WO2015080273A1 - イソプレンモノマーの製造方法 - Google Patents

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WO2015080273A1
WO2015080273A1 PCT/JP2014/081645 JP2014081645W WO2015080273A1 WO 2015080273 A1 WO2015080273 A1 WO 2015080273A1 JP 2014081645 W JP2014081645 W JP 2014081645W WO 2015080273 A1 WO2015080273 A1 WO 2015080273A1
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isoprene
ptac
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strain
microorganism
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義教 田島
大貫　朗子
博昭 良知
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味の素株式会社
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03027—Isoprene synthase (4.2.3.27)

Definitions

  • the present invention relates to an isoprene synthase-expressing microorganism having improved expression of pyrophosphate phosphatase, a method for producing an isoprene monomer using the isoprene synthase-expressing microorganism, and the like.
  • Natural rubber is a very important raw material in the tire industry and rubber industry. As demand increases in the future due to motorization centering on emerging countries, it is difficult to expand farms due to deforestation regulations and competition with palms, so it is difficult to expect an increase in the yield of natural rubber, and the supply-demand balance becomes tight. It is expected to go. Synthetic polyisoprene is an alternative material to natural rubber, but the raw material monomer (isoprene (2-methyl-1,3-butadiene)) is obtained mainly by extraction from the C5 fraction obtained by naphtha cracking. . However, in recent years, the production of isoprene has been decreasing due to the lightening of the cracker feed, and there is concern about its supply. In recent years, it is strongly affected by fluctuations in oil prices, and in order to stably secure isoprene monomers, establishment of a system for producing isoprene at low cost from non-petroleum resources is desired.
  • Non-patent Document 1 The reaction mechanism of isoprene synthase has also been clarified, and pyrophosphate and isoprene are produced using DMAPP (dimethylally pyrophosphate) as a substrate (Non-patent Document 1).
  • DMAPP dimethylally pyrophosphate
  • Non-patent Document 2 As an effect of the product pyrophosphate on the activity of isoprene synthase, it has been known that the enzyme activity of isoprene synthase derived from willow (Salix discol L.) is decreased by 1 mM sodium pyrophosphate (non- Patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide a biological method excellent in isoprene production.
  • the present inventors have found that, by improving the expression level of pyrophosphate phosphatase in an isoprene synthase-expressing microorganism, the ability to produce isoprene monomer is improved, and the present invention has been completed. It came to do.
  • the present invention is as follows.
  • the microorganism is a microorganism transformed with an isoprene synthase expression vector.
  • a method for producing isoprene monomer comprising culturing the isoprene synthase-expressing microorganism of any one of [1] to [12] in a culture medium to produce isoprene monomer.
  • a method for producing an isoprene polymer comprising the following (I) and (II): (I) producing an isoprene monomer by the method of [13]; (II) polymerizing isoprene monomers to produce isoprene polymers.
  • a rubber composition comprising the polymer of [15].
  • the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention is excellent in isoprene-producing ability and significantly improves the glucose yield.
  • the growth of the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention also improves as the expression of pyrophosphate phosphatase increases (eg, see FIG. 13).
  • FIG. 1 is a diagram showing an analysis of PPA expression by SDS-PAGE.
  • Controls in lanes 1 and 2 mean samples prepared from MG1655 Ptac-KKDyI strain.
  • Ptac-ppa in lanes 3 and 4 means a sample prepared from MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa strain.
  • M means protein molecular weight marker.
  • FIG. 2 is a graph showing the amount of isoprene generated per unit weight of the dried leaves of various plants.
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of isoprene generated per total amount of protein extracted from leaves of various plants.
  • FIG. 4 is a diagram showing an overview of the downstream of the mevalonate pathway immobilized on the chromosome and the surrounding region.
  • FIG. 1 is a diagram showing an analysis of PPA expression by SDS-PAGE.
  • FIG. 5 is a diagram showing an outline of the downstream of the mevalonate pathway controlled by the tac promoter in the chromosome and its surrounding region.
  • FIG. 6 shows a map of the pAH162-Para-mvaES plasmid.
  • FIG. 7 is a diagram showing a map of pAH162-KKDyI-ispS (K).
  • FIG. 8 is a diagram showing a map of pAH162-Ptac-ispS (M) -mvk (Mma).
  • FIG. 9 is a diagram showing the construction of ⁇ ampC :: KKDyI-ispS (K) chromosome variant.
  • FIG. 10 is a diagram showing the construction of ⁇ ampH :: Para-mvaES chromosome variant.
  • A) shows ⁇ Red-dependent replacement of the ampH gene by the attLphi80-kan-attRphi80 PCR-generated DNA fragment.
  • FIG. 11 is a diagram showing the construction of a modified ⁇ crt :: KKDyI-ispS (K) of pEA320 megapramide.
  • A) is the result of P. elegans placed in the pEA320 megaplasmid. It is a figure which shows the structure of ananatis crt locus.
  • B) shows ⁇ Red dependent substitution of the crt operon by the attLphi80-kan-attRphi80 PCR generated DNA fragment.
  • FIG. 12 is a diagram showing the protein expression level of pyrophosphate phosphatase in the AG10265 strain.
  • Lane 1 Soluble protein derived from AG10265 strain
  • Lanes 2-4 Soluble protein derived from AG10265 Ptac- ⁇ 10-ppa1 strain
  • Lanes 5-6 Soluble protein derived from AG10265 Ptac- ⁇ 10-ppa2 strain
  • M Molecular weight marker.
  • FIG. 15 is a diagram showing a map of pAH162-mvaES.
  • FIG. 16 is a view showing a plasmid for immobilizing pAH162-MCS-mvaES chromosome.
  • Figure 17 is a diagram showing a set of chromosomes fixing plasmid carrying the mvaES gene under the transcriptional control of P PhOC.
  • FIG. 18 is a diagram showing the construction of a pAH162- ⁇ attL-KmR- ⁇ attR integration vector.
  • FIG. 19 is a diagram showing an expression vector incorporating pAH162-Ptac.
  • FIG. 20 is a diagram showing codon optimization in a chemically synthesized KDyI operon.
  • FIG. 21 shows the integrated plasmids of (A) pAH162-Tc-Ptac-KDyI and (B) pAH162-Km-Ptac-KDyI carrying the KDyI operon with optimized codons.
  • FIG. It is a figure which shows the integration type plasmid holding the mevalonate kinase gene derived from pallidcola.
  • FIG. 23 shows maps of genomic variants of (A) ⁇ ampC :: attB phi80 , (B) ⁇ ampH :: attB phi80 , and (C) ⁇ crt :: attB phi80 .
  • FIG. 24 shows maps of genomic variants of (A) ⁇ crt :: pAH162-P tac -mvk (X) and (B) ⁇ crt :: P tac -mvk (X).
  • FIG. 25 shows maps of chromosome modifications of (A) ⁇ ampH :: pAH162-Km-P tac -KDyI and (B) ⁇ ampC :: pAH162-Km-P tac -KDyI.
  • FIG. 24 shows maps of genomic variants of (A) ⁇ crt ::: pAH162-P tac -mvk (X) and (B) ⁇ crt :: P tac -mvk (X
  • FIG. 26 shows maps of chromosome modifications of (A) ⁇ ampH :: pAH162-Para-mvaES and (B) ⁇ ampC :: pAH162-Para-mvaES.
  • FIG. 27 is a diagram showing confirmation of PPA expression in SWITCH-PphoC-1 (S) ⁇ ydcI :: Ptac-MG-ppa. Cont represents a sample derived from a SWITCH-PphoC-1 (S) ⁇ ydcI strain, and MG-ppa represents a sample migrated from a SWITCH-PphoC-1 (S) ⁇ ydcI :: Ptac-MG-ppa strain.
  • the present invention provides an isoprene-expressing microorganism having improved expression of pyrophosphate phosphatase.
  • Pyrophosphate phosphatase is an enzyme that hydrolyzes pyrophosphate into two molecules of phosphate.
  • Examples of pyrophosphate phosphatase include pyrophosphate phosphatase derived from a microorganism described later as a host.
  • pyrophosphate phosphatase may be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, or SEQ ID NO: 138.
  • the pyrophosphate phosphatase is also a protein having an amino acid sequence showing 70% or more amino acid sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, or SEQ ID NO: 138, and having pyrophosphate phosphatase activity. Also good.
  • the amino acid sequence identity% may be, for example, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • Pyrophosphate phosphatase activity refers to the activity of hydrolyzing pyrophosphate into two molecules of phosphate.
  • the pyrophosphate phosphatase is a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are mutated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, or SEQ ID NO: 138, and having pyrophosphate phosphatase activity. There may be.
  • amino acid residue mutations include deletion, substitution, addition and insertion of amino acid residues.
  • the mutation of one or several amino acid residues may be introduced into one region in the amino acid sequence, but may be introduced into a plurality of different regions.
  • the term “one or several” indicates a range in which the three-dimensional structure and activity of the protein are not significantly impaired. In the case of protein, the number “1 or several” indicates, for example, 1 to 50, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10, or 1 to Five.
  • the pyrophosphate phosphatase activity of the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, or SEQ ID NO: 138 when measured under the same conditions (eg, buffer, concentration, temperature, reaction time) It is preferable to have an activity of 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • a mutation may be introduced into a site in the catalytic domain and a site other than the catalytic domain.
  • Those skilled in the art will know the positions of amino acid residues to which mutations can be introduced, which can retain the desired activity. Specifically, those skilled in the art 1) compare the amino acid sequences of a plurality of proteins having the same type of activity, 2) reveal a relatively conserved region and a relatively unconserved region, 3) From the relatively conserved region and the relatively unconserved region, it is possible to predict the region that can play an important role in the function and the region that can not play the important role in the function, respectively. Recognize the correlation between structure and function. Accordingly, those skilled in the art can identify the positions of amino acid residues to which mutations may be introduced in the amino acid sequence of pyrophosphate phosphatase.
  • substitutions of amino acid residues may be conservative substitutions.
  • conservative substitution refers to substitution of a given amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains are well known in the art.
  • such families include amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids having uncharged polar side chains (Eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (eg, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chain Amino acids (eg, threonine, valine, isoleucine), amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine), amino acids having side groups containing hydroxyl groups (eg, alcoholic, phenolic) ( Example, serine, thread Nin, tyrosine), and amino acids (e.g.
  • the conservative substitution of amino acids is a substitution between aspartic acid and glutamic acid, a substitution between arginine and lysine and histidine, a substitution between tryptophan and phenylalanine, and between phenylalanine and valine. Or a substitution between leucine, isoleucine and alanine, and a substitution between glycine and alanine.
  • Improvement in the expression of pyrophosphate phosphatase in an isoprene synthase-expressing microorganism can be performed in any manner that increases the amount of pyrophosphate phosphatase expressed in the isoprene synthase-expressing microorganism.
  • the pyrophosphate phosphatase whose expression is to be improved in the isoprene synthase-expressing microorganism is a homologous or heterologous pyrophosphate phosphatase relative to the isoprene synthase and / or the isoprene synthase-expressing microorganism.
  • the homologous pyrophosphate phosphatase relative to the isoprene synthase expressing microorganism may be an pyrophosphate phosphatase inherent to the isoprene synthase expressing microorganism or may be a foreign pyrophosphate phosphatase. Good.
  • the pyrophosphate phosphatase whose expression is to be improved in the isoprene synthase-expressing microorganism may also be one or more (eg, 2 or 3).
  • Improved expression of pyrophosphate phosphatase in an isoprene synthase-expressing microorganism can be achieved, for example, by modifying the peripheral region of the pyrophosphate phosphatase gene unique to the isoprene synthase-expressing microorganism or by transforming an isoprene synthase-expressing microorganism with a pyrophosphate phosphatase expression vector. Then, the expression unit containing a polynucleotide encoding pyrophosphate phosphatase may be introduced into an isoprene synthase-expressing microorganism.
  • the expression vector used in the present invention may further contain one or more regions that allow homologous recombination with the host cell genome when introduced into the host cell.
  • an expression unit containing a predetermined polynucleotide is located between a pair of homologous regions (eg, homology arms homologous to a specific sequence in a host genome, loxP, FRT). May be designed.
  • An expression unit is a transcription of a polynucleotide, including a predetermined polynucleotide to be expressed and a promoter operably linked thereto (eg, a homologous promoter, a heterologous promoter), and thus a polypeptide encoded by the polynucleotide.
  • a unit that enables the production of The expression unit may further contain elements such as a terminator, a ribosome binding site, and a drug resistance gene.
  • Examples of the expression vector used in the present invention include a vector for expressing a protein in a host.
  • the expression vector may also be a plasmid, viral vector, phage, or artificial chromosome.
  • the expression vector may further be a DNA vector or an RNA vector.
  • the expression vector may be an integral vector or a non-integration vector.
  • An integrative vector may be a type of vector that is integrated entirely into the genome of the host cell. Alternatively, the integrative vector may be a vector in which only a part (eg, the above-mentioned expression unit) is integrated into the host cell genome.
  • the peripheral region to be modified for the pyrophosphate phosphatase gene includes, for example, a promoter region, a Shine-Dalgarno (SD) sequence, a spacer region between the RBS and the start codon (in particular, a sequence immediately upstream of the start codon (5 ′ -UTR)).
  • SD Shine-Dalgarno
  • the modification include substitution, insertion or deletion of one to plural (eg, 1 to 500, 1 to 300, 1 to 200, or 1 to 100) nucleotides in the peripheral region.
  • the modification of the surrounding region is a replacement of the promoter region and, if necessary, a replacement of the SD sequence.
  • promoter to be introduced after substitution examples include inducible promoters such as tac promoter (Ptac), trc promoter (Ptrc), and lac promoter (Plac).
  • sequence to be introduced after substitution of the SD sequence examples include RBS of gene 10 derived from phage T7 (Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235).
  • the activity is enhanced by increasing the number of copies of the pyrophosphate phosphatase gene on the chromosome. It is preferable that a plurality of copies, desirably 2 copies or more, more preferably 3 copies or more are mounted on the chromosome.
  • the increase in copy number can be achieved by introducing a plasmid carrying a pyrophosphate phosphatase gene into a host cell.
  • the increase in copy number can also be achieved by transferring the pyrophosphate phosphatase gene onto the host genome using a transposon, Mu phage, or the like.
  • An isoprene synthase-expressing microorganism is a microorganism that produces isoprene synthase.
  • the isoprene synthase-expressing microorganism is a microorganism obtained by transforming a host cell with an isoprene synthase expression vector and introducing an expression unit containing a polynucleotide encoding isoprene synthase into the host cell.
  • the expression unit and expression vector are as described above.
  • it is preferable that multiple copies, desirably 2 copies or more, more preferably 3 copies or more of isoprene synthase genes are mounted on the chromosome.
  • Such an isoprene synthase-expressing microorganism can be obtained by introducing an isoprene synthase expression vector into a host. Such an isoprene synthase-expressing microorganism can also be obtained by transferring an isoprene synthase gene onto the host genome using a transposon, Mu phage, or the like.
  • the host cell may be homologous or heterologous to isoprene synthase, but is preferably heterologous. Examples of the isoprene synthase gene contained in the isoprene synthase expression vector include kuzu (Pueraria montana var.
  • the isoprene synthase expression vector may be an integrated vector or a non-integrated vector.
  • the gene encoding isoprene synthase can be placed under the control of a constitutive promoter or an inducible promoter (eg, a growth promoter-independent promoter described below).
  • the gene encoding isoprene synthase can be placed under the control of a constitutive promoter.
  • constitutive promoter include tac promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, T7 promoter, T5 promoter, T3 promoter, and SP6 promoter.
  • the isoprene synthase may be, for example, the following protein: 1) a full-length protein (amino acid sequence of SEQ ID NO: 8) that can be derived from Kuzu; 2) a protein from which the chloroplast translocation signal has been removed from the full-length protein of 1) above (an amino acid sequence from which amino acid residues 1 to 45 have been removed from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8); 3) Full-length protein that can be derived from poplar (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11); 4) A protein from which the chloroplast translocation signal has been removed from the full-length protein of 3) above (an amino acid sequence from which amino acid residues 1 to 37 have been removed from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11); 5) a full-length protein that can be derived from Mucuna (amino acid sequence of SEQ ID NO: 7); and 6) a protein from which the chloroplast translocation signal has been removed from the full-length protein of 5) above (position
  • the isoprene synthase may be derived from kuzu. In another preferred embodiment, the isoprene synthase can be derived from poplar. In yet another preferred embodiment, the isoprene synthase can be derived from Mucuna.
  • the isoprene synthase is a protein having an amino acid sequence identity of 70% or more with respect to the amino acid sequences of the proteins 1) to 6) and having isoprene synthase activity.
  • the amino acid sequence identity% may be, for example, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • The% amino acid sequence identity can be determined as described above.
  • the isoprene synthase activity refers to the activity of producing isoprene from dimethylallyl diphosphate (DMAPP).
  • the isoprene synthase comprises an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are mutated in the amino acid sequences of the proteins 1) to 6) above and has isoprene synthase activity. is there.
  • amino acid residue mutations include deletion, substitution, addition and insertion of amino acid residues.
  • the mutation of one or several amino acid residues may be introduced into one region in the amino acid sequence, but may be introduced into a plurality of different regions.
  • the term “one or several” indicates a range in which the three-dimensional structure and activity of the protein are not significantly impaired. In the case of protein, the number “1 or several” indicates, for example, 1 to 100, preferably 1 to 80, more preferably 1 to 50, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10 or 1 to 5.
  • the isoprene synthase activity is 50% or more, 60% or more, 70% or more of the isoprene synthase activity of the proteins 1) to 6) above when measured under the same conditions (eg, buffer, concentration, temperature, reaction time). 80% or more, preferably 90% or more, or preferably 95% or more.
  • isoprene synthase remains in a predetermined buffer (eg, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.15 mM MgCl 2 solution) when stored at 4 ° C. for 48 hours.
  • the activity is preferably 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, or 65% or more.
  • mutations may be introduced at sites in the catalytic domain and at sites other than the catalytic domain.
  • Those skilled in the art will know the positions of amino acid residues to which mutations can be introduced, which can retain the desired activity. Specifically, those skilled in the art 1) compare the amino acid sequences of a plurality of proteins having the same type of activity, 2) reveal a relatively conserved region and a relatively unconserved region, 3) From the relatively conserved region and the relatively unconserved region, it is possible to predict the region that can play an important role in the function and the region that can not play the important role in the function, respectively. Recognize the correlation between structure and function.
  • amino acid residue substitution may be a conservative substitution as described above.
  • the isoprene synthase-expressing microorganism may be a microorganism that expresses mevalonate kinase in addition to isoprene synthase. Therefore, the isoprene synthase-expressing microorganism may have a mevalonate kinase expression vector introduced into the host.
  • the mevalonate kinase gene to be introduced into the host by the mevalonate kinase expression vector include, for example, the genus of Methanosarcina, such as Methanosarcina mazei, and the genus of the genus Methanocarcina, such as Methanocella parodicola.
  • the mevalonate kinase expression vector may be an integrative vector or a non-integration vector.
  • the gene encoding mevalonate kinase can be placed under the control of a constitutive promoter as described above, or an inducible promoter (eg, a growth promoter-independent promoter described later).
  • the gene encoding mevalonate kinase can be placed under the control of a constitutive promoter.
  • the isoprene synthase-expressing microorganism used in the present invention, bacteria or fungi are preferable.
  • the bacterium may be a gram positive bacterium or a gram negative bacterium.
  • As the isoprene synthase-expressing microorganism a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae, particularly a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae among the microorganisms described later, is also preferable.
