WO2015140375A1 - Método pronostico de enfermedades autoinmunes mediante el genotipado de variantes genéticas del peptido intestinal vasoactivo - Google Patents

Método pronostico de enfermedades autoinmunes mediante el genotipado de variantes genéticas del peptido intestinal vasoactivo Download PDF

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WO2015140375A1
WO2015140375A1 PCT/ES2015/070182 ES2015070182W WO2015140375A1 WO 2015140375 A1 WO2015140375 A1 WO 2015140375A1 ES 2015070182 W ES2015070182 W ES 2015070182W WO 2015140375 A1 WO2015140375 A1 WO 2015140375A1
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polymorphism
allele
vip
disease
autoimmune
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PCT/ES2015/070182
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Isidoro Gonzalez Alvaro
Ana María Ortiz Garcia
Amalia Lamana Dominguez
Rosa Perez Gomariz
María del Carmen MARTINEZ MORA
Javier Leceta Martinez
Yasmina JUARRANZ MORATILLA
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Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Universitario De La Princesa
Universidad Complutense De Madrid
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a prognostic method of autoimmune diseases comprising the detection of genetic polymorphisms of the vasoactive intestinal peptide (VIP) gene. Therefore, the present invention could be framed in the field of biomedicine. STATE OF THE TECHNIQUE
  • RA rheumatoid arthritis
  • psoriasis inflammatory bowel disease
  • spondyloarthritis inflammatory bowel disease
  • systemic lupus erythematosus a number of etiopathogenic mechanisms that have led them to be globally referred to as "inflammatory diseases mediated by immune mechanisms. "(EIMMI) and also share their response to similar or equal immunomodulatory or immunosuppressive treatments.
  • EIMMI rheumatoid arthritis
  • psoriasis inflammatory mediated by immune mechanisms.
  • (EIMMI) also share their response to similar or equal immunomodulatory or immunosuppressive treatments.
  • RA is the most common autoimmune rheumatic disease.
  • RA causes chronic inflammation of the synovial membrane of the diartrodial joints, which causes its progressive deterioration, and as a consequence, causes a disability and deterioration of the patient's quality of life. In addition, it is often accompanied by systemic manifestations and an increase in the number of comorbidities and even mortality compared to the general population. Its etiology is considered of multigenic origin with an important interaction with environmental factors. Its prevalence ranges between 0.3 and 1%, for example in Spain the prevalence of 0.5%, which is about 200,000 patients with RA in that country. Given its ability to produce functional disability, RA is one of the main causes of permanent work disability in Spain. Therefore, it is a disease with great economic and social relevance.
  • Spondyloarthropathies are a heterogeneous group of diseases that share clinical and radiological manifestations, of which ankylosing spondylitis is the most prevalent. They are characterized by the presence of inflammation of the spinal and sacroiliac joints, as well as their association with the presence of HLA-B27, which determines their family association and a series of common pathogenic mechanisms. Although the prevalence of ankylosing spondylitis is lower than that of RA, it also has an important ability to impair the functional capacity of patients, which also entails high social costs, especially derived from the work disability they cause, since it affects younger patients.
  • systemic lupus erythematosus is a very heterogeneous disease that is characterized by an activation of the immune system in its humoral side, which determines the appearance of autoantibodies, commonly antinuclear antibodies, anti-DNA and others. Its clinical expression is very variable from clinically mild and even silent forms to catastrophic forms with involvement of vital organs such as the kidney, brain, heart or lungs. Its prevalence is lower than that of the two previously described EIMMIs and mostly affects young women.
  • the search for reproducible markers is necessary that allow a better determination of the prognosis of autoimmune diseases, or that may involve alternatives or complement the biomarkers already available to detect patients who respond better or worse to a certain treatment, which would save time and costs in the management of EIMMI .
  • genetic variants of the P gene have been determined that are associated with an increased risk of having a poor evolutionary course of autoimmune diseases, exemplified by rheumatoid arthritis, spondyloarthritis and systemic lupus erythematosus, and need more intensive treatment. Long follow up. These gene variants are associated with a low serum level of the VIP peptide.
  • the present invention demonstrates the usefulness of several polymorphisms ("single nucleotide prolymorphisms", SNP) of the VIP gene, specifically SNPs rs35643203, rs71575932 and / or rs7755568 in the prognosis of rheumatoid arthritis.
  • SNP single nucleotide prolymorphisms
  • the authors have shown that rs35643203, rs71575932 and rs7755568 are in linkage imbalance, so all three are informative for the present invention.
  • SNPs3823082 and / or rs688136 are used, the severity of the disease can also be predicted.
  • the present invention shows results for other inflammatory diseases mediated by immune mechanisms (EIMMI), such as spondyloarthritis and systemic lupus erythematosus, demonstrating that the results obtained for RA are extrapolabas to other EIMMI.
  • EIMMI immune mechanisms
  • the present invention relates to a method of prognosis of an autoimmune disease, such as inflammatory bowel disease, psoriasis, spondyloarthritis (for example, ankylosing spondylitis) or systemic lupus erythematosus. It also refers to a method to establish a personalized treatment of the patient presenting an EIMMI.
  • an autoimmune disease such as inflammatory bowel disease, psoriasis, spondyloarthritis (for example, ankylosing spondylitis) or systemic lupus erythematosus.
  • a first aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the prognosis of an autoimmune disease comprising the detection of genetic polymorphisms of the "vasoactive intestinal peptide" gene ⁇ VIP) rs35643203, rs71575932 and / or rs7755568 in an isolated biological sample of a subject suffering from an autoimmune disease.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • prognosis is understood as the ability to determine in patients of an autoimmune disease how the disease will evolve in terms of its severity.
  • prognosis also refers to the ability to detect subjects already diagnosed with an autoimmune disease with a high probability of suffering a worsening of the disease.
  • This bad evolution or "bad prognosis” can be defined as a lower possibility of achieving disease remission, taking into account that the person skilled in the art knows that there are multiple ways to define this ideal state of remission in each disease. For example, in rheumatoid arthritis there are different ways of defining the ideal state of remission, such as, but not limited to those described in Felson et al. Arthritis Rheum 201 1; 63: 573-586. Other situations that can also be considered as poor evolution or poor prognosis are not reaching a state of minimal disease activity (Wells et al.
  • the prognosis should be carried out, preferably, but not limited, in the first year of the onset of autoimmune disease symptoms, even before the definitive diagnosis of the disease is established.
  • the method can also be applied at any time during the development of the disease.
  • VIP in the present invention is understood as that gene that has the ability to code for the "vasoactive intestinal peptide” or "VIP.”
  • the gene can be, for example, but not limited to, the VIP gene with GenBank access number of the NCBI ⁇ National Center for Biotechnology Information) AH003027
  • the VIP in the present invention refers to the peptide with access number to the GenBank of the NCBI AAB22264.1 of amino acid sequence SEQ ID NO: 1 (HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN).
  • genetic polymorphism refers to a variation in the nucleotide sequence of the deoxyribonucleic acid chain (DNA or DNA, "deoxyribonucleic acid”) that has at least a frequency of 1% in individuals in a population. Genetic polymorphisms can be variations of one or more nucleotides. Single nucleotide polymorphism, “single nucleotide polymorphism” or SNP, generally results in two distinct alleles. SNPs or polymorphisms may contain information on the variation of a single polymorphism or the information of a haplotype if they are SNP tags or "tag-SNP". In the present invention the terms “polymorphism” and "SNP" are used interchangeably.
  • haplotype is understood as a combination of alleles of different chromosome loci that are transmitted together.
  • a haplotype can be a locus, several loci, or an entire chromosome depending on the number of recombination events that have occurred between a given set of loci.
  • the transmitted alleles of the mother form the maternal haplotype, while the alleles of the father form the paternal haplotype.
  • genotyped polymorphisms rs35643203, rs71575932 and rs7755568 belong to the same haplotypic block according to the results obtained (ie, they are Tag-SNPs). Any genetic variant that is within the same haplotypic block as these genotyped Tag-SNPs will be inherited together with them with a high probability. Polymorphisms within a haplotypic block are in linkage imbalance.
  • Linkage imbalance (LD of English “Hnkage disequilibrium") is the property of some loci of not segregating independently, that is, they have a recombination frequency of less than 50%.
  • minor allele refers to the allele that has less representation in the population, as the person skilled in the art knows it and therefore, the term “major allele” refers to the most frequent allele in the population.
  • Rs35643203 polymorphism is understood as the substitution C> T (in the complementary strand the substitution would be G> A) at position 153072433 located in intron 1 of the VIP gene.
  • Rs71575932 polymorphism is understood as the substitution A> G (in the complementary strand the substitution would be T> C) at position 153075844 located in intron 3 of the VIP gene.
  • Rs7755568 polymorphism is understood as the substitution T> A (in the complementary strand the substitution would be A> T) at position 153076955 located in intron 4 of the VIP gene.
  • the term "biological sample” in the present invention refers to any sample that allows determining the VIP polymorphisms of the individual from whom said sample has been obtained, and includes, but is not limited to, biological fluids of an individual, obtained by any known method. by an expert in the field that serves this purpose.
  • the sample Biological comprises genomic deoxyribonucleic acid (DNA).
  • the biological sample could be, for example, but not limited to, a sample of fluid, such as blood, plasma, serum, saliva, urine, synovial fluid or lymph. It can also be a tissue sample. Other samples of interest would be, for example, peripheral blood mononuclear cells, for example T lymphocytes.
  • the biological sample can also come from routine extractions in analyzes that can be performed periodically to patients.
  • the biological sample in the present invention can be fresh, frozen, fixed or fixed and embedded in paraffin.
  • the term "subject”, “individual” and “patient” are used interchangeably.
  • the subject is a human.
  • a preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the method which further comprises the detection of the rs3823082 genetic polymorphism of the VIP gene and / or of the rs688136.
  • Rs3823082 polymorphism is understood as the substitution C> T (in the complementary strand the substitution would be G> A) at position 153074322 located in intron 2 of the VIP gene.
  • Rs688136 polymorphism is understood as the substitution T> C (in the complementary strand the substitution would be A> G) at position 153080061 located in exon 7 of the VIP gene that corresponds to the 3 'UTR region of its mRNA.
  • a more preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the method which further comprises the detection of at least one of the genetic polymorphisms of the VIP gene that is selected from the list comprising: rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs12201 140, rs74760293 and rs149081483; or any of its combinations, in an isolated biological sample of a subject.
  • Rs12213214 polymorphism is understood as the substitution C> A (in the complementary strand the substitution would be G> T) at position 153070786 located in the VIP gene promoter.
  • Rs60946248 polymorphism is understood as the C> T substitution (in the complementary strand the substitution would be G> A) at position 153071 195 located in the VIP gene promoter.
  • Rs140023105 polymorphism is understood as the substitution A> G (in the complementary strand the substitution would be T> C) at position 153072056 located in exon 1 of the VIP gene that corresponds to the 5 'UTR region of its mRNA.
  • Rs7764067 polymorphism is understood as the substitution A> T (in the complementary strand the substitution would be T> A) at position 153074199 located in intron 2 of the VIP gene.
  • Rs12201030 polymorphism is understood as the substitution A> G (in the complementary strand the substitution would be T> C) at position 153076789 located in intron 4 of the VIP gene.
  • Rs12201 140 polymorphism is understood as the substitution A> T (in the complementary strand the substitution would be T> A) at position 153076956 located at intron 4 of the VIP gene.
  • Rs74760293 polymorphism is understood as the substitution T> C (in the complementary strand the substitution would be A> G) at position 153077241 located at intron 4 of the VIP gene.
  • the autoimmune disease is preferably autoimmune arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, spondyloarthritis or systemic lupus erythematosus.
  • the autoimmune arthritis is newly started arthritis or rheumatoid arthritis.
  • autoimmune disease is understood in the present invention as a disease in which the cells of the immune system trigger a chronic inflammatory response in one or several tissues of the individual causing deterioration or even destruction.
  • EIMMI Embec disease
  • autoimmune arthritis would encompass both the terms “Rheumatoid Arthritis” and “Undifferentiated Arthritis” whether it is of recent onset or if it is well established. It is understood by “Recent Arthritis” (ARC) (or onset arthritis) in the present invention, that disease consisting of inflammation of at least one joint, of less than a year of evolution that meets the criteria pre-established by the American College of Rheumatology (ACR) and EULAR of "Rheumatoid arthritis or RA” (Aletaha, Neogi et al.
  • undifferentiated arthritis (Al) which, in many cases, left to its free evolution, ends up leading to an RA.
  • the definition of undifferentiated arthritis is progressively gaining acceptance among those skilled in the art, since it is understood that the earlier patients are treated, the more options for inducing remission we have and currently it is accepted to establish immunomodulatory treatment in patients who do not meet criteria. of AR.
  • ARC refers to a chronic and progressive autoimmune systemic disease, which causes chronic inflammation mainly of the joints, and that given its progressive nature, produces the destruction of them, with their consequent deformation and loss of functional capacity.
  • this disease can cause extraarticular alterations in various organs.
  • the disease activity can be determined by compound indices that provide a number that brings together the information of different clinical and analytical variables such as DAS28 (Prevoo et al. Arthritis Rheum 1995; 38: 44-48), SDAI, CDAI (Smolen et al. Rheumatology (Oxford) 2003; 42: 244-257) and others.
  • Spondyloarthritis in the present invention is understood as those autoimmune diseases with axial and / or peripheral involvement that meet the classification criteria of the Assessment of SpondyloArthritis International Society (ASAS) (Rudwaleit et al. Ann Rheum Dis 201 1; 70: 25-31).
  • ASAS SpondyloArthritis International Society
  • Systemic lupus erythematosus is understood in the present invention as a systemic autoimmune disease defined by the criteria of the American College of Rheumatology (Tan et al. Arthritis Rheum- 1982; 25: 1271-1277).
  • the term "inflammatory bowel disease” or “EN” in the present invention refers to chronic inflammation of the intestine in an individual, where said inflammation is due to the individual's own immune system. The two most frequent forms correspond to ulcerative colitis and Crohn's disease. So in a preferred embodiment the autoimmune disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • psoriasis is understood to be that skin disease which is characterized by a malfunction of the immune system, which causes excess production of skin cells.
  • This disease leads to the formation of reddish bulges covered with scaling.
  • excess cell production also causes the infiltration of white blood cells into the skin.
  • the lesions are generally located in regions with greater friction, such as, but not limited to, elbows, knees or English.
  • Another even more preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the method where the biological sample is blood, serum, plasma, saliva, urine, synovial fluid or lymph.
  • a second aspect of the present invention relates to an in vitro method for the prognosis of an autoimmune disease in a subject suffering from an autoimmune disease, which comprises:
  • in vitro refers to the method of the invention being performed outside the subject's body.
  • a preferred embodiment of the second aspect of the invention relates to the method which further comprises in step (a) the detection of the rs3823082 polymorphism and / or the detection of the rs688136 polymorphism of the VIP gene; and in step (b) the association of the TT genotype of the rs3823082 polymorphism with a poor prognosis and / or the association of the CC genotype of the rs688136 polymorphism with a good prognosis.
