WO2015100736A1

WO2015100736A1 - 一种对癌症患者进行术后监控的微创方法

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Publication number: WO2015100736A1
Application number: PCT/CN2014/070118
Authority: WO
Inventors: 朱家楼; 赵鑫
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2014-01-03
Filing date: 2014-01-03
Publication date: 2015-07-09
Anticipated expiration: 2016-07-03
Also published as: CN105849282A

Abstract

本发明公开了确定生物标志物及对癌症患者进行术后监控的方法，其中该生物标志物与癌症相关，该确定生物标志物的方法包括：针对同一癌症患者的癌组织和癌旁组织分别构建测序文库；对癌组织文库和癌旁组织文库进行测序；将所述癌组织测序结果和癌旁组织测序结果与人参考基因组序列进行比对；基于所述癌组织比对结果和所述癌旁组织比对结果，确定所述癌症患者的体细胞结构变异；以及从所述癌症患者的体细胞结构变异中筛选断点支持数不小于5的染色体内易位（ITX）和染色体间易位（CTX），作为所述癌症患者的生物标志物。该生物标志物可用于癌症患者的术后监控。

Description

一种对癌症患者进行术后监控的微创方法

优先权信息

无技术领域

本发明涉及确定生物标志物的方法，以及对癌症患者进行术后监控的方法。背景技术

20世纪 70年代以来，我国癌症发病及死亡率一直呈上升趋势，至 90年代的 20年间，癌症死亡率上升 29.42%，年龄调整死亡率上升 11.56%。 2000年癌症发病人数约 180-200万，死亡 140-150万。恶性肿瘤发病率全国 35岁至 39岁年龄段为 87.07/10万， 40岁至 44岁年龄段几乎翻番，达到 154.53/10万； 50岁以上人群发病占全部发病的 80%以上， 60岁以上癌症发病率超过 1%， 80岁达到高峰。全国肿瘤死亡率为 180.54/10万，每年因癌症死亡病例达 270万例。我国居民因癌症死亡的几率是 13%。癌症不仅严重影响劳动人民的健康，而且成为医疗费用上涨的重要因素。据有关部门估算，我国每年用于癌症病人的医疗费用达数百亿元。

癌症的治疗经常涉及评估对治疗的响应以及监测疾病的复发。此外，在临床上对癌症进行根治性手术治疗和辅助化疗之后，会对患者进行治疗后的监测，目的在于评估可能发生的治疗副作用；发现有切除治愈可能的复发灶，在新的异时性肿瘤未发生浸润时将其诊断出来。目前国内外临床治疗指南采用的监控方法主要以 CT或 MRI及 PET扫描为主，蛋白生物标记为辅。例如，在包括结肠癌在内的多种疾病中常用 CT扫描来监测癌症的复发，然而扫描分辨率（病灶 ^ lcm) 限制了病灶的早期发现及复发后跟踪的及时性，且伴随辐射风险。同样，蛋白质生物标记，如 PSA和 CEA，仅适用于追踪前列腺癌和胃肠道癌的血液生物标记，但其灵敏度和检出度相对不高，且需要持续很久的动态的监控节点才能进行临床指征判断。针对有特定基因重排的疾病，例如慢性髓性白血病（CML), 急性淋巴细胞白血病（ALL)等血液类癌症，其部分患者中存在 BCR-ABL易位，该标记物也成为疾病状态评估的生物标记之一。目前临床上多用 PCR技术来检验。遗憾的是，大多数 ALL患者不存在这类可灵敏且特异地检测复发的标记物。流式细胞术（FCM) 可用于检测最小残留疾病 (MRD), 因此对于癌症的预后监控是有用的。在这种使用荧光激活细胞分选 (FACS)的技术中，可借助于癌细胞具有的特定细胞表面标记物来鉴定癌细胞。该技术的灵敏度局限在< 10-⁴, 即 10,000个正常细胞中有 1个癌细胞)，并且在某一时间点出现的标记物稍后可能会消失，且操作繁琐价格昂贵并不适合于临床上癌症的术后跟踪和监控术后的早期复发。

因而，目前的确定癌症相关生物标志物以及对癌症患者进行术后监控的方法仍有待改进。发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

