
또한 본 발명은 미래창조과학부의 지원 하에서 과제번호 2013065203 에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 (재)한국연구재단, 연구사업명은 "이공분야 기초연구사업 /중견연구자지원사업 /도약연구" , 연구과제명은 "선택적 종양 제어를 위한 나노물질 하이브리드 유전자전달체 개발" ， 주관기관은 한양대학교 산학협력단 연구기간은 2013. 09. 01 ~ 2014. 8. 31이다. 본 특허출원은 2014 년 4 월 22 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10—2014-0048146 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명은 바이러스의 형질도입 효율성을 높임으로써 보다 효과적으로 종양 세포를 파괴할 수 있는 pH 민감성 및 생환원성 폴리머- 바이러스 복합체， pH 민감성 및 생환원성 폴리머, 및 상기 폴리머-바이러스 복합체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】 지난 50 년 동안， 종양살상 아데노바이러스 (Ad)는 그 다양한 생화학적 이점 때문에 암에 대한 치료학적 전략으로서 제시되고 있다 ( 1-4) . 이들 종양살상 아데노바이러스는， 첫 번째, 암-특이성; 정상세포에 존재하는 바이러스 복제에 대한 방어 기전 예컨대 내인성 종양 억제 단백질 (p53 , pRb , pl2ARF 등)은 암 세포에서 기능올 나타내지 않으며, 이는 종양에 대한 아데노바이러스의 선택성을 구축시킨다 (5) . 아데노바이러스는 용균성 생활사의 말기에 직접 숙주를 파괴시킬 뿐만 아니라， 또한 바이러스의 자손들의 확산하고， 이것은 또한 이웃한 종양 세포들의 감염시키고 이후 파괴한다 (6 , 7) . 아데바이러스는 종양 살상적 특성 뿐만 아니라, 유전자 치료에 있어서 가장 효과적인 바이러스성 백터 중의 하나이다. 아데노 바이러스는 분열 세포 및 비분열 세포에서 높은 유전자 전달 효율, 효과적인 핵산 진입 메커니즘 및 역가를 갖는다. 결과적으로 다양한 임상적 시도가 종양 유전자 치료를 위한 아데노바이러스의 국소투여를 이용하여 성공적으로 보고되었다 (9-11) .
그러나， 아데노바이러스는 바람직한 특징들에도 불구하고 전신 투여에서 최대 치료효과를 실현하는데 있어서 많은 도전적 과제들에 직면하고 있다. 아데노바이러 ^는 전신에 전달될 때 다음의 3 개의 주요한 면역학적 장벽을 통해서 혈관으로부터 제거된다: 1) 마크로파지 및 수지상세포에 의해 유도된 선천성 면역반웅， 2) 항아데노바이러스 항체의 무력화에 의한 적응 면역반응 , 3) 쿠퍼 (Kupper ) 세포에 의한 바이러스 입자의 모집. 3 가지 면역학적 장벽들은 급성 간 독성 및 간세포의 감염을 야기한다. 또한， 아데노바이러스는 혈소관 및 적혈구와 상호작용하고， 이것은 독성 및 기타 가능한 부작용을 유발한다. 아데노바이러스의 형질도입 효율은 면역학적 장벽에서 뿐만 아니라, 종양 세포에서 CAR(coxsacki e and adenovi rus receptor )의 발현 수준에 의해서 심각하게 제한된다. CAR 은 아데노바이러스가 표적 세포로 들어가는 일차적인 출입구로서 작용하는 46 kDa 의 내막투과성 단백질이다. 아데노바이러스의 펜톤 (penton) 염기는 Arg-Gly-Asp(RGD) 모티프를 이용하여， 특히 α νβ 3 및 ^ |3 5 와 상호작용한다. 이것은 엔도좀의 내부에서 바이러스의 내재화를 용이하게 하는 클라트린피복 소공의 형성을 유도한다 ( 12) . 아데노바이러스의 종양내 및 전신 투여의 치료 효과는 이와 같은 의존성 때문에 종양세포에서 CAR의 낮은 발현 수준에 의해 절충될 수 있다.
바이러스성 백터를 이용하는데 있어서 본질적인 생화학적 및 면역학적 장벽을 극복하기 위하여 고안된 한가지 전략은 비바이러스성 시스템을 갖는 바이러스 표면 변형을 통한 "똑똑한 ( smart ) " 아데노바이러스 나노복합체의 개발이다 ( 13-16) . 비바이러스성 시스템은 독특한 장점， 예컨대 낮은 면역원성， 효과적인 재생성 및 단순한 품질 제어 과정을 갖는다. 이러한 장점은 상술한 바이러스성 백터의 제한을 보상한다. 결과적으로， 다양한 아데노바이러스 나노복합체가 유해한 부작용을 최소화하는 반면에 표적화 효율성을 최소화하기 위해 개발되었다 ( 17， 18) . 예컨대， 폴리에틸렌글리콜 (PEG)는 간 흡수를 줄이고, 혈액 순환에서 이의 반감기를 늘이기 위하여 아데노바이러스와 결합시키는 주요한 폴리머 중의 하나이다. 또한 아데노바이러스의 폴리에틸렌글리콜화는 아데노바이러스에 대한 선천성 면역반응을 감소시킨다는 것 뿐만 아니라 숙주 항체가 아데노바이러스를 무력화시키는 것을 방해한다는 것을 입증하였다 ( 19) .
양이온성 폴리머를 이용한 아데노바이러스 캡슐화는 CAR 의존성 및 면역학적 장벽을 극복하는 또다른 효과적인 전략이다. 세포막 및 아데노바이러스는 모두 음전하를 지니고 있기 때문에, 폴리머의 양전하는 폴리머 및 바이러스 사이의 이온성 상호작용을 가능하게 할 뿐만 아니라， 정전기성 상호작용을 이용하여 바이러스의 숙주세포로의 진입을 용이하게 한다. 이 문제를 다루기 위해서， 폴리 (에틸이민) (PEI ) 및 폴리 (L- 리신) (PLL)은 아데노바이러스 및 DNA 전달의 형질전달 효율올 개선하기 위하여 사용되는 가장 표준적인 22 가지 양이온성 폴리머가 되었다. 그러나， 이 폴리머가 코팅된 아데노바이러스는 양전하에 의한 비특이적 흡수 때문에 종양 선택성이라는 관점에서는 여전히 불층분한 상태로 남아있다 (20， 21) . 또한, 이러한 양이온성 폴리머는 in-vivo 에서 비분해성이고 음전하를 지닌 세포막과 양전하를 갖는 폴리머의 강한 흡수 때문에 심각한 세포독성을 유발하고, 이러한 세포독성은 PEI 및 PLL 에 의하여 매개되는 세독성에 기인한다 (다중양이온의 in vitro 세포독성 테스트: 세포 생존능력 및 용혈ᅳ PLL의 영향 참조) . 최근에 유전자 및 약물의 종양 -표적 전달을 위한 종양 저산소증 반응성 폴리머의 나노입자 /나노물질의 발달에 대한 관심이 높아져 왔다. 더욱이， 저산소증은 두가지 전형적인 생물학적 반웅， 즉， 저산소증 유도성인자 -1 의 안정화 및 가속화된 생환원성 반응을 유도한다. 또한， 저산소증은 병에 걸린 상태이고， 이 상태의 조직은 산소의 공급을 빼앗기 항암치료의 화학요법 뿐만 유전자 치료에도 상당히 부정적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 저산소증 상태에 의해 유도되는 고비율의 호기성 및 혐기성 해당과정 때문에, 젖산은 외세포의 환경에서 축적되고， 이것은 결국 정상적인 생리 pH(7 .4)와 비교하여 산성이 된다. 따라서， 종양의 외세포성 pH 를 포함하는 종양 미세환경의 특이적 양상을 표적화하는 "똑똑한" 나노복합체는 종양 선택적이고 안전한 백터 시스템으로서 개발될 수 있다. 이와 관련하여， 수많은 자극 민감성 폴리머가 개발되었고 이들의 작업 메커니즘은 폴리머의 화학적 구조에 기초한다. 예컨대 산성 또는 염기성 그룹을 갖는 폴리^는 pH 용액과 반웅올 보인다. PH 반웅성 시스템을 개발하기 위하여， 산성 잔기， 예컨대 카복실산 또는 염기성 잔기, 예컨대 4 차 아민이 공중합체 내로 통합된다. 그러나, 생리학적으로 접근 가능한 pH 범위 (pH 4, 5 - 7.4)에 반응하는 시스템의 수는 아주 제한적이다. 최근에, pH 반응성 약물 전달 시스템은 일부 전하 전환 폴리머， 예컨대 폴리 (히스티딘) 및 폴리 (베타아미노에스터 )에 기초하여 보고되어 온 것이 소수이다 (22-24) . 이러한 연구에서， 본 발명자들은 폴리머 백본에 생환원성 이황화결합올 갖는 PH 민감성 폴리머 (mPEG-PiP-CBA) (CBA)를 고안하여 합성하였다. 나아가， 본 발명자들은 in vitro 에서 형질도입 효율 및 Ad- CBA의 세포 흡수를 연구하였다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
[발명의 내용] 【해결하고자 하는 과제】
본 발명자들은 폴리머 백본에 생환원성 이황화결합을 갖는 pH 민감성 폴리머 (mPEG-PiP-CBAKCBA)를 고안하여 합성하였고， 나아가 in vitro 에서 형질도입 효율 및 Ad-CBA 의 세포 흡수를 연구한 결과， pH 민감성 및 생환원성 (bioreducible) 폴리머-바이러스 복합체가 항암 치료의 우수한 효과가 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 pH 민감성 및 생환원성 폴리머가 바이러스 표면에 결합된 폴리머-바이러스 복합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 폴리머-바이러스 복합체를 포함하는 항암치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 면역반웅 회피성 부위 (escapable port ion from i mmune reactions), (i i ) 전하성 부위 (chargable port ion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위 (bioreducible portion)를 포함하는 pH 민감성 및 생환원성 (bioreducible) 폴리머를 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 폴리머-바이러스 복합체의 치료학적 유효량을 객체 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 항암치료 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다 .
【과제 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 (i) 면역반응 회피성 부위 (escapable port ion from immune reactions), (i i ) 전하성 부위 (chargable portion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위 (bioreducible port ion)를 포함하는 pH 민감성 및 생환원성 (bioreducible) 폴리머가 바이러스의 표면에 결합된 폴리머- 바이러스 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체에서 이용되는 폴리머는 3 가지 부위를 포함하도록 제조된다. 그리고 3 종의 부위는 각각 (i) 면역반웅 회피성 부위 (escapable port ion from immune reactions), ( i i ) 전하성 부위 (chargable port ion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위 (bioreducible portion)를 포함한다.