  • Another preferred embodiment of the second aspect of the invention relates to the in vitro method which further comprises the detection in step (a) of at least one of the genetic polymorphisms of the VIP gene that is selected from the list comprising rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 and rs12201 140; or any combination thereof, and the association in step (b) of allele A of polymorphism rs12213214, of allele T of polymorphism rs60946248, of allele G of polymorphism rs140023105, of allele T of polymorphism rs7764067,, of allele C of polymorphism rs7764067, , from the G allele of the rs149081483 polymorphism and the T allele of the rs12201 140 polymorphism, or any combination thereof, to a poor
  • a more preferred embodiment of the second aspect of the invention relates to the in vitro method where the autoimmune disease is autoimmune arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, spondyloarthritis or systemic lupus erythematosus.
  • the autoimmune arthritis is newly started arthritis or rheumatoid arthritis.
  • the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • An even more preferred embodiment of the second aspect of the invention relates to the in vitro method where the biological sample is blood, serum, plasma, saliva, urine, synovial fluid or lymph.
  • Another even more preferred embodiment of the second aspect of the invention relates to the method where the subject is a human.
  • the methods of the invention make it possible to have useful information for therapeutic decision making, allowing patients to be selected more likely to need intensive treatment. This results in a reduction in the direct and indirect costs of the disease and an improvement in the patient's quality of life.
  • the present invention also relates to a method according to the second method of the invention where after step (b) if the subject has a poor prognosis, the subject is treated with a combined therapy of synthetic DMARDs or of a synthetic and biological DMARD , especially if biological therapy is a blocking agent of tumor necrosis factor (TNF).
  • TNF tumor necrosis factor
  • the TNF blocking agent is adalimumab, certolizumab, etanercept, golimumab or infliximab.
  • Synthetic DMARDs include azathioprine, antimalarials, methotrexate, leflunomide, sulfasalacin and / or cyclosporine A.
  • a third aspect of the invention relates to an in vitro method for designing an individualized treatment for a subject suffering from an autoimmune disease which comprises detecting the genetic polymorphisms of the VIP gene rs35643203, rs71575932 and / or rs7755568 in a biological sample; in which the presence of the T allele of the genetic polymorphism rs35643203, the presence of the G allele of the genetic polymorphism rs71575932 or the presence of the A allele of the genetic polymorphism rs7755568 is indicative that the treatment to be administered is a combined synthetic and biological DMARD therapy.
  • the third method of the invention we will refer to this as the "third method of the invention.
  • Treatment means the set of means used to cure or alleviate a disease.
  • the treatment to be administered is a combination therapy of DMARD, where the drugs are at least one synthetic and at least one biological when the subject has a poor prognosis.
  • the biological drug is a tumor necrosis factor (TNF) blocking agent, for example but without limiting the TNF blocking agent is adalimumab, certolizumab, etanercept, golimumab or infliximab.
  • TNF tumor necrosis factor
  • Synthetic DMARDs may include azathioprine, antimalarials, methotrexate, leflunomide, sulfasalacin and / or cyclosporine A.
  • azathioprine antimalarials
  • methotrexate methotrexate
  • leflunomide methotrexate
  • sulfasalacin sulfasalacin
  • cyclosporine A cyclosporine A
  • a preferred embodiment of the third aspect of the invention relates to the in vitro method which further comprises detecting the rs3823082 and / or rs688136 polymorphism and where the presence of the TT genotype of the rs3823082 polymorphism of said polymorphism is indicative that the treatment to be administered is said combined therapy and / or where the presence of the CC genotype of the rs688136 polymorphism is indicative that the treatment to be administered is synthetic DMARD monotherapy.
  • a more preferred embodiment of the third aspect of the invention relates to the in vitro method which further comprises the detection of the WP gene polymorphism that is selected from the list comprising rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs12201 140, rs747601483, rs149081483 and rs12201 140; or any of its combinations; and where the presence of allele A of the polymorphism rs12213214, of the allele T of the polymorphism rs60946248, of the allele G of the polymorphism rs140023105, of the allele T of the polymorphism rs7764067, of the allele A of the polymorphism rs7755568, of the allele of C rs149081483 polymorphism any of its combinations, is indicative that the treatment to be administered is said combined therapy and where the presence of the T allele of the
  • an even more preferred embodiment of the third aspect of the invention relates to the in vitro method where the autoimmune disease is autoimmune arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, spondyloarthritis or systemic lupus erythematosus.
  • the autoimmune arthritis is newly started arthritis or rheumatoid arthritis.
  • the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Cro n disease.
  • Another even more preferred embodiment of the third aspect of the invention relates to the in vitro method where the biological sample is blood, serum, plasma, saliva, urine, synovial fluid or lymph.
  • the detection of the polymorphisms of the invention can be carried out by any technique known to the person skilled in the art, for example by sequencing, by genotyping, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), by "restriction fragment length polymorphysm” (RFLP) or by restriction enzymes. Detection can be carried out using primers or probes.
  • sequence can be carried out using primers or probes.
  • sequence refers to the determination of the nucleotides of a template nucleic acid and its order.
  • Conditions under which sequencing is performed generally include (a) contacting a template nucleic acid with a polymerase in a mixture that further comprises a primer, a bivalent cation (eg, Mg 2+ ), and nucleotides, generally, dNTPs and at least one ddNTP (dideoxynucleotide triphosphate), and (b) subjecting said mixture to a temperature sufficient for the polymerase to initiate the incorporation of the nucleotides into the primer by complementing the bases with the template nucleic acid, and resulting in a population of complementary DNA molecules of different sizes.
  • the separation of said population from complementary DNA molecules generally, by electrophoresis, allows the nucleotide sequence to be determined.
  • amplification refers to the increase in the number of copies of a template nucleic acid.
  • the conditions under which amplification is performed generally include (a) contacting a template nucleic acid with a polymerase in a mixture that further comprises at least one primer (usually two primers), a bivalent cation (eg, Mg 2 + ), and nucleotides, generally, dNTPs (b) subjecting said mixture to a temperature sufficient for the polymerase to initiate the incorporation of the nucleotides into the primer by complementarity of bases with the template nucleic acid, and then to a population of molecules of Complementary DNA generally of the same size.
  • a primer usually two primers
  • a bivalent cation eg, Mg 2 +
  • nucleotides generally, dNTPs
  • CPR can also be quantitative CPR in real time.
  • template nucleic acid refers to a single or double stranded nucleic acid molecule that is to be amplified or sequenced.
  • primer also called “first” or “oligo”
  • oligo refers to an oligonucleotide capable of acting as the starting point of DNA synthesis when hybridized with the template nucleic acid.
  • the primer is a deoxyribose oligonucleotide.
  • Primers can be prepared by any suitable method, including, but not limited to, cloning and restriction of appropriate sequences and direct chemical synthesis.
  • the primers can be designed to hybridize with specific nucleotide sequences in the template nucleic acid (specific primers) or can be synthesized at random (arbitrary primers).
  • a "primer” can be labeled or labeled by techniques well known in the state of the art.
  • Detectable labels include, for example, radioactive isotopes, fluorescent labels, chemiluminescent labels, bioluminescent labels or enzymatic labels.
  • primers are those described as SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, or any combination thereof.
  • the primers may be modified to comprise sequences that are useful in the technique used, for example in sequencing.
  • the primers may comprise the sequence SEQ ID NO: 60 attached to its 5 'end in the case of the first direction, and the sequence SEQ ID NO: 61 attached to the 5' end of the first antisense.
  • the methods of the invention can be applied at any time during the development of autoimmune disease. Also the methods of the invention can be applied in patients without treatment with immunomodulatory drugs.
  • the methods of the invention may further comprise quantifying at least one VIP gene expression product in an isolated biological sample and / or also quantifying clinical variables.
  • These clinical variables can be, for example, without limiting the patient's sex, the state of activity at the onset of the disease, as well as others known to the person skilled in the art. If you are studying recently started arthritis or rheumatoid arthritis, it could be citrullinated antiseptic antibodies (ACPA). Therefore, a particular embodiment of the first, second and third aspects of the invention refers to the methods where ACPA is also detected.
  • the ACPA can be detected by techniques known to those skilled in the art, such as ELISA.
  • any of the steps of the methods of the invention can be fully or partially automated.
  • the methods described herein may comprise additional steps, for example, related to the pre-treatment of the sample or the extraction of the genetic material necessary for further analysis.
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of the genetic polymorphism of the VIP gene rs35643203, rs71575932 and / or rs7755568 as a prognostic marker of autoimmune disease in a subject suffering from an autoimmune disease.
  • a preferred embodiment of the fourth aspect of the invention relates to the use which further comprises the use of the genetic polymorphism of the VIP gene rs3823082 and / or rs688136.
  • a more preferred embodiment of the fourth aspect of the invention relates to the use which further comprises the use of the genetic polymorphisms of the VIP gene selected from the list comprising: rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483, rs122001 140, or any of its combinations.
  • an even more preferred embodiment of the fourth aspect of the invention relates to the use where the autoimmune disease is autoimmune arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, spondyloarthritis or systemic lupus erythematosus.
  • the autoimmune arthritis is newly started arthritis or rheumatoid arthritis.
  • the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • a fifth aspect of the invention relates to a kit comprising primers or probes for detecting the genetic polymorphisms of the VIP gene rs35643203, rs71575932 and / or rs7755568.
  • a preferred embodiment of the fifth aspect of the invention relates to the kit which further comprises primers or probes for detecting the genetic polymorphism of the VIP gene rs3823082 and / or rs688136.
  • a more preferred embodiment of the fifth aspect of the invention relates to the kit which further comprises primers or probes that detect the genetic polymorphisms of the VIP gene rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 and rs12201 140, combinations .
  • kits which further comprises the elements necessary to detect ACPA, for example, primers, probes, specific antibodies, citrullinated peptides or citrullinated proteins.
  • the kit comprises the primers described as SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, or any combination thereof.
  • the primers may be modified to comprise sequences that are useful in the technique used, for example in sequencing.
  • the primers may comprise the sequence SEQ ID NO: 60 attached to its 5 'end in the case of the first direction, and the sequence SEQ ID NO: 61 attached to the 5' end of the first antisense.
  • the kit of the invention can also comprise at least one DNA polymerase, a retrotranscriptase, an RNA polymerase or a fluorophore.
  • the kit may comprise a mixture of tri-phosphate deoxynucleotides (dNTPs), a mixture of tri-phosphate nucleotides (NTPs), deoxyribonuclease (DNase), ribonuclease inhibitors (RNase), Dithiothreitol (DTT), inorganic pyrophosphatase (PPi) and the necessary buffers for the enzymes provided in the kit.
  • the kits may also contain other molecules, genes, proteins or probes of interest, that serve as positive and negative controls.
  • the kits further comprise the instructions for carrying out the methods of the invention.
  • the probe or primers may be located on a solid support, for example, but not limited to, glass, plastic, tubes, multiwell plates, membranes, or any other known support.
  • a sixth aspect of the invention relates to the use of the kit of the fifth aspect of the invention for the prognosis of an autoimmune disease in a subject suffering from said disease.
  • a preferred embodiment of the sixth aspect of the invention relates to the use where the autoimmune disease is autoimmune arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, spondyloarthritis or systemic lupus erythematosus.
  • autoimmune arthritis is newly initiated autoimmune arthritis or rheumatoid arthritis.
  • the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • polynucleotide refers to a polymeric form of nucleotides of any length, which may be, or not, chemically or biochemically modified.
  • FIG. 1 represents serum VIP levels of patients with onset arthritis according to the genotype of polymorphisms rs35643203 (panel A), rs71575932 (panel B) and rs7755568 (panel C).
  • FIG. 2 represents VIP levels according to the rs3823082 polymorphism genotype in serum in patients with RA.
  • FIG. 3. Represents VIP levels according to the genotype of polymorphism rs688136 (panel A) and rs12201 140 (panel B) in serum in patients with RA.
  • FIG. 4 represents the serum VIP levels of patients with RA according to the genotype combination of rs3823082, rs35643203, rs71575932 and rs7755568.
  • the label 0 corresponds to not being homozygous T of rs3823082 and not having any minor allele of rs35643203, rs71575932 or rs7755568.
  • Label 1 corresponds to being homozygous T of rs3823082 or having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • Label 2 corresponds to being homozygous T of rs3823082 and having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • FIG. 5 represents how the presence of genotypes associated with low levels of VIP interferes with the CC genotype of rs688136, which is associated with higher levels of VIP.
  • the label 0 corresponds to not being homozygous T of rs3823082 and not having any minor allele of rs35643203, rs71575932 or rs7755568.
  • Label 1 corresponds to being homozygous T of rs3823082 or having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • Label 2 corresponds to being homozygous T of rs3823082 and having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • FIG. 6 represents activity levels (estimated with the index of the Princess University Hospital [HUPI]; Castrejón et al, Arthritis Care Res 2013; 65: 518-25) throughout the follow-up according to the combination of genotypes of rs3823082, rs35643203, rs71575932 and rs7755568 that are associated with having low serum VIP of patients with RA.
  • the label 0 corresponds to not being homozygous T of rs3823082 and not having any minor allele of rs35643203, rs71575932 or rs7755568.
  • Label 1 corresponds to being homozygous T of rs3823082 or having at least one minor allele of rs35643203, rs71575932 or rs7755568.
  • the label 2 corresponds to being homozygous T of rs3823082 and having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • FIG. 7 represents the intensity of treatment after two years of follow-up (calculated as the number of days with DMARD in the two years of follow-up / number of days between baseline and final visit; for a more extensive definition see González-Alvaro PLoS One 201 1 ; 6: e29492) according to the genotype combination of rs3823082, rs35643203, rs71575932 and rs7755568 that are associated with having low serum VIP of patients with RA.
  • the label 0 corresponds to not being homozygous T of rs3823082 and not having any minor allele of rs35643203, rs71575932 or rs7755568.
  • Label 1 corresponds to being homozygous T of rs3823082 or having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • Label 2 corresponds to being homozygous T of rs3823082 and having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • the label 0 corresponds to not being homozygous T of rs3823082 and not having any minor allele of rs35643203, rs71575932 or rs7755568.
  • Label 1 corresponds to being homozygous T of rs3823082 or having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • Label 2 corresponds to being homozygous T of rs3823082 and having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or rs7755568.
  • FIG. 9 represents the radiological progression after two years of follow-up depending on whether or not patients have any of the rs3823082, rs35643203, rs71575932 or rs7755568 genotypes that are associated with having low serum VIP in patients with RA.
  • FIG. 10 represents radiological progression after two years of follow-up depending on whether or not patients have any of the genotypes of rs3823082, rs35643203, rs71575932 or rs7755568 that are associated with having low serum VIP in patients with RA, stratified by number of copies of the shared epitope (A) or smoking habit (B).
  • FIG. 10 represents radiological progression after two years of follow-up depending on whether or not patients have any of the genotypes of rs3823082, rs35643203, rs71575932 or rs7755568 that are associated with having low serum VIP in patients with RA, stratified by number of copies of the shared epitope (A) or smoking habit (B).
  • A shared epitope
  • B smoking habit
  • 11 represents how the presence of genotypes associated with low levels of VIP interferes in patients with rheumatoid arthritis (being homozygous TT of rs3823082 or having at least one minor allele of rs35643203, rs7157932 or rs7755568) with having a C allele of rs688136 in the serum VIP levels of patients in the spondyloarthritis onset registry.
  • Example 1 descriptive study of genetic variants of VIP that are related to their serum levels in rheumatoid arthritis
  • the VIP gene was sequenced and surprisingly it was found that certain genetic variants of it correlated with low serum levels of the VIP peptide in serum and it was shown that certain genotypes appeared in patients with a worse prognosis (i.e. worse evolutionary course or greater severity ) and need for more intense treatment.
