WO2015129916A1 - 腎細胞癌の予後判定方法 - Google Patents

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弥栄 金井
恵吏 新井
有理子 山田
卓也 與谷
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国立研究開発法人国立がん研究センター
積水メディカル株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the prognosis of renal cell carcinoma using detection of methylated DNA.
  • a CpG island is a region in which a two-base sequence of cytosine (C) -guanine (G) through a phosphodiester bond (p) appears frequently, and is often present in a promoter region upstream of a gene.
  • C cytosine
  • G guanine
  • p phosphodiester bond
  • Abnormal DNA methylation of CpG islands is involved in carcinogenesis through inactivation of tumor suppressor genes.
  • Increased DNA methylation of CpG islands correlated with clinicopathological factors has been reported in colorectal cancer, gastric cancer, and the like (Non-Patent Documents 1 to 4). It is called CIMP) positive cancer.
  • a method for analyzing methylated DNA there is a method using a bisulfite (bisulfite, bisulfite, bisulfite) reaction.
  • This method is the most widely used method for analyzing methylated DNA.
  • cytosine When single-stranded DNA is treated with bisulfite, cytosine is converted to uracil through sulfonation, hydrodeamination, and desulfonation.
  • methylated cytosine has a very slow reaction rate of the first sulfonation, and thus remains methylated cytosine in the reaction time of the actual bisulfite treatment.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • methylated cytosine remains cytosine, but unmethylated cytosine is amplified by replacing uracil with thymine.
  • the methylation state is analyzed using the difference between the bases cytosine and thymine generated in the sequence of the PCR amplification product.
  • MSP Methylation-Specific PCR
  • COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis
  • the MSP method performs PCR amplification using a methylated sequence-specific primer and an unmethylated sequence-specific primer after DNA bisulfite treatment, and agarose gel electrophoresis in order.
  • This is a method for determining the DNA methylation state of a region.
  • the COBRA method uses PCR amplification using a common primer for methylated and unmethylated DNA after treatment with bisulfite, and a restriction enzyme that recognizes different sequences between methylated and unmethylated DNA.
  • the agarose gel electrophoresis are sequentially performed, and the DNA methylation state of the target region is determined based on the presence or absence of the restriction enzyme-treated fragment.
  • Both methods are methylated DNA analysis methods that are widely used today because they allow quantitative analysis of methylated DNA without a special device. However, both methods are laborious in that they use electrophoresis for analysis. There was a problem of taking time.
  • ion exchange chromatography is widely used as a simple and accurate method for separating and analyzing biopolymers such as nucleic acids, proteins, and polysaccharides in fields such as biochemistry and medicine.
  • anion exchange chromatography that separates using the negative charge of phosphate contained in the nucleic acid molecule is used.
  • Anion exchange chromatography columns packed with a column filler having a cationic functional group as an ion exchange group are already commercially available and used in various research fields.
  • Renal cell carcinoma often occurs in the middle years of the working population, and there are many cases that can be cured by nephrectomy, but there are also cases of rapid metastasis. There is a big difference in the clinical course of both. Furthermore, there are known cases in which immunotherapy and molecular targeted therapeutic drugs are successful even after metastasis. Patients with a high probability of recurrence may closely follow up to diagnose recurrence early and add post-treatment to improve prognosis. However, there are cases of rapid metastasis while belonging to clear cell RCC, which is the most common histopathologically low histological type, and the prognosis prediction by existing clinicopathological factors is Have difficulty.
  • Patent Document 4 the above-mentioned 17 is performed by a bead array method, mass spectrometry (MassARRAY method), pyrosequencing, methylation sensitive high resolution melting curve analysis, quantitative PCR, direct sequencing of a bisulfite-treated product, COBRA method and the like.
  • a method for detecting the risk of poor prognosis of RCC by detecting the methylation level at the CpG site of a gene has been proposed.
  • the value of the DNA methylation rate obtained by a conventionally used method such as MassARRAY method or pyrosequencing provides a DNA methylation rate as an average value of the entire sample subjected to the measurement. Therefore, when there are many cells with a low DNA methylation rate in the sample, even if cells having highly methylated DNA are mixed, the value of the obtained DNA methylation rate is low. As a result, there is a problem that the presence or absence of cells having highly methylated DNA cannot be determined, and further, there is an inevitable risk of estimating the DNA methylation rate low.
  • cancer metastasis / recurrence can be predicted and detected early, immunotherapy and molecular targeted therapeutic agents can be expected to be effective against them, so a method capable of more accurate cancer prognosis is required. Further, there is a need for a quick and simple method for accurate cancer prognosis.
  • the present inventors have found that methylated DNA can be detected quickly and easily by separating a PCR amplification product obtained by amplifying DNA treated with bisulfite by PCR using ion exchange chromatography. Furthermore, the present inventors analyze that the pattern of signals obtained by ion exchange chromatography differs between DNA obtained from CIMP positive cancer and DNA obtained from CIMP negative cancer, and the difference in the pattern. The inventors have found that a cancer with a poor prognosis can be determined, and have completed the present invention.
  • a method for determining a tissue containing renal cell carcinoma comprising: (1) treating genomic DNA prepared from kidney tissue of a subject with bisulfite; (2) a step of amplifying the DNA treated with the bisulfite by PCR; (3) A step of subjecting the obtained PCR amplification product to ion exchange chromatography; (4) A step of obtaining a retention time of the detection signal obtained by the chromatography; (5) A step of determining that the tissue is a tissue containing renal cell carcinoma obtained from a renal cell carcinoma patient with a poor prognosis when the result of step (4) is earlier than a reference retention time; Including methods.
  • a method for obtaining data for determining a tissue containing renal cell carcinoma (1) treating genomic DNA prepared from kidney tissue of a subject with bisulfite; (2) a step of amplifying the DNA treated with the bisulfite by PCR; (3) A step of subjecting the obtained PCR amplification product to ion exchange chromatography; (4) A step of obtaining a retention time of the detection signal obtained by the chromatography; (5) Whether the tissue is a tissue containing renal cell carcinoma obtained from a renal cell carcinoma patient with a poor prognosis is determined based on whether or not the result of step (4) is earlier than the reference retention time. Process to obtain as data for Including methods.
  • a method for determining the prognosis of a renal cell carcinoma patient (1) treating genomic DNA prepared from kidney tissue of a subject with bisulfite; (2) a step of amplifying the DNA treated with the bisulfite by PCR; (3) A step of subjecting the obtained PCR amplification product to ion exchange chromatography; (4) A step of obtaining a retention time of the detection signal obtained by the chromatography; (5) a step of determining that the subject has a poor prognosis if the result of step (4) is earlier than a reference retention time; Including methods.
  • DNA amplified in the step (2) is FAM150A, GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, RIMS4, PCDHAC1, KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1, PRAC, WNT3A, TRH, FAM78A, ZNF671, N
  • the present invention provides a rapid, simple and highly accurate cancer prognosis determination method. According to the present invention, the risk of recurrence of cancer patients can be determined more quickly, simply, and with high accuracy, so that early treatment resumption for cancer patients that require treatment becomes possible. Therefore, this invention contributes to the improvement of the survival rate of a cancer patient.
  • renal cell carcinoma is a cancer of renal tubular epithelial cells, and, from its pathological characteristics, clear cell type, granule cell type, chromophore type, spindle type Cancers classified into cyst-associated type, cyst-derived type, cystic type, and papillary type.
  • examples of the “subject” include a patient suffering from or suspected of having renal cell carcinoma, and a patient who has been treated for renal cell carcinoma by surgery or the like.
  • “poor prognosis” of cancer includes, for example, a low prognosis (post-treatment) survival rate of a subject, and more specifically, a recurrence-free survival rate after 500 days after surgery.
  • (Cancer-free survival rate) may be 50% or less, or the overall survival rate (overall survival rate) after 1500 days after surgery may be 70% or less.
  • DNA methylation means a state in which the carbon at the 5-position of cytosine is methylated in DNA.
  • detecting methylation of DNA means measuring the presence / absence or abundance of methylated DNA in the DNA, a ratio of the abundance, or a methylation rate of the DNA.
  • the “DNA methylation rate” means the rate at which cytosine of CpG islands is methylated in the specific DNA to be detected.
  • the CpG of the specific DNA to be detected It can be represented by the ratio of the number of methylated cytosines to the total number of cytosines (methylated cytosine and unmethylated cytosine) in the island.
  • CpG site means a site where cytosine (C) and guanine (G) have a phosphodiester bond (p) in DNA.
  • CpG island refers to a region in which a two-base sequence of cytosine (C) -guanine (G) through a phosphodiester bond (p) appears with high frequency. CpG islands are often present in promoter regions upstream of genes.
  • the CpG site or CpG island of a gene refers to a CpG island present at a position close to the coding region of the gene, or a CpG site contained in the CpG island, preferably It means a CpG site or CpG island present in the promoter region of a gene.
  • a CpG site or CpG island of a specific gene can be identified based on a method such as MassARRAY method or pyrosequencing.
  • the “standard retention time” (hereinafter also referred to as “standard retention time”) is an HPLC retention time that can separate a CIMP positive group and a CIMP negative group, or is prepared from renal cell carcinoma.
  • the retention time of HPLC capable of separating a signal group derived from highly methylated DNA and a signal group derived from DNA having a low methylation degree is shown. That is, since a signal derived from highly methylated DNA is detected at a retention time earlier than the reference retention time (reference retention time), a sample having a detection signal at a retention time earlier than the reference retention time is It can be determined that the prognosis is poor.
  • the above-described reference retention time may be set appropriately according to those conditions. In addition, it is preferable to set the reference retention time in consideration of the required clinical sensitivity.
  • the present invention provides a method for determining a tissue containing renal cell carcinoma, comprising the following steps. (1) treating genomic DNA prepared from kidney tissue of a subject with bisulfite; (2) a step of amplifying the DNA treated with the bisulfite by PCR; (3) A step of subjecting the obtained PCR amplification product to ion exchange chromatography; (4) A step of obtaining a retention time of the detection signal obtained by the chromatography; (5) A step of determining that the tissue is a tissue containing renal cell carcinoma obtained from a renal cell carcinoma patient with a poor prognosis when the result of the step (4) is earlier than a reference retention time.
  • the present invention provides a method for obtaining data for determining tissue containing renal cell carcinoma, comprising the following steps. (1) treating genomic DNA prepared from kidney tissue of a subject with bisulfite; (2) a step of amplifying the DNA treated with the bisulfite by PCR; (3) A step of subjecting the obtained PCR amplification product to ion exchange chromatography; (4) A step of obtaining a retention time of the detection signal obtained by the chromatography; (5) Determine whether the result of step (4) is earlier than the reference retention time, and whether the tissue is a tissue containing renal cell carcinoma obtained from a renal cell carcinoma patient with a poor prognosis The process of acquiring as data for doing.
  • the present invention provides a prognosis determination method for a renal cell carcinoma patient, comprising the following steps. (1) treating genomic DNA prepared from kidney tissue of a subject with bisulfite; (2) a step of amplifying the DNA treated with the bisulfite by PCR; (3) A step of subjecting the obtained PCR amplification product to ion exchange chromatography; (4) A step of obtaining a retention time of the detection signal obtained by the chromatography; (5) A step of determining that the subject's renal cell carcinoma has a poor prognosis when the result of step (4) is earlier than the reference retention time.
  • the present invention provides a method for determining a tissue containing renal cell carcinoma or a renal cell carcinoma patient, wherein the following steps are further performed before step (4).
  • (1 ′) a step of treating unmethylated DNA corresponding to a PCR amplification region of genomic DNA prepared from kidney tissue of the subject with bisulfite;
  • (2 ′) a step of amplifying the DNA treated with the bisulfite obtained in step (1 ′) by PCR;
  • (3a) A step of obtaining difference data by subtracting the detection signal obtained by the chromatography of the step (3 ′) from the detection signal obtained by the chromatography of the step (3).
  • the subject's kidney tissue may be a kidney tissue containing DNA or cells thereof, and examples thereof include tissues collected by biopsy, surgery, etc., and frozen or immobilized samples thereof. From the viewpoint of suppressing the degradation of genomic DNA and the like and more efficiently detecting DNA methylation, it is desirable to use frozen kidney tissue.
  • the method for preparing sample DNA from the kidney tissue or cells is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used.
  • a known method for preparing DNA a phenol chloroform method or a commercially available DNA extraction kit such as QIAamp DNA Mini kit (manufactured by Qiagen), Clean Columns (manufactured by NexTec), AquaPure (manufactured by Bio-Rad), which will be described later.
  • DNA extraction method using ZR Plant / Seed DNA Kit manufactured by Zymo Research
  • prepGEM manufactured by ZyGEM
  • BuccalQuick manufactured by TrimGen
  • the extracted sample DNA is treated with bisulfite.
  • a well-known method can be selected suitably and can be used.
  • Known methods for the treatment of bisulfite include, for example, EpiTect Bisulfite Kit (48) (manufactured by Qiagen), Methyl Easy (manufactured by Human Genetics Pty), and Cells-to-CpG BisulfiteCv And a commercially available kit such as CpGenome Turbo Bisulfite Modification Kit (MERCK MILIPORE).
  • the sample DNA treated with bisulfite is amplified by PCR.
  • the PCR amplification method is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used according to the sequence, length, amount, etc. of the DNA to be amplified.
  • the target DNA to be PCR-amplified in the method of the present invention is preferably selected so that DNA methylation of CpG island in at least one gene selected from the group consisting of the 17 genes can be detected, more preferably , Selected so that methylation of the CpG site of the 17 genes can be detected.
  • the target DNA is DNA encoding part or all of the coding region and / or promoter region of any of the 17 genes.
  • it is DNA encoding part or all of the promoter region of any of the 17 genes. More preferably, it is a DNA encoding part or all of the CpG island of any one of the 17 genes.
