WO2015133074A1 - 分泌シグナルペプチドをコードするｄｎａ - Google Patents

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WO2015133074A1
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amino acid
peptide
signal peptide
acid sequence
valine
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赤田　倫治
尚司 星田
透 鎗水
美紀子 中村
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Yamaguchi University NUC
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Yamaguchi University NUC
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    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to a DNA encoding a secretory signal peptide capable of secreting a protein outside a cell.
  • Protein production technology using various microorganisms including yeast has been developed.
  • a method is used in which a DNA encoding the protein is introduced into a host cell and the protein is expressed in the cell.
  • Proteins expressed in cells include proteins that are secreted outside the cells and proteins that are not secreted or hardly secreted outside the cells. When the latter protein is produced, it is necessary to crush the cells and separate the protein from the cell lysate, which has a problem of poor production efficiency.
  • a method is used in which a secretory signal peptide is bound or substituted on the N-terminal side of the protein and the expressed protein is secreted outside the cell.
  • secretory signal peptide a peptide that can function as a secretory signal in a eukaryotic host derived from the genome of Candida utilis (see Patent Document 1) or a hawk derived from Aspergillus oryzae (Taka)
  • An amylase signal sequence TAA signal sequence
  • a secretory signal peptide derived from copepod or shellfish luciferase see Patent Document 3
  • Peptides were not fully satisfactory because they were not highly secreted.
  • a method using a peptide obtained by modifying a wild type secretory signal peptide has been developed.
  • a DNA sequence encoding a signal peptide is converted to an amino acid sequence MMRP.
  • [Hydrophobic amino acid] n selected from the DNA sequence encoding TSALA or the amino acid sequence MKT [hydrophobic amino acid] n DNA sequence encoding CATVHC, wherein n is an integer of 4 to 16,
  • An expression cassette in which the hydrophobic amino acid is A, I, L, M, F, or V has been proposed (see Patent Document 4), but it is secreted compared to a control using a routinely used signal sequence.
  • the type and position of amino acids involved in secretion are not specified. It is known that the secretory signal peptide contains a basic amino acid near the N-terminus, followed by many hydrophobic amino acids, especially valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, and tryptophan. It has not been fully clarified as to whether the amount of secretion increases if it is placed in the. Therefore, in order to modify the secretory signal peptide, it is necessary to examine a huge number of amino acid combinations, which requires labor and cost.
  • An object of the present invention is to provide a DNA encoding a highly versatile secretion signal peptide that has a high secretion ability and can secrete a plurality of proteins.
  • Gaussia luciferase GLuc
  • yeast using secretory signal peptides obtained from amino acid sequences of secreted proteins derived from various organisms. It was.
  • secretory signal peptides obtained from amino acid sequences of secreted proteins derived from various organisms. It was.
  • each secretory signal peptide used was mainly composed of hydrophobic amino acids, there were various cases in which the amount of secretion was large or small depending on the type of secretory signal peptide.
  • GLuc Gaussia luciferase
  • the present invention provides [1] (a) a secretory signal peptide consisting of an amino acid sequence represented by formula (I); XM 1 -M 2 -... -M i -E Formula (I) (In the formula (I), X represents lysine or arginine, M represents methionine, E represents glutamic acid, and i represents an integer of 12 to 17) (B) a secretory signal peptide consisting of an amino acid sequence in which one or two methionines in formula (I) are substituted with hydrophobic amino acids, and having the ability to secrete the target protein expressed in yeast cells; DNA encoding a secretory signal peptide consisting of the amino acid sequence shown in (a) or (b) above, or [2] DNA described in [1] above encoding a secretory signal peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 [3] a recombinant vector for yeast containing the DNA described in [1] or [2
  • the present invention also provides [7] (a) a secretory signal peptide consisting of an amino acid sequence represented by formula (I); XM 1 -M 2 -... -M i -E Formula (I) (In the formula (I), X represents lysine or arginine, M represents methionine, E represents glutamic acid, and i represents an integer of 12 to 17) (B) a secretory signal peptide consisting of an amino acid sequence in which one or two methionines in the above formula (I) are substituted with hydrophobic amino acids, and having the ability to secrete the target protein expressed in yeast cells; It relates to a secretory signal peptide consisting of the amino acid sequence shown in (a) or (b).
  • the present invention it is possible to provide a new DNA encoding a secretory signal peptide having the ability to secrete the target protein expressed in yeast cells.
  • the DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention to secrete and produce the target protein, various proteins can be efficiently produced without disrupting the cells.
  • i is preferably an integer of 14 to 17, more preferably 16, and represented by the formula (I)
  • a secretory signal peptide consisting of an amino acid sequence is preferred.
  • the secretion signal peptide of the present invention is preferably a secretion signal peptide having methionine as an initiation codon on the N-terminal side of lysine or arginine in the formula (I).
  • glycine is G
  • valine V
  • lysine is K
  • leucine is L
  • isoleucine is I
  • methionine is M
  • serine is S
  • proline is P
  • threonine is T
  • alanine is A
  • tyrosine is Y
  • histidine H
  • glutamine is Q
  • asparagine is N
  • aspartic acid is D
  • glutamic acid E
  • cysteine is C
  • tryptophan W
  • arginine is R
  • phenylalanine is F.
  • the DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention is not particularly limited as long as it encodes the secretory signal peptide of the present invention, but is more preferably a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • secretion means that a protein expressed in a cell is transported outside the cell
  • secretion signal peptide means a peptide that functions to secrete the protein
  • the amino acid sequence in which one or two methionines in formula (I) are substituted with hydrophobic amino acids is preferably an amino acid sequence in which one methionine in formula (I) is substituted with a hydrophobic amino acid.
  • hydrophobic amino acids include leucine, alanine, phenylalanine, tryptophan, isoleucine, valine and tyrosine, and preferably leucine, alanine, phenylalanine and tryptophan.
  • the target protein is not particularly limited and may be a secretory protein or a non-secretory protein, and examples thereof include storage proteins such as enzymes, antibodies, hormones, and albumins, structural proteins, metal binding proteins, and cofactor proteins. Can do.
  • Non-secretory proteins include proteins from which secretory signals in secretory proteins are deleted.
  • the yeast in the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the yeast in taxonomics.
  • the genus Kluyveromyces, Debaryomyces, Hansenuala, Candida Metschnikowia, Nematospora, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces, Schiesoswan ), Trichosporon, Triulosporon, Torulopsis, Rhodotorula, Yarrowia and the like.
  • Kluyveromyces africanus K. africanus
  • K. lactis Kruiberoma Yeasts of the genus Kluyveromyces such as K. marxianus and K.
  • yeasts of the genus Debaryomyces such as D. hansenii, Hansenula Hansenula yeast such as H. anomala, C. albicans, C. utilis, C. glabrata, Candida boise (C. boidinii), Candida tropicalis, C. lipolytica, C. flaveri, C. versatilis and other yeasts of the genus Candida, Methnicowia yeasts such as M. pulcherrima (M.pulcherrima), Nematospora corili (N. coryli), etc. Yeast of Nematospora, P. stipitis P. farinosa, P. pastris, P.
  • Saccharomyces kudria S. kudriavzevii Saccharomyces cerevisiae, S. douglasii, S. carlsbergensis, S. paradoxus, Saccharomyces paradoxus (S.pastorianus), Saccharomyces bayanus (S.bayanus), Saccharomyces manginini (S.mangini), Saccharomyces mikatae (S.mikatae) and other yeasts of the genus Saccharomyces, S. ludwigii Saccharomycodes yeast such as S. pombe and other yeasts of the genus Schizosaccharomyces, S. a11uvius, S.
  • yeasts of the genus Torlopsis such as Tolropsis candida (T.candida)
  • yeasts of the genus Rhodotorula such as Rhodotorula minuta (R.mucilaginosa)
  • Yarrowia Yarrowia yeasts such as Mycopsis and Lipolytica (Y. (Saccharomycopsis) lipolytica)
  • Kluyveromyces or Saccharomyces yeasts yeasts mention may be made inter alia of Kluyveromyces marxianus or Saccharomyces cerevisiae suitably.
  • the yeast in the present invention includes mutants of these yeasts.
  • the ability to secrete the target protein expressed in yeast cells outside the cell can be evaluated by the amount of the target protein secreted outside the cell.
  • the amount of the target protein secreted outside the cell can be determined by transforming yeast using a recombinant vector containing the DNA encoding the target protein operably downstream of the DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention. It can be determined by quantifying the amount of protein in the culture medium secreted by culturing the transformant by a known method.
  • the target protein when expressed using a wild-type secretory signal peptide of Gaussia luciferase (GLuc) as a secretory signal peptide having the ability to secrete the target protein expressed in yeast cells to the outside of the cell.
  • GLuc Gaussia luciferase
  • the recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains a DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention, and the target protein can be obtained by performing PCR or ligation using such a vector. It becomes possible to introduce DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention upstream of the encoding DNA. Even when the target protein already has a secretory signal peptide, the addition or substitution of DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention is useful when it is desired to further increase the amount of secretion.
  • the recombinant vector of the present invention may contain DNA encoding the target protein operably downstream of the DNA encoding the secretory signal peptide, and if the target protein is expressed in cells using such a vector, The expressed target protein can be secreted.
  • the vector used for the recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it can express the target protein, and may be linear or circular, and can be autonomously replicated, or can be integrated into a chromosome. Those containing control sequences such as promoters, enhancers and terminators can be preferably used.
  • yeast transformant containing a recombinant vector containing a DNA encoding the target protein operably downstream of the DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention is used.
