WO2015155387A1 - Procedimiento para incrementar el contenido de fenoles con actividad biológica en uvas tintas que comprende un tratamiento exógeno con un enantiómero de jasmonato de metilo diluído en etanol - Google Patents

Procedimiento para incrementar el contenido de fenoles con actividad biológica en uvas tintas que comprende un tratamiento exógeno con un enantiómero de jasmonato de metilo diluído en etanol Download PDF

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WO2015155387A1
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grapes
quercetin
diluted
ethanol
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PCT/ES2015/070170
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Gema FLORES MONREAL
Gracia Patricia BLANCH MANZANO
Maria Luisa RUIZ DEL CASTILLO
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10
    • A23B7/144—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10 in the form of gases, e.g. fumigation; Compositions or apparatus therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K36/87—Vitaceae or Ampelidaceae (Vine or Grape family), e.g. wine grapes, muscadine or peppervine

Definitions

  • the present invention encompasses the food and health sectors, since it specifically refers to a procedure for increasing the content of phenols with healthy biological activity in previously harvested red grapes, preferably polyphenols, and more preferably resveratrol and various forms of quercetin, and comprising an exogenous treatment with a methyl jasmonate enantiomer diluted in ethanol.
  • bioactive compounds present in the grape it is worth mentioning the polyphenols, starting with resveratrol, from which this fruit is considered one of the main sources and is characterized by its antitumor activity.
  • Another polyphenol present in grapes in minor quantities is quercetin, both free and in its different forms, which also has important biological properties.
  • quercetin both free and in its different forms, which also has important biological properties.
  • nutritional supplements of resveratrol and quercetin which are supplied individually or in combination.
  • JM methyl jasmonate
  • JM that is mostly used in food and plant tissue treatments referred to is the stereoisomeric mixture of commercial JM, which contains 5% of (-) - and (+) - ep ⁇ JM and 95% of (-) - and (+) - JM.
  • An aspect of the invention constitutes a process for simultaneously increasing the content of more than one phenolic compound with healthy biological activity in red grapes comprising: a) contacting previously harvested red grapes with a dilute Methyl Jasmonate (JM) enantiomer in ethanol
  • the above procedure comprises the following steps: b) subject the whole of stage (a) to a constant temperature between
  • stage (b) hermetically isolate the whole of stage (b) and keep it at a temperature between 4 and 10 ° C for a period of time between 0 and 7 days.
  • the JM enantiomer is selected from (-) - JM and (+) - JM and the phenolic compounds with healthy biological activity are polyphenols, which are more preferably resveratrol and different forms of quercetin.
  • the technical problem that solves the invention is to achieve an alternative to post-harvest treatments with hormones to achieve the increase of phenols with healthy biological activity in red grapes.
  • the proposed procedure ensures that more than one of these phenolic compounds in red grapes is increased simultaneously, significantly higher than what is achieved using other hormone treatments known in the state of the art.
  • the inventors have discovered that an exogenous treatment comprising contacting already harvested red grapes and a JM enantiomer diluted in ethanol; keep at constant room temperature for 24 hours; and let stand for 5 days at a temperature of 4 o C (see example 2), it increases the activity of the enzymes involved in the simultaneous bioforming of resveratrol and different forms of quercetin and, as a consequence, achieve a high accumulation of these phenols with healthy biological activity in the tissue of the grapes (see example 4.3).
  • the activity of the activating agents in terms of increasing the activity of the enzymes involved in the bioforming of phenolic compounds with healthy biological activity, such as polyphenols, and more specifically resveratrol and different forms of quercetin, is a process specific that occurs between each activation agent and the fruit or plant tissue on which it is applied.
  • the invention relates to a process for simultaneously increasing the content of more than one phenolic compound with healthy biological activity in red grapes, which are preferably polyphenols and more preferably resveratrol and quercetin forms, hereinafter process of the invention, which comprises contacting previously harvested grapes with a JM enantiomer diluted in ethanol.
  • the JM enantiomer diluted in ethanol is introduced into a vial, and subsequently converted into steam that contacts the grapes.
  • the JM grapes and enantiomer are introduced into a container that has a volume such that 2/3 of the container is occupied by the red grapes and 1/3 is free to allow vaporization of the JM.
  • the process of the invention is optimized when immediately following the contact of the previously harvested grapes and the JM enantiomer diluted in ethanol, the following steps are carried out: b) the previous assembly is subjected to a constant temperature between 25 and 40 ° C for a period of time between 20 and 30 hours; and subsequently c) said assembly is hermetically isolated and maintained at a temperature between 4 and 10 ° C for a period of time between 0 and 7 days.
  • phenols or phenolic compounds with healthy activity means organic compounds whose molecular structure contains at least one phenol group and which possess some kind of biological activity beneficial to the organism.
  • Phenolic compounds with healthy activity that are included in the scope of the invention are preferably polyphenols such as flavonols, anthocyanins and tannins, and more preferably resveratrol and quercetin forms.
  • Resveratrol means 3, 5, 4-trihydroxy-trans-stilbene, a type of polyphenolic compound produced naturally by some plants.