  • FAM150A is a gene encoding a protein specified by RefSeq ID: NP_997296
  • GRM6 is a gene encoding a protein specified by RefSeq ID: NP_000834
  • ZNF540 encodes a protein specified by RefSeq ID: NP_689819
  • ZFP42 is a gene encoding a protein specified by RefSeq ID: NP_777560
  • ZNF154 is a gene encoding a protein specified by RefSeq ID: NP_001078853
  • RIMS4 is specified by RefSeq ID: NP_892015
  • PCDHAC1 is specified by RefSeq ID: NP_061721
  • KHDRBS2 is a gene encoding a protein specified by RefSeq ID: NP_689901
  • ASCL2 is a gene encoding a protein specified by RefSeq ID: NP_005161
  • FAM78A is RefSeq ID: NP_2 ZNF671 is a gene encoding a protein specified by RefSeq ID: NP — 079109
  • SLC13A5 is a gene encoding a protein specified by RefSeq ID: NP — 808218
  • NKX6 -2 is a gene encoding a protein specified by RefSeq ID: NP_769374.
  • the CpG site of the 17 genes is present at the position on the chromosome described in Tables 1 to 4 with reference to the position on the NCBI database Genome Build 37, which is the reference human genome sequence.
  • positions on the NCBI database Genome Build 37 which is a reference human genome sequence, are located at chromosomes 53, 478, 454, and 5th.
  • the chain length of the PCR amplification product can be appropriately selected in consideration of factors such as shortening the PCR amplification time, shortening the analysis time in ion exchange chromatography, and maintaining separation performance.
  • the PCR amplification product has a chain length of preferably 1000 bp or less, more preferably 700 bp or less, and even more preferably 500 bp or less.
  • the chain length of the PCR amplification product when using sample DNA with few CpG islands is 30 to 40 bp which is the chain length of the PCR amplification product when using a primer near 15 mer that can avoid non-specific hybridization in PCR. Is the lower limit.
  • cytosine at the CpG site is preferably contained at 2% or more, more preferably 5% or more, with respect to the chain length of the PCR amplification product.
  • the ion exchange chromatography performed in the present invention is preferably anion exchange chromatography.
  • the column packing used in the ion exchange chromatography performed in the present invention is not particularly limited as long as it is a base particle having a strong cationic group on the surface, but strong packing on the surface of the packing shown in Patent Document 2. Base particles having both groups and weak cationic groups are preferred.
  • the strong cationic group means a cationic group that dissociates in a wide range of pH 1 to 14. That is, the strong cationic group can be kept dissociated (cationized) without being affected by the pH of the aqueous solution.
  • the quaternary ammonium group is an example of the strong cationic group.
  • Specific examples include trialkylammonium groups such as a trimethylammonium group, a triethylammonium group, and a dimethylethylammonium group.
  • Examples of the counter ion of the strong cationic group include halide ions such as chloride ions, bromide ions, and iodide ions.
  • the amount of the strong cationic group introduced onto the surface of the substrate particles is not particularly limited, but a preferable lower limit per dry weight of the filler is 1 ⁇ eq / g, and a preferable upper limit is 500 ⁇ eq / g.
  • a preferable lower limit per dry weight of the filler is 1 ⁇ eq / g
  • a preferable upper limit is 500 ⁇ eq / g.
  • the amount of the strong cationic group is less than 1 ⁇ eq / g, the holding power is weak and the separation performance may be deteriorated.
  • the amount of the strong cationic group exceeds 500 ⁇ eq / g, the holding power becomes too strong and the PCR amplification product cannot be easily eluted, and problems such as an excessive analysis time may occur.
  • the weak cationic group means a cationic group having a pka of 8 or more. That is, the weak cationic group is affected by the pH of the aqueous solution, and the dissociation state changes. That is, when the pH is higher than 8, the protons of the weak cationic group are dissociated, and the proportion not having a positive charge increases. On the other hand, when the pH is lower than 8, the weak cationic group becomes protonated and the proportion of positive charges increases.
  • Examples of the weak cationic group include a tertiary amino group, a secondary amino group, and a primary amino group. Of these, a tertiary amino group is desirable.
  • the amount of the weak cationic group introduced onto the surface of the base particle is not particularly limited, but a preferable lower limit per dry weight of the filler is 0.5 ⁇ eq / g, and a preferable upper limit is 500 ⁇ eq / g.
  • a preferable lower limit per dry weight of the filler is 0.5 ⁇ eq / g
  • a preferable upper limit is 500 ⁇ eq / g.
  • the amount of the weak cationic group is less than 0.5 ⁇ eq / g, the separation performance may not be improved because the amount is too small. If the amount of the weak cationic group exceeds 500 ⁇ eq / g, the holding power becomes too strong as in the case of the strong cationic group, so that the PCR amplification product cannot be easily eluted and the analysis time becomes too long. May occur.
  • the amount of the strong cationic group or the weak cationic group on the surface of the substrate particle can be measured by quantifying the nitrogen atom contained in the amino group.
  • An example of a method for quantifying nitrogen is the Kjeldahl method.
  • nitrogen contained in the strong cationic group is quantified after polymerization, and then the strong cationic group and the weak cationic group after the introduction of the weak cationic group.
  • the amount of the weak cationic group introduced later can be calculated. By quantifying in this manner, the amount of strong cationic group and the amount of weak cationic group can be adjusted within the above range when preparing the filler.
  • the base particle for example, synthetic polymer fine particles obtained using a polymerizable monomer, inorganic fine particles such as silica, etc. can be used.
  • the particles are desirable.
  • the hydrophobic crosslinked polymer is a hydrophobic crosslinked polymer obtained by copolymerizing at least one hydrophobic crosslinking monomer and a monomer having at least one reactive functional group, and at least one hydrophobic crosslinked polymer. Any of the hydrophobic cross-linked polymers obtained by copolymerizing the polymerizable cross-linking monomer, the monomer having at least one reactive functional group and at least one hydrophobic cross-linking monomer may be used. .
  • the hydrophobic crosslinkable monomer is not particularly limited as long as it has two or more vinyl groups in one monomer molecule.
  • ethylene glycol di (meth) acrylate, polyethylene glycol di (meth) Di (meth) acrylates such as acrylate, propylene glycol di (meth) acrylate, polypropylene glycol di (meth) acrylate, tri (meth) such as trimethylol methane tri (meth) acrylate, tetramethylol methane tri (meth) acrylate
  • acrylic esters, tetra (meth) acrylic esters, and aromatic compounds such as divinylbenzene, divinyltoluene, divinylxylene, and divinylnaphthalene.
  • the above (meth) acrylate means acrylate or methacrylate
  • (meth) acryl means acryl or methacryl.
  • Examples of the monomer having a reactive functional group include glycidyl (meth) acrylate and isocyanate ethyl (meth) acrylate.
  • the hydrophobic non-crosslinkable monomer is not particularly limited as long as it is a non-crosslinkable polymerizable organic monomer having hydrophobic properties.
  • methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate examples thereof include (meth) acrylic acid esters such as butyl (meth) acrylate and t-butyl (meth) acrylate, and styrene monomers such as styrene and methylstyrene.
  • the hydrophobic cross-linked polymer is obtained by copolymerizing the hydrophobic cross-linkable monomer and the monomer having a reactive functional group, the hydrophobic property in the hydrophobic cross-linked polymer
  • the preferable lower limit of the content ratio of the segment derived from the crosslinkable monomer is 10% by weight, and the more preferable lower limit is 20% by weight.
  • the filler for ion exchange chromatography of the present invention preferably has a polymer layer having the strong cationic group and the weak cationic group on the surface of the base particle.
  • the strong cationic group and the weak cationic group are preferably derived from independent monomers.
  • the filler for ion exchange chromatography of the present invention is a hydrophilic polymer having the above-mentioned hydrophobic crosslinked polymer particles and a strong cationic group copolymerized on the surface of the hydrophobic crosslinked polymer particles. It is preferable that a weak cationic group is introduced on the surface of the coated polymer particle comprising the above layer.
  • the hydrophilic polymer having a strong cationic group is composed of a hydrophilic monomer having a strong cationic group, and is derived from a hydrophilic monomer having one or more strong cationic groups. What is necessary is just to contain a segment. That is, as a method for producing the hydrophilic polymer having a strong cationic group, a method of polymerizing a hydrophilic monomer having a strong cationic group alone, a hydrophilic property having two or more strong cationic groups. Examples thereof include a method of copolymerizing monomers, a method of copolymerizing a hydrophilic monomer having a strong cationic group and a hydrophilic monomer having no strong cationic group.
  • the hydrophilic monomer having a strong cationic group is preferably one having a quaternary ammonium group.
  • ethyl triethylammonium chloride ethyl dimethylethylammonium methacrylate, ethyl dimethylbenzylammonium methacrylate, ethyl dimethylbenzylammonium acrylate, ethyl triethylammonium acrylate, ethyl dimethylethylammonium acrylate
  • Examples include chloride, acrylamidoethyltrimethylammonium chloride, acrylamidoethyltriethylammonium chloride, acrylamidoethyldimethylethylammonium chloride, and the like.
  • a method for introducing the weak cationic group into the surface of the coated polymer particle a known method can be used. Specifically, for example, as a method of introducing a tertiary amino group as the weak cationic group, a hydrophobic crosslinked polymer particle comprising a hydrophobic crosslinked polymer having a segment derived from a monomer having a glycidyl group is used.
  • the carboxy group produced by hydrolysis and the reagent having a tertiary amino group are then combined with the reagent. And a method such as condensation with Bojiimido.
  • the hydrophilic monomer having a strong cationic group is copolymerized on the surface of a hydrophobic crosslinked polymer particle composed of a hydrophobic crosslinked polymer having a segment derived from a monomer having a glycidyl group, and then A method of reacting a reagent having a tertiary amino group with a glycidyl group, or the above strong cationic property on the surface of a hydrophobic crosslinked polymer particle comprising a hydrophobic crosslinked polymer having a segment derived from a monomer having an isocyanate group A method of copolymerizing a hydrophilic monomer having a group and then reacting a reagent having a tertiary amino group with an isocyanate group is preferred.
  • the reagent having a tertiary amino group to be reacted with a reactive functional group is not particularly limited as long as the reagent has a functional group capable of reacting with the tertiary amino group and the reactive functional group.
  • a functional group capable of reacting with the tertiary amino group and the reactive functional group include a primary amino group and a hydroxyl group. Of these, a group having a primary amino group at the terminal is preferable.
  • Specific reagents having such functional groups include N, N-dimethylaminomethylamine, N, N-dimethylaminoethylamine, N, N-dimethylaminopropylamine, N, N-dimethylaminobutylamine, N, N- Diethylaminoethylamine, N, N-diethylaminopropylethylamine, N, N-diethylaminobutylamine, N, N-diethylaminopentylamine, N, N-diethylaminohexylamine, N, N-dipropylaminobutylamine, N, N-dibutylaminopropyl An amine etc. are mentioned.
  • the relative position relationship between the strong cationic group, preferably a quaternary ammonium salt, and the weak cationic group, preferably a tertiary amino group is such that the strong cationic group is a substrate rather than the weak cationic group. It is preferable that it is located far from the surface of the particle, that is, outside. For example, it is preferable that the weak cationic group is within 30 mm from the surface of the base particle, and the strong cationic group is within 300 mm from the base particle surface, and is outside the weak cationic group.
  • the average particle diameter of the base particles used in the filler for ion exchange chromatography of the present invention is not particularly limited, but a preferred lower limit is 0.1 ⁇ m and a preferred upper limit is 20 ⁇ m. If the average particle size is less than 0.1 ⁇ m, the inside of the column may become too high, resulting in poor separation. When the average particle diameter exceeds 20 ⁇ m, the dead volume in the column becomes too large, which may cause poor separation.
  • the average particle diameter indicates a volume average particle diameter, and can be measured using a particle size distribution measuring apparatus (such as AccuSize 780 / Particle Sizing Systems).
  • composition of the eluent used in the ion exchange chromatography performed in the present invention known conditions can be used.
  • buffers or organic solvents containing known salt compounds it is preferable to use buffers or organic solvents containing known salt compounds. Specifically, for example, Tris-HCl buffer, TE buffer consisting of Tris and EDTA, Tris And a TBA buffer solution composed of boric acid and EDTA.
  • the pH of the eluent is not particularly limited, but the preferred lower limit is 5 and the preferred upper limit is 10. By setting in this range, it is considered that the weak cationic group also effectively acts as an ion exchange group (anion exchange group).
  • the more preferable lower limit of the pH of the eluent is 6, and the more preferable upper limit is 9.
  • Examples of the salt contained in the eluent include salts consisting of halides such as sodium chloride, potassium chloride, sodium bromide, potassium bromide and alkali metals; calcium chloride, calcium bromide, magnesium chloride, magnesium bromide. Salts composed of halides such as alkaline earth metals and the like; inorganic acid salts such as sodium perchlorate, potassium perchlorate, sodium sulfate, potassium sulfate, ammonium sulfate, sodium nitrate, and potassium nitrate can be used. Moreover, organic acid salts, such as sodium acetate, potassium acetate, sodium succinate, potassium succinate, can also be used. Any of the above salts may be used alone or in combination.
  • the salt concentration of the eluent may be appropriately adjusted according to the analysis conditions, but the preferred lower limit is 10 mmol / L, the preferred upper limit is 2000 mmol / L, the more preferred lower limit is 100 mmol / L, and the more preferred upper limit is 1500 mmol / L. L.
  • the eluent used in the ion exchange chromatography of the present invention contains anti-chaotropic ions to further improve the separation performance.
  • Anti-chaotropic ions have a property opposite to that of kaorotopic ions and have a function of stabilizing the hydration structure. Therefore, there is an effect of strengthening the hydrophobic interaction between the filler and the nucleic acid molecule.
  • the main interaction of the ion exchange chromatography of the present invention is an electrostatic interaction, but in addition, the separation performance is enhanced by utilizing the action of hydrophobic interaction.