  • the yeast is preferably a yeast of the genus Kluyveromyces or Saccharomyces.
  • the DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention can be synthesized according to a conventional method using various commercially available DNA synthesizers.
  • the secretory signal peptide of the present invention can be produced by a general chemical synthesis method according to its amino acid sequence.
  • Chemical synthesis methods include peptide synthesis methods using ordinary liquid-phase methods and solid-phase methods. More specifically, the step of extending the chain by sequentially binding each amino acid one by one based on amino acid sequence information.
  • the wise erosion method and a fragment condensation method in which a fragment consisting of several amino acids is synthesized in advance and then each fragment is subjected to a coupling reaction are included.
  • a recombinant vector containing the DNA encoding the target protein operably downstream of the DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention is used.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method for producing a transformed cell in which the target protein is expressed, and a method for producing such a transformed cell is a general method for introducing a recombinant vector into the cell.
  • methods that are widely used in this technical field such as lithium acetate method, liposome method, lipofection method, microinjection method, DEAE dextran method, calcium phosphate method, electroporation method and the like.
  • the production method of the target protein of the present invention is not particularly limited as long as it is a method for culturing a yeast transformant containing the recombinant vector of the present invention and recovering the target protein from the culture solution. It can carry out according to the usual method used for culture
  • the yeast cell used for the production of the transformant is Kluyveromyces or Saccharomyces
  • it is cultured at about 30 ° C., at about pH 6, and under aerobic conditions such as shaking culture or aeration-agitation culture. be able to.
  • Examples of the method for recovering the target protein from the culture solution include a known protein recovery method, for example, centrifugation, followed by gel filtration, ion exchange, affinity chromatography and the like. Since the target protein is secreted outside the cell, it is preferable to recover the target protein without destroying the cells.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by yeast cells and can culture the transformant. Any of them may be used.
  • the carbon source that can be used in the above medium include carbohydrates such as glucose, galactose, fructose, sucrose, raffinose, and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol.
  • Nitrogen sources that can be used in the above medium include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor And substances containing nitrogen sources such as various amino acids.
  • examples of inorganic substances that can be used in the above-mentioned medium include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. it can.
  • the DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention can be provided as a kit for secreting and producing the target protein.
  • a kit for secreting and producing the target protein includes a buffer, dNTPs, and a control. Templates, instructions, etc. may be included.
  • Gaussia luciferase has a secretory signal peptide on the N-terminal side. An attempt was made to produce a secretory signal peptide having a high secretory ability by adding a mutation to a part of the secretory signal peptide to express GLuc.
  • PCR was performed using a primer and a reverse primer, and the wild type peptide (MGVKV) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the peptide 2G3V ⁇ lacking the second glycine and the third valine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (MKV) Peptide 2G3V ⁇ 4KR (MRV) in which the second glycine and the third valine are deleted and the fourth lysine is replaced with arginine. The second glycine and the third valine are deleted and the fourth lysine is removed.
  • MKV wild type peptide
  • Peptide 2G3V ⁇ 4KN (MNV) substituted with asparagine is missing the second glycine and the third valine, Peptide 2G3V ⁇ 4KW (MWV) in which the second lysine is replaced with tryptophan, peptide 2G3V ⁇ 4KF (MFV) in which the second glycine and the third valine are deleted, and the fourth lysine is replaced with phenylalanine, the second glycine and the third glycine Peptide 2G3V ⁇ 4KY (MYV) with valine deficient and 4th lysine substituted with tyrosine 2G3V ⁇ 4KM (MMV) with 2nd glycine and 3rd valine deficient and 4th lysine substituted with methionine Peptide 2G3V ⁇ 4KH (MHV) in which the glycine and the third valine are deleted and the fourth lysine is replaced with histidine, the second glycine and the
  • PCR was performed using KOD FX neo (Toyobo Co., Ltd.) according to the protocol.
  • the KOD FX neo reaction mixture consists of 1 ⁇ l template DNA solution, 0.3 ⁇ l 10 ⁇ M forward primer solution, 0.3 ⁇ l 10 ⁇ M reverse primer solution, 5 ⁇ l 2 ⁇ KOD FX neo buffer, 2 ⁇ l 2 mM dNTPs in 10 ⁇ l reaction.
  • 0.2 ⁇ l of KOD FX neo DNA polymerase and 1.2 ⁇ l of sterilized ultrapure water were prepared.
  • the reaction was initially denatured at 94 ° C. for 2 minutes, followed by heat denaturation at 98 ° C. for 10 seconds, annealing at 65 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 68 ° C. for 3 minutes under 30 cycles.
  • the transformant of Kluyveromyces marcianus was prepared according to the method of Abdel-Banat et al. (Abdel-Banat et al., Yeast vol. 27 29-39 (2009)). Using a 250 ml flask, Kluyveromyces marxianus RAK3908 strain (ura3 ade2: Yarimizu et al., Yeast vol. 30: 485-500) in 30 ml YPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) (2013)) was cultured with shaking at 150 rpm for 24 hours at 30 ° C.
  • the cultured cells were collected by centrifugation at 3000 rpm for 3 minutes, and 900 ⁇ l of TFB buffer (20 ml of 60% polyethylene glycol 3350 (manufactured by Sigma-Aldrich)), 3 ml of 1M dithiothreitol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), Suspended in 5 ml of 4M lithium acetate (manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.), 5.5 ml of sterile water, centrifuged again at 3000 rpm for 3 minutes, and suspended in 600 ⁇ l of TFB buffer.
  • TFB buffer 20 ml of 60% polyethylene glycol 3350 (manufactured by Sigma-Aldrich)
  • 3 ml of 1M dithiothreitol manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • 4M lithium acetate manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.
  • sterile water centrifuged again at 3000 rpm for 3
  • the horizontal axis represents the relative value of the luciferase activity measured by expressing each mutant peptide when the luciferase activity measured by expressing wild-type GLuc (MGVKV) is 1, and the vertical axis is expressed. Shows the types of peptides. As shown in FIG. 2, when lysine or arginine is used as the basic amino acid on the N-terminal side of the secretory signal peptide, it was revealed that the secretory ability is more than twice as high as that of the wild type.
  • the provided mutant GLuc was expressed in yeast, and the secretion ability of the mutant secretion signal peptide was evaluated by examining the luciferase activity of the culture solution.
  • PCR was performed using each forward primer and reverse primer shown in Table 2, and in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the second glycine and the third valine were Peptide lacking, 5th-12th amino acid substituted with leucine (MKL8), 2nd glycine and 3rd valine are missing, 4th lysine replaced with arginine, 5th-12th amino acid Is a peptide in which the second glycine and the third valine are deleted, the fourth lysine is replaced with arginine, and the fifth to twelfth amino acids are replaced with methionine, (MRM8), The second glycine and third valine are missing, the fourth lysine is replaced with arginine, and the fifth to twelfth amino acids are tripped.
  • MKL8 5th-12th amino acid substituted with leucine
  • MRM8 methionine
  • MRT8 threonine
  • MRT8 threonine
  • MRT8 threonine
  • MRT8 threonine
  • the 2nd glycine and the 3rd valine are deleted
  • the 4th lysine is Peptide substituted with arginine and 5th to 12th amino acid with glutamine (MRQ8), lack of 2nd glycine and 3rd valine
  • the horizontal axis represents the relative value of the luciferase activity measured by expressing each mutant peptide when the luciferase activity measured by expressing wild-type GLuc (MGVKV) is 1, and the vertical axis is expressed. Shows the types of peptides. As shown in FIG. 3, when the amino acid following lysine or arginine is leucine, methionine, or tryptophan as the basic amino acid on the N-terminal side of the secretory signal peptide, the secretory ability is more than doubled compared to the wild type. It became clear.
  • the second glycine and the third valine were A peptide that is deleted and in which the 5th to 15th amino acids are replaced with 7 consecutive leucines (MKL7E), the 2nd glycine and the 3rd valine are deleted, and the 8th to 15th amino acids are consecutive Peptide substituted with leucine (MKL8E), peptide lacking 2nd glycine and 3rd valine, 5th to 15th amino acid substituted with 9 consecutive leucines (MKL9E), 2nd glycine and A peptide in which the third valine is deleted and the 5th to 15th amino acids are replaced by 10 consecutive leucines (MKL10E), the second glycine and 3 A peptide in which the valine of the eye is missing and the 5th to 15th amino acids are replaced with 11 consecutive leucines (MKL11E), the 2nd glycine and the 3rd valine are missing, and the 5th to 15th amino acids
  • the horizontal axis is the relative value of the luciferase activity measured by expressing each mutant peptide when the luciferase activity measured by expressing wild-type GLuc (MGVKV) is 1, and the vertical axis is expressed. Shows the types of peptides. As shown in FIG. 4, when the amino acid following lysine or arginine was leucine, the luciferase activity was high when the number of consecutive leucines was 11 to 13, but about three times that of the wild type.
  • the second glycine and the third valine were Peptide lacking, 5th to 15th amino acid substituted with leucine (MKL13E), 2nd glycine and 3rd valine deleted, 5th to 15th amino acid replaced with leucine, 16th glutamic acid Peptide substituted with proline (MKL13P), peptide with 16th glutamic acid replaced with aspartic acid (MKL13D), peptide with 16th glutamic acid replaced with glutamine (MKL13Q), peptide with 16th glutamic acid replaced with asparagine ( MKL13N), a peptide in which the 16th glutamic acid is replaced with histidine (M KL13H), peptide with 16th glutamic acid substituted with lysine (MKL13K), peptide with 16th glutamic acid replaced with arginine (MKL13R), peptide with 16th glutamic acid replaced with serine (M
  • the horizontal axis represents the relative value of the luciferase activity measured by expressing each mutant peptide when the luciferase activity measured by expressing wild-type GLuc (MGVKV) is 1, and the vertical axis is expressed. Shows the types of peptides. As shown in FIG. 5, it was revealed that secretory ability is high when the amino acid on the C-terminal side of continuous leucine is an acidic amino acid glutamic acid.