发明人发现，随着第二代测序技术的发展，基于基因组变异检测外周血样本的测序技术已经应用于产前诊断等临床层面；而在血液学恶性肿瘤中，高度复发的体细胞结构变异已被证实是有效的分子诊断标记物，包括 BCR-ABL原癌基因、免疫球蛋白基因、 T细胞受体基因、维甲酸受体 α基因等，基于实时定量 PCR的分析方法可以定量检测外周血中游离癌细胞的目标基因重排，这些分子诊断标记物可用于实时监控治疗后肿瘤发展情况，检测手术后肿瘤残余量，以及长期的临床管理等。

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有微创性、实时性、灵敏度高、方便快捷的癌症治疗后的监控技术。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种确定生物标志物的方法，所述生物标志物与癌症相关。根据本发明的实施例，该方法包括：针对同一癌症患者的癌组织和癌旁组织分别构建测序文库，以便获得癌组织文库和癌旁组织文库；对所述癌组织文库和所述癌旁组织文库进行测序，以便分别获得癌组织测序结果和癌旁组织测序结果；将所述癌组织测序结果和癌旁组织测序结果与人参考基因组序列进行比对，以便分别获得癌组织比对结果和癌旁组织比对结果；基于所述癌组织比对结果和所述癌旁组织比对结果，确定所述癌症患者的体细胞结构变异（Somatic Structure Variation); 以及从所述癌症患者的体细胞结构变异中筛选断点支持数不小于 5 的染色体内易位（ITX) 和染色体间易位（CTX)，作为所述癌症患者的生物标志物。

需要说明的是，本文中所使用的术语 "断点"是指发生结构变异的位置。本文中所使用的表达方式 "断电支持数 "是指支持断点真实存在的测序序列的条数。其中，断点支持数越大，得到的结果越准确。根据本发明的实施例，所采用的断点数为 5及以上，由此可以获得较高准确度的结果。

发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够有效确定癌症患者特有的基因组结构变异，即生物标志物，该生物标志物灵敏度和检出度高，进而该生物标志物能够有效用于癌症患者的术后监控，例如通过荧光定量 PCR技术等对该癌症患者在手术前后各个时间段进行该生物标志物的含量检测，能够有效地实现对该癌症患者的癌症预后情况的监控，以便评估可能发生的治疗副作用，发现有切除治愈可能的复发灶，以及在新的异时性肿瘤未发生浸润时将其诊断出来，这对于后续临床应用意义重大。

另外，根据本发明实施例的确定生物标志物的方法还可以具有如下附加的技术特征：根据本发明的实施例，通过以下步骤构建所述测序文库：提取所述同一癌症患者的癌组织或癌旁组织的基因组 DNA; 将所述基因组 DNA进行片段化，以便获得 DNA片段；将所述 DNA片段依次进行末端修复和 3'末端添加碱基 "A"，以便获得经过末端修复和 3'末端添加碱基 "A"的 DNA片段；将所述经过末端修复和 3'末端添加碱基 "A"的 DNA片段与接头相连，以便获得接头连接产物；对所述接头连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；将所述目的片段进行 PCR扩增，以便获得扩增产物；以及将所述扩增产物进行纯化回收，以便获得纯化产物，所述纯化产物构成所述测序文库。

根据本发明的实施例，利用琼脂糖凝胶电泳进行所述片段选择，所述目的片段为 500bp。根据本发明的实施例，利用选自 ABI3730xl、 Hiseq2000、 SOLID 454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。由此，获得的测序结果准确，有利于后续步骤的进行，从而有利于确定生物标志物的结果的准确性。

根据本发明的实施例，将所述癌组织测序结果和癌旁组织测序结果与人参考基因组进行比对，包括：利用 BWA软件，将所述癌组织测序结果和癌旁组织测序结果与人参考基因组进行比对，并且选择唯一比对序列作为第一癌组织比对结果和第一癌旁组织比对结果，其中最多允许 3个错配（mismatch); 以及将所述第一癌组织比对结果和所述第一癌旁组织比对结果，分别依次进行 samtools软件去重和 GATK软件局部重新比对处理，以便分别获得癌组织比对结果和癌旁组织比对结果。由此，能够有效获得比对结果，且所述比对结果准确性好，可靠度高，从而能够有效用于后续步骤。