상기 면역반웅 회피성 부위는 폴리머가 결합하는 바이러스가 생체 내 면역반웅 (세포성 면역반응 및 체액성 면역반웅 포함)을 회피할 수 있도록 하는 작용을 한다. 상기 면역반웅 회피성 부위에 이용될 수 있는 물질은, 구체적으로 생체 내 면역반웅 (세포성 면역반응 및 체액성 면역반응 포함)을 회피할 수 있는 폴리머이고, 보다 구체적으로 PEG(polyethylene glycol), 폴리알킬렌 옥사이드 [예컨대, 폴리옥시에틸렌， 폴리옥시프로필렌 또는 이들의 공중합체 (예컨대， 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드- 폴리에틸렌 옥사이드 공중합체)]， 폴리페닐렌 옥사이드, PEG 와 폴리알킬렌 옥사이드의 . 공중합체， 폴리 (메톡시에틸 메타크릴에이트)， 폴리 (메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르， 텍스트란 또는 폴리비닐피를리돈이고， 보다 구체적으로, PEG, 폴리알킬렌 옥사이드 또는 PEG와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체이며 , 보다 더 구체적으로 PEG이다. 본 발명에서 이용되는 폴리머의 전하성 부위 (chargable port ion)는 생체 내 pH, 구체적으로 중성 pH 부근에서 상기 폴리머에 전하 (예컨대， 양전하)를 부여하여 바이러스의 표면 (예컨대， 아데노바이러스의 음전하성 표면)과 이온성 상호작용에 의해 결합할 수 있도록 한다. 전하성 부위는 상기 폴리머에 양전하 또는 음전하를 부여하는 물질을 포함하며， 예를 들어 음전하를 부여하는 경우에는 카복실레이트기， 양전하를 부여하는 경우에는 3차 아민기 또는 아미노기를 갖는 물질이， 전하성 부위에 이용될 수 있다.
이황화결합을 포함하는 생환원성 부위는 이황화결합을 포함하는 어떠한 물질도 포함한다. 생환원성 부위는 생체 내 산성 환경하에서 환원되어 이황화결합이 설프히드릴기로 전환되고 이에 따라 폴리머 구조의 파쇄가 이루어지고， 결국 결합되어 있는 바이러스 (naked virus)가 방출되도록 한다.
가장 구체적으로， 본 발명의 복합체에서 이용되는 폴리머는 다음 화학식 1로 표시된다:
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폴리머-바이러스 복합체에서 이용되는 바이러스는 어떠한 바이러스도 포함하며 , 구체적으로 유전자 치료제로 이용되는 바이러스를 포함하고, 예를 들어 다음과 같다:
i . 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기 , 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 백터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp 의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
현재 개발된 아데노바이러스 백터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편， E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 백터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thi隱 appaya, B. et al . , Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al . , Science, 245：1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 데코린 유전자는 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및 /또는 E1B 영역 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고 보다 바람직하게는 결실된 E3 영역에 삽입된다. 한편, 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및 /또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어， "결실 "은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.
또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에 , 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다 (Ghosh-Choudhury et al. , EMBO J. , 6:1733-1739(1987)). 따라서 , 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42 개의 상이한 혈청형 및 A-F 의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서， 서브그룹 C 에 속하는 아데노바이러스 타입 5 가 본 발명의 아데노바이러스 백터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며， 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서， 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다. ϋ . 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고， 대량의 외래 유전 물질올 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 백터로서 많이 이용되고 있다 .
레트로바이러스 백터를 구축하기 위하여， 데코린 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여， gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al. , Cell, 33： 153-159(1983)) . 데코린 유전자， 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열， LTR 및 Ψ서열올 포.함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면， Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산올 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고， 바이러스는 배지로 배줄된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors , " In: Vectors-' A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2 세대 레트로바이러스 백터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다.
Kasahara et al . Science, 266: 1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스 (腿 LV)의 변이체를 제조하였고， 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메락 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2 세대 레트로바이러스 백터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.
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iii. AAV 백터
아데노 -관련 바이러스 (MV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고， 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 백터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 MV 에 대한 연구는 LaFace et al , Viology, 162:483486(1988), Zhou et al . , Exp. Hematol . (NY), 21： 928- 933(1993), Walsh et al， J. Clin. Invest. , 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2 :29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에， AAV 백터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.
전형적으로, MV 바이러스는 두 개의 MV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열 (데코린 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al .， J. Virol. , 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al . , J. Virol. , 63： 3822- 3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 MV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al .， J. Virol. , 65： 2936-2945 ( 1991))를 동시형질전환시켜 제조된다. iv. 다른 바이러스 백터
다른 바이러스 백터들도 본 발명에서 이용될 수 있다. 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al . , Human Gene Therapy 10:649-657(1999)； Ridgeway , "Mammal i an expression vectors , " In: Vectors ·' A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt , eds . Stoneham: Butterworth, 467-492(1988)； Baichvval and Sugden , "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al . , Gene, 68： 1-10(1988)) , 렌티바이러스 (Wang G. et al . , J. Clin. Invest. 104(11) :R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R.， et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 1411-1415(1995))로부터 유래된 백터들도, 본 발명에서 이용될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 바이러스는 다음과 같은 치료 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다:
본 명세서에서 용어 "항원성 유전자 (antigenic gene)"는 표적 세포내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 PSA(prostate specific ant i gen) , AFP( α-feto protein) , p53 (WO 94/02167)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해， 상기 항원성 유전자를 MHC 제 I 형 항원에 결합시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어 "세포독성 유전자 (cytotoxic gene)"는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소 (exotoxin), 리신 독소， 디프테리아 독소 등올 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.
본 명세서에서 용어 "세포증식 억제 유전자 (cytostatic gene)"는 세포내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자， 사이클린-종속성 키나아제 억제인자를 코딩하는 유전자 (예를 들면, pl6, pl5, pl8 및 pl9), 성장 중지 특이성 호메오박스 (growth arrest specific homeobox , GAX) 유전자 (W0 97/16459 및 TO 96/30385) 등이 있으며， 이에 한정되는 것은 아니다.
또한， 각종 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 많은 치료 유전자도 본 발명의 시스템에 의해 운반된다. 예를 들면， 사이토카인 (예， 인터페론-알파， -베타, -델타 및 -감마)， 인터루킨 (예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-19 및 IL-20) 및 콜로니 자극 인자 (예， GM- CSF 및 G-CSF)를 암호화하는 유전자, 케모카인 그룹 (단핵구 화학 주성단백질 1 (MCP-1), 단핵구 화학 주성 단백질 2 (MCP-2), 단핵구 화학 주성단백질 3(MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4(MCP-4), 대식구 염증성 단백질 Ια(ΜΙΡ-Ια), 대식구 염증성 단백질 Ιβ(ΜΙΡ-Ιβ), 대식구 염증성 단백질 Ιγ(ΜΙΡ-Ιγ), 대식구 염증성 단백질 3α(ΜΙΡ-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(ΜΙΡ-3β), 케모카인 (ELC), 대식구 염증성 단백질 4(ΜΙΡ-4), 대식구 염증성 단백질 5(MIP-5), LD78i3， RANTES, SIS-엡실론 (ρ500) , 흉선 활성화-조절되는 케모카인 (TARC；)， 에오탁신， 1-309， 인간 단백질 HCC- 1/NCC-2, 인간 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등)이 포함된다. 또한， 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA) 또는 우로키나제를 발현하는 유전자 및 지속적인 혈전 효과를 제공하여 콜레스테를 과다혈증을 예방하는 LAL 생성 유전자가 포함된다. 또한, 낭성 섬유증， 아데노신 데아미나제 결핍증 및 AIDS 와 같은 바이러스， 악성 및 염증 질환 및 상태를 치료하기 위한 많은 폴리뉴클레오타이드가 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 "친 -세포사멸 유전자 (pro-apoptotic gene)' '는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다ᅳ 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3- 11.6K (Ad2 및 Ad5 에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad 에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, Fas 리간드, TNF -， TRAIL, P53 경로 유전자 및 카스파아제를 코딩하는 유전자가 포함된다.
본 발명의 명세서에서 용어 "항-신생혈관생성 유전자 (anti- angiogenic gene)"는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는， 안지오스타틴， Tie 2 (PNAS, 1998ᅳ 95,8795-800)와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 ) 상술한 본 발명의 폴리머-바이러스 복합체의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 폴리머-바이러스 복합체를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다.
상술한 본 발명의 폴리머-바이러스 복합체는 다양한 질환의 치료에 이용될 수 있지만， 특히 항암 치료에 유용하다 .
본 발명의 조성물에 포함되는 폴리머-바이러스 복합체는 상술한 바와 같이， 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암， 폐암， 유방암， 난소암, 간암, 기관지암. 비인두암， 후두암， 췌장암， 방광암， 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어
"치료 "는 ( i ) 종양 세포 형성의 예방; ( H ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 ( m ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다 . 따라서 , 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량 "은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스， 덱스트로스， 수크로스, 솔비를， 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슴 , 알기네이트 , 젤라틴 , 규산 칼슘， 미세결정성 샐를로스， 폴리비닐피롤리돈， 셀롤로스ᅳ 물， 시럽， 메틸 샐를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트, 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고， 예컨대 정맥내 투여， 복강내 투여， 근육내 투여， 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고， 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고， 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성， 질병 증상의 정도 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며， 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 I X 105 - 1 X 1015 pfu/i 의 폴리머-바이러스 복합체를 포함하며, 통상적으로 1 X 1010 pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제， 분말제, 과립제， 정제 또는 캅샐제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며， 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라린 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplat in)， 프로카르바진 (procarbazine), 데클로러)타민 (mechlorethamine) , 시클로포스파미드 (cyclophosphamide) , 이포스파미드 (ifosf amide), 멜팔란 (melphalan)， 클로라부실
(chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin)， 다우노루비신 (daunorubi cin) , 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (pi i comycin)， 口 1토마이신 (mitomycin) , 에토포시드 (etoposide) , 탁목시펜 (tamoxifen) , 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5- fluorouracil), 빈크리스틴 (vincr i st in)， 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 Y -선 조사 등이다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 면역반웅 회피성 부위 (escapable port ion from immune reactions), ( i i ) 전하성 부위 (chargable portion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위 (bioreducible port ion)를 포함하는 pH 민감성 및 생환원성 (bioreducible) 폴리머가 바이러스의 표면에 결합될 수 있는 폴리머를 제공한다.
