WO2015085386A1 - Uso de compostos obtidos a partir de extratos da arrabidaea brachypoda como antiulcerogênico - Google Patents

Uso de compostos obtidos a partir de extratos da arrabidaea brachypoda como antiulcerogênico Download PDF

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WO2015085386A1
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brachypoda
extract
animals
saline
arrabidaea
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Cláudia QUINTINO DA ROCHA
Wagner Vilegas
Emerson Ferreira Queiroz
Jean-Luc WOLFENDER
Laurence MARCOURT
Alba Regina MONTEIRO SOUZA BRITO
Felipe MEIRA DE FARIA
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Universidade Estadual Paulista "Julio De Mesquita Filho" - Unesp
Université De Genève
Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
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    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like

Definitions

  • This invention describes the use of compounds obtained from the extract of roots, stems, bark and leaves of Arrabidaea plant species, in particular Arrabidaea brachypoda, also known as lipo-una or field beer, to treat ulcerogenic diseases.
  • ulcer generally describes any superficial lesion in skin or mucosal tissue. In these lesions, the epithelium ruptures in order to expose deeper tissues.
  • Ulcers can be classified according to the type of tissue affected. Thus, cutaneous ulcers affect the skin (non-piled areas or scalp), mucous ulcers affect the mucous membranes (external or internal), ulcers
  • Serous tumors affect serosa and complex ulcers affect different tissue types along their extension or depth.
  • Peptic ulcer is an example of a lesion that occurs in the lining of the stomach or in the first part of the small intestine called the duodenum. When located in the stomach, the peptic ulcer is called gastric ulcer.
  • Aggressive factors of the gastric mucosa originate from a variety of endogenous or exogenous stimuli, including alcohol consumption, smoking, improper diet, consumption of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and the presence in the Helicobacter pylori bacteria.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • the therapeutic options available for the treatment of ulcers are drugs that promote antibacterial action, neutralization of gastric acid, reduction of stomach acid secretion and cytoprotection.
  • Proton pump inhibitors such as omeprazole and lansoprazole ⁇ and histamine receptor (cimetidine) receptor antagonists are used, and drugs such as carbenoxolone and indometecin are also used. Therapy is associated with the onset of adverse effects and in many cases recurrence of the gastric lesion occurs.
  • this invention proposes the use of compounds obtained from Arrab ⁇ daea brachypoda in the treatment of ulcerogenic diseases.
  • WO 2013/091056 describes stable pharmaceutical compositions comprising Arrab ⁇ dae chica extract in controlled release systems in the form of liposomes, microparticles or nanoparticles.
  • WO 0152809 describes cosmetic or pharmaceutical preparations containing an active amount of Arrabidaècica extract
  • JP 2001/122763 describes a composition for external use comprising plants such as those of the genus Arrabidaea as well as extracts thereof.
  • This invention describes the use of compounds obtained from Arrabidaea brachypoda extracts for the treatment of ulcerogenic diseases.
  • Figure 1 graphically represents the effect of oral administration of A. brachypoda root extract to animals submitted to the ethanol-induced ulcer model, where A represents control (saline ⁇ , B represents control (saline) with pretreatment. with N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) over the ulcerogenic lesion area, C represents carbenoxolone, D represents carbenoxolone pretreated with N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) on the ulcerogenic lesion area, E represents the root extract of A. brachypoda and F represents the same extract with pretreatment with N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) on the ulcerogenic lesion area.
  • A represents control (saline ⁇
  • B control (saline) with pretreatment.
  • C represents carbenoxolone
  • D carbenoxolone pretreated with N-nitro-L-arginine methyl ester (L-
  • Figure 2 graphically represents the effect of oral administration of A. brachypoda root extract to animals submitted to the ethanol-induced ulcer model, where A represents the control (saline), B represents the (saline) control with N-ethylmaleimide (NEM) pretreatment over the ulcerogenic lesion area, C represents carbenoxolone, D represents N-ethylmaleimide (NEM) pretreatment carbenoxolone over the ulcerogenic lesion area, E represents the root extract of A. brachypoda and F represents the same extract with pretreatment with N-ethylmaleimide (MEN) over the ulcerogenic lesion area.
  • A represents the control (saline)
  • B represents the (saline) control with N-ethylmaleimide (NEM) pretreatment over the ulcerogenic lesion area
  • C represents carbenoxolone
  • D N-ethylmaleimide
  • E represents the root extract of A.
  • brachypoda and F represents the same extract with pretreatment with N-
  • Figures 3 and 4 graph the effect of oral administration of A. brachypoda root extract for 7 and 14 consecutive days on liver weight (A), lungs (B), testis (C), heart (D) and kidneys (E) of animals submitted to the acetic acid-induced ulcer model, where (a) is SHAM, (b) is saline, (c) is lansoprazole and (d) is A. brachypoda extract.
  • Figure 5 graphically represents the evolution of the effect of oral administration of A. brachypoda root extract for 14 consecutive days on liver weight.
  • Figures 6 and 7 graphically show the effect of oral administration of A. brachypoda root extract after 7 and 14 consecutive days on acetic acid-induced wound healing in rats, where (A) is saline,
  • (B) is lansoprazole and (C) is A. brachypoda.
  • Figure 8 graphically represents "the evolution of the healing process of acetic acid induced injury in rats treated orally with the extract of the A. brachypoda roots for 14 consecutive days, where (A) is saline, (B) is lansoprazole and (C) is A. brachypoda.
  • Figure 9 graphically represents a comparison of MPO enzymatic activity in animals treated with saline (A), lansoprazole (B) and A. brachypoda (C) extract for 7 (a) and 14 (b) days.
  • Figures 10A and 10B are photomicrographs of rat stomachs with acetic acid-induced ulcer after saline treatment for 7 consecutive days at 20x (A) and ⁇ (B) increments.
  • Figures 10C and 10D are photomicrographs of rat stomachs with acetic acid-induced ulcer after lansoprazole treatment for 7 consecutive days at 20x (C) and 100x (D) increments.
  • Figures 10E and 10F are photomicrographs of rat stomachs with acetic acid-induced ulcer after treatment with A. brachypoda for 7 consecutive days at 20x (E) and 100x (F) increments.
  • Figures 11A and 11B are photomicrographs of rat stomachs with acetic acid-induced ulcer after saline treatment for 14 consecutive days at 20x (A) and 100x (B) increments.
  • Figures 11C and 11D are photomicrographs of rat stomachs with acetic acid-induced ulcer following lansoprazole treatment for 14 consecutive days at 20x (C) and 100x (D) increments.
  • Figures 11E and 11F are photomicrographs of rat stomachs with acetic acid-induced ulcer after treatment with A. brachypoda for 14 consecutive days, at 20x (E) and 100x (F) increments.
  • Figure 12 graphically represents the gastroprotection promoted by oral administration of saline (A), lansoprazole (B) and hydroalcoholic extract of A. brachypoda roots (10, 30, 100 and 300 mg.Kg-1, respectively C, D, E and F) in the rat ethanol-induced ulcer model.
  • Figure 13 graphically represents the effect of oral pretreatment of SHAM (A), saline (B), carbene (C), and A. brachypoda hydroalcoholic extract (D) on the NSAID induction model.
  • Figure 14 graphically represents the effect of oral administration of saline (A), carbene (B) and hydroalcoholic extract of A. brachypoda (C) on the production of mucus adhered by the gastric mucosa of pyloric ligated rats.
  • the invention consists of the use of compounds obtained from extracts of roots, stems, barks and leaves of species of the genus Arrabidaea, in particular from roots of Arrabidaea brachypoda, known as field beer or liana.
  • the root extract of this plant comprises fractions enriched in compounds that have an antiulcerogenic activity.
  • the compounds of the present invention are obtained from standardized extracts of species of the genus Arrabidaea, in particular Arrabidaea brachypoda.
  • biomass comprising roots, stems, bark, and leaves, as well as mixtures thereof, it is extracted by percolation, soxhlet maceration or supercritical gas as well as a mixture of these techniques.
  • the biomass may be green and / or dry, pulverized, ground, shredded and / or crumbled.
  • the biomass is frozen before being processed.
  • Prior freezing of plant material prevents thermal degradation caused by heating when passing through the electric mill.
  • Extraction is done using basic or acidic medium, in aqueous medium or using organic solvents, alone or in combinations.
  • the acids may be strong or weak acids, diluted or concentrated, alone or in mixtures.
  • the acid is selected from acetic acid, hydrochloric acid and formic acid.
  • the bases may be concentrated or diluted, alone or in mixtures.
  • the base is selected from ammonium hydroxide (NH 4 OH) and sodium carbonate (Na 2 CO 3 ).
  • the organic solvent is selected from those comprising halogenated compounds, alcohols, aldehydes, ethers, esters, ketones, alkanes, cycloalkanes, phenolic compounds, benzenes and derivatives alone or mixtures thereof.
  • the extract obtained can be dried using spray-drying technology at reduced pressure or at room temperature.