  • Anti-chaotropic ions contained in the eluent include phosphate ions (PO 4 3 ⁇ ), sulfate ions (SO 4 2 ⁇ ), ammonium ions (NH 4 + ), potassium ions (K + ), sodium ions (Na + )). Among these ion combinations, sulfate ions and ammonium ions are preferably used.
  • the anti-chaotropic ions can be used either alone or in combination.
  • a part of the above-mentioned antichaotropic ion includes a salt or a buffer component contained in the eluent. When such a component is used, it has both a property as a salt or a buffer capacity contained in the eluent and a property as an anti-chaotropic ion, which is preferable for the present invention.
  • the concentration of anti-chaotropic ions in the eluent for ion-exchange chromatography according to the present invention may be appropriately adjusted according to the analysis target, but is preferably 2000 mmol / L or less as the anti-chaotropic salt.
  • a method of performing gradient elution with the concentration of the antichaotropic salt in the range of 0 to 2000 mmol / L Therefore, the concentration of the antichaotropic salt at the start of the analysis need not be 0 mmol / L, and the concentration of the antichaotropic salt at the end of the analysis need not be 2000 mmol / L.
  • the gradient elution method may be a low pressure gradient method or a high pressure gradient method, but a method of eluting while performing precise concentration adjustment by the high pressure gradient method is preferred.
  • the anti-chaotropic ion may be added to only one type of eluent used for elution, or may be added to a plurality of types of eluent.
  • the anti-chaotropic ion may have both the role of enhancing the hydrophobic interaction between the packing material and the PCR amplification product or the buffering capacity, and the effect of eluting the PCR amplification product from the column.
  • the column temperature when analyzing PCR amplification products by ion exchange chromatography performed in the present invention is preferably 30 ° C. or higher, more preferably 40 ° C. or higher, and further preferably 45 ° C. or higher.
  • the column temperature of the ion exchange chromatography is less than 30 ° C., the hydrophobic interaction between the packing material and the PCR amplification product becomes weak, and it becomes difficult to obtain a desired separation effect.
  • the column temperature of ion exchange chromatography is less than 45 ° C.
  • the PCR amplification product (methylated DNA sample) of methylated DNA treated with bisulfite and the PCR amplified product of unmethylated DNA treated with bisulfite The difference in retention time from the unmethylated DNA sample is small.
  • the column temperature is 60 ° C. or higher, the difference in retention time between the methylated DNA sample and the non-methylated DNA sample is further widened, and each peak becomes clearer. Can be detected.
  • both of the methylated DNA sample and the unmethylated DNA sample are clearly separated when the column temperature of the ion exchange chromatography is increased, both of the methylated DNA sample and the unmethylated DNA sample are present according to the abundance ratio of the methylated DNA and the unmethylated DNA in the sample DNA. A difference tends to occur in the peak area or peak height of the holding time. Therefore, the higher the column temperature, the presence of each of methylated and unmethylated DNA in the sample DNA based on the area or height of the retention time peak between the methylated and unmethylated DNA samples It becomes easier to measure the quantity and the abundance ratio.
  • the column temperature of ion exchange chromatography is 90 ° C. or higher, the double strands of the nucleic acid molecules in the PCR amplification product are dissociated, which is not preferable for analysis. Furthermore, if the column temperature is 100 ° C. or higher, the eluent may be boiled, which is not preferable for analysis. Therefore, the column temperature when analyzing the PCR amplification product by ion exchange chromatography performed in the present invention may be 30 ° C. or higher and lower than 90 ° C., preferably 40 ° C. or higher and lower than 90 ° C., more preferably 45 ° C. It is more than 55 degreeC and less than 90 degreeC, More preferably, it is 55 degreeC or more and 85 degrees C or less, More preferably, it is 60 degreeC or more and 85 degrees C or less.
  • the amount of sample injected into the ion exchange chromatography column is not particularly limited, and may be appropriately adjusted according to the ion exchange capacity and sample concentration of the column.
  • the flow rate is preferably from 0.1 mL / min to 3.0 mL / min, more preferably from 0.5 mL / min to 1.5 mL / min. If the flow rate is slow, improvement of the separation can be expected. However, if the flow rate is too slow, it may take a long time for the analysis, or the separation performance may be lowered due to broad peaks. Conversely, an increase in the flow rate has an advantage in terms of shortening the analysis time, but the peak is compressed, leading to a decrease in separation performance.
  • the holding time of each sample can be determined in advance by conducting a preliminary experiment on each sample.
  • a liquid feeding method a known liquid feeding method such as a linear gradient elution method or a stepwise elution method can be used, but a linear gradient elution method is preferred as the liquid feeding method in the present invention.
  • the size of the gradient may be appropriately adjusted in accordance with the separation performance of the column and the characteristics of the analyte (here, PCR amplification product) in the range of 0 to 100% of the eluent used for elution.
  • DNA methylation in sample DNA is detected by subjecting a PCR amplification product of DNA treated with bisulfite in the above-described procedure to ion exchange chromatography.
  • the detection signal from the PCR amplification product of the sample DNA treated with bisulfite is the same as that of the sample DNA but the DNA amplification product of the bisulfite treated product of DNA that is not methylated (hereinafter, negative control).
  • negative control the DNA amplification product of the bisulfite treated product of DNA that is not methylated
  • positive control a PCR amplification product of a bisulfite treatment product of DNA having the same base sequence as the sample DNA and a known methylation rate (eg, 100%).
  • the abundance of methylated DNA in the sample DNA and unmethylated DNA by comparing the detection signal from the PCR amplification product of the bisulfite treatment of the sample DNA with the detection signal from the negative and positive controls
  • the abundance ratio can be measured.
  • detection signals from a plurality of PCR amplification products hereinafter referred to as standards
  • a bisulfite-treated product of a plurality of DNAs having the same base sequence as the sample DNA and a known methylation rate Measure the methylation rate, abundance, and ratio of abundance with unmethylated DNA in the sample DNA by comparing the detection signal from the PCR amplification product of the bisulfite-treated product of Can do.
  • a sample containing the PCR amplification product of the bisulfite-treated product of the sample DNA, the negative control or the positive control, or the standard sample are individually separated.
  • the sample adsorbed on the column is eluted with a gradient using a plurality of eluents, so that the PCR amplification product of the bisulfite-treated product of the sample DNA and the negative control or positive control or standard are converted according to the DNA methylation rate. Elute with different retention times.
  • the detection signal from the negative control was obtained by performing bisulfite treatment and PCR according to the procedure described above using DNA having the same base sequence as that of the sample DNA but not methylated in place of the sample DNA.
  • the product can be obtained by ion exchange chromatography.
  • the detection signal from the positive control was obtained by performing bisulfite treatment and PCR according to the procedure described above using DNA having the same base sequence as the sample DNA and a known methylation rate (for example, 100%) instead of the sample DNA.
  • the obtained PCR amplification product can be obtained by subjecting it to ion exchange chromatography.
  • a detection signal from the negative or positive control may be obtained by subjecting the above-described synthetic DNA or commercially available DNA to ion exchange chromatography as a negative or positive control.
  • the detection signal from the standard is obtained by performing bisulfite treatment and PCR according to the procedure described above using a plurality of DNAs having the same base sequence as the sample DNA and a known methylation rate instead of the sample DNA.
  • a plurality of PCR amplification products can be obtained by subjecting each product to ion exchange chromatography. Further, a calibration curve may be created from each obtained detection signal.
  • the detection signal from the standard may be obtained by subjecting the above-described synthetic DNA or commercially available DNA to the ion exchange chromatography as a standard.
  • the detection signal from the PCR amplification product of the bisulfite-treated sample DNA obtained by the above chromatography is compared with the detection signal from the negative or positive control or standard. Based on the difference between the two detection signals, methylation of the sample DNA can be detected.
  • the retention time of the peak of the detection signal obtained from the PCR amplification product of the sample DNA treated with bisulfite is different from the retention time of the negative control peak, it can be determined that the sample DNA is methylated. . Furthermore, at this time, it can be estimated that the greater the shift in retention time, the greater the methylation rate. Conversely, as the retention time of the peak of the detection signal obtained from the PCR amplification product of the sample DNA treated with bisulfite is shifted from the retention time of the peak of the 100% methylation positive control, the methylation of the sample DNA is increased. The rate can be estimated to be smaller.
  • a calibration curve can be created based on the retention times of a plurality of peaks obtained from a standard with a known methylation rate, and the methylation rate of the sample DNA can be determined based on this calibration curve (FIG. 1 and FIG. 1). 2).
  • the above-mentioned calibration curve can correlate the DNA methylation rate and the retention time. Therefore, based on the calibration curve, a DNA methylation rate corresponding to the reference retention time (hereinafter also referred to as a reference DNA methylation rate) can be obtained. Once the reference DNA methylation rate is obtained, even if the HPLC equipment and analysis conditions are changed, the reference DNA methylation rate is added to the calibration curve newly created under the changed equipment and conditions. By applying, a new reference holding time can be easily calculated.
  • the peak height or peak area of the detection signal obtained from the PCR amplification product of the sample DNA treated with bisulfite is treated with the bisulfite treatment of DNA with a known methylation rate and mixing ratio of the methylated DNA.
  • the abundance ratio of methylated DNA in the sample DNA for example, the abundance ratio of unmethylated DNA or methyl at a specific ratio
  • the abundance ratio of the converted DNA, etc. can be determined.
  • LCsolution Shiadzu Corporation
  • GRAMS / AI Thermo Fisher Scientific
  • Igor Pro Peak detection using WaveMetrics
  • the parameter “WIDTH” is set to be larger than the half-width of the unnecessary peak
  • the parameter “SLOPE” is set to be larger than the rising slope of the unnecessary peak
  • the setting of the parameter “DRIFT” is changed so that the low-separation peak is vertically For example, selecting whether to divide or to divide the baseline. Since different chromatograms can be obtained as parameter values depending on the analysis conditions, the type of gene marker selected, the amount of specimen, etc., appropriate values may be set according to the chromatogram.
  • Retention time ie peak top time
  • the chromatogram is first-order differentiated, and the time when the differential coefficient changes from positive to negative can be acquired as the peak top time.
  • the retention time of the detection signal by chromatography is examined.
  • the sample is determined to be a sample obtained from a renal cell carcinoma patient with a poor prognosis.
  • FIGS. 3A and 3B the separation of the peak of the high methylation rate DNA and the peak of the low methylation rate DNA is good, and in the case of bimodalization, the effect of unmethylated DNA is removed by the separation of the peaks. It is possible to accurately determine that the sample is obtained from a renal cell carcinoma patient with a poor prognosis.
  • difference data obtained by subtracting the detection signal obtained from the negative control from the detection signal obtained from the PCR amplification product of the bisulfite-treated sample DNA can be obtained.
  • the difference data it is possible to remove the signal (noise) from the unmethylated DNA from the detection signal as the whole sample DNA and extract only the signal from the methylated DNA.
  • the difference data corresponds to a detection signal by methylated DNA in the sample DNA.
  • the difference data holding time is compared with the reference holding time. If the result is earlier than the reference retention time, the sample is determined to be a sample obtained from a renal cell carcinoma patient with a poor prognosis.
  • sample DNA having a low abundance ratio of methylated DNA or sample DNA containing methylated DNA having a low methylation rate In addition, it becomes possible to detect and analyze methylated DNA.
  • various patterns of chromatograms are obtained, such as a shouldered peak and a plurality of peaks overlapping. In such a case, since only the signal of the sample DNA having a high methylation rate can be extracted by obtaining the difference data, the cancer prognosis can be determined with high accuracy.
  • the procedure of the cancer prognosis determination method of the present invention when using the difference data is basically the same as that of the data before the difference described above.
  • the retention time of the detection signal by chromatography is examined, and when the detection signal is obtained at a retention time earlier than the reference retention time, the sample is obtained from a renal cell carcinoma patient with a poor prognosis. Judge that there is.
  • the use of the difference data is very effective.
  • Samples collected for clinical examination include normal cells such as non-cancer epithelial cells and stromal cells that have not undergone DNA methylation, or precancerous conditions in which DNA methylation has not progressed so much.
  • cancer cells with various DNA methylation rates may exist in various ratios.
  • methylated DNA and unmethylated DNA in a sample can be separated and detected, so that even if the sample contains many normal cells, the presence of methylated DNA and The methylation rate can be detected with high accuracy, and accurate prognosis can be determined.
  • the method of the present invention it is possible to accurately determine a prognosis even for a subject who has not been determined to be CIMP positive despite a poor prognosis in a conventional test.
  • 109 cancer tissue (T) samples and corresponding 107 non-cancerous renal cortical tissue (N) samples were surgically removed from 110 patients with primary clear cell renal cell carcinoma No significant histological change was observed in the N sample. These patients have not received preoperative treatment and have undergone nephrectomy at the National Cancer Center Hospital. It consists of 79 men and 31 women, with an average age of 62.8 ⁇ 10.3 years (mean ⁇ standard deviation, 36-85 years).
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • Type 3 (multi-nodule type) HCC is less histologically differentiated than type 1 (single-nodule type) and type 2 (peri-nodule growth type) HCC, and the incidence of intrahepatic metastasis is High (see Kanai, T. et al., Cancer, 1987, 60, 810-819).
  • the presence or absence of vascular invasion was examined by observing a slide stained with hematoxylin-eosin and elastica one-Geeson with a microscope.
  • the presence of tumor thrombus in the main trunk of the renal vein was examined by visual observation.
  • the MassARRAY method amplifies the DNA after bisulfite treatment, transcribes it into RNA, further cleaves with RNAase in a base-specific manner, and then uses a mass spectrometer to determine the molecular weight of methylated DNA fragments and unmethylated DNA fragments. This is a method for detecting a difference.
  • MassARRAY primer design was performed on the CpG island including the CpG site using EpiDesigner (manufactured by SEQUENOM, PrimeARRAY primer design software).