  • Gram-positive bacteria examples include Bacillus bacteria, Listeria bacteria, Staphylococcus bacteria, Streptococcus bacteria, Enterococcus bacteria, Clostridium bacteria, Clostridium bacteria, and Clostridium bacteria.
  • Examples include bacteria belonging to the genus Corynebacterium and bacteria belonging to the genus Streptomyces, and bacteria belonging to the genus Bacillus and bacteria belonging to the genus Corynebacterium are preferred.
  • Bacillus bacteria include Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and the like, and Bacillus subtilis is more preferable.
  • bacteria belonging to the genus Corynebacterium include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium, and Corynebacterium. Is more preferable.
  • Examples of the gram-negative bacteria include Escherichia bacteria, Pantoea bacteria, Salmonella bacteria, Vibrio bacteria, Serratia bacteria, Enterobacter bacteria, and the like. Among them, Escherichia bacteria, Pantoea bacteria, Enterobacter bacteria are preferable. As the bacterium belonging to the genus Escherichia, Escherichia coli is preferable. Examples of the genus Pantoea include Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, Pantoea citrea, and Pantoea citrea Pantoea ananatis) and Pantoea citrea are preferred.
  • Pantoea bacterium strains exemplified in European Patent Application Publication No. 09522121 may be used.
  • strains of the genus Pantoea for example, Pantoea ananatis AJ13355 strain (FERM BP-6614), Pantoea ananatis AJ13356 strain (FERM BP-6615), and Pantoea Ananatis SC17 (0) strain.
  • SC17 (0) was published on 21st September 2005 in Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (address:deteriorat, o17hd. 1) is deposited under the accession number VKPM B-9246.
  • Enterobacter bacteria examples include Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, and the like, with Enterobacter aerogenes being preferred. Further, as the Enterobacter bacterium, a strain exemplified in European Patent Application Publication No. 09522121 may be used. Representative strains of Enterobacter bacteria include, for example, Enterobacter agglomerans ATCC 12287 strain, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 strain, Enterobacter aerogenes NBRC 12010 strain (Biotechnol Bioeng. 2007 Mar 27; 98 (2): 340-348. ), Enterobacter aerogenes AJ11037 (FERM BP-10955) strain, and the like.
  • Enterobacter aerogenes AJ110737 strain was deposited on August 22, 2007 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1-6 Higashi 1-chome, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki 305-8565, Japan) Deposited as FERM P-21348, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on March 13, 2008, and given the receipt number of FERM BP-10955.
  • fungi examples include the genus Saccharomyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Yarrowia, the genus Trichoderma, the genus Aspergillus, the genus Aspergillus, Preferred are microorganisms of the genus Saccharomyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Yarrowia, or the genus Trichoderma.
  • Saccharomyces The Saccharomyces (Saccharomyces) microorganisms of the genus, Saccharomyces carlsbergensis (Saccharomyces carlsbergensis), Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae), Saccharomyces Deer statics (Saccharomyces diastaticus), Saccharomyces Dougurashi (Saccharomyces douglasii), Saccharomyces Kuruibera (Saccharomyces reteyveri), Saccharomyces norbensis, Saccharomyces obiformis, and Saccharomyces s. -Saccharomyces cerevisiae is preferred.
  • Schizosaccharomyces As a microorganism belonging to the genus Schizosaccharomyces, Schizosaccharomyces pombe is preferable. As a microorganism belonging to the genus Yarrowia, Yarrowia lipolytica is preferable.
  • Trichoderma The Trichoderma (Trichoderma) microorganisms of the genus, Trichoderma Harujianumu (Ttichoderma harzianum), Trichoderma Koningi (Trichoderma koningii), Trichoderma Rongifurakiamu (Trichoderma longibrachiatum), Trichoderma reesei (Trichoderma reesei), Trichoderma viride (Trichoderma viride) are And Trichoderma reesei is preferred.
  • the pathway for synthesizing dimethylallyl diphosphate (DMAPP), which is a substrate for isoprene synthase may be further enhanced.
  • DMAPP dimethylallyl diphosphate
  • an isopentenyl diphosphate delta isomerase expression vector having the ability to convert isopentenyl diphosphate (IPP) to dimethylallyl diphosphate (DMAPP) is used as an isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention. May be introduced.
  • an expression vector for one or more enzymes involved in the mevalonate pathway and / or methylerythritol phosphate pathway associated with the production of IPP and / or DMAPP may be introduced into the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention.
  • Such an enzyme expression vector may be an integrative vector or a non-integrative vector.
  • Such enzyme expression vectors further express together or individually a plurality of enzymes (eg, 1, 2, 3 or 4 or more) involved in the mevalonate pathway and / or the methylerythritol phosphate pathway.
  • it may be an expression vector for polycistronic mRNA.
  • the origin of one or more enzymes involved in the mevalonate pathway and / or the methylerythritol phosphate pathway may be homologous or heterologous to the host.
  • the origin of the enzyme involved in the mevalonate pathway and / or methylerythritol phosphate pathway is heterologous to the host, for example, the host is a bacterium as described above (eg, E. coli), and the mevalonate pathway
  • the enzyme involved may be derived from a fungus (eg, Saccharomyces cerevisiae).
  • the expression vector introduced into the host may express an enzyme involved in the mevalonate pathway.
  • isopentenyl diphosphate delta isomerase (EC: 5.3.3.2), for example, Idi1p (ACCESSION ID NP_015208), AT3G02780 (ACCESSION ID NP_186927), AT5G16440 (ACCESSION ID NP_197165N, ID_197165N, P_197165) ).
  • the gene encoding isopentenyl diphosphate delta isomerase may be placed under the control of a growth promoter reverse-dependent promoter described below.
  • Examples of enzymes involved in the mevalonate (MVA) pathway include, for example, mevalonate kinase (EC: 2.7.1.36; Example 1, Erg12p, ACCESSION ID NP — 013935; Example 2, AT5G27450, ACCESSION ID NP — 001190411), phosphomevalonic acid Kinase (EC: 2.7.4.2; Example 1, Erg8p, ACCESSION ID NP_013947; Example 2, AT1G31910, ACCESSION ID NP_001185124), diphosphomevalonate decarboxylase (EC: 4.1.1.33; Example 1, Mvd1p , ACCESSION ID NP_014441; Example 2, AT2G38700, ACCESSION ID NP_181404; Example 3, AT3G54250, A CESSION ID NP_566995), acetyl-CoA-C-acetyltransferase (EC: 2.3.1.9; Example 1, Erg10p,
  • one or more enzymes involved in the mevalonate (MVA) pathway eg, phosphomevalonate kinase, diphosphomevalonate decarboxylase, acetyl-CoA-C-acetyltransferase / hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, hydroxymethylglutaryl
  • MVA mevalonate
  • the gene encoding -CoA synthase may be placed under the control of a growth promoter reverse-dependent promoter described below.
  • Examples of enzymes involved in the methylerythritol phosphate (MEP) pathway include 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (EC: 2.2.1.7, Example 1, Dxs, ACCESSION ID NP_414954; Example 2, AT3G21500, ACCESSION ID NP_566686; Example 3, AT4G15560, ACCESSION ID NP_193291; Example 4, AT5G11380, ACCESSION ID NP_001078570), 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (EC: 1.1.
  • Example 1 Dxr, ACCESSION ID NP_414715; Example 2, AT5G62790, ACCESSION ID NP_001190600), 4 Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase (EC: 2.7.7.60; Example 1, IspD, ACCESSION ID NP_417227; Example 2, AT2G02500, ACCESSION ID NP_565286), 4-diphosphocytidyl-2-C- Methyl-D-erythritol kinase (EC: 2.7.1.148; Example 1, IspE, ACCESSION ID NP_415726; Example 2, AT2G26930, ACCESSION ID NP_180261), 2-C-methyl-D-erythritol-2,4- Cycloniphosphate synthase (EC: 4.6.1.12; Example 1, IspF, ACCESSION ID NP_417226;
  • Transformation of host cells with an expression vector into which a gene has been incorporated can be performed using a conventionally known method.
  • a competent cell method using microbial cells treated with calcium, an electroporation method, and the like can be mentioned.
  • a phage vector may be used to infect and introduce into a microbial cell.
  • a gene encoding a mevalonate pathway or methylerythritol phosphate pathway enzyme that synthesizes dimethylallyl diphosphate, which is a substrate of isoprene synthase may be introduced.
  • Such enzymes include 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase that converts pyruvate and D-glyceraldehyde-3-phosphate to 1-deoxy-D-xylose-5-phosphate; isopentenyl Examples include isopentyl diphosphate isomerase that converts diphosphate to dimethylallyl diphosphate.
  • a gene encoding an enzyme of the mevalonate pathway or the methylerythritol phosphate pathway that synthesizes dimethylallyl diphosphate is a constitutive promoter as described above, or an inducible promoter (e.g. It can be placed under the control of a dependent promoter).
  • DMAPP dimethylally phosphophosphate
  • isoprene is a precursor of peptidoglycan and electron acceptors (menaquinone, etc.) and is known to be essential for the growth of microorganisms (Fujisaki et al., J. Biochem. , 1986; 99: 1137-1146).
  • the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention is a step 1) corresponding to the growth phase of the microorganism (the isoprene-expressing microorganism is cultured in the presence of a sufficient concentration of a growth promoter,
  • the method of producing isoprene may be used, in which step 3) (culturing the isoprene-expressing microorganism to produce isoprene monomer) corresponding to the isoprene production phase is separated.
  • step 2) corresponding to the induction phase of production of isoprene (reducing the sufficient concentration of the growth promoter, isoprene-expressing microorganisms) Inducing the production of isoprene monomers by
  • the growth promoter is a factor essential for the growth of microorganisms or a factor having an action of promoting the growth of microorganisms, which can be consumed by microorganisms. It means that growth is lost or reduced. For example, if a certain amount of growth promoter is used, the microorganism will continue to grow until that amount of growth promoter is consumed, but once all of the growth promoter has been consumed, the microorganism cannot grow, or The growth rate can be reduced. Therefore, the degree of microbial growth can be controlled by the growth promoter.
  • Such a growth promoter examples include substances such as oxygen (gas); minerals such as ions of iron, magnesium, potassium, and calcium; phosphoric acid (eg, monophosphoric acid, diphosphoric acid, polyphosphoric acid) or salts thereof Phosphorus compounds; nitrogen compounds (gas) such as ammonia, nitric acid, nitrous acid, urea; sulfur compounds such as ammonium sulfate, thiosulfuric acid; vitamins (eg, vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, vitamin B1, vitamin B2) , Vitamin B6, vitamin B12, niacin, pantothenic acid, biotin, ascorbic acid) and amino acids (eg, alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, leucine, isoleucine, lysine, methionine, Phenylalanine, proline Serine, threonine, tryptophan
  • the isoprene-expressing microorganism of the present invention may have the ability to grow depending on the growth promoting agent and the ability to produce isoprene depending on the growth promoting agent-independent promoter. .
  • the isoprene-producing microorganism can grow in the presence of a growth promoter at a concentration sufficient for the growth of the isoprene-producing microorganism.
  • “sufficient concentration” may mean that the growth promoter is used at a concentration effective for the growth of isoprene-producing microorganisms.
  • the expression “ability to produce isoprene depending on the growth promoter-independent promoter” means that in the presence of a relatively high concentration of growth promoter, isoprene cannot be produced or isoprene production efficiency is low. In the presence of a relatively low concentration of a growth promoter or in the absence of a growth promoter, it can mean that isoprene can be produced or that the production efficiency of isoprene is high. Therefore, the isoprene-producing microorganism used in the present invention can grow well in the presence of a sufficient concentration of the growth promoter, but cannot produce isoprene or has a low isoprene production efficiency. Isoprene-producing microorganisms can also not grow well in the presence of insufficient concentrations of growth promoters or in the absence of growth promoters, but can produce isoprene or have a high isoprene production efficiency.
  • the gene encoding the above-described enzyme can be under the control of a growth promoter reverse-dependent promoter.
  • the expression “growth promoter reverse-dependent promoter” means that in the presence of a relatively high concentration of growth promoter, it has no or low transcriptional activity, but a relatively low concentration of growth promoter. In the presence of or in the absence of a growth promoter, it may mean a promoter having transcription activity or having high transcription activity. Therefore, the growth promoter reverse-dependent promoter can suppress the expression of the gene encoding the enzyme described above in the presence of a growth promoter at a concentration sufficient for the growth of the isoprene-producing microorganism.
  • the expression of the gene encoding the above-described enzyme can be promoted.
  • the isoprene-producing microorganism is a microorganism transformed with an expression vector comprising a gene encoding the above-described enzyme under the control of a growth promoter reverse-dependent promoter.
  • a microaerobic inducible promoter when the growth promoter is oxygen, a microaerobic inducible promoter can be used.
  • the microaerobic inducible promoter may refer to a promoter that can promote the expression of a downstream gene under microaerobic conditions.
  • the saturated dissolved oxygen concentration is 7.22 ppm (atmospheric pressure of 760 mmHg, temperature 33 ° C., water vapor saturated with 20.9% oxygen).
  • the microaerobic condition may refer to a condition of (dissolved) oxygen concentration of 0.35 ppm or less.
  • the (dissolved) oxygen concentration under microaerobic conditions may be 0.30 ppm or less, 0.25 ppm or less, 0.20 ppm or less, 0.15 ppm or less, 0.10 ppm or less, or 0.05 ppm or less.
  • microaerobic inducible promoters include promoters for genes encoding D- or L-lactate dehydrogenase (eg, lld, ldhA), promoters for genes encoding alcohol dehydrogenase (eg, adhE), pyruvate formate lyase And the promoter of a gene (eg, budA) encoding ⁇ -acetolactoate decarboxylase.
  • a phosphorus deficiency inducible promoter when the growth promoter is a phosphorus compound, a phosphorus deficiency inducible promoter can be used.
  • the expression “phosphorus deficiency inducible promoter” may refer to a promoter that can promote the expression of downstream genes with low concentrations of phosphorus compounds.
  • a low concentration phosphorus compound may refer to conditions under a (free) phosphorus concentration of 100 mg / L.
  • the term “phosphorus” is synonymous with the term “phosphorus compound” and may be used interchangeably.
  • (Free) phosphorus concentration under phosphorus deficiency conditions may be 50 mg / L or less, 10 mg / L or less, 5 mg / L or less, 1 mg / L or less, 0.1 mg / L or less, or 0.01 mg / L or less Good.
  • Examples of the phosphorus deficiency inducible promoter include a promoter of a gene encoding alkaline phosphatase (eg, phoA), a promoter of a gene encoding acid phosphatase (eg, phoC), and a gene encoding sensor histidine kinase (eg, phoR) Promoter, a gene encoding a response regulator (eg, phoB), and a gene encoding a phosphorus uptake carrier (eg, pstS).
  • alkaline phosphatase eg, phoA
  • phoC promoter of a gene encoding acid phosphatase
  • sensor histidine kinase eg, phoR
  • a gene encoding a response regulator eg, phoB
  • a gene encoding a phosphorus uptake carrier eg, pstS
  • an amino acid deficiency inducible promoter can be used.
  • An amino acid deficiency-inducible promoter can refer to a promoter that can promote the expression of a downstream gene at a low amino acid concentration.
  • the low amino acid concentration may refer to a condition where the concentration of (free) amino acid or a salt thereof is 100 mg / L or less.
  • the concentration of (free) amino acid or its salt under amino acid deficiency conditions is 50 mg / L or less, 10 mg / L or less, 5 mg / L or less, 1 mg / L or less, 0.1 mg / L or less, or 0.01 mg / L or less It may be.
  • amino acid deficient promoter examples include a promoter of a gene encoding a tryptophan leader peptide (eg, trpL) and a promoter encoding a N-acetylglutamate synthase (eg, ArgA).
  • a promoter of a gene encoding a tryptophan leader peptide eg, trpL
  • a promoter encoding a N-acetylglutamate synthase eg, ArgA
  • the present invention provides a process for producing isoprene monomers.
  • the method for producing isoprene monomer of the present invention includes culturing the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention in a culture medium to produce isoprene monomer.
  • the production method of the isoprene monomer of the present invention can be performed by culturing the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention.
  • Dimethylallyl diphosphate as a raw material for the isoprene monomer is efficiently supplied from the carbon source in the medium by the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention. Since the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention produces isoprene monomer mainly as outgas from a carbon source in the medium, the isoprene monomer is recovered by collecting the gas generated from the transformant.
  • Dimethylallyl diphosphate which is a substrate for isoprene synthase, is synthesized by the mevalonate pathway or the methyl erythritol phosphate pathway in the host cell, with the carbon source in the medium as the basis.
  • the medium for culturing the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention preferably contains a carbon source for conversion to isoprene.
  • Examples of the carbon source include carbohydrates such as monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides; invert sugar obtained by hydrolyzing sucrose; glycerol; 1 carbon number such as methanol, formaldehyde, formate, carbon monoxide and carbon dioxide Compounds (hereinafter referred to as C1 compounds); oils such as corn oil, palm oil and soybean oil; acetates; animal fats; animal oils; fatty acids such as saturated fatty acids and unsaturated fatty acids; lipids; phospholipids; glycerolipids; Glycerin fatty acid esters such as glyceride, diglyceride, and the like; polypeptides such as microbial proteins and plant proteins; renewable carbon sources such as hydrolyzed biomass carbon sources; yeast extracts; or combinations thereof.
  • carbohydrates such as monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides
  • invert sugar obtained by hydrolyzing sucrose gly
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia and the like
  • it is desirable to contain an appropriate amount of a required substance such as vitamin B1, L-homoserine or a yeast extract.
  • a small amount of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manganese ion or the like is added as necessary.
  • the medium used in the present invention may be a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic trace components as required.
  • monosaccharides include trioses such as ketotriose (dihydroxyacetone) and aldtriose (glyceraldehyde); tetroses such as ketotetrose (erythrulose) and aldetetrose (erythrose and threose); ketopentose (ribulose and xylulose) Pentose such as ribose, arabinose, xylose, lyxose), deoxy sugar (deoxyribose); ketohexose (psicose, fructose, sorbose, tagatose), aldohexose (allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, talose ), Deoxy sugars (fucose, fucrose, rhamnose) and other hexoses; heptose such as sedoheptulose; fructose, manno S
  • Examples of the disaccharide include sucrose, lactose, maltose, trehalose, tunulose, and cellobiose, and sucrose and lactose are preferable.
  • Examples of oligosaccharides include trisaccharides such as raffinose, melezitose, and maltotriose; tetrasaccharides such as acarbose and stachyose; and other oligosaccharides such as fructooligosaccharide (FOS), galactooligosaccharide (GOS), and mannan oligosaccharide (MOS).
  • Examples of the polysaccharide include glycogen, starch (amylose, amylopectin), cellulose, dextrin, and glucan ( ⁇ 1,3-glucan), and starch and cellulose are preferable.
  • Microbial proteins include polypeptides derived from yeast or bacteria.
  • plant proteins include polypeptides derived from soybean, corn, canola, jatropha, palm, peanut, sunflower, coconut, mustard, cottonseed, palm kernel oil, olive, safflower, sesame and flaxseed.
  • lipids include substances containing one or more saturated or unsaturated fatty acids of C4 or higher.
  • the oil contains one or more saturated or unsaturated fatty acids of C4 or higher, and is preferably a lipid that is liquid at room temperature.
  • Examples of the fatty acid include compounds represented by the formula RCOOH (“R” represents a hydrocarbon group).
  • the unsaturated fatty acid is a compound having at least one carbon-carbon double bond in “R”, and examples thereof include oleic acid, vaccenic acid, linoleic acid, palmitate acid, and arachidonic acid.