  • the temperatures of inlet and outlet will range from 150 to 190 ° C and 80 to 90 ° C, respectively. In drying under reduced pressure, it varies between 25 and 100 ° C.
  • the different compounds are separated and purified by pressure or non-pressure chromatographic techniques such as atmospheric pressure chromatography or low, medium or high pressure chromatography.
  • a normal stationary phase such as silica gel or a reverse phase such as C-8 or C-18 may be used.
  • liquid / liquid partition such as current chromatography, or centrifugal partition, may be used using ion exchange resins or filtration membranes.
  • Arrab ⁇ daea brachypoda root extract is subjected to guided fractionation.
  • the extract is fractionated by reverse phase medium pressure chromatography (PLC), with a solvent system showing stepwise methanol-water gradient from 10:90, with gradual increase to 100%.
  • PLC reverse phase medium pressure chromatography
  • the maximum pressure is 20 bar (2x10 3 kPa) and samples are placed in an introduction cartridge after mixing with the stationary phase (silica) at a weight ratio of 1: 3.
  • fractions are tested in antiulcerogenic tests. From these fractions, isolated compounds RAB-01, RAB-02 and RAB-03 are obtained, the structures of which are elucidated by spectroscopic methods (such as ultraviolet UV, nuclear magnetic resonance - 1D and 2D NMR, low and high resolution mass spectrometry (MS and HRMS), as well as chemical and enzymatic reactions.
  • spectroscopic methods such as ultraviolet UV, nuclear magnetic resonance - 1D and 2D NMR, low and high resolution mass spectrometry (MS and HRMS), as well as chemical and enzymatic reactions.
  • RAB-01 R is hydroxyl; for RAB-02, R is methoxy and for RAB-03, R is hydrogen.
  • compositions obtained in accordance with the present invention comprise the compounds RAB-01, RAB-02 and RAB-03 in standardized amounts, in their isolated form or in combination with other natural or synthetic products, in different proportions.
  • the pharmaceutical compositions of this The invention comprises compounds RAB-01, RAB-02 and RAB-03 in a concentration range ranging from 0.001 to 50% of at least one of the compounds in their free or salt form (such as chlorates, sulfates or borates). , associated with pharmaceutically acceptable excipients.
  • compositions may further comprise drugs, vitamins, salts and / or sugars.
  • compositions described herein are presented in the form of tablets, soft or hard capsules, microcapsules, nanoparticles, tinctures, syrups, O / W and A / O emulsions, liposomes, injectable liquids, aerosols, powders, lyophilisates and the like. to be administered orally, topically, injected or inhaled.
  • compositions are useful in the treatment of ulcers, especially peptic ulcers.
  • the material is pulverized and frozen in liquid nitrogen and then crushed in an electric mill.
  • the extraction furnace is gradually heated in a heating speed of 10 ° C per minute until a temperature of 45 to 50 ° C is reached.
  • the extract is then hot filtered at a temperature ranging from 35 to 40 ° C under vacuum through 100 to 150 mm filters.
  • the process is repeated until exhaustion, that is, until the dichloromethane phase no longer stains when mixed with the aqueous phase.
  • the dichloromethane phase is rotary evaporated, yielding 31.2%.
  • the dichloromethane extract thus obtained is purified by medium pressure liquid chromatography (HPLC) using an eluent system composed of a mixture of methanol and water. in gradient mode (5% to 100% in 72 hours) and a stationary phase to reverse phase (C-18 and 15-25 ⁇ ) in a column 460 mm wide by 70 mm in diameter.
  • HPLC medium pressure liquid chromatography
  • the compounds were detected by ultraviolet at 254 nm.
  • the obtained fractions are subjected to various chromatographic techniques to isolate the compounds RAB-01, RAB-
  • the drugs used to determine the antiulcerogenic activity of compounds obtained from Arrabidaea brachypoda were:
  • the animals used were male unib-H rats, with a mass between 150 and 250 grams. Animals were acclimated to laboratory conditions for at least seven days prior to experimental manipulation, with temperature (23 ⁇ 2 ° C) and 12-hour controlled light-dark cycles. Still, they were fed with feed and water ad libitum and randomly distributed in the different experimental groups, being fasted (with water ad libitum) for at least 12 hours, depending on the type of experiment.
  • the rats fasted for 24 hours were divided into groups according to the treatments.
  • the control group received peritoneal saline injection or L-NAME (N-nitro-L-arginine methyl ester), a NO synthase inhibitor (10 mg / kg).
  • the groups received (i) vehicle (saline), (ii) Arrabidaea brachypoda extract and (iii) carbenoxolone (positive control) orally.
  • the animals received orally absolute ethanol.
  • the animals were sacrificed after 1 hour and the stomachs were removed and opened at the great curvature to determine the lesion area.
  • mice were randomly divided into groups treated with a subcutaneous injection of saline (negative control) or 10 mg / kg N-ethylmaleimide (NOR), a blocker of sulfhydryl groups.
  • negative control a subcutaneous injection of saline
  • NOR N-ethylmaleimide
  • the groups received oral vehicle (10 mL / kg), carbenoxolone (positive control) and A. brachypoda extract (300 mg / kg).
  • GSH glutathione
  • Reduced DTNB acquires a yellowish coloration, which can be determined spectrophotometrically.
  • the generated GSSG is reduced by glutathione reductase enzyme in the presence of NADPH.
  • the formed GSH oxidizes again, generating a continuous cycle in which the rate of reduction of DTNB (and its consequent increase in absorbance at 412 nm) is proportional to the total amount of glutathione (GSH + GSSG).
  • cytosolic extracts obtained from the stomachs of the animals induced by the ethanol-induced ulcer experiment were used.
  • samples were 20 ⁇ l of their volume removed and pipetted in a 96-channel plate, where 140 ⁇ l of NADPH, 5 ⁇ was added. of PBS and 20 ⁇ l DTNB.
  • the plate was arranged in the spectrophotometer reader, where it remained incubated for 5 minutes at a temperature of 30 ° C.
  • rats were anesthetized with xylazine hydrochloride and ketamine for a longitudinal incision just below the xiphoid apophysis.
  • the anterior wall of the stomach was exposed and an area of the serosa was delimited with a plastic ring to which 50 ⁇ l of P.A. acetic acid was added with the aid of an automatic micropipette, maintaining contact between acid and serosa for 60 seconds.
  • the animals were weighed and observed from the induction of the lesions until the end of the treatments. At the end of this period, the animals were sacrificed, their stomachs were removed and opened in the direction of greater curvature to determine the area of the ulcerative lesion.
  • Tissue sections were also collected to make histological slides. The animals also had the heart, lungs, liver, kidneys and testicles collected and weighed for possible signs of toxicity.
  • the separated proteins in the SDS-PAGE were transferred to a nitrocellulose membrane in electrotransfer equipment, with the membranes soaked in transfer buffer maintained at a constant voltage of 25 V, current 1.0 A for 12 minutes.
  • Nitrocellulose membranes containing the transferred proteins were incubated in blocking solution for one hour to decrease nonspecific protein binding.
  • the membranes were then subjected to successive buffer washes at 5 minute intervals.
  • the membrane was incubated at 4 ° C overnight using COX-1, COX-2 and EGF specific antibody.
  • nitrocellulose membrane was again subjected to successive buffer washes and then incubated at room temperature for 1 h with secondary antibody to COX-1, COX-2 and EGF.
  • the membranes were soaked with chemiluminescence solution for 5 minutes. After this period, the membranes were placed in a photocumenter to detect the fluorescent bands and subsequent densitometric analysis with the aid of specific software.
  • MPO activity was also verified in the chronic ulcer model.
  • Histological sections and slides were prepared by fixation of the material in ALFAC (formalin, 80% alcohol and acid acetic acid) for 24 hours. The pieces were then dehydrated and included in appropriate solid medium.
  • ALFAC formalin, 80% alcohol and acid acetic acid
  • the middle blocks were cut (7 ⁇ thick) in microtome, in a serial manner.
  • the samples were subjected to hematoxylin-eosin (HE) staining for general observation of the structure and cellularity under light microscopy.
  • HE hematoxylin-eosin
  • Unib-WH rats were fasted for 24 h with water ad libitum. On the day of the experiment, they were divided into 7 groups: saline as negative control, lansoprazole as positive control and four groups with A. brachypoda root extract at different concentrations (doses of 10, 30, 100 and 300 mg. Kg " 1 ) dissolved in saline at concentrations of 10 mL.Kg -1 .
  • the animals received the predicted treatment for each group and one hour later, 1 ml of absolute ethanol was administered orally.
  • the stomachs were homogenized, the cytosolic extracts prepared and membranes for performing biochemical assays.
  • NSAID Non-steroidal anti-inflammatory gastric ulcer
  • the animals were fasted for 24 hours with water ad libitum. On the day of the experiment, the animals were divided into five groups: SHAM, saline, carbenoxolone, treatment with plant extract A. brachypoda that will be administered indomethacin and treatment with plant extract where indomethacin will not be administered, for further evaluation of prostaglandin E2 levels.