  • the second glycine and the third valine were A peptide that is deleted and in which the 5th to 15th amino acids are replaced with 7 consecutive methionines (MKM7), the 2nd glycine and the 3rd valine are deleted, and the 5th to 15th amino acids are consecutive 8 Peptide substituted with methionine (MKM8), peptide lacking 2nd glycine and 3rd valine, 5th to 15th amino acid substituted with 9 consecutive methionine (MKM9), 2nd glycine and Peptide (MKM10) in which the 3rd valine is deleted and the 5th to 15th amino acids are replaced with 10 consecutive methionines (MKM10) And the 3rd valine, the 5th to 15th amino acids are replaced with 11 consecutive methionines (MKM11), the 2nd glycine and the 3rd valine are deficient.
  • MKM16 A peptide in which the acid is replaced with 16 consecutive methionines
  • MKM17 a peptide in which the 2nd glycine and the 3rd valine are deleted and the 5th to 15th amino acids are replaced with 17 consecutive methionines
  • the horizontal axis represents the relative value of the luciferase activity measured by expressing each mutant peptide when the luciferase activity measured by expressing wild-type GLuc (MGVKV) is 1, and the vertical axis is expressed. Shows the types of peptides. As shown in FIG. 6, it is clear that if methionine has 12 to 17 amino acids following lysine, the secretion ability is very high, and in particular, the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has a very high secretion ability. It became.
  • the hydrophobic amino acid leucine was deeply involved in secretion, but it was unexpected that the peptide substituted with methionine had higher secretion ability than leucine.
  • the number of methionine is 12 to 17 and has a high secretory ability, the number of methionine is adjusted according to the type of target protein to be expressed, and the secretory signal peptide optimal for the protein to be expressed is selected to select the target protein. It is possible to secrete efficiently.
  • PCR was carried out using a forward primer (hLIF + 4) shown in SEQ ID NO: 85 and a reverse primer (MKM (16) Ec-TDH3p-1c) shown in SEQ ID NO: 86.
  • a forward primer (hLIF + 58) represented by SEQ ID NO: 88 and a reverse primer (SEQ ID NO: 86) PCR was performed using MKM (16) Ec-TDH3p-1c), and a mutant peptide (MKM16E) in which the second to 19th amino acids of the hLIF amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 87 were substituted with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 -20G), FLAG tag, URA3 marker, KmCenD, KmARS7, ADE2 marker, and DNA fragment encoding TDH promoter (MKM16E-20G-hLIF-FLAG-URA3-KmCenD-KmARS7-ADE2-TDH3) was made.
  • a forward primer (hLIF + 79) represented by SEQ ID NO: 89 and a reverse primer (SEQ ID NO: 86) PCR was performed using MKM (16) Ec-TDH3p-1c), and a mutant peptide (MKM16E) in which the second to 26th amino acids of the hLIF amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 87 were replaced with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 -27I), FLAG tag, URA3 marker, KmCenD, KmARS7, ADE2 marker TDH, and DNA fragment (MKM16E-27I-hLIF-FLAG-URA3-KmCenD-KmARS7-ADE2-TDH3) was made.
  • Three DNA fragments encoding the produced mutant peptides were introduced into Kluyveromyces marxianus RAK3908 strain, cultured in uracil-deficient medium, and the grown strain was selected as a transformant.
  • the transformant obtained by introducing DNA fragments encoding RAK11618 and MKM16E-271 was obtained by storing the adenine / uracil non-auxotrophic transformant as RAK11620.
  • Table 6 shows the genotype of each strain.
  • the Kluyveromyces marxianus RAK11616 strain, RAK11618 strain, and RAK11620 strain were each cultured in a YPD medium with shaking at 150 rpm and 28 ° C. for 2 days.
  • the medium was centrifuged at 12,000 g for 10 minutes to obtain 400 ⁇ l of supernatant.
  • 500 ⁇ l of acetone was added to precipitate the protein.
  • the precipitate was dissolved in 40 ml of SDS-PAGE sample buffer (Laemmli sample buffer containing 5% 2-mercaptoethanol: manufactured by Bio-Rad), and then Laemmli sample buffer (Bio-Rad). After diluting 10 times, it was heated at 95 ° C. for 30 minutes.
  • RAK8772 strain which is a transformant of Kluyveromyces marxianus RAK3908 prepared using a DNA fragment encoding a mutant peptide (MKM16), and RAK6205 strain having DNA encoding a wild type peptide (MGVKV), respectively.
  • 1st PCR was performed using the DNA of the above as a template and the forward primer shown in SEQ ID NO: 90 (TDH3-572) and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 91 (3CG9-yGLuc + 558c), and the ScTDH promoter, MKM16 signal sequence and yGLuc And a DNA fragment encoding ScTDH3 promoter and yGLuc.
  • a forward primer (TDH3-572) shown in SEQ ID NO: 90 and a reverse shown in SEQ ID NO: 92 are used to add the sequence of the C-terminal part of ScURA3 for homologous recombination.
  • the vector DNA is YEpGAP-cherry plasmid DNA (Keppler-Ross et al., Genetics 179: 705-710 (2008)) as a template and the forward primer (URA3 + 771c) shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 29. It was prepared by performing PCR using the reverse primer (TDH3-1c40). 1st, 2nd PCR was performed according to the protocol using KOD FX neo (manufactured by Toyobo).
  • Each 2nd PCR product and vector DNA were mixed to transform Saccharomyces cerevisiae BY4700 strain, applied to uracil-deficient medium, cultured at 28 ° C. for 2-3 days, and the grown transformants were named RAK11911 and RAK11908, respectively. did.
  • Table 7 shows the genotypes of BY4700, RAK11911 strain, and RAK11908 strain.
  • RAK11911 strain and RAK11908 strain were cultured in YPB medium, and the luciferase activity of the culture supernatant was measured in the same manner as in Example 1 except that GloMax (registered trademark) 20/20 luminometer (Promega) was used. .
  • GloMax registered trademark 20/20 luminometer (Promega) was used.
  • Table 8 The results are shown in Table 8. In the table, WT is RAK11908 strain, M 16 is GLuc the culture supernatant RAK11911 strain.
  • the DNA encoding the secretory signal peptide of the present invention is used for highly secretory production of useful proteins.

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Abstract

　分泌能力が高く、かつ複数のタンパク質を分泌することができる汎用性の高い分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを提供する。　次の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを作製する。 （ａ）式（I）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド； Ｘ－Ｍ１－Ｍ2・・・－Ｍｉ－Ｅ　式（I） （式（I）中、Ｘはリジン又はアルギニンを示し、Ｍはメチオニンを示し、Ｅはグルタミン酸を示し、ｉは１２～１７の整数を示す） （ｂ）上記式（I）において１又は２個のメチオニンが疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、酵母細胞で発現した目的タンパク質を細胞外に分泌する能力を有する分泌シグナルペプチド；

