WO2015151349A1 - そばアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途 - Google Patents

そばアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途 Download PDF

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WO2015151349A1
WO2015151349A1 PCT/JP2014/083351 JP2014083351W WO2015151349A1 WO 2015151349 A1 WO2015151349 A1 WO 2015151349A1 JP 2014083351 W JP2014083351 W JP 2014083351W WO 2015151349 A1 WO2015151349 A1 WO 2015151349A1
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nucleic acid
acid molecule
allergen
buckwheat
buckwheat allergen
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PCT/JP2014/083351
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English (en)
French (fr)
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朋子 横山
行大 白鳥
克紀 堀井
宏貴 皆川
穣 秋冨
金子　直人
嘉仁 吉田
巌 和賀
Original Assignee
Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid molecules that bind to buckwheat allergens and uses thereof.
  • Soba is a food that is frequently consumed on a daily basis, but in recent years, the number of soba allergy patients has increased and is regarded as a problem. Many processed foods such as bread and noodles use soba, so it is very important to analyze whether soba is mixed as a raw material in processed foods and their production lines. .
  • Allergic allergens are generally proteins and their degradation products (peptides), and analysis methods using antibodies using these as antigens are the mainstream.
  • Fag e 2 which is a buckwheat protein
  • its gene has been cloned (Non-patent Document 4)
  • epitope analysis using patient IgE has been performed (Non-patent Document). 5).
  • Reported methods include, for example, a method using PCR (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2), a method using an antibody (Non-Patent Document 3), and the like.
  • an antibody is a protein and has a problem in stability, it is difficult to use the antibody for a simple test method at a low cost. For this reason, in recent years, attention has been focused on nucleic acid molecules that specifically bind to antigens instead of antibodies. However, no nucleic acid molecule for buckwheat allergen has been reported so far.
  • an object of the present invention is to provide a new nucleic acid molecule that can be used for the detection of buckwheat allergen.
  • the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule having a dissociation constant for buckwheat allergen of 60 nM or less.
  • the buckwheat allergen analysis sensor of the present invention comprises the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the method for analyzing buckwheat allergen of the present invention comprises contacting a buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention with a sample and binding the buckwheat allergen in the sample to the nucleic acid molecule, thereby A step of detecting.
  • the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention can bind to buckwheat allergen with the dissociation constant as described above. For this reason, according to the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention, for example, buckwheat allergen can be detected with excellent accuracy based on the presence or absence of binding to the buckwheat allergen in the sample. Therefore, the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention can be said to be a very useful tool for detecting buckwheat allergens in fields such as food production, food management, and food distribution.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a predicted secondary structure of the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a predicted secondary structure of the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of a predicted secondary structure of the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding ability between aptamer and buckwheat allergen in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the binding ability between aptamer and buckwheat allergen in Example 1 of the present invention.
  • the soba allergen is Fag e 2 or a subunit thereof.
  • the buckwheat allergen is a native allergen or a heat-denatured allergen.
  • the nucleic acid molecule of the present invention includes, for example, at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (d).
  • A a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-10
  • b one or several bases deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the nucleotide sequences of
  • a polynucleotide that binds to the buckwheat allergen (c) has a base sequence that has 80% or more identity to any of the base sequences of (a), and binds to the buckwheat allergen
  • D a polynucleotide comprising a complementary base sequence and binding to a buckwheat allergen to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising any one of the base sequences of (a) above nucleotide
  • the polynucleotide is DNA.
  • the analysis sensor of the present invention further includes, for example, a nucleic acid molecule that forms a G quartet structure.
  • the nucleic acid molecule forming the G quartet structure is DNAzyme or RNAzyme.
  • the analysis sensor of the present invention further includes porphyrin, for example.
  • the sample is at least one selected from the group consisting of food, food raw materials, and food additives.
  • the buckwheat allergen binding nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule having a dissociation constant for buckwheat allergen of 60 nM or less as described above.
  • the nucleic acid molecule of the present invention binds to, for example, Fag e 2, its subunit, or its domain, which is a major allergen of buckwheat.
  • the buckwheat allergen may be, for example, an unmodified allergen that is not denatured by heating or a denatured allergen that is denatured by heating.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can bind to any allergen.
  • the dissociation constant for the buckwheat allergen is, for example, 60 nM or less, 10 nM or less, or 3 nM or less.
  • the detection limit concentration of the buckwheat allergen is, for example, 6.25 nM, 12.5 nM, or 25 nM.
  • the nucleic acid molecule of the present invention has a dissociation constant with respect to the above-mentioned Fague 2 of, for example, 60 nM or less, 10 nM or less, or 3 nM or less.
  • the detection limit concentration of the above Flag e 2 is, for example, 6.25 nM, 12.5 nM, or 25 nM.
  • the binding between the nucleic acid molecule of the present invention and the buckwheat allergen can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • BioRad BioRad
  • the nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of (a) to (d) below, for example.
  • a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-10 (b) one or several bases deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the nucleotide sequences of (a)
  • a polynucleotide that binds to the buckwheat allergen (c) has a base sequence that has 80% or more identity to any of the base sequences of (a), and binds to the buckwheat allergen
  • D a polynucleotide comprising a complementary base sequence and binding to a buckwheat allergen to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising any one of the base sequences of (a) above nucleotide
  • the structural unit of the polynucleotide is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the polynucleotide is, for example, DNA composed of deoxyribonucleotide residues, DNA containing deoxyribonucleotide residues and ribonucleotide residues, and may further contain non-nucleotide residues.
  • the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention is hereinafter also referred to as a DNA aptamer, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of any of the polynucleotides (a) to (d) or a molecule containing the polynucleotide.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain two or more of any of the polynucleotides (a) to (d) as described later.
  • the two or more polynucleotides may have the same sequence or different sequences.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have, for example, a linker and / or an additional sequence.
  • the polynucleotide (a) is a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1-10 shown in Table 1 below.
  • SEQ ID NO: 2 is a miniaturized sequence of SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 4 is a miniaturized sequence of SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 6 is a miniaturized sequence of SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 8 is SEQ ID NO: 7 is a miniaturized sequence
  • SEQ ID NO: 10 is a miniaturized sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the underlined portion of SEQ ID NO: 1 indicates the region of SEQ ID NO: 2
  • the underlined portion of SEQ ID NO: 3 indicates the region of SEQ ID NO: 4
  • the underlined portion of SEQ ID NO: 5 indicates the region of SEQ ID NO: 6
  • the underlined portion of 7 indicates the region of SEQ ID NO: 8
  • the underlined portion of SEQ ID NO: 9 indicates the region of SEQ ID NO: 10.
  • the FAGE2191R8m1s24 (SEQ ID NO: 2), the FAGE2191R8m2 (SEQ ID NO: 3), the FAGE2191R8m2s32 (SEQ ID NO: 4), the FAGE2215NNHR8m1 (SEQ ID NO: 5), the FAGE2215NNHR8m1s30 (SEQ ID NO: 6), the FAGE2215NNHR8m2 (SEQ ID NO: 6)
  • the predicted secondary structures of the FAGE2215NNHR8m2s30 (SEQ ID NO: 8), the FAGE2215NNHR8m3 (SEQ ID NO: 9), and the FAGE2215NNHR8m3s33 (SEQ ID NO: 10) are shown in FIGS. 1-3, but are not limited thereto.