  • quercetin forms is meant forms of the compound 2- (3, 4) - dihydrox ⁇ phen ⁇ l) -3, 5, 7-trih ⁇ drox ⁇ -4H-cromen-4-one, which is a flavonol that It is found in high concentrations in both fruits and vegetables.
  • quercetin may be present in free form, its most frequent forms are linked to a molecule of a carbohydrate, specifically as 0-glycoside, O-galactoside and O-rutinoside.
  • examples of forms of quercetin which are included within the scope of the process of the invention, are preferably chosen from quercetin-3-O-glucoside, quercetin-3- ⁇ -galactoside and quercetin-3-O-rutinoside.
  • activating agent is meant that compound that when it interacts with an active fruit or plant tissue or promotes the synthesis of other compounds existing in said material.
  • the activation agents are phytohormones existing in all higher plants, which are involved in growth, senescence and defense mechanisms against the attack of pathogens.
  • red grapes by way of illustration and not limitation, which are included in the scope of the process of the invention are Bobal, Cabernet Franc, Cari ⁇ ena, Garnacha Ink, Merlot, Tempranillo and Malbec.
  • the JM has two chiral centers at carbons 3 and 7 of the molecule. This implies that there may be four different stereoisomeric configurations, that is, as two pairs of different enantiomers. These configurations are called (-) - and (+) - JM ((3R, 7R) - and (3S, 7S) -isomers, respectively) and (-) - and (+) - methyl epijasmonate (epiJM, (3R , 7R) - and (3R, 7S) -isomers, respectively). As with all chiral compounds, the dissymmetric nature of certain biological receptors implies that the stereochemistry of JM is the main factor in the relationship between the structure of the molecule and its biological activity.
  • the isolation of the enantiomers that are used in the process of the invention is carried out, for example, starting from a stereoisomeric mixture of Commercial JM, by preparative HPLC using a chiral column packaged with permethylated ⁇ -cyclodextrin as a stationary phase (see example 1).
  • any other technique that allows obtaining said enantiomers such as enantioselective synthesis.
  • JM enantiomer that is used in the process of the invention is derived from a stereoisomeric mixture of commercial JM, which comprises 5% of (-) - and (+) - ep ⁇ JM and 95% of (-) - and (+) - JM and that is isolated by preparative HPLC using a chiral column packed with permethylated ⁇ -cyclodextrin as a stationary phase.
  • the preferred ratio of JM enantiomer diluted in 1 ml of ethanol per gram of ink grape used in the process of the invention is between 0.005 and 0.1 ⁇ .
  • the ratio of JM enantiomer diluted in 1 ml of ethanol per gram of ink grape is 0.025 ⁇ .
  • the JM enantiomer is selected from (-) - JM and (+) - JM.
  • the enantiomer used in the process of the invention comprises a high degree of purity, which is preferably greater than 95%. However, enantiomers with lower degrees of purity are also included in the scope of the invention.
  • the temperature used in step (b) of the process of the invention is 25 ° C and the period of time is 24 hours.
  • step (c) of the process of the invention is carried out for 5 days and at a temperature of 4 ° C.
  • the process of the invention comprising using an enantiomer that is (-) - JM and red grapes of the Red Globe variety, achieves an increase in resveratrol greater than 125%; of quercetin-3-glu-glucoside greater than 350%; of quercetin-3-O-galactoside greater than 130%; and of quercetin-3-O-rutinoside greater than 125%, the percentages referring to the content of the untreated sample.
  • the process of the invention comprising using an enantiomer that is (+) - JM and red grapes of the Red Globe variety, achieves an increase of quercetin-3-O-glycoside greater than 75%; and of quercetin-3-O-rutinoside greater than 80%, the percentages referring to the content of the untreated sample.
  • a 30 m long and 20 mm internal diameter column was used, packed with a 5 pm thickness of permethylated ⁇ -cyclodextrin, which was used as a chiral stationary phase.
  • a solution of 50 mg of commercial JM in 10 ml of ethanol was started and 1500 ⁇ of this solution was introduced into the chromatograph.
  • a volume of 23.4 ml and 31.2 ml was collected from the fractions of (-) - JM and (+) - JM respectively in the MeOH / H 2 0 elution solvent and in independent vials. The isolated amounts of each of them were 3.56 mg respectively.
  • red grapes of the Red Globe variety were placed in a glass container of 1 L capacity, inside which an open vial of 1 ml capacity was introduced.
  • the container has a volume such that 2/3 of the container is occupied by red grapes and 1/3 is free to allow vaporization of the JM.
  • Each open glass vessel was placed inside an oven with the thermostated temperature at 25 ° C, which was maintained for 24 hours, allowing JM steam to act on the grapes. After this time, the JM enantiomer vial was removed from the container, sealed and stored at 4 ° C for 5 days. After the period, the grapes were lyophilized.
  • Example 3 Extraction of resveratrol and quercetin in treated and untreated red grapes
  • Samples of lyophilized grapes according to example 2 were extracted with a mixture of MeOH / H 2 0 in 80/20 proportion at room temperature using a blender for 5 min .
  • a volume of 20 ml of solvent per gram of sample was used.
  • the two extracts obtained were combined, evaporating the solvent in vacuo using a rotary evaporator.