  • a fresh frozen tissue sample obtained from the patient was treated with phenol-chloroform and then subjected to dialysis to extract high molecular weight DNA (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: Experimental Manual 3rd Edition, Cold Spring Harbor Publishing, NY, see pages 6.14-6.15). Then, 500 ng of DNA was subjected to bisulfite treatment using an EZ DNA Methylation-Gold TM kit (manufactured by Zymo Research). Bisulfite-treated genomic DNA was amplified by PCR and subjected to in vitro transcription reaction.
  • RNA was specifically cleaved at the uracil site by RNAase, and fragments having different lengths according to the presence or absence of methylation of the genomic DNA of each sample were generated.
  • the obtained RNA fragment was subjected to MALDI-TOF MAS (manufactured by SEQUENOM, MassARRAY Analyzer 4) capable of detecting a difference in mass of a single base, and mass spectrometry was performed.
  • MALDI-TOF MAS manufactured by SEQUENOM, MassARRAY Analyzer 4
  • the obtained mass spectrometry result was aligned with the reference sequence, and the mass ratio of the RNA fragment derived from methylated DNA to the RNA fragment derived from unmethylated DNA From this, the methylation level was calculated.
  • the sequences of the primers used in this analysis and the sequences of the PCR products amplified using the set of primers are shown in Tables 5 and 6 and the Sequence Listing.
  • the mixture was heated with stirring and polymerized at 80 ° C. for 1 hour in a nitrogen atmosphere.
  • 100 g of ethyl trimethyl ammonium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a hydrophilic monomer having a strong cationic group was dissolved in ion-exchanged water. This was added to the same reactor and polymerized in the same manner at 80 ° C. for 2 hours under stirring in a nitrogen atmosphere.
  • the obtained polymerization composition was washed with water and acetone to obtain coated polymer particles having a hydrophilic polymer layer having a quaternary ammonium group on the surface.
  • the obtained coated polymer particles were measured using a particle size distribution analyzer (Accumizer 780 / Particle Sizing Systems), and the average particle size was 10 ⁇ m.
  • the above-mentioned packing material for ion exchange chromatography was packed into a stainless steel column (column size: inner diameter 4.6 mm ⁇ length 20 mm) of a liquid chromatography system.
  • PCR The bisulfite-treated genomic DNA obtained in (1) was PCR amplified.
  • PCR is 10 ng of template DNA, GeneAmp 1 ⁇ PCR buffer (manufactured by Life Technologies), 200 ⁇ mol / L GeneAmp dNTP Mix (manufactured by Life Technologies), 0.75U AmpliTold Gold Polymol Polymol PolyGol DNATolgo Molmol
  • the reaction was performed in 25 ⁇ L of a reaction solution containing L forward and reverse primers. In PCR, after initial heat denaturation at 95 ° C. for 5 minutes, 35 cycles of 94 ° C. 30 seconds ⁇ 59 ° C. (when using F3-R3 primer) 30 seconds ⁇ 72 ° C.
  • Example 1 Variation in chromatographic retention time depending on the DNA methylation rate DNA in which all 39 CpG sites are methylated based on the DNA sequence of the 384 bp region having 39 CpG sites in the FAM150A gene promoter
  • Eight DNAs with different methylation rates were synthesized from (100% methylated DNA) to DNA not methylated at all (0% methylated DNA).
  • For 50% methylated DNA three patterns of DNA were synthesized with the methylation positions closer to the 5 'side, closer to the 3' side, and closer to the center.
  • Table 8 shows the methylation rate of each synthetic DNA and the methylation number of CpG islands.
  • the eight synthetic DNAs were subjected to bisulfite treatment, PCR, and HPLC according to the procedure of Reference Example 3.
  • the HPLC chromatogram for 5 (75% methylation) is shown in FIG.
  • the retention time was shortened according to the DNA methylation rate.
  • the data which plotted the retention time of HPLC with respect to methylation rate about 8 DNA are shown in FIG.
  • HPLC retention time showed a very high correlation with DNA methylation rate.
  • 50% methylated DNA showed almost the same retention time regardless of the methylation position. From this, it was shown that the retention time was determined depending on the methylation rate, regardless of the methylation position in the DNA. Therefore, the methylation rate contained in the sample DNA can be measured by measuring the retention time of HPLC.
  • Example 2 DNA methylation analysis and prognosis determination in renal cell carcinoma Among renal cell carcinomas determined in CIMP in Reference Example 1, CIMP positive renal cell carcinoma from 13 patients and CIMP negative kidney cells from 5 Genomic DNA was prepared from cancer. The DNA was subjected to bisulfite treatment, PCR, and HPLC according to the procedure of Reference Example 3 (1) to (3). In PCR, a 384 bp region in the FAM150A gene promoter was amplified. Furthermore, HPLC analysis was also performed on DNA having a methylation rate of 0% (negative control) and 100% (positive control) in the PCR amplification region by the same procedure.
  • FIG. 3 shows HPLC chromatograms obtained from CIMP positive and CIMP negative samples. Also shown in FIG. 3 are chromatograms of unmethylated DNA (negative control) and 100% methylated DNA (positive control). 3A and 3B are chromatograms of a CIMP positive sample. The peak of unmethylated DNA (negative control) and the peak having different retention times clearly appear, indicating the presence of methylated DNA. FIG. 3C is a chromatogram of a CIMP negative sample, the peak of which is almost indistinguishable from the peak of unmethylated DNA (negative control), indicating that there is almost no methylated DNA. FIG.
  • 3D is a chromatogram of a CIMP negative sample, where a peak of unmethylated DNA (negative control) and a peak having a different retention time clearly appear, indicating the presence of methylated DNA. That is, even if it is determined that the CIMP is negative, it may indicate a sample with a poor prognosis.
  • FIG. 4 is a graph plotting HPLC chromatogram peak retention times for all 18 CIMP negative / positive samples examined in this example. Since the distribution of retention time is clearly different between the CIMP negative sample and the positive sample, it is clear that the CIMP of the cancer determined by the MassARRAY method can be accurately determined by the method of the present invention by the method of the present invention. It was made.
  • the CIMP positive group and the CIMP negative group are separated around the retention time of 9.3 min.
  • the above-mentioned reference retention time may be set to an appropriate reference retention time because the chromatogram changes depending on the HPLC analysis conditions, the genomic DNA region, or the type of gene marker. In addition, it is preferable to set the reference retention time in consideration of the required clinical sensitivity.
  • the retention time of the positive control (DNA methylation rate 100%) was about 9.0 minutes and the retention time of the negative control (DNA methylation rate 0%) was about 9.35 minutes.
  • the reference DNA methylation rate resulting in a reference retention time was calculated to be about 17%. Therefore, in the FAM150A gene promoter 384 bp region used in this example, a sample having a DNA methylation rate higher than the reference DNA methylation rate (about 17%) was shown to have a poor prognosis.
  • the average value of the DNA methylation rate obtained by MassARRAY is compared with the DNA methylation rate obtained by the present invention.
  • the detection signal obtained by the present invention is calculated from the retention time (the retention time of the earlier elution is a and the retention time of the later is b) for the bimodal peaks as shown in FIGS. 3A and 3B.
  • FIG. 5A shows a plot of the DNA methylation rate and comparison with the DNA methylation rate obtained by MassARRAY. In FIG. 5A, the DNA methylation rates obtained by each method do not appear to be correlated.
  • the DNA methylation rate obtained from the synthetic peak C (retention time c) calculated from the average of the retention time a and the retention time b is plotted, and similarly compared with the DNA methylation rate obtained by MassARRAY. Shown in FIG. 5B. As shown in FIG. 5B, the DNA methylation rate calculated from the synthetic peak C correlates well with the average value of the DNA methylation rate obtained by the MassARRAY method.
  • a sample in which equal amounts of 30% methylated DNA and 70% methylated DNA are mixed with a sample that is all 50% methylated DNA can be clearly distinguished on the chromatogram.
  • the MassARRAY method can only obtain information on 50% methylated DNA as an average value for any sample.
  • signals of various DNA methylation rates contained in a sample can be separated and detected, so that an unaveraged DNA methylation rate can be obtained.
  • the value of the DNA methylation rate obtained by the method such as MassARRAY method or pyrosequencing provides the DNA methylation rate as an average value of the whole sample subjected to the measurement, and as a result, highly methylated DNA.
  • the present invention even if it is determined that the CIMP is negative, it is possible to remove the influence of non-methylated DNA and detect whether or not it contains hypermethylated DNA, thereby avoiding the risk of underestimating the DNA methylation rate. . Furthermore, a sample suspected of having a poor prognosis can be determined.
  • CIMP determination by the method described in Patent Document 4 methylation of CpG sites was examined for CpG islands of a plurality of gene markers, and CIMP positive or CIMP negative was determined. According to the present invention, it was suggested that prognosis determination of renal cell carcinoma equivalent to CIMP determination can be easily performed by analyzing a detection signal obtained by HPLC even with a single gene marker. Furthermore, it was suggested that the prognosis determination could be improved by analyzing the detection signals by HPLC for a plurality of gene markers.

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Abstract

　迅速、簡便、かつ高精度な癌予後判定方法の提供。腎細胞癌患者の予後判定方法であって：（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該被験体の腎細胞癌を予後不良と判定する工程、 を含む方法。

Description

腎細胞癌の予後判定方法
　本発明は、メチル化ＤＮＡの検出を利用した腎細胞癌の予後判定方法に関する。
　近年、ＤＮＡの異常なメチル化ががん化に深く関与することが明らかになり、注目を集めている。癌細胞における特徴的なエピジェネティック異常として、一部の遺伝子プロモーター領域におけるＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化が知られている。ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）－グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域のことであり、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。ＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化は、がん抑制遺伝子の不活化などを通じて発がんに関与する。大腸癌、胃癌等において、臨床病理学的因子と相関したＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化亢進が報告されており（非特許文献１～４）、このようなタイプの癌は、ＣｐＧアイランドメチル化形質（ＣＩＭＰ）陽性癌と呼ばれる。