  • the saturated fatty acid is a compound in which “R” is a saturated aliphatic group, and examples thereof include docosanoic acid, icosanoic acid, octadecanoic acid, hexadecanoic acid, tetradecanoic acid, and dodecanoic acid.
  • fatty acids containing one or more C2 to C22 fatty acids are preferred, and those containing C12 fatty acids, C14 fatty acids, C16 fatty acids, C18 fatty acids, C20 fatty acids and C22 fatty acids are more preferred.
  • the carbon source include salts of these fatty acids, derivatives, and salts of derivatives.
  • the salt include lithium salt, potassium salt, sodium salt and the like.
  • examples of the carbon source include lipids, oils, fats and oils, fatty acids, combinations of glycerin fatty acid esters and carbohydrates such as glucose.
  • Biomass carbon sources include cellulosic substrates such as wood, paper, and pulp waste, foliate plants, and pulp; parts of plants such as stalks, grains, roots, and tubers.
  • Examples of plants used as biomass carbon sources include corn, wheat, rye, sorghum, triticate, rice, millet, barley, cassava, pea and other legumes, potato, sweet potato, banana, sugar cane, tapioca and the like.
  • pretreatment is preferably performed.
  • the pretreatment include enzymatic pretreatment, chemical pretreatment, and a combination of enzymatic pretreatment and chemical pretreatment. It is preferred to hydrolyze all or part of the renewable carbon source before adding it to the cell culture medium.
  • examples of the carbon source include yeast extract or a combination of yeast extract and another carbon source such as glucose, and a combination of yeast extract and C1 compound such as carbon dioxide or methanol is preferable.
  • cells are preferably cultured in a standard medium containing physiological saline and a nutrient source.
  • the culture medium is not particularly limited, and examples thereof include commercially available conventional culture media such as Luria Bertani (LB) broth, Sabouraud Dextrose (SD) broth, and Yeast medium (YM) broth.
  • LB Luria Bertani
  • SD Sabouraud Dextrose
  • YM Yeast medium
  • a medium suitable for culturing a specific host cell can be appropriately selected and used.
  • the cell culture medium includes suitable minerals, salts, cofactors, buffers, and ingredients known to those skilled in the art to be suitable for culture or to promote isoprene production. It is desirable.
  • the culture conditions of the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention are not particularly limited as long as the isoprene synthase-expressing microorganism can improve the isoprene-producing ability by improving the expression of pyrophosphate phosphatase, and standard cell culture conditions are used. be able to.
  • the culture temperature is preferably 20 ° C. to 37 ° C.
  • the gas composition is preferably a CO 2 concentration of about 6% to about 84%, and a pH of about 5 to about 9. Further, it is preferable to perform the culture under aerobic, anoxic, or anaerobic conditions depending on the properties of the host cell.
  • Examples of the culture method include a method of culturing the transformant using a known fermentation method such as a batch culture method, a fed-batch culture method, or a continuous culture method.
  • the batch culture method is a method in which a medium composition is prepared at the start of fermentation, host cells are inoculated into the medium, and transformants are cultured while controlling pH, oxygen concentration, and the like.
  • the transformant goes from a gentle induction phase to a logarithmic growth phase and finally to a stationary phase where the growth rate decreases or stops. Isoprene is produced by transformants in the logarithmic growth phase or stationary phase.
  • the fed-batch culture method is a method in which a carbon source is gradually added as the fermentation process proceeds in addition to the batch method described above.
  • the fed-batch culture method is effective when the metabolism of the transformant tends to be suppressed by catabolite suppression and it is preferable to limit the amount of the carbon source in the medium.
  • the fed-batch culture method can be performed using a limited or excessive amount of a carbon source such as glucose.
  • the continuous culture method is a culture method in which a predetermined amount of culture medium is continuously supplied to a bioreactor at a constant rate, and at the same time, the same amount of culture medium is withdrawn.
  • the culture can be kept at a constant high density, and the transformant in the culture solution is mainly in the logarithmic growth phase.
  • Examples of the promoter possessed by the expression vector introduced into the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention include the promoters described above.
  • an inducible promoter such as the lac promoter, IPTG (isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside), for example, is added to the culture solution.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • Examples of the method for evaluating the production amount of isoprene monomer obtained by culturing the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention include a method in which a gas phase is collected by a headspace method and the gas phase is analyzed by a gas chromatography method. . Specifically, the isoprene monomer in the headspace when the culture medium containing the transformant is cultured while shaking in a sealed vial is analyzed using standard gas chromatography. Next, using the calibration curve, the area obtained from the gas chromatography measurement curve is converted into the isoprene monomer production amount of the transformant.
  • isoprene gas is continuously removed from the outgas.
  • isoprene gas can be removed by various methods, such as adsorption to a solid phase, separation into a liquid phase, or a method of directly condensing isoprene gas.
  • the recovery of isoprene monomer can be performed in one stage or in multiple stages.
  • the separation of the isoprene monomer from the outgas and the conversion of the isoprene monomer into a liquid phase are simultaneously performed.
  • Isoprene monomer can also be condensed directly from the outgas into a liquid phase.
  • the separation of the isoprene monomer from the off-gas and the conversion of the isoprene monomer into a liquid phase are sequentially performed.
  • a method in which isoprene monomer is adsorbed on a solid phase and extracted from the solid phase with a solvent can be mentioned.
  • the method for recovering the isoprene monomer may include a step of purifying the isoprene monomer.
  • the purification step include separation from a liquid phase extract by distillation and various chromatographies.
  • the present invention also provides a method for producing an isoprene polymer.
  • the method for producing the isoprene polymer of the present invention includes the following (I) and (II): (I) producing an isoprene monomer by the method of the present invention; (II) polymerizing isoprene monomers to produce isoprene polymers.
  • Step (I) can be performed in the same manner as the above-described method for producing the isoprene monomer of the present invention.
  • the polymerization of the isoprene monomer in the step (II) can be performed by any method known in the art (eg, organic chemical synthesis method), for example, addition polymerization.
  • the rubber composition of the present invention contains a polymer derived from isoprene produced by the method for producing isoprene of the present invention.
  • the polymer derived from isoprene can be a homogenous polymer (ie, isoprene polymer) or a heterogeneous polymer (eg, a copolymer such as a block copolymer) comprising one or more monomer units other than isoprene and isoprene.
  • the polymer derived from isoprene is the same kind of polymer (that is, isoprene polymer) produced by the production method of isoprene polymer of the present invention.
  • the rubber composition of the present invention may further contain one or more polymers other than the above polymer, one or more rubber components, and / or other components.
  • the rubber composition of the present invention can be produced using a polymer derived from isoprene.
  • the rubber composition of the present invention comprises a polymer derived from isoprene, one or more polymers other than the polymer, one or more rubber components, and / or other components (eg, reinforcing materials, cross-linking agents, vulcanization accelerators). And an antioxidant).
  • the tire of the present invention is manufactured by using the rubber composition of the present invention.
  • the rubber composition of the present invention is not limited and can be used in any part of a tire, and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the rubber composition of the present invention may be used in tire treads, base treads, sidewalls, side reinforcing rubbers, and bead fillers.
  • a method for producing a tire a conventional method can be used. For example, a carcass layer, a belt layer, a tread layer made of tire unvulcanized rubber, and other members used in normal tire manufacturing are sequentially laminated on a tire molding drum, and the drum is removed to obtain a green tire. To do. Then, a desired tire (eg, pneumatic tire) can be manufactured by heat vulcanizing the green tire according to a conventional method.
  • a desired tire eg, pneumatic tire
  • Example 1 Enhanced expression of ppa gene in MG1655 Ptac-KKDyI strain
  • E. coli strain a strain in which the intrinsic ppa gene (pyrophosphate phosphatase gene) was replaced with another strong promoter to enhance the expression of the endogenous ppa gene was prepared by the following procedure. First, see MG1655 Ptac-KKDyI strain (Reference Example 7-4). In addition, this stock is E. coli transformants. The competent cell for electroporation was prepared as follows. The MG1655 Ptac-KKDyI strain was subjected to shaking culture at 37 ° C. overnight in 5 mL of LB medium.
  • pKD46 was introduced into a competent cell of MG1655 Ptac-KKDyI strain by electroporation.
  • the electroporation method was introduced using GENE PULSER II (BioRad) under the conditions of an electric field strength of 18 kV / cm, a capacitor capacity of 25 ⁇ F, and a resistance value of 200 ⁇ .
  • 1 mL of SOC medium (bactotryptone 20 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 0.5 g / L, glucose 10 g / L) is added to the cells into which pKD46 has been introduced by electroporation, at 30 ° C.
  • MG1655 Ptac-KKDyI / pKD46 strain competent cells for electroporation were prepared as follows. MG1655 Ptac-KKDyI / pKD46 strain was subjected to shaking culture at 30 ° C. overnight in 5 mL of LB medium containing 100 (mg / L) ampicillin. Thereafter, 50 ⁇ L of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium containing 100 (mg / L) ampicillin, and shaking culture was performed at 30 ° C. until OD600 was around 0.6. Thereafter, the cells were collected, washed three times with ice-cooled 10% glycerol, and finally suspended in 0.3 mL of 10% glycerol to obtain competent cells.
  • a gene fragment for replacing the promoter region of the ppa gene on the chromosome was prepared.
  • the base sequence of the ppa gene and its promoter region can be obtained from an existing database (NCBI Reference Sequences NC_000913.2, ppa gene locus tag: b4225, Range: 4447145.4447475, complement).
  • Replacement of the promoter region of the ppa gene was performed by the ⁇ -red method.
  • a genomic fragment having ⁇ attL-Tet- ⁇ attR-Ptac was used as a PCR template. This includes the tac promoter (Ptac), tetracycline resistance drug marker (Tet), and ⁇ attL and ⁇ attR, which are attachment sites for ⁇ phage.
  • SEQ ID NO: 1 PCR reaction was performed using primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • DNA polymerase LA-Taq polymerase sold by Takara Bio Inc. is used, and 92 ° C., 1 minute, (92 ° C., 10 seconds, 54 ° C., 20 seconds, 72 ° C., 2 minutes) ⁇ 40 cycles, 72 The reaction was carried out at 5 ° C. for 5 minutes.
  • ⁇ attL-Tet- ⁇ attR-Ptac and a gene fragment to which 60 bp upstream and 60 bp downstream of the promoter region of the ppa gene were respectively added were amplified.
  • This gene fragment was purified using Wizard PCR Prep DNA Purification System (Promega).
  • the obtained gene fragment is named Tet-Ptac-ppa.
  • Tet-Ptac-ppa was introduced into a competent cell of MG1655 Ptac-KKDyI / pKD46 strain by electroporation.
  • the electroporation method was introduced using GENE PULSER II (BioRad) under the conditions of an electric field strength of 18 kV / cm, a capacitor capacity of 25 ⁇ F, and a resistance value of 200 ⁇ .
  • 1 mL of SOC medium was added to the competence cell, and after shaking culture at 30 ° C. for 2 hours, the resultant was applied to an LB agar medium containing 25 (mg / L) tetracycline. After overnight culture at 37 ° C., the emerged colonies were purified using the same agar medium.
  • colony PCR was performed using primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, and it was confirmed that the promoter region of the ppa gene was replaced with the tac promoter.
  • the strain in which the promoter region of the ppa gene was replaced with the tac promoter was named MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa strain.
  • Example 2 Analysis of PPA expression in MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa strain
  • the protein expression level of pyrophosphate phosphatase (PPA) in the MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa strain was confirmed by SDS-PAGE.
  • the MG1655 Ptac-KKDyI strain and the MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa strain were subjected to shaking culture at 37 ° C. overnight in 5 mL of LB medium.
  • the collected cells are washed three times with ice-cooled 50 mM Tris buffer (Tris-HCl pH 8.0), and the bacteria are collected using an ultrasonic crusher (Bio-ruptor: 30 seconds ON, 30 seconds OFF 20 minutes). The body was crushed. The disrupted bacterial cell solution was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes to remove unbroken cells. The obtained supernatant fraction was handled as a soluble protein fraction. After quantifying the soluble protein fraction by the Bradford method, 5 ⁇ g of the soluble protein was subjected to electrophoresis using SDS-PAGE (NuPAGE: SDS-PAGE Gel System manufactured by Invitrogen). Thereafter, CBB staining and decolorization were performed according to a conventional method.
  • FIG. 1 shows a photograph of the gel near the amount of PPA protein.
  • Example 3 Construction of MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa / pSTV28-Ptac-ispSK / pMW-Para-mvaES strain
  • a competent cell for electroporation of the MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa strain was prepared as follows. did. The MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa strain was subjected to shaking culture overnight at 37 ° C. in 5 mL of LB medium. Thereafter, 50 ⁇ L of the culture solution was inoculated into a new 5 mL LB medium, and shaking culture was performed at 37 ° C. until the OD600 was around 0.6. Thereafter, the cells were collected, washed 3 times with ice-cooled 10% glycerol, and finally suspended in 0.5 mL of 10% glycerol to obtain competent cells.
  • the MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa strain competent cells were introduced with the kuzu-derived isoprene synthase expression plasmid, pSTV28-Ptac-ispSK (see Reference Example 3-5) by the electroporation method under the conditions described above. Thereafter, 1 mL of SOC medium was added to the competence cell, and after shaking culture at 30 ° C. for 2 hours, the resultant was applied to an LB agar medium containing 60 (mg / L) chloramphenicol.
  • MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa / pSTV28-Ptac-ispSK strain was introduced with pMW-Para-mvaES-TTrp (see Reference Example 7-3).
  • pMW-Para-mvaES-Ttrp was introduced by the electroporation method under the above conditions. Thereafter, 1 mL of SOC medium was added to the competence cell, and after shaking culture at 30 ° C.
  • a ppa expression enhanced strain the MG1655 Ptac-KKDyI Ptac-ppa / pSTV28-Ptac-ispSK / pMW-Para-mvaES-Ttrp strain in which the expression of the ppa gene is enhanced is referred to as a ppa expression enhanced strain.
  • Example 4 Evaluation of jar culture of ppa expression-enhanced strain Jar culture evaluation of the ppa expression-enhanced strain and the control strain (MG1655 Ptac-KKDyI / pSTV28-Ptac-ispSK / pMW-Para-mvaES-Ttrp strain) was performed. It was applied to an LB agar medium containing 60 (mg / L) chloramphenicol and 100 (mg / L) kanamycin, and cultured at 34 ° C. for 16 hours. Next, 0.3 L of glycol medium described in Table 1 was put into a fermentor having a volume of 1 L, and the cells of one well-grown plate were inoculated and cultured.
  • the culture conditions were pH 7.0 (controlled with ammonia gas), aeration at 30 ° C. and 150 mL / min, and stirring control was performed so that the oxygen concentration in the medium was 5% or more. After OD600 reached around 20, L-arabinose was added to the medium to a final concentration of 20 mM, and culturing was performed for 45 hours. During the culture, glucose prepared to 500 (g / L) was appropriately added so that the glucose concentration in the medium was 10 (g / L) or more. The exhaust gas was collected in a 1 L gas bag over time, and the concentration of isoprene gas contained in the exhaust gas was measured. The analysis conditions of isoprene gas are described below. The analysis conditions for gas chromatography are the same as those described in Reference Example 4-3).
  • Table 2 shows the amount of isoprene produced (mg / B) per jar after 45 hours of culturing in the control strain and the ppa expression-enhanced strain and the yield% of glucose consumption. It was confirmed that the ppa expression-enhanced strain had higher isoprene production (mg / B) per jar and higher glucose consumption yield (%) than the control strain.
  • Reference Example 1 Examination of Isoprene Production Ability in Plants 1-1) Measurement of Isoprene Production Amount per Unit Weight of Dry Leaf Product
  • isoprene production per gram of dry leaf weight in plants The amount was measured.
  • Mucuna, willow (weeping willow), Momijibahu, Ginkgo biloba, and kuzu were used.
  • a gas exchange desiccator (trade name: vacuum desiccator, manufactured by ASONE) was accommodated in an incubator (product name: growth chamber MLR-351 HSANYO) and installed in the gas exchange desiccator.
  • the incubator was set to high temperature induction conditions (40 ° C. at an illuminance of 100 ⁇ mol E / m 2 / s) while operating the gas stirring fan to stir the atmosphere in the space of the gas exchange desiccator.
  • the temperature of the atmosphere in the gas exchange desiccator reached 40 ° C.
  • the Mucuna plant planted in the planter was accommodated, and the gas exchange desiccator was kept in a sealed state for 3 hours.
  • the gas component released by Mucuna was sucked from the space in the gas exchange desiccator through a silicon tube, an adsorption tube, and a gas sampling tube by a suction pump.
  • the amount of isoprene generated per gram of dry leaf weight in the plant was determined by dividing the amount of isoprene generated from the whole Mucuna plant by the estimated dry weight of the leaves of the whole plant. As a result, it became clear that Mucuna was excellent in the amount of isoprene generated per unit weight of the dried leaf (FIG. 2).
  • a buffer solution 50 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl, 5% Glycerol, 0.02% Triton-X100, pH 8.0
  • Benzamidine-HCl was added to 1 mM (each final concentration) and used as a protein extraction buffer.
  • the total (ammonium sulfate fraction) protein amount was determined by measuring the ammonium sulfate fraction by the Bradford method.
  • a calibration curve was prepared for the protein amount with respect to the absorbance at a wavelength of 595 nm measured with a spectrophotometer by reacting with Bradford reagent.
  • the absorbance at a wavelength of 595 nm was measured in the same manner for a 50-fold diluted ammonium sulfate fraction, and the total (ammonium sulfate fraction) protein amount was estimated from a standard protein calibration curve.
  • the amount of isoprene produced is 100 ⁇ l of crude extract or crude enzyme solution boiled at 100 ° C.
  • the amount generated after 0.5 hour, 1 hour and 2 hours with the crude enzyme was determined by subtracting the measured value of the crude enzyme solution boiled at 100 ° C. from the measured value. Enzyme activity (specific activity) per 1 mg of total protein was determined from the amount of isoprene generated per hour. The amount of isoprene generated was measured with a constant amount of DMAPP, which is a substrate for isoprene synthase. As a result, it was revealed that Mucuna was excellent in the amount of isoprene generated per total protein amount (FIG. 3, Table 3). From the above, it was shown that Mucuna is excellent in isoprene-producing ability.
  • Reference Example 2 Mucuna-derived isoprene synthase gene cloning 2-1) Examination of sampling time Sampled isoprene gas released from Mucuna leaves irradiated for 1, 2, 3, and 5 hours at a temperature of 40 ° C. When the amount of isoprene produced was quantified by gas chromatography, production of 4,8,12,10 ⁇ g isoprene / g DW leaf isoprene was confirmed, and the optimum light irradiation time was confirmed to be 3 hours. .
  • RNA lysate was extracted from Mucuna leaves by the following procedure. (1) Mucuna leaves irradiated for 3 hours at a temperature of 40 ° C. were sampled. (2) After 100 mg of leaf tissue was crushed in a mortar while quickly frozen with liquid nitrogen, the liquid nitrogen was dispensed into an RNase-free 2 ml Eppendorf tube to vaporize liquid nitrogen. (3) 450 ⁇ l of lysis buffer RLT (containing 2-mercaptoethanol) attached to RNeasy Plant Kit (manufactured by Qiagen) was added to this Eppendorf tube and vigorously mixed by vortex to obtain a leaf tissue lysate.
  • lysis buffer RLT containing 2-mercaptoethanol
  • RNeasy Plant Kit manufactured by Qiagen
  • This RNeasy spin column was set in a 2 ml collection tube attached to the RNeasy Plant Kit, centrifuged at 15000 rpm for 1 minute, and the filtrate was discarded.
  • This RNeasy spin column was set in a 1.5 ml collection tube attached to the RNeasy Plant Kit.