  • the groups received the respective oral treatments and, after 30 minutes, the indomethacin (50 mg. Kg "1 solubilized in 0.5% sodium carbonate) was administered to all groups except SHAM and received treatment with the plant only for PGE verification.
  • the indomethacin 50 mg. Kg "1 solubilized in 0.5% sodium carbonate
  • mice were fasted for 48 hours with water ad libitum. On the day of the experiment, the animals were divided into four groups: saline, lansoprazole, cimetidine and treated with A. brachypoda plant extract.
  • the rats were anesthetized and incised just below the xiphoid apophysis to the pylorus
  • the administration of the drugs was performed shortly after tying, intraduodenally.
  • the incisions were sutured and, after four hours of surgery, the rats were sacrificed.
  • the stomachs were carefully removed and the acid secretion was collected. After centrifugation, the volume and pH of the secretion of each animal was measured.
  • the rats were fasted for 24 hours with water ad libitum for the experiment.
  • the animals were divided into three groups: saline, carbenoxolone and plant extract ⁇ . Brachypoda.
  • the glandular segments of the stomach were removed and weighed and each segment was immediately transferred to a tube containing coloring agent. After soaking for 2 hours in this solution, excess paint was removed by two successive washes with 10 mL of 0.25 M sucrose solution, first for 15 minutes and then for 45 minutes.
  • the ink complexed with gastric wall mucus was extracted with 10 mL of 0.5 M MgCl 2 by intermittent stirring for 1 minute at 30 minute intervals for 2 hours.
  • the amount of dye extracted per gram of glandular tissue was then calculated and expressed as iq dye concentration per ml of solution per gram of glandular portion.
  • MPO Myeloperoxidase
  • Myeloperoxidase activity was determined by the method described by Krawisz et al. in 1984. The samples were homogenized in 0.5% (w / v) hexadecyltrimethylammonium bromide (HTAB) buffer in phosphate buffered saline (50 m, pH 6.0) with a final dilution of 1:20 (w / v). ) until obtaining a uniform appearance.
  • HTAB hexadecyltrimethylammonium bromide
  • HTAB acts as a detergent, facilitating the release of the enzyme MPO from the neutrophil azurophil granules, where it is stored.
  • the homogenate was subjected to an ultrasonic bath for 10 seconds, followed by a triple freezing and thawing process, which facilitates the rupture of cell structures and, consequently, the enzyme release.
  • the sample was centrifuged at 7000 G for 10 minutes and the MPO activity was determined following the reaction kinetics against hydrogen peroxide.
  • Absorbance was determined at 450 nm and enzyme activity was calculated by standard curve interpolation performed with MPO from human neutrophils.
  • MPO unit A n is defined as the amount required to degrade 1 mmol / min hydrogen peroxide 25 ° C. Results were expressed as U / g protein.
  • Figure 1 shows the data obtained in the evaluation of NO involvement in gastroprotection promoted by A. brachypoda (300 mg. Kg "1 ).
  • Figure 2 graphically represents the result of the observation made about the involvement of sulfhydryl groups in the protection of the gastric mucosa exerted by oral administration of A. brachypoda (300 mg. Kg '1 ).
  • the assays evaluated the antioxidant activity of glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx) enzymes and sulfhydryl group (GSH) levels in gastric mucosa of rats submitted to the ethanol induced ulcer model.
  • GR glutathione reductase
  • GPx glutathione peroxidase
  • GSH sulfhydryl group
  • Table 1 Effect of oral administration of A. brachypoda root extract on the enzymatic activity of GR and GPx of gastric mucosa of rats submitted to the ethanol-induced ulcer model.
  • Table 2 Effect of oral administration of A. brachypoda root extract on GSH levels in gastric mucosa of rats submitted to ethanol-induced ulcer model.
  • GSH levels were not maintained or increased by oral administration of A. brachypoda to rats subjected to ethanol-induced ulcer model, lansoprazole treatment led to the preservation or increase of cytosolic levels of GSH.
  • Acetic acid-induced ulcer - subchronic model Acetic acid-induced ulcer - subchronic model:
  • Figures 3, 4 and 5 are illustrative of data representing subchronic toxicity of experimental treatments.
  • Figure 4 shows the same relationship found in Figure 3, however, the analysis was performed after 14 days of treatment and no significant differences were observed.
  • Figure 5 shows the body weight evolution of the subchronically treated animals and also serves as an indication of toxicity, although there was a drop in the average body weight of the lansoprazole treated animals, no statistically significant differences were observed.
  • Figures 6 and 7 represent the data obtained in the verification of the ulcerogenic lesion area measured after 7 and 14 consecutive days of treatment.
  • Figure 6 shows that A. brachypoda treatment reduced the lesion area after 7 days, as well as the control group lansoprazole.
  • Figure 8 shows the evolution of the healing process, evidenced by the reduction of the lesion area over the treatment period. Importantly, after 20 days, the lesions are recovered physiologically.
  • the data shown show the acceleration promoted by lansoprazole and A. brachypoda treatments in the gastric mucosa recovery of rats.
  • Tables 3 and 4 gather the data obtained in the evaluation of the enzymatic activity of the enzyme MPO.
  • Figure 9 graphically gathers the results from Tables 3 and 4, comparing them.
  • An analysis of the results obtained for MPO activity shows that it is high after 7 days of treatment, being reduced in the groups treated with lansoprazol and A. brachypoda for more than 7 days, suggesting an important participation of the enzyme in the process. healing.
  • Figures 10A, 10B, 10C, 10D, 10E and 10F and 11A, 11B, 11C, 11D, 11E and llF are photomicrographs of stomachs of animals submitted to the subchronic acetic acid-induced ulcer model and treated for 7 and 14 days. respectively.
  • Figure 11 shows that the groups treated with lansoprazol and A. brachypoda accelerated healing of the gastric mucosa in relation to the saline group, which has a large neutrophilic infiltrate in the mucosa and submucosa layers.
  • the pictures show intense reduction of the lesion in the experimental groups, demonstrating the improvement promoted by the administration of both lansoprazole and A. brachypoda.
  • Figure 12 shows that the antiulcerogenic activity of A. brachypoda plant root extract is best obtained at 300 mg doses. Kg "1 .

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Abstract

Esta invenção descreve o uso de compostos obtidos a partir do extrato de raízes, caules, cascas e folhas de espécies vegetais do género Arrabidaea, em especial a Arrabidaea brachypoda, também conhecida como cipó-una ou cervejinha do campo, para tratar doenças ulcerogênicas.

Description

USO DE COMPOSTOS OBTIDOS A PARTIR DE EXTRATOS DA ARRABIDAEA BRACHYPODA COMO ANTIULCEROGÊNICO
Campo da Invenção:
Esta invenção descreve o uso de compostos obtidos a partir do extrato de raízes, caules, cascas e folhas de espécies vegetais do género Arrabidaea, em especial a Arrabidaea brachypoda, também conhecida como cipó-una ou cervejinha do campo, para tratar doenças ulcerogênicas .
Fundamentos da invenção:
A denominação úlcera descreve, genericamente, qualquer lesão superficial em tecido cutâneo ou mucoso. Nessas lesões, ocorre a ruptura do epitélio de modo a haver exposição de tecidos mais profundos.
As úlceras podem ser classificadas de acordo com o tipo de tecido acometido. Assim, úlceras cutâneas acometem a pele (áreas não pilificadas ou couro cabeludo) , úlceras mucosas acometem as mucosas (externas ou internas) , úlceras
t serosas acometem serosas e as úlceras complexas acometem diferentes tipos de tecidos ao longo de sua extensão ou profundidade.
A úlcera péptica é um exemplo de lesão que ocorre no revestimento do estômago ou na primeira parte do intestino delgado, chamada duodeno. Quando localizada no estômago, a úlcera péptica é denominada úlcera gástrica.
Os fatores agressores da mucosa gástrica se originam a partir de uma variedade de estímulos endógenos ou exógenos, dentre os quais estão o consumo de álcool, tabagismo, dieta inadequada, o consumo de anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) e a presença, no local, da bactéria Helicobacter pylori. Dentre as opções terapêuticas existentes no mercado para tratamento das úlceras, estão disponíveis medicamentos que promovem uma ação antibacteriana, a neutralização do acido gástrico, a redução da secreção ácida estomacal e a citoproteção .
São utilizados inibidores da bomba protônica (tal como o omeprazol e o lansoprazol} e antagonistas do receptor de histamina ¾ (cimetidina) . Fármacos como a carbenoxolona e a indometecina também são usados. Os fármacos disponíveis atuam predominantemente minimizando os fatores lesivos da mucosa e a terapia está associada ao surgimento dos efeitos adversos e, em muitos casos, ocorre recidiva da lesão gástrica .