　既に確立されたメチル化ＤＮＡの解析方法として、亜硫酸水素塩（重亜硫酸塩、バイサルファイト、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）反応を利用した方法がある。この方法は、メチル化ＤＮＡの解析に最も汎用されている方法である。一本鎖ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理すると、シトシンはスルホン化、加水脱アミノ化、脱スルホン化を経て、ウラシルに変換される。一方、メチル化されたシトシンは、最初に起こるスルホン化の反応速度が極めて遅いため、実際に行われる亜硫酸水素塩処理の反応時間の中ではメチル化シトシンのままである。従って、亜硫酸水素塩処理をしたＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うと、メチル化シトシンはシトシンのままであるが、非メチル化シトシンは、ウラシルからチミンに置き換わって増幅される。このＰＣＲ増幅産物の配列中に生じるシトシンとチミンという塩基の違いを利用してメチル化状態を解析する。これを基本原理として汎用されている方法が、特許文献１、非特許文献５に記載のＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、および非特許文献６、７に記載のＣｏｍｂｉｎｅｄ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法である。
　ＭＳＰ法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後にメチル化配列特異的プライマーと非メチル化配列特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅と、アガロースゲル電気泳動とを順に行い、両プライマーによる増幅産物の有無により対象領域のＤＮＡメチル化状態を判定する方法である。ＣＯＢＲＡ法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理後にメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡに共通のプライマーを用いたＰＣＲ増幅と、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡで配列が異なる箇所を認識する制限酵素を用いた処理と、アガロースゲル電気泳動とを順に行い、制限酵素処理断片の有無により対象領域のＤＮＡメチル化状態を判定する方法である。両方法ともに、特別な装置なしにメチル化ＤＮＡの定量的な解析ができるという点で、現在でも広く使用されるメチル化ＤＮＡ解析方法であるが、解析に電気泳動法を利用する点で手間と時間がかかるという課題があった。
　一方、生化学や医学等の分野における核酸、タンパク質、多糖類といった生体高分子の分離分析には、簡便かつ短時間に精度良く検出できる方法としてイオン交換クロマトグラフィーが汎用されている。核酸のＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離する場合、一般的には、核酸分子中に含まれるリン酸のマイナス電荷を利用して分離するアニオン交換クロマトグラフィーが用いられる。カチオン性の官能基をイオン交換基として有するカラム充填剤が充填されたアニオン交換クロマトグラフィー用カラムは既に市販され、各種研究分野で使用されている。
　さらに、カチオン性の官能基として強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有するカラム充填剤を充填したカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、２０ｍｅｒの非メチル化合成オリゴヌクレオチド間における一塩基の相違を分離分析できることが報告されている（特許文献２）。
　腎細胞癌（Ｒｅｎａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＲＣＣ）は、労働人口に属する壮年期にもしばしば発生し、腎摘除術で根治する症例群が大勢をなす反面、急速に遠隔転移を来す症例群も明らかに存在し、両者の臨床経過には大きな差違がある。さらに、転移しても免疫療法・分子標的治療薬等が奏功する症例が知られている。再発の可能性が高い症例は密に経過観察して再発を早期に診断し、後療法を追加すれば予後が改善できる可能性がある。しかし、病理組織学的に低異型度で最もありふれた組織型である淡明細胞型ＲＣＣに属しながら急速に遠隔転移を来す症例が経験され、既存の臨床病理学的因子等による予後予測は困難である。
　ＭＳＰ法、ＣＯＢＲＡ法、及び細菌人工染色体（ＢＡＣ）アレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法（ＢＡＭＣＡ法）による解析によって、ＲＣＣ患者から得た非癌腎皮質組織が、ＤＮＡメチル化状態の変化に関連した前癌段階に既にあることが示されている（特許文献３及び非特許文献８～１１）。さらに、ＢＡＭＣＡ法によるゲノムワイドな解析によって、前癌段階にある非癌腎皮質組織のＤＮＡメチル化の変化は、同一患者の対応するＲＣＣに受け継がれていることも明らかにし、ＲＣＣ症例の予後を予測する方法を開発することに成功している（特許文献３及び非特許文献１０）。
　最近、悪性度の高いＲＣＣがＣＩＭＰ陽性形質を示すこと、さらにＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６－２の１７遺伝子のＣｐＧサイトにおけるメチル化がＲＣＣのＣＩＭＰの特徴であることが明らかにされた（特許文献４）。特許文献４では、ビーズアレイ法、質量分析（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法）、パイロシークエンシング、メチル化感受性高解像能融解曲線分析、定量ＰＣＲ、バイサルファイト処理物の直接シークエンシング、ＣＯＢＲＡ法などにより、上記１７遺伝子のＣｐＧサイトにおけるメチル化レベルを検出することによって、ＲＣＣの予後不良リスクを検出する方法が提案されている。従来から用いられているＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、パイロシークエンシング等の方法で得られるＤＮＡメチル化率の値は、測定に供した試料全体の平均値としてのＤＮＡメチル化率が得られる。そのため、試料中にＤＮＡメチル化率の低い細胞が多い場合に、高度にメチル化されたＤＮＡを有する細胞が混在していたとしても、得られるＤＮＡメチル化率の値は低くなる。結果として、高度にメチル化されたＤＮＡを有する細胞の有無を判定することができない、さらにはＤＮＡメチル化率を低く見積もるリスクが避けられない、という問題点があった。
米国特許第５７８６１４６号公報 国際公開公報第２０１２／１０８５１６号 特開２０１０－６３４１３号公報 国際公開公報第２０１３／０６２６５０号
Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４，９８８－９９３（２００４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，８６８１－８６８６（１９９９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４，１８６５４－１８６５９（２００７） Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５９，５４３８－５４４２（１９９９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９８２１－９８２６（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２４，５０５８－５０５９（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５，２５３２－２５３４（１９９７） Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，１４，５５３１－５５３９（２００８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９，２８８－２９６（２００６） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，３０，２１４－２２１（２００９） Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，７８，１－９（２０１１）
　癌の再発を防ぐためには、ゲノムＤＮＡのメチル化状態の情報を得ることにより、特異性高く再発リスクを判定して治療を開始することが望ましい。癌の転移・再発を予測し早期に発見できれば、それらに対して免疫療法や分子標的治療薬等の奏功が期待できることから、より正確な癌予後診断を行うことができる方法が求められている。さらに、正確な癌予後診断のための、迅速かつ簡便な方法が求められている。
　本発明者らは、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡをＰＣＲで増幅して得たＰＣＲ増幅産物を、イオン交換クロマトグラフィーによって分離することで、迅速かつ簡便にメチル化ＤＮＡを検出できることを見出した。さらに本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィーで得られたシグナルのパターンが、ＣＩＭＰ陽性癌から得られたＤＮＡとＣＩＭＰ陰性癌から得られたＤＮＡとで異なること、当該パターンの違いを解析することで予後不良な癌を判定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明は、以下を提供する。
〔１〕腎細胞癌を含む組織の判定方法であって：
　（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
　（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
　（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
　（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
　（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該組織を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であると判定する工程、
を含む方法。
　〔２〕腎細胞癌を含む組織を判定するためのデータを得る方法であって：
　（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
　（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
　（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
　（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
　（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早いか否かを、該組織が予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であるか否かを判定するためのデータとして取得する工程、
を含む方法。
〔３〕腎細胞癌患者の予後判定方法であって：
　（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
　（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
　（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
　（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
　（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該被験体の腎細胞癌を予後不良と判定する工程、
を含む方法。
〔４〕前記工程（２）において、ＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６－２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドを含む、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記工程（２）においてＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター領域を含む、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記工程（２）のＰＣＲにおいて、配列番号５１及び５２で示されるＰＣＲプライマーが使用される、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記工程（４）の前に、さらに以下の工程：
　（１’）前記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
　（２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
　（３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
　（３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程、
を含む、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
　本発明は、迅速、簡便、かつ高精度な癌予後判定方法を提供する。本発明によれば、より迅速、簡便、かつ高精度な癌患者の再発リスクを判定することができるので、治療が必要な癌患者に対する早期の治療再開が可能になる。したがって本発明は、癌患者の生存率の向上に貢献する。
ＤＮＡメチル化率によるクロマトグラフィー溶出時間の変動。Ａ：ＤＮＡメチル化率の異なるＤＮＡ（０％、２５％、５０％、７５％、１００％）のクロマトグラムＢ：ＤＮＡメチル化位置の異なる５０％メチル化ＤＮＡ（ランダム、５'側寄り、３'側寄り、中央）のクロマトグラム。 ＤＮＡメチル化率とクロマトグラフィー保持時間との相関。 ＣＩＭＰ陽性および陰性試料のクロマトグラム。Ａ，Ｂ：ＣＩＭＰ陽性試料、Ｃ，Ｄ：ＣＩＭＰ陰性試料。 ＣＩＭＰ陽性および陰性試料のクロマトグラフィー保持時間。 ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法と本発明とで得られたＤＮＡメチル化率の比較。 ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法と本発明とで得られたＤＮＡメチル化率の比較。
　本明細書において、「腎細胞癌」とは、腎臓の尿細管上皮細胞が癌化したものであり、その病理学的特徴から、淡明細胞型、顆粒細胞型、色素嫌性型、紡錘型、嚢胞随伴型、嚢胞由来型、嚢胞性型、乳頭状型に分類される癌である。また、本明細書において、「被験体」としては、例えば、腎細胞癌に罹患した患者又はその疑いのある患者、外科手術等によって腎細胞癌の治療が施された患者が挙げられる。
　本明細書において、癌の「予後不良」とは、例えば、被験体の予後（治療後）の生存率が低いことが挙げられ、より具体的には、術後５００日経過後の無再発生存率（無癌生存率）が５０％以下であることが挙げられ、あるいは、術後１５００日経過後の全生存率（全体的な生存率）が７０％以下となることが挙げられる。
　本明細書において、「ＤＮＡメチル化」とは、ＤＮＡにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。また本明細書において、ＤＮＡの「メチル化を検出する」とは、当該ＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡの存在の有無もしくは存在量、存在量の比、または当該ＤＮＡのメチル化率を測定することを意味する。本明細書において、「ＤＮＡメチル化率」とは、検出の対象とする特定のＤＮＡにおいてＣｐＧアイランドのシトシンがメチル化されている割合を意味し、例えば、検出の対象とする特定のＤＮＡのＣｐＧアイランドにおける、全シトシン数（メチル化シトシン及び非メチル化シトシン）に対するメチル化シトシン数の比率にて表すことができる。
　本明細書において、「ＣｐＧサイト」とは、ＤＮＡ中でシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味する。また本明細書において、ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）－グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域をいう。ＣｐＧアイランドは、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。本明細書において、「（ある）遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧアイランド」とは、当該遺伝子のコード領域に近い位置に存在するＣｐＧアイランド、または該ＣｐＧアイランドに含まれるＣｐＧサイトを意味し、好ましくは当該遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧサイトまたはＣｐＧアイランドを意味する。特定の遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧアイランドは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、パイロシークエンシング等の方法に基づいて同定することができる。
　本明細書において、「基準となる保持時間」（以下、基準保持時間ともいう）とは、ＣＩＭＰ陽性群とＣＩＭＰ陰性群とを分けることができるＨＰＬＣの保持時間、あるいは、腎細胞癌から調製されたゲノムＤＮＡに由来する検出シグナルについて、高度にメチル化されたＤＮＡに由来するシグナル群と、メチル化の程度の低いＤＮＡに由来するシグナル群とを分けることができるＨＰＬＣの保持時間を示す。すなわち、基準となる保持時間（基準保持時間）より早い保持時間には、高度にメチル化されたＤＮＡに由来するシグナルが検出されるので、基準保持時間より早い保持時間に検出シグナルを有する検体は予後不良であると判定され得る。前述の基準保持時間は、ＨＰＬＣの分析条件、ゲノムＤＮＡの領域、あるいは遺伝子マーカーの種類等によってクロマトグラムが変化するので、それらの条件等に応じて適切な基準保持時間を設定すればよい。また、必要とされる臨床感度も考慮し、基準保持時間を設定するのが好ましい。
　一実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、腎細胞癌を含む組織の判定方法を提供する。
（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該組織を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であると判定する工程。
　別の一実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、腎細胞癌を含む組織を判定するためのデータを得る方法を提供する。
（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合か否かを、該組織が予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であるか否かを判定するためのデータとして取得する工程。
　別の一実施形態において、本発明は、以下の工程を含む腎細胞癌患者の予後判定方法を提供する。
（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該被験体の腎細胞癌を予後不良と判定する工程。
　別の一実施形態において、本発明は、上記工程（４）の前にさらに以下の工程が行われる、腎細胞癌を含む組織または腎細胞癌患者の判定方法を提供する。
　（１’）上記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
　（２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
　（３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
　（３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程。
　被験体の腎臓組織としては、ＤＮＡを含む腎臓組織またはその細胞であればよく、例えば、生検や外科手術等において採取した組織、およびその凍結物や固定化標本が挙げられる。ゲノムＤＮＡの分解等を抑制し、より効率よくＤＮＡメチル化検出を行えるという観点からは、凍結した腎臓組織を用いることが望ましい。
　上記腎臓組織または細胞からサンプルＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ＤＮＡを調製する公知の方法としては、フェノールクロロホルム法、または市販のＤＮＡ抽出キット、例えば後述するＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、Ｃｌｅａｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ＺＲ　Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ　ＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴｒｉｍＧｅｎ社製）を用いるＤＮＡ抽出方法等が挙げられる。
　次いで、抽出したサンプルＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理の方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。亜硫酸水素塩処理のための公知の方法としては、例えば、後述するＥｐｉＴｅｃｔ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｋｉｔ（４８）（Ｑｉａｇｅｎ社製）や、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ　Ｐｔｙ社製）、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣｐＧ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ　Ｔｕｒｂｏ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）などの市販のキットを用いる方法が挙げられる。
　次いで、亜硫酸水素塩によって処理されたサンプルＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ増幅の方法としては特に制限はなく、増幅対象のＤＮＡの配列、長さ、量などに応じて、公知の手法を適宜選択して用いることができる。