  • the primer sequences described by Applied Biosystems® and accessible through the NCBI (“> gnl
  • the primers were also used where at the 5 'end the sequence TGTAAAACGACGGCCAGT was added in the primers direction (SEQ ID NO: 60) and the sequence CAGGAAACAGCTATGACC in the antisense primers (SEQ ID NO: 61 ), where these sequences refer to an added sequence of the M13 virus that was used to verify correct sequencing. Sequencing was carried out in a genetic analyzer of capillary electrophoresis with 8 capillaries of Applied Biosystems® (3500 Genetic Analyzer) that allows to execute the resequencing of the gene in search of mutational profiles using a single polymer in the capillary matrix.
  • High quality sequencing data were obtained in 9 patients with low VIP and 1 1 patients with high VIP.
  • the main clinical data of these patients according to their level of VIP expression are shown in Table 1.
  • Table 1 Once the sequences of the 29 amplicons were obtained for each of the 20 patients, they were compared with the VIP consensus sequence published in PubMed with reference NC_000006.1 1 (Chromosome 6; 153071932-153080900) using the Variant Repórter software (Applied Biosystems®). In this process, 17 single nucleotide polymorphisms (SNPs), 15 previously described and 2 new ones, were detected with respect to the VIP consensus sequence.
  • Table 2 describes in more detail the genetic variants detected in the 20 patients with their distribution according to serum VIP levels.
  • Table 1 Clinical data of the patients in whom VIP sequencing was performed, according to the serum levels of this neuropeptide.
  • ACPA anti-citrullinated protein antibodies
  • DAS28 disease activity score for counts of 28 joints
  • HUPI activity index of the Princess HU (Castrejon et al. Arthritis Care Res 2013, 65 (4): 518-25); med: median; p25: 25th percentile; p75: 75th percentile; p ⁇ 0.05 was considered significant.
  • rs35643203 this is a C> T substitution (in the complementary strand the substitution would be G> A) at position 153072433 located in intron 1 of the VIP gene.
  • the frequency of the minor allele (MAF) T in the general population is 3% and in the present invention a MAF of 17% was found in patients with low VIP and 0% in patients with high VIP. This position was correctly sequenced in the 20 patients and, in addition, could be confirmed as it was covered by amplicons 4 and 5.
  • rs3823082 it is a C> T substitution (in the complementary strand the substitution would be G> A) at position 153074322 located at intron 2.
  • the frequency of the minor allele T described in the general population is 25%.
  • an MAF of 28% was found in patients with low VIP and 4% in patients with high VIP. This position was correctly sequenced in the 20 patients, being located in amplicon 9.
  • rs71575932 it is a substitution A> G (in the complementary strand the substitution would be T> C) at position 153075844 located in intron 3.
  • the frequency of the minor allele G described in the general population is 3%.
  • an MAF of 17% was found in patients with low VIP and 0% in patients with high VIP.
  • Example 2 validation of VIP single nucleotide polymorphisms rs3823082, rs7755568, rs35643203, rs71575932 and rs688136
  • SNPs rs3823082, rs35643203, rs71575932 and rs688136 proceeded to genotyping by Applied Biosystems TaqMan® probes (catalog numbers: C_27491244_10, C_3250637_10, C_3250638_10 and C respectively 3250639_10 reference TaqMan Genotyping Assays 4,351,379).
  • SNP rs7755568 genotyping has been carried out by sequencing amplicon 17 as previously described. This has allowed us to have information on two other genetic variants also present in said amplicon: rs12201030 and rs12201 140. Table 3. Clinical data of the patients in which the data obtained in example 1) was validated.
  • ACPA antibodies against citrullinated proteins
  • DAS28 disease activity score for counts of 28 joints
  • HUPI La Princesa HU activity index (Castrejon et al. Arthritis Care Res 2013, 65 (4): 518-25); med: median; p25: 25th percentile; p75: 75th percentile.
  • the genotype of the first 2 SNPs has been obtained in 440 patients in the registry, in 428 patients in the case of rs71575932 and in 425 patients for rs688136.
  • the MAF (minor allele frequency, in this case the T allele) of rs3823082 is 23.2%.
  • the MAF (T allele) of rs35643203 is 6.5%.
  • the MAF of rs71575932 (allele G) is 7.5%.
  • the MAF (allele C) of rs688136 is 34%.
  • rs35643203 has been chosen as the representative of the previous 3. Even with some of them the association is not significant.
  • Example 2.1 Relationship between the genotype of the different variants and the levels of VIP in the newly started enlarged arthritis population.
  • homozygous patients of the rs35643203 common allele panel A, CC genotype
  • panel A CC genotype
  • the pattern of serum VIP levels between their genotypes is practically identical (panels B and C respectively).
  • the differences in the levels of significance correspond to differences in the number of samples due to lack of information on the genotype of some patients due to technical failure.
  • VIP levels are generally higher, there are still patients with low VIP levels. This implies that these genetic variants are not the only ones involved in the regulation of neuropeptide levels.
  • SNP rs3823082 As shown in Figure 2, it is the homozygous patients of the minor allele (T) who have lower levels of VIP. As mentioned in describing the previous figure, also in the case of this SNP there are patients with low levels among those who present, at least one copy of the common allele (C).
  • Figure 3 shows the VIP levels according to the genotypes of SNPs rs688136 (panel A) and rs12201 140 (panel B).
  • the minor allele of rs688136 was found more frequently among patients with high VIP, especially the CC genotype. In the total population in which we have serum VIP levels, this trend is observed, although without reaching significant levels ( Figure 3A). This situation seems to be related to the interaction with rs12201 140.
  • the minor allele (T) was only found in one of the patients with low VIP, as a heterozygous genotype. In the wider population with serum VIP levels, this tendency is observed to be lower in the AT heterozygotes, but this tendency is lost in the homozygous TT.
  • Figure 5 shows how to be homozygous CC of rs688136 modulates towards higher levels of VIP the effect described in figure 4.
  • At least 5 of the 17 SNP type genetic variants detected in example 1) are associated with differential distribution in VIP levels. Therefore, they could be used as prognostic biomarkers instead of measuring VIP levels.
  • the genotypes that individually provide more information are rs35643203, rs71575932 and rs7755568 that could be interchangeable, since their distribution is practically identical (Tables 4 to 6).
  • rs3823082 provides additional information on a subpopulation of patients, homozygous of their minor allele, which also contributes to lower serum levels of VIP. The additive effect of these four SNPs is clearly seen in Figure 4.
  • the CC genotype of rs688136 is associated with having higher serum VIP levels.
  • Example 2.2 Study of the genetic variants rs3823082, rs35643203 and rs71575932 as prognostic markers in patients with onset arthritis. To analyze whether the mentioned genetic variants or their combination were useful to predict the prognosis of patients with onset arthritis, three parameters related to the severity of the disease were used:
  • treatment requirement variables are subrogated activity variables. of the disease or severity.
  • the intensity of treatment with DMARD has been used, which is calculated as the sum of the number of days that the patient has been with the different DMARDs he has received in the first two years of follow-up, weighted by a coefficient according to the power FAME, based on the number of days between the baseline visit and two years of follow-up (for a more exact definition see González-Alvaro et al. PLoS One 201 1; 6 (12): e29492)
  • label 0 corresponds to not being homozygous T of rs3823082 and not having any minor allele of rs35643203, rs71575932 or rs7755568.
  • Label 1 corresponds to being homozygous T of rs3823082 or having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • Label 2 corresponds to being homozygous T of rs3823082 and having at least one minor allele of rs35643203, of rs71575932 or of rs7755568.
  • the next variable to analyze was the intensity of the treatment with DMARD over the two years of follow-up. This variable can be considered a subrogated variable of severity, since, as mentioned in the previous paragraph, those patients who in the follow-up have worse evolution are being treated more intensely.
  • each variable considered as reference by the model is that against which the other conditions of that variable are compared. For example, adjusted for the effect of the rest of the variables, being a woman is associated with receiving 0.36 times the treatment that men receive.
  • Figure 8 allows us to visualize how the variables gender, diagnosis and ACPA are introducing a bias or confusing / modifying the effect of our variable of interest (low or normal VIP levels) on the dependent (or outcome) variable, in this case the intensity of treatment with FAME.
  • the greater intensity of treatment associated with presenting the genetic variants that determine having low VIP is best seen in the case of male patients, with undifferentiated arthritis or negative ACPA who do not encourage the rheumatologist to a more intensive treatment from the beginning of the condition.
  • patients who meet RA criteria are women or have positive ACPA, responsible physicians tend to always treat more intensely, although there is also a certain tendency towards greater treatment in those who have more genetic variants associated with low VIP ( label 2).
  • E.C . shared epitope (refers to the common amino acid sequence encoding those HLA-DRB1 alleles that are associated with increased risk for developing rheumatoid arthritis). N.l. not included for not improving the model.
  • Example 3 Relationship between the genotype of the different variants and VIP levels in a recently started spondyloarthritis population
  • Spondylitis Disease Activity Index "; BASFI,” Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index "; PCR: C-reactive protein; ESR, erythrocyte sedimentation rate; Hb, hemoglobin; VIP,” vasoactive intestinal peptide "; N.S. not significant.
  • Figure 1 1 shows graphically how to carry the minor allele of rs688136, in the absence of any minor allele of rs3823082, rs71575932 or rs35643203, is associated with the presence of higher levels of VIP (white box to the left of the figure ). On the contrary, having some minor allele of rs3823082, rs71575932 or rs35643203, in the absence of the minor allele of rs688136, causes VIP levels to be lower (dark gray box to the right of the figure).
  • Example 4 Relationship between the genotype of the different variants and VIP levels in a population of systemic lupus erythematosus

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de pronóstico de determinación de la gravedad de enfermedades autoinmunes, por ejemplo, artritis reumatoide, espondiloartritis y lupus eritematosos sistémico, caracterizado por comprender la detección de ciertos polimorfismos genéticos del gen VIP, entre los que se encuentran rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568. También el método de la invención es útil para establecer un tratamiento personalizado del paciente. También se refiere al uso de los polimorfismos genéticos del gen VIP descritos en la invención como biomarcadores de dichas enfermedades, así como a un kit que comprende primers o sondas para la detección de dichos polimorfismos y a su uso para el mismo fin

Description

Método pronóstico de enfermedades autoinmunes mediante el qenotipado de variantes genéticas del péptido intestinal vasoactivo
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a un método pronóstico de enfermedades autoinmunes que comprende la detección de polimorfismos genéticos del gen del péptido intestinal vasoactivo ( VIP). Por lo tanto, la presente invención se podría encuadrar en el campo de la biomedicina. ESTADO DE LA TÉCNICA
Las enfermedades autoinmunes, como la artritis reumatoide (AR), la psoriasis, la enfermedad inflamatoria intestinal, la espondiloartritis o el lupus eritematoso sistémico, comparten una serie de mecanismos etiopatogénicos que ha hecho que se las denomine globalmente como "enfermedades inflamatorias mediadas por mecanismos inmunes" (EIMMI) y también comparten su respuesta a tratamientos inmunomoduladores o inmunosupresores similares o iguales. La AR es la enfermedad reumática autoinmune más común.
La AR provoca inflamación crónica de la membrana sinovial de las articulaciones diartrodiales, lo cual causa su progresivo deterioro, y como consecuencia, provoca una discapacidad y deterioro de la calidad de vida del paciente. Además, con cierta frecuencia se acompaña de manifestaciones sistémicas y de un aumento en el número de comorbilidades e incluso de la mortalidad en comparación con la población general. Su etiología se considera de origen multigénico con una importante interacción con factores ambientales. Su prevalencia oscila entre un 0,3 y un 1 %, siendo por ejemplo en España la prevalencia de un 0,5%, lo que supone unos 200.000 pacientes con AR en dicho país. Dada su capacidad para producir incapacidad funcional, la AR es una de las principales causas de incapacidad laboral permanente en España. Por tanto, se trata de una enfermedad con una gran relevancia económica y social. Las espondiloartropatias son un grupo heterogéneo de enfermedades que comparten manifestaciones clínicas y radiológicas, de las cuales la espondilitis anquilosante es la más prevalente. Se caracterizan por la presencia de inflamación de las articulaciones de la columna y las sacroilíacas, así como su asociación a la presencia del HLA-B27, lo que condiciona su asociación familiar y una serie de mecanismos patogénicos comunes. Aunque la prevalencia de la espondilitis anquilosante es menor que la de la AR, también tiene una importante capacidad para deteriorar la capacidad funcional de los pacientes, lo que también conlleva altos costes sociales, especialmente derivados de la incapacidad laboral que provocan, ya que afecta a pacientes de menor edad.
Por otra parte, el lupus eritematosos sistémico es una enfermedad muy heterogénea que se caracteriza por una activación del sistema inmune en su vertiente humoral lo que condiciona la aparición de autoanticuerpos, comúnmente anticuerpos antinucleares, anti-DNA y otros. Su expresión clínica es muy variable desde formas clínicamente leves e incluso silentes hasta formas catastróficas con afectación de órganos vitales como el riñon, cerebro, corazón o pulmones. Su prevalencia es menor que la de las dos EIMMI descritas previamente y afecta mayoritariamente a mujeres jóvenes.
Durante los últimos años se ha ido acumulando evidencias que demuestran que el inicio de tratamiento precoz con fármacos modificadores de la enfermedad (FAME) permite un mejor control de las EIMMI. Aun así, muchos pacientes no alcanzan el estado ideal de remisión, probablemente porque no se establece un tratamiento lo suficientemente intenso desde el inicio, por no poderse determinar la gravedad con la que va a cursar la enfermedad.
Por todo ello, se hace necesaria la búsqueda de elementos que permitan determinar cuál va a ser el curso evolutivo de la enfermedad y que, por tanto, permitan determinar precozmente la intensidad del tratamiento adecuada para cada paciente, asumiendo los riesgos de los tratamientos más agresivos para pacientes que vayan a tener un peor pronóstico y evitando estos tratamientos agresivos en los pacientes que vayan a tener una forma leve de la enfermedad. En este sentido ya se han realizado algunos estudios sobre cuantificación de determinadas proteínas o péptidos en fluidos biológicos, entre los que se encuentra el VIP (por ejemplo, Martínez C et al. 2014 PLOS One 1 :e85248) sin embargo, los métodos de cuantificación utilizados hasta la fecha tienen una mala reproducibilidad interensayo, de modo que se hace necesario un método más fiable y reproducible. En lo que respecta a VIP, no se han observado variantes genéticas asociadas a un mayor riesgo para padecer enfermedades autoinmunes. De hecho, puede ocurrir que variantes genéticas de determinadas moléculas incidan en el riesgo de desarrollar las enfermedades autoinmunes, pero no influyan en el curso evolutivo de las mismas y, por el contrario, que moléculas cuya variabilidad genética no influye en el riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune, sí modulen su gravedad. En este sentido, se han realizado estudios de variantes genéticas de diversos genes con la asociación al pronóstico en la AR (por ejemplo WO2008010085), aunque no hay resultados definitivos y, en concreto, no se ha estudiado previamente el gen de VIP desde el punto de vista de la predicción pronostica. Así pues, se hace necesaria la búsqueda de marcadores reproducibles que permitan una mejor determinación del pronóstico de las enfermedades autoinmunes, o que puedan suponer alternativas o complementen los biomarcadores ya disponibles para detectar a pacientes que respondan mejor o peor a un determinado tratamiento, lo cual permitiría ahorrar tiempo y costes en el manejo de las EIMMI.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se han determinado variantes genéticas del gen P que se asocian a un mayor riesgo de tener un mal curso evolutivo de enfermedades autoinmunes, ejemplificado por la artritis reumatoide, espondiloartritis y lupus eritematoso sistémico, y necesitan de un tratamiento más intenso a lo largo de su seguimiento. Dichas variantes génicas se asocian a un bajo nivel sérico del péptido VIP.