  • RNA lysis solution was checked for RNA quality using a bioanalyzer (Agilent Technologies) RNA nanochip, It was confirmed that there was no contamination with genomic DNA and RNA in the lysate was not degraded.
  • the total RNA was double-stranded using reverse transcriptase and then fragmented using a nebulizer.
  • the base sequence of 198179 fragments having a polyA sequence at the 3 ′ end was analyzed using a 454 Titanium FLX high-speed sequencer (Roche Applied Science). In the obtained fragment sequence, overlapping sequences were linked to obtain 13485 contig sequences.
  • Reference Example 3 Preparation of isoprene synthase expression plasmid derived from each plant species 3-1) Pueraria montana var. Chemical synthesis of isobarene synthase from Lovata montana var. The base sequence and amino acid sequence of isobarene synthase cDNA derived from lobata are already known (ACCESSION: AAQ84170: P. montana var. lobata (kudzu) isoprene synthase (IspS)). P. The amino acid sequence of montana-derived IspS protein and the base sequence of cDNA are shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively. The IspS gene was transformed into E. coli.
  • IspSK IspSK gene that was optimized for E. coli codon usage and further cleaved from the chloroplast translocation signal was designed and named IspSK.
  • the base sequence of IspSK is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the IspSK gene was chemically synthesized and then cloned into pUC57 (GenScript), and the resulting plasmid was named pUC57-IspSK.
  • IspSP An IspS gene that was optimized for E. coli codon usage and further cleaved from the chloroplast translocation signal was designed and named IspSP.
  • the base sequence of IspSP is shown in SEQ ID NO: 13.
  • the IspSP gene was chemically synthesized and then cloned into pUC57 (GenScript), and the resulting plasmid was named pUC57-IspSP.
  • a DNA fragment having a BamHI site at the 3 ′ end (Ptac-Ttrp) was chemically synthesized (the base sequence of Ptac-Ttrp is shown in SEQ ID NO: 16).
  • the obtained Ptac-Ttrp DNA fragment was digested with KpnI and BamHI, and similarly ligated with pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.) digested with KpnI and BamHI by a ligation reaction using DNA Ligase.
  • the obtained plasmid was named pSTV28-Ptac-Ttrp (the base sequence is shown in SEQ ID NO: 17).
  • the expression of the IspS gene can be amplified by cloning the IspS gene downstream of Ptac.
  • IspS gene expression plasmid derived from each plant species Plasmids for expressing the IspSK gene, IspSP gene, IspSM gene, and IspSM (L) gene in E. coli were constructed by the following procedure.
  • PCR was performed using Prime Star polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and 40 cycles of reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 54 ° C. for 20 seconds, and 68 ° C. for 120 seconds were performed.
  • a PCR product containing an IspSK gene, an IspSP gene, an IspSM gene, and an IspSM (L) gene was obtained.
  • pSTV28-Ptac-Ttrp was subjected to PCR using Prime Star polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27 as primers.
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and 40 cycles of reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 54 ° C. for 20 seconds, and 68 ° C. for 210 seconds were performed. As a result, a PCR product containing pSTV28-Ptac-Ttrp was obtained. Thereafter, the purified IspSK gene, IspSP gene, IspSM gene, and IspSM (L) gene fragment and the PCR product of pSTV28-Ptac-Ttrp were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). .
  • the resulting IspSK gene expression plasmid was pSTV28-Ptac-IspSK
  • the IspSP gene expression plasmid was pSTV28-Ptac-IspSP
  • the IspSM gene expression plasmid was pSTV28-Ptac-IspSM
  • the IspSM (L) gene expression plasmid was pSTV28- It was named Ptac-IspSM (L).
  • coli MG1655 strain is a MG1655 / pSTV28-Ptac-Ttp strain
  • a strain in which pSTV28-Ptac-IspSK is introduced is a strain MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSK, pSTVsp-SPac-SPac-SPt
  • the introduced strain was MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSP strain
  • the strain into which pSTV28-Ptac-IspSM was introduced was the MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSM strain
  • the strain into which pSTV28-Ptac-IspSM (L) was introduced was MG1655.
  • PSTV28-Ptac-IspSM (L) strain was introduced.
  • the cells of 1/6 plate were inoculated into a Sakaguchi flask filled with 20 ml of LB containing 60 (mg / L) chloramphenicol and cultured at 37 ° C. for 6 hours.
  • the cells are centrifuged from the culture solution at 5000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes, and washed twice with ice-cooled isoprene synthase buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM MgCl 2.5 % glycerol). did.
  • the washed cells were suspended in 1.8 ml of the same buffer.
  • Headspace Sampler (Turbo Matrix 40 manufactured by Perkin Elmer) Vial insulation temperature 40 ° C Vial incubation time 30 min Pressurization time 3.0min Injection time 0.02min Needle temperature 70 °C Transfer temperature 80 °C Carrier gas pressure (high purity helium) 124kPa
  • Reagent isoprene (specific gravity 0.681) was diluted 10, 100, 1000, 10000, and 100,000 times with cooled methanol to prepare a standard solution for addition. Thereafter, 1 ⁇ L of each standard solution for addition was added to a headspace vial containing 1 mL of water to prepare a standard sample.
  • Table 5 shows the amount of isoprene produced after 2 hours of reaction of each strain.
  • the isoprene production amounts are MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSM strain MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSM (L) strain, MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSK strain in descending order, and MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSP.
  • the MG1655 strain and the MG1655 / pSTV28-Ptac-TTrp strain had almost the same value. From the above results, the crude enzyme extract of the strain introduced with Mucuna-derived isoprene synthase showed the highest isoprene production activity.
  • Reference Example 5 E.I. Effect of introduction of isoprene synthase derived from each plant species in E. coli MG1655 strain From the result of the crude enzyme activity of Reference Example 4, the highest activity was confirmed with the isoprene synthase derived from Mucuna lacking the chloroplast translocation signal. Therefore, the isoprene-producing ability from glucose was compared for all isoprene synthase-introduced strains lacking the chloroplast translocation signal.
  • MG1655 / pSTV28-Ptac-Ttrp strain MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSK strain, MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSP strain, and MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSM strain, 60 mg / L of chloramphenicol The resulting mixture was uniformly applied to the LB plate and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • the isoprene concentration in the head space of the vial was measured by gas chromatography.
  • the OD value was measured at 600 nm with a spectrophotometer (HITACHI U-2900).
  • Table 7 shows the isoprene concentration and OD value at the end of the culture of each strain.
  • the isoprene production amount was in the descending order of MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSM strain, MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSK strain, MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSP strain, and MG1655 / pSTV28-Ptac-Ttrp strain. became. From the above results, in the wild strain, the strain into which Mucuna-derived isoprene synthase was introduced showed the highest isoprene-producing ability.
  • E. coli with enhanced MEP (methylerythritol) pathway Effect of introduction of isoprene synthase derived from each plant species in E. coli MG1655 strain 6-1) Construction of dxs gene expression plasmid (pMW219-dxs) It has already been reported that when the expression of the dxs gene (1-deoxy-D-xylose-5-phosphate synthase) constituting the MEP pathway in E. coli is enhanced, the amount of isoprene produced is improved (Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2011) 90, 1915-1922).
  • PCR was performed using Prime Star polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using pMW219 as a template and a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 as primers.
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and 40 cycles of reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 54 ° C. for 20 seconds, and 68 ° C. for 240 seconds were performed.
  • a PCR product containing pMW219 was obtained. Thereafter, the purified dxs gene fragment and the PCR product of pMW219 were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). The obtained plasmid for dxs gene expression was named pMW219-dxs.
  • the resulting mixture was uniformly applied to the LB plate and cultured at 37 ° C. for 18 hours. From the obtained plate, a transformant having resistance to chloramphenicol and kanamycin was obtained.
  • E. coli with enhanced expression of DXS Effects of introduction of isoprene synthase from each plant species in E. coli MG1655 strain
  • the isoprene production amounts are in descending order of MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSM / pMW219-dxs strain, MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSK / pMW219-dxs strain, MG1655 / pSTV28-Ptac-IspSP / dx219- And the strain MG1655 / pSTV28-Ptac-Ttrp / pMW219-dxs. From the above results, among the MEP pathway-enhanced strains, the strain into which Mucuna-derived isoprene synthase was introduced showed the highest isoprene-producing ability.
  • E. coli introduced MVA (mevalonic acid) pathway Effect of introduction of isoprene synthase derived from each plant species in E. coli MG1655 strain 7-1) Cloning of mevalonate pathway downstream gene derived from yeast The downstream region of the mevalonate pathway was obtained from Saccharomyces cerevisiae (WO2009076666, Saccharomyces Genome database: www.yeastgenome.org/# Nucleic Acids Res., Jan 2012; 40: D700-D705).
  • ERG12 gene encoding mevalonate kinase
  • ERG8 gene encoding phosphomevalonate kinase
  • ERG19 gene encoding diphosphomevalonate decarboxylase
  • IDI1 gene encoding isopentenyl diphosphate delta isomerase Amplification was carried out by PCR reaction using the indicated primers (Table 10).
  • PrimeSTAR MAX Premix sold by Takara Bio Inc. is used as a PCR enzyme, 98 ° C., 2 minutes, (98 ° C., 10 seconds, 55 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 5 seconds / kb) ⁇ 30 cycles. The reaction was conducted under conditions.
  • the PCR fragment was inserted into the pSTV28-Ptac-Ttrp vector (SEQ ID NO: 17) treated with the restriction enzyme SmaI by the in-fusion cloning method, and cloning and expression vector construction were performed.
  • E. E. coli DH5 ⁇ was transformed, and clones having the expected sequence length of each gene were selected, followed by plasmid extraction according to a conventional method to confirm the sequence.
  • the base sequences of these amplified genes and the amino acid sequences of the enzymes encoded by the genes are described in Saccharomyces Genome database http: // www. yeastgenome. org / #.
  • PCR enzyme KOD plus sold by Toyobo is used, 94 ° C., 2 minutes, (94 ° C., 15 seconds, 45 ° C., 30 seconds, 68 ° C., 1 minute / kb) ⁇ 30 cycles, 68 ° C., The reaction was performed for 10 minutes.
  • the PCR fragment was inserted into the pUC118 vector treated with the restriction enzyme SmaI by the in-fusion cloning method, and cloning and expression vector construction were performed.
  • E. E. coli JM109 was transformed and a clone having the expected sequence length of each gene was selected, followed by plasmid extraction according to a conventional method to confirm the sequence.
  • the prepared plasmid was named pUC-mvk-pmk.
  • the nucleotide sequence of pUC-mvk-pmk is shown in SEQ ID NO: 40.
  • the PCR enzyme used is KOD plus sold by Toyobo, 94 ° C, 2 minutes, (94 ° C, 15 seconds, 45 ° C, 30 seconds, 68 ° C, 1 minute / kb) x 30 cycles, 68 ° C, The reaction was performed for 10 minutes.
  • the PCR fragment was inserted into the pTWV228 vector treated with the restriction enzyme SmaI by the in-fusion cloning method, and cloning and expression vector construction were performed.
  • E. E. coli DH5 ⁇ was transformed, and clones having the expected sequence length of each gene were selected, followed by plasmid extraction according to a conventional method to confirm the sequence.
  • the prepared plasmid was named pTWV-dmd-yidi.
  • the base sequence of pTWV-dmd-yidi is shown in SEQ ID NO: 45.
  • Carboxylase and isopentenyl diphosphate delta isomerase were amplified by PCR, and then cloned into pTrcHis2B vector by In-fusion cloning to construct an expression plasmid in which four enzyme genes were arranged in a linear form. .
  • PCR enzyme PrimeSTAR HS DNA polymerase sold by Takara Bio Inc. is used, 98 ° C., 2 minutes, (98 ° C., 10 seconds, 52 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 1 minute / kb) ⁇ 30 cycles. The reaction was carried out at 72 ° C. for 10 minutes.
  • the PCR fragment was inserted into the pTrcHis2B vector treated with restriction enzymes NcoI and PstI by the in-fusion cloning method to construct an expression vector.
  • E. E. coli JM109 was transformed and a clone having the target sequence length was selected, followed by plasmid extraction according to a conventional method to confirm the sequence.
  • the constructed expression vector was named pTrc-KKDyI ( ⁇ ).
  • the base sequence of pTrc-KKDyI ( ⁇ ) is shown in SEQ ID NO: 50.
  • the Tn7 downstream region in the chromosome fixed region was amplified by PCR using the E. coli genome as a template.
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase sold by Takara Bio Inc. is used as a PCR enzyme, 98 ° C., 2 minutes, (98 ° C., 10 seconds, 52 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 1 minute / kb) ⁇ 30 cycles The reaction was carried out at 72 ° C. for 10 minutes.
  • the cat gene region containing the ⁇ phage attachment site was amplified by PCR using the pMW118-attL-Cm-attR plasmid as a template (WO2010-027022).
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase sold by Takara Bio Inc. is used as the PCR enzyme, 95 ° C., 3 minutes, (95 ° C., 1 minute, 34 ° C., 30 seconds, 72 ° C., 40 seconds) ⁇ 2 cycles, The reaction was conducted under the conditions of 95 ° C., 30 seconds, 50 ° C., 30 seconds, 72 ° C., 40 seconds) ⁇ 25 cycles, 72 ° C., 5 minutes.
  • amplification of a downstream sequence of the mevalonate pathway (hereinafter abbreviated as KKDyI) to which a promoter and a transcription termination region had been added was performed by PCR using pTrc-KKDyI ( ⁇ ) as a template.
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase sold by Takara Bio Inc. is used as a PCR enzyme, 98 ° C., 2 minutes, (98 ° C., 10 seconds, 52 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 1 minute / kb) ⁇ 30 cycles The reaction was carried out at 72 ° C. for 10 minutes.
  • pMW219-KKDyI-TaspA The base sequence of pMW219-KKDyI-TaspA is shown in SEQ ID NO: 55.
  • the Tn7 upstream region was amplified in the chromosome fixed region by PCR using the E. coli genome as a template.
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase sold by Takara Bio Inc. is used, 98 ° C., 2 minutes, (98 ° C., 10 seconds, 52 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 1 minute / kb) ⁇ 30 cycles. The reaction was carried out at 72 ° C. for 10 minutes.
  • a vector was constructed by the In-Fusion cloning method using the PCR product and pMW219-KKDyI-TaspA treated with the restriction enzyme SalI. E. E.
  • coli JM109 was transformed and a clone having the target sequence length was selected, followed by plasmid extraction according to a conventional method to confirm the sequence.
  • the resulting plasmid was named pMW-Tn7-Pgi-KKDyI-TaspA-Tn7.
  • the sequence of the constructed plasmid is shown in SEQ ID NO: 56.
  • the chloramphenicol resistance gene, the glucose isomerase promoter, the mevalonate downstream operon, and the aspA gene transcription termination region were subjected to chromosome fixation.
  • the chromosome fixing fragment was prepared by extracting the plasmid pMW-Tn7-Pgi-KKDyI-TaspA-Tn7, treating it with restriction enzymes PvuI and SalI, and then purifying it.
  • E. coli MG1655 contains a plasmid pKD46 having a temperature-sensitive replication ability.
  • Plasmid pKD46 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, no. 12, p6640-6645] is a DNA fragment (GenBank / EMBL accession number J02459) of ⁇ phage including ⁇ Red system genes ( ⁇ , ⁇ , exo genes) controlled by the arabinose-inducible ParaB promoter (GenBank / EMBL accession number J02459). 31088th to 33241th). After electroporation, colonies that acquired chloramphenicol resistance were obtained.
  • genomic DNA was extracted, and it was confirmed that the target region was fixed to the chromosome by PCR using the primers shown in Table 16. Furthermore, the sequence of the target region was confirmed by confirming the sequence of the PCR fragment.
  • the base sequence of the downstream of the mevalonic acid pathway fixed on the chromosome and the surrounding region is shown in SEQ ID NO: 57, and the construction outline is shown in FIG.
  • the obtained mutant was named MG1655 cat-Pgi-KKDyI.
  • the drug marker of MG1655 cat-Pgi-KKDyI was removed by the following procedure. After creating competent cells of MG1655 cat-Pgi-KKDyI, pMW-int-xis was introduced. pMW-int-xis is a plasmid carrying a gene encoding lambda phage integrase (Int) and gene encoding exonase (Xis) and having temperature-sensitive replication ability (WO2007 / 037460, specially Open 2005-058827).
  • the chloramphenicol resistance gene located in the region sandwiched between attL and attR, which are attachment sites of ⁇ phage is dropped from the chromosome.
  • the host is known to lose chloramphenicol resistance. Therefore, a chloramphenicol sensitive strain was obtained from the obtained colonies. Thereafter, the cells were cultured at 42 degrees for 6 hours in the LB medium, and then applied to the LB plate medium to allow colonies to appear. Drug resistance was removed by selecting clones that lost ampicillin resistance from these.
  • the mutant thus obtained was named MG1655 Pgi-KKDyI.
  • the PCR enzyme uses LA-Taq polymerase sold by Takara Bio Inc., 92 ° C, 1 minute, (92 ° C, 10 seconds, 50 ° C, 20 seconds, 72 ° C, 1 minute / kb) x 40 cycles The reaction was conducted at 72 ° C. for 7 minutes.
  • the PCR product was purified and used to electroporate MG1655 Pgi-KKDyI (hereinafter referred to as MG1655 Pgi-KKDyI / pKD46) containing the plasmid pKD46 having temperature-sensitive replication ability. Plasmid pKD46 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, no.
  • p6640-6645 is a DNA fragment (GenBank / EMBL accession number J02459) of ⁇ phage containing ⁇ Red system genes ( ⁇ , ⁇ , exo genes) controlled by the arabinose-inducible ParaB promoter (GenBank / EMBL accession number J02459). 31088th to 33241th). Plasmid pKD46 is required to incorporate the PCR product into MG1655 Pgi-KKDyI.
  • a competent cell for electroporation was prepared as follows. MG1655 Pgi-KKDyI / pKD46 cultured overnight at 30 ° C. in LB medium containing 100 mg / L ampicillin was diluted 100-fold with 5 mL of LB medium containing ampicillin and L-arabinose (1 mM). The obtained dilution was allowed to grow until the OD600 was about 0.6 while aerated at 30 ° C., and then washed three times with an ice-cooled 10% glycerol solution so that it could be used for electroporation. Electroporation was performed using 50 ⁇ L of competent cells and approximately 100 ng of PCR product.
  • the cell after electroporation was 1 mL of SOC medium [Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, J. et al. In addition, Cold Spring Harbor Press (1989)] was added and cultured at 37 ° C. for 1 hour, and then plated on LB agar medium at 37 ° C. to select a chloramphenicol resistant recombinant.
  • SOC medium Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, J. et al. In addition, Cold Spring Harbor Press (1989)] was added and cultured at 37 ° C. for 1 hour, and then plated on LB agar medium at 37 ° C. to select a chloramphenicol resistant recombinant.
  • SOC medium Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, J. et al. In addition, Cold Spring Harbor Press (1989)
  • pKD46 plasmid it was subcultured on an LB agar medium containing tetracycline at 37
  • pMW-int-xis is a plasmid carrying a gene encoding lambda phage integrase (Int) and gene encoding exonase (Xis) and having temperature-sensitive replication ability (WO2007 / 037460, specially Open 2005-058827).
  • pMW-int-xis the tetracycline resistance gene in the region sandwiched between attL and attR, which are attachment sites of ⁇ phage, is dropped from the chromosome.
  • a tetracycline sensitive strain was obtained from the obtained colony. Thereafter, the cells were cultured at 42 ° C. for 6 hours in LB medium, and then applied to LB plate medium to allow colonies to appear. Drug resistance was removed by selecting clones that lost ampicillin resistance from these.