  • the final dry extract was dissolved in MeOH for analysis by liquid chromatography.
  • the extract according to example 3 was filtered using a 0.22 pm pore size filter. It was subsequently injected into HPLC using a 100 ⁇ syringe.
  • the equipment used was an LC Waters model 996, equipped with an automatic injector and diode array detector (DAD). The separation was carried out in reverse phase using a column 250 mm long and 4.6 mm long. internal diameter and 5 pm of phase thickness (C18, ACE, Madrid, Spain). A mixture of H 2 0 with 1% formic acid (solvent A) and AcCN (solvent B) was used as the mobile phase.
  • the applied flow was 1 ml / min throughout the analysis.
  • the program used began with a Socratic composition of 5:95 of A: B during the 10 min of analysis to move to 10:90 over 15 min, at 15:85 in the next 10 min to finally finish in 25 : 75 for the next 20 min.
  • the final conditions were maintained for 10 min. Subsequently, it returned to the initial ratio of 5:95 which was maintained for 15 min to ensure cleanliness and stability between chromatographic analyzes.
  • the signal was recorded at 304 and 348 nm to detect resveratrol and the three compounds derived from quercetin, respectively.
  • To carry out the identification a calibration line was prepared with model solutions between 0.00006 mg / l and 0.25 mg / l. In all cases, retention times were compared with those provided by the standards under the same experimental conditions. An exception was quercetin-O-rutinoside, which had to be identified by mass spectrometry (MS), as described below, due to the lack of availability of the commercial standard.
  • MS mass spectrometry
  • the extract according to example 3 was filtered with a 0.22 pm pore size filter and introduced into the liquid chromatograph.
  • the equipment used was an Agilent Model 1 100 LC equipped with two detectors, a DAD and an MS with an electrospray.
  • the separation was carried out in reverse phase using a column of 250 mm in length and 4.6 mm in internal diameter and 5 pm in phase thickness (C18, ACE, Madrid, Spain).
  • As a mobile phase a mixture of H 2 0 with 1% formic acid (solvent A) and AcCN (solvent B) was used.
  • the applied flow was 1 ml / min throughout the analysis.
  • the elution program used was the same as indicated in example 3.
  • the mass spectra were recorded both positively and negatively by applying a voltage gradient from 200 m / z to 3000 m / z.
  • the nebulizer pressure was set at 55 psi. 4.3. Phenol concentration in treated and untreated red grapes

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Abstract

La presencia de compuestos polifenólicos en uvashace que su consumo presente múltiples efectos beneficiosos para la salud. La presente invención plantea por primera vez un sencillo procedimiento post-cosecha, que comprende poner en contacto de forma exógena uvas tintas con un enantiómero de JM diluido en etanol. Elprocedimiento planteadoconsigue el incremento simultáneo y sustancial de más de un compuesto fenólicocon actividad biológica saludable en uvas,que preferentemente son polifenoles y que más preferentemente sonresveratrol y formas de quercetina, y constituye una alternativa a los procedimientos que utilizan fitohormonas como agentes de activación.

Description

PROCEDIMIENTO PARA INCREMENTAR EL CONTENIDO DE FENOLES CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA EN UVAS TINTAS QUE COMPRENDE UN TRATAMIENTO EXÓGENO CON UN ENANTIOMERO DE JASMONATO DE METILO DILUIDO EN ETANOL
DESCRIPCIÓN
SECTOR DE LA TECNICA La presente invención se engloba dentro de los sectores de la alimentación y de la salud, ya que específicamente se refiere a un procedimiento para incrementar el contenido de fenoles con actividad biológica saludable en uvas tintas previamente cosechadas, preferentemente polifenoles, y más preferentemente resveratrol y distintas formas de quercetina, y que comprende un tratamiento exógeno con un enantiómero de jasmonato de metilo diluido en etanol.
ESTADO DE LA TÉCNICA La presencia de compuestos bioactivos en las uvas hace que su consumo presente múltiples efectos beneficiosos para la salud. Así, son conocidos sus efectos antiinflamatorios, su capacidad para prevenir el desarrollo de enfermedades cardiovasculares y la diabetes, y singularmente, su efecto anticancerígeno.
De entre los compuestos bioactivos presentes en la uva, cabe destacar los polifenoles, empezando por el resveratrol, del que este fruto es considerado una de las principales fuentes y que se caracteriza por su actividad antitumoral. Otro polifenol presente en la uva en cantidades minoritarias es la quercetina, tanto libre como en sus diferentes formas, que posee también importantes propiedades biológicas. Tales son los efectos beneficiosos para la salud de estos polifenoles bioactivos presentes en la uva que su extracto se comercializa desde hace años como suplemento alimenticio. De igual forma, existen también en el mercado suplementos nutricionales de resveratrol y quercetina, los cuales son suministrados de forma individual o combinados.
En el estado de la técnica se identifican documentos que se refieren a procedimientos para incrementar el contenido de polifenoles en tejidos vegetales o alimentos mediante el uso de agentes de activación.