根据本发明的实施例，基于所述癌组织比对结果和所述癌旁组织比对结果，确定所述癌症患者的 somatic SV (在本文中 somatic SV、 Somatic Structure Variation和体细胞结构变异可以互换使用）包括：利用 CREST软件分别确定癌组织中的体细胞结构变异，以及癌旁组织中的体细胞结构变异；将所述癌组织中的体细胞结构变异和所述癌旁组织中的体细胞结构变异进行比较，以便确定所述癌症患者的体细胞结构变异，其中，所述癌症患者的体细胞结构变异为所述癌旁组织中不存在但所述癌组织中存在的体细胞结构变异。根据本发明的实施例，进一步包括：将所述癌症患者的 somatic SV进行断点支持数过滤处理，过滤条件为保留断点支持数大于等于 5的 somatic SV。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种对癌症患者进行术后监控的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：根据前面所述的方法，确定所述癌症患者的生物标志物；确定用于扩增所述生物标志物的 QPCR 引物；提供所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA; 利用所述 QPCR引物，将所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA分别进行 QPCR 反应，以便确定所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量；以及基于所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，确定所述癌症患者术后的病情发展情况。

发明人惊奇地发现，利用该方法能够有效地实现对该癌症患者的癌症预后情况的监控，实时监控治疗后肿瘤发展情况，检测手术后的肿瘤残余量，发现有切除治愈可能的复发灶，以及在新的异时性肿瘤未发生浸润时将其诊断出来，或者依据监控结果能够有效评估可能发生的治疗副作用以及指导长期的临床管理，为提早预防癌症的复发和转移提供临床诊疗依据。并且，本发明的对癌症患者进行术后监控的方法具有微创性、实时性、灵敏度高、方便快捷的特点，具有潜在的临床应用价值。

另外，根据本发明实施例的对癌症患者进行术后监控的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，是以癌组织 DNA为相对内参计算获得的相对含量。由此，获得的生物标志物的含量结果更可靠，有利于后续对癌症患者手术前后的外周血游离 DNA中生物标志物的含量进行比较，从而能够有效确定所述癌症患者术后的病情发展情况。

根据本发明的实施例，所述癌症患者术后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，低于所述癌症患者术前的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，为所述癌症患者的病情控制良好的指示；反之，所述癌症患者术后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，与所述癌症患者术前的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量相当或高于所述癌症患者术前的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，为所述癌症患者的病情复发的指示。

需要说明的是，临床上，肿瘤患者（在本文中指癌症患者）的 ctDNA主要来源于肿瘤细胞释放或者裂解，其浓度平均可达 180ng/ml，是正常人的 20倍以上，因此通过检测外周血 ctDNA的突变及其含量变化，可以获知该患者在不同治疗时期的巨大差异，因此，采集治疗后不同时间段癌症患者的外周血可以实时监控患者病程进展，为提早预防癌症的复发和转移提供临床诊疗依据。相对于传统的癌症术后监控方法，本发明的方法具有如下优势:

1 ) 微创性，只需患者提供外周血血浆样本和唾液样本即可；

2) 高灵敏度，不受限制于病灶大小；

3) 高度特异性，本发明所采用的生物标志物是针对个人的特异的生物标志物；

4) 数字化监控，本发明能够给出患者个人生物标志物的定量变化结果；

5) 方便快捷，一旦经过高通量测序技术找到了可用的生物标志物，后续分析可在一天内完成，并且大多数分子病理学实验室都可以胜任。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明

本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图 1显示了根据本发明一个实施例的确定生物标志物的方法的流程示意图；

图 2显示了根据本发明一个实施例， SV-P6在患者外周血 ctDNA中的相对含量检测结果；以及

图 3显示了根据本发明一个实施例， SV-P7在患者外周血 ctDNA中的相对含量检测结果。发明详细描述

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。所述实施例的示例在附图中示出。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自 Illumina公司。