  • the obtained mutant was named MG1655 Ptac-KKDyI.
  • SEQ ID NO: 69 The nucleotide sequence downstream of the mevalonate pathway controlled by the tac promoter on the chromosome and the surrounding region are shown in SEQ ID NO: 69, and the outline is shown in FIG.
  • a strain in which pSTV28-Ptac-Ttrp was introduced into the MG1655 Ptac-KKDyI strain was designated as MG1655 Ptac-KKDyI / pSTV28-Ptac-Ttrp strain, and a strain in which pSTV28-Ptac-IspSK was introduced into MG1655 Ptac-KKDySpKSTyPp / STKD-STP
  • the strain introduced with pSTV28-Ptac-IspSM was named MG1655 Ptac-KKDyI / pSTV28-Ptac-IspSM strain
  • the strain introduced with pSTV28-Ptac-IspSP was named MG1655 Ptac-KKDyI / pSTV28-Ptac-IspSP strain .
  • isoprene production in descending order is MG1655 Ptac-KKDyI / pSTV28-Ptac-IspSM strain, MG1655 Ptac-KKDyI / pSTV28-Ptac-IspSK strain, MG1655 Ptac-KKDyI / pSTVsp-SPtac-SPtac-SPt- It became MG1655 Ptac-KKDyI / pSTV28-Ptac-TTrp strain. From the above results, even in the MVA pathway-introduced strain, the strain into which Mucuna-derived isoprene synthase was introduced showed the highest isoprene-producing ability.
  • Example 5 P.I. Construction of ananatis AG10265 5-1) Construction of pMW-Para-mvaES-Ttrp 5-1-1) Chemical synthesis of enterococcus faecalis-derived mvaE gene And the amino acid sequence are already known (base sequence ACCESSION numbers: AF29009.1, (1479..3890), amino acid sequence ACCESSION number: AAG02439) (J. Bacteriol. 182 (15), 4319-4327 (2000). )). The amino acid sequence of Enterococcus faecalis-derived mvaE protein and the nucleotide sequence of the gene are shown in SEQ ID NO: 72 and SEQ ID NO: 73, respectively. The mvaE gene was transformed into E.
  • E. coli for efficient expression in E. coli.
  • An mvaE gene optimized for E. coli codon usage was designed and named EFmvaE. This base sequence is shown in SEQ ID NO: 74.
  • the mvaE gene was chemically synthesized and then cloned into pUC57 (GenScript), and the resulting plasmid was named pUC57-EFmvaE.
  • coli for efficient expression in E. coli.
  • An mvaS gene optimized for E. coli codon usage was designed and named EFmvaS. This base sequence is shown in SEQ ID NO: 77.
  • the mvaS gene was chemically synthesized and then cloned into pUC57 (GenScript), and the resulting plasmid was named pUC57-EFmvaS.
  • arabinose-inducible mevalonate pathway upstream gene expression vector was constructed by the following procedure. E. coli by PCR using the plasmid pKD46 as a template and the synthetic oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 78 and SEQ ID NO: 79 as primers. A PCR fragment containing Para comprising the araC and araBAD promoter sequences from E. coli was obtained.
  • a PCR fragment containing the EFmvaE gene was obtained by PCR using the plasmid pUC57-EFmvaE as a template and the synthetic oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 80 and SEQ ID NO: 81 as primers.
  • a PCR fragment containing the EFmvaS gene was obtained by PCR using the plasmid pUC57-EFmvaS as a template and the synthetic oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 82 and SEQ ID NO: 83 as primers.
  • a PCR fragment containing the Ttrp sequence was obtained by PCR using the plasmid pSTV-Ptac-Ttrp as a template and the synthetic oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 84 and SEQ ID NO: 85 as primers.
  • Prime Star polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for PCR to obtain these four PCR fragments.
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and 30 cycles of reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 1 minute / kb were performed.
  • Synthetic oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 78 and SEQ ID NO: 81 using a PCR product containing purified Para and a PCR product containing EFmvaE gene as a template SEQ ID NO: using a PCR product containing purified EFmvaS gene and a PCR product containing Ttrp as a template PCR was performed using 82 and the synthetic oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 85 as primers.
  • PCR products containing Para and EFmvaE genes, EFmvaS and Ttrp were obtained.
  • Plasmid pMW219 (Nippon Gene) was digested with SmaI according to a conventional method.
  • a PCR product containing pMW219 and purified Para and EFmvaE genes, and a PCR product containing EFmvaS gene and Ttrp after SmaI digestion were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech).
  • the resulting plasmid was named pMW-Para-mvaES-TTrp.
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase sold by Takara Bio Inc. is used as a PCR enzyme, 98 ° C., 2 minutes, (98 ° C., 10 seconds, 52 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 1 minute / kb) ⁇ 30 cycles The reaction was carried out at 72 ° C. for 10 minutes.
  • the PCR fragment was inserted into the pTrcHis2B vector treated with restriction enzymes NcoI and PstI by the in-fusion cloning method to construct an expression vector.
  • E. E. coli JM109 was transformed and a clone having the target sequence length was selected, followed by plasmid extraction according to a conventional method to confirm the sequence.
  • the constructed expression vector was named pTrc-KKDyI ( ⁇ ).
  • the base sequence of pTrc-KKDyI ( ⁇ ) is shown in SEQ ID NO: 90.
  • pTrc-KKDyI-ispS (K) in which IspS (K) was added to the obtained pTrc-KKDyI ( ⁇ ) (SEQ ID NO: 90) was carried out by the following procedure.
  • pTrc-KKDyI ( ⁇ ) was digested with the restriction enzyme PstI (Takara Bio Inc.) to obtain pTrc-KKDyI ( ⁇ ) / PstI.
  • PCR was performed using Prime Star polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) with pUC57-ispSK as a template, pTrcKKDyIkSS_6083-10-1 (SEQ ID NO: 91) and pTrcKKDyIkSA_6083-10-2 (SEQ ID NO: 92) as primers.
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and the reaction was carried out for 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 54 ° C. for 20 seconds, and 68 ° C. for 120 seconds. As a result, a PCR product containing the IspSK gene was obtained.
  • Mmamvk The base sequence of Mmamvk is shown in SEQ ID NO: 96.
  • the Mmamvk gene was chemically synthesized and then cloned into pUC57 (GenScript), and the resulting plasmid was named pUC57-Mmamvk.
  • a plasmid for expressing the IspSK gene and the Mmamvk gene in E. coli was constructed by the following procedure. PCR was performed using Prime Star polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using pUC57-IspSK as a template and a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 97 and SEQ ID NO: 98 as primers. The reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and 40 cycles of reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 54 ° C.
  • PCR product containing the IspSK gene was obtained.
  • pSTV28-Ptac-Ttrp was subjected to PCR using Prime Star polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 99 and SEQ ID NO: 100 as a primer.
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and 40 cycles of reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 54 ° C. for 20 seconds, and 68 ° C. for 210 seconds were performed.
  • a PCR product containing pSTV28-Ptac-Ttrp was obtained. Thereafter, the purified IspSK gene fragment and the pSTV28-Ptac-Ttrp PCR product were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). The obtained plasmid for expressing the IspSK gene was named pSTV28-Ptac-IspSK.
  • PCR was performed using Prime Star polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using pUC57-Mmamvk as a template and a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 101 and SEQ ID NO: 102 as primers.
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and 30 cycles of reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 1 minute / kb were performed. As a result, a PCR product containing the Mmamvk gene was obtained.
  • pSTV28-Ptac-IspSK was subjected to PCR using Prime Star polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 103 and SEQ ID NO: 104 as a primer.
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and 30 cycles of reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 1 minute / kb were performed. As a result, a PCR product containing pSTV28-Ptac-IspSK was obtained.
  • the obtained plasmid for expression of IspSK gene and Mmamvk gene was named pSTV28-Ptac-ispSK-Mmamvk.
  • the KpnI-SalI fragment of pMW-Para-mvaES-Ttrp was cloned into the SphI-SalI recognition site of pAH162- ⁇ attL-TcR- ⁇ attR.
  • E.I. E. coli under the control of the Para Para promoter and repressor gene araC.
  • the pAH162-Para-mvaES plasmid carrying the faecalis-derived mvaES operon was constructed (FIG. 6).
  • the BglII-EcoRI fragment of pSTV28-Ptac-ispS-Mamvk containing the ispS (Mucuna) and mvk (M.mazei) genes under the control of Ptac is recognized by the BamHI-Ecl136II site of the integrating vector pAH162- ⁇ attL-TcR- ⁇ attR. Subcloned into. The resulting plasmid pAH162-Ptac-ispS (M) -mvk (Mma) is shown in FIG.
  • PMWattphi plasmid (Minaeva NI et al., BMC Biotechnol. 2008; 8:63) was used as a template in these reactions.
  • the resulting integrants were named SC17 (0) ⁇ ampC :: attLphi80-kan-attRphi80, SC17 (0) ⁇ amph :: attLphi80-kan-attRphi80, and SC17 (0) ⁇ crt :: attLphi80-kan-attRphi80.
  • Oligonucleotides 7 and 8, 9 and 10, and 11 and 12 were converted to SC17 (0) ⁇ ampC :: attLphi80-kan-attRphi80, SC17 (0) ⁇ ampHpH :: attLphi80-kan-attRphi80, and SC17, respectively.
  • (0) ⁇ crt :: attLphi80-kan-attRphi80 strain was used for verification by PCR.
  • the obtained SC17 (0) ⁇ ampC :: pAH162-KKDyI-ispS (K) strain was obtained by following the procedure described previously (Katashkina JI et al., BMC Mol Biol. 2009; 10:34). Using the pMWintxis-cat helper plasmid carrying the gene, the vector portion of pAH162-KKDyI-ispS (K) was cured. As a result, an SC17 (0) ⁇ ampC :: KKDyI-ispS (K) strain was obtained. Oligonucleotides 7 and 15 (Table 20) were used for PCR verification of kanamycin sensitive derivatives. The construction of SC17 (0) ⁇ ampC :: KKDyI-ispS (K) is shown in FIG.
  • Genomic DNA isolated from the SC17 (0) ⁇ amph :: attLphi80-kan-attRphi80 strain using the GeneElute bacterial genomic DNA kit (Sigma) was previously reported (Katashkina JI et al., BMC Mol Biol. 2009; 10: According to the method of chromosome electroporation of 34), the SC17 (0) ⁇ ampC :: KKDyI-ispS (K) strain was electroporated. Transfer of the ⁇ ampH :: attLphi80-kan-attRphi80 mutation was confirmed by PCR using primers 9 and 10.
  • the last strain was cured from the kanamycin resistance marker using the phi80 Int / Xis dependency method (Andreeva IG et al., FEMS Microbiol Lett. 2011; 318 (1): 55-60).
  • the ⁇ ampC :: KKDyI-ispS (K) variant was verified by PCR using primers 7 and 15, and then SC17 (0) ⁇ ampC :: KKDyI-ispS (K) ⁇ amppH :: attBphi80 A stock was selected.
  • the pAH162-Para-mvaES plasmid was transformed into SC17 (0) ⁇ ampC :: KKDyI-ispS using the pAH123-cat helper plasmid (Andreweva IG et al., FEMS Microbiol Lett. 2011; 318 (1): 55-60).
  • K Incorporated into ⁇ ampH :: attBphi80. Oligonucleotides 13 and 9 and oligonucleotides 14 and 10 (Table 20) were used for PCR verification of the resulting integrants.
  • Chromosome variant SC17 (0) ⁇ crt :: pAH162-Ptac-ispS (K) -mvk (Mma) thus constructed has been reported (Katashkina JI et al., BMC Mol Biol. 2009; 10:34).
  • the obtained integrant was transformed into pAH162-Ptac-ispS (K) -mvk (Mma) using the phage ⁇ Int / Xis dependent technology (Katashkina JI et al., BMC Mol Biol. 2009; 10:34). Cure from vector part.
  • the structure of the final construct ⁇ crt :: Ptac-ispS (K) -mvk (Mma) (FIG. 11) was confirmed by PCR using primers 11 and 17.
  • the ISP3-S strain without the marker (P. ananatis SC17 (0) ⁇ ampC :: attLphi80- KKDyI-ispS (K) -attRphi80 ⁇ ampH :: attLphi80-Para-mvaES-attRphi80 ⁇ crt :: attLphi80-Ptac-ispS (K) -mvk (Mma) -attRphi80) was obtained.
  • the constructed ⁇ crt :: pAH123-Ptac-mvk (M.palladicola) chromosomal variant was transformed into ISP3-S via electroporation of genomic DNA isolated from SC17 (0) ⁇ crt :: pAH162-Ptac-Mclmvk. Strain [see 5-7].
  • the resulting integrant was designated as AG10265 (P.
  • Example 6 Production of Pantoea strain with improved expression of ppa gene and production of isoprene by culture using the same In the ananatis strain, a strain in which the intrinsic ppa gene (pyrophosphate phosphatase gene) was replaced with another strong promoter and expression of the endogenous ppa gene was enhanced was prepared by the following procedure.
  • a strain in which the promoter sequence and SD sequence of the PAJ_2344 (ppa-1) gene and the PAJ_2736 (ppa-2) gene were substituted with Ptac and ⁇ 10, respectively, in the ananatis SC17 (0) strain was prepared by the ⁇ Red method.
  • the ⁇ Red method is described in BMC Mol Biol. 2009; 10:34.
  • Annotated P.P. Genomic sequence information for ananatis AJ13355 is available under GenBank accession numbers AP012032.1 and AP012033.1.
  • Genomic DNA was extracted from ananatis SC17 (0) strain Ptac-lacZ (RU application 2006134574, WO2008 / 090770, US20110062496) and used as a template for PCR.
  • P. In the ananatis SC17 (0) strain Ptac-lacZ, ⁇ attL-Km r - ⁇ attR-Ptac in which the Ptac promoter is linked downstream of ⁇ attL-Km r - ⁇ attR is incorporated upstream of the lacZ gene (WO2011 / 87139 A1 See).
  • the synthetic nucleotide comprising the nucleotide sequence shown in Table 21 of PAJ — 2344-F and PAJ — 2344-R was used as a primer, and the promoter region of the PAJ — 2736 (ppa-2) gene was replaced.
  • PCR was performed using PrimeSTAR MAX DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using the synthetic nucleotides consisting of the nucleotide sequences shown in PAJ — 2736-F and PAJ — 2736-R in Table 21 as primers.
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and the reaction was carried out for 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds. As a result, a promoter replacement fragment containing ⁇ attL-Km r - ⁇ attR- ⁇ 10 was obtained.
  • the RSF-Red-TER (US7919284B2) plasmid was introduced into SC17 (0) by electroporation according to a conventional method, and the resulting strain was named SC17 (0) / RSF-Red-TER.
  • the purified promoter replacement fragment containing ⁇ attL-Km r - ⁇ attR- ⁇ 10 was introduced by electroporation. After electroporation, colonies that acquired kanamycin resistance were obtained.
  • ppa_p1-F (Table 21) and ppa_p1-R (Table 21) indicate that a sequence derived from a PCR fragment was inserted into the upstream region of PAJ — 2344 (ppa-1) gene or the upstream region of PAJ — 2736 (ppa-2) gene.
  • ppa_p2-F (Table 21) and ppa_p2-R (Table 21) were confirmed by PCR using synthetic DNA primers, and a strain in which fragment insertion was confirmed was obtained.
  • the bacterial strain thus obtained is ananatis SC17 (0) Ptac- ⁇ 10-ppa1 and P. It was named ananatis SC17 (0) Ptac- ⁇ 10-ppa2.
  • Amplification was carried out by PCR using a synthetic nucleotide consisting of the base sequence shown by -R primer as a primer.
  • PrimeSTAR GXL DNA polymerase manufactured by Takara Bio Inc.
  • the reaction solution was prepared according to the composition attached to the kit, and the reaction was performed at 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 5 minutes. For 40 cycles.
  • a fragment containing 1 kb upstream from 1 kb upstream of the PAJ — 2344 (ppa-1) gene or PAJ — 2736 (ppa-2) gene was obtained.
  • the obtained fragment was purified, and 600 ng of the PCR product was introduced into AG10265 by electroporation for transformation to obtain colonies that acquired kanamycin resistance.
  • the promoter of PAJ — 2344 (ppa-1) gene was replaced by colony PCR using a synthetic nucleotide consisting of the base sequence shown in Ppa_p1-F and Ppa_p1-R in Table 21 as a primer. confirmed.
  • substitution of the PAJ_2736 (ppa-2) gene promoter was confirmed by colony PCR using synthetic nucleotides composed of the base sequences shown in Table 21 Ppa_p2-F and Ppa_p2-R as primers.
  • the promoter region of the PAJ — 2344 (ppa-1) gene or the PAJ — 2736 (ppa-2) gene is replaced with Ptac- ⁇ 10.
  • One clone of each was selected and named AG10265 Ptac- ⁇ 10-ppa1 and AG10265 Ptac- ⁇ 10-ppa2.
  • the collected cells were washed twice with ice-cooled 50 mM Tris buffer (Tris-HCl pH 8.0), and multi-bead shocker (Yasui Kikai, Japan, 4 ° C., 60 seconds ON, 60 seconds OFF, 2500 rpm).
  • the cells were disrupted with 5 cycles).
  • the disrupted cell solution was centrifuged at 14000 rpm for 20 minutes to remove unbroken cells.
  • the obtained supernatant fraction was handled as a soluble protein fraction.
  • 5 ⁇ g of the soluble protein was subjected to electrophoresis using SDS-PAGE (NuPAGE: SDS-PAGE Gel System manufactured by Invitrogen).
  • FIG. 12 shows a photograph of the gel near the amount of PPA protein.
  • an increase in the expression level of the protein presumed to be PPA was confirmed in the AG10265 Ptac- ⁇ 10-ppa1 strain and the AG10265 Ptac- ⁇ 10-ppa2 strain, respectively.
  • the expression level of PPA protein in AG10265 Ptac- ⁇ 10-ppa1 strain and AG10265 Ptac- ⁇ 10-ppa2 strain is that of the original strain (AG10265). It was estimated to be about 1.5 to 2.0 times.
  • Isoprene production amount in jar culture AG10265 (Control), AG10265 PPA1, and AG10265 PPA2 were cultured under the above jar culture conditions, and the production amount of isoprene was measured.
  • FIG. 13 shows the profile of cell growth
  • FIG. 14 shows the results of measurement of isoprene production up to 71 hours after the start of culture. They were AG10265 PPA2, AG10265 PPA1, and AG10265 Control in descending order of total isoprene production (FIG. 3).
  • the total amount of isoprene produced was 2478 mg for AG10265 PPA2, 2365 mg for AG10265 PPA1, and 2013 mg for AG10265 (Control).
  • Ananatis isoprene-producing bacteria are P. aeruginosa that has not enhanced the expression level of pyrophosphate phosphatase.
  • the isoprene producing ability was superior to that of the ananatis isoprene producing bacterium.
  • MVA pathway upstream chromosome fixing plasmid pAH162-PphoC-mvaES was constructed as follows. (1-1) Construction of arabinose-induced enterococcus faecalis (E. faecalis) -derived mevalonate pathway upstream gene (mvaES (E. faecalis)) expression plasmid pMW-P ara -mvaES-Ttrp (1) -1-1) Chemical synthesis and cloning of mvaES (E.