Em vista das dificuldades acima apontadas, tanto na prevenção quanto no tratamento das doenças, esta invenção propõe o uso de compostos obtidos a partir da Arrabídaea brachypoda no tratamento de doenças ulcerogênicas.
Estado da técnica.:
Documentos disponíveis no estado da técnica descrevem diferentes compostos obtidos a partir da Arrabídaea, bem como a incorporação destes em composições farmacêuticas.
O documento brasileiro PI 0600943-3 A2 descreve o uso de extratos itoterápicos a base de Arrabídaea chica como antifúngico e antibacteriano . Os extratos podem ser utilizados como fármaco ou aditivo a cosméticos, podendo ser aplicados diretamente ou incorporados a um veículo farmacológico ou cosmético.
No documento WO 2013/091056 são descritas composições farmacêuticas estáveis compreendendo o extrato de Arrabídae chica em sistemas de liberação controlada, na forma de lipossomas, microparticulas ou nanoparticulas .
No WO 0152809 são descritas preparações cosméticas ou farmacêuticas contendo uma quantidade ativa de extrato de Arrabidaè chica, enquanto que em JP 2001/122763 descreve-se uma composição para uso externo compreendendo plantas, tais como aquelas do género Arrabidaea, bem como seus extratos .
Nenhum dos documentos do estado da técnica descreve o uso de compostos obtidos a partir da Arrabidaea brachypoda para o tratamento de doenças ulcerogênicas .
Sumário da Invenção:
Esta invenção descreve o uso de compostos obtidos a partir de extratos da Arrabidaea brachypoda para o tratamento de doenças ulcerogênicas.
Breve descrição das figuras:
A Figura 1 representa graficamente o efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda a animais submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol, em que A representa o controle (salina}, B representa o controle (salina) com pré-tratamento com N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) sobre a área de lesão ulcerogênica, C representa a carbenoxolona, D representa a carbenoxolona com pré-tratamento com N-nitro-L-arginina metil éster (L- NAME) sobre a área de lesão ulcerogênica, E representa o extrato das raízes de A. brachypoda. e F representa o mesmo extrato com pré-tratamento com N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) sobre a área de lesão ulcerogênica.
A Figura 2 representa graficamente o efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda a animais submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol, em que A representa o controle (salina), B representa o controle (salina) com pré-tra amento com N-etilmaleimida (NEM) sobre a área de lesão ulcerogênica, C representa a carbenoxolona, D representa a carbenoxolona com pré- tratamento com N-etilmaleimida (NEM) sobre a área de lesão ulcerogênica, E representa o extrato das raízes de A. brachypoda e F representa o mesmo extrato com pré- tratamento com N-etilmaleimida (NEM) sobre a área de lesão ulcerogênica .
As Figuras 3 e 4 representam graficamente o efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda por 7 e 14 dias consecutivos sobre o peso do fígado (A) , pulmões (B) , testículos (C), coração (D) e rins (E) de animais submetidos ao modelo de úlcera induzida por ácido acético, em que (a) é SHAM, (b) é salina, (c) é lansoprazol e (d) é o extrato de A. brachypoda.
A Figura 5 representa graficamente a evolução do efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda por 14 dias consecutivos sobre o peso do fígado
(A) , pulmões (B) , testículos (C) , coração (D) e rins (E) de animais submetidos ao modelo de úlcera induzida por ácido acético, em que (a) é SHAM, (b) é salina, (c) é lansoprazol e (d) é o extrato de A, brachypoda.
As Figuras 6 e 7 representam graficamente o efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda após 7 e 14 dias consecutivos sobre a cicatrização da lesão induzida em ratos por ácido acético, em que (A) é salina,
(B) é lansoprazol e (C) é A. brachypoda.
A Figura 8 representa graficamente" a evolução do processo de cicatrização da lesão induzida por ácido acético em ratos que tratados oralmente com o extrato das raízes de A. brachypoda por 14 dias consecutivos, em que (A) é salina, (B) é lansoprazol e (C) é A. brachypoda .
A Figura 9 representa graficamente uma comparação da atividade enzimática da MPO em animais tratados com salina (A) , lansoprazol (B) e extrato de A. brachypoda (C) por 7 (a) e 14 (b) dias.
As Figuras 10A e 10B são fotomicrografias de estômagos de ratos com úlcera induzida por ácido acético após tratamento com salina por 7 dias consecutivos, nos aumentos de 20x (A) e ΙΟΟχ (B) .
As Figuras 10C e 10D são fotomicrografias de estômagos de ratos com úlcera induzida por ácido acético após tratamento com lansoprazol por 7 dias consecutivos, nos aumentos de 20x (C) e lOOx (D) .
As Figuras 10E e 10F são fotomicrografias de estômagos de ratos com úlcera induzida por ácido acético após tratamento com A. brachypoda por 7 dias consecutivos, nos aumentos de 20x (E) e lOOx (F) .
As Figuras 11A e 11B são fotomicrografias de estômagos de ratos com úlcera induzida por ácido acético após tratamento com salina por 14 dias consecutivos, nos aumentos de 20x (A) e lOOx (B) .
As Figuras 11C e 11D são fotomicrografias de estômagos de ratos com úlcera induzida por ácido acético após tratamento com lansoprazol por 14 dias consecutivos, nos aumentos de 20x (C) e lOOx (D) .
As Figuras 11E e 11F são fotomicrografias de estômagos de ratos com úlcera induzida por ácido acético após tratamento com A. brachypoda por 14 dias consecutivos, nos aumentos de 20x (E) e lOOx (F) . A Figura 12 representa graficamente a gastroproteção promovida pela administração oral de salina (A) , lansoprazol (B) e do extrato hidroalcoólico das raízes de A. brachypoda (10, 30, 100 e 300 mg.Kg-1, respectivamente C, D, E e F) no modelo de úlceras induzidas por etanol em ratos .
A Figura 13 representa graficamente o efeito do pré- tratamento oral de SHAM (A) , salina (B) , carbeno (C) e extrato hidroalcoólico de A. brachypoda (D) no modelo de indução de úlceras por AINE .
A Figura 14 representa graficamente o efeito da administração oral salina (A) , carbeno (B) e extrato hidroalcoólico de A. brachypoda (C) sobre a produção de muco aderido pela mucosa gástrica de ratos submetidos à ligadura do piloro.
Descrição detalhada da invenção:
A invenção consiste no uso de compostos obtidos a partir de extratos de raízes, caules, cascas e folhas de espécies do género Arrabidaea, em especial, a partir de raízes de Arrabidaea brachypoda , conhecida como cervejinha do campo ou cipó-una.
O extrato de raízes desta planta compreende frações enriquecidas em compostos que apresentam uma atividade antiulcerogênica .
Método de obtenção dos compostos :
Os compostos da presente invenção são obtidos a partir de extratos padronizados de espécies do género Arrabidaea, em especial a Arrabidaea brachypoda.
Para a obtenção do extrato, a biomassa compreendendo raízes, caules, cascas, e folhas, bem como misturas destes, é extraída por meio de percolação, maceração soxhlet ou por meio de gases em estado supercrítico, bem como uma mistura dessas técnicas.
A biomassa pode estar verde e/ou seca, pulverizada, moída, em pedaços e/ou esfarelada. De forma opcional, a biomassa é congelada antes de ser processada.
O congelamento prévio do material vegetal evita a degradação térmica provocada pelo aquecimento ao passar pelo moinho elétrico.
A extraçao é feita utilizando meio básico ou meio ácido, em meio aquoso ou utilizando solventes orgânicos, isolado ou em combinações.
Os ácidos podem ser ácidos fortes ou fracos, diluídos ou concentrados, isolados ou em misturas.
Em modalidades específicas da invenção, o ácido é selecíonado dentre ácido acético, ácido clorídrico e ácido fórmico .
As bases, por sua vez, podem estar concentradas ou diluídas, isoladas ou em misturas.
Em modalidades específicas da invenção, a base é selecionada dentre hidróxido de amónia (NH4OH) e carbonato de sódio (Na2C03) .
0 solvente orgânico é selecíonado dentre aqueles que compreendem compostos halogenados, álcoois, aldeídos, éteres, ésteres, cetonas, alcanos, cicloalcanos, compostos fenólicos, benzenos e derivados, isolados ou suas misturas.
O extrato obtido pode ser seco com a tecnologia de secagem por pulverização (spray-drying) , à pressão reduzida ou à temperatura ambiente.
Para a secagem por pulverização, as temperaturas de entrada e saida variara entre 150 e 190 °C e 80 e 90 °C, respectivamente. Já na secagem à pressão reduzida, a mesma varia entre 25 e 100 °C.
Os diferentes compostos são separados e purificados por meio de técnicas cromatográficas com ou sem pressão, como cromatografia a pressão atmosférica ou cromatografia a baixa, média ou alta pressão.
Para execução da técnica, pode-se utilizar uma fase estacionária normal, tal comó a sílica gel, ou uma fase inversa, tal como a C-8 ou C-18.