본 발명의 바이러스의 표면에 결합될 수 있는 폴리머는 다음과 같이 화학식 1 으로 정의되며, 상술한 폴리머-바이러스 복합체의 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
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본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 폴리머- 바이러스 복합체의 치료학적 유효량을 객체 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 항암치료 방법을 제공한다.
본 발명인 항암치료 방법은 상술한 본 발명의 다른 양태인 폴리머- 바이러스 복합체 또는 이를 이용한 항암치료용 조성물을 이용하는 방법에 해당하므로, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항암치료방법에서 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암， 비인두암, 후두암 췌장암, 방광암， 결장암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이다. 【발명의 효과】
이상에서 상세히 설명한 바와 같이. 본 발명은 PH 민감성 및 생환원성 폴리머-바이러스 복합체， pH 민감성 및 생환원성 폴리머, 및 상기 폴리머-복합체를 포함하는 항암치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 폴리머-바이러스 복합체는 조직 또는 종양 세포내로의 흡수 효율 및 면역 회피 메커니즘을 통해서， 아데노바이러스의 형질도입 효율을 높임으로써 보다 효과적으로 종양 세포를 파괴할 수 있는 항암치료용 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 Ad-CBA 구조 및 특성 규명의 도식적 설명을 나타낸 도이다. 도 la 는 pH 및 생환원성 폴리머 (CBA)의 합성의 도식적 설명올 나타낸 도이다.
도 lb 는 CBA 폴리머린 D20 에서 CBA 폴리머의 ¾NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 lc 는 종양 위치에서 Ad/CBA 복합체 축적 및 미세환경 하에서 폴리머로부터 Ad 방출 의 가설을 나타낸 도이다.
도 Id 는 MCF-7 세포에서 CBA 폴리머의 세포 독성을 MTT 어세이에 의해서 평가한 도이다.
도 le 는 Ad 로 코팅된 CBA 의 제타 전위값 (niV)을 다양한 농도， 1 mL PBS 에서 1 X 1010 VP 및 상온 조건의 CBA 풀리머에서 측정한 도이다 (CBA 폴리머 농도를 나타내었다. 데이터는 3 번 반복하여 평균 土 SD 로 나타내었다) .
도 2 는 나출형 Ad (도 2A) 및 Ad-CBA 복합체의 TEM 이미지이다. Ad 및 Ad-CBA 를 pH 7.4(도 2B) 및 pH 6.0(도 2C)에서 PBS 을 이용하여 30 분 동안 배양하였다.
도 3 은 Ad-CBA 복합체 형성을 위한 최적 조건이 Ad-CBA 복합체의 pH 의존성 유전자 전이 효율성 및 젤 지연 효과에 의해 결정된다는 것을 나타낸 도이다. 도 3A 는 다양한 농도의 CBA 에서 Ad-CBA 복합체로 처리된 세포의 형광 이미지를 나타낸 도이다. MOI 20 J343) (도 3A) 및 M0I 200(도 3B)에서 나출형 Ad 또는 Ad/CBA 복합체 (0.05， 0. 1， 0.25 및 0.5 mg/mL)로 형질도입된 U343 및 MCF그 mot 세포를 나타낸 도이다. 다양한 농도의 CBA 폴리을 이용하여 Ad-CBA 복합체의 젤지연 어세이를 나타내었다.
도 4 는 섬유 단백질을 이용한 경쟁 어세이를 나타낸 도이다. 도
4a 는 CAR 에 특이적인 섬유 단백질 (0.2， 2 y g/ml )의 존재 및 부재 하에서 Ad 및 Ad-CBA를 이용하여 U343 세포로의 형질도입을 나타낸 도이다. 나출형 Ad 및 Ad-CBA 는 MOI 20 에서 첨가되었다. 형질도입한지 48 시간 후에 세포를 GFP 발현을 위해 유세포분석에 의해 분석하였다. 데이터는 3 번의 독립적인 반박실험의 대푯값이다 (평균 士 표준오차， ***P < 0. 001 대 비처리 그룹) 도 4b는 지시된 농도의 나출형 Ad 또는 Ad-CBA 복합체의 세포 흡수 메커니즘을 확인하기 위하예 세포를 지시된 농도에서 30 분 동안 전처리하였다. 이후 나출형 Ad 또는 Ad-CBA 를 추가적인 2 시간 동안 억제제의 존재 또는 부재 하에서 첨가하였다. Ad 또는 Ad-CBA 를 이후 제거하였고, 신선한 배지로 교체하였고 24 시간 동안 배양하였다. GFP 발현량을 형광 현미경 및 유세포분석기에 의해 관찰하였다 (기본 배율: 100 . 막대는 평균 土 표준오차를 나타내고， *P < 0 .05 및 ** P<0. 01 대 비처리 그룹) .
도 5 는 Ad— CBA 엔조좀 탈출성의 평가를 나타낸 도이다. U343 및 MCF 세포를 BF-al 으로 4 °C에서 1 시간 동안 사전 배양하였다. 나출형 Ad 및 Ad- CBA 를 각각 M0I 20 또는 200 에서 첨가하였다. 형질도입한지 48 시간 후， 세포를 유세포분석기에 의해 GFP 발현에 대해서 분석하였다. 데이터는 3 번의 독립적인 반복실험에서 수행되었고， 막대는 평균 土 표준오차를 나타내고， *P < 0 .05 및 ** PO. 01대 비처리 그룹이다.
도 6은 RdB/shVEGF-CBA의 VEGF 및 항암살상 효과의 정량화를 나타낸 도이다. 도 6a 는 U343 세포를 1 및 10 M0I 에서 PBS , dB/shVEGF 또는 RdB/shVEGF-CBA 복합체로 처리하였다. ELI SA에 의해 감염시키고 24 시간 후 VEGF 농도를 배양 상등액을 측정한 것을 나타낸 도이다. 도 6b 는 U343 및 MCF7 세포를 PBS , RdB/shVEGF , 또는 RdB/shVEGF-CBA 복합체로 처리하였다. 48 시간 후, 세포 생존능력을 MT 어세이에 의해 평가하였다. 비처리된 그룹을 100%에서 세팅하였다. 데이터는 3 번 반복된 실험의 평균 및 표준편차이다. 막대는 평균 土 표준오차를 의미한다 5, ***P<0. 001, 나출형 RdB/shVEGF-처리 그룹) .
도 7 은 dB/shVEGF-CBA 의 강한 항혈관신생 효과 및 항종양 효과를 나타낸 도이다. 도 7a 는 항— CD31 항체로 마트리젤 플러그 절편의 면역 조직화학적 착색법으로 나타낸 도이다 (기본 배율: x200 , 막대는 평균 土 SE 그룹 당 혈관 *， ***P < 0 .001 , pH 7 .4 에서 RdB/shVEGF 또는 RdB/shVEGF- CBA) . 도 7b 는 종양내 주입을 통해서 누드 마우스의 U87교모세포종이 이종 이식된 U87 에서 나출형 Ad 또는 Ad-CBA 복합체의 항암 치료 효과를 나타낸 도이다. U87 세포로부터 이식된 피하 종양을 PBS , RdB/shVEGF(5 x 109 VP) 또는 RdB/shVEGF-CBA(5 x 109 VP) 복합체로 처리하였다. 종양 부피를 다음과 같이 처리후 2 일 마다 측정하였다. 막대는 평균 土 표준오차를 나타낸다 0 ?. , ***p<0. 001, 나출형 RdB/shVEGF-처리 그룹) .
도 8은 Ad-CBA의 면역 반응 및 간세포독성의 평가를 나타낸 도이다. 도 8a 는 항염증성 사이토카인 IL-6 의 형질도입을 나타낸 도이다. 1 X 1010 VP 의 나출형 Ad 및 Ad-CBA를 마우스내로 정맥 주사한지 6 시간 후， 혈청을 수득하였고 IL-6 수준을 ELISA 에 의하여 측정한 도이다. 도 8b 는 Ad 또는 Ad-CBA 의 1 X 1010 VP 의 정맥 투여 후 ALT 및 AST 혈청을 측정한 도이다 (데이터는 각각의 실험 조건당 평균 士 표준오차 및 n=3을 나타낸다. **P < 0. 01 , 나출형 Ad-처리 그룹) .
도 9 는 정맥 ( IV) 주사를 통해 누드 마이스에서의 U87 교아세포종 종양 이종이식에서 나출형 Ad 또는 Ad-CBA 복합체의 항암 치료 효과를 나타낸 도이다. 1187 세포로부터 이식된 피하 종양을 PBS , RdB/shVEGF (2 x 1010VP) 또는 RdB/shVEGF-CBA (2 x 1010VP)로 처리하였다. 화살표는 치료량의 투여를 나타낸다. 실험결과는 평균 土 표준오차로 나타내었다 ί ?Λ RdB/shVEGF-처리 그룹) .
도 10은 CBA로 코팅되거나 코팅되지 않은 Ad의 안정성 시험 결과를 나타낸다. 측정 시간 간격을 달리하여 입자의 평균 사이즈를 측정한 결과를 나타낸다.
도 11은 Ad-CBA 복합체를 DTT로 처리하기 전 /후의 평균 크기 분포를 DLS로 측정한 결과를 나타낸다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험 재료 및 실험 방법
1. 아데노바이러스 (Ad)의 세포 배양 및 세포 제너레이션 (generation)
본 발명의 실험에 사용된 세포주들을 Dulbecco's modified Eagle's medi围 (DMEM; GIBCO-BRL, Grand Island, NY)에 10% fetal bovine serum(FBS) (GIBCO-BRL)를 첨가하여 37°C, 5% C02 건조 대기 상태에서 배양하였다. Ad El 지역을 발현하는 인간 배아 신장 세포주 (HEK293), 인간 뇌종양 세포주 (U343,U87) 및 인간 유방암 종양 세포주를 American Type Culture Col lect ion(ATCC, Manassas, VA)에서 구입하였다. in vitro 에서 아데노바이러스 유전자 전달 효율성을 GFP 발현 복제 불능 Ad(dEl/GFP)을 이용하여 검사하였다 (25). E1A 부위에서 돌연변이되고 E1B 부위에서 결실된 복제 가능 Ad (RdB/shVEGF)의 제너레이션을 이전의 dEl/GFP 로 특성규명하였고， RdB/shVEGF를 HEK293 세포에서 증식시켰고 CsCl 농도 구배 방법에 의하여 정제하였다 (25). 바이러스성 입자 (VP)의 수를 계산하였고 여기서 0D 260 에서의 1 흡광도 단위는 1012 VP/mL 과 동등하다. 정제된 바이러스를 -80°C에서 사용할 때까지 저장하였다.