  • “one or several” may be in the range where the polynucleotide of (b) binds to the buckwheat allergen.
  • the “one or several” is, for example, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 3, 1 or 2 in any one of the base sequences of (a).
  • the numerical range of numbers such as the number of bases and the number of sequences, for example, discloses all positive integers belonging to the range. That is, for example, the description “1 to 5 bases” means all disclosures of “1, 2, 3, 4, 5 bases” (the same applies hereinafter).
  • the “identity” may be, for example, a range in which the polynucleotide (c) binds to the buckwheat allergen.
  • the identity is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • the identity can be calculated with default parameters using analysis software such as BLAST and FASTA (hereinafter the same).
  • the “hybridizable polynucleotide” is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the polynucleotide in (a).
  • the hybridization can be detected by, for example, various hybridization assays.
  • the hybridization assay is not particularly limited, for example, Zanburuku (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • the “stringent conditions” may be, for example, any of low stringent conditions, moderate stringent conditions, and highly stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
  • the degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, time, and the like.
  • “Stringent conditions” are, for example, Zanburuku previously described (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may include, for example, one of the polynucleotide sequences (a) to (d) or a plurality of the polynucleotide sequences. In the latter case, it is preferable that a plurality of polynucleotide sequences are linked to form a single-stranded polynucleotide.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be directly linked to each other or indirectly linked via a linker.
  • the polynucleotide sequences are preferably linked directly or indirectly at the respective ends.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be the same or different, for example.
  • sequences of the plurality of polynucleotides are preferably the same, for example.
  • the number of the sequences is not particularly limited, and is, for example, 2 or more, 2 to 20, 2 to 10, 2 or 3.
  • the linker is not particularly limited.
  • the length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases long, 1 to 20 bases long, 3 to 12 bases long, and 5 to 9 bases long.
  • the structural unit of the linker is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues.
  • linker examples include polydeoxythymine (poly dT), polydeoxyadenine (poly dA), poly dAdT which is a repeating sequence of A and T, and preferably poly dT and poly dAdT.
  • the polynucleotide is preferably a single-stranded polynucleotide.
  • the single-stranded polynucleotide is preferably capable of forming a stem structure and a loop structure by, for example, self-annealing.
  • the polynucleotide is preferably capable of forming a stem loop structure, an internal loop structure, and / or a bulge structure, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, double stranded.
  • one single-stranded polynucleotide includes any of the polynucleotides (a) to (d), and the other single-stranded polynucleotide is not limited.
  • the other single-stranded polynucleotide include a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any one of the polynucleotides (a) to (d).
  • the nucleic acid molecule of the present invention is double-stranded, it is preferably dissociated into a single-stranded polynucleotide by denaturation or the like prior to use.
  • the dissociated single-stranded polynucleotide of any one of (a) to (d) preferably has, for example, a stem structure and a loop structure as described above.
  • the stem structure and the loop structure can be formed means, for example, that the stem structure and the loop structure are actually formed, and even if the stem structure and the loop structure are not formed, the stem structure depending on the conditions. And the ability to form a loop structure.
  • a stem structure and a loop structure can be formed includes, for example, both experimental confirmation and prediction by a computer simulation.
  • the structural unit of the nucleic acid molecule of the present invention is, for example, a nucleotide residue.
  • the nucleotide residue include deoxyribonucleotide residue and ribonucleotide residue.
  • Examples of the nucleic acid molecule of the present invention include DNA composed only of deoxyribonucleotide residues, DNA containing one or several ribonucleotide residues, and the like. In the latter case, “one or several” is not particularly limited. For example, in the polynucleotide, for example, 1 to 91, 1 to 30, 1 to 15, 1 to 7, 1 to 3 One or two.
  • the polynucleotide may include a modified base.
  • the modified base is not particularly limited, and examples thereof include a base modified with a natural base (non-artificial base), and preferably has the same function as the natural base.
  • the natural base is not particularly limited, and examples thereof include a purine base having a purine skeleton and a pyrimidine base having a pyrimidine skeleton.
  • the purine base is not particularly limited, and examples thereof include adenine (a) and guanine (g).
  • the pyrimidine base is not particularly limited, and examples thereof include cytosine (c), thymine (t), uracil (u) and the like.
  • the base modification site is not particularly limited.
  • examples of the purine base modification site include the 7th and 8th positions of the purine skeleton.
  • examples of the modification site of the pyrimidine base include the 5th and 6th positions of the pyrimidine skeleton.
  • modified uracil or modified thymine when “ ⁇ O” is bonded to carbon at position 4 and a group other than “—CH 3 ” or “—H” is bonded to carbon at position 5, it is called modified uracil or modified thymine. Can do.
  • the modifying group of the modifying base is not particularly limited, and examples thereof include a methyl group, a fluoro group, an amino group, a thio group, a benzylaminocarbonyl group represented by the following formula (1), and a tryptaminocarbonyl represented by the following formula (2).
  • the modified base is not particularly limited.
  • modified adenine modified with adenine, modified thymine modified with thymine, modified guanine modified with guanine, modified cytosine modified with cytosine and modified modified with uracil examples include uracil and the like, and the modified thymine, the modified uracil and the modified cytosine are preferable.
  • modified adenine examples include 7'-deazaadenine and the like.
  • modified guanine examples include, for example, 7'-deazaguanine.
  • modified cytosine examples include 5'-methylcytosine (5-Me-dC).
  • modified thymine examples include 5'-benzylaminocarbonylthymine, 5'-tryptaminocarbonylthymine, 5'-isobutylaminocarbonylthymine and the like.
  • modified uracil examples include 5'-benzylaminocarbonyluracil (BndU), 5'-tryptaminocarbonyluracil (TrpdU), 5'-isobutylaminocarbonyluracil and the like.
  • the exemplified modified uracil can also be referred to as a modified base of thymine.
  • the polynucleotide may contain, for example, only one of the modified bases or two or more kinds of the modified bases.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, a modified nucleotide.
  • the modified nucleotide may be a nucleotide having the modified base described above, a nucleotide having a modified sugar in which a sugar residue is modified, It may be a nucleotide having a modified base and the modified sugar.
  • the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include deoxyribose residue or ribose residue.
  • the modification site in the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include the 2'-position and the 4'-position of the sugar residue, and both of them may be modified.
  • Examples of the modifying group of the modified sugar include a methyl group, a fluoro group, an amino group, and a thio group.
  • the base when the base is a pyrimidine base, for example, the 2'-position and / or the 4'-position of the sugar residue is preferably modified.
  • Specific examples of the modified nucleotide residue include, for example, a 2′-methylated-uracil nucleotide residue and a 2′-methylated-cytosine nucleotide residue in which the deoxyribose residue or the 2 ′ position of the ribose residue is modified.
  • the number of the modified nucleotides is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100, 1 to 90, 1 to 80, 1 to 70 in the polynucleotide.
  • the modified nucleotides in the full length of the nucleic acid molecule including the polynucleotide are not particularly limited, and are, for example, 1 to 91 or 1 to 78, preferably the same as the above-mentioned range.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, one or several artificial nucleic acid monomer residues.
  • the “one or several” is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 30, or 1 to 10 in the polynucleotide.
  • Examples of the artificial nucleic acid monomer residue include PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids) and the like.