En la presente invención se demuestra la utilidad de varios polimorfismos ("single nucleotide prolymorphisms", SNP) del gen VIP, en concreto los SNPs rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568 en el pronóstico de artritis reumatoide. Los autores han demostrado que rs35643203, rs71575932 y rs7755568 están en desequilibrio de ligamiento, por lo que los tres resultan informativos para la presente invención. Además de estos SNPs, se ha demostrado que si se utilizan rs3823082 y/o rs688136 también se puede pronosticar la gravedad de la enfermedad. También los polimorfismos rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 y rs12201 140; o cualquiera de sus combinaciones; en combinación con los anteriores resulta de utilidad. Además, en la presente invención se muestran resultados para otras enfermedades inflamatorias mediadas por mecanismos inmunes (EIMMI), como son la espondiloartritis y el lupus eritematoso sistémico, demostrándose que los resultados obtenidos para AR son extrapolabas a otras EIMMI. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método de pronóstico de una enfermedad autoinmune, como por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, espondiloartritis (por ejemplo, la espondilitis anquilosante) o el lupus eritematoso sistémico. También se refiere a un método para establecer un tratamiento personalizado del paciente que presenta una EIMMI.
Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el pronóstico de una enfermedad autoinmune que comprende la detección de los polimorfismos genéticos del gen "péptido intestinal vasoactivo" { VIP) rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568 en una muestra biológica aislada de un sujeto que padece una enfermedad autoinmune. En adelante nos referiremos a éste como al "método primero de la invención". En la presente invención se entiende por "pronóstico" la capacidad de determinar en pacientes de una enfermedad autoinmune cómo va a evolucionar dicha enfermedad en cuanto a su gravedad. El término "pronóstico" también se refiere a la capacidad de detectar sujetos ya diagnosticados de una enfermedad autoinmune con alta probabilidad de sufrir un empeoramiento de la enfermedad. Esta mala evolución o "mal pronóstico" puede definirse como una menor posibilidad de alcanzar la remisión de la enfermedad, teniendo en cuenta que el experto en la materia conoce que existen múltiples formas de definir este estado ideal de remisión en cada enfermedad. Por ejemplo en la artritis reumatoide existen diferentes formas de definir el estado ideal de remisión, como por ejemplo aunque sin limitarse los descritos en Felson et al. Arthritis Rheum 201 1 ;63:573-586. Otras situaciones que también pueden considerarse mala evolución o mal pronóstico son no alcanzar un estado de mínima actividad de la enfermedad (Wells et al. J Rheumatol 2005;32:2016-2024) o como la posibilidad de tener peor respuesta terapéutica bien según criterios ACR20, 50 o 70 (Felson et al. Arthritis Rheum 1995;38:727-735) o según criterios de la Liga Europea Contra el Reumatismo {European League Against Rheumatism o (EULAR) (van Gestel et al. Arthritis Rheum 1996;39:34-40). También se entiende por "mal pronóstico" en la presente invención a tener mayor probabilidad de necesidad de un tratamiento más intenso, por ejemplo en el caso de la AR a la necesidad de una terapia combinada de fármacos FAME, independientemente de que uno de los fármacos sea biológico o no. Y también se entiende por "mal pronóstico" a un aumento en la probabilidad de mayor destrucción articular según la evaluación radiográfica para el caso de la AR.
En el caso de espondilitis anquilosante se considera "mal pronóstico" no alcanzar la remisión definida según los puntos de corte de los siguientes índices para la evaluación de la actividad: BASDAI<2 (Juanola Roura X et al. Reumatol Clin 201 1 ;7:1 13-23) o ASDAS<1 ,3 (Machado P et al. Ann Rheum Dis 201 1 ;70:47-53). También se entiende por "mal pronóstico" la necesidad de iniciar tratamiento con terapia biológica o tener progresión del daño estructural evaluado bien por radiología simple o resonancia magnética.
Para lupus eritematoso sistémico la definición de "mal pronóstico" como bien lo conoce el experto en la materia, es más compleja, ya que esta es una enfermedad mucho más heterogénea y la actividad clínica se mide más por brotes, considerando como tal, por ejemplo, tener un índice SLEDAI>3 (Calvo-Alén J et al. Reumatología Clin 2013; 9: 281 -296). No obstante, la gravedad de la enfermedad puede depender del órgano afectado. De manera que estando la enfermedad activa, las formas de la enfermedad que afectan a órganos vitales (corazón, riñon, cerebro) serían más graves desde el punto de vista vital que otras con afectación de órganos no vitales como las articulaciones o la piel. Otra forma de evaluar el mal pronóstico sería la refractariedad a varios tratamientos y el requerimiento de tratamiento más intenso.
Se entiende por lo tanto como "buen pronóstico" lo contrario a lo anteriormente descrito, es decir, una mayor probabilidad de alcanzar un estado de remisión o mínima actividad de la enfermedad, o bien ser capaz de conseguir una adecuada respuesta terapéutica según los criterios antes definidos o también se refiere a una remisión espontánea de la enfermedad.
El pronóstico debe ser realizado, de forma preferible, aunque sin limitarse, en el primer año del inicio de los síntomas de la enfermedad autoinmune, incluso antes de que se establezca el diagnóstico definitivo de la enfermedad. De cualquier forma, el método también puede ser aplicado a lo largo de cualquier momento del desarrollo de la enfermedad.
Se entiende por " VIP' en la presente invención aquel gen que presenta capacidad de codificar para el "péptido intestinal vasoactivo" o "VIP". El gen puede ser, por ejemplo, aunque sin limitarse, el gen VIP con número de acceso al GenBank del NCBI {National Center for Biotechnology Information) AH003027. El VIP en la presente invención se refiere al péptido con número de acceso al GenBank del NCBI AAB22264.1 de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 (HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN).
El término "polimorfismo genético" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de la cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN o DNA, "desoxirribonucleic acid") que tiene al menos una frecuencia del 1 % en los individuos de una población. Los polimorfismos genéticos pueden ser variaciones de uno o varios nucleótidos. El polimorfismo de un solo nucleótido, "single nucleotide polymorphism" o SNP, generalmente da lugar a dos alelos distintos. Los SNPs o polimorfismos pueden contener información sobre la variación de un solo polimorfismo o la información de un haplotipo si son SNP etiquetas o "tag-SNP". En la presente invención los términos "polimorfismo" y "SNP" se utilizan de manera indistinta.
En la presente invención se demuestra que los polimorfismos rs35643203, rs71575932 y rs7755568 están en desequilibrio de ligamiento, es decir, son polimorfismos marcadores de una región genómica que se encuentra dentro de un determinado bloque haplotípico. Se entiende por "haplotipo", una combinación de alelos de diferentes loci de un cromosoma que son trasmitidos juntos. Un haplotipo puede ser un locus, varios loci, o un cromosoma entero dependiendo del número de eventos de recombinación que han ocurrido entre un conjunto dado de loci. Los alelos transmitidos de la madre forman el haplotipo materno, mientras que los alelos del padre forman el haplotipo paterno. También se refiere a un conjunto de polimorfismos (SNPs) que se heredan en bloque con unas medidas de desequilibrio de ligamiento r2≥0,90 y que se identifican mediante el genotipado de uno de los polimorfismos incluidos en dicho haplotipo. En la presente invención, los polimorfismos genotipados rs35643203, rs71575932 y rs7755568 pertenecen al mismo bloque haplotípico según los resultados obtenidos (es decir, son Tag- SNPs). Cualquier variante genética que se encuentre dentro del mismo bloque haplotípico que estos Tag-SNPs genotipados se heredará conjuntamente con éstos con una alta probabilidad. Los polimorfismos dentro de un bloque haplotípico están en desequilibrio de ligamiento. "Desequilibrio del ligamiento" (LD del inglés "Hnkage disequilibrium") es la propiedad de algunos loci de no segregar de forma independiente, es decir, poseen una frecuencia de recombinación menor del 50%. En la presente invención el término "alelo menor" se refiere al alelo que menor representación tiene en la población, tal y como lo conoce el experto en la materia y por lo tanto, el término "alelo mayor" se refiere al alelo más frecuente en la población.
Se entiende por polimorfismo rs35643203 a la sustitución C>T (en la hebra complementaria la sustitución sería G>A) en la posición 153072433 localizada en el intrón 1 del gen VIP.
Se entiende por polimorfismo rs71575932 a la sustitución A>G (en la hebra complementaria la sustitución sería T>C) en la posición 153075844 localizada en el intrón 3 del gen VIP. Se entiende por polimorfismo rs7755568 a la sustitución T>A (en la hebra complementaria la sustitución sería A>T) en la posición 153076955 localizada en el intrón 4 del gen VIP.
El término "muestra biológica" en la presente invención se refiere a cualquier muestra que permita determinar los polimorfismos de VIP del individuo del que se ha obtenido dicha muestra, e incluye, pero sin limitarnos, fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica comprende ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico. La muestra biológica podría ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, saliva, orina, líquido sinovial o linfa. También puede ser una muestra de tejido. Otras muestras de interés serían por ejemplo células mononucleares de sangre periférica, por ejemplo linfocitos T. La muestra biológica además se puede provenir de extracciones realizadas de forma rutinaria en análisis que se pueden realizar periódicamente a los pacientes.
La muestra biológica en la presente invención puede ser fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.
En la presente invención el término "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente. Preferiblemente el sujeto es un humano.
Una realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere al método que además comprende la detección del polimorfismo genético rs3823082 del gen VIP y/o del rs688136.
Se entiende por polimorfismo rs3823082 a la sustitución C>T (en la hebra complementaria la sustitución sería G>A) en la posición 153074322 localizada en el intrón 2 del gen VIP. Se entiende por polimorfismo rs688136 a la sustitución T>C (en la hebra complementaria la sustitución sería A>G) en la posición 153080061 localizada en el exón 7 del gen VIP que corresponde a la región 3' UTR de su mRNA.
Una realización más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al método que además comprende la detección de al menos uno de los polimorfismos genéticos del gen VIP que se selecciona de la lista que comprende: rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs12201 140, rs74760293 y rs149081483; o cualquiera de sus combinaciones, en una muestra biológica aislada de un sujeto. Se entiende por polimorfismo rs12213214 a la sustitución C>A (en la hebra complementaria la sustitución sería G>T) en la posición 153070786 localizada en el promotor del gen VIP.
Se entiende por polimorfismo rs60946248 a la sustitución C>T (en la hebra complementaria la sustitución sería G>A) en la posición 153071 195 localizada en el promotor del gen VIP. Se entiende por polimorfismo rs140023105 a la sustitución A>G (en la hebra complementaria la sustitución sería T>C) en la posición 153072056 localizada en el exón 1 del gen VIP que se corresponde con la región 5' UTR de su mRNA. Se entiende por polimorfismo rs7764067 a la sustitución A>T (en la hebra complementaria la sustitución sería T>A) en la posición 153074199 localizada en el intrón 2 del gen VIP.
Se entiende por polimorfismo rs12201030 a la sustitución A>G (en la hebra complementaria la sustitución sería T>C) en la posición 153076789 localizada en el intrón 4 del gen VIP.
Se entiende por polimorfismo rs12201 140 a la sustitución A>T (en la hebra complementaria la sustitución sería T>A) en la posición 153076956 localizada en el intrón 4 del gen VIP.
Se entiende por polimorfismo rs74760293 a la sustitución T>C (en la hebra complementaria la sustitución sería A>G) en la posición 153077241 localizada en el intrón 4 del gen VIP.
Se entiende por polimorfismo rs149081483 a la sustitución T>G (en la hebra complementaria la sustitución sería A>C) en la posición 153078500 localizada en el intrón 6 del gen VIP. Una realización aún más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al método donde la enfermedad autoinmune es preferiblemente artritis autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, espondiloartritis o lupus eritematoso sistémico. En una realización aún más preferida la artritis autoinmune es artritis de reciente comienzo o artritis reumatoide.
Se entiende por "enfermedad autoinmune" en la presente invención aquella enfermedad en la que las células del sistema inmune desencadenan una respuesta inflamatoria crónica en uno o varios tejidos del individuo provocando su deterioro o incluso destrucción. En la presente invención los términos "enfermedad autoinmune" y EIMMI se utilizan indistintamente.
En la presente invención el término "artritis autoinmune" englobaría tanto los términos "Artritis Reumatoide" como "Artritis Indiferenciada" tanto si es de reciente comienzo como si está bien establecida. Se entiende por "Artritis de Reciente Comienzo" (ARC) (o artritis de inicio) en la presente invención, aquella enfermedad consistente en inflamación de al menos una articulación, de menos de un año de evolución que cumple los criterios preestablecidos por el Colegio Americano de Reumatología (American College of fíheumatology o ACR) y EULAR de "Artritis reumatoide o AR" (Aletaha, Neogi et al. Ann Rheum Dis 2010;69:1580-1588) o, que sin cumplir dichos criterios, no cumple criterios de otras enfermedades autoinmunes, degenerativas o metabólicas que puedan explicar los síntomas. Este último caso, viene siendo denominado "Artritis Indiferenciada" (Al) que, en muchos de los casos, dejados a su libre evolución, acaban desembocando en una AR. La definición de Artritis Indiferenciada está ganando progresivamente aceptación entre los expertos en la materia, ya que se entiende que cuanto más precozmente se trate a los pacientes más opciones de inducir remisión tenemos y en la actualidad se acepta establecer tratamiento inmunomodulador en pacientes que no cumplen criterios de AR. En esta invención los términos ARC, AR o Al hacen referencia a una enfermedad sistémica autoinmune crónica y progresiva, la cual provoca la inflamación crónica fundamentalmente de las articulaciones, y que dada su naturaleza progresiva, produce la destrucción de las mismas, con su consecuente deformación y pérdida de capacidad funcional. Además, esta enfermedad puede provocar alteraciones extraarticu lares en diversos órganos. La actividad de la enfermedad se puede determinar mediante índices compuestos que proporcionan un número que aglutina la información de diferentes variables clínicas y analíticas como el DAS28 (Prevoo et al. Arthritis Rheum 1995;38:44-48), SDAI, CDAI (Smolen et al. Rheumatology (Oxford) 2003;42:244-257) y otros.
Se entiende por "espondiloartritis" en la presente invención como aquellas enfermedades autoinmunes con afectación axial y/o periférica que cumplen los criterios de clasificación de la Assessment of SpondyloArthrítis International Society (ASAS o Sociedad Internacional de Evaluación de Espodiloartritis) (Rudwaleit et al. Ann Rheum Dis 201 1 ;70:25-31 ).
Se entiende por "lupus eritematoso sistémico" en la presente invención aquella enfermedad autoinmune sistémica definida por los criterios del Colegio Americano de Reumatología (Tan et al. Arthritis Rheum- 1982;25:1271 -1277). El término "enfermedad inflamatoria intestinal" o "EN" en la presente invención se refiere a la inflamación crónica del intestino en un individuo, donde dicha inflamación es debida al sistema inmune del propio individuo. Las dos formas más frecuentes corresponden a la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Por lo que en una realización preferida la enfermedad autoinmune es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. En la presente invención se entiende por "psoriasis" aquella enfermedad cutánea la cual está caracterizada por un mal funcionamiento del sistema inmune, lo que provoca un exceso de producción de células cutáneas. Esta enfermedad da lugar a la formación de abultamientos rojizos cubiertos de descamaciones. Además, el exceso de producción de células también produce la infiltración de glóbulos blancos en la piel. Las lesiones de forma general se localizan en regiones con un mayor rozamiento, como por ejemplo, aunque sin limitarse, los codos, las rodillas o ingles.