Un agente de activación frecuentemente utilizado es el jasmonato de metilo (JM) que es una fitohormona que existe de forma endógena en las plantas superiores y que tiene múltiples funciones. Así por ejemplo, es posible encontrar documentos que se refieren al uso de JM en cultivos in vitro (US7666677; Nopo-Olazabal et al. , J. Agrie. Food Chem. 2013, 61 , 1 1744-1 1758); o al uso de JM combinado con otros compuestos como las ciclodextrinas también en cultivos in vitro (WO2009106662A1 ).
Por otra parte, es posible encontrar documentos que se refieren a la aplicación precosecha de JM sobre la planta para incrementar el contenido en compuestos con actividad antioxidante. Por ejemplo, antocianinas y flavonoles que incluyen el O-glucosido de quercetina en uvas (Ruiz-García y col. , J. Agrie. Food Chem. 2012, 60, 1283-1290); o actividad antioxidante y contenido de compuestos fenólicos en zarzamora y frambuesas (Wang y col. , Food Chem. 2008, 107, 1261 -1269).
Por el contrario, otros documentos se refieren a la aplicación postcosecha de JM directamente sobre el fruto para incrementar, por ejemplo, quercetina en col (Khang y Liang, Biochem & Pharmacol. 1997, 54, 1013-1018); carotenos y clorofilas en manzanas y tomates (Pérez y col. , J. Plant Growth Regulat. 1993, 12, 163-167; Saniewski y Czapski, Experientia. 1983, 39, 1373-1374); la capacidad antioxidante de frambuesas (Chanjirakul y col. , Postharvest Biol. Technol. 2006, 40, 106-1 15); o para favorecer la biosíntesis de resveratrol en uva (Vezzulli y col., Am. J. Enol. Vitic, 2007, 58, 530-533.).
Sin embargo, la forma de JM que se utiliza mayoritariamente en los tratamientos de alimentos y tejidos vegetales referidos es la mezcla estereoisomérica de JM comercial, que contiene un 5% de (-)- y (+)-ep¡JM y un 95% de (-)- y (+)-JM.
En el conocimiento de los inventores son muy pocos los documentos que se refieren al uso de enantiomeros de JM en este tipo de tratamientos. Véase de la Peña Moreno y col. (J. Agrie. Food Chem., 2010. 58, 1 1639-1 1644) que se refiere el tratamiento postcosecha de frambuesas con (+)-JM y de (-)-JM; y de la Peña Moreno y col. {Eur. Food Res. Technol. 2010, 231 , 829-834) que se refiere el uso de los mismos enantiomeros para la modificación de compuestos volátiles en fresas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
Constituye un aspecto de la invención un procedimiento para incrementar simultáneamente el contenido de más de un compuesto fenólico con actividad biológica saludable en uvas tintas que comprende: a) poner en contacto las uvas tintas previamente cosechadas con un enantiómero de Jasmonato de Metilo (JM) diluido en etanol.
Adicionalmente, el procedimiento anterior comprende las siguientes etapas: b) someter al conjunto de la etapa (a) a una temperatura constante de entre
25 y 40 °C durante un período de tiempo de entre 20 y 30 horas; y posteriormente c) aislar herméticamente al conjunto de la etapa (b) y mantenerlo a una temperatura de entre 4 y 10 °C durante un período de tiempo de entre 0 y 7 días.
Preferentemente, el enantiómero de JM se selecciona de entre (-)-JM y (+)-JM y los compuestos fenólicos con actividad biológica saludable son polifenoles, que más preferentemente son resveratrol y distintas formas de quercetina. Descripción detallada de la invención
El problema técnico que resuelve la invención es conseguir una alternativa a los tratamientos post-cosecha con hormonas para conseguir el incremento de fenoles con actividad biológica saludable en uvas tintas. El procedimiento que se propone consigue que simultáneamente se incremente más de uno de estos compuestos fenólicos en uvas tintas, de forma significativamente superior a lo que se consigue utilizando otros tratamientos con hormonas conocidos en el estado de la técnica. Los inventores han descubierto que un tratamiento exógeno que comprende poner en contacto uvas tintas ya cosechadas y un enantiómero de JM diluido en etanol; mantener a temperatura ambiente constante durante 24 horas; y dejar reposar durante 5 días a una temperatura de 4o C (ver ejemplo 2), consigue aumentar la actividad de las enzimas implicadas en la bioformación simultánea de resveratrol y distintas formas de quercetina y, como consecuencia, conseguir una elevada acumulación de estos fenoles con actividad biológica saludable en el tejido de las uvas (ver ejemplo 4.3). El procedimiento propuesto referido exclusivamente a uvas tintas y los resultados obtenidos, se consideran novedosos y completamente inesperados ya que los escasos documentos presentes en el estado de la técnica que se refieren al tratamiento de otras frutas con enantiómeros de JM y con mezclas esteroisoméricas comerciales refieren resultados divergentes. Las principales ventajas del procedimiento de la invención se enumeran a continuación: a) permite incrementar simultánea y considerablemente el contenido de más de un fenol con actividad biológica saludable, obteniendo una uva funcional más completa; b) se trata de un procedimiento sencillo y económico puesto que no requiere ningún tipo de tecnología, ni personal cualificado para su manejo; c) se lleva a cabo una vez cosechadas las uvas; y d) el procedimiento es fácil de implementar por parte de cualquier industria.