  • the nucleic acid in the monomer residue is the same as described above, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is preferably nuclease resistant, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention preferably has, for example, the modified nucleotide residue and / or the artificial nucleic acid monomer residue for nuclease resistance. Since the nucleic acid molecule of the present invention is nuclease resistant, for example, tens of kDa PEG (polyethylene glycol) or deoxythymidine may be bound to the 5 'end or 3' end.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have an additional sequence, for example.
  • the additional sequence is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule, and more preferably the 3 'end.
  • the additional sequence is not particularly limited.
  • the length of the additional sequence is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases long, 1 to 50 bases long, 1 to 25 bases long, or 18 to 24 bases long.
  • the structural unit of the additional sequence is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the additional sequence is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues. Specific examples of the additional sequence include poly dT and poly dA.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used, for example, immobilized on a carrier.
  • a carrier for example, either the 5 'end or the 3' end is preferably immobilized, and more preferably the 3 'end.
  • the nucleic acid molecule may be immobilized directly or indirectly on the carrier. In the latter case, for example, it is preferable to immobilize via the additional sequence.
  • the method for producing the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, and can be synthesized by, for example, a genetic engineering technique such as a nucleic acid synthesis method using chemical synthesis or a known method.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can also be obtained, for example, by the so-called SELEX method.
  • the target is preferably Flag e 2 which is a buckwheat allergen.
  • the nucleic acid molecule of the present invention exhibits binding property to the buckwheat allergen.
  • the use of the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited as long as it uses the binding property to the buckwheat allergen.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used in various methods, for example, instead of the antibody against the buckwheat allergen.
  • the sensor for buckwheat allergen analysis of the present invention includes the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention as described above.
  • the sensor of the present invention only needs to include the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention, and other configurations are not limited at all.
  • the sensor of the present invention becomes active when the buckwheat allergen binds to the buckwheat allergen binding nucleic acid molecule, and becomes inactive when the buckwheat allergen binding nucleic acid molecule does not bind to the buckwheat allergen binding nucleic acid molecule.
  • a nucleic acid molecule for detecting binding that detects the binding may be further included.
  • the binding of the buckwheat allergen to the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule depends on whether the nucleic acid molecule for binding detection is an active type or an inactive type. The presence / absence of the allergen can be confirmed.
  • binding detection nucleic acid molecule examples include a nucleic acid molecule that forms a G quartet structure.
  • the nucleic acid molecule that forms the G-culted structure is, for example, an active type when a G-culted structure is formed, and an inactive state when a G-culted structure is not formed.
  • nucleic acid molecule forming the G quartet structure examples include DNAzyme and RNAzyme, and preferably DNAzyme.
  • An active DNAzyme having a G-culted structure exhibits a peroxidase-like activity that catalyzes a redox reaction, for example. Therefore, when the sensor of the present invention has DNAzyme, the presence or amount of the buckwheat allergen bound to the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule can be analyzed by detecting the catalytic activity of the DNAzyme.
  • the sensor of the present invention coexists, for example, porphyrin.
  • the porphyrin is not particularly limited, and examples thereof include unsubstituted porphyrin and derivatives thereof.
  • the derivatives include substituted porphyrins and metal porphyrins complexed with metal elements.
  • Examples of the substituted porphyrin include N-methylmesoporphyrin.
  • Examples of the metal porphyrin include hemin, which is a trivalent iron complex.
  • the porphyrin is, for example, preferably the metal porphyrin, more preferably hemin.
  • active DNAzyme having a G-culted structure generates fluorescence by forming a complex with porphyrin, for example. Therefore, when the sensor of the present invention has DNAzyme, binding of the buckwheat allergen to the buckwheat allergen binding nucleic acid molecule by detecting the fluorescence due to the complex formation of the DNAzyme and the porphyrin in the presence of the porphyrin The presence or absence or the amount of binding can be analyzed.
  • the porphyrin is not particularly limited, and for example, N-methylmesoporphyrin (NMM), Zn-DIGP, ZnPP9, and TMPyP are preferable.
  • the sensor of the present invention may further include a labeling substance, for example.
  • the labeling substance is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule, and more preferably the 5 'end.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent substances, dyes, isotopes and enzymes. Examples of the fluorescent substance include pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy3 dye, Cy5 dye, FAM dye, rhodamine dye, Texas red dye, JOE, MAX, HEX, TYE and the like, and the dye includes, for example, And Alexa dyes such as Alexa 488 and Alexa 647.
  • the labeling substance may be linked directly to the nucleic acid molecule or indirectly via a linker, for example.
  • the linker is not particularly limited, and for example, the above examples can be used.
  • the analysis method of the present invention is a method for analyzing buckwheat allergen, wherein the sample is brought into contact with the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention, and the buckwheat allergen in the sample is The method includes a step of detecting buckwheat allergen in the sample by binding to a nucleic acid molecule.
  • the analysis method of the present invention is characterized by using the nucleic acid molecule of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the buckwheat allergen analysis sensor of the present invention may be used as the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to buckwheat allergen, for example, by detecting the binding of buckwheat allergen and the nucleic acid molecule, the buckwheat allergen in the sample is specifically detected. Can be detected. Specifically, for example, the presence or absence of buckwheat allergen in the sample or the amount of buckwheat allergen can be analyzed, so that it can be qualitatively or quantitatively possible.
  • the sample is not particularly limited.
  • the sample include foods, food materials, food additives, and the like.
  • Examples of the sample include a deposit in a food processing shop or a cooking place, a cleaning liquid after cleaning, and the like.
  • the sample may be, for example, a liquid sample or a solid sample.
  • the sample is preferably a liquid sample because it is easy to contact with the nucleic acid molecule and is easy to handle.
  • a mixed solution, an extract, a dissolved solution, and the like may be prepared using a solvent and used.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
  • the detection step for example, a contact step in which the sample and the nucleic acid molecule are brought into contact with each other to bind the buckwheat allergen in the sample and the nucleic acid molecule, and a binding between the buckwheat allergen and the nucleic acid molecule is detected.
  • the detection step further includes, for example, a step of analyzing the presence or amount of buckwheat allergen in the sample based on the result of the binding detection step.
  • the method for contacting the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact between the sample and the nucleic acid molecule is preferably performed in a liquid, for example.
  • the liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
  • the contact condition between the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact temperature is, for example, 4 to 37 ° C. or 18 to 25 ° C.
  • the contact time is, for example, 10 to 120 minutes or 30 to 60 minutes.
  • the nucleic acid molecule may be, for example, an immobilized nucleic acid molecule immobilized on a carrier or an unfixed free nucleic acid molecule.
  • the sample is contacted in a container.
  • the nucleic acid molecule is preferably, for example, the immobilized nucleic acid molecule because of its excellent handleability.
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include a substrate, a bead, and a container. Examples of the container include a microplate and a tube.
  • the nucleic acid molecule is immobilized as described above, for example.
  • the binding detection step is a step of detecting the binding between the buckwheat allergen in the sample and the nucleic acid molecule as described above.
  • the presence or absence of binding between the two for example, the presence or absence of buckwheat allergen in the sample can be analyzed (qualitative), and by detecting the degree of binding (binding amount) between the two, for example, The amount of buckwheat allergen in the sample can be analyzed (quantified).