　腎細胞癌については、１７遺伝子（ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６－２）におけるＤＮＡメチル化が、腎細胞癌の予後不良（ＣＩＭＰ陽性）と関連していることが報告されている（特許文献４）。したがって、本発明の方法においてＰＣＲ増幅される標的ＤＮＡは、好ましくは、上記１７遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化を検出できるように選択され、より好ましくは、上記１７遺伝子のＣｐＧサイトのメチル化を検出できるように選択される。例えば、標的ＤＮＡは、上記１７遺伝子のいずれかのコード領域および／またはプロモーター領域の一部または全部をコードするＤＮＡである。好ましくは、上記１７遺伝子のいずれかのプロモーター領域の一部又は全部をコードするＤＮＡである。より好ましくは、上記１７遺伝子のいずれかのＣｐＧアイランドの一部又は全部をコードするＤＮＡである。
　ＦＡＭ１５０ＡはＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿９９７２９６で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＧＲＭ６はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿０００８３４で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＮＦ５４０はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿６８９８１９で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＦＰ４２はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿７７７５６０で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＮＦ１５４はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿００１０７８８５３で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＲＩＭＳ４はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿８９２０１５で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＰＣＤＨＡＣ１はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿０６１７２１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＫＨＤＲＢＳ２はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿６８９９０１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＡＳＣＬ２はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿００５１６１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＫＣＮＱ１はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿０００２０９で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＰＲＡＣはＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿１１５７６７で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＷＮＴ３ＡはＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿１４９１２２で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＴＲＨはＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿００９０４８で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＦＡＭ７８ＡはＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿２０３７４５で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＮＦ６７１はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿０７９１０９で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＳＬＣ１３Ａ５はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿８０８２１８で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＮＫＸ６－２はＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＰ＿７９６３７４で特定されるタンパク質をコードする遺伝子である。
　上記１７遺伝子のＣｐＧサイトは、基準ヒトゲノム配列である、ＮＣＢＩデータベース　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｕｉｌｄ　３７上の位置を基準にして、表１～４に記載の染色体上の位置に存在する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
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　特許文献４に記載のＣＩＭＰ判定において、ＤＮＡメチル化の検出対象として好ましいＣｐＧサイトとしては、基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩデータベース　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｕｉｌｄ　３７上の位置が、第８染色体５３，４７８，４５４位、第５染色体１７８，４２２，２４４位、第１９染色体３８，０４２，４７２位、第４染色体１８８，９１６，８６７位、第１９染色体５８，２２０，６６２位、第２０染色体４３，４３８，８６５位、第５染色体１４０，３０６，４５８位、第６染色体６２，９９５，９６３位、第１１染色体２，２９２，００４位、第１１染色体２，４６６，４０９位、第１７染色体４６，７９９，６４０位、第１９染色体５８，２２０，４９４位、第１染色体２２８，１９４，４４８位、第３染色体１２９，６９３，６１３位、第９染色体１３４，１５２，５３１位、第１９染色体５８，２３８，９２８位、第１７染色体６，６１７，０３０位及び第１０染色体１３４，５９９，８６０位からなる群から選択される少なくとも１のＣｐＧサイトである。
　ＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲの増幅時間の短縮、ならびにイオン交換クロマトグラフィーでの分析時間の短縮や分離性能の維持等の要素を勘案して適宜選択することができる。例えば、ＣｐＧアイランドが多いサンプルＤＮＡを用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、１０００ｂｐ以下が好ましく、７００ｂｐ以下がより好ましく、５００ｂｐ以下がさらに好ましい。一方、ＣｐＧアイランドが少ないサンプルＤＮＡを用いる場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長は、ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイズを避けられる１５ｍｅｒ付近のプライマーを使用する場合のＰＣＲ増幅産物の鎖長である３０～４０ｂｐが下限となる。一方で、ＣｐＧアイランドの含有率がリッチになるようにプライマーを設計するのが好ましい。例えば、ＣｐＧサイトのシトシンが、ＰＣＲ増幅産物の鎖長に対して２％以上含まれるのが好ましく、５％以上含まれるのがより好ましい。
　続いて、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーが好適である。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムの充填剤としては、表面に強カチオン性基を有する基材粒子であれば特に限定されないが、特許文献２に示される充填剤表面に強カチオン性基と弱カチオン性基の両方を有する基材粒子が好ましい。
　本明細書において、上記強カチオン性基とは、ｐＨが１から１４の広い範囲で解離するカチオン性基を意味する。すなわち、上記強カチオン性基は、水溶液のｐＨに影響を受けず解離した（カチオン化した）状態を保つことが可能である。
　上記強カチオン性基としては、４級アンモニウム基が挙げられる。具体的には例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基等が挙げられる。また、上記強カチオン性基のカウンターイオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。
　上記基材粒子の表面に導入される上記強カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は１μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記強カチオン性基量が１μｅｑ／ｇ未満であると、保持力が弱く分離性能が悪くなることがある。上記強カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、保持力が強くなり過ぎてＰＣＲ増幅産物を容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。
　本明細書において、上記弱カチオン性基とは、ｐｋａが８以上のカチオン性基を意味する。すなわち、上記弱カチオン性基は、水溶液のｐＨによる影響を受け、解離状態が変化する。すなわち、ｐＨが８より高くなると、上記弱カチオン性基のプロトンは解離し、プラスの電荷を持たない割合が増える。逆にｐＨが８より低くなると、上記弱カチオン性基はプロトン化し、プラスの電荷を持つ割合が増える。
　上記弱カチオン性基としては、例えば、３級アミノ基、２級アミノ基、１級アミノ基等が挙げられる。なかでも、３級アミノ基であることが望ましい。
　上記基材粒子の表面に導入される上記弱カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は０．５μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記弱カチオン性基量が０．５μｅｑ／ｇ未満であると、少なすぎて分離性能が向上しないことがある。上記弱カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、強カチオン性基と同様保持力が強くなり過ぎてＰＣＲ増幅産物を容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。
　上記基材粒子表面の強カチオン性基または弱カチオン性基量は、アミノ基に含まれる窒素原子を定量することにより測定することができる。窒素を定量する方法として、例えばケルダール法が挙げられる。本発明（実施例）記載の充填剤の場合には、まず、重合後に強カチオン性基に含まれる窒素を定量し、次いで、弱カチオン性基を導入した後の強カチオン性基と弱カチオン性基に含まれる窒素を定量することにより、後から導入した弱カチオン性基量を算出することができる。このように定量することにより、充填剤を調製する際に、強カチオン性基量および弱カチオン性基量を上記範囲内に調整することができる。
　上記基材粒子としては、例えば、重合性単量体等を用いて得られる合成高分子微粒子、シリカ系等の無機微粒子等を用いることができるが、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子であることが望ましい。
　上記疎水性架橋重合体は、少なくとも１種の疎水性架橋単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも１種の疎水性架橋単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体と少なくとも１種の疎水性架橋単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。
　上記疎水性架橋性単量体としては、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステル、トリメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル若しくはテトラ（メタ）アクリル酸エステル、またはジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物が挙げられる。なお、本明細書において上記（メタ）アクリレートとは、アクリレートまたはメタクリレートを意味し、（メタ）アクリルとは、アクリルまたはメタクリルを意味する。
　上記反応性官能基を有する単量体としては、グリシジル（メタ）アクリレート、イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
　上記疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ－ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルや、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体が挙げられる。
　上記疎水性架橋重合体が、上記疎水性架橋性単量体と上記反応性官能基を有する単量体とを共重合して得られるものである場合、上記疎水性架橋重合体における上記疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は１０重量％、より好ましい下限は２０重量％である。
　本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記基材粒子の表面に、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体層を有するものであることが好ましい。また、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体において、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とはそれぞれ独立した単量体に由来するものであることが好ましい。具体的には、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記疎水性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合された強カチオン性基を有する親水性重合体の層とからなる被覆重合体粒子の表面に、弱カチオン性基が導入されたものであることが好適である。
　上記強カチオン性基を有する親水性重合体は、強カチオン性基を有する親水性単量体から構成されるものであり、１種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体に由来するセグメントを含有すればよい。すなわち、上記強カチオン性基を有する親水性重合体を製造する方法としては、強カチオン性基を有する親水性単量体を単独で重合させる方法、２種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合させる方法、強カチオン性基を有する親水性単量体と強カチオン性基を有しない親水性単量体を共重合させる方法等が挙げられる。
　上記強カチオン性基を有する親水性単量体としては、４級アンモニウム基を有するものであることが好ましい。具体的には例えば、メタクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等が挙げられる。
　上記被覆重合体粒子の表面に上記弱カチオン性基を導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には例えば、上記弱カチオン性基として３級アミノ基を導入する方法としては、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いでグリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；上記疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体と３級アミノ基を有する単量体とを共重合する方法；３級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて上記強カチオン性基を有する親水性重合体の層を有する被覆重合体粒子の表面に３級アミノ基を導入する方法；カルボキシ基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、カルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法；エステル結合を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、エステル結合部を加水分解した後、次いで、加水分解によって生成したカルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法等が挙げられる。なかでも、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、グリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法や、イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法が好ましい。
　グリシジル基やイソシアネート基等の反応性官能基に反応させる上記３級アミノ基を有する試薬としては、３級アミノ基と反応性官能基に反応可能な官能基を有する試薬であれば、特に限定されない。上記３級アミノ基と反応性官能基に反応可能な官能基としては、例えば、１級アミノ基、水酸基等が挙げられる。なかでも、末端に１級アミノ基を有している基が好ましい。当該官能基を有する具体的な試薬としては、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノペンチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ－ジプロピルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジブチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。
　上記強カチオン性基、好ましくは４級アンモニウム塩と、上記弱カチオン性基、好ましくは３級アミノ基との相対的な位置関係は、上記強カチオン性基が上記弱カチオン性基よりも基材粒子の表面から遠い位置、即ち外側にあることが好ましい。例えば、上記弱カチオン性基は基材粒子表面から３０Å以内にあり、上記強カチオン性基は基材粒子表面から３００Å以内で、かつ、弱カチオン性基よりも外側にあることが好ましい。
　本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤に用いられる上記基材粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。上記平均粒子径が０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがある。上記平均粒子径が２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。なお、本明細書において上記平均粒子径は体積平均粒子径を示し、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製など）を用いて測定することができる。
　本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液の組成としては、公知の条件を用いることができる。
　上記溶離液に用いる緩衝液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液、トリスとホウ酸とＥＤＴＡからなるＴＢＡ緩衝液等が挙げられる。
　上記溶離液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は５、好ましい上限は１０である。この範囲に設定することで、上記弱カチオン性基も効果的にイオン交換基（アニオン交換基）として働くと考えられる。上記溶離液のｐＨのより好ましい下限は６、より好ましい上限は９である。
　上記溶離液に含まれる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のハロゲン化物とアルカリ金属とからなる塩；塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のハロゲン化物とアルカリ土類金属とからなる塩；過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩、等を用いることができる。また、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いることもできる。上記塩は、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。
　上記溶離液の塩濃度としては、分析条件に合わせ適宜調整すればよいが、好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましい下限は１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１５００ｍｍｏｌ／Ｌである。
　さらに、本発明のイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液には、分離性能をさらに高めるためにアンチカオトロピックイオンが含まれている。アンチカオトロピックイオンは、カオロトピックイオンとは逆の性質を有し、水和構造を安定化させる働きがある。そのため、充填剤と核酸分子との間の疎水性相互作用を強める効果がある。本発明のイオン交換クロマトグラフィーの主たる相互作用は静電的相互作用であるが、加えて、疎水性相互作用の働きも利用することにより分離性能が高まる。
　上記溶離液に含まれるアンチカオトロピックイオンとしては、リン酸イオン（ＰＯ４ ３－）、硫酸イオン（ＳＯ４ ２－）、アンモニウムイオン（ＮＨ４ ＋）、カリウムイオン（Ｋ＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）などが挙げられる。これらのイオンの組合せの中でも、硫酸イオンおよびアンモニウムイオンが好適に用いられる。上記アンチカオトロピックイオンは、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。なお、上述のアンチカオトロピックイオンの一部には、上記溶離液に含まれる塩や緩衝液の成分が含まれる。このような成分を使用する場合、溶離液に含まれる塩としての性質または緩衝能と、アンチカオトロピックイオンとしての性質の両方を具備するので、本発明には好適である。