Otra realización aún más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al método donde la muestra biológica es sangre, suero, plasma, saliva, orina, líquido sinovial o linfa.
Otra realización aún más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al método donde el sujeto es un humano. Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico de una enfermedad autoinmune en un sujeto que padece una enfermedad autoinmune, que comprende:
a. la detección de los polimorfismos genéticos del gen VIP rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568 en una muestra biológica ;
b. la asociación del alelo T del polimorfismo genético rs35643203, la asociación del alelo G del polimorfismo genético rs71575932 y/o la asociación del alelo A del polimorfismo rs7755568, a un mal pronóstico.
En adelante nos referiremos a éste como al "método segundo de la invención".
El término "in vitro" se refiere a que el método de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto.
Una realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método que además comprende en el paso (a) la detección del polimorfismo rs3823082 y/o la detección del polimorfismo rs688136 del gen VIP; y en el paso (b) la asociación del genotipo TT del polimorfismo rs3823082 con un mal pronóstico y/o la asociación del genotipo CC del polimorfismo rs688136 con un buen pronóstico. Otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método in vitro que además comprende la detección en el paso (a) de al menos uno de los polimorfismos genéticos del gen VIP que se selecciona de la lista que comprende rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 y rs12201 140; o cualquiera de sus combinaciones, y la asociación en el paso (b) del alelo A del polimorfismo rs12213214, del alelo T del polimorfismo rs60946248, del alelo G del polimorfismo rs140023105, del alelo T del polimorfismo rs7764067, , del alelo C del polimorfismo rs74760293, del alelo G del polimorfismo rs149081483 y del alelo T del polimorfismo rs12201 140, o cualquiera de sus combinaciones, a un mal pronóstico y/o la asociación del alelo G del polimorfismo rs12201030 a un buen pronóstico. Una realización más preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método ¡n vitro donde la enfermedad autoinmune es artritis autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, espondiloartritis o lupus eritematoso sistémico. En una realización aún más preferida la artritis autoinmune es artritis de reciente comienzo o artritis reumatoide. En otra realización preferida, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
Una realización aún más preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método in vitro donde la muestra biológica es sangre, suero, plasma, saliva, orina, líquido sinovial o linfa.
Otra realización aún más preferida del segundo aspecto de la invención se refiere al método donde el sujeto es un humano.
Los métodos de la invención permiten disponer de información útil para la toma de decisiones terapéuticas, permitiendo seleccionar a los pacientes con mayor probabilidad de necesitar un tratamiento intenso. Esto deriva en un abaratamiento de los costes directos e indirectos de la enfermedad y una mejora de la calidad de vida del paciente.
La presente invención también se refiere a un método según el método segundo de la invención donde tras el paso (b) si el sujeto presenta un mal pronóstico, se trata al sujeto con una terapia combinada de FAME sintéticos o de un FAME sintético y uno biológico, especialmente si la terapia biológica es un agente bloqueante del factor de necrosis tumoral (TNF). Por ejemplo pero sin limitarse el agente bloqueantes del TNF es adalimumab, certolizumab, etanercept, golimumab o infliximab. Entre los FAME sintéticos se pueden encontrar azatioprina, antipalúdicos, metotrexato, leflunomida, sulfasalacina y/o ciclosporina A. Por el contrario, si el sujeto presenta un buen pronóstico tras el paso (b), se trata a dicho sujeto con una monoterapia de FAME no biológico. Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para diseñar un tratamiento individualizado para un sujeto que padece una enfermedad autoinmune que comprende detectar los polimorfismos genéticos del gen VIP rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568 en una muestra biológica; en el que la presencia del alelo T del polimorfismo genético rs35643203, la presencia del alelo G del polimorfismo genético rs71575932 o la presencia del alelo A del polimorfismo genético rs7755568 es indicativa de que el tratamiento a administrar es una terapia combinada de FAME sintético y biológico. En adelante nos referiremos a éste como al "método tercero de la invención".
Se entiende por "tratamiento" al conjunto de medios que se emplean para curar o aliviar una enfermedad. En la presente invención el tratamiento a administrar es una terapia combinada de FAME, donde los fármacos son al menos uno sintético y al menos uno biológico cuando el sujeto presenta un mal pronóstico. Preferiblemente el fármaco biológico es un agente bloqueante del factor de necrosis tumoral (TNF), por ejemplo pero sin limitarse el agente bloqueantes del TNF es adalimumab, certolizumab, etanercept, golimumab o infliximab. Entre los FAME sintéticos (también denominado no-biológicos) se pueden encontrar azatioprina, antipalúdicos, metotrexato, leflunomida, sulfasalacina y/o ciclosporina A. Por el contrario, si el sujeto presenta un buen pronóstico, se trata a dicho sujeto con una monoterapia de FAME no biológico.
Una realización preferida del tercer aspecto de la invención se refiere al método in vitro que además comprende la detección el polimorfismo rs3823082 y/o del rs688136 y donde la presencia del genotipo TT del polimorfismo rs3823082 de dicho polimorfismo es indicativa de que el tratamiento a administrar es dicha terapia combinada y/o donde la presencia del genotipo CC del polimorfismo rs688136 es indicativa de que el tratamiento a administrar sea monoterapia de FAME sintético.
Una realización más preferida del tercer aspecto de la invención se refiere al método in vitro que además comprende la detección del polimorfismo del gen WP que se selecciona de la lista que comprende rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs12201 140, rs74760293, rs149081483 y rs12201 140; o cualquiera de sus combinaciones; y donde la presencia del alelo A del polimorfismo rs12213214, del alelo T del polimorfismo rs60946248, del alelo G del polimorfismo rs140023105, del alelo T del polimorfismo rs7764067, del alelo A del polimorfismo rs7755568, del alelo C del polimorfismo rs74760293 y del alelo G del polimorfismo rs149081483 cualquiera de sus combinaciones, es indicativa de que el tratamiento a administrar es dicha terapia combinada y donde la presencia del alelo T del rs12201030 es indicativa de que el tratamiento a administrar sea monoterapia de FAME sintético.
Una realización aún más preferida del tercer aspecto de la invención se refiere al método in vitro donde la enfermedad autoinmune es artritis autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, espondiloartritis o lupus eritematoso sistémico. En una realización aún más preferida, la artritis autoinmune es artritis de reciente comienzo o artritis reumatoide. En otra realización preferida, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Cro n.
Otra realización aún más preferida del tercer aspecto de la invención se refiere al método in vitro donde la muestra biológica es sangre, suero, plasma, saliva, orina, líquido sinovial o linfa.
La detección de los polimorfismos de la invención puede realizarse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, por ejemplo por secuenciación, por genotipado, por amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (RCP), por "restriction fragment length polymorphysm" (RFLP) o mediante enzimas de restricción. La detección puede realizarse mediante el empleo de cebadores o sondas. El término "secuenciación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la determinación de los nucleótidos de un ácido nucleico molde y de su orden.
Las condiciones en las cuáles se realiza la secuenciación generalmente incluyen (a) poner en contacto un ácido nucleico molde con una polimerasa en una mezcla que además comprende un cebador, un catión bivalente (por ejemplo, Mg2+), y nucleótidos, generalmente, dNTPs y al menos, un ddNTP (dideoxinucleótido trifostato), y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que la polimerasa inicie la incorporación de los nucleótidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar a una población de moléculas de ADN complementario de diferente tamaño. La separación de dicha población de moléculas de ADN complementario, generalmente, mediante electroforesis, permite determinar la secuencia de nucleótidos.
El término "amplificación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al aumento del número de copias de un ácido nucleico molde. Las condiciones en las cuáles se realiza la amplificación generalmente incluyen (a) poner en contacto un ácido nucleico molde con una polimerasa en una mezcla que además comprende al menos un cebador (siendo normalmente dos cebadores), un catión bivalente (por ejemplo, Mg2+), y nucleotidos, generalmente, dNTPs (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que la polimerasa inicie la incorporación de los nucleotidos al cebador mediante complementariedad de bases con el ácido nucleico molde, y de lugar a una población de moléculas de ADN complementario generalmente del mismo tamaño.
La RCP también puede ser RCP cuantitativa en tiempo real.
El término "ácido nucleico molde" o "molde", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ácido nucleico de cadena simple o de doble cadena que va a ser amplificada o secuenciada. El término "cebador" (también denominado "primer" u "oligo"), como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando híbrida con el ácido nucleico molde. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleótido de desoxirribosa. Los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa. Los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias específicas de nucleotidos en el ácido nucleico molde (cebadores específicos) o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios).
De acuerdo con la presente invención un "cebador" puede ser marcado o etiquetado mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica. Etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimáticas.
En una realización preferida, los cebadores (primers) son los descritos como SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o cualquiera de sus combinaciones. Además, los primers pueden estar modificados para comprender secuencias que sean de utilidad en la técnica utilizada, por ejemplo en secuenciación. Por ejemplo, los primers pueden comprender la secuencia SEQ ID NO: 60 unida a su extremo 5' en el caso del primer sentido, y la secuencia SEQ ID NO: 61 unida al extremo 5' del primer antisentido. Los métodos de la invención pueden ser aplicados a lo largo de cualquier momento del desarrollo de la enfermedad autoinmune. También los métodos de la invención se pueden aplicar en pacientes sin tratamiento con fármacos inmunomoduladores.
Los métodos de la invención pueden comprender además la cuantificacion de al menos un producto de expresión del gen VIP en una muestra biológica aislada y/o también la cuantificacion de variables clínicas. Estas variables clínicas pueden ser por ejemplo, aunque sin limitarse el sexo del paciente, el estado de actividad al inicio de la enfermedad, así como otras conocidas por el experto en la materia. En caso de estarse estudiando la artritis de reciente comienzo o artritis reumatoide, podrían ser los anticuerpos antipéptidos citrulinados (ACPA). Por lo que una realización particular del primer, del segundo y del tercer aspecto de la invención se refiere a los métodos donde además se detectan ACPA. La detección de los ACPA puede realizarse por las técnicas conocidas por el experto en la materia, como por ejemplo ELISA.
Cualquiera de los pasos de los métodos de la invención pueden ser total o parcialmente automatizados. Además de los pasos especificados anteriormente, los métodos descritos en la presente memoria pueden comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, relacionados con el pre-tratamiento de la muestra o con la extracción del material genético necesario para su posterior análisis.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso del polimorfismo genético del gen VIP rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568 como marcador pronóstico de enfermedad autoinmune en un sujeto que padece una enfermedad autoinmune.
Una realización preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere al uso que además comprende el uso del polimorfismo genético del gen VIP rs3823082 y/o rs688136. Una realización más preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere al uso que además comprende el uso de los polimorfismos genéticos del gen VIP seleccionados de la lista que comprende: rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 y rs122001 140, o cualquiera de sus combinaciones. Una realización aún más preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere al uso donde la enfermedad autoinmune es artritis autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, espondiloartritis o lupus eritematoso sistémico. En una realización aún más preferida la artritis autoinmune es artritis de reciente comienzo o artritis reumatoide. En otra realización preferida, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. Un quinto aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende primers o sondas para detectar los polimorfismos genéticos del gen VIP rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568.
Una realización preferida del quinto aspecto de la invención se refiere al kit que además comprende primers o sondas para detectar el polimorfismo genéticos del gen VIP rs3823082 y/o rs688136.
Una realización más preferida del quinto aspecto de la invención se refiere al kit que además comprende primers o sondas que detectan los polimorfismos genéticos del gen VIP rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 y rs12201 140, o cualquiera de sus combinaciones.
Otra realización aún más preferida del quinto aspecto de la invención se refiere al kit que además comprende los elementos necesarios para detectar ACPA, por ejemplo, primers, sondas, anticuerpos específicos, péptidos citrulinados o proteínas citrulinadas.
En una realización preferida, el kit comprende los primers descritos como SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o cualquiera de sus combinaciones. Además, los primers pueden estar modificados para comprender secuencias que sean de utilidad en la técnica utilizada, por ejemplo en secuenciación. Por ejemplo, los primers pueden comprender la secuencia SEQ ID NO: 60 unida a su extremo 5' en el caso del primer sentido, y la secuencia SEQ ID NO: 61 unida al extremo 5' del primer antisentido. El kit de la invención además puede comprender al menos una ADN polimerasa, una retrotranscriptasa, una ARN polimerasa o un fluoróforo. Además el kit puede comprender una mezcla de deoxinucleótidos tri-fosfato (dNTPs), una mezcla de nucleótidos tri-fosfato (NTPs), deoxirribonucleasa (DNasa), inhibidores de la ribonucleasa (RNasa), Dithiothreitol (DTT), pirofosfatasa inorgánica (PPi) y los tampones necesarios para las enzimas proporcionadas en el kit. Los kits pueden contener además otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos. Preferiblemente, los kits comprenden además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
En la presente invención la sonda o los cebadores pueden estar situados en un soporte sólido, por ejemplo, pero sin limitarse, cristal, plástico, tubos, placas multipocillo, membranas, o cualquier otro soporte conocido.
Un sexto aspecto de la invención se refiere al uso del kit del quinto aspecto de la invención para el pronóstico de una enfermedad autoinmune en un sujeto que padece dicha enfermedad.
Una realización preferida del sexto aspecto de la invención se refiere al uso donde la enfermedad autoinmune es artritis autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, espondiloartritis o lupus eritematoso sistémico. En una realización aún más preferida la artritis autoinmune es artritis autoinmune de reciente comienzo o artritis reumatoide. En otra realización preferida, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
Por la presente invención se deduce que ésta también se refiere a los métodos de la invención cuando los polimorfismos que se detectan son los relativos a los alelos mayores y que están descritos en la presente invención. Lo mismo sucede en el caso del uso de dichos polimorfismos del cuarto aspecto de la invención, del kit del quinto aspecto de la invención y del uso del kit del sexto aspecto de la invención.
Los términos "polinucleótido", "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan en la presente invención de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 representa los niveles de VIP en suero de pacientes con artritis de inicio según el genotipo de los polimorfismos rs35643203 (panel A), rs71575932 (panel B) y rs7755568 (panel C).
FIG. 2 representa los niveles de VIP según el genotipo del polimorfismo rs3823082 en suero en pacientes con AR. FIG. 3. representa los niveles de VIP según el genotipo del polimorfismo rs688136 (panel A) y rs12201 140 (panel B) en suero en pacientes con AR.
FIG. 4 representa los niveles de VIP en suero de pacientes con AR según la combinación de genotipos de rs3823082, rs35643203, rs71575932 y rs7755568. *En el eje de abscisas, la etiqueta 0 corresponde a no ser homocigoto T de rs3823082 y no tener ningún alelo menor de rs35643203, rs71575932 o rs7755568. La etiqueta 1 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 o tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568. La etiqueta 2 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 y tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568.