Ainda, pode-se utilizar a partição líquido/líquido, tal como a cromatografia contra corrente, ou a partição centrífuga, utilizando resinas de troca iônica ou membranas de filtração.
A fim de identificar as moléculas responsáveis pela atividade farmacológica, o extrato de raízes de Arrabídaea brachypoda é submetido a um fracionamento guiado.
0 extrato é fracionado por cromatografia a pressão média ( PLC) em fase reversa, com um sistema de solventes apresentando gradiente por passos de metanol-água a partir de 10:90, com aumento gradual até 100%.
A pressão máxima é de 20 bar (2xl03 kPa) e as amostras são colocadas em um cartucho de introdução após sua mistura com a fase estacionária (sílica) em uma proporção em peso de 1:3.
As frações são testadas nos testes antiulcerogênico . A partir destas frações, são obtidos os compostos isolados RAB-01, RAB-02 e RAB-03, cujas estruturas são elucidadas através de métodos espectroscópicos (tal como ultravioleta UV, ressonância magnética nuclear - RMN 1D e 2D, espectrometria de massa a baixa e alta resolução - MS e HRMS) , além de reações químicas e enzimáticas.
Os compostos isolados foram identificados como sendo flavonoides diméricos de fórmula I abaixo:
Figure imgf000010_0001
em que, para RAB-01, R é hidroxila; para RAB-02, R é metoxila e para RAB-03, R é hidrogénio.
A estrutura dos mesmos é identificada por técnicas clássicas de elucidação estrutural, incluindo ultravioleta, ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massa (MS) .
Os dados referentes a ressonância magnética nuclear de hidrogénio (MeOD, 500 MHz) , ressonância magnética nuclear de carbono (MeOD, 125 MHz) e espectrometria de massas para cada um dos componentes RAB-01, RAB-02 e RAB-03 estão descritos abaixo e nas tabelas 1, 2 e 3:
RAB-01 - Sólido amorfo vermelho; [a] D20'1 -108, 43° (c 0.1 MeOH) ; UV Amax (log e) 266 nm (5.02); lH-RMN ( CD3OD, 500 MHz) e 13C-RMN (CD3OD, 125 MHz) : Tabela 1; ESI-MS (modo positivo) : m/z 525.1 [M+H]+; HRMS: m/z 525.1926 [M+H]+ (calculado para C32H28O7, 525.1913, Δ ppm = 1.3).
RAB-02 - Sólido amorfo laranja; [ ]D 20,9 -118, 80° (c 0.1 MeOH); UV Àraax (log e) 254 nm (4.82); 'H-RMN (CD30D, 500 MHz) e 13C-RMN (CD3OD, 125 MHz) : Tabela 1; ESI- S (Modo positivo) m/z 539.1 [M+H]+; HRMS (modo positivo) m/z 539. 2095 [M+H]+ ]+ (calculado para C33H3o07, 539. 2070, Δ ppm = 4.6) .
RAB-03 - Sólido amorfo laranja; [a] D20'1 -82,86 {c 0.1
MeOH) ; UV Àmax {log e) 266 nm (5.78); lH-RMN (CD3OD, 500 MHz) e 13C-RMN (MeOD, 125 MHz) : tabela 1; ESI-MS (modo positivo) m/z 509.1 [M+H]+; HRMS (Pos. Mod) : 509.1974 [M+H] + ]+ (calculado para C32H2906, 509.1964, Appm = 2.0) .
Tabela 1. Dados de RMN de XH e RMN de 13C (500 e 125 MHz,
30D,~5 em ppm) do composto RAB
N° 2H 13C
1 161.1
2 6.08 d, J = 2.2 92.8
3 161.1
4 5.94 d, J = 2.2 96.4
4a 157.8
6 4.78 d, J = 11.2 78.2
6a 2.22 dt, J = 11.2, 1.9 Hz 42.4
3.17 ddd, J = 5.5, 1.9,
7 34
1.6 Hz
7a 101.8
8 160.2
9 6.05 d, J = 2.1 Hz 93
10 159.1
11 5.98 d, J = 2.1 Hz 96.5
11a 155.4
12a 5.28 d, J = 2.3 Hz 63.5
12b 103.8 1· 140.4
2' ,6' 7.24 d, J = 7.6 Hz 128.5
3' ,5' 7.38 m 129.5
4' 7.38 m 129.6
A 5.95 dd, J = 15.9, 5.5 Hz 130.7
Β 5.81 dd, J = 15.9, 1.6 Hz 131.7
1' ' 130.4
2 ' ' , 6' * 7.05 d, J = 8.6 Hz 128.4
3' ' , 5' ' 6.64 d, J= 8 . 6 Hz 116.2
4· ' 157.7
1-OMe 3.81 s 56.1
8-OMe 3.62 s 55.9
41 ' -OMe - -
Tabela 2. Dados de RMN de 1U e RMN de 13C (500 e 125 MHz,
CD3OD, δ em ppm) do composto RAB-02.
N° XH 1 3C
1 160.9
2 6.08 d, J= 2.1 Hz 92.7
3 161, 1
4 5.94 d, J= 2.1 Hz 96.3
4a 157.7
6 4.77 d, J = 11.3 Hz 78.1
6a 2.19 dt, J = 11.3, 1.9 Hz 42.3
3.17 ddd, J = 5.6, 1.9,
7 34
1.6 Hz
7a 101.6
8 160.2
9 6.05 d, J = 2.1 Hz 93
10 159.2 11 5.98 d, J = 2.1 Hz 96.5
11a 155.3
12a 5.27 d, J = 2.3 Hz 63.4
12b 103.7
1* 140.4
2· ,6' 7.23 d, J = 7.0 Hz 128.5
3' ,5* 7.38 m 129.5
4' 7.38 m 129.5
A 5.99 dd, J = 15.8, 5.6 Hz 131.5
B 5.83 dd, J = 15.8, 1.6 Hz 131.3
1· » 131.1
2■ ' , 6' · 7.11 d, J = 8.8 Hz 128.2
3' ' , 5' ' 6.75 d, J = 8.8 Hz 114.8
4' » 160.2
1-OMe 3.79 s 56.1
8-OMe 3.62 s 55.9
4 · 1 -O e 3.73 s 55.6
Tabela 3. Dados de RMN de 1H e RMN de 13C (500 e 125 MHz,
CD3OD, δ em ppm) do composto RAB-03.
N° 13C
1 161.1
2 6.08 d, J = 2.2 Hz 92.8
3 161.1
4 5.95 d, J = 2.2 Hz 96.4
4a 157.8
6 4.79 d, J= 11.3 Hz 78.2
6a 2.24 dt, J = 11.3, 1.9 Hz 42.2
3.21 ddd, J = 5.7, 1.9,
7 34.2
1.7 Hz 7a 101.5
8 160.2
" 9 6.05 d, J = 2.3 Hz 93
10 159.2
11 5.99 d, J = 2.3 Hz 96.6
11a 155.4
12a 5.28 d, J = 2.4 Hz 63.5
12b 103.8
1 * 140.4
2' , 6' 7.24 d, J = 7.6 Hz 128.5
3' ,5' 7.38 m 129.5
4 ' 7.38 m 129.6
A 6.15 dd, J = 15.7, 5.7 Hz 133.8
B 5.91 dd, J = 15.7, 1.7 Hz 132
11 ' 138.6
2 · ' , 6' ' 7.18 m 127.2
3' ', 5' * 7.18 m 129.4
4 ' ' 7.10 m 128
1-OMe 3.79 s 56.1
8-OMe 3.61 s 55.9
4 ' ' -OMe - -
Incorporação dos compostos RAB-01, RAB-02 e RAB-03 em composições farmacêuticas :
As composições farmacêuticas obtidas de acordo com a presente invenção compreendem os compostos RAB-01, RAB-02 e RAB-03 em quantidades padronizadas, em sua forma isolada ou em associação com outros produtos naturais ou sintéticos, em diferentes proporções.
Preferencialmente, as composições farmacêuticas desta invenção compreendem os compostos RAB-01, RAB-02 e RAB-03 em uma faixa de concentração que varia de 0,001 a 50 % de pelo menos um dos compostos em sua forma livre ou na forma de sal (como cloratos, sulfatos ou boratos), associados a excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
As composições farmacêuticas podem ainda compreender fármacos, vitaminas, sais e/ou açúcares.
As composições ora descritas são apresentadas na forma de comprimidos, cápsulas gelatinosas (duras ou moles) , microcápsulas, nanoparticulas , tinturas, xaropes, emulsões do tipo O/A e A/O, lipossomas, líquidos injetáveis, aerossóis, pós, liofilizados e similares, para serem administradas por via oral, tópica, injetável ou inalável.
As referidas composições são úteis no tratamento de úlceras, principalmente úlceras pépticas.
Exemplos da. invenção:
A seguir, são apresentados exemplos expositivos de realizações particulares da presente invenção, sem criar quaisquer limitações ao seu escopo.