一般方法：

参照图 1，根据本发明实施例的确定生物标志物的方法，一般包括以下步骤：

S100: 构建癌组织文库和癌旁组织文库

首先，针对同一癌症患者的癌组织和癌旁组织分别构建测序文库，以便获得癌组织文库和癌旁组织文库。

S200: 对癌组织文库和癌旁组织文库进行测序

其次，对所述癌组织文库和所述癌旁组织文库进行测序，以便分别获得癌组织测序结果和癌旁组织测序结果。

S300: 将癌组织测序结果和癌旁组织测序结果与人参考基因组序列进行比对

接着，将所述癌组织测序结果和癌旁组织测序结果与人参考基因组序列进行比对，以便分别获得癌组织比对结果和癌旁组织比对结果。

S400: 确定所述癌症患者的 somatic SV

接下来，基于所述癌组织比对结果和所述癌旁组织比对结果，确定所述癌症患者的体细胞结构变异。

S500: 确定癌症患者的生物标志物

然后，从所述癌症患者的 somatic SV中筛选断点支持数不小于 5的染色体内易位（ITX) 和染色体间易位（CTX), 作为所述癌症患者的生物标志物。实施例 1 :

本实施例以一结直肠癌患者为研究对象，进行如下技术操作，以便确定所述患者的生物标志物：

(一）文库建立及测序

按照以下步骤，分别针对手术后获得的上述结直肠癌病人的癌组织及癌旁组织，进行测序文库构建：

1、基因组 DNA的提取：

将组织样本用研杵碾压至粉末状后转移到 1.5mL离心管中，加入 300uL的 ATL buffer, 盖紧盖子上下颠倒摇匀。

1 ) 加入 30uL蛋白酶 K，涡旋 15s。

2) 56°C恒温孵育 5h至组织样品完全溶解。

3 ) 加入 300uL AL buffer, 涡旋 15s。

4) 加入 300uL预冷的无水乙醇，涡旋 15s，室温静置 5min。

5 ) 将上述溶液转移至洗脱柱中， 8000rpm离心 lmin，将洗脱柱置于一个新的 2mL收集管中，弃掉离心后的废液和收集管。

6) 向洗脱柱中加入 600uL的 AW1 buffer, 8000rpm离心 lrnin, 将洗脱柱置于一个新的 2mL收集管中，弃掉离心后的废液和收集管。

7 ) 向洗脱柱中加入 600uL的 AW2 buffer, 8000rpm离心 lrnin, 将洗脱柱置于一个新的 2mL收集管中，弃掉离心后的废液和收集管。

8 ) 14000rpm空甩 3min，将洗脱柱置于新的 1.5mL离心管中，开盖室温晾 3min。

9) 加入 lOOuL ddH₂0溶解 DNA，静置 10min， 14000rpm离心 lrnin收集洗脱液。

10) 1%琼脂糖凝胶电泳以及 Qubit dsDNA BR Assay Kit检测。

2、文库的构建：

1 ) 打断：采用 Covaris S2将基因组 DNA随机打断为约 500bp片段并纯化，其中打断时间 38s/cycle，进行 5个 cycle。

2) 末端修复：在 1.5ml的离心管中配制末端修复反应体系如下：

20°C温浴 30min。用 QIAquick PCR Purification Kit 回收纯化反应体系中的 DNA，用个离心纯化柱进行纯化，溶于 34 μ 1的 ΕΒ 中。

3 ) 末端加 "Α": 在 1.5 ml的离心管中配制末端加 "A"反应体系如下：

37°C温浴 30 min。用 MiniElute PCR Purification Kit 回收纯化反应体系中的 DNA，用个离心纯化柱进行纯化，溶于 12 μ 1的 ΕΒ 中。

4) 接头的连接：在 1.5 ml的离心管中配制接头连接反应体系如下：

末端加 A纯化后的样品 10 L

2x Rapid连接缓冲液 25 L

HS-PEIA (标签街头寡核苷酸混合物 10 L 0.02nmol/ul)

T4 DNA连接酶（Rapid, L603-HC-L) 5 L 总体积 50 L 20°C温浴 15 min。用 QIAquick PCR纯化试剂盒回收纯化反应体系中的 DNA，用一个离心纯化柱进行纯化，溶于 30 μ 1的 ΕΒ中。

5 ) DNA片段大小的选取：将上步产物用胶浓度为 2%的回收胶进行电泳，电压 100V, 时间 120min，使用 NEB 50bp Ladder。结束后选择 500bp位置进行切胶回收。