2. pH-민감성 및 생환원성 폴리머 (CBA)의 합성
H 민감성 폴리머를 Michael 반응 종류 폴리머화를 통해서 합성하였다 (24). 요약하면， mPEG-아크릴레이트 (Mn=2.0kDa, 0.10 隱01)(^ 3쒜(11^(±， St. Louis, MO, USA 및 N, Ν'- cystaminebi sacrylamided .0 讓 ol) (PolySciences Inc , Warrington, PA)를 메탄올 (5.0 mL)에 용해시켰다. 이후 피페라진 (1.0 誦 ol) (Sigma-Aldr i ch, St. Louis, M0, USA)을 첨가한 후， 반응 흔합물을 50°C에서 질소 하의 암실 조건에서 48 시간 동안 교반하였다. 반응물을 상온까지 식힌 후， 폴리머를 디에틸에테르에서 침전시켰다. 침전된 폴리머를 2 일 동안 상은, 진공 상태에서 건조하였다. 마지막으로, 폴리머를 ¾ NMR(Mercury plus 300 MHz, Varian inc. USA)에 의하여 특성규명하였고， -0C¾ 및 -NCH2C¾ 양성자 공명 피크 적분값에 기초하여 계산한 분자량은 4.0 kDa이다.
3. 나출형 아데노바이러스 (naked Ad) 및 Ad/CBA복합체의 특성 규명 Ad-CBA 복합체의 평균 크기 및 제타 전위를 Zetasizer 3000HS(Malvern Instruments , Inc., Worcestershire, UK) with a He-Ne laser beam (633 nm, fixed scattering angle of 90° )을 이용하여 25°C에서 측정하였다. CBA 폴리머와 Ad 의 정전기성 상호작용을 CBA-용량 의존적 방법으로 제조하였다ᅳ 요약하면， 다양한 농도의 폴리머를 Ad(2 X 1010 VP)와 흔합하였고， 피펫팁을 이용하여 부드럽게 저어주고 상은에서 30 분 동안 배양하였다. 각각의 비율에서 Ad-CBA 복합체의 형성 후， PBS(pH 7.4)를 최종 부피가 1.0 mL 이 되도록 첨가하였다. 크기 및 제타 전위값은 3번의 측정치의 평균값으로 나타내었다.
4. 투과전자현미경 (TEM) 이미지 분석
나출형 Ad 및 Ad-CBA 복합체의 형태를 다양한 pH 조건의 PBS(7.4 및 6.0)에서 30 분 동안 배양한 후 200 kV에서 TEM(JEM-2000EX11, JEPL, Nikon Tokyo, Japan)으로 분석하였다.
5. Ad-CBA 형질도입 효율성 어세이
다양한 CBA 농도에서 각각의 Ad-CBA 복합체의 형질도입 효율성을 (CAR)-양성 (U343) 및 CAR-음성 (MCF7) 세포에서 FACS 분석에 의한 GFP 발현량으로 측정하였다. 각각의 세포주를 Ad 형질도입 전에 12 웰- 플레이트에서 1 X 105 세포 /웰의 밀도로 분주하였다. 세포를 나출형 Ad 또는 Ad-CBA 복합체를 이용하여 100 J343), 500(MCF7) M0I 에서 pH 7.4 및 pH 6.0 의 PBS 에서 3Q 분 동안 형질도입하였다. 37°C에서 48 시간 동안 형질도입한 후， 세포를 형광현미경으로 관찰하였다 (Olympus 1X81； Olympus Optical , Tokyo , Japan) . 또한， 세포를 Cel 1 Quest sof tware(Becton- Dickinson) FACScan analyzer (Becton-Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 관찰하였다; 10000 번의 데이터를 추가 분석을 위하여 수집하였고 상대적인 형광 신호강도값을 나타내었다. 데이터는 3 번 실험의 평균 및 표준편차를 나타낸다.
6. 젤 -지연 어세이 (Gel-retardation assay) Ad-CBA 복합체의 캡슐화 능력을 평가하기 위하여， 다양한 농도 (0.01 ~ 0.5 mg/ml)의 Ad 로 코팅된 CBA 를 제조하였다. 다양한 농도의 Ad-CBA 복합체를 EtBr 을 포함하는 IX TAE 완충액 (10.0 mM Tris/HCl, 1%(ν/ν) 아세트산 및 1.0 mM EDTA) 0.8% (w/v) 아가로오스젤에서 충진하였고 동일한 완충액에서 30 분 동안 80V 에서 전기영동을 수행하였다. 마지막으로， 바이러스 DNA 를 ChemiDoc gel document at ion system(Syngene, Cambridge, UK)을 이용하여 가시화하였다.
7. 아데노바이러스의 섬유 단백질을 이용한 경쟁 어세이
U343 세포를 12 웰—플레이트에서 1 X 105 세포 /웰의 농도로 플레이팅을 하였다. 24 시간 후， 세포를 PBS 또는 섬유 단백질 (0.2 and 2 mg/mL )이 포함된 FBS- f r ee DMEM에서 4 °C에서 1시간 동안 배양하였다 .
나출형 Ad 또는 Ad-CBA 복합체를 20 M0I 에서 배지에 첨가하였고 37°C에서 1 시간 동안 배양하였다. 이후， 배지를 차가운 PBS 를 이용하여 세척하였고 5% FBS을 포함하는 DMEM로 교체하였다. 24시간 동안 배양한 후 세포를 형광 현미경에 의해 관찰하였다. GFP 발현을 유세포분석기 (flow cytometry)에 의해 정량화하였고 CellQuest software 를 이용하여 분석하였다. 8. Ad-CBA복합체의 세포성 흡수 메커니즘 /엔도좀 탈출 (endosomal escape)
U343 및 MCF7 세포주를 a) 클로프로마진 (chlorpromazine)(0.2 및 1 yM)(a clathrin— mediated endocytosis inhibitor), b) Genistein(1.25 ac 5 u M) (a caveol in-medi ated endocytosis inhibitor) , c) NH4CI (0.5 및 1 M) (a macropinocytosi s inhibitor) , or d) Baf i lomycin Al(a endosomal escape inhibitor)를 이용하여 pH 6.0 및 7.4 에서 30 분 동안 전처리를 하였다. 나출형 Ad 또는 Ad— CBA 복합체를 추가적인 2 시간 동안 억제제의 존재 또는 부재 하에서 첨가하였다. 이후, 세포를 PBS 로 세척하였고 5% PBS 를 포함하는 DMEM 으로 교체하였다. 48 시간 동안 배양한 세포를 형광현미경으로 관찰하였다. GFP 발현을 유세포분석기에 의해 정량화하였고 CellQuest software를 이용하여 분석하였다. 9. VEGF 정량화
인간 VEGF-A 를 매뉴얼에 따라 인간 VEGF Quant ikine Immunoassay ki t (R&D Systems , Mi nneapol i s , MN)를 이용하여 정량화하였다. 통상의 양의 정제된 재조합 인간 VEGF-A 의 연속적 회석를 이용하여 표준 곡선을 확립하였다. 요약하면， 세포를 6-웰 플레이트에서 5% FBS 를 포함하는 배지에 분주하였다. 세포가 50%의 밀집도에 도달할 때, 세포를 RdB/shVEGF 및 RdB/shVEGF-CBA(pH 7.4， 6.0)로 1 및 10 M0I 에서 감염시켰고， 분비된 VEGF를 ELISA 키트에 의해 측정하였다. 10. MTT어세이
pH 7.4 및 pH 6.0에서 RdB/shVEGF 또는 RdB/shVEGF-CBA의 종양 세포 살상 효과를 측정하기 위하여 , 50% 밀집도까지 배양된 U343 및 MCF7 세포를 M0I ( (U343 세포 - 20 M0I， MCF7-mot - 200 M0I ) )에서 나출형 RdB/shVEGF 또는 RdB/shVEGF-CBA 를 이용하여 감염시켰고 37 °C에서 배양하였다. 감염시킨지 2 일 후에 250 의 3-(4， 5-디메틸싸이아졸 -2-일) -2 , 5-디페닐- 테트라졸리움 브로마이드 (MTT; Sigma-Aldr i ch , St . Loui s , MO, USA)를 PBS 에서 2 mg/mL 의 속도로 각각의 웰에 첨가하였고， 37°C에서 4 시간 동안 배양한 후， 그 상등엑을 버리고 침전물을 l . OmL DMS0에서 용해시켰다. 이후 플레이트를 540 nm 의 마이크로플레이트 리더 상에서 해독하였다. 비감염된 세포군에서 생존 세포의 수를 음성 대조군과 유사하게 분석하였다.
11. Ex vivo마트리젤 플러그 어세이 (matr igel plug assay)
MCF7 세포 (2 x 105)를 6-웰 플레이트에 분주하고， pH 7.4 또는 pH 6.0 PBS 에서 RdB/shVEGF 또는 RdB/shVEGF-CBA 를 이용하여 감염시켰다. 6 시간 후, 처리된 세포를 트립신 처리 후 수득하였고， 5ml 의 HBSS 완층액을 이용하여 세 번 세척하였다. 이후 세포를 60( i L 의 차가운 마트리젤과 흔합하였고 1 tnL 주사기로 수컷 무흉선의 nu/nu 마우스의 측면 지역 위의 피하 공간으로 주입하였다. 주입된 마트리젤은 빠르게 단일， 고체젤 플러그를 형성하였다. 14 일 후, 동물을 희생시켜서 각각의 마우스 피부를 끌어 을려서 마트리젤 플러그에 노출시켰다. 그리고 이 마트리젤 플러그는 손상되지 않은 상태로 두었다. 혈관 형성을 정량화하기 위해서, 마트리젤 폴러그를 파라핀에 밖힌 아연 고정 용액을 이용하여 고정하였다. 이 박편들을 정제된 모노클로날 랫트 항마우스 CD31(platelet/endothelial cell adhesion molecule' 1； BD biosciences Pharmingen, San Diego, CA. city and state)로 처리하였고， 이후 염소 항래트 -IgG-HRP 로 처리하였다. 모든 슬라이드를 Meyer의 헤마톡실린으로 대비 염색을 하였다.
12. 염증성 사이토카인의 측정 및 독성 연구
염증성 면역 반웅 및 독성을 PBS, Ad(2 X 1010 VP) 및 Ad— CBA(2xl010 VP)의 전신 주입 후에 검사하였다. 주입한지 6시간 후, 혈청올 안와 후방의 혈액을 수득하였고 IL-6(DY406; R&D System) 수준을 정량화하였다. 주입한지 3 일 후, 마우스를 희생시켜서 혈청을 수득하였다. 아스파테이트 아미노트랜스퍼레이즈 (AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 (ALT) 수준을 측정하였다. 독성에 대한 측정은 Neodin Corporation (Seoul , Korea)에 의해 수행되었다.