Se sugiere que la actividad de los agentes de activación en cuanto al incremento de actividad de las enzimas implicadas en la bioformación de compuestos fenólicos con actividad biológica saludable, como son los polifenoles, y más concretamente el resveratrol y distintas formas de quercetina, es un proceso específico que se da entre cada agente de activación y el fruto o tejido vegetal sobre el cual se aplica.
Así por ejemplo, tal y como se recoge en el estado de la técnica, y como puede verse en la información resumida en la Tabla 1 sobre los incrementos de compuestos polifenólicos obtenidos mediante el tratamiento con la mezcla de esteroisómeros de JM comercial, cabría esperar que su aplicación en combinación con etanol sobre la uva tinta supusiese un incremento de la concentración de los compuestos que comprende la presente invención. Sin embargo, los inventores han descubierto (ver ejemplo 4.3) que no solo no produce cambios significativamente estadísticos en el contenido de polifenoles como el resveratrol, la quercetina-3-O-glucósido y la quercetina-3-O-rutinósido, sino que además produce una disminución significativa del contenido de la quercetina-3-O-galactósido.
Tabla 1 . Resumen bibliográfico sobre el incremento de compuestos fenólicos obtenidos mediante el tratamiento de alimentos vegetales con la mezcla estereoisomérica comercial de JM.
Figure imgf000007_0001
En la misma línea, de la Peña Moreno y col. (J. Agrie. Food Chem., 2010, 58, 1 1639-1 1644) obtuvieron incrementos de miricetina, quercetina y kaempferol en frambuesas utilizando el enantiómero (+)-JM, pero no apreciaron incrementos al utilizar el (-)-JM.
Se trata de datos divergentes a los que se presentan en este documento y que refuerzan el hecho de que los resultados obtenidos son totalmente inesperados al utilizar el procedimiento de la invención.
La invención se refiere a un procedimiento para incrementar simultáneamente el contenido de más de un compuesto fenólico con actividad biológica saludable en uvas tintas, que preferentemente son polifenoles y más preferentemente resveratrol y formas de quercetina, en adelante procedimiento de la invención, que comprende poner en contacto las uvas previamente cosechadas con un enantiomero de JM diluido en etanol.
Preferentemente, el enantiomero de JM diluido en etanol se introduce en un vial, y posteriormente se convierte en vapor que contacta con las uvas.
También preferentemente, las uvas y el enantiomero de JM se introducen en un recipiente que cuenta con un volumen tal que 2/3 del recipiente quedan ocupados por las uvas tintas y 1/3 queda libre para permitir la vaporización del JM.
El procedimiento de la invención se optimiza cuando inmediatamente tras poner en contacto las uvas previamente cosechadas y el enantiomero de JM diluido en etanol se llevan a cabo las siguientes etapas: b) se somete al conjunto anterior a una temperatura constante de entre 25 y 40 °C durante un período de tiempo de entre 20 y 30 horas; y posteriormente c) se aisla dicho conjunto herméticamente y se mantiene a una temperatura de entre 4 y 10 °C durante un período de tiempo de entre 0 y 7 días.
En la presente invención por "fenoles o compuestos fenólicos con actividad saludable" se entiende compuestos orgánicos cuya estructura molecular contiene al menos un grupo fenol y que poseen algún tipo de actividad biológica beneficiosa para el organismo. Compuestos fenólicos con actividad saludable que se incluyen en el ámbito de la invención son preferentemente polifenoles como flavonoles, antocianinas y taninos, y más preferentemente resveratrol y formas de quercetina.
Por "resveratrol" se entiende el 3, 5, 4-trihidroxi-trans-estilbeno, un tipo de compuesto polifenólico producido de forma natural por algunas plantas. Por "formas de quercetina" se entiende formas del compuesto 2-(3, 4)- dihidrox¡phen¡l)-3, 5, 7-trih¡drox¡-4H-cromen-4-ona, que es un flavonol que se encuentra en altas concentraciones tanto en frutas como en verduras. Aunque la quercetina puede estar presente en forma libre, sus formas más frecuentes son unidas a una molécula de un carbohidrato, concretamente como 0- glucósido, O-galactósido y O-rutinósido. De este modo, ejemplos de formas de quercetina que se incluyen dentro del ámbito del procedimiento de la invención, preferentemente se eligen de entre quercetina-3-O-glucósido, quercetina-3-Ο- galactósido y quercetina-3-O-rutinósido.
Por "agente de activación" se entiende aquel compuesto que cuando interactúa con un fruto o tejido vegetal activa o promueve la síntesis de otros compuestos existentes en dicho material. En el ámbito de la presente invención los agentes de activación son fitohormonas existentes en todas las plantas superiores, que intervienen en el crecimiento, senescencia y mecanismos de defensa contra el ataque de patógenos.
Ejemplos de uvas tintas, a título ilustrativo y no limitativo, que se incluyen en el ámbito del procedimiento de la invención son Bobal, Cabernet Franc, Cariñena, Garnacha tinta, Merlot, Tempranillo y Malbec.