1 - Obtenção do extrato hidroalcoólico de Arrabidaea brachypoda :
Numa cuba de um extrator dotado de agitação mecânica, adiciona-se 1,5 kg de raízes, caules ou folhas de plantas do género Arrabidaea, tais como a Arrabidaea brachypoda, secas em estufas com temperatura controlada a 60 °C.
O material é pulverizado e congelado em nitrogénio líquido e, posteriormente, triturado em moinho elétrico.
Em seguida, adiciona-se 9,0 L de etanol 70% (v/v), com agitação frequente, pelo período de 150 horas.
A dorna de extração é aquecida gradativamente, em uma velocidade de aquecimento de 10 °C por minuto, até que se atinja uma temperatura entre 45 e 50 °C. Em seguida, o extrato é filtrado a quente, em uma temperatura que varia de 35 a 40 °C a vácuo, através de filtros de 100 a 150 mm.
Após evaporação do solvente em evaporador rotativo com pressão reduzida e temperatura máxima de 40 °C, obtém-se cerca de 20 g de um extrato hidroalcoólico concentrado.
2 - Obtenção da partição diclorometano de Arrabidaea brachypoda :
Cerca de 8,0 g do extrato hidroalcoólico é dissolvido em 500 mL de solução de água/metanol 8:2 e 250 mL de diclorometano a uma temperatura que varia de 20 a 25 °C.
A solução é adicionada a um balão de separação e, após a agitação, aguarda-se a separação das fases ao abrigo da luz. Ά fase diclorometânica é retirada e adiciona-se mais
250 mL de diclorometano, repetindo-se as etapas de agitação e separação de fases ao abrigo da luz.
0 processo é repetido até a exaustão, ou seja, até que a fase diclorometânica não apresente mais coloração ao ser misturada com a fase aquosa. A fase diclorometânica é rotaevaporada, apresentando um rendimento de 31,2%.
3 ~ Obtenção dos compostos ativos a partir da purificação do extrato de Arrabidaea brachypoda:
Após obtenção do extrato hidroalcoólico (conforme exemplificado em 1 ) e obtenção da partição diclorometano (conforme exemplificado em 2) , uma fase diclorometânica apresentando um rendimento de 33,7% é obtida.
0 extrato diclorometânico assim obtido é purificado por cromatografia líquida a média pressão (CLMP) utilizando sistema eluente composto por uma mistura de metanol e água em modo gradiente (5 % a 100 % em 72 horas) e uma fase estacionária a fase inversa (C-18 e 15-25 μκι) em uma coluna de 460 mm de largura por 70 mm de diâmetro.
Os compostos foram detectados por ultravioleta a 254 nm. As frações obtidas são submetidas a diversas técnicas cromatográficas, de modo a isolar os compostos RAB-01, RAB-
02 e RAB-03.
Avaliação da atividade gastxoprotetora:
Para efeito comparativo, as drogas utilizadas para a determinação da atividade antiulcerogênica dos compostos obtidos a partir da Arrabidaea brachypoda foram:
- lansoprazol;
- carbenoxolona;
- indometacina;
- cimetidina.
Todas as drogas foram preparadas imediatamente antes da administração em solução salina com concentração de 0, 09%.
Os animais utilizados eram ratos machos unib- H, com massa entre 150 e 250 gramas. Os animais foram aclimatados às condições do laboratório por pelo menos sete dias antes da manipulação experimental, com temperatura (23 ± 2 °C) e ciclos claro-escuro de 12 horas controlados. Ainda, os mesmos foram alimentados com ração e água ad libitum e distribuídos ao acaso nos diferentes grupos experimentais, sendo submetidos a jejum (com água ad libitum) de pelo menos 12 horas, dependendo do tipo de experimento.
Envolvimento do NO na gastroproteção (técnica desenvolvida por Síkiríc et al. em 1997):
Os ratos submetidos a jejum por 24 horas foram divididos em grupos de acordo com os tratamentos .
O grupo controle recebeu injeção peritoneal de solução salina ou a administração de L-NAME (N-nitro-L-arginina metil éster), um inibidor da NO-sintase pela mesma via (10 mg/kg) .
Após 30 min, os grupos receberam (i) veiculo (salina) , (ii) extrato de Arrabidaea brachypoda e (iii) carbenoxolona (controle positivo) por via oral.
Posteriormente, decorridos 50 minutos da administração dos pré-tratamentos , os animais receberam oralmente etanol absoluto. Os animais foram sacrificados após 1 hora e os estômagos foram removidos e abertos na grande curvatura para determinação da área das lesões.
Envolvimento de grupamentos sulfidrila na gastroproteção (técnica desenvolvida por Matsuda et al. Em 1999) :
Após jejum de 24 horas, os animais foram divididos ao acaso em grupos, tratados com uma injeção subcutânea de solução salina (controle negativo) ou 10 mg/kg de N- etilmaleimida (NEM) , um bloqueador dos grupos sulfidrilas.
Após 30 min do pré-tratamento, os grupos receberam veiculo (10 mL/kg) , carbenoxolona (controle positivo) e extrato de A. brachypoda (300 mg/kg) por via oral.
Trinta minutos após o tratamento, todos os grupos de animais receberam etanol absoluto pór via oral. Uma hora depois, os animais foram sacrificados e seus estômagos foram removidos e abertos ao longo da grande curvatura para determinação da área das lesões.
Determinação dos níveis de PGE2 (técnica desenvolvida por Curtis et al. em 1995): O tecido dos animais submetidos à úlcera induzida por DAINES foi homogeneizado e preparado conforme metodologia conhecida, procedendo-se à sensibilização e leitura por ELISA.
Dosagens em tecido de animais submetidos à úlcera induzida por etanol:
- Determinação dos níveis de glutationa (GSH) :
Para efetuar a determinação do conteúdo de glutationa total, usou-se o método descrito por Anderson em 1985, que se baseia na oxidação total da glutationa reduzida (GSH) presente em uma amostra à sua forma oxidada (GSSG) , por meio da incubação da amostra com o ácido ditiobisnitro benzóico (DTNB) .
O DTNB reduzido adquire uma coloração amarelada, que pode ser determinada espectrofotometricamente . O GSSG gerado é reduzido por ação da enzima glutationa redutase na presença de NADPH.
O GSH formado se oxida novamente, gerando um ciclo continuo, no qual a velocidade de redução do DTNB (e o seu consequente aumento de absorbância a 412 nm) é proporcional à quantidade total de glutationa (GSH+GSSG) .
Para efetuar a determinação do conteúdo de glutationa total, foram utilizados os extratos citosólicos obtidos dos estômagos dos animais do experimento de úlcera induzida por etanol.
As amostras, após descongelamento, tiveram 20 uL do seu volume retirado e pipetado em uma placa de 96 canais, onde se adicionam 140 \i de NADPH, 5 μΐ. de PBS e 20 \iL DTNB.
A placa foi disposta no leitor do espectrofotômetro, onde permaneceu incubada por 5 minutos em uma temperatura de 30°C.
Após este período, foram adicionados 15i de glutationa redutase e registrou-se o aumento de absorbância a 412 nra. Os resultados foram expressos como nmol/g de tecido .
- Determinação da atividade da glutationa redutase
(GR) :
Para a determinação da atividade da GR, a reação enzimática foi preparada com 100 pL da amostra (após centrifugação e diluição do sobrenadante em tampão fosfato pH = 7,4, na relação 1:10) e 150 L da mistura formada por EDTA (0,20 mM) , glutationa oxidada (1 mM) e NADPH (0,1 mM) . A absorbância foi lida a 365 nm, entre 0 e 10 min, conforme técnica desenvolvida por Carlberg & Mannervik, 1985.
- Determinação da atividade da glutationa peroxidase (GPx) :
As amostras foram centrifugadas a 12000 rpm, a 4 °C, por 15 min e o sobrenadante foi diluído em tampão fosfato 0,1 M (pH = 7,4) na proporção 1:10.
A uma alíquota de 100 pL do raspado, foram adicionados 150 uL de solução de glutationa reduzida (10 mM) , NADPH (4 mM) e glutationa redutase (1U) e 20 L de H202 (25 mM) , de acordo com método desenvolvido por Yoshika a et al. em 1993. A absorbância foi determinada a 365 nm, entre 0 e 10 min .
- Avaliação do efeito cicatrizante de úlcera induzida por ácido acético (técnica desenvolvida por Takagi et al. em 1969) :
ratos foram anestesiados com cloridrato de xilazina e cetamina para a realização de uma incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifoide.
A parede anterior do estômago foi exposta e uma área da serosa foi delimitada com um anel plástico sobre a qual se adicionou 50 iL de ácido acético P.A. com auxilio de uma micropipeta automática, sendo mantido o contato entre o ácido e a serosa durante 60 segundos.
Em seguida, a área foi limpa com solução salina e os animais tiveram suas cavidades abdominais fechadas, sendo mantidos em repouso até completa recuperação da anestesia para, então, serem acondicionados no biotério.