13. 항암 효과의 평가
Ad(RdB/shVEGF)-CBA 의 항암 효과를 평가하기 위하여， U87 종양 이종 이식물을 1 X 107 의 세포를 6 - 8 주령의 암컷 무흉선 누드 마우스 (Charles River Korea Inc)의 복부내로 주입함으로써 피하지방으로 확립하였다. 한번 종양 크기가 100 - 120 tnm3의 부피에 도달하면， 마우스를 3 개의 그룹 (PBS, RdB/shVEGF, and RdB/shVEGF-CBA)으로 랜덤화하였고 30 uL PBS or 5 x 109VPof RdB/shVEGFᅳ or RdB/shVEGF-CBA 를 이용하여 종양내로 하루 걸러 한번 주입하였다. 전신 투여의 항암 효과를 평가하기 위해， U87 종양을 지닌 마우스를 PBS, RdB/shVEGF (2 x 1010 VP/200 μί) 및 RdB/shVEGF-CBA(2xi010VP/20(hjL)를 이용하여 꼬리 정맥에 각각 주입하였다. 종양의 길이 (L) 및 넓이 (W)를 일주일에 3 번 칼리퍼를 이용하여 측정하여 종양 성장을 계산하였다. 종양 부피를 다음 수식에 따라 계산하였다.
수식 ： 종양 부피 = 0.523 LW2
14. 안정성 및 DTT처리 효과 시험 폴리머-코팅된 Ad 복합체의 평균 사이즈를 DLS 분석기에 의해 시험하였다. 실온에서 30 분간 PBS 내에서 CBA로 Ad(dEl/GFP)를 코팅한 후， 입자 크기 분포를 1 시간에서 24 시간까지 미리 정한 시간 간격으로 측정하였다. 측정된 사이즈는 3회의 평균값으로 나타내었다.
또한, 37°C에서 2 시간 동안 DTT(5 mM)로 처리하기 전과 후에， DLS 분석기에 의해 Ad-CBA 복합체의 평균 사이즈 분포를 측정하였다.
15. 통계 분석
데이터를 평균 士 평균 표준오차로 표현하였다. Mann-Whi tney 테스트 (SPSS 18.0 software ; SPSS, Chi cago , IL)를 이용하여， 통계 비교를 위해 수행하였다 (SPSS 18.0 sof tware ; SPSS , Chi cago , IL) . 통계적으로 유의한 편차값은 0.05 이하이다. 실험 결과
1. 생환원성 폴리머 및 Ad-CBA복합체의 합성 및 특성 분성
pH 민감성 및 생환원성 폴리머 (CBA)의 합성은 도 1A 에 설명하였다. 이 폴리머 (CBA)는 Mi chael 형태 첨가 폴리머화를 통해서 합성되었다 (24) . 이후 mPEG-아크릴레이트 및 피페라진을 갖는 N , Ν' - 시스타민비스아크릴아마이드의 반웅은 mPEG-ZrPip-CBA(CBA)의 형성을 유도하였다. CBA 의 화학 구조는 ¾ NMR(300 MHz , CDCI3)에 의해 그것의 전형적인 공명 피크인 2.3 - 2.8 ppm 에서 확인되었고， 이것은 mPEG 의 특징적 피크에 따라 각각 -N(CH2-CH2) , 피페라진의 메틸렌 양이온， mPEG 의 특징적인 피크에 따른 CBA의 -S-C¾-CH2-NH-C0-양성자에 상웅한다 (도 1B) . 구조적 도표 (도 1C)에서 나타낸 바와 같이， 양전하성 CBA 폴리머는 이온성 상호작용을 통해서 음전하성 Ad 의 복합체화 및 세포성 분해 메커니즘을 가능하게 한다ᅳ 또한， 폴리머에 존재하는 이황화 결합은 효소, 예컨대 글루타타이온 및 타이오리독신 리덕테이즈 ( thioredoxin reductase)를 환원시킴으로써 폴리머의 세포성 분해를 허용한다 (27) . CBA 폴리머의 세포독성 프로파일을 MTT 분석에 의하여 평가하였다. 도 1D 는 고농도에서 조차 CBA 가 유의한 독성을 나타내지 못한다는 것을 보여준다. 세포 생존능력은 100 u g/mL 미만에서 95% 이상이었다. 정전기성 인력을 통해서 Ad-CBA 복합체를 발생시킨 후， CBA 의 농도가 증가함에 따라 복합체의 평균 크기 및 표면 전하는 동적광산란법 (DLS) 및 제타 전위 분석기에 의해 측정되었다 (도 1E) . 나출형 Ad 의 직경은 104 土 6 .64 nm to 175 土 5.2 讓 까지 증가하였고, 이 때 CBA가 최대 농도이었다 (0.5 mg/mL) . 또한 복합체의 표면전하는 나출형 Ad 의 음수값인 -17. 5 mV 土 0.40 mV 로부터 양수값인 그 31 士 0.78 mV 까지 증가하였고 이후 CBA 의 코팅은 0.5 mg/mL 이었다. 이러한 실험결과는 바이러스 입자를 갖는 양이온성 CBA 폴리머의 코팅이 농도 의존적인 방법으로 Ad-CBA의 직경 및 제타 전위 값을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 종합하면， 상기 실험결과는 CBA 가 정전기적 상호작용을 통해서 Ad와 적절히 복합체를 형성한다는 것을 확인한 것이다.
2. Ad-CBA복합체의 투과 전자현미경 (TEM) 이미지
나출형 Ad 및 Ad-CBA 복합체의 형태를 TEM 으로 검사하였다. 도 2 는 0.5 mg/ml 의 CBA 농도, pH 7.4 및 pH 6. 0 에서 나출형 Ad 및 Ad-CBA 복합체의 광학현미경 사진을 보여준다. 나출형 Ad 는 바이러스 입자의 20 면체 모양 (도 2A) 뿐만 아니라 특징적인 핵손 구조를 나타낸다. 반면에, ρΗ 7 · 4(도 2Β)에서 본 발명자들은 Ad 입자의 덩어리가 CBA 폴리머의 "인장 덩어리 ( tens i l e chunk) "에 의해 둘려싸여 있는 경향을 관찰하였고ᅳ 이 인장 덩어리가 Ad-CBA 복합체의 모집을 유도한다. 이러한 관찰은 양이온성 CBA 폴리머가 음전하의 바이러스에 다른 입자를 포헉하고 연결시킨다는 것을 시사한다 ( 18， 27 , 28) . 대조적으로， pH 6.0 에서 본 발명자들은 폴리머에서 pH 민감성 잔기의 이온화에 의해 입증된 CBA 폴리머의 삼켜진 모양을 관찰하였고， 이것은 결국 각각의 Ad 입자의 분리를 유도한다. 이러한 실험결과는 pH 7.4에서 나타나는 압축된 Ad-CBA 복합체의 구조가 pH 민감성 폴리머의 이온화 및 탈이온화 특징 때문에， 더 낮은 pH 의 복합체와 비교된다는 것을 확인하였다.
3. CBA농도에 기초한 Ad-CBA의 형질도입의 평가
CAR (+) 및 CAR (-) 세포주에서 Ad-CBA 복합체의 형질전환 효율성을 평가하기 위해서 , 본 발명자들은 먼저 pH 7 .4 및 pH .6 .0 에서 U343(CAR (+) ) 및 MCF-7 (CAR ( -) ) 항암 세포를 나출형 Ad 또는 Ad-CBA 복합체에 대해 각각 MOI 20 및 200을 이용하여 형질도입하였고, 이 CBA 농도는 0.05 mg/mL 내지 0. 5 mg/mL 이다. U343 세포 (도 3A)에 대해서는， 나출형 Ad 는 전이유전자의 낮은 발현 정도를 나타내는 반면에， Ad-CBA 나노복합체는 중성 pH 에서 낮은 전이유전자 발현을 보여주고， pH 6.4 에서 높은 전이유전자 발현을 나타낸다. 또한， 전이유전자 발현량은 모두 pH 조건에 대해 폴리머의 농도를 증가시킴으로서 증가된다. MCF-7 세포 (도 3B)에 대해서, 실험데이터는 0 .5 mg/mL 에서 가장 명백한 차이를 보이는 동시어ᄂ 중성 pH 에서 나출형 Ad 및 Ad-CA 의 발현과 비교하여 pH 6 .0 에서 전이유전자 발현량에서 있어서 현저히 증가됨을 나타낸다. 산성 pH 조건에서， 복합체 /폴리머는 음전하성 세포막과 결합 친화도를 증가시키는 더 양성적인 표면 전하를 나타내고， 중성 pH 와 비교하여 더 낮은 pH 에서 증가된 유전자전이를 야기한다.
Ad 복합체 형성에 대한 최적의 CBA 농도를 찾기 위해서， 본 발명자들은 젤지연 어세이 (도 X)를 수행하였다. 실험결과들은 Ad-CBA 복합체 지연이 0 .25 mg/mL 에서 시작했고 0 . 5 mg/mL 에서 완전히 지연되었다는 것을 입증하였다. 이러한 실험결과에 기초해서， 0 .5 mg/mL 의 농도는 다른 언급이 없는한， 하기의 실험결과들을 위해 이용되었다. 이러한 실험결과들은 0.5 mg/mL의 CBA농도를 Ad 변형 /컨쥬게이션에 대한 최적화된 농도로서의 지정했을 뿐만 아니라， CBA 폴리머가 Ad 와 적절하게 복합체를 형성한다는 것을 입증하였다. 종합하면 상기 실험결과들은 CAR 수용기의 존재와 상관없이, 산성 조건에서 나출형 · Ad 대웅물 보다 Ad-CBA 복합체의 훨씬 더 개선된 형질전환 효율성을 입증하였다.
4. Ad-CBA복합체의 흡수 메커니즘
본 발명자들은 Ad-CBA 복합체의 세포성 흡수 메커니즘을 밝히려고 노력하였다. 첫째로， CAR 경쟁 어세이는 흡수 메커니즘에서 나노복합체의 CAR 결핍의 정도를 연구하기 위하여 수행되었다. CAR-특이적인 섬유 단백질로의 전처리는 투여량-의존적인 방법으로 나출형 Ad 에 GFP 형질도입을 상당히 감소시켰다 (각각 0.2 및 2 u g/ml 의 섬유 단백질 전처리일 때， 67% 및 90% 감소) . 대조적으로 Ad-CBA(pH 6 .0)에 의해 매개되는 GFP 형질도입은 섬유 단백질에 의해 차단되지 않았고， 이것은 Ad- CBA 흡수가 CAR 및 섬유간의 상호작용에 의해 매개되지 않았다는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 실험결과는 명백히 Ad-CBA 의 흡수가 CAR 의존성 흡수를 극복할 능력을 갖는다는 것을 입증하였다 (도 4A).