  • mvaES gene encoding mevalonate pathway upstream gene (mvaES (E. faecalis)) from Enterococcus faecalis (E. faecalis) Nucleotide sequence (GenBank / EMBL / DDBJ accession ID AF29009.1) and amino acid sequence (mvaS, GenPe) t accession ID AAG02438.1, mvaE, GenPept accession ID AAG02439.1) are known (Wilding, EI et al., J. Bacteriol. 182 (15), see 4319-4327 (2000)). Based on these information, mvaE gene and mvaS gene optimized for codon usage of E.
  • coli were designed and named EFmvaE and EFmvaS, respectively.
  • the base sequence of EFmvaE is shown in SEQ ID NO: 139
  • the base sequence of EFmvaS is shown in SEQ ID NO: 140.
  • the DNA sequences of EFmvaE and EFmvaS prepared by chemical synthesis were cloned into an expression plasmid pUC57 (GenScript) by conventional methods, and the resulting plasmids were named pUC57-EFmvaE and pUC57-EFmvaS, respectively.
  • the nucleotide sequence of pUC57-EFmvaE is shown in SEQ ID NO: 141
  • the nucleotide sequence of pUC57-EFmvaS is shown in SEQ ID NO: 142.
  • Plasmid pMW219 (manufactured by Nippon Gene, product number: 310-02571) was digested with SmaI, and the digested plasmid was purified. The resulting plasmid was named pMW219 / SmaI.
  • a PCR reaction was performed using a plasmid pTrcHis2B having a P trc region as a template and a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 143 and SEQ ID NO: 144 as primers. It was.
  • a PCR reaction was performed using plasmid pUC57-EFmvaE as a template and synthetic oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 145 and SEQ ID NO: 146 as primers.
  • PCR reaction was performed using plasmid pUC57-EFmvaS as a template and synthetic oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 146 and SEQ ID NO: 147 as primers.
  • a gene of the trp terminator (T trp ) region a plasmid pSTV-P tac -T trp having a T trp region as a template and a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 148 and SEQ ID NO: 149 as primers are used.
  • PCR was performed.
  • Prime Star polymerase manufactured by Takara Bio Inc.
  • a reaction solution was prepared according to the instructions provided by the enzyme manufacturer.
  • the reaction conditions were 98 ° C .: 10 seconds, 55 ° C .: 5 seconds, 72 ° C .: 60 seconds / kb, and cycle number: 30.
  • cycle number 30.
  • a PCR product containing the gene in the P trc region and the mvaE gene and a PCR product containing the mvaS gene and the gene in the T trp region were obtained. Thereafter, a PCR product containing a gene in the P trc region and the mvaE gene, a PCR product containing the mvaS gene and a gene in the T trp region, and the digested plasmid pMW219 / SmaI were converted into an In-Fusion HD Cloning Kit. (Clontech) was used for connection. The resulting plasmid was named pMW-P trc -mvaES-T trp . The sequence of the obtained pMW-P trc -mvaES-T trp is shown in SEQ ID NO: 151.
  • PCR was performed using the plasmid pMW-P trc -mvaES-T trp prepared in (1-2-3) as a template and a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 152 and SEQ ID NO: 153 as primers.
  • Gene P araC region as a template, araC gene, and P genes of the region containing the gene of araBAD region (hereinafter together referred to as "gene of P ara region") plasmid pKD46 containing (Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645), and PCR was performed using synthetic oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 154 and SEQ ID NO: 155 as primers.
  • a PCR product containing the pMW plasmid and mvaES gene was obtained and a PCR product containing the gene for P ara region.
  • These purified PCR products were ligated to each other using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech).
  • the resulting arabinose-derived E. coli. faecalis-derived mevalonate pathway upstream gene (mvaES (E. faecalis)) the expression plasmid was designated pMW-P ara -mvaES-Ttrp.
  • the base sequence of pMW-P ara -mvaES-Ttrp is shown in SEQ ID NO: 156.
  • a set of plasmids for immobilizing chromosomes holding mvaES genes under the control of different promoters was constructed.
  • a polylinker containing I-SceI, XhoI, PstI and SphI recognition sites was inserted into the only HindIII recognition site located upstream of the mvaES gene.
  • annealing was performed using a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 157 and SEQ ID NO: 158 and polynucleotide kinase, and the resulting fragment was ligated to pAH162-mvaES plasmid cleaved with HindIII.
  • the resulting pAH162-MCS-mvaES plasmid (FIG. 16) is convenient for cloning the promoter while maintaining the desired orientation in front of the mvaES gene.
  • a DNA fragment carrying the regulatory region of the phoC gene was isolated from P. cerevisiae.
  • genomic DNA of ananatis SC17 (0) strain (Katashkina JI et al. BMC Mol Biol. 2009; 10:34) as a template and oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 159 and SEQ ID NO: 160
  • the obtained plasmid is shown in FIG.
  • the cloned promoter fragment was sequenced and confirmed to correspond exactly to the expected nucleotide sequence.
  • the resulting plasmid was designated as pAH162-PphoC-mvaES.
  • a pAH162-Km-Ptac-KDyI-integrated plasmid was constructed as follows as a plasmid for fixing chromosomes downstream of the MVA pathway.
  • the AatII-ApaI fragment of pAH162- ⁇ attL-Tc R - ⁇ attR (Minaeva NI et al. BMC Biotechnol.
  • an integrative expression vector pAH162-P tac was constructed.
  • the cloned promoter fragment was sequenced.
  • a map of pAH162-P tac is shown in FIG. Chemically synthesized by ATG Service Gene ( Russian), S. cerevisiae having a substituted rare codon.
  • a DNA fragment carrying the cerevisiae-derived PMK, MVD and yldI genes was subcloned into the SphI-KpnI restriction endonuclease recognition site of the integrative vector pAH162-Ptac.
  • the DNA sequence containing the chemically synthesized KDyI operon is shown in SEQ ID NO: 184.
  • FIG. 21A The resulting plasmid pAH162-Tc-Ptac-KDyI carrying the Ptac-KDyI expression cassette is shown in FIG. 21A. Thereafter, the NotI-KpnI fragment of pAH162-Tc-P tac -KDyI carrying the tetAR gene was replaced with the corresponding fragment of pAH162- ⁇ attL-KmR- ⁇ attR. As a result, a pAH162-Km-Ptac-KDyI plasmid was obtained using the kanamycin resistance gene kan as a marker (FIG. 21B).
  • a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 163 (primer 13) and SEQ ID NO: 164 (primer 14), and SEQ ID NO: 165 (primer 15) and SEQ ID NO: 166 ( Synthetic oligonucleotides consisting of the base sequence of primer 16) were used as primers to generate DNA fragments used for incorporation into the ampH and ampC genes, respectively.
  • a primer it was used for PCR verification of the obtained chromosome modification product.
  • a DNA fragment used for the replacement of the crt operon by attL phi80 -kan-attR phi80 was amplified by a PCR reaction using a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 171 (primer 21) and SEQ ID NO: 172 (primer 22). .
  • the pMWattphi plasmid (Minaeva NI et al. BMC Biotechnol. 2008; 8:63) was used as a template in this reaction.
  • the resulting integrant was named SC17 (0) ⁇ crt :: attL phi80 -kan-attR phi80 .
  • a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 173 (primer 23) and SEQ ID NO: 174 (primer 24) was converted into SC17 (0) ⁇ crt :: attL phi80 -kan-attR phi80 . It was used for PCR verification of the chromosomal structure. Removal of the kanamycin resistance marker from the constructed strain was performed using the pAH129-cat helper plasmid according to a previously reported technique (Andreweva IG et al. FEMS Microbiol Lett. 2011; 318 (1): 55-60).
  • the resulting maps of ⁇ ampC :: attB phi80 , ⁇ ampH :: attB phi80, and ⁇ crt :: attB phi80 genomic variants are shown in FIGS. 23A), 7B), and 7C), respectively.
  • the pAH162-Ptac-mvk (M. palidicola) plasmid was prepared according to a previously reported protocol (Andrewa IG et al. FEMS Microbiol Lett. 2011; 318 (1): 55-60) according to SC17 (0) ⁇ crt :: attB phi80 . Integrated into the genome. Polymerase using the synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 171 (primer 21) and SEQ ID NO: 173 (primer 23), SEQ ID NO: 172 (primer 22) and SEQ ID NO: 174 (primer 24) as primers for plasmid integration Confirmed by chain reaction.
  • SC17 (0) ⁇ crt :: pAH162-P tac -mvk (M.paludicola) to SC17 (0) via a genomic DNA electroporation procedure (Katashkina JI et al. BMC Mol Biol. 2009; 10:34).
  • ⁇ ampC :: attB phi80 Transfer into ⁇ ampH :: attB phi80 was performed.
  • the obtained strain was isolated from the previously reported pMW-intxis-cat helper plasmid [Katashkina JI et al. BMC Mol Biol. 2009; 10: 34] was cured from the vector portion of the pAH162-Ptac-mvk (M. palladicola) integrated plasmid.
  • SWITCH-PphoC stock The pAH162-Km-Ptac-KDyI plasmid was transformed into SC17 (0) ⁇ ampH :: attB ⁇ 80 ⁇ ampC :: tampC :: tamp according to a previously reported protocol (Andreweva IG et al. FEMS Microbiol Lett. 2011; 318 (1): 55-60). It was integrated into the chromosome of ⁇ 80 ⁇ crt :: P tac -mvk (M. palidicola) / pAH123-cat strain. After electrophoresis, cells were seeded on LB agar containing 50 mg / L kanamycin.
  • the propagated Km R clone was primered with a synthetic oligonucleotide consisting of the base sequences of SEQ ID NO: 163 (primer 13) and SEQ ID NO: 167 (primer 17), and SEQ ID NO: 163 (primer 13) and SEQ ID NO: 169 (primer 19).
  • the polymerase chain reaction was used.
  • Strains carrying the pAH162-Km-Ptac-KDyI plasmid integrated into ⁇ ampH :: attB ⁇ 80 or pC :: attB ⁇ 80 m were selected.
  • FIG. 25 A map of ⁇ ampH :: pAH162-Km-Ptac-KDyI and ⁇ ampC :: pAH162-Km-Ptac-KDyI chromosomal modifications is shown in FIG. 25 (A and B).
  • pAH162-PphoC-mvaES was prepared using a previously reported protocol [Andreeva IG et al. FEMS Microbiol Lett. 2011; 318 (1): 55-60] using the pAH123-cat helper plasmid with SC17 (0) ⁇ ampC :: pAH162-Km-P tac -KDyI ⁇ ampH :: attB phi80 ⁇ crt :: P tac -mvk (M .Paludicola) and SC17 (0) ⁇ ampC :: attB phi80 ⁇ ampH :: pAH162-Km-P tac -KDyI ⁇ crt :: P tac -mvk (M.palladicola) inserted into the chromosome of the recipient strain.
  • SWITCH-PphoC-1 and SWITCH-PphoC-2 were obtained.
  • a map of ⁇ ampH :: pAH162-PphoC-mvaES and ⁇ ampC :: pAH162-PphoC-mvaES chromosome modifications is shown in FIG.
  • SWITCH-PphoC-1 (S) strain Removal of tetracycline and kanamycin resistance markers from SWITCH-PphoC-1 was carried out by phage phi80 Int / Xis-dependent removal according to a previously reported method (Katashkina JI et al. BMC Mol. Biol. 2009; 10:34). The obtained strain was named SWITCH-PphoC-1 (S) strain.
  • Example 7 E. coli in the SWITCH-PphoC-1 (S) strain. production of Pantoea strain in which the ppa gene of E. coli MG1655 (b4226) is highly expressed, and isoprene production by culture using the same In the ananatis strain, A strain in which the expression of the E. coli MG1655 (b4226) ppa gene (pyrophosphate phosphatase gene) was enhanced with a strong promoter was prepared by the following procedure.
  • ppa gene (b4226) was isolated by PCR using the genomic DNA isolated from E. coli MG1655 strain as a template and a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 175 and SEQ ID NO: 176 as primers, and the pSTV28Ptac-TTrp vector (reference)
  • the ppa gene isolated by PCR was introduced into the site cleaved with the restriction enzyme SmaI by the in-fusion method to construct plasmid pSTV28Ptac-MG-ppa-Trp.
  • a region containing the Tac promoter, ppa gene, and Trp terminator was isolated by PCR using this plasmid as a template and a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 177 and SEQ ID NO: 178 as primers, and pAH162-Km-attLR was isolated.
  • the vector was introduced into the site cleaved with restriction enzymes BamHI and EcoRI using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to construct plasmid pAH162-Ptac-MG-ppa.
  • E.E. ... Coli MG1655 ppa gene construct expression enhanced isoprene production strain and the control strain
  • YdcI gene PAJ_1320, Hara Y et al, The complete genome sequence of Pantoea ananatis AJ13355, an organism with great biotechnological potential Appl Microbiol Biotechnol 2012 Jan; 93 (1): 331-41), which carries the attB site of phi80 phage.
  • Ananatis SC17 (0) derivative was constructed.
  • a synthetic oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 179 and SEQ ID NO: 180 was used as a primer.
  • Genomic DNA isolated from this strain was electroporated into SWITCH-PphoC-1 (S) strain according to the method of chromosomal electroporation described previously (Katashkina JI et al., BMC Mol Biol. 2009; 10:34). . It was verified by PCR that the ⁇ ydcI :: Ptac-MG-ppa variant was integrated into the chromosome of the SWITCH-PphoC-1 (S) strain using a primer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 182 and SEQ ID NO: 183. In this way, E.I.
  • Ptac-MG-ppa strain which is an isoprene-producing strain into which the ppa gene derived from coi MG1655 was introduced.
  • Genomic DNA was isolated from the ananatis SC17 (0) derivative, and the SWITCH-PphoC-1 (S) strain was prepared according to the method of chromosome electroporation described previously (Katashkina JI et al., BMC Mol Biol. 2009; 10:34). Electroporated.
  • a ⁇ ydcI variant was verified by PCR using primers having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 181 and SEQ ID NO: 182, and then a control isoprene-producing strain SWITCH-PphoC-1 (S) ⁇ ydcI was selected.
  • FIG. 27 shows a photograph of the gel near the amount of PPA protein.
  • SWITCH-PphoC-1 (S) ydcI The obtained isoprene-producing strains were named SWITCH-PphoC-1 (S) ydcI :: MG-PPA / ispSM, SWITCH-PphoC-1 (S) ⁇ ydcI / ispSM (Control), respectively.
  • SWITCH-PphoC-1 (S) ydcI Measurement of isoprene synthase activity
  • SWITCH-PphoC-1 (S) ydcI MG-PPA / ispSM strain
  • SWITCH-PphoC-1 (S) ⁇ ydcI / ispSM (Control) strain each contain chloramphenicol
  • the LB plate was evenly spread and cultured at 34 ° C. for 16-24 hours. From the resulting plate, 1 platinum loop of microbial cells is inoculated into 1 mL of PS medium in a headspace vial (22 mL CLEAR CLIMP TOP Vial cat # B0104236 manufactured by Perkin Elmer), with cap butyl rubber septum for headspace vial (Perkin Elmer). After sealing with CRIMPS cat # B0104240 manufactured by the company, the cells were cultured at 30 ° C. for 48 hours with a reciprocating shake culture apparatus (120 rpm).
  • composition of the PS medium is as described in Table 23.
  • Example 8 Production of polyisoprene Isoprene is recovered in a liquid nitrogen cold trap by passing through a fermentation exhaust. The recovered isoprene is placed in a well-dried 100 mL glass container under a nitrogen atmosphere with 35 g of hexane (Sigma-Aldrich), 10 g of silica gel (Sigma-Aldrich, catalog number 236772), and 10 g of alumina (Sigma-Aldrich). , Catalog number 267740). The resulting mixture is left at room temperature for 5 hours. The supernatant is then collected and added to a well-dried 50 mL glass container.
  • Example 9 Production of Rubber Composition A rubber composition formulated as shown in Table 25 is prepared and vulcanized at 145 ° C. for 35 minutes.
  • the isoprene synthase-expressing microorganism of the present invention is useful for the production of isoprene.