Description

分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
　本発明は、タンパク質を細胞外に分泌させることが可能な分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡに関する。
　これまでに、酵母をはじめとする様々な微生物を利用したタンパク質の生産技術が開発されている。遺伝子組み換え技術を利用してタンパク質を工業的に生産するには、タンパク質をコードするＤＮＡを宿主となる細胞に導入し、細胞内でタンパク質を発現させる方法が用いられている。細胞内で発現したタンパク質には、細胞外に分泌されるタンパク質と、細胞外に分泌されない若しくは分泌されにくいタンパク質が存在する。後者のタンパク質を生産する場合には、細胞を破砕してタンパク質を細胞破砕物から分離する必要があり、生産効率が悪いという問題があった。そこで、細胞外に分泌されない若しくは分泌されにくいタンパク質を生産する場合には、タンパク質のＮ末端側に分泌シグナルペプチドを結合又は置換し、発現したタンパク質を細胞外に分泌させる方法が用いられている。
　分泌シグナルペプチドとしては、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来する、真核細胞宿主内で分泌シグナルとして機能しうるペプチド（特許文献１参照）や、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）由来タカ（Taka）アミラーゼシグナル配列（ＴＡＡシグナル配列）（特許文献２参照）や、カイアシ類又は貝虫類のルシフェラーゼに由来する分泌シグナルペプチド（特許文献３参照）が提案されているが、いずれの分泌シグナルペプチドも、分泌能力が高いとはいえず、十分に満足いくものではなかった。
　また、野生型の分泌シグナルペプチドを改変したペプチドを利用する方法が開発されており、例えば、異種性タンパク質の分泌のための発現カセットとして、シグナルペプチドをコード化しているＤＮＡ配列が、アミノ酸配列ＭＭＲＰ［疎水性アミノ酸］ｎ　ＴＳＡＬＡをコード化しているＤＮＡ配列又はアミノ酸配列ＭＫＴ［疎水性アミノ酸］ｎ　ＣＡＴＶＨＣをコード化しているＤＮＡ配列から選択され、式中のｎは４～１６の整数であり、前記疎水性アミノ酸はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ又はＶである発現カセット（特許文献４参照）が提案されているが、ルーチン的に使用されたシグナル配列を用いたコントロールと比較して、分泌量はわずか３０％程度増加しているにすぎなかった。さらに、卵白リゾチームの天然のシグナルペプチドの第１、第２及び第１６～１８番目のアミノ酸を除く全て、又は少なくとも大部分のアミノ酸を１種の疎水性アミノ酸で置換した該シグナルペプチドのアミノ酸配列（特許文献５参照）が開示されているが、分泌量の向上は２．５倍程度にとどまっていた。
　このように、野生型の分泌シグナルペプチドを改変しても十分な分泌量を得られていない理由の一つとして、分泌に関わるアミノ酸の種類や位置が特定されていないことが挙げられる。分泌シグナルペプチドはＮ末端近傍に塩基性アミノ酸が存在し、その後に疎水性アミノ酸、特にバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンが多く含まれていることは知られているが、どのアミノ酸がどのように配置されていれば分泌量が増加するかについては十分に明らかにされていない。そのため、分泌シグナルペプチドを改変するには、膨大なアミノ酸の組み合わせを検討する必要が生じ、手間も費用も必要となる。したがって、分泌シグナルペプチドを利用して細胞外へタンパク質を分泌させる場合には、既知の分泌シグナルペプチドの中から経験と勘によって最適と思われる分泌シグナルペプチドを選択して用いるのが現状であった。
再表２０１１－０７８３５１号公報 特開２００９－０６０８０４号公報 特開２００７－５２０２００号公報 特開２０１０－５２８６３４号公報 特開昭６３－２３３７８９号公報
　本発明の課題は、分泌能力が高く、かつ複数のタンパク質を分泌することができる汎用性の高い分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した中で、まずは様々な生物由来の分泌タンパク質のアミノ酸配列から得た分泌シグナルペプチドを用いて酵母でガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を分泌させた。その結果、用いた各分泌シグナルペプチドはいずれも主に疎水性のアミノ酸から構成されているにも関わらず、分泌シグナルペプチドの種類によって分泌量が多い場合と少ない場合と様々であった。
　そこで、分泌シグナルペプチドを構成するアミノ酸の一部を削除又は置換し、分泌に関わるアミノ酸を特定することを試みた。改変する分泌シグナルペプチドとしては、本明者らのこれまでの長年の知見等に基づいて、アミノ酸配列を改変することにより分泌能力が向上すると考えられるガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）の分泌シグナルペプチドを選択した。
　その結果、Ｎ末端側のリジン又はアルギニンから一定の長さのメチオニンの連続配列が分泌量を高めることが明らかとなった。また、連続するメチオニンに続くＣ末端側のアミノ酸が、グルタミン酸の場合には分泌量が多いことが明らかとなった。さらに、リジン又はアルギニンとグルタミン酸の間のメチオニンの数を変えてみたところ、連続するメチオニンの数が１２～１７個の場合に、野生型のガウシアルシフェラーゼの分泌シグナルペプチドを用いた場合と比べて１５倍以上もの高い分泌能力を有することが明らかとなった。加えて、かかる人工的な配列からなる分泌シグナルペプチドは、酵母において分泌させることが難しいヒトのＬＩＦタンパク質（ｈＬＩＦ）を分泌させる能力を有することを見いだし、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は［１］（ａ）式（I）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
Ｘ－Ｍ1－Ｍ2－・・・－Ｍｉ－Ｅ　式（I）
（式（I）中、Ｘはリジン又はアルギニンを示し、Ｍはメチオニンを示し、Ｅはグルタミン酸を示し、ｉは１２～１７の整数を示す）
（ｂ）上記式（I）において１又は２個のメチオニンが疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、酵母細胞で発現した目的タンパク質を細胞外に分泌する能力を有する分泌シグナルペプチド；
の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡや、［２］配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドをコードする上記［１］記載のＤＮＡや、［３］上記［１］又は［２］記載のＤＮＡを含む酵母用組換えベクターや、［４］目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む上記［３］記載の組換えベクターや、［５］上記［４］記載の組換えベクターを含む酵母の形質転換体や、［６］上記［５］記載の形質転換体を培養し、培養液から目的タンパク質を回収することを特徴とする目的タンパク質の生産方法に関する。
　また、本発明は、［７］（ａ）式（I）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
Ｘ－Ｍ1－Ｍ2－・・・－Ｍｉ－Ｅ　式（I）
（式（I）中、Ｘはリジン又はアルギニンを示し、Ｍはメチオニンを示し、Ｅはグルタミン酸を示し、ｉは１２～１７の整数を示す）
（ｂ）上記式（I）における１又は２個のメチオニンが疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、酵母細胞で発現した目的タンパク質を細胞外に分泌する能力を有する分泌シグナルペプチド；
の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドに関する。
　本発明により、酵母細胞で発現した目的タンパク質を細胞外に分泌する能力を有する分泌シグナルペプチドをコードする新たなＤＮＡを提供することができる。かかる本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを用い、目的タンパク質を分泌生産させることにより、細胞を破砕することなく様々なタンパク質を効率よく生産することが可能となる。
プラスミドｐＫＭ１５２のマップを示す図である。 配列番号３に示す野生型ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）のアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンを削除し、４番目のリジンを他のアミノ酸に置換した、変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させた場合のルシフェラーゼ活性を示す図である。 配列番号３に示すＧｌｕｃのアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンを削除し、４番目のリジン又はアルギニンに続くアミノ酸を連続する８個の同一のアミノ酸に置換した、変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させた場合のルシフェラーゼ活性を示す図である。 配列番号３に示すＧｌｕｃのアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンを削除し、５番目から１５番目のアミノ酸を７個～１７個の連続するロイシンに置換した、変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させた場合のルシフェラーゼ活性を示す図である。 配列番号３に示すＧｌｕｃのアミノ酸配列において、１６番目のグルタミン酸を他のアミノ酸に置換した、変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させた場合のルシフェラーゼ活性を示す図である。 配列番号３に示すＧｌｕｃのアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンを削除し、５番目から１５番目のアミノ酸を７個～１７個の連続するメチオニンに置換した変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させた場合のルシフェラーゼ活性を示す図である。 ＲＡＫ６２０５株、ＲＡＫ８７７２株の培養液上澄みのウェスタンブロッティング解析結果を示す図である。 プラスミドｐＫＭ３９８のマップを示す図である。 配列番号８７に示されるｈＬＩＦアミノ酸配列の１番目のメチオニンと２番目のリジンの間に配列番号１に示されるアミノ酸配列を導入した変異ペプチド（ＭＫＭ１６Ｅ－２Ｋ）、ｈＬＩＦアミノ酸配列の２番目～１９番目のアミノ酸を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換した変異ペプチド（ＭＫＭ１６Ｅ－２０Ｇ）、ｈＬＩＦアミノ酸配列の２番目～２６番目のアミノ酸を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換した変異ペプチド（ＭＫＭ１６Ｅ－２７Ｉ）を発現させた場合のウェスタンブロッティング解析によるｈＬＩＦの分泌（右の写真）を示す図である。
　本発明における分泌シグナルペプチドとしては、
（ａ）式（I）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
Ｘ－Ｍ1－Ｍ2－・・・－Ｍｉ－Ｅ　式（I）
（式（I）中、Ｘはリジン又はアルギニンを示し、Ｍはメチオニンを示し、Ｅはグルタミン酸を示し、ｉは１２～１７の整数を示す）
（ｂ）上記式（I）における１又は２個のメチオニンが疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、酵母細胞で発現した目的タンパク質を細胞外に分泌する能力を有する分泌シグナルペプチド；
の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドであれば特に制限されないが、ｉは好ましくは１４～１７の整数、より好ましくは１６であり、式（I）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドが好ましい。式（I）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドであって、ｉが１６の分泌シグナルペプチドとしては、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることがより好ましい。
　また、本発明の分泌シグナルペプチドにおいて、式（I）におけるリジン又はアルギニンのＮ末端側に開始コドンとしてのメチオニンを有する分泌シグナルペプチドであることが好ましい。
　なお、以下、グリシンをＧ、バリンをＶ、リジンをＫ、ロイシンをＬ、イソロイシンをＩ、メチオニンをＭ、セリンをＳ、プロリンをＰ、スレオニンをＴ、アラニンをＡ、チロシンをＹ、ヒスチジンをＨ、グルタミンをＱ、アスパラギンをＮ、アスパラギン酸をＤ、グルタミン酸をＥ、システインをＣ、トリプトファンをＷ、アルギニンをＲ、フェニルアラニンをＦということもある。
　本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限されないが、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡであることがより好ましい。
　本発明において、「分泌」とは、細胞内で発現したタンパク質が細胞外に輸送されることを意味し、「分泌シグナルペプチド」とはタンパク質を分泌させるために機能するペプチドを意味する。