El JM posee dos centros quirales en los carbonos 3 y 7 de la molécula. Esto implica que pueden existir cuatro configuraciones estereoisoméricas diferentes, es decir como dos parejas de enantiómeros distintos. Estas configuraciones se denominan (-)- y (+)-JM ((3R, 7R)- y (3S, 7S)-isómeros, respectivamente) y (-)- y (+)-epijasmonato de metilo (epiJM, (3R, 7R)- y (3R, 7S)-isómeros, respectivamente). Al igual que ocurre con todos los compuestos quirales, el carácter disimétrico de determinados receptores biológicos implica que la estereoquímica del JM sea el factor principal de la relación entre la estructura de la molécula y su actividad biológica.
El aislamiento de los enantiómeros que se utilizan en el procedimiento de la invención se realiza, por ejemplo, partiendo de una mezcla estereoisomérica de JM comercial, mediante HPLC preparativa utilizando una columna quiral empaquetada con β-ciclodextrina permetilada como fase estacionaria (ver ejemplo 1 ). Como el experto en el estado de la técnica sabrá es posible utilizar cualquier otra técnica que permita obtener dichos enantiomeros como por ejemplo, síntesis enantioselectiva.
Un ejemplo de enantiómero de JM que se utiliza en el procedimiento de la invención procede de una mezcla estereoisómérica de JM comercial, que comprende un 5% de (-)- y (+)-ep¡JM y 95% de (-)- y (+)-JM y que se aisla mediante HPLC preparativa utilizando una columna quiral empaquetada con β- ciclodextrina permetilada como fase estacionaria.
La relación preferente de enantiómero de JM diluido en 1 mi de etanol por cada gramo de uva tinta que se utiliza en el procedimiento de la invención es de entre 0.005 y 0.1 μΙ.
En una realización particular, la relación de enantiómero de JM diluido en 1 mi de etanol por cada gramo de uva tinta es de 0.025 μΙ. Preferentemente, el enantiómero de JM se selecciona de entre (-)-JM y (+)-JM.
El enantiómero que se utiliza en el procedimiento de la invención comprende un alto grado de pureza, que preferentemente es superior al 95%. Sin embargo, en el ámbito de la invención también se incluyen enantiomeros con grados inferiores de pureza.
En otra realización particular, la temperatura que se utiliza en la etapa (b) del procedimiento de la invención es 25°C y el período de tiempo son 24 horas.
Alternativamente se retira el vial en el que se introduce el enantiómero de JM diluido en etanol antes de iniciar la etapa (c) del procedimiento de la invención. En otra realización particular, la etapa (c) del procedimiento de la invención se lleva a cabo durante 5 días y a una temperatura de 4°C.
En otra realización particular, el procedimiento de la invención que comprende utilizar un enantiómero que es (-)-JM y uvas tintas de la variedad Red Globe, consigue un incremento de resveratrol superior al 125 %; de quercetina-3-Ο- glucósido superior al 350 %; de quercetina-3-O-galactósido superior al 130 %; y de quercetina-3-O-rutinósido superior al 125 %, refiriéndose los porcentajes al contenido de la muestra sin tratar.
En otra realización particular, el procedimiento de la invención que comprende utilizar un enantiómero que es (+)-JM y uvas tintas de la variedad Red Globe, consigue un incremento de quercetina-3-O-glucósido superior al 75 %; y de quercetina-3-O-rutinósido superior al 80 %, refiriéndose los porcentajes al contenido de la muestra sin tratar.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas. Para el experto en la materia, otros aspectos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1. Aislamiento de enantiómeros de JM
Los enantiómeros puros de JM: (-)- y (+)- de JM, fueron separados y aislados a partir del compuesto comercial formado por la mezcla estereoisomérica, (Sigma-Aldrich; Steinheim, Alemania) según el procedimiento descrito en Flores y col. {Food Chem., 2013, 141 , 2982-2987) que se basa en técnicas de HPLC a escala preparativa y que permiten resolver cromatográficamente los cuatro estereoisómeros de JM hasta línea base.
Se utilizó una columna de 30 m de longitud y 20 mm de diámetro interno, empaquetada con un espesor de 5 pm de β-ciclodextrina permetilada, la cual fue utilizada como fase estacionaria quiral. Se partió de una disolución de 50 mg de JM comercial en 10 mi de etanol y se introdujeron 1500 μΙ de esta disolución en el cromatógrafo. Se recogió un volumen de 23.4 mi y 31 .2 mi de las fracciones de (-)-JM y (+)-JM respectivamente en el disolvente de elución MeOH/H20 y en viales independientes. Las cantidades aisladas de cada uno de ellos fueron 3.56 mg respectivamente.
Las fracciones anteriores se sometieron a extracción en fase sólida (SPE) en fase inversa, utilizando C18 como material de empaquetamiento y eluyendo con 2 mi de etanol. El exceso de etanol fue evaporado a vacío en un rotavapor hasta un volumen final de 1 mi. De esta forma se aislaron los cuatro estereoisómeros de JM disueltos en etanol. En concreto, se recogieron 3.56 mg de (-)- y (+)-JM, respectivamente y 0.1 8 mg de (-)- y (+)-ep¡JM. La pureza con la que se aislaron fue 96.1 %, 98.6%, 91 .6% y 99.9% para (-)-JM, (-)-epiJM, (+)- epiJM y (+)-JM, respectivamente.