  • the binding between the buckwheat allergen and the nucleic acid molecule cannot be detected, it can be determined that the buckwheat allergen is not present in the sample, and if the binding is detected, the buckwheat allergen is present in the sample. It can be judged.
  • the method for analyzing the binding between the buckwheat allergen and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • a conventionally known method for detecting the binding between substances can be adopted, and specific examples include the above-mentioned SPR, fluorescence polarization method and the like.
  • the binding may be, for example, detection of a complex of the buckwheat allergen and the nucleic acid molecule.
  • the detection of the binding between the buckwheat allergen and the nucleic acid molecule by the fluorescence polarization method can be performed, for example, as follows.
  • the fluorescence polarization method is generally characterized in that when the labeling substance is irradiated with polarized excitation light, the fluorescence emitted from the labeling substance exhibits different degrees of polarization depending on the molecular weight of the molecule labeled with the labeling substance.
  • Is a measurement method based on In the present invention for example, by using the nucleic acid molecule labeled with the labeling substance (labeled nucleic acid molecule), the binding between the buckwheat allergen and the nucleic acid molecule can be detected by the fluorescence polarization method. .
  • the former when the labeled nucleic acid molecule is compared with a state that is not bound to buckwheat allergen and a state that is bound to buckwheat allergen, the former has a relatively low molecular weight, and therefore has a relatively low degree of polarization.
  • the latter has a relatively high degree of polarization due to its relatively high molecular weight. Therefore, for example, by comparing the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule before contacting with the sample and the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule after contacting with the sample, the buckwheat allergen and the label Binding to the activated nucleic acid molecule can be detected.
  • the polarization of the labeled nucleic acid molecule after contact with the sample is evaluated based on the degree of polarization of at least one of the labeled nucleic acid molecule unbound to buckwheat allergen and the labeled nucleic acid molecule bound to buckwheat allergen. By evaluating the degree, the binding between the buckwheat allergen and the labeled nucleic acid molecule can be detected.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be easily used as a sensor only by labeling with the labeling substance.
  • the detection wavelength of the labeling substance varies depending on the type thereof, for example, the influence of the fluorescence derived from the sample can be reduced by selecting the labeling substance according to the type of the sample.
  • the labeled nucleic acid molecule is not particularly limited as long as the nucleic acid molecule of the present invention is labeled with the labeling substance, for example.
  • Examples of the labeled nucleic acid molecule include a form in which the labeling substance is linked to the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the labeling substance may be directly linked to the nucleic acid molecule of the present invention, or the labeling substance is indirectly linked via a linker or the like as described above. You may connect to.
  • the length of the linker is not particularly limited and is, for example, 0 to 10 bases, 0 to 7 bases, or 0 to 5 bases.
  • the labeling substance may be linked to, for example, any part of the nucleic acid molecule of the present invention, and specific examples include 5 ′ end and 3 ′ end, and may be linked to both ends. It may be linked to any one of the ends, preferably the 5 ′ end.
  • labeled nucleic acid molecule examples include, for example, the nucleic acid molecule of the present invention and a complementary strand that is complementary to the nucleic acid molecule (hereinafter also referred to as “labeled complementary strand”). And a hybrid molecule in which the nucleic acid molecule and the labeled complementary strand are hybridized.
  • the complementary strand only needs to have a sequence complementary to a part of the nucleic acid molecule of the present invention, for example, may be composed of only the complementary sequence, or includes the complementary sequence. But you can.
  • the complementary strand may be complementary to any region of the nucleic acid molecule of the present invention, and is preferably complementary to the 5 'end region or 3' end region.
  • the nucleic acid molecule of the present invention preferably has a linker at the 5 'end or 3' end, and the complementary sequence is preferably complementary to the linker.
  • the length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 10 to 30 bases long, 15 to 25 bases long, or 18 to 24 bases long.
  • the length of the complementary strand is not particularly limited, and is, for example, 10 to 30 bases long, 15 to 25 bases long, or 18 to 24 bases long.
  • the labeling substance may be linked to, for example, any part of the complementary strand, and specific examples include the 5 ′ end and the 3 ′ end. Alternatively, it may be linked to either one of the ends.
  • the labeling substance is preferably linked to the 5 ′ end of the complementary strand
  • the labeled complementary strand is When complementary to the 5 ′ end region of the nucleic acid molecule of the present invention, the labeling substance is preferably linked to the 3 ′ end of the complementary strand.
  • the labeling substance is not particularly limited, and the examples described above can be used, and among these, the fluorescent substance and the dye are preferable.
  • the analysis method of the present invention includes, for example, a contact step of bringing the sample and the labeled nucleic acid molecule into contact with each other, and binding the buckwheat allergen in the sample and the labeled nucleic acid molecule with each other.
  • the wavelength of the polarized excitation light and the detection wavelength of the polarization degree are not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the type of the labeling substance.
  • the wavelength of the polarized excitation light is, for example, 620 to 680 nm
  • the detection wavelength of the degree of polarization is, for example, 660 to 800 nm.
  • the irradiation time of the polarized excitation light is not particularly limited, and examples thereof include 1 nanosecond to 5 nanoseconds.
  • the evaluation criterion may be determined in advance or may be determined for each measurement, for example.
  • the evaluation standard for example, a standard for buckwheat allergen unbinding and a standard for buckwheat allergen binding can be set.
  • the former criterion is, for example, the degree of polarization of only the labeled nucleic acid molecule to which buckwheat allergen is not bound
  • the latter criterion is, for example, the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule to which buckwheat allergen is bound.
  • the former standard for example, if the measured value in the measurement step is higher than the standard, it can be determined that buckwheat allergen is present, and if it is relatively higher than the standard, relatively many It can be determined that buckwheat allergen is present. On the other hand, if the measurement value in the measurement step is the same or lower than the reference, it can be determined that buckwheat allergen is not present.
  • the former criterion may be, for example, the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule before the contacting step.
  • the measured value in the measurement step is lower than the standard, it can be determined that buckwheat allergen is not present.
  • the standard may be a correlation between the amount of buckwheat allergen and the degree of polarization.
  • the correlation is shown by contacting a plurality of known concentrations of buckwheat allergens with a predetermined amount of the labeled nucleic acid molecule and measuring the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecules bound to the buckwheat allergen at each concentration. A correlation equation is obtained. And the amount of buckwheat allergen in the sample can be determined from the correlation formula and the measured value in the measuring step.
  • the buckwheat allergen analysis sensor of the present invention when used as the nucleic acid molecule of the present invention, the buckwheat allergen can be detected by, for example, detecting a redox reaction or detecting fluorescence.
  • the DNAzyme is G by the binding of the buckwheat allergen to the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule. It forms a culted structure and becomes an active form showing the catalytic activity of a peroxidase-like redox reaction. Therefore, by detecting the redox reaction, the binding of the buckwheat allergen to the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule can be detected. In this case, for example, it is preferable to use a substrate for the oxidation-reduction reaction in combination.
  • the substrate is not particularly limited, and for example, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), 1,2-phenylenediamine (OPD), 2,2′-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt (ABTS), 3,3'-Diaminobenzodinine (DAB), 3,3'-Diaminobenzoidine Tetrahhydrochloride Hydrate (DAB4HCl), 3-Amino-9-ethylChalo-1 (EC) 4-N, 4-C 2,4,6-Tribromo-3-hydroxybenzoic Acid, 2, 4-Dichlorophenol, 4-Aminoantipyrine, 4-Aminoantipyrine Hydrochloride, luminol and the like.