　本発明において、式（I）における１又は２個のメチオニンが疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列としては、式（I）における１個のメチオニンが疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列であることが好ましい。
　本発明において、疎水性アミノ酸としては、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、イソロイシン、バリン、チロシンを挙げることができ、好ましくはロイシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファンを挙げることができる。
　本発明において、目的タンパク質としては特に制限されず、分泌性タンパク質でも非分泌性タンパク質でもよく、酵素、抗体、ホルモン、アルブミン等の貯蔵タンパク質、構造タンパク質、金属結合タンパク質、補因子タンパク質等を挙げることができる。なお、非分泌性タンパク質には分泌性タンパク質における分泌シグナルが削除されたタンパク質も含まれる。
　本発明における酵母としては、分類学上酵母に属するものであれば特に制限されず、例えば、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、デバリオマイセス属（Debaryomyces）、ハンゼヌラ属（Hansenuala）、キャンディダ属（Candida）、メチニコウィア属（Metschnikowia）、ネマトスポラ属（Nematospora）、ピキア属（Pichia）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、サッカロマイコデス属（Saccharomycodes）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、シュワニオマイセス属（Schwanniomyces）、トリコスポロン属(Trichosporon)、トルロプシス属（Torulopsis）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、ヤローウィア属（Yarrowia）等の酵母を挙げることができ、より具体的には、クルイベロマイセス・アフリカヌス（K.africanus）、クルイベロマイセス・ラクチス（K.lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（K.marxianus）、クルイベロマイセス・ファゼオロスポラス（K.phaseolosporus）等のクルイベロマイセス属の酵母、デバリオマイセス・ハンセニイ（D.hansenii）等のデバリオマイセス属の酵母、ハンゼヌラ・アノマラ（H.anomala）等のハンゼヌラ属の酵母、キャンディダ・アルビカンス（C.albicans）、キャンディダ・ウティリス（C.utilis）、キャンディダ・グラブラタ（C.glabrata）、キャンディダ・ボイジニィ(C.boidinii)、キャンディダ・トロピカリス（C.tropicalis）、キャンディダ・リポリティカ（C.lipolytica）、キャンディダ・フレーベリ（C.flaveri）キャンディダ・ビルサチルス（C.versatilis）等のキャンディダ属の酵母、メチニコウィア・プルテェリマ（M.pulcherrima）等のメチニコウィア属の酵母、ネマトスポラ・コリリ（N.coryli）等のネマトスポラ属の酵母、ピキア・スチピチス（P.stipitis）ピキア・ファリノサ（P.farinosa）、ピキア・パストリス（P.pastris）、ピキア・アノマラ（P.anomala）等のピキア属の酵母、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（S.kudriavzevii）、サッカロマイセス・セレビシエ（S.cerevisiae）、サッカロマイセス・ドウグラシ（S.douglasii）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（S.carlsbergensis）、サッカロマイセス・パラドキサス（S.paradoxus）、サッカロマイセス・パストリアヌス（S.pastorianus）、サッカロマイセス・バヤヌス（S.bayanus）、サッカロマイセス・マンジニ（S.mangini）、サッカロマイセス・ミカタエ（S.mikatae）等のサッカロマイセス属の酵母、サッカロマイコデス・ルドウイギ（S.ludwigii）等のサッカロマイコデス属の酵母、シゾサッカロミセス・ポンベ（S.pombe）等のシゾサッカロミセス属の酵母、シュワニオマイセス・アルビウス(S.a11uvius)、シュワニオマイセス・オシデンタリス（S.occidentalis）、シュワニオマイセス・カステリ（S.castellii）等のシュワニオマイセス属の酵母、トリコスポロン・プルランス(T.pu11ulans)、トリコスポロン・ペニシァタム（T.penicillatum）等のトリコスポロン属の酵母、トルロプシス・マグノリアエ（T.magnoliae）、トルロプシス・ヴェラティリス（T.veratilis）、トルロプシス・キャンディダ（T.candida）等のトルロプシス属の酵母、ロドトルラ・ミニュータ（R.minuta）、ロドトルラ・ムシラギノーザ（R.mucilaginosa）等のロドトルラ属の酵母、ヤローウィア(サッカロマイコプシス)・リポリティカ(Y.(Saccharomycopsis)lipolytica)等のヤローウィア属の酵母を挙げることができるが、クルイベロマイセス属又はサッカロマイセス属の酵母の酵母、中でもクルイベロマイセス・マルシアヌス又はサッカロマイセス・セレビシエを好適に挙げることができる。また、本発明における酵母には、これらの酵母の変異株も含まれる。
　酵母細胞で発現した目的タンパク質を細胞外に分泌する能力は、細胞外に分泌される目的タンパク質の量で評価することができる。細胞外に分泌される目的タンパク質の量は、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの下流に作動可能に目的タンパク質をコードするＤＮＡを含んだ組換えベクターを用いて酵母を形質転換し、形質転換体を培養して分泌された培養液中のタンパク質の量を公知の方法で定量することで求めることができる。
　本発明において、酵母細胞で発現した目的タンパク質を細胞外に分泌する能力を有する分泌シグナルペプチドとしては、たとえば、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）の野生型分泌シグナルペプチドを用いて目的タンパク質を発現させた場合の細胞外に分泌される目的タンパク質の量と比較して、１５倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは３５倍以上の目的タンパク質を分泌することが可能なペプチドを挙げることができる。
　本発明の組換えベクターとしては、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含んでいる組換えベクターであれば特に制限されず、かかるベクターを用いてＰＣＲやライゲーションを行うことにより、目的タンパク質をコードするＤＮＡの上流に本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを導入することが可能となる。目的タンパク質が既に分泌シグナルペプチドを有している場合であっても、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの付与や置換は、分泌量をさらに高めたい場合に有用である。
　また、本発明の組換えベクターは、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの下流に作動可能に目的タンパク質をコードするＤＮＡを含んでもよく、かかるベクターを用いて細胞内で目的タンパク質を発現させれば、発現した目的タンパク質を分泌させることができる。
　本発明の組換えベクターに用いるベクターとしては、目的タンパク質を発現できるものであれば特に制限されず、直鎖状でも環状でもよく、自立複製可能であるものや、あるいは染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
　本発明の組換えベクターを含む酵母の形質転換体としては、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの下流に作動可能に目的タンパク質をコードするＤＮＡを含んだ組換えベクターを含んでいる酵母の形質転換体であって、酵母としては、クルイベロマイセス属又はサッカロマイセス属の酵母が好ましい。
　本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。
　本発明の分泌シグナルペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。化学合成法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含され、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とが包含される。
　本発明の組換えベクターを含む酵母の形質転換体の製造方法としては、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの下流に作動可能に目的タンパク質をコードするＤＮＡを含んだ組換えベクターを酵母内に導入し、前記目的タンパク質が発現する形質転換細胞を製造する方法であれば特に制限されず、かかる形質転換細胞を製造する方法としては、組換えベクターを細胞内に導入する一般的な方法であればよく、酢酸リチウム法、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等、当技術分野で広く用いられている手法を挙げることができる。
　本発明の目的タンパク質の生産方法としては、本発明の組換えベクターを含む酵母の形質転換体を培養し、培養液から目的タンパク質を回収する方法であれば特に制限されず、培養方法としては酵母の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、形質転換体の作製に用いる酵母細胞がクルイベロマイセス属又はサッカロマイセス属の場合は、３０℃前後、ｐＨ６前後、及び、振とう培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で培養することができる。培養液から目的タンパク質を回収する方法としては、公知のタンパク質の回収方法、例えば、遠心分離、次いで、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティ等のクロマトグラフィーにより回収する方法を挙げることができる。目的タンパク質は細胞外に分泌されるため、細胞を破壊せずに目的タンパク質を回収することが好ましい。
　本発明の形質転換体を培養する培地としては、酵母細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を培養し得る培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。上述の培地に用い得る炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を挙げることができる。上述の培地に用い得る窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物や、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等の窒素源を含む物質を挙げることができる。上述の培地に用い得る無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を挙げることができる。
　本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、目的タンパク質を分泌生産するためのキットとして提供することもでき、かかるキットには本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの他、バッファー、ｄＮＴＰｓ、コントロールテンプレート、説明書等を含んでもよい。
　ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）はＮ末端側に分泌シグナルペプチドを有している。かかる分泌シグナルペプチドの一部に変異を加えてＧＬｕｃを発現させることで、分泌能力の高い分泌シグナルペプチドの作製を試みた。
［リジンの置換］
　配列番号３に示すＧＬｕｃのアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンを削除し、４番目のリジンを他のアミノ酸に置換した、変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させ、培養液のルシフェラーゼ活性を調べることにより変異分泌シグナルペプチドの分泌能力を評価した。
（変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片の作製）