Ejemplo 2. Tratamiento de uvas tintas cosechadas utilizando el procedimiento de la invención
160 g de uvas tintas de la variedad Red Globe se colocaron en un recipiente de vidrio de 1 L de capacidad, en cuyo interior se introdujo un vial abierto de 1 mi de capacidad. El recipiente cuenta con un volumen tal que 2/3 del recipiente quedan ocupados por las uvas tintas y 1 /3 queda libre para permitir la vaporización del JM. Se realizaron cuatro tratamientos diferentes: el primero introduciendo 0.025 μΙ del enantiómero (-)-JM diluido en 1 mi de etanol en el vial; el segundo introduciendo 0.025 μΙ del enantiómero (+)-JM diluido en 1 mi de etanol en el vial; el tercero introduciendo 0.050 μΙ de la mezcla estereoisomérica comercial en el vial, diluido en 1 mi de etanol; el cuarto sin vial de JM a modo de control.
Cada recipiente de vidrio abierto se colocó en el interior de un horno con la temperatura termostatizada a 25°C, la cual se mantuvo durante 24 h dejando actuar el vapor de JM sobre las uvas. Pasado este tiempo, se retiró el vial de enantiomero de JM del recipiente, se cerró herméticamente y se almacenó a 4°C durante 5 días. Una vez transcurrido el período las uvas fueron liofilizadas.
Ejemplo 3. Extracción de resveratrol y quercetina en uvas tintas tratadas y sin tratar Muestras de las uvas liofilizadas según el ejemplo 2, se extrajeron con una mezcla de MeOH/H20 en proporción 80/20 a temperatura ambiente utilizando una batidora durante 5 min. Para la extracción se utilizó un volumen de 20 mi de disolvente por gramo de muestra. Para asegurar la extracción completa de resveratrol y de la formas de quercetina, el procedimiento se repitió dos veces. Los dos extractos obtenidos se juntaron, evaporando el disolvente a vacío utilizando un rotavapor. El extracto final seco se disolvió en MeOH para su análisis por cromatografía de líquidos.
Ejemplo 4. Determinación y cuantificación de compuestos bioactivos
4.1. Resveratrol y formas de quercetina en uvas tintas tratadas y sin tratar
El extracto según el ejemplo 3 se filtró utilizando un filtro de 0.22 pm de tamaño de poro. Posteriormente se inyectó en HPLC utilizando una jeringa de 100 μΙ. El equipo utilizado fue un LC Waters modelo 996, provisto de un inyector automático y detector de diode array (DAD). La separación se llevó a cabo en fase inversa utilizando una columna de 250 mm de longitud y 4.6 mm de diámetro interno y 5 pm de espesor de fase (C18, ACE, Madrid, España). Como fase móvil se empleó una mezcla de H20 con 1 % de ácido fórmico (disolvente A) y AcCN (disolvente B). El flujo aplicado fue 1 ml/min durante todo el análisis.
El programa utilizado comenzó con una composición ¡socrática de 5:95 de A: B durante los 10 min de análisis para pasar a 10:90 a lo largo de 15 min, a 15:85 en los siguientes 10 min para terminar finalmente en 25:75 durante los siguientes 20 min. Las condiciones finales se mantuvieron durante 10 min. Posteriormente, se volvió a la proporción inicial de 5:95 la cual se mantuvo durante 15 min para garantizar la limpieza y estabilidad entre análisis cromatográficos. Se registró la señal a 304 y 348 nm para detectar resveratrol y los tres compuestos derivados de quercetina, respectivamente. Para realizar la identificación se preparó una recta de calibrado con disoluciones modelo comprendidas entre 0.00006 mg/l y 0.25 mg/l. En todos los casos se compararon los tiempos de retención con aquéllos proporcionados por los patrones en las mismas condiciones experimentales. Una excepción fue la quercetina-O-rutinósido, la cual tuvo que ser identificada por espectrometría de masas (MS), tal y como se describe a continuación, debido a la falta de disponibilidad del patrón comercial.
La cuantificación de los cuatro compuestos se llevó a cabo interpolando en la recta de calibrado realizada para cada compuesto. Cada inyección se realizó en triplicado. 4.2. Quercetina-O-rutinósido en uvas tintas tratadas y sin tratar
El extracto según el ejemplo 3 se filtró con un filtro de 0.22 pm de tamaño de poro y se introdujo en el cromatógrafo de líquidos. El equipo utilizado fue un LC Agilent modelo 1 100 equipado con dos detectores, un DAD y un MS con inferíase de electrospray. La separación se llevó a cabo en fase inversa utilizando una columna de 250 mm de longitud y 4.6 mm de diámetro interno y 5 pm de espesor de fase (C18, ACE, Madrid, España). Como fase móvil se utilizó una mezcla de H20 con 1 % de ácido fórmico (disolvente A) y AcCN (disolvente B). El flujo aplicado fue de 1 ml/min durante todo el análisis. El programa de elución utilizado fue el mismo que se indica en el ejemplo 3. Los espectros de masas se registraron tanto en positivo como en negativo aplicando un gradiente de voltaje desde 200 m/z hasta 3000 m/z. La presión del nebulizador fue fijada en 55 psi. 4.3. Concentración de fenoles en uvas tintas tratadas y sin tratar
Los valores obtenidos y los resultados del tratamiento estadístico de análisis de varianzas mediante ANOVA considerando como diferencias significativas aquellas determinadas por el test de Student, se recogen en la tabla 2.