  • TMB 5,5′-tetramethylbenzidine
  • OPD 1,2-phenylenediamine
  • 2,2′-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt
  • DAB 3,
  • the DNAzyme when the sensor of the present invention has a DNAzyme that forms a G-culted structure as the binding detection nucleic acid molecule, the DNAzyme has a G quartet structure due to the binding of the buckwheat allergen to the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule. Fluorescence is generated by forming a complex with porphyrin. For this reason, the buckwheat allergen to the buckwheat allergen binding nucleic acid molecule is detectable by detecting the said fluorescence.
  • the detection kit of the present invention comprises the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention is not limited as long as it contains the nucleic acid molecule of the present invention. If the detection kit of the present invention is used, for example, the detection of the buckwheat allergen can be performed as described above.
  • the detection kit of the present invention may include, for example, the sensor of the present invention as the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention may include other components in addition to the nucleic acid molecule of the present invention, for example. Examples of the component include the carrier, the porphyrin, a buffer solution, and instructions for use.
  • Example 1 The binding ability and kinetic parameters for buckwheat allergen were confirmed for each aptamer.
  • the aptamer was added with polydeoxyadenine (poly dA) having a length of 24 bases at the end, and used as a poly dA addition aptamer in SPR described later.
  • the poly dA is FAGE2191R8m1 (SEQ ID NO: 1), FAGE2191R8m2 (SEQ ID NO: 3), FAGE2215NNHR8m1s30 (SEQ ID NO: 6), FAGE2215NNHR8m2 (SEQ ID NO: 7), FAGE2215NNHR8m2s30 (SEQ ID NO: 8), FAGE2215NNHR8m3 (SEQ ID NO: 9) and AGE2215NNHR8m3 (SEQ ID NO: 9) No.
  • a chip product name: ProteOn NLC Sensor Chip, BioRad
  • streptavidin was immobilized
  • 5 ⁇ mol / L of biotinylated poly dT was injected into the flow cell of the sensor chip using ultrapure water (DDW), and was bound until the signal intensity (RU: Resonance Unit) was about 900 RU.
  • the biotinylated poly dT was prepared by biotinylating the 5 'end or 3' end of deoxythymidine having a length of 24 bases.
  • an aptamer solidification measurement value (A) as a signal indicating the amount of solidification of the aptamer to the sensor chip.
  • the sample was injected with an SPR buffer at a flow rate of 50 ⁇ L / min for 120 seconds, and then washed by flowing the SPR buffer under the same conditions. In parallel with the injection of the sample and the washing with the SPR buffer, the signal intensity was measured.
  • a protein binding measurement value (B) As a signal indicating the binding amount of the aptamer and protein.
  • the concentration of the sample was 50 nmol / L, 25 nmol / L, 12.5 nmol / L, 6.25 nmol / L, and 3.125 nmol / L.
  • the composition of the SPR buffer was 40 mmol / L HEPES, 125 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, and 0.01% Tween (registered trademark) 20, and the pH was 7.5.
  • FIGS. 4 and 5 are graphs showing the binding ability of an aptamer to the above Flag e 2, wherein the horizontal axis indicates measurement time (seconds) and the vertical axis indicates signal intensity (RU). On the horizontal axis, 0 to 120 seconds are the injection time of the sample, and 120 seconds and after are the time for washing with the SPR buffer (the same applies hereinafter).
  • the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention can bind to buckwheat allergen with the dissociation constant as described above. For this reason, according to the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention, for example, buckwheat allergen can be detected with excellent accuracy based on the presence or absence of binding to the buckwheat allergen in the sample. Therefore, the buckwheat allergen-binding nucleic acid molecule of the present invention can be said to be a very useful tool for detecting buckwheat allergens in fields such as food production, food management, and food distribution.

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Abstract

　そばアレルゲンの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供する。　本発明のそばアレルゲン結合核酸は、そばアレルゲンに対する解離定数が、６０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とし、例えば、配列番号１－１０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことが好ましい。

Description

そばアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
　本発明は、そばアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途に関する。
　そばは、日常的に頻繁に摂取される食品であるが、近年、そばアレルギーの患者が増加しており、問題視されている。パンおよび麺の加工食品等は、そばを使用するものが多く存在するため、加工食品やその製造ライン等においては、原料としてそばが混入しているか否かを分析することは、極めて重要である。
　アレルギーのアレルゲンは、一般的に、タンパク質やその分解物（ペプチド）であり、これらを抗原とする抗体を使用した分析方法が、主流である。そばに関しては、例えば、そばタンパク質であるＦａｇ　ｅ　２がアレルゲンとして知られており、その遺伝子がクローニングされ（非特許文献４）、患者ＩｇＥを使ったエピトープ解析等が行われている（非特許文献５）。しかしながら、いまだ、Ｆａｇ　ｅ　２に特異的な分析方法は、報告されていない。報告されている方法としては、例えば、ＰＣＲを用いた方法（非特許文献１、非特許文献２）、抗体を使用する方法（非特許文献３）等である。
　しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。このため、近年、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が注目されている。しかしながら、これまでにそばアレルゲンに対する核酸分子は報告されていない。
‘PCR　Method　for　Detecting　Trace　Amounts　of　Buckwheat　(Fagopyrum　spp.)　in　Food’,　Takashi　HIRAO,　Shinsuke　IMAI,　Hiroshi　SAWADA,　Nobuo　SHIOMI,　Satoshi　HACHIMURA,　Hisanori　KATO,　Bioscience,　Biotechnology,　and　Biochemistry,　69　(4),　pp724-731,　2005 ‘Specific　Detection　of　Buckwheat　Residues　in　Processed　Foods　by　Polymerase　Chain　Reaction’,　Hirohito　YAMAKAWA,　Hiroshi　AKIYAMA,　Yumi　ENDO,　Kiyoko　MIYATAKE,　Shinobu　SAKAI,　Kazunari　KONDO,　Masatake　TOYODA,　Atsuo　URISU,　Reiko　TESHIMA,　Bioscience,　Biotechnology,　and　Biochemistry,　72　(8),　pp2228-2231,　2008 ‘Japan　Food　Allergen　Labeling　Regulation-History　and　Evaluation’,　Hiroshi　Akiyama,　Takanori　Imai,　Motohiro　Ebisawa,　Advances　in　Food　and　Nutrition　Research,　62,　pp139-171,　2011 ‘Molecular　cloning　and　expression　of　a　major　allergenic　protein　Fag　e　2　from　buckwheat’,　Hiroyuki　YOSHIOKA,　Natsuko　YASUEDA　and　Taiji　ADACHI,　Fagopyrum,　21:　35-38　(2004) ‘Identification　of　a　New　IgE-Binding　Epitope　of　Peanut　Oleosin　That　Cross-Reacts　with　Buckwheat’,　Shoko　KOBAYASHI,　Shinta　KATSUYAMA,　Tamae　WAGATSUMA,　Shinji　OKADA　and　Soichi　TANABE,　Biosci.　Biotechnol.　Biochem,　76　(6),　1182-1188　(2012)