FIG. 5 representa como interfieren entre si la presencia de genotipos asociados a bajos niveles de VIP con el genotipo CC de rs688136 que se asocia a niveles más altos de VIP. *En el eje de abscisas, la etiqueta 0 corresponde a no ser homocigoto T de rs3823082 y no tener ningún alelo menor de rs35643203, rs71575932 o rs7755568. La etiqueta 1 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 o tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568. La etiqueta 2 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 y tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568.
FIG. 6 representa niveles de actividad (estimada con el índice del Hospital Universitario de la Princesa [HUPI]; Castrejón et al, Arthritis Care Res 2013; 65: 518-25) a lo largo del seguimiento según la combinación de genotipos de rs3823082, rs35643203, rs71575932 y rs7755568 que se asocian a tener VIP bajo en suero de pacientes con AR. *En el eje de abscisas, la etiqueta 0 corresponde a no ser homocigoto T de rs3823082 y no tener ningún alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568. La etiqueta 1 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 o tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, rs71575932 o rs7755568. La etiqueta 2 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 y tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568.
FIG. 7 representa la intensidad de tratamiento después de dos años de seguimiento (calculada como el número de días con FAME en los dos años de seguimiento/ número de días entre visita basal y final; para una definición más extensa ver González-Alvaro PLoS One 201 1 ; 6: e29492) según la combinación de genotipos de rs3823082, rs35643203, rs71575932 y rs7755568 que se asocian a tener VIP bajo en suero de pacientes con AR. *En el eje de abscisas, la etiqueta 0 corresponde a no ser homocigoto T de rs3823082 y no tener ningún alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568. La etiqueta 1 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 o tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568. La etiqueta 2 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 y tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568. FIG. 8 representa la intensidad de tratamiento después de dos años de seguimiento (calculada como el número de días con FAME en los dos años de seguimiento/ número de días entre visita basal y final; para una definición más extensa ver González-Alvaro PLoS One 201 1 ; 6: e29492) según la combinación de genotipos de rs3823082, rs35643203, rs71575932 y rs7755568 que se asocian a tener VIP bajo en suero estratificado por género (A), diagnóstico (B) y resultado del test de anticuerpos anti-proteínas citrulinadas (ACPA; C) en pacientes con AR. *En el eje de abscisas, la etiqueta 0 corresponde a no ser homocigoto T de rs3823082 y no tener ningún alelo menor de rs35643203, rs71575932 o rs7755568. La etiqueta 1 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 o tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568. La etiqueta 2 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 y tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o rs7755568.
FIG. 9 representa la progresión radiológica después de dos años de seguimiento según los pacientes tengan o no alguno de los genotipos de rs3823082, de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568 que se asocian a tener VIP bajo en suero en pacientes con AR.
FIG. 10 representa la progresión radiológica después de dos años de seguimiento según los pacientes tengan o no alguno de los genotipos de rs3823082, de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568 que se asocian a tener VIP bajo en suero en pacientes con AR, estratificada por número de copias del epítopo compartido (A) o del hábito tabáquico (B). FIG. 11 representa como interfiere la presencia de genotipos asociados a bajos niveles de VIP en pacientes con artritis reumatoide (ser homocigoto TT de rs3823082 o tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs7157932 o de rs7755568) con tener un alelo C de rs688136 en los niveles de VIP sérico de pacientes del registro de espondiloartritis de inicio.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la utilidad de los métodos de la invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Ejemplo 1 : estudio descriptivo de variantes genéticas de VIP que se relacionan con sus niveles séricos en artritis reumatoide
Se procedió a secuenciar el gen VIP y sorprendentemente se encontró que determinadas variantes genéticas del mismo correlacionaban con niveles séricos bajos del péptido VIP en suero y se demostró que determinados genotipos aparecían en los pacientes con peor pronóstico (es decir, peor curso evolutivo o mayor gravedad) y necesidad de un tratamiento más intenso.
Se llevaron a cabo dos tipos de estudios: en el primero se seleccionaron 10 pacientes con niveles bajos de VIP en suero y 15 pacientes con niveles altos de VIP en suero para secuenciar el gen completo de VIP y detectar las diferencias existentes entre los dos grupos; en el segundo estudio se validaron las variantes genéticas detectadas en el primer estudio en la población completa de artritis de inicio del Hospital Universitario (HU) de La Princesa (342 pacientes con, al menos, dos años de seguimiento).
Población: para este estudio, de entre 91 pacientes, en los que se determinaron los niveles de VIP a lo largo de su seguimiento en el estudio, se seleccionaron 10 pacientes cuyos niveles de VIP a lo largo del seguimiento se encontraban por debajo del percentil 25 de la población control (100 donantes de sangre sanos procedentes del Centro Nacional de Transfusiones de Madrid). De ellos, 5 pacientes tenían niveles de VIP por debajo del percentil 10. Por otra parte, se seleccionaron 15 pacientes con niveles de VIP por encima del percentil 90 de la población control. Se obtuvo DNA de estos 25 pacientes y se secuenció el gen de VIP desde -1933 pares de bases (pb o bp) antes del inicio de transcripción hasta 2651 pb después del fin del último exón. Para llevar a cabo la secuenciación se dividió el gen en 29 segmentos (amplicones) solapantes. Para la mayor parte de los amplicones se utilizaron las secuencias de primers descritas por Applied Biosystems® y accesibles a través del NCBI (">gnl|Probe| 1357097b.1 RSA probé RSA001033793, PCR primer (42 bp); >gnl|Probe|1357097c.1 RSA probé RSA001033793, PCR primer (44 bp); >gnl|Probe| 1357099b.1 RSA probé RSA001033798, PCR primer (38 bp); >gnl|Probe|1357100b.1 RSA probé RSA001033801 , PCR primer (38 bp);
>gnl Probé 1357101 b.1 RSA probé RSA001033803, PCR primer (38 bp);
>gnl Probé 1361007C.1 RSA probé RSA000585838, PCR primer (38 bp);
>gnl Probé 1357100c.1 RSA probé RSA001033801 , PCR primer (39 bp);
>gnl Probé 1357101 C.1 RSA probé RSA001033803, PCR primer (44 bp);
>gnl Probé 1357102b.1 RSA probé RSA001033807, PCR primer (38 bp);
>gnl Probé 1357103b.1 RSA probé RSA001033810, PCR primer (44 bp);
>gnl Probé 1357103c.1 RSA probé RSA001033810, PCR primer (42 bp);
>gnl Probé 1357317c.1 RSA probé RSA001031301 , PCR primer (42 bp);
>gnl Probé 1357318b.1 RSA probé RSA001031306, PCR primer (43 bp);
>gnl Probé 1357318c.1 RSA probé RSA001031306, PCR primer (44 bp);
>gnl Probé 1356759b.1 RSA probé RSA001046167, PCR primer (37 bp);
>gnl Probé 1357310b.1 RSA probé RSA001031315, PCR primer (44 bp);
>gnl Probé 1356759c.1 RSA probé RSA001046167, PCR primer (38 bp);
>gnl Probé 135731 1 b.1 RSA probé RSA001031320, PCR primer (42 bp);
>gnl Probé 1357313b.1 RSA probé RSA001031334, PCR primer (44 bp);
>gnl Probé 1356753c.1 RSA probé RSA001046172, PCR primer (38 bp)", referidos a las secuencias SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 21 , 24, 25, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 44, 57 y 59). No obstante, hubo que diseñar nuevos primers específicos para cubrir las áreas no descritas (principalmente en intrones) e incluso dividir algunos de los amplicones descritos debido a que su tamaño era demasiado grande (SEQ ID NO: 9, 1 1 , 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 26, 28, 31 , 34, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 58). La lista de primers (sentido, "forward" y antisentido, "reverse") para los diferentes amplicones que se utilizaron se muestra en las secuencias SEQ ID NO: 2 a 59. Para evitar errores en la secuenciación, también se utilizaron los primers en donde en su extremo 5' se añadió la secuencia TGTAAAACGACGGCCAGT en los primers sentido (SEQ ID NO: 60) y la secuencia CAGGAAACAGCTATGACC en los primers antisentido (SEQ ID NO: 61 ), donde dichas secuencias se refieren a una secuencia añadida del virus M13 que se utilizó para verificar la correcta secuenciación. La secuenciación se llevó a cabo en un analizador genético de electroforesis capilar con 8 capilares de Applied Biosystems® (3500 Genetic Analyzer) que permite ejecutar la resecuenciación del gen en busca de perfiles mutacionales utilizando un solo polímero en la matriz capilar.
Se consiguieron datos de alta calidad de secuenciación en 9 pacientes con VIP bajo y 1 1 pacientes con VIP alto. Los principales datos clínicos de estos pacientes según su nivel de expresión de VIP (alto o bajo) se muestran en la tabla 1 . Una vez obtenidas las secuencias de los 29 amplicones para cada uno de los 20 pacientes, se compararon con la secuencia consenso de VIP publicada en PubMed con la referencia NC_000006.1 1 (Cromosoma 6; 153071932-153080900) mediante el software Variant Repórter (Applied Biosystems®). En este proceso, se detectaron 17 polimorfismos de nucleótido único (SNP), 15 descritos previamente y 2 nuevos, respecto a la secuencia consenso de VIP. La tabla 2 describe de forma más detallada las variantes genéticas detectadas en los 20 pacientes con su distribución según niveles séricos de VIP.
Tabla 1 . Datos clínicos de los pacientes en los que se realizó la secuenciación de VIP, según los niveles séricos de este neuropéptido.
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ACPA: anticuerpos anti-proteínas citrulinadas; DAS28: disease activity score para recuentos de 28 articulaciones; HUPI: índice de actividad del HU de la Princesa (Castrejon et al. Arthritis Care Res 2013, 65(4):518-25); med: mediana; p25: percentil 25; p75: percentil 75; se consideró significativo p≤0,05.
Como se observa en la tabla 2, de las 17 variantes tipo SNP, cuatro mostraron diferencias casi significativas entre los dos grupos de pacientes (VIP alto y VIP bajo): rs35643203, rs3823082, rs71575932 y rs7755568. rs35643203: se trata de una sustitución C>T (en la hebra complementaria la sustitución sería G>A) en la posición 153072433 localizada en el intrón 1 del gen VIP. La frecuencia del alelo menor (MAF) T en la población general es del 3% y en la presente invención se encontró un MAF del 17% en los pacientes con VIP bajo y del 0% en los pacientes con VIP alto. Esta posición se secuenció correctamente en los 20 pacientes y, además, pudo ser confirmada ya que se encontraba cubierta por los amplicones 4 y 5. rs3823082: se trata de una sustitución C>T (en la hebra complementaria la sustitución sería G>A) en la posición 153074322 localizada en el intrón 2. La frecuencia del alelo menor T descrita en población general es del 25%. En la presente invención se encontró una MAF del 28% en los pacientes con VIP bajo y del 4% en los pacientes con VIP alto. Esta posición se secuenció correctamente en los 20 pacientes, estando localizada en el amplicón 9. rs71575932: se trata de una sustitución A>G (en la hebra complementaria la sustitución sería T>C) en la posición 153075844 localizada en el intrón 3. La frecuencia del alelo menor G descrita en población general es del 3%. En la presente invención se encontró una MAF del 17% en los pacientes con VIP bajo y del 0% en los pacientes con VIP alto. Esta posición se secuenció correctamente en los 20 pacientes, con confirmación por estar representada en los amplicones 14 y 15. rs7755568: se trata de una sustitución T>A (en la hebra complementaria la sustitución sería A>T) en la posición 153076955 localizada en el intrón 4. La frecuencia del alelo menor A descrita en población general es del 8%. En la presente invención se encontró una MAF del 22% en los pacientes con VIP bajo y del 0% en los pacientes con VIP alto. Esta posición se secuenció correctamente en los 20 pacientes, estando localizada en el amplicón 17.
Figure imgf000025_0002
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Ejemplo 2: validación de los polimorfismos de único nucleótido de VIP rs3823082, rs7755568, rs35643203, rs71575932 y rs688136
De las 17 variantes genéticas descritas respecto a la secuencia consenso (Tabla 2), en un primer paso se decidió estudiar aquellos SNPs que mostraron una distribución diferencial entre pacientes con niveles de VIP bajo y pacientes con VIP alto con una tendencia a la significación estadística. Dado el bajo número de pacientes estudiados, se consideró que una p<0,2 podría ser una forma de priorizar el estudio de las variantes genéticas. Además se ha estudiado el SNP rs688136 por ser el único cuya variante menor aparecía más representada en pacientes con VIP alto. Para el estudio de validación se han utilizado 457 pacientes del registro de artritis de reciente comienzo del HU de La Princesa con muestras de DNA disponibles (datos clínicos completos en Tabla 3). En el caso de los SNPs rs3823082, rs35643203, rs71575932 y rs688136, se procedió al genotipado mediante sondas TaqMan® de Applied Biosystems® (números de catálogo: C_27491244_10, C_3250637_10, C_3250638_10 y C 3250639_10 respectivamente de la referencia TaqMan Genotyping Assays 4351379). En el caso del SNP rs7755568, el genotipado se ha llevado a cabo mediante secuenciación del amplicón 17 según se ha descrito previamente. Esto nos ha permitido tener información de otras dos variantes genéticas también presentes en dicho amplicón: rs12201030 y rs12201 140. Tabla 3. Datos clínicos de los pacientes en los que se realizó la validación de los datos obtenidos en el ejemplo 1 ).
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
ACPA: anticuerpos anti proteínas citrulinadas; DAS28: disease activity score para recuentos de 28 articulaciones; HUPI: índice de actividad del HU de La Princesa (Castrejon et al. Arthritis Care Res 2013, 65(4):518-25); med: mediana; p25: percentil 25; p75: percentil 75. Como control de calidad, el genotipo obtenido por secuenciación para los SNPs rs3823082, rs35643203, rs71575932 y rs688136 en los 20 pacientes del ejemplo 1 ) ha sido confirmado mediante genotipado por RCP cuantitativa y sondas TaqMan. Globalmente se ha obtenido el genotipo de los 2 primeros SNPs en 440 pacientes del registro, en 428 pacientes en el caso de rs71575932 y en 425 pacientes para rs688136. La MAF (minor alíele frequency, en este caso el alelo T) de rs3823082 es de 23,2%. La MAF (alelo T) de rs35643203 es de 6,5%. La MAF de rs71575932 (alelo G) es de 7,5%. LA MAF (alelo C) de rs688136 es de 34%.
En el caso de rs7755568 no se ha podido genotipar este SNP mediante sondas TaqMan puesto que se encuentra en una región con predominio de las bases A y T, resultando imposible conseguir primers suficientemente específicos. Por este motivo, se decidió realizar mediante secuenciación del amplicón 17, lo cual nos ha permitido conocer también el genotipo de rs12201030 y rs12201 140. Se ha conseguido el genotipo de 293, 301 y 291 pacientes respectivamente. La MAF (alelo A) de rs7755568 es de 6,8%. La MAF (alelo G) de rs12201030 es de 10,6%. Y la MAF (alelo T) de rs12201 140 es de 12,9%.
Como se observa en las siguientes tablas de expresión, algunas de estas 7 variantes genéticas tienen una asociación significativa que casi alcanza el desequilibrio de unión perfecto entre rs35643203, rs71575932 y rs7755568. A pesar de que estas tres variantes genéticas se encuentran en intrones distintos (1 , 3 y 4), como se observa en las tablas 4, 5 y 6, sus alelos se distribuyeron de forma prácticamente idéntica. Por lo que se puede concluir que los SNPs rs35643203, rs71575932 y rs7755568 están en desequilibrio de ligamiento.