Tabla 2. Concentración de compuestos fenólicos con actividad biológica saludable presentes en el extracto de uva tratadas según el procedimiento de la invención ( g de compuesto fenólico / g uva)
Muestras Resveratrol quercetina- quercetina-3- quercetina-3-
3-0- O- O-rutinósido glucósido galactósido
Uvas sin tratar (control) 27.4 ± 0.9 398.9 ± 0.7 58.9 ± 0.5 23.3 ± 0.6
Uvas tratadas con la 22.3 ± 0.8 387.7 ± 0.5 21 .5 ± 0.9 17.6 ± 0.3 mezcla esteroisomérica
de JM comercial
Uvas tratadas con (-)- 38.9 ± 1 .0 807.6 ± 1 .0 136.4± 0.8 43.6 ± 0.7
JM
Uvas tratadas con (+)- 21 .5 ± 0.6 692.7 ± 0.7 58.9 ± 0.6 51 .7 ± 0.8
JM

Claims

REIVINDICACIONES
1 .- Procedimiento para incrementar simultáneamente el contenido de más de un compuesto fenólico con actividad biológica saludable en uvas tintas que comprende: a) poner en contacto las uvas tintas previamente cosechadas con un enantiómero de Jasmonato de Metilo (JM) diluido en etanol.
2.- Procedimiento según la reivindicación 1 , donde el enantiómero de JM diluido en etanol se introduce en un vial y postenormente se vaporiza y contacta con las uvas.
3.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, donde las uvas tintas y el enantiómero de JM diluido en etanol se introducen en un recipiente que cuenta con un volumen tal que 2/3 del recipiente quedan ocupados por las uvas tintas y 1 /3 queda libre para permitir la vaporización del JM.
4.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, que adicionalmente comprende las siguientes etapas: b) someter al conjunto de la etapa (a) a una temperatura constante de entre 25 y 40 °C durante un período de tiempo de entre 20 y 30 horas; y c) aislar herméticamente al conjunto de la etapa (b) y mantenerlo a una temperatura de entre 4 y 10 °C durante un período de tiempo de entre 0 y 7 días.
5.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el enantiómero de JM se utiliza en una relación de entre 0.005 y 0.1 μΙ diluido en 1 mi de etanol por cada gramo de uva.
6.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el enantiomero de JM se utiliza en una relación de 0.025 μΙ diluido en 1 mi de etanol por cada gramo de uva.
7.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el enantiomero de JM se selecciona de entre (-)-JM y (+)-JM.
8. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el enantiomero de JM comprende un grado de pureza superior al 95%.
9. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la etapa (b) tiene lugar a una temperatura de 25°C durante un período de tiempo de 24 horas.
10.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde se retira el vial previamente a la etapa (c).
1 1 . - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 0, donde la etapa (c) se lleva a a una temperatura de 4°C durante 5 días.
12. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , donde los compuestos fenólicos son polifenoles.
13. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde los polifenoles son resveratrol y formas de quercetina.
14. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde las formas de quercetina son quercetina-3-O-glucósido, quercetina-3-Ο- galactósido y quercetina-3-O-rutinósido.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108184990A (zh) * 2018-02-09 2018-06-22 江苏沿海地区农业科学研究所 一种利用茉莉酸甲酯延长冷藏黄瓜保鲜期的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2256209A1 (en) * 2008-02-29 2010-12-01 Universidad De Alicante Combined use of methyl jasmonate and cyclodextrins for the production of resveratrol

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2256209A1 (en) * 2008-02-29 2010-12-01 Universidad De Alicante Combined use of methyl jasmonate and cyclodextrins for the production of resveratrol

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERNANDEZ-MARIN M I ET AL.: "Isorhapontigenin: A novel bioactive stilbene from wine grapes''.", FOOD CHEMISTRY, vol. 135, no. 3, 2012, pages 1353 - 1359, XP028935605, ISSN: 0308-8146 *
FLORES G ET AL.: "Isolation of the four methyl jasmonate stereoisomers and their effects on selected chiral volatile compounds in red raspberries", FOOD CHEMISTRY, vol. 141, 2013, pages 2982 - 2987, XP028678959, Retrieved from the Internet <URL:http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.05.117> *
RUÍZ-GARCÍA Y ET AL.: "Elicitors: A Tool for Improving Fruit Phenolic Content", AGRICULTURE, vol. 3, 2013, pages 33 - 52, XP055230379, ISSN: 2077-0472 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108184990A (zh) * 2018-02-09 2018-06-22 江苏沿海地区农业科学研究所 一种利用茉莉酸甲酯延长冷藏黄瓜保鲜期的方法

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