둘째로， 본 발명자들은 u343 세포를 서로 다른 흡수 억제제와 함께 공배양하였다: 1) 클로프로마진 (CPZ): 클래트린 -매개 엔도사이토시스의 억제제 (0.2 및 1 ιιΜ)(29), 2) 제니스테인: 카베올래 -매개 엔도사이토시스 (1.25 및 5 uM)(30), 3) NH4C1： 마크로피노사이토시스 (0.5 μΜ)(31). 도 4Β 에서 나타낸 바와 같이, Ad_CBA 복합체는 GFP 발현 수준이 동일하게 남아있었기 때문에， 두 pH 모두에서 CPZ 에 의해 영향을 받지 않았다. 대조적으로, 나출형 Ad 그룹은 GFP 발현에 있어서의 감소를 나타내었고， 이것은 Ad 의 클래트린 -매개 엔토사이토시스에 대한 의존성을 확인해주었다 (32). 제니스테인 처리는 동일한 pH 에서 나출형 Ad 및 Ad-CBA 복합체의 흡수에 대한 억제 효과를 전혀 갖지 않았다. 이것은 모든 세 그룹이 카베올린 -매개 엔도사이토시스를 이용하지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, NH4C1 의 처리는 마크로피노사이토시스가 Ad-CBA 에 대한 주요한 엔도사이토시스 경로라는 것을 나타내었다 (pH 6.0). 0.5 μΜ 에서， Ad- CBA 의 GFP 발현량의 감소 (Ph 6.0)는 통계적으로 유의한 반면에, 나출형 Ad 및 Ad-CBA 에서의 감소 (pH 7.4)는 통계적으로 유의하지 않다 (도 4C) . 종합하면， 이러한 실험결과는 Ad—CBA(pH 6.0)가 서로 다른 흡수 경로 (마크로피노사이토시스)를 이용함으로써 CAR 의존성을 극복한다는 것을 나타낸다.
5. Ad-CBA 복합체의 엔도좀 탈출의 평가
바필로마이신 (Bf-A)는 Ad 의 산성화를 방지하는 액포성 H+ ATPase 이고， 이것는 엔도좀으로부터 바이러스의 달출을 위한 중요한 요소이다. Ad-CBA 복합체의 엔도좀 탈출 능력을 평가하기 위해서， U343 및 MCF-7 세포주를 5 및 20 μΜ 의 Bf-A 로 공배양하였다. 형질도입 효율성 연구에서 입증하였던 바와 같이， ί)Η 6.0 에서 Ad-CBA 는 CAR(+) 및 CAR (-) 세포주에서 나출형 Ad 및 Ad-CBA 그룹 보다 더 높은 형질도입 효율성을 나타내었다 (pH 7.4). 그러나， 두 세포주의 상대적으로 정상화된 GFP 발현 수준은 Bf-A 의 처리를 할 때 Ad-CBA(pH 6.0)의 형질도입 수준에서 급격한 감소를 나타낸다 (도 5) . 흥미롭게도 U343 세포주에서， 본 발명자들은 Ad- CBA(pH 6.0)의 GFP 발현량이 Bf-A(5 μ Μ)의 최초 처리시에 Ad-CBA(pH 7.4)의 발현량과 유사한 수준까지 감소하였다는 것을 관찰할 수 있었고, 이것은 엔도좀의 산성화가 Ad-CBA 의 효율적인 형질도입에 극히 중요하다는 것을 시사한다 (p < 0.001) . MCF7 데이터는 유사한 포인트를 입증한다 (도 5B) . 다른 CAR-의존성 그룹 (나출형 Ad 및 Ad-CBA(pH 7.4) )은 Bf-A 의 처리 후'여전히 현저한 감소를 보였다 (P < 0.001 ) . 상기 실험결과들은 Ad-CBA 의 형질도입 경로가 엔도좀 조절 하에 있다는 것올 나타낸다. 6. In wYro Ad(RdB/shVEGF)-CBA의 치료 효과
Ad-CBA 의 형질도입 및 흡수 메커니즘을 밝힌 후， 본 발명자들은 Ad- CBA 의 유전자 전달 및 종양학에서 기능적 능력의 정도를 평가하려고 노력하였다. 플라스미드를 발현하는 VEGF-특이적 shRNA를 구축하였고 VEGF- 특이적인 짧은 헤어핀 RNA 를 발현하는 Ad(RdB/shVEGF)-CBA 를 상술한 바와 같이 합성하였다 (26) . 본 발명자들은 우선 RdB/shVEGF)-CBA 의 유전자 전달 능력에 대한 지표로서 RdB/shVEGF-CBA 에 의한 유전자 사일런싱의 정도를 모니터링하였다. 본 발명자들은 나출형 RdB/shVEGF , RdB/shVEGF-CBA (pH 7.4) 또는 RdB/shVEGF— CBA (pH 6.0)로 U343 세포를 MOI 1 및 10에서 각각 24 시간 동안 감염시켰고 각각의 그룹에서 VEGF의 발현을 VEGF ELISA 어세이를 이용히여 측정하였다. 나출형 RdB/shVEGF 및 RdB/shVEGF-CBA (pH 7.4) 그룹은 두 M0I 에서 모두 VEGF 수준에서 유의한 감소를 나타내지 않았고， 10 M0I 에서는 RdB/shVEGF— CBA(pH 6 .0)은 VEGF 발현을 효율적으로 억제하였다 (p < 0.05) . 이것은 산성 조건에서 RdB/shVEGF-CBA 의 많은 개선된 형질도입 효율이 치료용 s i RNA 의 증가된 전달 및 기능성을 유도한다는 것을 확인해주었다 (도 6A) .
한편， 본 발명자들은 CAR (+) and CAR (-) 모두에서 Ad (RdB/shVEGF-¬ CBA 의 종양살상 효과를 검증하려고 하였다. 본 발명자들은 나출형 RdB/shVEGF , RdB/shVEGF-CBA (pH 7 .4) 또는 RdB/shVEGF_CBA(pH 6 .0)로 U343 및 f7 세포를 48 시간 동안 감염사켰고 각각의 그룹을 ΜΊΤ 어세이를 통해서 분석하였다. 나출형 Ad 및 Ad-CBA 는 CAR 수용기에 의해 Ad 의 촉진된 흡수 때문에 U343 세포주에서 두 pH 모두에서 다양한 정도로 항암 활성을 나타내었다 (도 6B) . 그러나， RdB/shVEGF-CBA(pH 6.0)는 나출형 RdB/shVEGF 또는 RdB/shVEGF-CBA(pH 7 .4) 그룹과 비교해서 여전히 가장 유의한 종양살상 효과를 보여주었다 (p < 0 .01 ) . RdB/shVEGF-CBA(pH 6 .0) 및 나머지간의 차이는 F7 세포주에서 이의 CAR+ 대웅물 보다 훨씬 더 급격하게 나타났다. 나출형 RdB/shVEGF 및 RdB/shVEGF-CBA(pH 7.4)의 항암 활성이 거의 존재하지 않는 반면에， RdB/shVEGF-CBA(6.0)은 세포 그룹에서 급격한 감소를 나타내었다 (p < 0. 001 ) . 상기 실험결과들은 RdB/shVEGF- CBA 의 우수한 형질도입 효율이 RdB/shVEGF 의 통상의 제한을 보층함으로써 기존의 RdB/shVEGF 의 강한 항혈관신행 및 항암효과를 증가시킨다는 것을 입증하고， 이로써 RdB/shVEGF-CBA 의 치료 효과 및 이의 시너지적 잠재력을 널리 공개할 수 있다.
7. in 'ra RdB/shVEGF-CBA의 치료 효과
본 발명자들은 RdB/shVEGF— CBA 의 치료 효과의 in vitro 실험결과를 기초로 하여 RdB/shVEGF-CBA 의 hi vitro 치료 효과가 in w>o 로도 해석된다는 것을 확인하고자 하였다. 우선， 본 발명자들은 마트리젤 플러그 어세이를 통해서 RdB/shVEGF-CBA 의 항혈관신생 효과를 평가하였다. MCF7 세포를 pH 7.4 또는 pH 6 .0 에서 PBS 로 처리된 나출형 RdB/shVEGF 또는 RdB/shVEGF-CBA 로 감염시켰고 차가운 마트리젤로 흔합하였고 측면 지역의 피하 공간으로 주입하였다. 마트리젤 플러그를 14 일 후 절개하였고 각각의 그룹의 혈관 정량화에 대하여 분석하였다. 나출형 RdB/shVEGF 및 RdB/shVEGF-CBA (pH 그4)는 혈관 수치에서 최소의 감소를 보였던 반면에， RdB/shVEGF-CBA(pH 6 .0) 그룹은 급격하게 감소된 혈관신생을 나타내었다 (도 7A) .