　そこで、本発明の目的は、そばアレルゲンの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供することにある。
　本発明のそばアレルゲン結合核酸分子は、そばアレルゲンに対する解離定数が、６０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。
　本発明のそばアレルゲン分析用センサは、前記本発明のそばアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする。
　本発明のそばアレルゲンの分析方法は、試料と前記本発明のそばアレルゲン結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のそばアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のそばアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする。
　本発明のそばアレルゲン結合核酸分子は、そばアレルゲンに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のそばアレルゲン結合核酸分子によれば、例えば、試料中のそばアレルゲンとの結合の有無によって、優れた精度で、そばアレルゲンを検出できる。したがって、本発明のそばアレルゲン結合核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野におけるそばアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。
図１は、本発明のそばアレルゲン結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。 図２は、本発明のそばアレルゲン結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。 図３は、本発明のそばアレルゲン結合核酸分子の推定二次構造の一例を示す概略図である。 図４は、本発明の実施例１において、アプタマーとそばアレルゲンとの結合能を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例１において、アプタマーとそばアレルゲンとの結合能を示すグラフである。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記そばアレルゲンが、Ｆａｇ　ｅ　２またはそのサブユニットである。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記そばアレルゲンが、未変性アレルゲンまたは加熱変性アレルゲンである。
　本発明の核酸分子は、例えば、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１－１０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記そばアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記そばアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、そばアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
　本発明の核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである。
　本発明の分析用センサは、例えば、さらに、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子を含む。
　本発明の分析用センサは、例えば、前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子が、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅである。
　本発明の分析用センサは、例えば、さらに、ポルフィリンを含む。
　本発明の分析方法は、例えば、前記試料が、食品、食品原料および食品添加物からなる群から選択された少なくとも一つである。
（１）そばアレルゲン結合核酸分子
　本発明のそばアレルゲン結合核酸分子は、前述のように、そばアレルゲンに対する解離定数が、６０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とする。
　本発明の核酸分子は、例えば、そばの主要アレルゲンである、Ｆａｇ　ｅ　２、そのサブユニット、またはそのドメインに結合する。
　前記そばアレルゲンは、例えば、加熱による変性が生じていない未変性アレルゲンでもよいし、加熱による変性が生じた変性アレルゲンでもよい。本発明の核酸分子は、例えば、いずれのアレルゲンに対しても結合可能である。
　本発明の核酸分子は、前記そばアレルゲンに対する解離定数が、例えば、６０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、３ｎＭ以下である。本発明の核酸分子は、前記そばアレルゲンの検出限界濃度が、例えば、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭである。
　本発明の核酸分子は、前記Ｆａｇ　ｅ　２に対する解離定数が、例えば、６０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、３ｎＭ以下である。本発明の核酸分子は、前記Ｆａｇ　ｅ　２の検出限界濃度が、例えば、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭである。
　本発明の核酸分子と前記そばアレルゲンとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface　Plasmon　resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名　BioRad社）が使用できる。
　本発明のそばアレルゲン結合核酸分子について、具体例を以下に示す。本発明の核酸分子は、例えば、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む核酸分子である。
（ａ）配列番号１－１０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記そばアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記そばアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、そばアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
　本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明のそばアレルゲン結合核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。
　前記（ａ）のポリヌクレオチドは、下記表１に示す配列番号１－１０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列番号２は、配列番号１の小型化配列であり、配列番号４は、配列番号３の小型化配列であり、配列番号６は、配列番号５の小型化配列であり、配列番号８は、配列番号７の小型化配列であり、配列番号１０は、配列番号９の小型化配列である。配列番号１の下線部は、配列番号２の領域を示し、配列番号３の下線部は、配列番号４の領域を示し、配列番号５の下線部は、配列番号６の領域を示し、配列番号７の下線部は、配列番号８の領域を示し、配列番号９の下線部は、配列番号１０の領域を示す。また、前記FAGE2191R8m1s24（配列番号２）、前記FAGE2191R8m2（配列番号３）、前記FAGE2191R8m2s32（配列番号４）、前記FAGE2215NNHR8m1（配列番号５）、前記FAGE2215NNHR8m1s30（配列番号６）、前記FAGE2215NNHR8m2（配列番号７）および前記FAGE2215NNHR8m2s30（配列番号８）、前記FAGE2215NNHR8m3（配列番号９）および前記FAGE2215NNHR8m3s33（配列番号１０）の推定二次構造を図１－３に示すが、これには限定されない。
　前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、そばアレルゲンに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１または２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
　前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、そばアレルゲンに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
　前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
　前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２～２０、２～１０、２または３である。
　前記リンカーは、特に制限されない。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～２０塩基長、３～１２塩基長、５～９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
　本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
　本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
　本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
　本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個、１～３０個、１～１５個、１～７個、１～３個、１または２個である。
　前記ポリヌクレオチドは、修飾塩基を含んでもよい。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「－ＣＨ３」または「－Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
　前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（１）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（２）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
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　前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシルおよび前記修飾シトシンが好ましい。
　前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’－デアザアデニン等があげられる。
　前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’－デアザグアニン等があげられる。
　前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’－メチルシトシン（５－Ｍｅ－ｄＣ）等があげられる。
　前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルチミン、５’－トリプタミノカルボニルチミン、５’－イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられる。
　前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’－イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。例示した前記修飾ウラシルは、チミンの修飾塩基ということもできる。
　前記ポリヌクレオチドは、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
　本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい、前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
　前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～１００個、１～９０個、１～８０個、１～７０個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１～９１個または１～７８個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
　本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～１００個、１～５０個、１～３０個、１～１０個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
　本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
　本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～５０塩基長、１～２５塩基長、１８～２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