Tabla 4.Asociación entre los SNPs rs71575932 y rs35643203
Figure imgf000027_0002
0 52 0 52
CT
0% 88,14% 0% 12,35%
0 0 2 2 τ 1 τ 1
0% 0% 100% 0,48%
360 52 2 421
Total
100% 100% 100% 100%
Test exacto de Fisher < 0,001
Tabla 5. Asociación entre los SNPs rs35643203 y rs7755568.
Figure imgf000028_0001
Test exacto de Fisher <0,001
Tabla 6. Asociación entre los SNPs rs71575932 y rs7755568
Figure imgf000028_0002
0% 0% 100% 0,48%
248 36 2 286
Total
100% 100% 100% 100%
Test exacto de Fisher <0,001
Para demostrar que la asociación no es tan perfecta con los otros SNP (rs3823082, rs688136, rs12201030 y rs12201 140) se ha elegido a rs35643203 como representante de los 3 anteriores. Incluso con algunos de ellos la asociación no es significativa.
Tabla 7. Asociación entre los SNPs rs35643203 y rs3823082.
Figure imgf000029_0001
Test exacto de Fisher <0,001
Tabla 8. Asociación entre los SNPs rs35643203 y rs688136.
Figure imgf000029_0002
8,79% 25,49% 100% 1 1 ,27%
364 51 2 417
Total
100% 100% 100% 100%
Test exacto de Fisher = 0,000
Tabla 9. Asociación entre los SNPs rs35643203 y rs12201030.
Figure imgf000030_0001
Test exacto de Fisher = 0,794 Tampoco existe relación relevante entre rs3823082, rs688136, rs12201030 y 12201 140. (Datos no mostrados)
Ejemplo 2.1 : Relación entre el genotipo de las diferentes variantes y los niveles de VIP en la población ampliada de artritis de reciente comienzo. Como se muestra en la Figura 1 , los pacientes homocigotos del alelo común de rs35643203 (panel A, genotipo CC), presentaron niveles significativamente mayores de VIP en suero que los pacientes portadores de, al menos, un alelo T. Como rs35643203 se encuentra en desequilibrio de unión con rs71575932 y rs7755568, el patrón de niveles de VIP sérico entre sus genotipos es prácticamente idéntico (paneles B y C respectivamente). Las diferencias en los niveles de significación corresponden a diferencias en el número de muestras por falta de información sobre el genotipo de algunos pacientes por fallo de la técnica. Como se puede apreciar en los tres casos, entre los pacientes homocigotos del alelo mayor, aunque los niveles de VIP son en general mayores, siguen existiendo pacientes con niveles bajos de VIP. Esto implica que estas variantes genéticas no son las únicas implicadas en la regulación de los niveles del neuropéptido.
En lo que respecta al SNP rs3823082, como se aprecia en la figura 2, son los pacientes homocigotos del alelo menor (T) los que presentan menores niveles de VIP. Como se ha mencionado al describir la figura previa, también en el caso de este SNP existen pacientes con niveles bajos entre los que presentan, al menos una copia del alelo común (C).
En la figura 3 se muestran los niveles de VIP según los genotipos de los SNPs rs688136 (panel A) y rs12201 140 (panel B). En el estudio de secuenciación el alelo menor de rs688136 se encontró con mayor frecuencia entre los pacientes con VIP alto, especialmente el genotipo CC. En la población total en la que disponemos de niveles séricos de VIP, se observa esta tendencia, aunque sin alcanzar niveles significativos (figura 3A). Esta situación parece estar relacionada con la interacción con rs12201 140. En el caso de este SNP, el alelo menor (T) solo se encontró en alguno de los pacientes con VIP bajo, como genotipo heterocigoto. En la población más amplia con niveles séricos de VIP se observa esa tendencia a que sean menores en los heterocigotos AT, pero se pierde esa tendencia en los homocigotos TT. La explicación es que estos cuatro pacientes homocigotos TT de rs12201 140, que deberían tener niveles más bajos que los heterocigotos AT, son todos homocigotos CC de rs688136 que se asocia a niveles más elevados. Esto sugiere que las diferentes variantes encontradas interaccionan entre ellas, por lo que se precisan estudios estadísticos más complejos que se describen más adelante.
Respecto a rs12201030, la información de la que disponemos sugiere que no influye en los niveles séricos de VIP (datos no mostrados). El estudio de las interacciones entre las diferentes variantes genéticas, se inició analizando si existía efecto aditivo entre las variantes claramente asociadas a VIP bajo: tener al menos un alelo menor de rs35643203, rs71575932 o rs7755568 (en desequilibrio de unión) y ser homocigoto del alelo menor de rs3823082. Como muestra la figura 4, cuantas más variantes genéticas asociadas a VIP bajo, menores son los niveles de VIP, aumentando la significación estadística.
En la figura 5 se muestra como ser homocigoto CC de rs688136 modula hacia niveles mayores de VIP el efecto descrito en la figura 4.
En resumen, al menos 5 de las 17 variantes genéticas tipo SNP detectadas en el ejemplo 1 ) se asocian con distribución diferencial en los niveles de VIP. Por lo que podrían ser utilizadas como biomarcadores pronósticos en vez de la medición de los niveles de VIP. Los genotipos que individualmente aportan más información son rs35643203, rs71575932 y rs7755568 que podrían ser intercambiables, ya que su distribución es prácticamente idéntica (Tablas 4 a 6). Por su parte, rs3823082 aporta información adicional sobre una subpoblación de pacientes, homocigotos de su alelo menor, que también contribuye a que se tengan niveles séricos menores de VIP. El efecto aditivo de estos cuatro SNPs se ve claramente en la figura 4. Por último, el genotipo CC de rs688136 se asocia a tener niveles séricos de VIP más elevados.
La interacción entre estas variantes genéticas se ve más claramente en el análisis multivariable mostrado en la tabla 1 1 , en la que se han incluido también las variables edad y uso de agentes bloqueantes del TNF que en un estudio previo habíamos demostrado que se asociaban significativamente a aumento de los niveles de VIP (Martínez C et al. 2014 PLOS One 1 :e85248). En el modelo sin interacción entre rs35643203 (como representación de los tres SNPs que están en desequilibrio de unión: rs35643203, rs71575932 y rs7755568) y rs3823082 se observa que en el caso del primer SNP resultan coeficientes negativos (indican asociación a niveles más bajos de VIP) en forma dosis dependiente a la presencia del alelo menor T que alcanza la significación estadística en los casos heterocigotos (por tener un mayor tamaño muestral). En el caso de rs3823082 los coeficientes también son negativos aunque no se alcanza significación estadística. Cuando se realiza el modelo con interacción se observa un efecto aditivo entre los dos alelos menores de rs35643203 y rs3823082. En ambos modelos, el genotipo CC de rs688136 presenta coeficientes positivos y altamente significativos. Tabla 1 1 . Efecto de diferentes variantes genéticas en el gen de VIP sobre sus niveles séricos, ajustado por edad y uso de medicación bloqueante de TNF. Modelo sin interacción* Modelo con interacción**
Coef. β ± e.s. P Coef. β± e.s. P
Edad 2,6 ± 1,1 0,016 2,5 ± 1,1 0,019
Uso de terapia anti-TNF 136 ±57 0,017 128 ±57 0,026 rs35643203 / rs3823082
CC /CC Referencia -
CC/CT -40 ± 46 0,388
CC/TT 128 ± 138 0,353
CT/CC No datos -
CT/CT -117 ±64 0,066
CT/TT -310 ±98 0,002
TT/CC No datos -
TT/CT No datos -
TT/TT -363 ± 174 0,037 rs35643203
CC Referencia -
CT -131 ±66 0,046
TT -239 ± 181 0,187
rs3823082
CC Referencia -
CT -25 ± 46 0,58
TT -75 ± 94 0,424
Genotipo rs688136
TT Referencia - Referencia -
TC 51 ±34 0,133 44 ±34 0,185
CC 211 ± 74 0,004 235 ± 74 0,002
Coef: coeficiente; e.s.: error estándar. Se considera estadísticamente significativo p<0,05. *EI modelo sin interacción estudia el efecto de los genotipos de rs35643203 y de rs3823082 por separado. **EI modelo con interacción estudia el efecto de las diferentes combinaciones de genotipos rs35643203 y rs3823082. Por este motivo hay celdas vacías en la tabla.
Ejemplo 2.2: Estudio de las variantes genéticas rs3823082, rs35643203 y rs71575932 como marcadores pronósticos en pacientes con artritis de inicio. Para analizar si las mencionadas variantes genéticas o su combinación eran de utilidad para predecir el pronóstico de los pacientes con artritis de inicio se utilizaron tres parámetros relacionados con la gravedad de la enfermedad:
- actividad de la enfermedad estimada mediante los índices compuestos DAS28 (el "gold standard" en la actualidad) y HUPI, un índice para la evaluación de la enfermedad recientemente descrito (Castrejon et al. Arthritis Care Res 2013;65:518-25) que tiene menos sesgos que el DAS28.
- requerimiento de tratamiento en los dos primeros años de seguimiento. Dado que no es éticamente aceptable estudiar la historia natural de la enfermedad sin intervención (tratamiento con FAME) que nos proporcionaría el escenario ideal e irrefutable para el estudio de factores pronósticos, se considera aceptable usar variables de requerimientos de tratamiento como variables subrogadas de la actividad de la enfermedad o gravedad. En este sentido, se ha utilizado la intensidad de tratamiento con FAME que se calcula como la suma del número de días que el paciente ha estado con los diferentes FAME que haya recibido en los dos primeros años de seguimiento, ponderados por un coeficiente según la potencia del FAME, partido por el número de días trascurridos entre la visita basal y la de dos años de seguimiento (para una definición más exacta ver González-Alvaro et al. PLoS One 201 1 ; 6(12):e29492)
- la progresión radiológica en los dos primeros años de seguimiento medida según el índice de Sharp modificado por van der Heijde (disponible sólo en 91 pacientes), conocido por el experto en la materia.
En lo que se refiere a la actividad de la enfermedad a lo largo del seguimiento, no se observaron diferencias entre los genotipos de los SNP de forma individualizada con ninguno de los dos índices de actividad utilizados (datos no mostrados). Cuando se agruparon los pacientes según el número de variantes genéticas asociadas a VIP sérico bajo (teniendo en cuenta los 4 SNPs según se ha descrito en la figura 4), se observó una tendencia, no significativa, a presentar un mayor nivel de actividad en los pacientes portadores de las variantes relacionadas con menores niveles de VIP (Figura 6), es decir, ser homocigoto T de rs3823082 y tener, al menos, una copia del alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568.
Estas diferencias fueron más marcadas en las visitas 2 y 3, aunque en ningún caso se alcanzó significación estadística (en el mejor de los casos, visita 3, la p=0,1 13). Lógicamente, a lo largo del seguimiento, en aquellos pacientes en los que se observó persistencia de la actividad de la enfermedad se fue intensificando el tratamiento y, por ello, en la visita final prácticamente no se observaron diferencias entre los 3 grupos de pacientes.
Por este motivo, se realizó un análisis multivariante en el que se estudió el efecto de los genotipos de variantes genéticas de VIP sobre la evolución de la actividad enfermedad, ajustado por otras variables ya descritas que inciden sobre la actividad de la enfermedad (género, edad, tratamiento, presencia de ACPA). Como se observa en la tabla 12, tener una edad mayor de 45 años se asocia a valores más elevados de los índices que evalúan la actividad de la enfermedad (DAS28 de proteína C reactiva, [PCR] o HUPI) y ser mujer se asocia a tener valores más elevados de DAS28 de PCR. Lógicamente, el uso de los diferentes FAME y la terapia anti-TNF se asociaron a disminución de la actividad de la enfermedad. Ajusfando por estas variables, tener 2 variantes genéticas asociadas a niveles séricos bajos de VIP se asoció, de forma significativa, a tener niveles más elevados de actividad de la enfermedad en pacientes con ACPA negativos. En el caso de rs688136, tener genotipo CC mostró una tendencia, no significativa, a tener menor actividad de la enfermedad.
Tabla 12. Análisis multivariable del efecto de las variantes genéticas de VIP sobre la evolución de la actividad en pacientes con artritis de inicio.
Figure imgf000035_0001
Negativo / 1 0,18±0,26 0,482 0,01 ±0,60 0,984
Negativo / 2 0,94±0,50 0,058 2,02±1 ,13 0,075
Positivo / 0 0,24±0,14 0,087 0,52±0,32 0,106
Positivo / 1 0,1 1 ±0,25 0,656 0,42±0,57 0,462
Positivo / 2 0,06±0,60 0,912 0,51 ±1 ,39 0,715
rs688136
TT Referencia - Referencia -
TC 0,13±0,13 0,323 0,25±0,31 0,414
CC -0,24±0,22 0,291 -0,71 ±0,52 0,172
* la etiqueta 0 corresponde a no ser homocigoto T de rs3823082 y no tener ningún alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568. La etiqueta 1 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 o tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568. La etiqueta 2 corresponde a ser homocigoto T de rs3823082 y tener, al menos, un alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568.
La siguiente variable a analizar fue la intensidad del tratamiento con FAME a lo largo de los dos años de seguimiento. Esta variable puede ser considerada una variable subrogada de gravedad, ya que, como se ha mencionado en el párrafo anterior, aquellos pacientes que en el seguimiento tienen peor evolución van siendo tratados de forma más intensa.
Como ocurrió con la actividad de la enfermedad, el genotipo de los SNP aislados no proporcionó información sólida (datos no mostrados). En la figura 7 se muestran los requerimientos de tratamiento según las combinaciones de los genotipos de rs3823082, rs35643203, rs71575932 y rs7755568 que se asocian a tener VIP bajo. De nuevo, se observa que los pacientes que tienen la asociación de genotipos para VIP bajo, precisan un tratamiento más intenso, de forma más homogénea. En un análisis simple estas diferencias no alcanzan significación estadística (p=0,3). Por estudio previos de la comunidad reumatológica está bien establecido que la presencia de ACPA (anticuerpos anti proteínas citrulinadas) o el género femenino son factores de mal pronóstico. Este conocimiento produce un sesgo de intervención, es decir, hace que los médicos responsables prescriban un tratamiento intensivo precoz cuando están presentes cualquiera de los factores y, por ello, en el análisis de la relación entre variantes genéticas de VIP e intensidad de tratamiento, ACPA y género femenino actúan como factores de confusión o modificadores.
Por este motivo, se realizó un análisis multivariable que confirmó que las mujeres, los pacientes que cumplían criterios de AR y, de forma casi significativa, los que presentaban ACPA, recibieron una mayor intensidad de tratamiento (Tabla 13). Ajustando por estas variables de confusión, comprobamos que los pacientes que presentaban las variantes genéticas asociadas a tener niveles bajos de VIP (es decir ser homocigoto T de rs3823082 y tener, al menos, una copia del alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568) recibieron un tratamiento significativamente más intenso (Tabla 13 y Figura 8).
Tabla 13. Variables asociadas a la prescripción de un tratamiento más intenso con FAME en pacientes con artritis de reciente comienzo.
Figure imgf000037_0001
La condición de cada variable considerada referencia por el modelo es aquella frente a la que se comparan las otras condiciones de dicha variable. Por ejemplo, ajustado por el efecto del resto de variables, ser mujer se asocia a recibir 0,36 veces más el tratamiento que reciben los hombres.