다음으로， 본 발명자들은 국소 투여에서 RdB/shVEGF -CBA 의 항암 효과를 평가하였다. U87 이종이식 종양을 갖는 마우스를 확립하였고 종양내적으로 PBS , 나출형 Ad 또는 Ad-CBA 를 23 일에 걸쳐서 처리하였다. 도 7B 에 나타낸 바와 같이， 종양 성장은 Ad 그룹과 비교하여 RdB/shVEGF- CBA 그룹에서 유의하게 억제되었다 (p < 0 .05) . 평균 종양 크기는 PBS , AD 및 AD-CBA 그룹에 대해 이종이식 피하주입 후 23 일째에 각각 1984 士 439 , 720 土 119， 177 土 73 画 3 이었다. Ad 및 Ad-CBA 그룹에 대해 상웅하는 종양 성장 억제는 각각 Ad 및 Ad— CBA 그룹이었다. 종합해서， 상기 실험결과들은 항혈관신생성 및 항종양활성에서 Ad-CBA 의 우수한 효율성을 입증하였고， 이것은 in vivo치료 효과를 확인하여 주었다. 8. in /VO면역 반응의 회피 ( IL-6 데이터， ALS/ALT의 간 데이터)
in vivo 에서 투여된 바이러스 유전자 백터에 내재하는 도전과제들 중의 하나는 혈액 내에서 Ad 입자의 시트템의 인지에 대한 선천성 면역반응의 활성화이다. Ad-CBA 의 젤지연 어세이 및 TEM 이미지에 기초하여 본 발명자들은 Ad 입자의 CBA 캡슐화가 Ad-CBA 복합체가 시스템의 면역 반응을 회피하는 것， 즉， "스텔스 (st eal th) " Ad 를 가능하게 할 수 있다는 가설을 세웠다. 본 발명자들은 Ad-CBA 복합체의 침투적 특성을 평가하기 위하여 전염증 사이토카인 IL-6(Ad 입자에 의해 유도됨)의 혈청 수준에서의 변화를 선천성 면역 시스템 활성화의 한 측정수단으로서 관찰하였다. BALB/C 마우스를 PBS 의 1 X 1010 VP , 나출형 Ad , CBA 또는 Ad-CBA 로 정맥 주사하였고 7 일 후에 마우스 혈청을 수득한 후 IL-6 ELISA 를 분석하였다. 예상한 바와 같이， 나출형 Ad 의 주사는 PBS 대응물과 비교하여 혈청 IL-6 수준을 급격하게 증가시켰다. 그러나, CBA 의 정맥 처리는 PBS 그룹의 수준과 거의 동일한 혈청 IL-6 수준을 나타내었고， 이는 전신투여에 있어서 CBA의 생체적합성을 입증하는 것이다. 결과적으로， Ad 입자의 CBA 캡슐화는 Ad-CBA 의 혈청 IL-6 수준에서 유의한 감소를 유도하였고， 이는 선천성 면역으로부터 Ad 입자를 보호하는 CBA의 능력을 확인한 것이다.
혈액 내에서 Ad 의 빠른 제거에 있어서의 또 따른 기여 인자는 쿠퍼 (Kupf fer ) 세포에 의하여 간에 바이러스 입자의 모집이다. 커다란 마크로파지는 특이적으로 간 동양혈관 내에 위치하고， 간 동양혈관은 스캐빈저 ( scavenger ) 수용기에 의해 대부분 매개된다 (XU , Z) . 쿠퍼 세포에 의해 방출된 사이토카인 (TNF 및 IL-6)은 Ad 의 간 형질도입 후 초기 간독성을 야기하는 것으로 알려져 있다. 그런 점에서, Ad-폴리머 복합체에 의해 유도된 간독성의 정도는 회피 면역에 있어서 폴리머의 능력에 대한 추가적인 증거이다. 따라서， 본 발명자들은 PBS , 나출형 Ad 또는 Ad-CBA 의 정맥 주사 후 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 (ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼레이즈 (AST)의 혈청 수준을 측정하였다 (도 8) . 나출형 Ad 그룹이 혈청 ALT/AST 수준에서 급격한 증가를 보인 반면에， Ad-CBA 그룹의 ALT/AST 수준은 Ad 대웅물 보다 각각 17. 1 및 30. 5 로 더 낮았다. 상기 실험결과는 Ad-CBA 가 CBA 의 면역회피 특성을 통해서 혈청 IL-6 및 ALT/AST 수준을 감소시켰다는 것을 나타낸다.
9. 정맥 주입된 Ad-CBA복합체의 항암 효과
U87 이종이식 종양을 갖는 마우스는 전신 투여에서 RdB/shVEGF- CBA 의 항암 효과를 평가하기 위하여 확립되었고 PBS , 나출형 Ad 또는 Ad- CBA 로 27 일에 걸쳐 처리되었다. 도 9 에 나타낸 바와 같이， 종양 성장은 RdB/shVEGF 그룹과 비교하여 RdB/shVEGF— CBA 에서 유의하게 억제되었다 (P < 0 .001) . 반면에 나출형 RdB/shVEGF 의 항종양 활성은 전신투여에서 나출형 AD 를 제거하는 면역반응의 존재 때문에 최소화되었다. PBS , RdB/shVEGF 및 RdB/shVEGF-CBA 그룹에 대해 이종이식 피하주입을 한 지 27 일 째에 평균 종양 크기는 각각 2144 士 167， 1777 士 484， 752 士 35 隱 3 이었다 . RdB/shVEGF 및 RdB/shVEGF— CBA 그룹에 대해 상웅하는 종양 성장 억제는 각각 17. 1% 및 65. 。이었다. 상기 실험결과들은 Ad 입자의 캡슐화를 통해 CBA 의 면역회피 효과를 확인하였올 뿐만 아니라 RdB/shVEGF-CBA 의 항암활성의 효율성을 입증하였고, 이는 RdB/shVEGF-CBA 의 전신투여에서 치료 잠재력을 밝힌 것이다.
10. CBA로 코팅되거나 코팅되지 않은 Ad의 안정성 및 DTT처리 효과
실온에서 24 시간까지 PBS 버퍼 내에서 Ad— CBA 나노복합체의 콜로이드 안정성을 측정하였다. 도 10 에 나타낸 바와 같이 Ad-CBA 나노복합체의 평균 사이즈는 24 시간 동안 유의하게 변화하지 않았고， CBA 양이온성 폴리머-코팅된 Ad 가 양호한 콜로이드 안정성을 보이는 것을 의미한다ᅳ 또한 환원제 디티오트레이를 (DTT)로 CBA의 환원성을 시험하였다. ΕΓΓΤ 로 처리하지 않거나 처리한 코팅되지 않은 Ad 및 Ad-CBA 복합체의 입자 사이즈를 DLS 분석기에 의해 측정하였다. 도 11 에 나타낸 바와 같이 , 코팅하지 않은 Ad 의 사이즈는 DTT 처리에 의해 변화하지 않았다. 그러나 PPCBA 코팅된 Ad 복합체의 평균 사이즈는 DTT 처리 후 유의하게 감소하였고, 코팅하지 않은 Ad 의 사이즈에 근접하였다. 이러한 결과들은 PPCBA 가 환원가능한 미세환경 (mi croenvi ronment ) 하에서 생분해될 수 있다는 것을 명백히 확인시켜준다. 결론적으로， 상술한 데이터는 Ad—CBA 가 성공적으로 복합체 형성되었고, 200 nm 이하 직경의 입자를 제조하며， Ad-CBA 가 효과적으로 세포 내로 도입되는 것을 보여준다.
11. 종합결론
본 발명자들은 pH 민감성 및 생환원성 폴리머， 이온성 상호작용을 통해 아데노바이러스 시스템을 코팅한 폴리머를 순차적으로 고안하고 합성하였다. 또한， 형질도입은 CAR 양성 및 음성 세포에서 pH 의존적 방법에 의해 유전자 전달 효과가 증가하였다는 것을 입증하였다. Ad-CBA 의 세포내 진입 메커니즘은 마크로피노사이토시스 경로를 통한 Ad-CBA 의 흡수가 나출형 Ad 와 상이하다는 것을 밝혔다. 또한， 세포살상 효과 데이터는 Ad 로 코팅된 폴리머가 세포에 강한 결합 친화력을 갖고 복합체의 세포 흡수를 증가시키기 때문에 Ad-CBA 폴리머가 나출형 Ad 및 CBA 폴리머 보다 유의적으로 더 높다는 것을 보여주었다. 또한， Ad-CBA 의 치료 효과는 in vitro 연구에서 뿐만 아니라 종양내 및 정맥내의 in vivo모델은 나출형 ' Ad와 비교하여 유의하게 증가된 치료효과를 보여주었다. 나아가， Ad-CBA의 성공은 종양 미세환경의 표적 특징올 이용한， 다른 Ad 복합체의 개발을 기대할 수 있다는 것이 본 발명의 장점이다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참고문헌
1 . Wo l d WS , Toth K . Adenovi rus vect ors for gene therapy , vaccinat i on and cancer gene therapy . Current gene therapy. 2013；13：421-33. 2. Choi IK, Yun CO. Recent developments in oncolytic adenovirusᅳ based immunotherapeut ic agent s for use against metastatic cancers . Cancer gene therapy. 2013 ;20： 70-6.
3. Choi JW, Lee JS, Kim SW, Yun CO. Evolution of oncolytic adenovirus for cancer treatment . Advanced drug del i very reviews.
2012;64:720-9.
4. Bachtarzi H, Stevenson M, Fisher K. Cancer gene therapy with targeted adenoviruses . Expert opinion on drug delivery. 2008;5:1231-40
5. Yun CO. Overcoming the extracellular matrix barrier to improve intratumoral spread and therapeutic potential of oncolytic virotherapy . Current opinion in molecular therapeutics. 2008； 10:356-61
6. Guo ZS, Thorne SH, Bart lett DL. Oncolytic virotherapy: molecular targets in tumor-select ive replication and carrier cellᅳ mediated delivery of oncolytic viruses . Biochimica et biophysica acta. 2008；1785：217-31.
7. Russell SJ , Peng KW, Bell JC. Oncolytic virotherapy. Nature biotechnology. 2012 ;30： 658-70.
8. Harrop R, John J , Carroll 删. Recombinant viral vectors: cancer vaccines . Advanced drug del i very reviews. 2006;58:931-47.
9. Re id T, Galanis E, Abbruzzese J, Sze D, Andrews J, Romel L, et al . Intra-arter ial administration of a repl icat ion-select ive adenovirus (dll520) in patients with colorectal carcinoma metastatic to the liver: a phase I trial . Gene therapy. 2001 ;8 :1618-26.
10. Kwon 0J, Kim PH, Huyn S, Wu L, Kim M, Yun CO. A hypoxia- and {alpha}ᅳ fetoproteinᅳ dependent oncolytic adenovirus exhibits specific killing of hepatocellular carcinomas . CI inical cancer research ■' an official journal of the American Assoc i at ion for Cancer Research. 2010;16:6071-82.
11. Yu W, Fang H. CI inical trials with oncolyt ic adenovirus in China . Current cancer drug targets. 2007;7: 141ᅳ 8. 12. Meier 0， Greber UF. Adenovirus endocytosi s .. The journal of gene medicine. 2003 ;5 :451ᅳ 62.
13. Kim J， Kim PH, Kim SW, Yun CO. Enhancing the therapeut ic efficacy of adenovirus in combination with biomaterials . Biomaterials. 2012;33:1838-50.
14. Wang C, Pham PT. Polymers for viral gene delivery. Expert opinion on drug delivery. 2008 ;5:385ᅳ 401.
15. ang E， Yun CO . Current advances i n adenovi rus nanocom lexes： more specificity and less immunogenicity . BMB reports. 2010；43：781-8.
16. Kasa la D， Cho i J W， Kim SW, Yun CO. Ut i 1 i z i ng adenov i rus vectors for gene delivery in cancer . Expert opinion on drug del i very. 2014.