Depois de 48 horas do procedimento cirúrgico, iniciou- se a administração oral dos tratamentos (uma vez ao dia durante 7 e 14 dias) com o EAB (300 mg/Kg), lansoprazol (30 mg/kg - controle positivo) e veiculo (solução salina 0.9% - controle negativo) .
Os animais foram pesados e observados desde a indução das lesões até o final dos tratamentos. Ao final deste período, os animais foram sacrificados, seus estômagos foram removidos e abertos no sentido da maior curvatura para determinação da área da lesão ulcerativa.
Também foram coletadas seções de tecido para confecção de lâminas histológicas. Os animais também tiveram coração, pulmões, fígado, rins e testículos coletados e pesados para verificação de possíveis sinais de toxicidade.
- Expressão das proteínas COX-1, COX-2 e EGF:
O homogenato gástrico foi centrifugado a 12000 rpm, a 4 °C, por 15 minutos. Valores determinados de proteína (50 ug) foram aplicados em gel de poliacrilamida e submetidos à eletroforese, com solução tampão. 0 gel foi submetido a 120V durante todo o processo.
Em seguida, as proteínas separadas no SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, em equipamento de eletrotransferência, com as membranas embebidas em tampão de transferência, mantidas em voltagem constante de 25 V, corrente de 1,0 A por 12 minutos.
As membranas de nitrocelulose contendo as proteínas transferidas foram incubadas em solução bloqueadora por uma hora para diminuir a ligação inespecífica de proteínas.
Em seguida, as membranas foram submetidas a sucessivas lavagens com tampão, em intervalos de 5 minutos. A membrana foi incubada a 4 °C durante uma noite, usando anticorpo específico para COX-1, COX-2 e EGF.
Após esse procedimento, a membrana de nitrocelulose foi novamente submetida a sucessivas lavagens com tampão, sendo, em seguida, incubada à temperatura ambiente por 1 h com anticorpo secundário para COX-1, COX-2 e EGF.
Para detectar as bandas imunoreativas, as membranas foram embebidas com solução de quimioluminescência por 5 minutos. Após esse período, as membranas foram colocadas em fotodocumentador para detecção das bandas fluorescentes e posterior análise densitométrica com auxílio do software específico.
- Determinação da atividade da MPO:
Por se tratar de um importante indicador inflamatório, verificou-se, ainda, a atividade da MPO no modelo de úlcera crónica .
- Preparação de lâminas histológicas:
Os cortes e lâminas histológicas foram preparados por fixação do material em ALFAC (formalina, álcool 80% e ácido acético) por 24 horas. As peças foram então desidratadas e incluídas em meio sólido apropriado.
Posteriormente, os blocos do meio foram cortados (7 μιη de espessura) em micrótomo, de maneira seriada. As amostras foram submetidas à coloração por hematoxilina-eosina (HE) para observação geral da estrutura e celularidade em microscopia de luz.
- Análise estatística:
Todos os resultados foram tratados estatisticamente e expressos como média ± desvio ou erro padrão e submetidos à análise de variância de uma via e, posteriormente, teste de Dunnett e/ou Tuckey com um nível de significância mínimo de *P < 0,05.
Úlcera gástrica induzida por etanol (técnica desenvolvida por Morimoto et al. em 1991):
Ratos unib-WH foram submetidos a jejum de 24 h com água ad libitum. No dia do experimento, eles foram divididos em 7 grupos: salina como controle negativo, lansoprazol como controle positivo e quatro grupos com o extrato das raízes da A. brachypoda em diferentes concentrações (doses de 10, 30, 100 e 300 mg. Kg"1) dissolvido em salina em concentrações de 10 mL.Kg-1.
Os animais receberam o tratamento previsto para cada grupo e, uma hora depois, foi administrado 1 mL de etanol absoluto por via oral.
Após uma hora da indução da úlcera, os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical e seus estômagos retirados para quantificação das lesões.
Calculadas as áreas das lesões, os estômagos foram homogeneizados, preparados os extratos citosólicos e membranados para a realização de ensaios bioquimicos.
- Úlcera gástrica induzida por anti-inflamatório não esteroidal (AINE) :
Os animais foram submetidos a jejum de 24 horas com água ad libitum. No dia do experimento, os animais foram divididos em cinco grupos: SHAM, salina, carbenoxolona, tratamento com o extrato da planta A. brachypoda que será submetido à administração de indometacina e tratamento com o extrato da planta em que a indometacina não será administrada, para posterior avaliação dos níveis de prostaglandina E2.
Os grupos receberam os respectivos tratamentos via oral e, após 30 minutos, foi administrado o agente lesivo, indometacina (50 mg. Kg"1 solubilizada em carbonato de sódio 0,5%) em todos os grupos, menos no grupo SHAM e no que recebeu tratamento com a planta apenas para a verificação da PGE.
Transcorridas seis horas da administração da indometacina, todos os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e tiveram seus estômagos retirados para contagem das lesões. A porção glandular foi raspada e congelada a -80 °C para ensaios bioquímicos.
- Ligadura de piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico (técnica desenvolvida por Shay e Gruenstein em 1946) :
Os ratos ficaram em jejum de 48 horas com água ad libitum. No dia do experimento, os animais foram divididos em quatro grupos: salina, lansoprazol, cimetidina e tratados com extrato da planta A. brachypoda.
Os ratos foram anestesiados e sofreram uma incisão longitudinal logo abaixo da apófise xifoide para a amarradura do piloro.
A administração das drogas foi realizada logo após a amarradura, por via intraduodenal . As incisões foram suturadas e, após quatro horas da cirurgia, os ratos foram sacrificados. Os estômagos foram retirados cuidadosamente e a secreção ácida foi coletada. Após centrifugação, o volume e pH da secreção de cada animal foi medido.
- Determinação da produção de muco aderido à mucosa gástrica (técnica desenvolvida por Corne et ai. em 1974):
Os ratos ficaram de jejum por 24 horas com água ad libitum para a realização do experimento. Os animais foram divididos em três grupos: salina, carbenoxolona e extrato da planta Ά. brachypoda.
Os grupos receberam os respectivos tratamentos por via oral e, transcorrida 1 hora, foi realizada a ligadura do piloro. Após quatro horas os animais foram sacrificados e os estômagos foram retirados e abertos no sentido da grande curvatura .
Os segmentos glandulares do estômago foram removidos e pesados e cada segmento foi transferido imediatamente para um tubo contendo agente corante. Após imersão por 2 horas nesta solução, o excesso de tinta foi removido por duas lavagens sucessivas com 10 mL de solução de sucrose 0.25 M, primeiro por 15 minutos e, então, por 45 minutos.
A tinta complexada com o muco da parede gástrica foi extraída com 10 mL de MgCl2 0,5 M por agitação intermitente por 1 minuto, a intervalos de 30 minutos, durante 2 horas.
Uma alíquota de 4 mL do extrato azul foi vigorosamente agitada com um volume igual de éter dietílico. A emulsão resultante foi centrifugada a 3600 rpm por 20 minutos e a absorvância da camada aquosa foi determinada a 580 nm.
A quantidade de corante extraída por grama de tecido glandular foi então calculada e expressa como concentração do corante em iq por mL de solução por grama de porção glandular.
- Atividade da mieloperoxidase (MPO) :
A atividade da mieloperoxidase foi determinada através do método descrito por Krawisz et al . em 1984. As amostras foram homogeneizadas em tampão de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB) a 0,5% (p/v) em tampão fosfato salina (50 m , pH 6,0) com diluição final de 1:20 (p/v) até que a obtenção de um aspecto uniforme.
O HTAB atua como detergente, facilitando a liberação da enzima MPO dos grânulos de azurófilos dos neutrófilos, onde se encontra armazenada.
O homogenato foi submetido ao banho ultrassônico por 10 segundos, seguido de triplo processo de congelamento e descongelamento, que facilita a ruptura das estruturas celulares e, em consequência, a liberação da enzima.
A amostra foi centrifugada a 7000 G, durante 10 minutos e a atividade da MPO foi determinada seguindo a cinética da reação frente à água oxigenada.
Numa placa de ELISA, foram colocados 50 \i do sobrenadante e 150 L de reativo de coloração e peróxido de hidrogénio (0,066%), em tampão fosfato (50mM, pH 6,0).
A absorbância foi determinada a 450 nm e a atividade da enzima foi calculada por interpolação em curva padrão, realizada com MPO procedente de neutrófilos humanos.
Uma unidade de MPO é definida como a quantidade necessária para degradar 1 mmol/minuto de peróxido de hidrogénio 25 °C. Os resultados foram expressos como U/g de proteína.
Resultados obtidos:
- Envolvimento do NO na gastroproteção
A figura 1 mostra os dados obtidos na avaliação do envolvimento do NO na gastroproteção promovida pela A. brachypoda (300 mg. kg"1).