La figura 8 permite visualizar como las variables género, diagnóstico y ACPA están introduciendo un sesgo o confundiendo/modificando el efecto de nuestra variable de interés (niveles de VIP bajos o normales) en la variable dependiente (o de desenlace), en este caso la intensidad de tratamiento con FAME. Así vemos que la mayor intensidad de tratamiento asociada a presentar las variantes genéticas que determinan tener VIP bajo (ser homocigoto T de rs3823082 y tener, al menos, una copia del alelo menor de rs35643203, de rs71575932 o de rs7755568) se ve mejor en el caso de pacientes varones, con artritis indiferenciada o ACPA negativo que no incitan al reumatólogo a un tratamiento más intensivo desde el comienzo del cuadro. En los pacientes que cumplen criterios de AR, son mujeres o tienen ACPA positivos, los médicos responsables tienden a tratar siempre de forma más intensa, aunque también se ve una cierta tendencia a mayor tratamiento en los que tienen más variantes genéticas asociadas a VIP bajo (etiqueta 2).
En lo que se refiere a uso de terapia combinada, aquellos pacientes que tenían más alelos asociados a VIP bajo en suero recibieron este tipo de tratamiento con mayor frecuencia (62,5%) que los que no tenían ningún alelo asociado a VIP bajo (46,03%). Las diferencias no alcanzaron significación estadística, probablemente porque, en aras de conseguir un control más rápido de la enfermedad, el uso de terapia combinada es una práctica muy frecuente entre los reumatólogos del HU La Princesa.
Por último, en una población más limitada, se estudió cómo afecta la presencia de las variantes genéticas en la destrucción articular medida con el índice de Sharp modificado por van der Heijde (Van der Heide DM et al. J Rheumatol 1995;22(9):1792-6). Como se aprecia en la figura 9, los pacientes que no tenían variantes genéticas asociadas a VIP sérico bajo tuvieron una menor progresión radiológica en conjunto que los que tenían, al menos, una variante genética. Estas diferencias casi alcanzaron la significación estadística (p=0,062). De nuevo, se realizó un análisis multivariante en el que se incluyeron variables que se sabe afectan a la progresión radiológica como la presencia del epítopo compartido, ser fumador o el sexo.
Tabla 14. Variables asociadas a la progresión de la destrucción articular en pacientes con artritis de reciente comienzo estimada en radiografías de manos y pies mediante el índice de Sharp con la modificación de van der Heijde.
Figure imgf000038_0001
Ex-fumador -8,7 6,7 0,196
Fumador 10,5 4,2 0,013
Número de copias de EC
Ninguna Referencia - -
Una 4,2 3,5 0,231
Dos 13,8 5,7 0,016
Variantes genéticas
asociadas a VIP sérico bajo
No
Referencia
Si
13,1 4,9 0,007 rs688136
I T I
TC N.l. N.l. -
CC
E.C.: epítopo compartido (se refiere a la secuencia de aminoácidos común que codifican aquellos alelos de HLA-DRB1 que se asocian a mayor riesgo para desarrollar artritis reumatoide). N.l. no incluido por no mejorar el modelo. Ejemplo 3: Relación entre el genotipo de las diferentes variantes y los niveles de VIP en una población de espondiloartritis de reciente comienzo
Para determinar si los hallazgos descritos previamente son extensibles a otras enfermedades mediadas por mecanismos inmunes, se estudiaron 54 pacientes de nuestra consulta de espondiloartritis de inicio en los que se determinaron los niveles de VIP en suero, así como aquellas variantes genéticas que en la población de artritis de inicio influían en los niveles de VIP (rs3823082, rs71575932, rs35643203, rs688136). En este estudio no se genotipo rs7755568 porque está en desequilibrio de unión con rs71575932 y rs35643203. Los datos clínicos de los pacientes se describen en la Tabla 15. Tabla 15. Características básales de los pacientes de la consulta de espondiloartritis de inicio según su diagnóstico final.
Figure imgf000040_0001
Spondylitis Disease Activity Index"; BASFI, "Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index"; PCR: proteína C reactiva; VSG, velocidad de sedimentación globular; Hb, hemoglobina; VIP, "vasoactive intestinal peptide"; N.S. no significativo.
En esta nueva población, confirmamos que, al igual que ocurría en la población de artritis de inicio, rs71575932 y rs35643203 se encuentran en desequilibrio de ligamiento ya que su genotipo es prácticamente idéntico en todos los pacientes (Tabla 16).
Tabla 16. Asociación entre los SNPs rs71575932 y rs35643203 en pacientes con espondiloartritis de inicio rs71575932
35643032 rs Total
AA AG GG
45 1 0 46
CC
100% 33% 0% 93,88%
0 2 0 2
CT
0% 66,67% 0% 4,08%
0 0 1 1
TT
0% 0% 100% 2,04%
45 3 1 49
Total
100% 100% 100% 100%
Test exacto de Fisher < 0,001
Por lo tanto, se puede concluir que ambos polimorfismos pueden ser utilizados indistintamente. Esta situación fue diferente con rs3823082 y rs688136, como se observa en las tablas 17 y 18 respectivamente. Como ocurrió con los pacientes de artritis de inicio, rs3823082 presentó una distribución similar a rs71575932 y rs35643203, pero con una subpoblación relevante no coincidente en sus genotipos (Tabla 17).
Tabla 17. Distribución comparativa de los genotipos de los SNPs rs71575932 y rs3823082 en pacientes con espondiloartritis de inicio
Figure imgf000041_0001
Test exacto de Fisher
Las diferencias en los genotipos de rs71575932 o rs35643203 y rs688136 fue aún más dispar (Tabla 18), igual que ocurría en el ejemplo 1 en pacientes con artritis de inicio. Tabla 18 Distribución comparativa de los genotipos de los SNPs rs71575932 y rs3823082 en pacientes con espondiloartritis de inicio
Figure imgf000042_0001
Test exacto de Fisher = 0,042 Para determinar cómo influyen las variantes genéticas de VIP estudiadas en los niveles séricos de este neuropéptido de los pacientes con espondiloartritis de inicio, se llevó a cabo un análisis multivariable ajustado de forma similar al que se ha mostrado en el ejemplo 2.1 (Tabla 1 1 ) para pacientes con artritis de inicio. Los resultados obtenidos son similares en ambos casos, con la salvedad de que los valores de significación p son menores en el análisis de pacientes con espondiloartritis ya que el tamaño muestral fue mucho menor. La tabla 19 muestra que tener algún alelo menor de los SNPs asociados a VIP bajo en artritis de inicio (rs3823082, rs71575932, rs35643203), también se asoció a menores niveles séricos de VIP en espondiloartritis de inicio. Por el contrario, ser portador de, al menos, un alelo menor C de rs688136 se asoció con niveles séricos de VIP más elevados (Tabla 19). La única diferencia es que en el caso de los pacientes con espondiloartritis la edad no mostró asociación a los niveles séricos de VIP, probablemente porque los pacientes con espondiloartritis suelen debutar a una edad homogéneamente más joven que los de artritis reumatoide, en los que hay una mayor variabilidad y el espectro de edades es más amplio como para detectar la pequeña asociación que se describe en la Tabla 1 1 .
La figura 1 1 muestra de forma gráfica cómo ser portador del alelo menor de rs688136, en ausencia de algún alelo menor de rs3823082, rs71575932 o rs35643203, se asocia con la presencia de niveles más altos de VIP (caja blanca a la izquierda de la figura). Por el contrario, tener algún alelo menor de rs3823082, rs71575932 o rs35643203, en ausencia del alelo menor de rs688136, hace que los niveles de VIP sean más bajos (caja gris oscura a la derecha de la figura). También se observa cómo interaccionan entre ellos, de forma que presente la presencia del alelo menor de rs688136 compensa el efecto de tener algún alelo menor de rs3823082, rs71575932 o rs35643203 y los niveles en este caso son intermedios y similares a que no hubiese ningún alelo menor de estas cuatro variantes (cajas centrales de la figura).
Tabla 19. Efecto de diferentes variantes genéticas en el gen de VIP sobre sus niveles séricos (normalizados mediante transformación logarítmica), ajustado por uso de medicación bloqueante de TNF.
Figure imgf000043_0001
Coe coeficiente; e.s.: error estándar. Se considera estadísticamente significativo p<0,05
Ejemplo 4: Relación entre el genotipo de las diferentes variantes y los niveles de VIP en una población de lupus eritematoso sistémico
Para determinar si los hallazgos descritos previamente eran extensibles a lupus eritematoso sistémico, se realizó un estudio con 78 sueros de pacientes de dicha enfermedad. Como conclusión, se observan datos similares a los referidos para la artritis reumatoide y para espondiloartritis.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Método de obtención de datos útiles para el pronóstico de una enfermedad autoinmune que comprende la detección de los polimorfismos genéticos del gen "péptido intestinal vasoactivo" ( VIP) rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568 en una muestra biológica aislada de un sujeto que padece una enfermedad autoinmune.
2. Método según la reivindicación 1 que además comprende la detección del polimorfismo genético rs3823082 y/o rs688136 del gen VIP.
3. Método según la reivindicación 2 que además comprende la detección de al menos uno de los polimorfismos genéticos del gen VIP que se selecciona de la lista que comprende: rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 y rs12201 140; o cualquiera de sus combinaciones.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la enfermedad autoinmune se selecciona de la lista que comprende: artritis autoinmune, espondiloartritis, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal.
5. Método según la reivindicación 4 donde la artritis autoinmune es artritis reumatoide.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la muestra biológica es sangre, suero, plasma, saliva, orina, líquido sinovial o linfa.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde el sujeto es un humano.
8. Método in vitro para el pronóstico de una enfermedad autoinmune en un sujeto que padece una enfermedad autoinmune, que comprende:
a. la detección de los polimorfismos genéticos del gen VIP rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568 en una muestra biológica ; y
b. la asociación del alelo T del polimorfismo genético rs35643203, la asociación del alelo G del polimorfismo genético rs71575932 y/o la asociación del alelo A del polimorfismo rs7755568, a un mal pronóstico.
9. Método según la reivindicación 8 que además comprende en el paso (a) la detección del polimorfismo rs3823082 y/o rs688136 del gen VIP y en el paso (b) la asociación del genotipo TT del polimorfismo rs3823082 con un mal pronóstico y/o la asociación del genotipo CC del polimorfismo rs688136 con un buen pronóstico.
10. Método según la reivindicación 9 que además comprende la detección en el paso (a) de al menos uno de los polimorfismos genéticos del gen VIP que se selecciona de la lista que comprende rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 y rs12201 140; o cualquiera de sus combinaciones, y la asociación en el paso (b) del alelo A del polimorfismo rs12213214, del alelo T del polimorfismo rs60946248, del alelo G del polimorfismo rs140023105, del alelo T del polimorfismo rs7764067, del alelo G del polimorfismo rs12201030, del alelo C del polimorfismo rs74760293, del alelo G del polimorfismo rs149081483 y del alelo T del polimorfismo rs12201 140, o cualquiera de sus combinaciones, a un mal pronóstico.
1 1 . Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 donde además en un paso (c) se detectan anticuerpos antiproteínas citrulinadas.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1 1 donde la enfermedad autoinmune se selecciona de la lista que comprende: artritis autoinmune, espondiloartritis, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal.
13. Método según la reivindicación 12 donde la artritis autoinmune es artritis reumatoide.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 donde la muestra biológica es sangre, plasma, suero, saliva, orina, líquido sinovial o linfa.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14 donde el sujeto es un humano.
16. Método ¡n vitro para diseñar un tratamiento individualizado para un sujeto que padece una enfermedad autoinmune que comprende detectar los polimorfismos genéticos del gen VIP rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568 en la muestra biológica; en el que la presencia del alelo T del polimorfismo genético rs35643203, la presencia del alelo G del polimorfismo genético rs71575932 y/o la presencia del alelo A del polimorfismo rs7755568 es indicativa de que el tratamiento a administrar es una terapia combinada de fármacos modificadores de la enfermedad (FAME) sintético y biológico.
17. Método según la reivindicación 16 que además comprende la detección del polimorfismo del gen VIP rs3823082 y/o rs688136 y donde la presencia del genotipo TT del polimorfismo rs3823082 es indicativa de que el tratamiento a administrar es dicha terapia combinada y/o la presencia del genotipo CC del polimorfismo rs688136 es indicativa de que el tratamiento a administrar es monoterapia de FAME no biológico.
18. Método según la reivindicación 17 que además comprende la detección del polimorfismo del gen VIP que se selecciona de la lista que comprende rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 y rs12201 140; o cualquiera de sus combinaciones; y donde la presencia del alelo A del polimorfismo rs12213214, del alelo T del polimorfismo rs60946248, del alelo G del polimorfismo rs140023105, del alelo T del polimorfismo rs7764067, del alelo A del polimorfismo rs7755568, del alelo C del polimorfismo rs74760293, del alelo G del polimorfismo rs149081483 y del alelo T del polimorfismo rs12201 140, o cualquiera de sus combinaciones, es indicativa de que el tratamiento a administrar es dicha terapia combinada y/o la presencia del alelo G del polimorfismo rs12201030 es indicativa de que el tratamiento a administrar es monoterapia de FAME no biológico.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 donde la enfermedad autoinmune se selecciona de la lista que comprende: artritis autoinmune, espondiloartritis, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal.
20. Método según la reivindicación 19 donde la artritis autoinmune es artritis reumatoide.
21 . Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 donde la muestra biológica es sangre, plasma, suero, saliva, orina, líquido sinovial o linfa.
22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 donde el FAME biológico es un agente bloqueante del factor de necrosis tumoral.
23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 donde el sujeto es un humano.
24. Uso de los polimorfismos genéticos del gen VIP rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568 como marcador pronóstico de enfermedad autoinmune en un sujeto que padece una enfermedad autoinmune.
25. Uso según la reivindicación 24 que además comprende el uso del polimorfismo genético del gen VIP rs3823082 y/o rs688136.
26. Uso según la reivindicación 25 que además comprende el uso de los polimorfismos genéticos del gen VIP seleccionados de la lista que comprende: rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 y rs12201 140, o cualquiera de sus combinaciones.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 donde la enfermedad autoinmune se selecciona de la lista que comprende: artritis autoinmune, espondiloartritis, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal.
28. Uso según la reivindicación 27 donde la artritis autoinmune es artritis reumatoide.
29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 donde el sujeto es un humano.
30. Kit que comprende primers y/o sondas para detectar los polimorfismos genéticos del gen VIP rs35643203, rs71575932 y/o rs7755568.
31 . Kit según la reivindicación 30 que además comprende primers y/o sondas para detectar el polimorfismo genético del gen P rs3823082 y/o rs688136.
32. Kit según la reivindicación 31 que además comprende primers y/o sondas que detectan los polimorfismos genéticos del gen VIP rs12213214, rs60946248, rs140023105, rs7764067, rs12201030, rs74760293, rs149081483 y rs12201 140, o cualquiera de sus combinaciones.
33. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32 que además comprende anticuerpos, sondas o primers específicos para detectar anticuerpos antiproteínas citrulinadas o péptidos citrulinados o proteínas citrulinadas .
34. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33 para el pronóstico de una enfermedad autoinmune en un sujeto que padece dicha enfermedad.
35. Uso según la reivindicación 34 donde la enfermedad autoinmune se selecciona de la lista que comprende: artritis autoinmune, espondiloartritis, lupus eritematoso sistémico, psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal.
36. Uso según la reivindicación 35 donde la artritis autoinmune es artritis reumatoide.
37. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36 donde el sujeto es un humano.
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