　プラスミドｐＫＭ１５２（図１）が維持されたクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ６２０５株(ura3 ade2 p[ScADE2c-KmARS7c-ScTDH3p-yGLuc-ScURA3-KmCEND])の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、表１に示される各フォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる野生型ペプチド(MGVKV)、配列番号３に示すアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損したペプチド２Ｇ３ＶΔ（MKV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＲ（MRV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアスパラギンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＮ（MNV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをトリプトファンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＷ（MWV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをフェニルアラニンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＦ（MFV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをチロシンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＹ（MYV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをメチオニンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＭ（MMV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをヒスチジンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＨ（MHV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをイソロイシンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＩ（MIV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをロイシンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＬ（MLV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをシステインに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＣ（MCV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをスレオニンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＴ（MTV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをグルタミン酸に置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＥ（MEV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをグリシンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＧ（MGV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアスパラギン酸に置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＤ（MDV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをセリンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＳ（MSV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをバリンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＶ（MVV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをプロリンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＰ（MPV）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアラニンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＡ（MAV）、又は２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをグルタミンに置換したペプチド２Ｇ３ＶΔ４ＫＱ（MQV）と、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＡＤＥ２マーカーと、ＫｍＡＲＳ７と、ＴＤＨ３プロモーターとをコードするＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲは、ＫＯＤ　ＦＸ　ｎｅｏ（東洋紡社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。ＫＯＤ　ＦＸ　ｎｅｏ反応混合液は、反応液１０μｌ中に１μｌのテンプレートＤＮＡ溶液、０．３μｌの１０μＭフォワードプライマー溶液、０．３μｌの１０μＭリバースプライマー溶液、５μｌの２×ＫＯＤ　ＦＸ　ｎｅｏバッファー、２μｌの２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、０．２μｌのＫＯＤ　ＦＸ　ｎｅｏ　ＤＮＡポリメラーゼ、１．２μｌの滅菌超純水を混ぜて調製した。反応は、９４℃で２分間初期変性させた後、９８℃で１０秒間の熱変性、６５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長反応を３０サイクルの条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（形質転換体の作製）
　クルイベロマイセス・マルシアヌスの形質転換体はAbdel-Banatらの方法(Abdel-Banat et al.,Yeast vol.27 29-39(2009))に従って作製した。２５０ｍｌのフラスコを用い、３０ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）でクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３９０８株(ura3 ade2:Yarimizu et al., Yeast vol. 30: 485-500(2013))を１５０ｒｐｍ、２４時間３０℃の条件下で振とう培養した。培養した細胞を３０００ｒｐｍ、３分間遠心して回収し、９００μｌのＴＦＢバッファー（２０ｍｌの６０％ポリエチレングリコール３３５０（シグマ・アルドリッチ社製）、３ｍｌの１Ｍジチオスレイトール（和光純薬工業社製）、１．５ｍｌの４Ｍリチウムアセテート（キシダ化学社製）、５．５ｍｌの滅菌水で懸濁した。再度３０００ｒｐｍ、３分間遠心して回収し、６００μｌのＴＦＢバッファーで懸濁した。細胞懸濁液を５０μｌずつ１．５ｍｌチューブに移し、上述で作製した野生型及び各変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片７０ｎｇと混和した。４２℃で３０分培養後、細胞懸濁液をウラシル欠損培地（０．１７％イーストニトロゲンベース（アミノ酸、硫酸アンモニウム不含）、０．５％硫酸アンモニウム、２％グルコース、ウラシル以外の必要な栄養素）に塗布し、２８℃で２－３日培養し、生育したコロニーを形質転換体とした。
（ルシフェラーゼ活性の測定）
　ルシフェラーゼ活性の測定にはBioLux（登録商標）Gaussia Luciferase Assay Kit（ニューイングランド・バイオラボ社製）を用いた。まず、上述で得られた形質転換体をウラシル欠損培地で培養し、前培養液を調製した。次に、９６ウェルのマイクロプレートを用い、３００μｌのＹＰＤ培地に１０μｌの前培養液を加えて、２８℃で２４時間培養し、かかる培養液１０μｌとＧＬｕｃアッセイ溶液（１ｍｌのBioLux(商標登録) GLuc Assay Buffer (×１)、１０μｌのBioLux(商標登録) GLuc Assay Substrate (×１００))２０μｌを混合し、室温で５秒間静置してルシフェラーゼ活性をCentro LB960 microplate reader（Berthold社製）により測定した。結果を図２に示す。
（結果）
　図２において、横軸は野生型のＧＬｕｃ（MGVKV）を発現させて測定したルシフェラーゼ活性を１とした場合の、それぞれの変異ペプチドを発現させて測定したルシフェラーゼ活性の相対値、縦軸は発現させたペプチドの種類を示す。図２に示すように、分泌シグナルペプチドのＮ末端側の塩基性アミノ酸としてリジン又はアルギニンがあれば、分泌能力が野生型に比べて２倍以上に高くなることが明らかとなった。
［リジン又はアルギニンに続くアミノ酸の置換］
　配列番号３に示すＧＬｕｃのアミノ酸配列において２番目のグリシンと３番目のバリンを削除し、４番目のリジン又はアルギニンに続くアミノ酸を連続する８個の同一のアミノ酸に置換した、変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させ、培養液のルシフェラーゼ活性を調べることにより変異分泌シグナルペプチドの分泌能力を評価した。
（変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片の作製）
　プラスミドｐＫＭ１５２（図１）が維持されたクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ６２０５株の染色体をテンプレートとして、配列番号２８に示されるフォワードプライマー（yGLuc+37）と配列番号２９に示されるリバースプライマー（TDH3-1c40）を用いてＰＣＲを行い、ＧＬｕｃと、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＡＤＥ２マーカーと、ＫｍＡＲＳ７と、ＴＤＨ３プロモーターとをコードするＤＮＡ断片を得た。次に、得られたＤＮＡ断片をテンプレートとして、表２に示される各フォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１２番目のアミノ酸をロイシンに置換したペプチド（MKL8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をロイシンに置換したペプチド（MRL8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をメチオニンに置換したペプチド（MRM8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をトリプトファンに置換したペプチド（MRW8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をフェニルアラニンに置換したペプチド（MRF8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をイソロイシンに置換したペプチド（MRI8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をスレオニンに置換したペプチド（MRT8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をセリンに置換したペプチド（MRS8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をグルタミンに置換したペプチド（MRQ8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をチロシンに置換したペプチド（MRY8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド（MRA8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をバリンに置換したペプチド（MRV8）、又は２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、４番目のリジンをアルギニンに置換し、５番目～１２番目のアミノ酸をシステインに置換したペプチド（MRC8）と、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＡＤＥ２マーカーと、ＫｍＡＲＳ７と、ＴＤＨ３プロモーターとをコードするＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ反応は、上述と同様の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（形質転換体の作製及びルシフェラーゼ活性の測定）
　作製した各変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片を用い、上述と同様の方法でクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３９０８株の形質転換体を作製し、かかる形質転換体をＹＰＢ培地で培養して培養液中のルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。
（結果）
　図３において、横軸は野生型のＧＬｕｃ(MGVKV)を発現させて測定したルシフェラーゼ活性を１とした場合の、それぞれの変異ペプチドを発現させて測定したルシフェラーゼ活性の相対値、縦軸は発現させたペプチドの種類を示す。図３に示すように、分泌シグナルペプチドのＮ末端側の塩基性アミノ酸として、リジン又はアルギニンに続くアミノ酸がロイシンやメチオニンやトリプトファンであれば、分泌能力が野生型に比べて２倍以上に高くなることが明らかとなった。
［連続したロイシンへの置換］
　上記結果より、リジン又はアルギニンに続くアミノ酸がロイシンの場合に分泌能力が高かったことから、配列番号３に示すＧｌｕｃのアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンを削除し、５番目から１５番目のアミノ酸を７個～１７個の連続するロイシンにした、変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させ、培養液のルシフェラーゼ活性を調べることにより変異分泌シグナルペプチドの分泌能力を評価した。
（変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片の作製）