Os resultados mostrados indicam que a gastroproteção exercida pelo extrato de A. brachypoda não deve ser mediada pelo NO, pois mesmo com sua síntese bloqueada pelo L-NAME, a atividade foi verificada pela redução dos danos à mucosa gástrica, tanto dos animais que não receberam L-NAME quanto daqueles que o receberam,
Envolvimento dos grupamentos sulfidrila na gastroproteção :
Na Figura 2, está representado graficamente o resultado da observação feita sobre o envolvimento de grupamentos sulfidrila na proteção à mucosa gástrica exercida pela administração oral de A. brachypoda (300 mg. kg'1) .
Os resultados obtidos demonstram que o grupo salina associado a NEM (B) não respondeu ao pré-tratamento com NEM, no entanto, uma análise sobre o resultado com os grupos tratados com carbenoxolona permite sugerir que A. brachypoda pode não depender de grupamentos sufidrila para promover proteção à mucosa gástrica, muito embora este modelo experimental tenha apresentado variação anormal no controle negativo.
- Ensaios de atividade antioxidante : Os ensaios avaliaram a atividade antioxidante das enzimas glutationa redutase (GR) , glutationa peroxidase (GPx) e os níveis de grupamentos sulfidrila (GSH) na mucosa gástrica de ratos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol.
Tabela 1 - Efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda sobre a atividade enzimática de GR e GPx da mucosa gástrica de ratos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol.
Figure imgf000028_0001
Os dados mostrados na Tabela 1 indicam que a A. brachypoda não exerce ação sobre as enzimas GR e GPx, ao contrário do lansoprazol que apresentou maior atividade dessas duas enzimas na mucosa gástrica de ratos.
Tabela 2 - Efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda sobre os níveis de GSH na mucosa gástrica de ratos submetidos ao modelo de úlcera induzida por etanol.
Figure imgf000028_0002
Os níveis de GSH não foram mantidos ou aumentados pe administração oral de A. brachypoda aos ratos submetidos modelo de úlcera induzida por etanol, já o tratamento com lansoprazol levou a preservação ou ao aumento dos níveis citosólicos de GSH.
Úlcera induzida por ácido acético - modelo subcrônico :
Avaliação da toxicidade subcrônica:
As Figuras 3, 4 e 5 são ilustrativas dos dados que representam indicativos de toxicidade subcrônica dos tratamentos experimentais.
Um análise da relação entre o peso dos órgãos e dos animais tratados por 7 dias mostrou que os grupos em que foi administrado lansoprazol e A. brachypoda apresentaram redução desta relação nos pulmões, este último tratamento também apresentou o mesmo efeito para o coração (Figura 3) .
A Figura 4 mostra a mesma relação verificada na Figura 3, no entanto, a análise se deu após 14 dias de tratamento e não foram observadas diferenças significantes.
A Figura 5 mostra a evolução de peso corporal dos animais tratados subcronicamente e também serve como indicativo de toxicidade, embora tenha havido queda na média do peso corporal dos animais tratados com lansoprazol, nenhuma diferença estatística significativa foi observada.
Cicatrização da lesão:
As Figuras 6 e 7 representam os dados obtidos na verificação da área de lesão ulcerogênica medida após 7 e 14 dias consecutivos de tratamento.
Na Figura 6, observa-se que o tratamento com A. brachypoda promoveu redução da área de lesão após o período de 7 dias, bem como o grupo controle administrado com o lansoprazol .
De acordo com a Figura 7, fica claro que o tratamento com A. brachypoda mantém seu efeito cicatrizante após 14 dias consecutivos de tratamento, sendo mais eficiente que o grupo controle lansoprazol.
A Figura 8 mostra a evolução do processo de cicatrização, evidenciado pela redução da área da lesão ao longo do período de tratamento. É importante ressaltar que, após 20 dias, as lesões são recuperadas fisiologicamente.
Os dados mostrados evidenciam a aceleração promovida pelos tratamentos com lansoprazol e A. brachypoda na recuperação da mucosa gástrica de ratos.
- Atívidade da MPO:
As Tabelas 3 e 4 reúnem os dados obtidos na avaliação da atividade enzimática da enzima MPO.
Tabela 3. Efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda por 7 dias consecutivos sobre a atividade da MPO da mucosa gástrica de animais submetidos ao modelo de úlcera induzida por ácido acético.
Figure imgf000030_0001
Após 7 dias de tratamento, os grupos experimentais apresentaram elevada atividade da enzima MPO. Ainda, o grupo tratado com A. brachypoda apresentou valores mais elevados que os demais grupos, embora não tenha sido verificada diferença estatística .
Tabela 4. Efeito da administração oral do extrato das raízes de A. brachypoda por 14 dias consecutivos sobre a atividade da MPO mucosa gástrica de animais submetidos ao modelo de ulcera induzida por ácido acético .
Figure imgf000031_0001
Os grupos tratados com lansoprazol e A. brachypoda por 14 dias consecutivos tiveram redução da atividade da MPO, com maior significância para este último.
A Figura 9 reúne graficamente os resultados das Tabelas 3 e 4, comparando-os . Uma análise dos resultados obtidos para a atividade da MPO mostra que a mesma encontra-se alta após 7 dias de tratamento, sendo reduzida nos grupos tratados com lansoprazol e A. brachypoda por mais de 7 dias, sugerindo uma participação importante da enzima no processo de cicat ização.
- Análise histológica :
As figuras 10A, 10B, 10C, 10D, 10E e 10F e 11A, 11B, 11C, 11D, 11E e llF correspondem a fotomicrografias dos estômagos dos animais submetidos ao modelo subcrônico de úlcera induzida por ácido acético e tratados por 7 e 14 dias, respectivamente.
A análise das fotomicrografias mostradas na Figura 10 sugere que o tratamento com A. brachypoda promoveu recuperação da mucosa, manutenção das glândulas e redução da borda de lesão, o que caracterizou seu efeito protetor, no entanto verifica-se maior extensão da submucosa que pode estar associada ao infiltrado neutrofilico que se desloca para a mucosa.
A Figura 11 mostra que os grupos tratados com lansoprazol e A. brachypoda aceleraram a cicatrização da mucosa gástrica em relação ao grupo salina, o qual apresenta grande infiltrado neutrofilico nas camadas mucosa e submucosa. As imagens mostram intensa redução da lesão nos grupos experimentais, demonstrando a melhora promovida pela administração tanto de lansoprazol quanto de A. brachypoda.
- Experimento de indução de úlcera por etanol:
A figura 12 evidencia que a atividade antiulcerogêníca do extrato das raízes da planta A. brachypoda é melhor obtida para as doses de 300 mg. Kg"1.
As demais doses não apresentaram atividade significativa. Em vista deste resultado, os experimentos subsequentes foram realizados com esta dose.
- Experimento de indução de úlcera por AINE:
De acordo com os dados ilustrados na figura 13, o pré- tratamento com o extrato hidroalcoólico da planta A. brachypoda na dose de 300 mg. Kg"1 promove a proteção da mucosa no modelo de indução de úlcera por AINE.
- Ligadura do piloro e avaliação dos parâmetros do suco gástrico :
Os resultados apontados na tabela 5 abaixo mostram que o extrato hidroalcoólico das raízes da A. brachypoda possui atividade antissecretora, já que se observa um aumento no pH e uma diminuição do volume de secreção no grupo de animais tratados com o extrato, quando comparado com o grupo tratado com a solução salina.
Tabela 5 - Volume (mL) e pH da secreção ácida gástrica medidos após a administração intraduodenal do extrato hidroalcoólico de A. Brachypoda no modelo de ligadura do piloro
Volume de secreção
Tr tamento pH
ácida gástrica (mL)
Salina 0,51 10 4,90 0,13
Lansoprazol 0,81 0,15 5,41 0,04*** Clmetldlna. 0,31 0,03** 5,39 0,11***
A. hrachypoda 0,41 0,09 5,19 0,05***
- Determinação da produção de muco:
Os dados ilustrados na figura 14 mostram que o tratamento com o extrato hidroalcoólico da A. brachypoda não interfere na produção de muco aderido à mucosa.
- Determinação da MPO e determinação dos níveis de GSH:
Os dados apresentados na tabela 6 abaixo mostram que o tratamento com o extrato hidroalcoólico de A. brachypoda mostrou-se eficaz em reduzir a atividade da MPO.
Tabela 6 - Atividade enzimática da MPO em ratos tratados com o extrato hidroalcoólico (70%) das raízes da planta A. brachypoda no modelo de úlceras induzidas por etanol.
Tratamentos MPO
(U/mg de proteína)
Salina 0,26 0, 01
Lansoprazol 0,16 0, 04*
A. brachypoda. 0,12 0,01**

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Uso de compostos obtidos a partir de extratos da Arrabidaea brachypoda caracterizado pelo fato de ser no preparo de uma composição farmacêutica para tratar doenças ulcerogênicas .
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as doenças parasitárias são selecionadas do grupo que consistem em úlceras que acometem a pele, úlceras mucosas, úlceras serosas e as úlceras complexas.
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