6) PCR反应：在 0.2 ml的 PCR管中配制 PCR 反应体系如下：

PCR反应条件如下:

PCR反应结束后，用胶浓度为 2%的回收胶进行电泳，电压 100V, 时间 120min，使用 NEB 50bp Ladder 结束后选择 500bp位置进行切胶回收。用 QIAquick Gel Extraction Kit进行胶纯化回收，回收连接产物并溶于含 0.1% Tween-20 的 Elution Buffer中。

3、在 illumina Hiseq 2000系统中进行 PE101测序。

(二）全基因组测序下机数据分析：

1 ) 去除原始数据中的杂质数据：原始序列含有少量低质量序列以及各种杂质成分，通过软件参数调整，去除 3'接头（有的序列含有 3'接头，需要将 3'接头去掉）；去除低质量 Tag (含有未知碱基 N的 tag )；获得可分析数据；

2) 使用 Burrows-Wheeler Alignment Tools (BWA软件）进行比对，设定最大 mismatch 为 3;

3 )比对后的 bam结果经过 samtools软件去重以及 GATK软件局部重新比对后生成 bam 结果；

4) 使用 CREST软件分别分析癌组织和癌旁组织的 bam结果：先分别确定癌组织中的体细胞结构变异，以及癌旁组织中的体细胞结构变异，然后对癌组织中的体细胞结构变异和癌旁组织中的体细胞结构变异进行比较，以便确定所述癌症患者的体细胞结构变异，其中，所述癌症患者的体细胞结构变异为所述癌旁组织中不存在但所述癌组织中存在的体细胞结构变异。之后得到患者 somatic SV列表，参数均为默认参数。

5) 根据患者 somatic SV列表，筛选断点支持数不小于 5的染色体内易位（ITX) 和染色体间易位 (CTX)，作为该患者的生物标志物，确定该患者的生物标志物为 SV-P6和 SV-P7, 其具体位置和用于该生物标志物的 QPCR扩增的引物序列信息详见下表:

引物 SV-P6 SV-P7

区域上游调控区内含子

基因 MRPL45 XYLT1

断点左边片段所在的染色体 chrl7 chrl6

断点左边片段右端点在原来染色 36452933 17544401

体上的位置

断点左边片段的正负链（和参考 - +

序列一致为正链）

包含断点左边片段右端点且能够 3 5

比对上的测序序列个数

断点右边片段所在的染色体 chrl7 chrl9

断点右边片段左端点在原来染色 36455819 22905406

体上的位置

断点右边片段的正负链（和参考序 + +

列一致为正链）

包含断点右边片段左端点且能够 9 0

比对上的测序序列个数

SV类型 ITX CTX

断点左边片段右端点的深度 34 61

断点右边片段左端点的深度 47 10

断点左边片段的组装长度 71 29

断点右边片段的组装长度 63 0

断点左边片段的一致性 0.902727273 0.949375 断点左边片段非唯一比对的测序 0.163636364 0.03125

序列比例

断点右边片段的一致性 0.941315789 0.933636364 断点右边片段非唯一比对的测序 0.078947368 0.272727273

序列比例

融合片段的左端点在融合片段上 1 1

的位置（第一个碱基坐标为 1 ) (start position of consensus mapping

to genome)

融合片段的左端点在基因组上的 chrl7 chrl6

染色体 ( starting chromosome of

consensus mapping to genome)