　本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
　本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。本発明の核酸分子は、例えば、いわゆるＳＥＬＥＸ法によっても得ることができる。この場合、ターゲットは、そばアレルゲンであるＦａｇ　ｅ　２が好ましい。
　本発明の核酸分子は、前述のように、前記そばアレルゲンに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記そばアレルゲンへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記そばアレルゲンに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
（２）そばアレルゲン分析用センサ
　本発明のそばアレルゲン分析用センサは、前述のように、本発明のそばアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のセンサは、前記本発明のそばアレルゲン結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。
　本発明のセンサは、例えば、前記そばアレルゲン結合核酸分子に前記そばアレルゲンが結合した状態で、活性型となり、前記そばアレルゲン結合核酸分子に前記そばアレルゲンが未結合の状態で、不活性型となる、前記結合を検出する結合検出用核酸分子を、さらに含んでもよい。本発明のセンサは、前記結合検出用核酸分子を含む場合、前記結合検出用核酸分子が活性型であるか不活性型であるかによって、前記そばアレルゲン結合核酸分子への前記そばアレルゲンの結合の有無を確認でき、それによって、前記そばアレルゲンの有無を分析することができる。
　前記結合検出用核酸分子としては、例えば、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子があげられる。前記Ｇカルテッド構造を形成する核酸分子は、例えば、Ｇカルテッド構造を形成した状態が、活性型であり、Ｇカルテッド構造を非形成の状態が、不活性型である。
　前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子は、例えば、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅ等があげられ、好ましくはＤＮＡｚｙｍｅである。
　Ｇカルテッド構造を形成した活性型ＤＮＡｚｙｍｅは、例えば、酸化還元反応を触媒するペルオキシダーゼ様の活性を示す。このため、本発明のセンサがＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ＤＮＡｚｙｍｅの触媒活性を検出することによって、前記そばアレルゲン結合核酸分子への前記そばアレルゲンの結合の有無または結合量を分析することができる。
　この場合、本発明のセンサは、例えば、ポルフィリンを共存させることが好ましい。前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ－メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
　また、Ｇカルテッド構造を形成した活性型のＤＮＡｚｙｍｅは、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することで、蛍光を生じる。このため、本発明のセンサがＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記ポルフィリンを共存させ、前記ＤＮＡｚｙｍｅと前記ポルフィリンとの複合体形成による蛍光を検出することによって、前記そばアレルゲン結合核酸分子への前記そばアレルゲンの結合の有無または結合量を分析することができる。
　前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、Ｎ－メチルメソポルフィリン（ＮＭＭ）、Ｚｎ－ＤＩＧＰ、ＺｎＰＰ９およびＴＭＰｙＰ等が好ましい。
　本発明のセンサは、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは５’末端である。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。
　前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、前述の例示を援用できる。
（３）分析方法
　本発明の分析方法は、前述のように、そばアレルゲンの分析方法であって、試料と前記本発明のそばアレルゲン結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のそばアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のそばアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。また、本発明の分析方法は、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のそばアレルゲン分析用センサを使用してもよい。
　本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、そばアレルゲンに特異的に結合することから、例えば、そばアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のそばアレルゲンを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のそばアレルゲンの有無またはそばアレルゲンの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。
　本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物等があげられる。また、前記試料は、例えば、食品加工場または調理場等における付着物、洗浄後の洗浄液等があげられる。
　前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のそばアレルゲンと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記そばアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のそばアレルゲンの有無または量を分析する工程を含む。
　前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４～３７℃、１８～２５℃であり、接触時間は、例えば、１０～１２０分、３０～６０分である。
　前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
　前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のそばアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のそばアレルゲンの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のそばアレルゲンの量を分析（定量）できる。
　そして、前記そばアレルゲンと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にそばアレルゲンは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にそばアレルゲンが存在すると判断できる。
　前記そばアレルゲンと前記核酸分子との結合の分析方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ、蛍光偏光法等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記そばアレルゲンと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
　前記蛍光偏光法による前記そばアレルゲンと前記核酸分子との結合の検出は、例えば、以下のようにして行うことができる。
　前記蛍光偏光法は、一般に、偏光励起光を前記標識物質に照射した際、前記標識物質から発せられる蛍光が、前記標識物質で標識された分子の分子量に応じて異なった偏光度を示すという特性に基づく測定方法である。本発明においては、例えば、前記標識物質で標識化した前記核酸分子（標識化核酸分子）を使用することで、前記蛍光偏光法により前記そばアレルゲンと前記核酸分子との結合を検出することができる。具体的には、前記標識化核酸分子は、そばアレルゲンと未結合の状態と、そばアレルゲンと結合した状態とを比較した場合、前者は、相対的に分子量が小さいため、相対的に偏光度が低く、一方、後者は、相対的に分子量が大きいため、相対的に偏光度が高い。このため、例えば、試料と接触させる前の前記標識化核酸分子の偏光度と、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の前記偏光度とを比較することで、そばアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。また、そばアレルゲンと未結合の前記標識化核酸分子およびそばアレルゲンと結合した前記標識化核酸分子の少なくとも一方の偏光度を評価基準として、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の偏光度を評価することでも、そばアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。
　前記蛍光偏光法によれば、例えば、前記本発明の核酸分子を、前記標識物質で標識化するのみで、センサとして容易に使用できる。また、前記標識物質は、その種類によって検出波長が異なるため、例えば、試料の種類に応じて前記標識物質を選択することで、前記試料由来の蛍光の影響を低減することもできる。
　前記標識化核酸分子は、例えば、前記本発明の核酸分子が前記標識物質で標識化されていればよく、その標識方法は、特に制限されない。
　前記標識化核酸分子としては、例えば、前記本発明の核酸分子に前記標識物質が連結した形態があげられる。この形態は、例えば、前述の記載が援用でき、前記本発明の核酸分子に、前記標識物質が直接的に連結してもよいし、前述のようにリンカー等を介して前記標識物質が間接的に連結してもよい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、０～１０塩基長、０～７塩基長、０～５塩基長である。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよく、好ましくは、５’末端である。
　前記標識化核酸分子としては、この他に、例えば、前記本発明の核酸分子と、これに相補的であって且つ標識物質が連結した相補鎖（以下、「標識化相補鎖」ともいう）とを含み、前記核酸分子と前記標識化相補鎖とがハイブリダイズしたハイブリッド分子があげられる。
　前記相補鎖は、例えば、前記本発明の核酸分子の一部に相補的な配列を有していればよく、前記相補的な配列のみから構成されてもよいし、前記相補的な配列を含んでもよい。前記相補鎖は、前記本発明の核酸分子のどの領域に対して相補的でもよく、好ましくは、５’末端領域または３’末端領域に相補的である。また、例えば、前記本発明の核酸分子が、その５’末端または３’末端にリンカーを有し、前記相補的な配列は、前記リンカーに相補的であることが好ましい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１０～３０塩基長、１５～２５塩基長、１８～２４塩基長である。前記相補鎖の長さは、特に制限されず、例えば、１０～３０塩基長、１５～２５塩基長、１８～２４塩基長である。
　前記標識化相補鎖において、前記標識物質は、例えば、前記相補鎖のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよい。前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の３’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の５’末端に連結することが好ましく、前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の５’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の３’末端に連結することが好ましい。
　前記標識物質は、特に制限されず、前述した例示を援用でき、中でも前記蛍光物質および前記色素が好ましい。
　前記蛍光偏光法を採用する場合、本発明の分析方法は、例えば、前記試料と前記標識化核酸分子とを接触させ、前記試料中のそばアレルゲンと前記標識化核酸分子とを結合させる接触工程と、前記標識化核酸分子に偏光励起光を照射して、前記標識化核酸分子の偏光度を測定する測定工程と、前記測定工程における測定結果と評価基準とを比較し、そばアレルゲンと前記標識化核酸分子との結合を検出する工程を検出する検出工程を含むことが好ましい。
　前記測定工程において、前記偏光励起光の波長および前記偏光度の検出波長は、特に制限されず、例えば、前記標識物質の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記標識物質がＡｌｅｘａ６４７の場合、前記偏光励起光の波長は、例えば、６２０～６８０ｎｍであり、偏光度の検出波長は、例えば、６６０～８００ｎｍである。前記偏光励起光の照射時間は、特に制限されず、例えば、１ナノ～５ナノ秒があげられる。