　本発明のイオン交換クロマトグラフィー用溶離液におけるアンチカオトロピックイオンの分析時の濃度は、分析対象物に合わせて適宜調整すればよいが、アンチカオトロピック塩として２０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましい。具体的には、アンチカオトロピック塩の濃度を０～２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲でグラジエント溶出させる方法を挙げることができる。従って、分析開始時のアンチカオトロピック塩の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌである必要はなく、また、分析終了時のアンチカオトロピック塩の濃度も２０００ｍｍｏｌ／Ｌである必要はない。上記グラジエント溶出の方法は、低圧グラジエント法であっても高圧グラジエント法であってもよいが、高圧グラジエント法による精密な濃度調整を行いながら溶出させる方法が好ましい。
　上記アンチカオトロピックイオンは、溶出に用いる溶離液のうちの１種のみに添加してもよいが、複数種の溶離液に添加してもよい。また上記アンチカオトロピックイオンは、充填剤とＰＣＲ増幅産物との間の疎水性相互作用を強める効果または緩衝能と、ＰＣＲ増幅産物をカラムから溶出させる効果の両方の役割を備えていても良い。
　本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでＰＣＲ増幅産物を分析する際のカラム温度は、好ましくは３０℃以上であり、より好ましくは４０℃以上であり、さらに好ましくは４５℃以上である。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が３０℃未満であると充填剤とＰＣＲ増幅産物との間の疎水性相互作用が弱くなり、所望の分離効果を得ることが難しくなる。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が４５℃未満である場合、メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（メチル化ＤＮＡサンプル）と非メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（非メチル化ＤＮＡサンプル）との保持時間の差が小さい。さらに、カラム温度が６０℃以上では、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間の差がさらに広がり、かつそれぞれのピークもより明瞭になるので、より精度のよいＤＮＡのメチル化の検出が可能になる。
　さらに、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が高くなると、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルとが明瞭に分離されるので、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡの存在比率に従って両者の保持時間のピーク面積またはピーク高さに差異が生じやすくなる。したがって、カラム温度を高くすれば、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間のピークの面積または高さに基づいて、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡそれぞれの存在量や存在比率を測定することがより容易になる。
　一方、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が９０℃以上になると、ＰＣＲ増幅産物中の核酸分子の二本鎖が乖離するため分析上好ましくない。さらに、カラム温度が１００℃以上になると、溶離液の沸騰が生じる恐れがあるため分析上好ましくない。したがって、本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでＰＣＲ増幅産物を分析する際のカラム温度は、３０℃以上９０℃未満であればよく、好ましくは４０℃以上９０℃未満であり、より好ましくは４５℃以上９０℃未満であり、さらに好ましくは５５℃以上９０℃未満であり、さらにより好ましくは５５℃以上８５℃以下であり、なお好ましくは６０℃以上８５℃以下である。
　上記イオン交換クロマトグラフィーカラムへの試料注入量は、特に限定されずカラムのイオン交換容量および試料濃度に応じて適宜調整すればよい。流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎから３．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．５ｍＬ／ｍｉｎから１．５ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。流速が遅くなると分離の向上が期待できるが、遅くなりすぎると分析に長時間を要したり、ピークのブロード化による分離性能の低下を招く恐れがある。逆に流速が早くなると分析時間の短縮という面においてはメリットがあるが、ピークが圧縮されるため分離性能の低下を招く。よって、カラムの性能によって適宜調整されるパラメータではあるが、上記流速の範囲に設定することが望ましい。各サンプルの保持時間は、各サンプルについて予備実験を行うことによって予め決定することができる。送液方法はリニアグラジエント溶出法やステップワイズ溶出法など公知の送液方法を用いることができるが、本発明における送液方法としてはリニアグラジエント溶出法が好ましい。グラジエント（勾配）の大きさは溶出に用いる溶離液を０％から１００％の範囲で、カラムの分離性能および分析対象物（ここではＰＣＲ増幅産物）の特性に合わせ適宜調整すればよい。
　本発明においては、上述した手順で亜硫酸水素塩処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって、サンプルＤＮＡにおけるＤＮＡのメチル化を検出する。
　ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した場合、当該ＤＮＡ中の非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンはシトシンのままである。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅すると、非メチル化シトシン由来のウラシルは、さらにチミンに置き換わるため、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの間で、シトシンとチミンの存在比率に差が生じる。したがって、ＰＣＲ増幅産物中のＤＮＡは、メチル化率に応じた異なる配列を有する。上記ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけると、当該増幅産物中に含まれるＤＮＡの塩基配列に応じて、異なるシグナルを示すクロマトグラムが得られる。
　例えば、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物からの検出シグナルを、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じであるがメチル化していないＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（以下、陰性対照という）からの検出シグナル、またはサンプルＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知（例えば、１００％）であるＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（以下、陽性対照という）からの検出シグナルと比較することにより、サンプルＤＮＡ中におけるメチル化ＤＮＡの存在の有無を測定することができる。
　あるいは、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物からの検出シグナルを、陰性および陽性対照からの検出シグナルと比較することにより、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡの存在量、および非メチル化ＤＮＡとの存在量の比を測定することができる。またあるいは、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知である複数のＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物に由来する複数のＰＣＲ増幅産物（以下、標準という）からの検出シグナルを、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物からの検出シグナルと比較することにより、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡのメチル化率、存在量、および非メチル化ＤＮＡとの存在量の比を測定することができる。
　本発明の方法においては、上記陰性対照、陽性対照または標準の代わりに、上記陰性対照、陽性対照または標準と同じ塩基配列からなる、化学的または遺伝子工学的に合成したＤＮＡを用いてもよい。さらに本発明の方法においては、陰性対照、陽性対照または標準の調製には市販品を用いることもでき、例えばＥｐｉＴｅｃｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＤＮＡ　Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用できる。
　好ましい態様において、本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーにおいては、上記サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物を含む試料と、上記陰性対照もしくは陽性対照、または上記標準の試料とを、個別にイオン交換クロマトグラフィー分析に供する。カラムに吸着した試料を、複数の溶離液を用いてグラジエント溶出させることにより、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物と陰性対照もしくは陽性対照または標準とを、ＤＮＡメチル化率に応じて異なる保持時間で溶出することができる。
　陰性対照からの検出シグナルは、サンプルＤＮＡの代わりに、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じであるがメチル化していないＤＮＡを用いて上述した手順で亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって獲得することができる。陽性対照からの検出シグナルは、サンプルＤＮＡの代わりに、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知（例えば、１００％）であるＤＮＡを用いて上述した手順で亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって獲得することができる。あるいは、上述した合成ＤＮＡや市販のＤＮＡを陰性または陽性対照として、イオン交換クロマトグラフィーにかけることで、陰性または陽性対照からの検出シグナルを得てもよい。
　標準からの検出シグナルは、サンプルＤＮＡの代わりに、サンプルＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知である複数のＤＮＡを用いて上述した手順で亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲを行い、得られた複数のＰＣＲ増幅産物をそれぞれイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって獲得することができる。さらに、得られた各々の検出シグナルから、検量線を作成してもよい。あるいは、上述した合成ＤＮＡや市販のＤＮＡを標準として、イオン交換クロマトグラフィーにかけることで、標準からの検出シグナルを得てもよい。
　次いで、上記クロマトグラフィーで得られたサンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物からの検出シグナルと、陰性もしくは陽性対照、または標準からの検出シグナルとを比較する。両者の検出シグナルの違いに基づいて、サンプルＤＮＡのメチル化を検出することができる。
　例えば、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの保持時間が、陰性対照のピークの保持時間とずれていれば、サンプルＤＮＡがメチル化していると判定できる。さらにこのとき、保持時間のずれが大きいほど、メチル化率がより大きいと推定できる。逆に、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの保持時間が、１００％メチル化陽性対照のピークの保持時間とずれているほど、サンプルＤＮＡのメチル化率はより小さいと推定できる。あるいは、メチル化率が既知の標準から得られた複数のピークの保持時間に基づいて検量線を作成し、この検量線に基づいてサンプルＤＮＡのメチル化率を決定することができる（図１および２参照）。
　上記検量線により、ＤＮＡメチル化率と保持時間とを関連づけることができる。したがって、該検量線に基づいて、基準保持時間に対応するＤＮＡメチル化率（以下、基準ＤＮＡメチル化率ともいう）を求めることができる。基準ＤＮＡメチル化率を取得しておけば、ＨＰＬＣの機材や分析条件を変更した場合であっても、該変更された機材や条件下で新たに作成した検量線に該基準ＤＮＡメチル化率をあてはめることによって、新しい基準保持時間を容易に算出することができる。
　また例えば、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの高さまたはピーク面積を、メチル化ＤＮＡのメチル化率および混合比が既知のＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの高さまたはピーク面積と比較することによって、サンプルＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡの存在比率（例えば非メチル化ＤＮＡの存在比率や、特定の割合でメチル化されたＤＮＡの存在比率など）を決定することができる。
　本発明の方法において、クロマトグラフィーによる検出シグナルのピークの有無を判定する方法としては、既存のデータ処理ソフトウェア、例えばＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ（島津製作所）、ＧＲＡＭＳ／ＡＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｉｇｏｒ　Ｐｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社）などを用いたピーク検出が挙げられる。ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎを用いたピークの有無の判定方法を例示すると、具体的には、まずピークを検出させたい保持時間の区間を指定する。次に、ノイズなど不要なピークを除去するために、各種パラメータを設定する。例えば、パラメータ「ＷＩＤＴＨ」を不要なピークの半値幅よりも大きくする、パラメータ「ＳＬＯＰＥ」を不要なピークの立ち上り傾斜より大きくする、パラメータ「ＤＲＩＦＴ」の設定を変えることにより分離度の低いピークを垂直分割するかベースライン分割するか選択する、などが挙げられる。パラメータの値は、分析条件、選択した遺伝子マーカーの種類、検体の量などにより、異なるクロマトグラムが得られるため、クロマトグラムに応じて適切な値を設定すればよい。
　保持時間、すなわちピークトップの時間は、上記のデータ処理ソフトウェアで自動的に計算することができる。例えば、クロマトグラムを一次微分し、微分係数が正から負へ変化する時間をピークトップの時間として取得することができる。
　本発明の方法においては、クロマトグラフィーによる検出シグナルの保持時間について調べる。その結果が、基準保持時間より早い保持時間に検出シグナルが得られる場合に、当該試料を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた試料であると判定する。図３Ａ、Ｂに示すように、高メチル化率ＤＮＡのピークと低メチル化率ＤＮＡのピークとの分離がよく、二峰化する場合には、ピークの分離によって非メチル化ＤＮＡの影響を除去でき、予後不良の腎細胞癌患者から得られた試料であることが精度よく判定できる。
　さらに、本発明の方法においては、サンプルＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルから、陰性対照から得られた検出シグナルを差し引いた差分データを求めることができる。差分データを求めることにより、サンプルＤＮＡ全体としての検出シグナルから非メチル化ＤＮＡからのシグナル（ノイズ）を除去し、メチル化ＤＮＡからのシグナルのみを抽出することができる。当該差分データは、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡによる検出シグナルに相当する。この差分データの保持時間を基準保持時間と比較する。その結果が、基準保持時間より早い場合、当該試料を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた試料であると判定する。当該差分データを用いることによって、メチル化ＤＮＡからのシグナル成分が微弱にしか検出されないサンプル、例えば、メチル化ＤＮＡの存在比率の低いサンプルＤＮＡや、メチル化率の低いメチル化ＤＮＡを含むサンプルＤＮＡにおいても、メチル化ＤＮＡの検出や解析が可能になる。また、サンプルＤＮＡ中に様々なメチル化率のＤＮＡが含まれる場合には、肩のあるピークが得られる、複数のピークが重なる、など様々なパターンのクロマトグラムが得られる。そのような場合において、差分データを求めることによって高メチル化率のサンプルＤＮＡのシグナルのみを抽出できることから、高精度に癌予後判定ができる。
　したがって、上記差分データを用いることにより、サンプルＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡに関するより高精度な解析が可能になる。なお差分データを求める際には、サンプルＤＮＡと陰性対照に用いるＤＮＡとのＤＮＡ量を合わせておくことが望ましい。ＤＮＡ量の確認は、吸光度測定等の測定方法により確認すればよい。
　上記差分データを利用する場合の本発明の癌予後判定方法の手順は、基本的には、上述した差分前のデータの場合と同じである。例えば、クロマトグラフィーによる検出シグナルの保持時間について調べ、結果が、基準となる保持時間より早い保持時間に検出シグナルが得られる場合に、当該試料を予後不良の腎細胞癌患者から得られた試料であると判定する。
　本発明の予後判定方法において、上記差分データの利用は非常に有効である。臨床検査のために採取される検体は、ＤＮＡメチル化が進行していない非癌上皮細胞や間質細胞等の正常細胞を含む場合や、またはＤＮＡメチル化がそれほど進行していない前癌状態の細胞を多く含む場合、あるいは様々なＤＮＡメチル化率の癌細胞が様々な割合で存在する場合がある。上記差分データを用いることによって、検体中の正常細胞や前癌細胞中の正常ＤＮＡ、あるいは測定対象とする遺伝子領域がメチル化されていない癌細胞に由来する非メチル化ＤＮＡの影響を除去することができるので、より高精度なメチル化ＤＮＡの検出を行うことができ、さらに当該検出結果を利用すれば、より高精度な癌予後判定を行うことができる。
　本発明の予後判定方法によれば、試料中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを分離検出することができるので、試料が正常細胞を多く含んでいる場合であってもメチル化ＤＮＡの存在およびそのメチル化率を高精度に検出し、正確な予後判定を行うことができる。本発明の方法では、従来の検査では予後不良にもかかわらずＣＩＭＰ陽性と判定されていなかったような被験体についても、正確な予後判定が可能になる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔患者及び組織サンプル〕
　１０９の癌組織（Ｔ）サンプル及び対応する１０７の非癌腎皮質組織（Ｎ）サンプルは、原発性の淡明細胞型腎細胞癌を罹患している１１０人の患者から手術によって摘出された試料から得たものであり、Ｎサンプルには顕著な組織学的変化は認められていない。なお、これら患者は、術前の治療は受けておらず、国立がん研究センター病院にて腎摘出術を受けた患者である。７９名の男性と３１名の女性とからなり、平均年齢は６２．８±１０．３歳（平均±標準偏差、３６～８５歳）である。
　また、サンプルの組織学的診断は、ＷＨＯの分類に従って行った（Ｅｂｌｅ，Ｊ．Ｎ．ら、「腎細胞癌　腫瘍ＷＨＯ分類　病理学及び遺伝学　男性生殖器及び泌尿系の腫瘍」、２００４年、ＩＡＲＣ出版、Ｌｙｏｎ、１０～４３ページ、図１　参照）。
　さらに、全ての腫瘍の組織学的異型度は「Ｆｕｈｒｍａｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９８２年、６巻、６５５～６６３ページ」に記載の基準に従って評価し、ＴＮＭ分類は「Ｓｏｂｉｎ，Ｌ．Ｈ．ら、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）、ＴＮＭ悪性腫瘍の分類、第６版、２００２年、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９３～１９５ページ」に従って分類した。
　また、腎細胞癌の肉眼分類の基準として、肝細胞癌（ＨＣＣ）において確立された基準を採用した（非特許文献４～６　参照）。なお、タイプ３（多結節癒合型）ＨＣＣは、タイプ１（単結節型）及びタイプ２（単結節周囲増殖型）のＨＣＣよりも、組織学的分化度は低く、肝内転移の発生率は高い（Ｋａｎａｉ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、１９８７年、６０巻、８１０～８１９ページ参照）。
　血管侵襲の有無は、へマトキシリン－エオジン及びエラスチカ・ワン・ギーソン染色を施したスライドを顕微鏡にて観察することによって調べた。腎静脈の本幹における腫瘍血栓の有無は肉眼的観察によって調べた。
　今回の研究対象である全ての患者からは、書面によるインフォームドコンセントを得ている。また、本研究は、国立がん研究センターの倫理委員会の承認を受けて実施されたものである。
〔参考例１〕従来法によるＣＩＭＰ陰性／陽性判定
　従来法によるＣＩＭＰ陰性／陽性判定は、特許文献４に記載のＭａｓｓＡＲＲＡＹ法（実施例５）に従って行った。メチル化ＤＮＡ検出方法の１つであるＭａｓｓＡＲＲＡＹ法にて、１７遺伝子（ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６－２）のＣｐＧサイト（表１～４）についてのＤＮＡメチル化レベルを検出した。
　ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法は、亜硫酸水素塩処理後のＤＮＡを増幅し、ＲＮＡに転写し、さらにＲＮＡａｓｅにより塩基特異的に切断した後、質量分析計によって、メチル化ＤＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡ断片との分子量の差を検出する方法である。
　先ず、前記ＣｐＧサイトを含むＣｐＧアイランドに対し、ＥｐｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ用プライマー設計ソフト）を用いてＭａｓｓＡＲＲＡＹのプライマー設計を行った。
　また、ＰＣＲにおけるバイアスの影響を排除するため、１プライマーセット当たり、ＤＮＡポリメラーゼ３種とアニール温度４段階程度の条件との組み合わせを平均して試行し、定量性の良好な至適ＰＣＲ条件を決定した。そして、ＰＣＲ標的配列に含まれ解析対象となる全てのＣｐＧ部位について、採用したＰＣＲ条件で定量性が良好であることを確認し、１０９の腎細胞癌組織サンプルのうち腎細胞癌１０２検体において、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析を実施した。