融合片段的左端点在基因组上的 36453004 17544331

位置

融合片段的右端点在融合片段上 168 100

的位置

融合片段的右端点在基因组上的 chrl7 chrl9

染色体

融合片段的右端点在基因组上的 36455914 22905434

位置

CGTGCTCGCGGG CATGGAAGTGGGA

AGTGGGGGAGGG AAGGACACGTGGG

TGGAGTAAGGAG TCACACACACGGCT

GGCGGAGTACGG GGAAGAAGAGACA

CCGCGCGTGCGC TGTGCATGCAGGGC

AGGGAGACAACG ACAGCAATATGTCA

局部组装得到的融合片段，由左右

CAGCCTCCTGAG CCCTGTGTACAGGG

两个片段组成（即两个片段的融

TAGCTGGGATTAC CTCAG

合）

AGGCATGTGCCA

CCATGCCCGGCTA

ATTTTGTATTTTTA

GTAGAGATGTGG

TTTCTCCATGTTG

GTCTGTT

实施例 2

利用实施例 1中筛选获得的生物标志物，以癌组织 DNA作为相对内参，检测患者各个阶段（A\B\C\D，其中， A: 患者手术前外周血 ctDNA; B: 手术后 7天外周血 ctDNA; C: 手术后 1个月外周血 ctDNA; D:手术后 10个月外周血 ctDNA)的外周血血浆游离 DNA (即 ctDNA) 中生物标志物的含量，以便确定该患者手术前后的肿瘤发展情况，具体步骤如下： 1、外周血血浆游离 DNA提取

使用 TIANamp Micro DNA Kit试剂盒，分别提取该患者 A\B\C\D各个阶段的外周血血浆游离 DNA，具体操作步骤如下： 1 ) 取 200 μΐ血浆到 2ml的离心管中，加入 20 μΐ Proteinase K溶液，涡旋混匀；

2) 加入 200 μ1的缓冲液 GB，轻轻颠倒混匀， 56°C孵育 10 min，并不时摇动样品。简短离心以去除管盖内壁的液滴；

3 ) 加入 200 μΐ的预冷乙醇（96-100%)。轻轻颠倒混匀样品，室温放置 5 min，简短离心以去除管盖内壁的液滴；

4) 将上一步所得溶液添加到一个吸附柱 CR2中（吸附柱放入收集管中）， 12,000 rpm 离心 30 s，弃废液，将吸附柱 CR2放回收集管中；

5 ) 向吸附柱 CR2中加入 500 μ1缓冲液 GD， 12,000 rpm离心 30 s，弃废液，将吸附柱 CR2放回收集管中；

6 ) 向吸附柱 CR2中加入 600 μΐ漂洗液 PW， 12,000 rpm离心 30 s，弃废液，将吸附柱 CR2放回收集管中。

7 ) 12,000 rpm离心 2 min，倒掉废液。将吸附柱 CR2置于室温放置 5 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

8 ) 将吸附柱 CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 25 μΐ洗脱缓冲液 ΤΒ，室温放置 2-5 min， 12,000 rpm离心 2 min，将溶液收集到离心管中。

9 ) 使用 Qubit dsDNA HS Assay Kit对得到 ctDNA进行浓度定量检测。

2、 ctDNA-QPCR检测：

1 ) 在冰上配置 QPCR Mix体系如下：

反应体系

SV-P6正向引物 TAGCACAGGAGTGGAATTTT

SV-P6反向引物 AGAGTGAAACTCCGTCTCAA

SV-P7正向引物 AGACTCCGTCTCAAAACAAA

SV-P7反向引物 ACTTTACTCTTTTGCATGGG

2) 反应条件如下：

95 V 30s

95 V 5s 40

58 V 30s cycles 72 °C 30s

72 °C 5min 國

4°C Hold -

4、结果分析：

采用相对定量的方法，即，依据下述公式计算各时间段 ctDNA的生物标志物的相对含

2^A t _2~ (不同阶段 PlasmaDNA的 Ct-癌组织 DNA的 Ct) 结果见图 2和图 3。

其中，图 2显示了 SV-P6在患者外周血 ctDNA中的相对含量检测结果。图 3显示了 SV-P7 在患者外周血 ctDNA中的相对含量检测结果。其中，如图 2和图 3所示， CRC-4A: 患者手术前外周血 ctDNA; CRC-4B: 手术后 7天外周血 ctDNA; CRC-4C: 手术后 1个月外周血 ctDNA; CRC-4D:手术后 10个月外周血 ctDNA。由图 2和图 3可知，实施例 1选择确定的的 SV作为该结直肠癌患者在外周血中的个人生物标志物，在不同时间的外周血血浆中会发生含量的变化，特别是在手术治疗后（CRC-4B ), 而发明人在癌组织中找到的 Somatic SV 明显减少，但随着癌症进展，其含量又逐渐增加。说明采用 somatic SV作为癌症患者个人癌症进程的跟踪监控用 biomarker技术可行。工业实用性