　前記検出工程において、前記評価基準は、例えば、予め決定してもよいし、測定ごとに決定してもよい。前記評価基準としては、例えば、そばアレルゲン未結合の基準、そばアレルゲン結合の基準が設定できる。前者の基準は、例えば、そばアレルゲンが結合していない前記標識化核酸分子のみの偏光度であり、後者の基準は、例えば、そばアレルゲンが結合した前記標識化核酸分子の偏光度である。
　前者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも高ければ、そばアレルゲンが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのそばアレルゲンが存在すると判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または低ければ、そばアレルゲンが存在しないと判断できる。前者の基準は、例えば、前記接触工程前の前記標識化核酸分子の偏光度でもよい。
　また、後者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも低ければ、そばアレルゲンが存在しないと判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または高ければ、そばアレルゲンが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのそばアレルゲンが存在すると判断できる。
　また、前記基準は、そばアレルゲンの量と偏光度との相関関係であってもよい。例えば、複数の既知濃度のそばアレルゲンと所定量の前記標識化核酸分子とを接触させ、各濃度のそばアレルゲンに結合した前記標識化核酸分子の偏光度を測定することにより、前記相関関係を示す相関式が得られる。そして、この相関式と、前記測定工程における測定値とから、前記試料におけるそばアレルゲンの量を判断することができる。
　また、本発明の核酸分子として、前記本発明のそばアレルゲン分析用センサを使用する場合、例えば、酸化還元反応の検出または蛍光発生の検出によって、前記そばアレルゲンの検出を行うことができる。
　前述のように、前記本発明のセンサが、前記結合検出用核酸分子としてＧカルテッド構造を形成するＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記そばアレルゲン結合核酸分子への前記そばアレルゲンの結合によって、前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇカルテッド構造を形成し、ペルオキシダーゼ様の酸化還元反応の触媒活性を示す活性型となる。このため、前記酸化還元反応を検出することによって、前記そばアレルゲン結合核酸分子への前記そばアレルゲンの結合を検出できる。この場合、例えば、前記酸化還元反応の基質を併用することが好ましい。
　前記基質は、特に制限されず、例えば、３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、１，２－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２’－Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）、３，３’－Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’－Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ　Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　Ｈｙｄｒａｔｅ（ＤＡＢ４ＨＣｌ）、３－Ａｍｉｎｏ－９－ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＡＥＣ）、４－Ｃｈｌｏｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈｏｌ（４Ｃ１Ｎ）、２，４，６－Ｔｒｉｂｒｏｍｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　Ａｃｉｄ、２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、４－Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、４－Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ルミノール等があげられる。
　また、前記本発明のセンサが、前記結合検出用核酸分子としてＧカルテッド構造を形成するＤＮＡｚｙｍｅを有する場合、前記そばアレルゲン結合核酸分子への前記そばアレルゲンの結合によって、前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇカルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発生する。このため、前記蛍光を検出することによって、前記そばアレルゲン結合核酸分子へのそばアレルゲンを検出できる。
（４）検出キット
　本発明の検出キットは、前記本発明のそばアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記そばアレルゲンの検出等を行うことができる。
　本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子として、前記本発明のセンサを含んでもよい。また、前記本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、前記ポルフィリン、緩衝液、使用説明書等があげられる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
　各アプタマーについて、そばアレルゲンに対する結合能および動態パラメータを確認した。
（１）アプタマー
　下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　前記アプタマーは、その末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。前記ポリｄＡは、FAGE2191R8m1（配列番号１）、FAGE2191R8m2（配列番号３）、FAGE2215NNHR8m1s30（配列番号６）、FAGE2215NNHR8m2（配列番号７）、FAGE2215NNHR8m2s30（配列番号８）、FAGE2215NNHR8m3（配列番号９）およびFAGE2215NNHR8m3s33（配列番号１０）について、３’末端に付加し、FAGE2191R8m1s24（配列番号２）およびFAGE2191R8m2s32（配列番号４）について、５’末端に付加した。また、FAGE2215NNHR8m1（配列番号５）については、３’末端または５’末端に付加し、いずれの末端にポリｄＡを付加しても、結果は同等であることを確認済みである。
（２）試料
　Ｆａｇ　ｅ　２タンパク質にヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）付加した状態で、発現させ、これを試料として、以下の試験に使用した。前記Ｆａｇ　ｅ　２をコードする遺伝子の全長塩基配列およびタンパク質の全長アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ２ＰＳ０７に登録されているとおりとし、前記Ｈｉｓタグは、１０個のＨｉｓが連続したペプチドを、前記Ｆａｇ　ｅ　２のＮ末端に付加した。
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
　結合能の解析には、ProteON　XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
　まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名　ProteOn　NLC　Sensor　Chip、BioRad社）を、前記ProteON　XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端または３’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。この結果を、アプタマーのセンサーチップへの固層化量を示すシグナルとして、アプタマー固層化測定値（Ａ）という。続いて、前記試料を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を行った。前記試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。この結果を、前記アプタマーとタンパクの結合量を示すシグナルとして、タンパク質結合測定値（Ｂ）という。前記試料の濃度は、５０ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌ、１２．５ｎｍｏｌ／Ｌ、６．２５ｎｍｏｌ／Ｌおよび３．１２５ｎｍｏｌ／Ｌとした。
　前記ＳＰＲバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌおよび０．０１％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。
　これらの結果を図４および５に示す。図４および５は、前記Ｆａｇ　ｅ　２に対するアプタマーの結合能を示すグラフであり、横軸は、測定時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、０～１２０秒が、前記試料のインジェクション時間であり、１２０秒以降が、前記ＳＰＲバッファーによる洗浄の時間である（以下、同様）。
　図４および５に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、前記Ｆａｇ　ｅ　２に対して、結合性を示した。
　また、前記図４および５のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。これらの結果を下記表３に示す。下記表３に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、Ｆａｇ　ｅ　２に対する解離定数（ＫＤ）は、６０ｎＭ以下であり、非常に優れた結合性であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
　この出願は、２０１４年３月３１日に出願された日本出願特願２０１４－０７３７４１を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
　本発明のそばアレルゲン結合核酸分子は、そばアレルゲンに対して前述のような解離定数で結合することができる。このため、本発明のそばアレルゲン結合核酸分子によれば、例えば、試料中のそばアレルゲンとの結合の有無によって、優れた精度で、そばアレルゲンを検出できる。したがって、本発明のそばアレルゲン結合核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野におけるそばアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。

Claims (11)

  1. そばアレルゲンに対する解離定数が、６０ｎＭ以下の核酸分子であることを特徴とするそばアレルゲン結合核酸分子。
  2. 前記そばアレルゲンが、Ｆａｇ　ｅ　２またはそのサブユニットである、請求項１記載のそばアレルゲン結合核酸分子。
  3. 前記そばアレルゲンが、未変性アレルゲンまたは加熱変性アレルゲンである、請求項１または２記載のそばアレルゲン結合核酸分子。
  4. 下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のそばアレルゲン結合核酸分子。
    （ａ）配列番号１－１０のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記そばアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
    （ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記そばアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
    （ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、そばアレルゲンに結合するポリヌクレオチド
  5. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項４記載のそばアレルゲン結合核酸分子。
  6. 請求項１から５のいずれか一項に記載のそばアレルゲン結合核酸分子を含むことを特徴とする、そばアレルゲン分析用センサ。
  7. さらに、Ｇカルテット構造を形成する核酸分子を含む、請求項６記載のそばアレルゲン分析用センサ。
  8. 前記Ｇカルテット構造を形成する核酸分子が、ＤＮＡｚｙｍｅまたはＲＮＡｚｙｍｅである、請求項７記載のそばアレルゲン分析用センサ。
  9. さらに、ポルフィリンを含む、請求項６から８のいずれか一項に記載のそばアレルゲン分析用センサ。
  10. 試料と請求項１から５のいずれか一項に記載のそばアレルゲン結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のそばアレルゲンと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のそばアレルゲンを検出する工程を含むことを特徴とする、そばアレルゲンの分析方法。
  11. 前記試料が、食品、食品原料および食品添加物からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１０記載のそばアレルゲンの分析方法。
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