　まず、前記患者から得た新鮮凍結組織サンプルを、フェノール－クロロホルムにて処理し、次いで透析を施すことによって、高分子量ＤＮＡを抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、モレキュラークローニング：実験マニュアル　第３版、コールドスプリングハーバー出版、ＮＹ、６．１４～６．１５ページ　参照）。そして、ＤＮＡ５００ｎｇを、ＥＺ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ＧｏｌｄＴＭキット（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、亜硫酸水素塩処理に供した。亜硫酸水素塩処理ゲノムＤＮＡをＰＣＲにて増幅して、インビトロ転写反応を行った。次いで、得られたＲＮＡをＲＮＡａｓｅによりウラシルの部位で特異的に切断し、各サンプルのゲノムＤＮＡのメチル化の有無に応じた長さの異なる断片を生成した。そして、得られたＲＮＡ断片を、一塩基の質量の差異を検出できるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＡＳ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　４）にかけ、質量分析を行った。得られた質量分析結果を、解析ソフトウェア（ＥｐｉＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製）を用いて、リファレンス配列にアラインメントし、メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片との質量の比から、メチル化レベルを算出した。本解析に用いたプライマーの配列と該プライマーのセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の配列を、表５及び６ならびに配列表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＭａｓｓＡＲＲＡＹの解析対象とした全ての領域に関し、前記ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することによって、予後不良の腎細胞癌（ＣＩＭＰ陽性群：１４検体）と、予後が良好である腎細胞癌（ＣＩＭＰ陰性群：８８検体）とを判別した。
〔参考例２〕アニオン交換カラムの調製
　攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２０００ｍＬに、テトラエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、グリシジルメタクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇおよび過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、強カチオン性基を有する親水性単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製）１００ｇをイオン交換水に溶解した。これを同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水およびアセトンで洗浄することにより、４級アンモニウム基を有する親水性重合体の層を表面に有する被覆重合体粒子を得た。得られた被覆重合体粒子について、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定したところ、平均粒子径は１０μｍであった。
　得られた被覆重合体粒子１０ｇをイオン交換水１００ｍＬに分散させ、反応前スラリーを準備した。次いで、このスラリーを撹拌しながら、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアミン（和光純薬工業社製）を１０ｍＬ加え、７０℃で４時間反応させた。反応終了後、遠心分離機（日立製作所社製、「Ｈｉｍａｃ　ＣＲ２０Ｇ」）を用いて上澄みを除去し、イオン交換水で洗浄した。洗浄後、遠心分離機を用いて上澄みを除去した。このイオン交換水による洗浄を更に４回繰り返し、基材粒子の表面に４級アンモニウム基と３級アミノ基とを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。
　上記イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのステンレス製カラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填した。
〔参考例３〕イオン交換クロマトグラフィーによるメチル化ＤＮＡの検出
（１）ゲノムＤＮＡの抽出と亜硫酸水素塩処理
　患者から得た新鮮凍結組織サンプルを、フェノール－クロロホルムにて処理し、次いで透析を施すことによって、高分子量ＤＮＡを抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、モレキュラークローニング：実験マニュアル　第３版、コールドスプリングハーバー出版、ＮＹ、６．１４～６．１５ページ　参照）。ＤＮＡ５００ｎｇを、ＥＺ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ＧｏｌｄＴＭキット（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、亜硫酸水素塩処理に供した。
（２）ＰＣＲ
　（１）で得られた亜硫酸水素塩処理ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ　１０ｎｇ、ＧｅｎｅＡｍｐ　１×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌ　ＧｅｎｅＡｍｐ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．７５Ｕ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．２５μｍｏｌ／Ｌ　ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーを含んだ２５μＬの反応液で行った。ＰＣＲでは、９５℃５分間初期熱変性を行った後、９４℃３０秒→５９℃（Ｆ３－Ｒ３プライマー使用時）３０秒→７２℃４０秒を１サイクルとして３５サイクル続け、さらに７２℃１０分の伸張反応を行った。ＰＣＲ終了後、予めｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅを添加した３％アガロースゲルに、反応液５μＬにｌｏａｄｉｎｇ　ｄｙｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１μＬを混ぜた後アプライして電気泳動し、ＰＣＲ増幅産物を観察して目的のＰＣＲ増幅産物が得られたことを確認した。各プライマーの配列は、表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（３）ＨＰＬＣ分析
　参考例２で準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でイオン交換クロマトグラフィーを行い、（２）で得られた各ＰＣＲ増幅産物を分離検出した。
　システム：ＬＣ－２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
　溶離液：溶離液Ａ　２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
　　　　　溶離液Ｂ　２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）＋１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム
　分析時間：分析時間は１５分
　溶出法：以下のグラジエント条件により溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させた。
　　　　　０分（溶離液Ｂ４０％）→１０分（溶離液Ｂ１００％）
　検体：（２）で得られたＰＣＲ増幅産物
　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
　検出波長：２６０ｎｍ
　試料注入量：５μＬ
　カラム温度：７０℃
〔実施例１〕ＤＮＡメチル化率によるクロマトグラフィー保持時間の変動
　ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーターにおける、３９個のＣｐＧサイトを有する３８４ｂｐ領域のＤＮＡ配列に基づいて、３９個のＣｐＧサイト全てがメチル化されているＤＮＡ（１００％メチル化ＤＮＡ）から全くメチル化されていないＤＮＡ（０％メチル化ＤＮＡ）まで、メチル化率の異なる８つのＤＮＡを合成した。なお５０％メチル化ＤＮＡについては、メチル化位置を５'側寄り、３’側寄り、および中央寄りの３パターンのＤＮＡを合成した。各合成ＤＮＡのメチル化率およびＣｐＧアイランドのメチル化数を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記８つの合成ＤＮＡを、参考例３の手順に従って亜硫酸水素塩処理、ＰＣＲ、およびＨＰＬＣにかけた。合成ＤＮＡ　Ｎｏ．１（１００％メチル化）、Ｎｏ．２（０％メチル化）、Ｎｏ．３（２５％メチル化）、Ｎｏ．４（５０％メチル化）およびＮｏ．５（７５％メチル化）についてのＨＰＬＣのクロマトグラムを図１に示す。ＤＮＡメチル化率に従って保持時間の短縮が見られた。さらに、８つのＤＮＡについて、メチル化率に対してＨＰＬＣの保持時間をプロットしたデータを図２に示す。ＨＰＬＣの保持時間は、ＤＮＡメチル化率に対して極めて高い相関を示した。さらに、５０％メチル化ＤＮＡについては、メチル化位置に依らず、ほぼ同一の保持時間を示すことが確認された。このことから、ＤＮＡ中のメチル化位置に依らず、メチル化率に依存して保持時間が決定されることが示された。したがって、ＨＰＬＣの保持時間を測定することにより、サンプルＤＮＡに含まれるメチル化率を測定することができる。
〔実施例２〕腎細胞癌におけるＤＮＡメチル化解析と予後判定
　参考例１でＣＩＭＰ判定された腎細胞癌のうち、患者１３人からのＣＩＭＰ陽性腎細胞癌と、５人からのＣＩＭＰ陰性腎細胞癌からゲノムＤＮＡを調製した。参考例３（１）～（３）の手順に従って、該ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理、ＰＣＲ、およびＨＰＬＣにかけた。ＰＣＲでは、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーターにおける、３８４ｂｐ領域を増幅した。
　さらに、上記ＰＣＲ増幅領域におけるメチル化率が０％（陰性対照）および１００％（陽性対照）のＤＮＡについても、それぞれ同様の手順でＨＰＬＣ分析した。
　ＣＩＭＰ陽性およびＣＩＭＰ陰性試料から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示す。図３には、非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）および１００％メチル化ＤＮＡ（陽性対照）のクロマトグラムも表示されている。図３Ａ，ＢはＣＩＭＰ陽性試料のクロマトグラムであり、非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）のピークと保持時間の異なるピークが明瞭に出現しており、メチル化ＤＮＡの存在を表している。図３ＣはＣＩＭＰ陰性試料のクロマトグラムであり、そのピークは非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）のピークと保持時間においてほとんど区別できず、メチル化ＤＮＡがほぼ存在しないことを示している。図３Ｄは、ＣＩＭＰ陰性試料のクロマトグラムであるが、非メチル化ＤＮＡ（陰性対照）のピークと保持時間の異なるピークが明瞭に出現しており、メチル化ＤＮＡの存在を表している。すなわち、ＣＩＭＰ陰性と判定されていても予後不良の検体である可能性を示唆している。
　図４は、本実施例で調べた１８個のＣＩＭＰ陰性／陽性試料全てについて、ＨＰＬＣクロマトグラムのピークの保持時間をプロットした図である。ＣＩＭＰ陰性試料と陽性試料は、保持時間の分布が明らかに異なっていることから、本発明の方法により、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法で判定された癌のＣＩＭＰを、本発明の方法によっても正確に判断できることが明らかにされた。
　本実施例にて用いたＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター３８４ｂｐ領域においては、図４に示されるように保持時間９．３ｍｉｎ付近でＣＩＭＰ陽性群とＣＩＭＰ陰性群とが分かれていることから、保持時間９．３ｍｉｎ付近を基準となる保持時間に設定できる。すなわち、基準となる保持時間（基準保持時間）より早い保持時間に検出シグナルを有する検体は、予後不良であると判定できる。前述の基準保持時間は、ＨＰＬＣの分析条件、ゲノムＤＮＡの領域、あるいは遺伝子マーカーの種類等によってクロマトグラムが変化するので、適切な基準保持時間を設定すればよい。また、必要とされる臨床感度も考慮し、基準保持時間を設定するのが好ましい。
　本実施例においては、陽性対照（ＤＮＡメチル化率１００％）の保持時間が約９．０分および陰性対照（ＤＮＡメチル化率０％）の保持時間が約９．３５分であったことから、基準保持時間をもたらす基準ＤＮＡメチル化率は約１７％と計算された。したがって、本実施例にて用いたＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター３８４ｂｐ領域において、上記基準ＤＮＡメチル化率（約１７％）より高いＤＮＡメチル化率を有する検体は、予後不良であることが示された。
　ＭａｓｓＡＲＲＡＹで得られたＤＮＡメチル化率の平均値と、本発明で得られたＤＮＡメチル化率とを比較する。本発明で得られた検出シグナルが図３Ａ，Ｂのような二峰化したピークについて、保持時間（溶出が早いほうの保持時間をａ、遅いほうの保持時間をｂとする）から算出されるＤＮＡメチル化率をプロットし、ＭａｓｓＡＲＲＡＹで得られたＤＮＡメチル化率と比較したものを、図５Ａに示す。図５Ａにおいては、それぞれの方法により得られたＤＮＡメチル化率は相関しているように見えない。しかしながら、保持時間ａと保持時間ｂの平均より算出した合成ピークＣ（保持時間ｃ）から得られるＤＮＡメチル化率をプロットし、同様にＭａｓｓＡＲＲＡＹで得られたＤＮＡメチル化率と比較したものを、図５Ｂに示す。図５Ｂに示されるように、合成ピークＣから算出されるＤＮＡメチル化率は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法で得られたＤＮＡメチル化率の平均値と良好に相関する。
　本発明によれば、例えば３０％メチル化ＤＮＡと７０％メチル化ＤＮＡが等量混合された試料と、すべて５０％メチル化ＤＮＡである試料とが、明確にクロマトグラム上で判別できる。それに対し、上記の例においては、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法ではいずれの試料も平均値として５０％メチル化ＤＮＡという情報しか得られない。本発明によれば、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法とは異なり、試料中に含まれる様々なＤＮＡメチル化率のシグナルを分離して検出できることから、平均化されていないＤＮＡメチル化率を得ることができる。
　ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、パイロシークエンシング等の方法で得られるＤＮＡメチル化率の値は、測定に供した試料全体の平均値としてのＤＮＡメチル化率が得られるため、結果として、高度にメチル化されたＤＮＡを有する細胞の有無を判定することができないという問題点があった。本発明によれば、ＣＩＭＰ陰性と判定されていても、非メチル化ＤＮＡの影響を除去し、高メチル化ＤＮＡを含むか否かを検出できることから、ＤＮＡメチル化率を低く見積もるリスクが避けられる。さらには、予後不良の疑いのある検体を判定できる。
　特許文献４に記載の方法によるＣＩＭＰ判定は、複数の遺伝子マーカーのＣｐＧアイランドを対象にＣｐＧサイトのメチル化を調べてＣＩＭＰ陽性またはＣＩＭＰ陰性を判定していた。本発明によれば、単独の遺伝子マーカーであっても、ＨＰＬＣより得られた検出シグナルを解析することによって、ＣＩＭＰ判定と同等の腎細胞癌の予後判定が容易にできる可能性が示唆された。さらに、複数の遺伝子マーカーについてＨＰＬＣによる検出シグナルを解析することによって、予後判定を高精度化できる可能性が示唆された。

Claims (15)

  1. 　腎細胞癌を含む組織の判定方法であって：
    　（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
    　（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
    　（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
    　（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
    　（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該組織を、予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であると判定する工程、
    を含む方法。
  2. 　前記工程（２）において、ＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６－２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドを含む、請求項１記載の方法。
  3. 　前記工程（２）においてＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター領域を含む、請求項１記載の方法。
  4. 　前記工程（２）のＰＣＲにおいて、配列番号５１及び５２で示されるＰＣＲプライマーが使用される、請求項１記載の方法。
  5. 　前記工程（４）の前に、さらに以下の工程：
    　（１’）前記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
    　（２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
    　（３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
    　（３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程、
    を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　腎細胞癌患者の予後判定方法であって：
    　（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
    　（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
    　（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
    　（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
    　（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早い場合に、該被験体の腎細胞癌を予後不良と判定する工程、
    を含む方法。
  7. 　前記工程（２）において、ＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６－２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドを含む、請求項６記載の方法。
  8. 　前記工程（２）においてＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター領域を含む、請求項６記載の方法。
  9. 　前記工程（２）のＰＣＲにおいて、配列番号５１及び５２で示されるＰＣＲプライマーが使用される、請求項６記載の方法。
  10. 　前記工程（４）の前に、さらに以下の工程：
    　（１’）前記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
    　（２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
    　（３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
    　（３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程、
    を含む、請求項６～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　腎細胞癌を含む組織を判定するためのデータを得る方法であって：
    　（１）被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
    　（２）該亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
    　（３）得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
    　（４）該クロマトグラフィーで得られた検出シグナルの保持時間を得る工程；
    　（５）工程（４）の結果が基準となる保持時間より早いか否かを、該組織が予後不良の腎細胞癌患者から得られた腎細胞癌を含む組織であるか否かを判定するためのデータとして取得する工程、
    を含む方法。
  12. 　前記工程（２）において、ＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６－２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子におけるＣｐＧアイランドを含む、請求項１１記載の方法。
  13. 　前記工程（２）においてＰＣＲ増幅されるＤＮＡが、ＦＡＭ１５０Ａ遺伝子プロモーター領域を含む、請求項１１記載の方法。
  14. 　前記工程（２）のＰＣＲにおいて、配列番号５１及び５２で示されるＰＣＲプライマーが使用される、請求項１１記載の方法。
  15. 　前記工程（４）の前に、さらに以下の工程：
    　（１’）前記被験体の腎臓組織から調製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅領域に相当するメチル化していないＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
    　（２’）工程（１’）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
    　（３’）工程（２’）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかける工程；
    　（３ａ）工程（３）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルから、工程（３’）のクロマトグラフィーで得られた検出シグナルを差し引いて差分データを得る工程、
    を含む、請求項１１～１４のいずれか１項記載の方法。
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