本发明的生物标志物，能够有效地应用于对癌症患者进行术后监控，并且灵敏度较高。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、 "一些实施例"、 "示意性实施例"、 "示例"、 "具体示例"、或 "一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims

权利要求书

1、一种确定生物标志物的方法，所述生物标志物与癌症相关，其特征在于，包括：针对同一癌症患者的癌组织和癌旁组织分别构建测序文库，以便获得癌组织文库和癌旁组织文库；

对所述癌组织文库和所述癌旁组织文库进行测序，以便分别获得癌组织测序结果和癌旁组织测序结果；

将所述癌组织测序结果和所述癌旁组织测序结果与人参考基因组序列进行比对，以便分别获得癌组织比对结果和癌旁组织比对结果；

基于所述癌组织比对结果和所述癌旁组织比对结果，确定所述癌症患者的体细胞结构变异；以及从所述癌症患者的体细胞结构变异中筛选断点支持数不小于 5 的染色体内易位和染色体间易位，作为所述癌症患者的生物标志物。

2、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，通过以下步骤构建所述测序文库：提取所述同一癌症患者的癌组织或癌旁组织的基因组 DNA;

将所述基因组 DNA进行片段化，以便获得 DNA片段；

将所述 DNA片段依次进行末端修复和 3'末端添加碱基 "A"，以便获得经过末端修复和 3'末端添加碱基 "A" 的 DNA片段；

将所述经过末端修复和 3'末端添加碱基 "A" 的 DNA片段与接头相连，以便获得接头连接产物；

对所述接头连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；

将所述目的片段进行 PCR扩增，以便获得扩增产物；以及

将所述扩增产物进行纯化回收，以便获得纯化产物，所述纯化产物构成所述测序文库。

3、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，利用琼脂糖凝胶电泳进行所述片段选择，所述目的片段为 500bp。

4、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，利用选自 ABI3730xl、 Hiseq2000、 SOLID,

454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。

5、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，将所述癌组织测序结果和癌旁组织测序结果与人参考基因组进行比对，包括：

利用 BWA 软件，将所述癌组织测序结果和癌旁组织测序结果与人参考基因组进行比对，并且选择唯一比对序列作为第一癌组织比对结果和第一癌旁组织比对结果，其中最多允许 3个错配；以及

将所述第一癌组织比对结果和所述第一癌旁组织比对结果，分别依次进行 samtools软件去重和 GATK软件局部重新比对处理，以便分别获得癌组织比对结果和癌旁组织比对结果。

6、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，基于所述癌组织比对结果和所述癌旁组织比对结果，确定所述癌症患者的体细胞结构变异包括：利用 CREST软件分别确定癌组织中的体细胞结构变异，以及癌旁组织中的体细胞结构变异；

将所述癌组织中的体细胞结构变异和所述癌旁组织中的体细胞结构变异进行比较，以便确定所述癌症患者的体细胞结构变异，其中，所述癌症患者的体细胞结构变异为所述癌旁组织中不存在但所述癌组织中存在的体细胞结构变异。

7、根据权利要求 6所述的方法，其特征在于，进一步包括：

将所述癌症患者的体细胞结构变异进行断点支持数过滤处理。

8、一种对癌症患者进行术后监控的方法，其特征在于，包括：

根据权利要求 1-7任一项所述的方法，确定所述癌症患者的生物标志物；

确定用于扩增所述生物标志物的 QPCR引物；

提供所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA;

利用所述 QPCR引物，将所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA分别进行 QPCR反应，以便确定所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量；以及基于所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，确定所述癌症患者术后的病情发展情况。

9、根据权利要求 8 所述的方法，其特征在于，所述癌症患者手术前后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，是以癌组织 DNA为相对内参计算获得的相对含量。

10、根据权利要求 9所述的方法，其特征在于，

所述癌症患者术后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，低于所述癌症患者术前的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，为所述癌症患者的病情控制良好的指示；反之，所述癌症患者术后的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，与所述癌症患者术前的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量相当或高于所述癌症患者术前的外周血游离 DNA中所述生物标志物的含量，为所述癌症患者的病情复发的指示。