17. Kim PH, Kim J,, Kim TI , Nam HY, Yockman JW, Kim M, et al. Bioreducible polymerᅳ conjugated oncolytic adenovi rus for hepatoma- speci f ic therapy via systemic administration. Biomaterials. 2011;32:9328-42.
18. Kim J, Li Y, Kim SW, Lee DS, Yun CO. Therapeut ic efficacy of a systemical ly delivered oncolytic adenovirus - biodegradable polymer complex. Biomaterials. 2013;34:4622-31.
19. Eto Y, Yoshioka Y, Mukai Y, Okada N, Nakagawa S. Development of PEGylated adenovirus vector wi th target ing 1 i gand . International journal of pharmaceutics. 2008 ;354 :3一 8.
20. Han J , Zhao D , Zhong Z, Zhang Z, Gong T, Sun X. Combination of adenovirus and crossᅳ 1 inked low molecular weight PEI improves efficiency of gene transduction. Nanotechnology. 2010；21： 105106.
21. Park JW, Mok H, Park TG. Physical adsorption of PEG grafted and blocked poly一ᄂ一 lysine copolymers on adenovirus surface for enhanced gene transduction. Journal of controlled release .· official journal of the Controlled Release Society. 2010；142：238-44. 22. Lee ES, Gao Z, Bae YH. Recent progress in tumor pH targeting nanotechnology. Journal of controlled release .· official journal of the Controlled Release Society. 2008;132:164-70.
23. Ge Z, Liu S. Funct ional block copolymer assembl ies responsive to tumor and intracellular microenvironments for site- spec i f ic drug de 1 i very and enhanced i maging per f ormance . Chemical Society reviews. 2013;42:7289-325.
24. Ko J, Park K, Kim YS, Kim MS, Han JK, Kim , et al. Tumoral acidic extracel lular pH target ing of pH-responsive ' MPEGᅳ poly (bet a一 amino ester) block copolymer micel les for cancer therapy. Journal of control led release ■ official journal of the Control led Release Society. 2007； 123： 109-15.
25. Kim PH, Sohn JH, Choi JW, Jung Y, Kim SW, Haam S, et al . Active target ing and safety profile of PEG一 modified adenovirus conjugated with hercept in. Biomaterials . 2011;32:2314-26.
26. Yoo JY, Kim JH, Kwon YG, Kim EC, Kim NK, Choi HJ, et al. VEGF-speci f ic short hairpin RNA一 express ing oncolyt ic adenovirus elicits potent inhibit ion of angiogenesis and tumor growth. Molecular therapy ·· the journal of the American Society of Gene Therapy. 2007；15：295-302.
27. Kim PH, Kim TI， Yockman JW, Kim SW, Yun CO. The effect of surface modification of adenovirus with an argi nineᅳ grafted bioreducible polymer on transduct ion efficiency and immunogenicity in cancer gene therapy. Biomaterials. 2010 ;31： 1865-74.
28. Park Y, Kang E, Kwon 0J, Hwang T, Park H, Lee JM, et al ,
Ionical ly crossl inked Ad/ chi tosan nanocomplexes processed by electrosp inning for targeted cancer gene therapy. Journal of control led release ' official journal of the Control led Release Society. 2010； 148:75-82. 29. Wang LH, Rothberg KG, Anderson RG. Mis-assembly of clathr in lattices on endo somes reveals a regulatory switch for coated pit formation. The Journal of cell biology. 1993;123:1107-17.
30. Aoki T, Nomura R, Fuj imoto T. Tyrosine phosphorylat ion of caveol in-1 in the endothelium. Experimental eel 1 research.
1999;253:629-36.
31. Perumal OP, Inapagol la R, Kannan S, Kannan RM. The effect of surface functionality on cellular trafficking of dendrimers. Biomaterials. 2008 ;29 :3469-76.
32. Meier 0， Greber UF. Adenovirus endocytosi s . The journal of gene medicine. 2004； 6 Supp 1 1： S152-63.
33. O'Riordan CR, Lachapel le A, Delgado C, Parkes V, Wadsworth SC, Smith AE, et al . PEGylat ion of adenovirus with retention of infect ivity and protect ion from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human gene therapy. 1999； 10： 1349-58.
34. Fisher KD, Green NK, Hale A, Subr V， Ulbrich , Seymour LW. Passive tumour targeting of polymerᅳ coated adenovirus for cancer gene therapy. Journal of drug targeting. 2007； 15:546-51.
35. Fisher KD, Stallwood Y, Green NK, Ulbrich K, Mautner V, Seymour LW. Polymer-coated adenovirus permi ts efficient retargeting arid evades neutralising ant i bodies . Gene therapy. 2001 ;8 :341-8.
36. Kwon 0J, Kang E, Kim S, Yun CO. Viral genome DNA/1 i op 1 exes elicit in situ oncolytic viral replication and potent antitumor efficacy via systemic delivery. Journal of control led release ■' official journal of the Controlled Release Society. 2011； 155 :317-25.
37. Kwon 0J, Kang E, Choi JW Kim SW, Yun CO. Therapeutic targeting of chi tosan-PEG-folate-complexed oncolytic adenovirus for active and systemic cancer gene therapy. Journal of controlled release ■' official journal of the Control led Release Society. 2013；169：257-65.
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Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
(i ) 면역반웅 회피성 부위 (escapable port ion from immune reactions), (ii) 전하성 부위 (chargable portion) 및 (iii) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위 (bioreducible port ion)를 포함하는 pH 민감성 및 생환원성 (bioreducible) 폴리머가 바이러스의 표면에 결합된 폴리머- 바이러스 복합체 .
[청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 면역반응 회피성 부위 (escapable portion from immune reactions)는 PEGCpolyethylene glycol ) , 폴리알킬렌 옥사이드' 폴리페닐렌 옥사이드, PEG 와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체, 폴리 (메톡시에틸 메타크릴에이트)， 폴리 (메타크릴로일 포스파티딜콜린)， 과불화된 폴리에테르， 덱스트란 및 폴리비닐피롤리돈으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리머-바이러스 복합체 .
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 바이러스는 아데노바이러스， 아데노 -관련 바이러스 (Adeno— associated viruses: AAV), 레트로바이러스， 렌티바이러스， 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 배시니아 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리머-바이러스 복합체.
[청구항 4】
(a) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리머-바이러스 복합체의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암치료용 약제학적 조성물.
【청구항 5】
제 4 항에 있어서， 상기 항암치료용 약제학적 조성물에서 암은 위암， 폐암， 유방암， 난소암， 간암， 기관지암， 비인두암， 후두암， 췌장암, 방광암， 결장암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것올 특징으로 하는 약제학적 조성물.
【청구항 6】
( i ) 면역반웅 회피성 부위 (escapable port ion from immune reactions), (i i) 전하성 부위 (chargable por ion) 및 (i i i) 이황화결합을 포함하는 생환원성 부위 (bioreducible portion)를 포함하고, 바이러스의 표면에 결합될 수 있는 pH 민감성 및 생환원성 (bioreducible) 폴리머.
【청구항 7】
제 6 항에 있어서, 상기 면역반응 회피성 부위 (escapable portion from i mmune react ions)는 PEG (polyethylene glycol), 폴리알킬런! 옥사이드 폴리페닐렌 옥사이드, PEG 와 폴리알킬렌 옥사이드의 공중합체， 폴리 (메특시에틸 메타크릴에이트), 폴리 (메타크릴로일 포스파티딜콜린), 과불화된 폴리에테르, 덱스트란 및 폴리비닐피롤리돈으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리머.
【청구항 8】
제 6 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스， 아데노 -관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스， 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 배시니아 바이러스로부터 선택된 어느 하나안 것을 특징으로 하는 폴리머.
【청구항 9]
제 6 항에 있어서, 상기 폴리머는 다음 화학식 1 로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리머:
1
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【청구항 10】
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리머-바이러스 복합체의 치료학적 유효량을 객체 (subj ect )에 투여하는 단계를 포함하는 항암치료 방법 ·
【청구항 11】
제 10 항에 있어서， 상기 항암치료방법에서 암은 위암， 폐암， 유방암， 난소암， 간암， 기관지암, 비인두암， 후두암, 췌장암， 방광암， 결장암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법 .
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2017039311A1 (ko) * 2015-08-31 2017-03-09 한양대학교 산학협력단 아데노바이러스 단백질 vi 유래 펩티드를 포함하는 세포 내 전달용 조성물 및 이를 포함하는 항암용 약제학적 조성물
WO2017155281A1 (ko) * 2016-03-07 2017-09-14 한양대학교 산학협력단 아데노바이러스와 pamam-peg-erbitux 복합체 및 이의 용도
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WO2019235746A1 (ko) * 2018-05-08 2019-12-12 한양대학교 산학협력단 비강투여에 의한 효과적인 뇌전달 기술
US20220389160A1 (en) * 2019-11-07 2022-12-08 Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University Effective intranasal delivery to brain

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000011202A1 (en) * 1998-08-24 2000-03-02 Genzyme Corporation Cationic complexes of polymer-modified adenovirus

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017155281A1 (ko) * 2016-03-07 2017-09-14 한양대학교 산학협력단 아데노바이러스와 pamam-peg-erbitux 복합체 및 이의 용도
KR102543671B1 (ko) * 2016-03-14 2023-06-16 진메디신 주식회사 전자기장에 의한 항종양 효과가 증대된 아데노바이러스-pcion 복합체

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000011202A1 (en) * 1998-08-24 2000-03-02 Genzyme Corporation Cationic complexes of polymer-modified adenovirus

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FISHER, K. D. ET AL.: "Polymer-coated adenovirus permits efficient retargeting and evades neutralising antibodies", GENE THERAPY, vol. 8, no. 5, 2001, pages 341 - 348, XP002514532 *
KASMAN, L. M. ET AL.: "Polymer-enhanced adenoviral transduction of CAR-negative bladder cancer cells", MOLECULAR PHARMACEUTICS, vol. 6, no. 5, 2009, pages 1612 - 1619, XP055233284 *
KIM, PYUNG - HWAN: "The Effect of Surface Modified Adenovirus with an Arginine-Grafted Bioreducible Polymer by Physical Coating or Chemical Conjugation for Cancer Gene Therapy", DOCTORATE THESIS, 2010 *
MOON, C. Y. ET AL.: "Dual tumor targeting with pH-sensitive and bioreducible polymer- complexed oncolytic adenovirus", BIOMATERIALS, vol. 41, 2015, pages 53 - 68, XP029116878 *

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