　プラスミドｐＫＭ１５２（図１）が維持されたクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ６２０５株の染色体をテンプレートとして、配列番号４３に示されるフォワードプライマー(yGLuc+64)と配列番号２９に示されるリバースプライマー(TDH3-1c40)を用いてＰＣＲを行い、ＧＬｕｃと、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＡＤＥ２マーカーと、ＫｍＡＲＳ７と、ＴＤＨ３プロモーターとをコードするＤＮＡ断片を得た。次に、得られたＤＮＡ断片をテンプレートとして、表３に示される各フォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する７個のロイシンに置換したペプチド（MKL7E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する８個のロイシンに置換したペプチド（MKL8E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する９個のロイシンに置換したペプチド（MKL9E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１０個のロイシンに置換したペプチド（MKL10E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１１個のロイシンに置換したペプチド（MKL11E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１２個のロイシンに置換したペプチド（MKL12E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１３個のロイシンに置換したペプチド（MKL13E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１４個のロイシンに置換したペプチド（MKL14E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１５個のロイシンに置換したペプチド（MKL15E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１６個のロイシンに置換したペプチド（MKL16E）、又は２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１７個のロイシンに置換したペプチド（MKL17E）と、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＡＤＥ２マーカーと、ＫｍＡＲＳ７と、ＴＤＨ３プロモーターとをコードするＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ反応は、上述と同様の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（形質転換体の作製及びルシフェラーゼ活性の測定）
　作製した各変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片を用い、上述と同様の方法でクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３９０８株の形質転換体を作製し、かかる形質転換体をＹＰＢ培地で培養してルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。
（結果）
　図４において、横軸は野生型のＧＬｕｃ（MGVKV）を発現させて測定したルシフェラーゼ活性を１とした場合の、それぞれの変異ペプチドを発現させて測定したルシフェラーゼ活性の相対値、縦軸は発現させたペプチドの種類を示す。図４に示すように、リジン又はアルギニンに続くアミノ酸がロイシンの場合、ルシフェラーゼ活性は、連続するロイシンの個数が１１～１３の場合に高かったが、野生型に対して３倍程度であった。
［１６番目のグルタミン酸の置換］
　配列番号３に示すＧｌｕｃのアミノ酸配列において、１６番目のグルタミン酸を他のアミノ酸に置換した、変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させ、培養液のルシフェラーゼ活性を調べることにより変異分泌シグナルペプチドの分泌能力を評価した。
（変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片の作製）
　プラスミドｐＫＭ１５２（図１）が維持されたクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ６２０５株の染色体をテンプレートとして、配列番号４３に示されるフォワードプライマー(yGLuc+64)と配列番号２９に示されるリバースプライマー(TDH3-1c40)を用いてＰＣＲを行い、ＧＬｕｃと、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＡＤＥ２マーカーと、ＫｍＡＲＳ７と、ＴＤＨ３プロモーターをコードするＤＮＡ断片を得た。次に、得られたＤＮＡ断片をテンプレートとして、表４に示される各フォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸をロイシンに置換したペプチド（MKL13E）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸をロイシンに置換し、１６番目のグルタミン酸をプロリンに置換したペプチド（MKL13P）、１６番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換したペプチド（MKL13D）、１６番目のグルタミン酸をグルタミンに置換したペプチド（MKL13Q）、１６番目のグルタミン酸をアスパラギンに置換したペプチド（MKL13N）、１６番目のグルタミン酸をヒスチジンに置換したペプチド（MKL13H）、１６番目のグルタミン酸をリジンに置換したペプチド（MKL13K）、１６番目のグルタミン酸をアルギニンに置換したペプチド（MKL13R）、１６番目のグルタミン酸をセリンに置換したペプチド（MKL13S）、１６番目のグルタミン酸をチロシンに置換したペプチド（MKL13Y）、１６番目のグルタミン酸をフェニルアラニンに置換したペプチド（MKL13F）、１６番目のグルタミン酸をスレオニンに置換したペプチド（MKL13T）、１６番目のグルタミン酸をアラニンに置換したペプチド（MKL13A）、１６番目のグルタミン酸をロイシンに置換したペプチド（MKL13L）、１６番目のグルタミン酸をメチオニンに置換したペプチド（MKL13M）、１６番目のグルタミン酸をシステインに置換したペプチド（MKL13C）、１６番目のグルタミン酸をバリンに置換したペプチド（MKL13V）、１６番目のグルタミン酸をイソロイシンに置換したペプチド（MKL13I）、１６番目のグルタミン酸をトリプトファンに置換したペプチド（MKL13W）、又は１６番目のグルタミン酸をグリシンに置換したペプチド（MKL13G）と、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＡＤＥ２マーカーと、ＫｍＡＲＳ７と、ＴＤＨ３プロモーターとをコードするＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ反応は、上述と同様の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（形質転換体の作製及びルシフェラーゼ活性の測定）
　作製した各変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片を用い、上述と同様の方法でクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３９０８株の形質転換体を作製し、かかる形質転換体をＹＰＢ培地で培養してルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図５に示す。
（結果）
　図５において、横軸は野生型のＧＬｕｃ（MGVKV）を発現させて測定したルシフェラーゼ活性を１とした場合の、それぞれの変異ペプチドを発現させて測定したルシフェラーゼ活性の相対値、縦軸は発現させたペプチドの種類を示す。図５に示すように、連続するロイシンのＣ末端側のアミノ酸が酸性アミノ酸であるグルタミン酸の場合に分泌能力が高いことが明らかとなった。
［連続したメチオニンへの置換］
　塩基性アミノ酸であるリジン又はアルギニンと、酸性アミノ酸であるグルタミン酸の間にロイシンが１１～１３個あれば、分泌能力を有することが明らかとなったが、さらに分泌能力が高い分泌シグナルペプチドの作製を試みた。配列番号３に示すＧｌｕｃのアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンを削除し、５番目から１５番目のアミノ酸を７個～１７個の連続するメチオニンに置換した、変異分泌シグナルペプチドを備えた変異ＧＬｕｃを酵母で発現させ、培養液のルシフェラーゼ活性を調べることにより変異分泌シグナルペプチドの分泌能力を評価した。
（変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片の作製）
　プラスミドｐＫＭ１５２（図１）が維持されたクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ６２０５株の染色体をテンプレートとして、配列番号４３に示されるフォワードプライマー(yGLuc+64)と配列番号２９に示されるリバースプライマー(TDH3-1c40)を用いてＰＣＲを行い、ＧＬｕｃと、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＡＤＥ２マーカーと、ＫｍＡＲＳ７と、ＴＤＨ３プロモーターをコードするＤＮＡ断片を得た。次に、得られたＤＮＡ断片をテンプレートとして、表５に示される各フォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する７個のメチオニンに置換したペプチド（MKM7）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する８個のメチオニンに置換したペプチド（MKM8）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する９個のメチオニンに置換したペプチド（MKM9）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１０個のメチオニンに置換したペプチド（MKM10）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１１個のメチオニンに置換したペプチド（MKM11）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１２個のメチオニンに置換したペプチド（MKM12）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１３個のメチオニンに置換したペプチド（MKM13）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１４個のメチオニンに置換したペプチド（MKM14）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１５個のメチオニンに置換したペプチド（MKM15）、２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１６個のメチオニンに置換したペプチド（MKM16）、又は２番目のグリシンと３番目のバリンが欠損し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１７個のメチオニンに置換したペプチド（MKM17）と、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＡＤＥ２マーカーと、ＫｍＡＲＳ７と、ＴＤＨ３プロモーターとをコードするＤＮＡ断片を作製した。ＰＣＲ反応は、上述と同様の条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（形質転換体の作製及びルシフェラーゼ活性の測定）
　作製した各変異ペプチドをコードするＤＮＡ断片を用い、上述と同様の方法でクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３９０８株の形質転換体を作製し、かかる形質転換体をＹＰＢ培地で培養してルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図６に示す。
（ルシフェラーゼ活性の測定結果）
　図６において、横軸は野生型のＧＬｕｃ（MGVKV）を発現させて測定したルシフェラーゼ活性を１とした場合の、それぞれの変異ペプチドを発現させて測定したルシフェラーゼ活性の相対値、縦軸は発現させたペプチドの種類を示す。図６に示すように、リジンに続くアミノ酸が１２～１７個のメチオニンであれば分泌能力が非常に高く、特に配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドが非常に高い分泌能力を有することが明らかとなった。これまでに疎水性アミノ酸のロイシンが分泌に深く関与していると考えられていたが、ロイシンに比べてメチオニンに置換したペプチドの方が、分泌能力が高いことは予想外であった。また、メチオニンの数が１２～１７で高い分泌能力を有することから、発現させる目的タンパク質の種類に応じてメチオニンの数を調整し、発現させるタンパク質に最適な分泌シグナルペプチドを選択して目的タンパク質を効率よく分泌させることが可能となる。
（ウェスタンブロッティング解析）
　配列番号３に示すＧｌｕｃのアミノ酸配列において、２番目のグリシンと３番目のバリンを削除し、５番目～１５番目のアミノ酸を連続する１６個のメチオニンに置換したペプチド（MKM16）をコードするＤＮＡ断片を用い、クルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３９０８株を形質転換体し、ＲＡＫ８７７２株を得た。かかるＲＡＫ８７７２株及びクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ６２０５株をそれぞれ２ｍｌのＹＰＤ培地で一晩培養した。培養後、上澄み液に１ｍｌのアセトンを加えて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。沈殿を２０μｌのＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー：バイオラッド社製）で溶解し、９５℃で５分間加熱した。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥはカセット電気泳動槽（コスモ・バイオ社製）とＳｕｐｅｒＳｅｐ　Ａｃｅ　１７ウェル（和光純薬工業社製）を用いて行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、タンパク質はimmobilon PVDF膜（ミリポア社製）に転写した。抗体反応においては、１／５０００希釈抗ＧＬｕｃ抗体Ｅ８０２３Ｓ（New England Biolabs社製）及び１／１０００希釈抗ラビットＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を用い、発光試薬としてはImmnostar（登録商標）Zeta（和光純薬工業社製）を用いて行った。ウェスタンブロッティング解析の結果を図７に示す。図７中、ＷＴはＲＡＫ６２０５株、Ｍ16はＲＡＫ８７７２株の培養液上澄みにおけるＧＬｕｃである。
（ウェスタンブロッティング解析の結果）
　図７に示すように、Ｍ16では約２０ｋＤより低い位置にバンドが検出され、ＷＴではバンドが検出されなかったことから、本発明のシグナルペプチドはタンパク質を細胞外に分泌する能力が高いことが確認された。また、１６個のメチオニンを含むシグナル配列を有するMKM16の推定分子量は２０．７ｋＤ、シグナル配列無しのＧＬｕｃの推定分子量は１８．４ｋＤであり、図７の結果から、１６個のメチオニンを含むシグナル配列は切断されていることが推測された。
［ヒトＬＩＦの分泌］
　配列番号１に示す分泌シグナルペプチドを用いて、酵母での分泌が難しいヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ）を分泌させた。
（分泌シグナルペプチドの付与）
　ｈＬＩＦ－ＦＬＡＧペプチドに配列番号１に示されるペプチド（ＫＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＥ）を付与するために、プラスミドｐＫＭ３９８（図８）が維持されたクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ１０２５２の染色体ＤＮＡをテンプレートとし、配列番号８５に示されるフォワードプライマー(hLIF+4)と、配列番号２９に示されるリバースプライマー(TDH3p-1c40)を用いてＰＣＲを行い、ｈＬＩＦと、ＦＬＡＧタグと、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＫｍＡＲＳ７と、ＡＤＥ２マーカーと、ＴＤＨ３プロモーターとをコードするＤＮＡ断片（hLIF-FLAG-URA3-KmCenD-KmARS7-ADE2-TDH3）を得た。次に、得られたＤＮＡ断片をテンプレートとし、配列番号８５に示されるフォワードプライマー（hLIF+4）と、配列番号８６に示されるリバースプライマー（MKM(16)Ec-TDH3p-1c）を用いてＰＣＲを行い、配列番号８７に示されるｈＬＩＦアミノ酸配列の１番目のメチオニンと２番目のリジンの間に配列番号１に示されるアミノ酸配列を導入した、変異ペプチド（ＭＫＭ１６Ｅ－２Ｋ）と、ＦＬＡＧタグと、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＫｍＡＲＳ７と、ＡＤＥ２マーカーと、ＴＤＨプロモーターとをコードするＤＮＡ断片（MKM16E-2K-hLIF-FLAG-URA3-KmCenD-KmARS7-ADE2-TDH3）を作製した。また、得られたＤＮＡ断片（hLIF-FLAG-URA3-KmCenD-KmARS7-ADE2-TDH3）をテンプレートとし、配列番号８８に示されるフォワードプライマー（hLIF+58）と、配列番号８６に示されるリバースプライマー（MKM(16)Ec-TDH3p-1c）を用いてＰＣＲを行い、配列番号８７に示されるｈＬＩＦアミノ酸配列の２番目～１９番目のアミノ酸を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換した変異ペプチド（ＭＫＭ１６Ｅ－２０Ｇ）と、ＦＬＡＧタグと、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＫｍＡＲＳ７と、ＡＤＥ２マーカーと、ＴＤＨプロモーターとをコードするＤＮＡ断片（MKM16E-20G-hLIF-FLAG-URA3-KmCenD-KmARS7-ADE2-TDH3）を作製した。さらに、得られたＤＮＡ断片（hLIF-FLAG-URA3-KmCenD-KmARS7-ADE2-TDH3）をテンプレートとし、配列番号８９に示されるフォワードプライマー（hLIF+79）と、配列番号８６に示されるリバースプライマー（MKM(16)Ec-TDH3p-1c）を用いてＰＣＲを行い、配列番号８７に示されるｈＬＩＦアミノ酸配列の２番目～２６番目のアミノ酸を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換した変異ペプチド（ＭＫＭ１６Ｅ－２７Ｉ）と、ＦＬＡＧタグと、ＵＲＡ３マーカーと、ＫｍＣｅｎＤと、ＫｍＡＲＳ７と、ＡＤＥ２マーカーＴＤＨと、プロモーターとをコードするＤＮＡ断片（MKM16E-27I-hLIF-FLAG-URA3-KmCenD-KmARS7-ADE2-TDH3）を作製した。
　作製した変異ペプチドをコードする３つのＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３９０８株にそれぞれ導入し、ウラシル欠損培地で培養し、生育した株を形質転換体として選択した。ＭＫＭ１６Ｅ－２ＫをコードするＤＮＡ断片を導入して得られたアデニン、ウラシル非栄養要求性形質転換体をＲＡＫ１１６１６、ＭＫＭ１６Ｅ－２０ＧをコードするＤＮＡ断片を導入して得られたアデニン、ウラシル非栄養要求性形質転換体をＲＡＫ１１６１８、ＭＫＭ１６Ｅ－２７ＩをコードするＤＮＡ断片を導入して得られたアデニン、ウラシル非栄養要求性形質転換体をＲＡＫ１１６２０と命名して保存した。それぞれの株の遺伝子型を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（ウェスタンブロッティング解析）
　クルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ１１６１６株、ＲＡＫ１１６１８株、ＲＡＫ１１６２０株それぞれをＹＰＤ培地で１５０ｒｐｍ、２８℃で２日間振とう培養した。培地を１２，０００ｇで１０分間遠心し、４００μｌの上澄み液を得た。かかる上澄み液に５００μｌのアセトンを加えてタンパク質を沈殿させた。１２，０００ｇで１０分間遠心後、沈殿を４０ｍｌのＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー（５％　２－メルカプトエタノール含有Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー：バイオラッド社製）で溶解し、その後Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオラッド社製）で１０倍に希釈後に９５℃で３０分間加熱した。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥはカセット電気泳動槽（コスモ・バイオ社製）とＳｕｐｅｒＳｅｐ　Ａｃｅ　１７ウェル（和光純薬工業社製）を用いて行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、タンパク質はimmobilon PVDF膜（ミリポア社製）に転写した。抗体反応においては、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体１Ｅ６（和光純薬工業社製）を用い、発光試薬としてはImmnostar（登録商標）Zeta（和光純薬工業社製）を用いて行った。ウェスタンブロッティング解析の結果を図９に示す。
（結果）
　図９に示すように野生型（Wild type）のｈＬＩＦを発現させた場合にはバンドが検出されず、ｈＬＩＦタンパク質が分泌していなかったが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する変異ｈＬＩＦタンパク質を発現させた場合にはバンドが検出され、ｈＬＩＦタンパク質が分泌されていることが明らかとなった。したがって、本発明のシグナルペプチドは、ＧＬｕｃだけでなく、酵母での分泌が難しいｈＬＩＦを細胞外へ分泌する能力を有することが明らかとなった。
［サッカロマイセス・セレビシエでの分泌］
　実施例１、２においては酵母としてクルイベロマイセス・マルシアヌスを用いたが、他の酵母においても本発明の分泌シグナルペプチドが同様に機能することを確かめるため、本発明の分泌シグナルペプチドを有するＧＬｕｃをサッカロマイセス・セレビシエで発現させて、ＧＬｕｃの分泌を調べた。
（形質転換体の作製）
　まず、変異ペプチド（MKM16）をコードするＤＮＡ断片を用いて作製したクルイベロマイセス・マルシアヌスＲＡＫ３９０８株の形質転換体であるＲＡＫ８７７２株、及び野生型ペプチド（MGVKV）をコードするＤＮＡを有するＲＡＫ６２０５株それぞれのＤＮＡをテンプレートとして、配列番号９０に示されるフォワードプライマー(TDH3-572)と配列番号９１に示されるリバースプライマー(3CG9-yGLuc+558c)を用いて１ｓｔＰＣＲを行い、ＳｃＴＤＨプロモーターとMKM16シグナル配列とｙＧＬｕｃとをコードするＤＮＡ断片、及びＳｃＴＤＨ３プロモーターとｙＧＬｕｃをコードするＤＮＡ断片を得た。得られたそれぞれの１ｓｔＰＣＲ産物をテンプレートとして、相同組換えのためのＳｃＵＲＡ３のＣ末部分の配列を付加するために配列番号９０に示されるフォワードプライマー(TDH3-572)と配列番号９２に示されるリバースプライマー(ScURA3(717786TAA)-3CG9)を用いて２ｎｄＰＣＲを行い、ＳｃＴＤＨプロモーターとMKM16シグナル配列とｙＧＬｕｃとＳｃＵＲＡ３の一部をコードするＤＮＡ断片、及びＳｃＴＤＨ３プロモーターとｙＧＬｕｃとＳｃＵＲＡ３の一部をコードするＤＮＡ断片を得た。ベクターＤＮＡは、YEpGAP-cherry plasmid DNA(Keppler-Ross et al., Genetics 179:705-710(2008))をテンプレートとして、配列番号５に示されるフォワードプライマー(URA3+771c)と配列番号２９に示されるリバースプライマー(TDH3-1c40)を用いてＰＣＲを行うことで調製した。１ｓｔ、２ｎｄＰＣＲは、ＫＯＤ　ＦＸ　ｎｅｏ（東洋紡社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。
　それぞれの２ｎｄＰＣＲ産物、及びベクターＤＮＡを混合してサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７００株を形質転換し、ウラシル欠損培地に塗布後に２８℃で２－３日培養し、生育した形質転換体をそれぞれＲＡＫ１１９１１、ＲＡＫ１１９０８と命名した。ＢＹ４７００、ＲＡＫ１１９１１株、ＲＡＫ１１９０８株の遺伝子型を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ＲＡＫ１１９１１株、ＲＡＫ１１９０８株をＹＰＢ培地で培養して培養液上澄みのルシフェラーゼ活性を、GloMax（登録商標）20/20ルミノメーター（プロメガ社製）を用いた以外は実施例１と同様の方法により測定した。結果を表８に示す。表中、ＷＴはＲＡＫ１１９０８株、Ｍ16はＲＡＫ１１９１１株の培養液上澄みにおけるＧＬｕｃである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８から明らかなように、ＲＡＫ１１９０８株の培養液上澄みに対してＲＡＫ１１９１１株の培養液上澄みにおいて１５１３倍ものルシフェラーゼ活性が検出され、本発明のシグナルペプチドはサッカロマイセス・セレビシエにおいても発現したタンパク質を細胞外に分泌する能力が高いことが明らかとなった。
　本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、有用タンパク質の高分泌生産に利用される。

Claims (7)

  1. 次の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ。
    （ａ）式（I）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
    Ｘ－Ｍ１－Ｍ2・・・－Ｍｉ－Ｅ　式（I）
    （式（I）中、Ｘはリジン又はアルギニンを示し、Ｍはメチオニンを示し、Ｅはグルタミン酸を示し、ｉは１２～１７の整数を示す）
    （ｂ）上記式（I）において１又は２個のメチオニンが疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、酵母細胞で発現した目的タンパク質を細胞外に分泌する能力を有する分泌シグナルペプチド；
  2. 配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチドをコードする請求項１記載のＤＮＡ。
  3. 請求項１又は２記載のＤＮＡを含む酵母用組換えベクター。
  4. 目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む請求項３記載の組換えベクター。
  5. 請求項４記載の組換えベクターを含む酵母の形質転換体。
  6. 請求項５記載の形質転換体を培養し、培養液から目的タンパク質を回収することを特徴とする目的タンパク質の生産方法。
  7. 次の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド。
    （ａ）式（I）に示されるアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
    Ｘ－Ｍ1－Ｍ2－・・・－Ｍｉ－Ｅ　式（I）
    （式（I）中、Ｘはリジン又はアルギニンを示し、Ｍはメチオニンを示し、Ｅはグルタミン酸を示し、ｉは１２～１７の整数を示す）
    （ｂ）上記式（I）における１又は２個のメチオニンが疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、酵母細胞で発現した目的タンパク質を細胞外に分泌する能力を有する分泌シグナルペプチド；
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