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Abstract

　本発明は、イソプレン生産能を向上させる生物学的方法を提供する。具体的には、本発明は、ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上したイソプレンシンターゼ発現微生物、および当該イソプレンシンターゼ発現微生物を培養培地中で培養してイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法を提供する。当該微生物は、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能、またはメバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有していてもよい。

Description

イソプレンモノマーの製造方法
　本発明は、ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上したイソプレンシンターゼ発現微生物、および当該イソプレンシンターゼ発現微生物を用いるイソプレンモノマーの製造方法などに関する。
　タイヤ業界及びゴム工業界において、天然ゴムは非常に重要な原材料である。新興国を中心とするモータリゼーションで今後需要が拡大していく中で、森林伐採規制やパームとの競合で農園拡大は容易でないことから天然ゴムの収量増加は見込みにくく、需給バランスはタイトになっていくことが予想される。天然ゴムに代わる材料として、合成ポリイソプレンがあるが、原料モノマー（イソプレン（２－メチル－１，３－ブタジエン））は、主にナフサのクラッキングにより得られたＣ５留分から抽出することで得られる。しかし近年、クラッカーのフィードのライト化に伴い、イソプレンの生産量は減少傾向にあり、供給が懸念されている。また、近年では石油価格の変動の影響も強く受けることから、イソプレンモノマーの安定した確保のために、非石油資源由来でイソプレンを安価に生産する系の確立が要望されている。
　このような要望に対して、単離された葛又はポプラ由来のイソプレンシンターゼ遺伝子及びこれらの変異体を発酵生産用の菌に組み込むことにより得られる形質転換体を用いて、イソプレンモノマーを生産する方法が開示されている（特許文献１～４参照）。
　イソプレンシンターゼの反応機構も既に明らかになっており、ＤＭＡＰＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質として、ピロリン酸とイソプレンを生成する（非特許文献１）。また、生成物であるピロリン酸がイソプレンシンターゼの活性に及ぼす影響として、柳由来（Ｓａｌｉｘ　ｄｉｓｃｏｌｏｒ　Ｌ．）のイソプレンシンターゼの酵素活性が、１ｍＭのピロリン酸ナトリウムにより低下する事が知られていた（非特許文献２）。発酵生産菌として幅広く利用されているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの野生株などでは、ピロリン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質により、細胞内のピロリン酸濃度が０．５ｍＭ程度に維持されている事が知られている（非特許文献３）。
　しかしながら、イソプレンを過剰に生産する微生物内のピロリン酸濃度に関する知見は無い。したがって、このような微生物においてピロリン酸がイソプレンシンターゼの活性を低下させるかについては未知であり、また、イソプレン生産能に及ぼすピロリン酸の影響についても未知であった。
特表２０１１－５０５８４１号公報 特表２０１１－５１８５６４号公報 国際公開第２０１０／０３１０７６号 国際公開第２０１４／０５２０５４号
Ｇａｒｙ　Ｍ．　Ｓｉｌｖｅｒ　ａｎｄ　Ｒａｙ　Ｆａｌｌ，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９９１）　９７：１５８８－１５９１ Ｍａｒｙ　Ｃ．　ｗｉｌｄｅｒｍｕｔｈ　ａｎｄ　Ｒａｙ　Ｆａｌｌ，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９９８）　１１６：１１１１－１１２３ Ｋｕｋｋｏ－Ｋａｌｓｋｅ　Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８９）　１７１：４４９８－４５００
　本発明は、イソプレン生産に優れる生物学的方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、イソプレンシンターゼ発現微生物においてピロリン酸ホスファターゼの発現量を向上させることにより、イソプレンモノマー生産能が向上することなどを見出し、本願発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上した、イソプレンシンターゼ発現微生物。
〔２〕前記微生物が、イソプレンシンターゼ発現ベクターで形質転換された微生物である。〔１〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔３〕ピロリン酸ホスファターゼが前記微生物に対して同種である、〔１〕または〔２〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔４〕ピロリン酸ホスファターゼの発現の向上が、前記微生物に固有のピロリン酸ホスファターゼのプロモーター領域の改変によるものである、〔３〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔５〕ピロリン酸フォスファターゼの発現の向上が、ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子の染色体でのコピー数の上昇によるものである、〔１〕～〔４〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔６〕前記微生物が、腸内細菌科に属する微生物に由来する、〔１〕～〔５〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔７〕前記微生物が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔１〕～〔６〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔８〕前記微生物がエシェリヒア属細菌である、〔７〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔９〕前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、〔８〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔１０〕前記微生物が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔１〕～〔７〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔１１〕前記微生物がパントエア属細菌である、〔１〕～〔７〕および〔１０〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔１２〕前記パントエア属細菌がパントエア・アナナティスである、〔１１〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔１３〕〔１〕～〔１２〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物を培養培地中で培養してイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法。
〔１４〕以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）〔１３〕の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
〔１５〕〔１３〕の方法により製造されるイソプレンモノマーに由来するポリマー。
〔１６〕〔１５〕のポリマーを含むゴム組成物。
〔１７〕〔１６〕のゴム組成物を使用することにより製造されるタイヤ。
　本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレン生産能に優れ、また、グルコース収率も顕著に改善される。
　本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物はまた、ピロリン酸ホスファターゼの発現の向上に伴って、その生育も改善される（例、図１３を参照）。
図１は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＰＰＡの発現解析を示す図である。レーン１，２のＣｏｎｔｒｏｌはＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ株から調製したサンプルを意味する。レーン３，４のＰｔａｃ－ｐｐａは、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株から調製したサンプルを意味する。Ｍはタンパク質分子量マーカーを意味する。 図２は、種々の植物の葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量を示す図である。 図３は、種々の植物の葉から抽出された総タンパク質量あたりのイソプレン発生量を示す図である。 図４は、染色体固定したメバロン酸経路下流とその周辺領域の概要を示す図である。 図５は、染色体におけるｔａｃプロモーターで支配されたメバロン酸経路下流とその周辺領域の概要を示す図である。 図６は、ｐＡＨ１６２－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ　プラスミドのマップを示す図である。 図７は、ｐＡＨ１６２－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）のマップを示す図である。 図８は、ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｍｖｋ（Ｍｍａ）のマップを示す図である。 図９は、ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）染色体改変体の構築を示す図である。Ａ）は、ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０　ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるａｍｐＣ遺伝子のλＲｅｄ依存性置換を示す。Ｂ）は、ｐＡＨ１６２－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）プラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込みを示す。Ｃ）は、ｐＡＨ１６２－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）のベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去を示す。 図１０は、ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ染色体改変体の構築を示す図である。Ａ）は、ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０　ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるａｍｐＨ遺伝子のλＲｅｄ依存性置換を示す。Ｂ）は、ｐＡＨ１６２－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳプラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込みを示す。Ｃ）は、ｐＡＨ１６２－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳのベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去を示す。 図１１は、ｐＥＡ３２０メガプラミドのΔｃｒｔ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体の構築を示す図である。Ａ）は、ｐＥＡ３２０メガプラスミド中に配置されたＰ．　ａｎａｎａｔｉｓ　ｃｒｔローカスの構造を示す図である。Ｂ）は、ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０　ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるｃｒｔオペロンのλＲｅｄ依存性置換を示す。Ｃ）は、ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｍｖｋ（Ｍｍａ）プラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込みを示す。Ｄ）は、ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｍｖｋ（Ｍｍａ）のベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去を示す。 図１２は、ＡＧ１０２６５株におけるピロリン酸ホスファターゼのタンパク質発現量を示す図である。２１．７ｋＤはＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）遺伝子によりコードされるピロリン酸ホスファターゼの想定分子量を示し、１９．８ｋＤはＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）遺伝子遺伝子によりコードされるピロリン酸ホスファターゼの想定分子量を示す。レーン１：ＡＧ１０２６５株由来可溶性タンパク質；レーン２～４：ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ１株由来可溶性タンパク質；レーン５～６：ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ２株由来可溶性タンパク質；Ｍ：分子量マーカー。 図１３は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌のジャー培養における生育変化を示す図である。 図１４は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌のジャー培養におけるイソプレン生産量を示す図である。バッチ（Ｂａｔｃｈ）当たりのイソプレン生産量（ｍｇ）を記す。 図１５は、ｐＡＨ１６２－ｍｖａＥＳのマップを示す図である。 図１６は、ｐＡＨ１６２－ＭＣＳ－ｍｖａＥＳ染色体固定用プラスミドを示す図である。 図１７は、ＰｐｈｏＣの転写制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを示す図である。 図１８は、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＫｍＲ－λａｔｔＲ組込み型ベクターの構築を示す図である。 図１９は、ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ組込み型発現ベクターを示す図である。 図２０は、化学合成ＫＤｙＩオペロン中のコドン最適化を示す図である。 図２１は、最適化コドンを有するＫＤｙＩオペロンを保持する、（Ａ）ｐＡＨ１６２－Ｔｃ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩ、および（Ｂ）ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩの組込み型プラスミドを示す図である。 図２２は、Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来のメバロン酸キナーゼ遺伝子を保持する組込み型プラスミドを示す図である。 図２３は、（Ａ）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、（Ｂ）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、および（Ｃ）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノム改変体のマップを示す図である。 図２４は、（Ａ）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｘ）、および（Ｂ）Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｘ）のゲノム改変物のマップを示す図である。 図２５は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩ、及び（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩの染色体改変物のマップを示す図である。 図２６は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ、および（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳの染色体改変物のマップを示す図である。 図２７は、ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａにおけるＰＰＡの発現確認を示す図である。ＣｏｎｔはＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ株由来サンプル、ＭＧ－ｐｐａはＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａ株由来サンプルを泳動したことを表す。
　本発明は、ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上した、イソプレン発現微生物を提供する。
　ピロリン酸ホスファターゼは、ピロリン酸を２分子のリン酸に加水分解する酵素である。ピロリン酸ホスファターゼとしては、例えば、宿主として後述する微生物に由来するピロリン酸ホスファターゼが挙げられる。ピロリン酸ホスファターゼとしてはまた、腸内細菌科に属する微生物、特に、後述する微生物のうち腸内細菌科に属する微生物に由来するピロリン酸ホスファターゼも好ましい。
　具体的には、ピロリン酸ホスファターゼは、配列番号１３６、配列番号１３７、または配列番号１３８のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
　ピロリン酸ホスファターゼはまた、配列番号１３６、配列番号１３７、または配列番号１３８のアミノ酸配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつピロリン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸配列同一性％は、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。ピロリン酸ホスファターゼ活性とは、ピロリン酸を２分子のリン酸に加水分解する活性をいう。
　ピロリン酸ホスファターゼはさらに、配列番号１３６、配列番号１３７、または配列番号１３８のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつピロリン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、１～２０個、１～１０個または１～５個である。
　ピロリン酸ホスファターゼ活性は、同一条件（例、緩衝液、濃度、温度、反応時間）で測定された場合、配列番号１３６、配列番号１３７、または配列番号１３８のアミノ酸配列からなるタンパク質のピロリン酸ホスファターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
　アミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ　Ｓｉｚｅ　ｔｏ　Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
　ピロリン酸ホスファターゼは、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、ピロリン酸ホスファターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
　アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
　イソプレンシンターゼ発現微生物におけるピロリン酸ホスファターゼの発現の向上は、イソプレンシンターゼ発現微生物において発現されるピロリン酸ホスファターゼの量を増加させる任意の様式で行うことができる。イソプレンシンターゼ発現微生物において発現が向上されるべきピロリン酸ホスファターゼは、イソプレンシンターゼおよび／またはイソプレンシンターゼ発現微生物に対して同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）のピロリン酸ホスファターゼである。イソプレンシンターゼ発現微生物に対して同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）のピロリン酸ホスファターゼは、イソプレンシンターゼ発現微生物に固有（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）のピロリン酸ホスファターゼであってもよく、または外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）のピロリン酸ホスファターゼであってもよい。イソプレンシンターゼ発現微生物において発現が向上されるべきピロリン酸ホスファターゼはまた、１種または複数種（例、２または３個）であってもよい。
　イソプレンシンターゼ発現微生物におけるピロリン酸ホスファターゼの発現の向上は、例えば、イソプレンシンターゼ発現微生物に固有のピロリン酸ホスファターゼ遺伝子の周辺領域を改変することにより、またはピロリン酸ホスファターゼ発現ベクターでイソプレンシンターゼ発現微生物を形質転換して、ピロリン酸ホスファターゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現単位をイソプレンシンターゼ発現微生物に導入することにより、行われてもよい。本発明で用いられる発現ベクターはまた、宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする１以上の領域をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明で用いられる発現ベクターは、所定のポリヌクレオチドを含む発現単位が一対の相同領域（例、宿主ゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位とは、発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーター（例、同種プロモーター、異種プロモーター）を含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの産生を可能にする単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。
　本発明で用いられる発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を発現させるベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、上述の発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。
　ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子について改変されるべき周辺領域としては、例えば、プロモーター領域、シャインダルガノ（ＳＤ）配列、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域（特に、開始コドンのすぐ上流の配列（５’－ＵＴＲ））が挙げられる。改変としては、例えば、上記周辺領域における１～複数個（例、１～５００、１～３００、１～２００または１～１００個）のヌクレオチドの置換、挿入または欠失が挙げられる。好ましくは、周辺領域の改変は、プロモーター領域の置換、および必要に応じてＳＤ配列の置換である。置換後に導入されるべきプロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）、ｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）等の誘導プロモーターが挙げられる。ＳＤ配列の置換後に導入されるべき配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Ｏｌｉｎｓ　Ｐ．　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９８８，７３，２２７－２３５）。
　本発明においては、ピロリン酸フォスファターゼ遺伝子の染色体でのコピー数が上昇することにより、活性が強化されていることが望ましい。染色体上に複数コピー、望ましくは２コピー以上、さらに好ましくは３コピー以上搭載されていることが好ましい。コピー数の上昇は、ピロリン酸フォスファターゼ遺伝子を搭載するプラスミドを宿主細胞に導入することにより達成できる。また、コピー数の上昇は、トランスポゾン、Ｍｕファ－ジ等を利用して、宿主のゲノム上にピロリン酸フォスファターゼ遺伝子を転移させることによっても達成できる。
　イソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンシンターゼを産生する微生物である。好ましくは、イソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンシンターゼ発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を宿主細胞に導入することにより得られる微生物である。発現単位および発現ベクターは、上述のとおりである。イソプレンシンターゼ発現微生物においては、複数コピー、望ましくは２コピー以上、さらに好ましくは３コピー以上のイソプレンシンターゼ遺伝子がその染色体上に搭載されていることが好ましい。このようなイソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンシンターゼ発現ベクターを宿主に導入することにより得ることができる。また、このようなイソプレンシンターゼ発現微生物は、トランスポゾン、Ｍｕファ－ジ等を利用して、宿主のゲノム上にイソプレンシンターゼ遺伝子を転移させることによっても得ることができる。宿主細胞は、イソプレンシンターゼに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。イソプレンシンターゼ発現ベクター中に含まれるイソプレンシンターゼ遺伝子としては、例えば、葛（Ｐｕｅｒａｒｉａ　ｍｏｎｔａｎａ　ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ａｌｂａ　ｘ　Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｅｍｕｌａ）、ムクナ（Ｍｕｃｕｎａ　ｂｒａｃｔｅａｔａ）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ　ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、フジ（Ｗｉｓｔｅｒｒｉａ）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、茶ノ木（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ　ａｌｔｅｒｎｉｆｌｏｒａ）由来イソプレンシンターゼ遺伝子等が挙げられる（例、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　６７　（４），１０２６－１０４０（２０１３）を参照）。イソプレンシンターゼ発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、イソプレンシンターゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーターまたは誘導型プロモーター（例、後述の増殖促進剤逆依存プロモーター）の制御下に配置され得る。好ましくは、イソプレンシンターゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーターの制御下に配置され得る。構成型プロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、およびＳＰ６プロモーターが挙げられる。
　一実施形態では、イソプレンシンターゼは、例えば、以下のタンパク質であってもよい：
１）葛に由来し得る全長タンパク質（配列番号８のアミノ酸配列）；
２）上記１）の全長タンパク質から葉緑体移行シグナルが除去されたタンパク質（配列番号８のアミノ酸配列において１～４５番目のアミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列）；
３）ポプラに由来し得る全長タンパク質（配列番号１１のアミノ酸配列）；
４）上記３）の全長タンパク質から葉緑体移行シグナルが除去されたタンパク質（配列番号１１のアミノ酸配列において１～３７番目のアミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列）；
５）ムクナに由来し得る全長タンパク質（配列番号７のアミノ酸配列）；および
６）上記５）の全長タンパク質から葉緑体移行シグナルが除去されたタンパク質（配列番号１４６のアミノ酸配列において１～４４番目のアミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列）。
　好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼは、葛に由来し得る。別の好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼは、ポプラに由来し得る。さらに別の好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼは、ムクナに由来し得る。
　別の実施形態では、イソプレンシンターゼは、上記１）～６）のタンパク質のアミノ酸配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸配列同一性％は、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。アミノ酸配列同一性％は、上述したとおり決定することができる。イソプレンシンターゼ活性とは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からイソプレンを生成する活性をいう。
　さらに別の実施形態では、イソプレンシンターゼは、上記１）～６）のタンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１～１００個、好ましくは１～８０個、より好ましくは１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個または１～５個である。
　イソプレンシンターゼ活性は、同一条件（例、緩衝液、濃度、温度、反応時間）で測定された場合、上記１）～６）のタンパク質のイソプレンシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。また、イソプレンシンターゼは、安定性の観点から、所定の緩衝液〔例、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０，１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液〕中で４℃にて４８時間保存した場合に、残存活性が３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上または６５％以上であることが好ましい。
　イソプレンシンターゼは、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、イソプレンシンターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、上述したような保存的置換であってもよい。
　好ましくは、イソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンシンターゼに加えて、メバロン酸キナーゼを発現する微生物であってもよい。したがって、イソプレンシンターゼ発現微生物は、メバロン酸キナーゼ発現ベクターが宿主に導入されていてもよい。メバロン酸キナーゼ発現ベクターにより宿主に導入されるべきメバロン酸キナーゼ遺伝子としては、例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｍａｚｅｉ）等のメタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ　ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）等のメタノセラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム・ヴァリアビル（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖａｒｉａｂｉｌｅ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノセタ・コンキリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ　ｃｏｎｃｉｌｉｉ）等のメタノセタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）属、およびニトロソプミラス・マリチマス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ　ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）等のニトロソプミラス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属に属する微生物の遺伝子が挙げられる。メバロン酸キナーゼ発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子は、上述したような構成型プロモーター、または誘導型プロモーター（例、後述の増殖促進剤逆依存プロモーター）の制御下に配置され得る。好ましくは、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーターの制御下に配置され得る。
　本発明で用いられるイソプレンシンターゼ発現微生物（宿主細胞）としては、細菌又は真菌が好ましい。細菌としては、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。イソプレンシンターゼ発現微生物としては、腸内細菌科に属する微生物、特に後述する微生物のうち腸内細菌科に属する微生物もまた好ましい。
　グラム陽性細菌としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
　バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
　コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。
　グラム陰性細菌としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
　エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が好ましい。
　パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ　ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ　ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開０９５２２２１号に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１４）、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１５）、およびパントエア・アナナティスＳＣ１７（０）株が挙げられる。ＳＣ１７（０）は、２００５年９月２１にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Ｒｕｓｓｉａｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＶＫＰＭ），ＧＮＩＩ　Ｇｅｎｅｔｉｋａ）（住所：Ｒｕｓｓｉａ，１１７５４５　Ｍｏｓｃｏｗ，１　Ｄｏｒｏｚｈｎｙ　ｐｒｏｅｚｄ．１）に受託番号ＶＫＰＭ　Ｂ－９２４６のもとに寄託されている。
　エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ．　２００７　Ｍａｒ　２７；９８（２）：３４０－３４８）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９５５の受領番号が付与されている。
　真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
　サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
　シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
　ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。
　トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギフラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。
　本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、さらにイソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する経路が強化されていてもよい。このような強化のため、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換能を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの発現ベクターが、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物に導入されてもよい。また、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生成に関連するメバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の発現ベクターが、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物に導入されてもよい。このような酵素の発現ベクターは、組込み型ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数の酵素（例、１種、２種、３種または４種以上）を一緒または個別に発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、大腸菌）であり、かつ、メバロン酸経路に関与する酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現ベクターは、メバロン酸経路に関与する酵素を発現するものであってもよい。
　イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（ＥＣ:５．３．３．２）としては、例えば、Ｉｄｉ１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１５２０８）、ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１８６９２７）、ＡＴ５Ｇ１６４４０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１９７１４８）、およびＩｄｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１７３６５）が挙げられる。発現ベクターにおいて、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする遺伝子は、後述の増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
　メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル－ＣｏＡ－Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　Ｐ１３７０２）、アセチル－ＣｏＡ－Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。発現ベクターにおいて、メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する１以上の酵素（例、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、アセチル－ＣｏＡ－Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ）をコードする遺伝子は、後述の増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
　メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１０７８５７０）、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１１９０６００）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６５２８６）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿１８０２６１）、２－Ｃ－メチル―Ｄ－エリスリトール－２，４－シクロニリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６４８１９）、１－ヒドロキシ－２－メチル－２－（Ｅ）－ブテニル－４－ニリン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿００１１１９４６７）、４－ヒドロキシ－３－メチル－２－ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　ＩＤ　ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。発現ベクターにおいて、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する１以上の酵素をコードする遺伝子は、後述の増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
　遺伝子が組込まれた発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
　更に、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物において、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子が導入されていてもよい。このような酵素としては、ピルビン酸塩とＤ－グリセルアルデヒド－３－ホスフェートを１－デオキシ－Ｄ－キシロース－５－ホスフェートに転換する１－デオキシ－Ｄ－キシロース－５－ホスフェートシンターゼ；イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に転換するイソペンチルジホスフェートイソメラーゼ等が挙げられる。発現ベクターにおいて、ジメチルアリル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子は、上述したような構成型プロモーター、または誘導型プロモーター（例、後述の増殖促進剤逆依存プロモーター）の制御下に配置され得る。
　イソプレンの基質であるＤＭＡＰＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、ペプチドグリカンや電子受容体（メナキノン等）の前駆体であり、微生物の増殖に必須であることが知られている（Ｆｕｊｉｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６；９９：１１３７－１１４６）。本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、効率的なイソプレンの製造の観点から、微生物の増殖期に対応する工程１）（十分な濃度の増殖促進剤の存在下でイソプレン発現微生物を培養して、イソプレン発現微生物を増殖させること）、およびイソプレンの生成期に対応する工程３）（イソプレン発現微生物を培養してイソプレンモノマーを生成すること）が分離された、イソプレンの製造方法で用いられてもよい。また、このイソプレンの製造方法は、微生物の増殖期からイソプレンの生成期に移行させるため、イソプレン生成の誘導期に対応する工程２）（増殖促進剤の十分な濃度を減少させて、イソプレン発現微生物によるイソプレンモノマーの生成を誘導すること）を含んでいてもよい。
　本発明では、増殖促進剤とは、微生物により消費され得る、微生物の増殖に必須の因子または微生物の増殖の促進作用を有する因子であって、微生物により消費され培地中の量が減少すると微生物の増殖が喪失または低減するものをいう。例えば、ある量の増殖促進剤を用いた場合、その量の増殖促進剤が消費されるまで微生物は増殖し続けるが、一旦増殖促進剤が全て消費されると、微生物は増殖し得ず、または増殖速度が低下し得る。したがって、増殖促進剤により、微生物の増殖の程度を調節することができる。このような増殖促進剤としては、例えば、酸素（ガス）等の物質；鉄、マグネシウム、カリウム、カルシウムのイオン等のミネラル；リン酸（例、モノリン酸、ニリン酸、ポリリン酸）またはその塩等のリン化合物；アンモニア、硝酸、亜硝酸、尿素等の窒素化合物（ガス）；硫酸アンモニウム、チオ硫酸等の硫黄化合物；ビタミン（例、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ナイアシン、パントテン酸、ビオチン、アスコルビン酸）、およびアミノ酸（例、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチヂン、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、セレノシステイン）等の栄養素が挙げられる。本発明の方法では、１種の増殖促進剤を用いてもよいし、２種以上の増殖促進剤を組み合わせて用いてもよい。
　増殖促進剤が用いられる場合、本発明のイソプレン発現微生物は、増殖促進剤に依存して増殖する能力、および増殖促進剤逆依存プロモーターに依存してイソプレンを生成する能力を有していてもよい。イソプレン生成微生物は、イソプレン生成微生物の増殖に十分な濃度の増殖促進剤の存在下で、増殖できる。ここで、「十分な濃度」とは、イソプレン生成微生物の増殖に有効な濃度で増殖促進剤が用いられることをいい得る。表現「増殖促進剤逆依存プロモーターに依存してイソプレンを生成する能力」とは、相対的に高い濃度の増殖促進剤の存在下では、イソプレンを生成できず、またはイソプレンの生成効率が低いが、相対的に低い濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、イソプレンを生成できること、またはイソプレンの生成効率が高いことを意味し得る。したがって、本発明で用いられるイソプレン生成微生物は、十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、良好に増殖し得るが、イソプレンを生成できず、またはイソプレンの生成効率が低い。イソプレン生成微生物はまた、不十分な濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、良好に増殖し得ないが、イソプレンを生成でき、またはイソプレンの生成効率が高い。
　このようなイソプレン生成微生物では、上述した酵素をコードする遺伝子が増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下にあり得る。表現「増殖促進剤逆依存性プロモーター」とは、相対的に高い濃度の増殖促進剤の存在下では、転写活性を有しない、または低い転写活性を有するが、相対的に低い濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、転写活性を有する、または高い転写活性を有するプロモーターを意味し得る。したがって、増殖促進剤逆依存性プロモーターは、イソプレン生成微生物の増殖に十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、上述した酵素をコードする遺伝子の発現を抑制でき、一方、イソプレン生成微生物の増殖に不十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、上述した酵素をコードする遺伝子の発現を促進できる。好ましくは、イソプレン生成微生物は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下にある上述した酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された微生物である。
　例えば、増殖促進剤が酸素である場合、微好気誘導型プロモーターを利用することができる。微好気誘導型プロモーターとは、微好気条件下で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。一般的に、飽和溶存酸素濃度は７．２２ｐｐｍである（気圧７６０ｍｍＨｇ、温度３３℃、酸素２０．９％の水蒸気が飽和した大気中）。微好気条件とは、（溶存）酸素濃度０．３５ｐｐｍ以下の条件をいい得る。微好気条件下の（溶存）酸素濃度は、０．３０ｐｐｍ以下、０．２５ｐｐｍ以下、０．２０ｐｐｍ以下、０．１５ｐｐｍ以下、０．１０ｐｐｍ以下、または０．０５ｐｐｍ以下であってもよい。微好気誘導型プロモーターとしては、例えば、Ｄ－またはＬ－乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例、ｌｌｄ、ｌｄｈＡ）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例、ａｄｈＥ）のプロモーター、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（例、ｐｆｌＢ）のプロモーター、およびα－アセトラクテイトデカルボシラーゼをコードする遺伝子（例、ｂｕｄＡ）のプロモーターが挙げられる。
　また、増殖促進剤がリン化合物である場合、リン欠乏誘導型プロモーターを利用することができる。表現「リン欠乏誘導型プロモーター」とは、低濃度のリン化合物で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。低濃度のリン化合物とは、（遊離）リン濃度１００ｍｇ／Ｌ下の条件をいい得る。用語「リン」は、用語「リン化合物」と同義であり、交換可能に使用され得る。リン欠乏条件下の（遊離）リン濃度は、５０ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、１ｍｇ／Ｌ以下、０．１ｍｇ／Ｌ以下、または０．０１ｍｇ／Ｌ以下であってもよい。リン欠乏誘導型プロモーターとしては、例えば、アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＡ）のプロモーター、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＣ）のプロモーター、センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＲ）のプロモーター、レスポンスレギュレーターをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＢ）のプロモーター、およびリン取り込み担体をコードする遺伝子（例、ｐｓｔＳ）のプロモーターが挙げられる。
　増殖促進剤がアミノ酸である場合、アミノ酸欠乏誘導型プロモーターを利用することができる。アミノ酸欠乏誘導型プロモーターとは、低アミノ酸濃度で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。低アミノ酸濃度とは、（遊離）アミノ酸またはその塩の濃度が１００ｍｇ／Ｌ以下である条件をいい得る。アミノ酸欠乏条件下の（遊離）アミノ酸またはその塩の濃度は、５０ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、１ｍｇ／Ｌ以下、０．１ｍｇ／Ｌ以下、または０．０１ｍｇ／Ｌ以下であってもよい。アミノ酸欠乏型プロモーターとしては、例えば、トリプトファンリーダーペプチドをコードする遺伝子（例、ｔｒｐＬ）のプロモーター、およびＮ－アセチルグルタメイトシンターゼをコードする遺伝子（例、ＡｒｇＡ）のプロモーターが挙げられる。
＜イソプレンモノマーおよびイソプレンポリマーの製造方法＞
　本発明は、イソプレンモノマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養培地中で培養してイソプレンモノマーを生成することを含む。
　本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物の培養により行うことができる。イソプレンモノマーの原料となるジメチルアリル二リン酸は、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物により、培地中の炭素源から効率的に供給される。本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、培地中の炭素源から、イソプレンモノマーを主にアウトガスとして生産するため、形質転換体から発生するガスを採取することにより、イソプレンモノマーが回収される。イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸は、培地中の炭素源を素に、宿主細胞内のメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路で合成される。
　本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養する培地としては、イソプレンに転換されるための炭素源を含むことが好ましい。炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ－ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
　単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
　二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
　オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
　多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β１，３－グルカン）が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
　微生物性タンパク質としては、酵母または細菌由来のポリペプチドが挙げられる。
　植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチドが挙げられる。
　脂質としては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられる。
　オイルとしては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸が１以上含み、室温で液体の脂質が好ましく、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ、又はこれらの２以上の組み合わせからなるものが挙げられる。
　脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられる。
　不飽和脂肪酸は、「Ｒ」に少なくとも１の炭素－炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。
　飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。
　中でも、脂肪酸としては、１以上のＣ２からＣ２２の脂肪酸が含まれるものが好ましく、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸が含まれるものがより好ましい。
　また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
　また、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセリン脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
　再生可能な炭素源としては、加水分解されたバイオマス炭素源が挙げられる。
　バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。
　バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。
　バイオマス等の再生可能な炭素源を細胞培地に添加する際には、前処理することが好ましい。前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせが挙げられる。
　再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい。
　また、炭素源としては、酵母エキス、または酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ１化合物との組み合わせが好ましい。
　本発明において、形質転換体の培養方法としては、細胞を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養することが好ましい。
　培養培地としては、特に限定されず、Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ　ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主細胞の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
　細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン産出を促進することが当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。
　本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物の培養条件としては、ピロリン酸ホスファターゼの発現の向上により、イソプレンシンターゼ発現微生物によるイソプレン生成能を改善できる条件であれば特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
　培養温度としては、２０℃～３７℃が好ましく、ガス組成としては、ＣＯ２濃度が約６％～約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５～約９であることが好ましい。
　また、宿主細胞の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。
　培養方法としては、形質転換体をバッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を用いて培養する方法が挙げられる。
　バッチ培養法は、発酵開始時に培地組成物に仕込み、宿主細胞を培地に植菌し、ｐＨや酸素濃度等の制御を行いながら形質転換体の培養を行う方法である。
　バッチ培養法による形質転換体の培養において、形質転換体は、穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少または停止する定常期に至る。イソプレンは、対数増殖期や定常期の形質転換体によって産出される。
　流加培養法は、上述したバッチ法に加えて、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源を添加する方法である。流加培養法は、カタボライト抑制により形質転換体の代謝が抑制される傾向があり、培地中の炭素源の量を制限することが好ましいときに有効である。流加培養法は、制限された量または過剰な量のグルコース等の炭素源を用いて行うことができる。
　連続培養法は、一定の速度でバイオリアクターに所定量の培地を連続的に供給しながら、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養法では培養物を一定の高密度に保つことができ、培養液中の形質転換体は主に対数増殖期にある。
　適宜、培地の一部または全部を入れ換えることにより、栄養素の補給を行うことができ、形質転換体の生育に悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物、及び死細胞の蓄積を防ぐことができる。
　本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物に導入される発現ベクターが有するプロモーターとしては、上述のプロモーターが挙げられる。本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物に導入される発現ベクターがｌａｃプロモーター等の誘導的プロモーターを有している場合には、培養液中に、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加して、タンパク質の発現を誘導してもよい。
　本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養することにより得られるイソプレンモノマーの生産量の評価方法としては、ヘッドスペース法により気相を採取し、この気相をガスクロマトグラフィー法で分析する方法が挙げられる。
　詳細には、密封したバイアル中で形質転換体を含む培養液を振蕩しながら培養したときのヘッドスペース中のイソプレンモノマーを、標準的なガスクロマトグラフィーを用いて分析する。次いで、検量線を用いて、ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、形質転換体のイソプレンモノマー生産量に換算する。
　本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養することにより得られるイソプレンモノマーの回収方法としては、ガスストリッピング、分留、或いは、固相に吸着させたイソプレンモノマーの熱若しくは真空による固相からの脱着、又は溶媒による抽出等が挙げられる。
　ガスストリッピングでは、アウトガスから連続的にイソプレンガスを除去する。このようなイソプレンガスの除去は種々の方法で行うことができ、固相への吸着、液相への分離、又はイソプレンガスを直接凝縮させる方法が挙げられる。
　イソプレンモノマーの回収は一段階又は多段階で行うことができる。イソプレンモノマーを一段階で回収する場合には、アウトガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換を同時に行う。イソプレンモノマーをアウトガスから直接凝縮させて液相にすることもできる。イソプレンモノマーを多段階で回収する場合には、オフガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンモノマーを固相に吸着させ、溶媒で固相から抽出する方法が挙げられる。
　更に、イソプレンモノマーの回収方法は、イソプレンモノマーを精製する工程が含まれていてもよい。精製工程としては、液相抽出物からの蒸留による分離や各種クロマトグラフィーが挙げられる。
　本発明はまた、イソプレンポリマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンポリマーの製造方法は、以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む：
（Ｉ）本発明の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
　工程（Ｉ）は、上述した本発明のイソプレンモノマーの製造方法と同様にして行うことができる。工程（ＩＩ）におけるイソプレンモノマーの重合は、当該分野で公知の任意の方法（例、有機化学的な合成法）、例えば、付加重合により行うことができる。
　本発明のゴム組成物は、本発明のイソプレンの製造方法により製造されるイソプレンに由来するポリマーを含む。イソプレンに由来するポリマーは、同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）、またはイソプレンおよびイソプレン以外の１以上のモノマー単位を含む異種ポリマー（例、ブロック共ポリマー等の共ポリマー）であり得る。好ましくは、イソプレンに由来するポリマーは、本発明のイソプレンポリマーの製造方法により製造される同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）である。本発明のゴム組成物はさらに、上記ポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、および／または他の成分を含んでいてもよい。本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを用いて製作することができる。例えば、本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを、このポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、ならびに／または他の成分（例、補強材、架橋剤、加硫促進剤、および抗酸化剤）と混合することにより調製することができる。
　本発明のタイヤは、本発明のゴム組成物を用いることにより製作される。本発明のゴム組成物は、制限されることなく、タイヤの任意の部分に利用することができ、その目的に応じて適切に選択され得る。例えば、本発明のゴム組成物は、タイヤのトレッド、ベーストレッド、サイドウォール、サイド補強ゴムおよびビードフィラーにおいて用いてもよい。タイヤを製造する方法としては、慣用の方法を用いることができる。例えば、タイヤ未加硫ゴムから構成されるカーカス層、ベルト層、トレッド層、および通常のタイヤ製造に用いられる他の部材をタイヤ成形用ドラム上に順次貼り重ね、ドラムを抜き去ってグリーンタイヤとする。次いで、このグリーンタイヤを常法に従って加熱加硫することにより、所望のタイヤ（例、空気式タイヤ）を製造することができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ株におけるｐｐａ遺伝子発現強化
　Ｅ．ｃｏｌｉ株において、内因性ｐｐａ遺伝子（ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子）に固有のプロモーターが別の強力なプロモーターに置換され、内因性ｐｐａ遺伝子の発現が増強された株を、以下の手順により作製した。
　先ず、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ株（参考例７－４）を参照。なお、本株は、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換体である。）のエレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ株を５ｍＬのＬＢ培地にて、一晩、３７℃で振盪培養を実施した。その後、培養液５０μＬを、新たな５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６付近になるまで振盪培養を実施した。その後、菌体を集菌し、氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄した後、最終的に０．５ｍＬの１０％グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとした。
　次に、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ株のコンピテントセルにｐＫＤ４６をエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーション法は、ＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ　ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、電場強度１８ｋＶ／ｃｍ、コンデンサー容量２５μＦ、抵抗値２００Ωの条件で導入した。エレクトロポレーション法によりｐＫＤ４６が導入された菌体に、ＳＯＣ培地（バクトトリプトン２０ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ　０．５ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ）１ｍＬを添加し、３０℃で２時間振盪培養を行った後、１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３０℃で一晩培養後、出現したコロニーを同寒天培地で純化する事で、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株を取得した。
　取得したＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株のエレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株を、１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地にて、一晩、３０℃で振盪培養を実施した。その後、培養液５０μＬを、１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃でＯＤ６００が０．６付近になるまで振盪培養を実施した。その後、菌体を集菌し、氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄した後、最終的に０．３ｍＬの１０％グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとした。
　次に染色体上のｐｐａ遺伝子のプロモーター領域を置換する為の遺伝子断片を調製した。ｐｐａ遺伝子の塩基配列とそのプロモーター領域については、既存のデーターベースより入手が可能である（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ＮＣ＿０００９１３．２，　ｐｐａ　ｇｅｎｅ　ｌｏｃｕｓ　ｔａｇ：　ｂ４２２５，　Ｒａｎｇｅ：　４４４７１４５．．４４４７６７５，　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）。ｐｐａ遺伝子のプロモーター領域の置換は、λ－ｒｅｄ法により実施した。ＰＣＲの鋳型として、λａｔｔＬ－Ｔｅｔ－λａｔｔＲ－Ｐｔａｃを有するゲノム断片を使用した。これは、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）とテトラサイクリン耐性薬剤マーカー（Ｔｅｔ）、及びλファージのアタッチメントサイトであるλａｔｔＬ及びλａｔｔＲが含まれる。これらのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。配列番号２と配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡポリメラーゼとして、タカラバイオ社より販売されているＬＡ－Ｔａｑポリメラーゼを利用し、９２℃、１分、（９２℃、１０秒、５４℃、２０秒、７２℃、２分）×４０サイクル、７２℃、５分の条件で反応を行った。前記ＰＣＲにより、λａｔｔＬ－Ｔｅｔ－λａｔｔＲ－Ｐｔａｃ、更にその外側にそれぞれｐｐａ遺伝子のプロモーター領域の上流６０ｂｐ、下流６０ｂｐの配列を付加した遺伝子断片を増幅した。この遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｅｐ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。以降、得られた遺伝子断片をＴｅｔ－Ｐｔａｃ－ｐｐａと命名する。
　次に、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株のコンピテントセルに、Ｔｅｔ－Ｐｔａｃ－ｐｐａをエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーション法は、ＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ　ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、電場強度１８ｋＶ／ｃｍ、コンデンサー容量２５μＦ、抵抗値２００Ωの条件で導入した。その後、コンピテンセルに、１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振盪培養を行った後、２５（ｍｇ／Ｌ）のテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３７℃で一晩培養後、出現したコロニーを同じ寒天培地を用いて純化した。その後、配列番号４と配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、ｐｐａ遺伝子のプロモーター領域がｔａｃプロモーターに置換されている事を確認した。ｐｐａ遺伝子のプロモーター領域がｔａｃプロモーターに置換された株をＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株と命名した。
実施例２：ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株におけるＰＰＡ発現解析
　ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株におけるピロリン酸ホスファターゼ（ＰＰＡ）のタンパク質発現量をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ株とＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株を５ｍＬのＬＢ培地にて、一晩、３７℃で振盪培養を実施した。集菌後の菌体は、氷冷した５０ｍＭのトリスバッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０）で３回洗浄を行い、超音波破砕装置（Ｂｉｏ－ｒｕｐｔｏｒ：３０秒ＯＮ　３０秒ＯＦＦ　２０ｍｉｎ）にて菌体を破砕した。破砕した菌体溶液は、１５０００ｒｐｍで１０分間の遠心を行い、未破砕細胞を取り除いた。得られた上清画分を可溶性タンパク質画分として取り扱った。可溶性タンパク質画分をブラッドフォード法にて定量後、５μｇの可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＮｕＰＡＧＥ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　Ｇｅｌ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて電気泳動を行った。その後、定法に従って、ＣＢＢ染色と脱色を行った。図１にＰＰＡタンパク質量付近のゲルの写真を示した。その結果、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株において、ＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量の増加を確認した（図１）。電気泳動後のＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンドの濃さから、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株におけるＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量は、元の菌株（コントロール）のものに比し、約２～５倍であると見積もられた。
実施例３：ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫ／ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ株の構築
　ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株のエレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株を５ｍＬのＬＢ培地にて、一晩、３７℃で振盪培養を実施した。その後、培養液５０μＬを、新たな５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６付近になるまで振盪培養を実施した。その後、菌体を集菌し、氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄した後、最終的に０．５ｍＬの１０％グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとした。
　ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ株のコンピテントセルに葛由来イソプレンシンターゼ発現プラスミド、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫ（参考例３－５）を参照）を前記の条件でエレクトロポレーション法により導入した。その後、コンピテンセルに、１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振盪培養を行った後、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３７℃で一晩培養後、出現したコロニーを同寒天培地で純化する事で、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫが導入されたＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫ株を取得した。
　その後、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫ株にｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐ（参考例７－３）を参照）の導入を行った。前記と同様に、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫ株のコンピテントセルを調製後、ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐを前記の条件でエレクトロポレーション法により導入した。その後、コンピテンセルに、１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振盪培養を行った後、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと１００（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３７℃で一晩培養後、出現したコロニーを同寒天培地で純化する事で、ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐが導入されたＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫ／ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐ株を取得した。以後、ｐｐａ遺伝子の発現が強化されたＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ　Ｐｔａｃ－ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫ／ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐ株をｐｐａ発現強化株と記載する。
実施例４：ｐｐａ発現強化株のジャー培養評価
　ｐｐａ発現強化株と、対照株（ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫ／ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐ株）のジャー培養評価を実施した。６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと１００（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３４℃にて１６時間培養を実施した。次に表１に記載したグルコール培地０．３Ｌを１Ｌの容積の発酵槽に投入し、充分に生育したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を行った。培養条件は、ｐＨ７．０（アンモニアガスにて制御）、３０℃、１５０ｍＬ／ｍｉｎの通気にて行い、培地中の酸素濃度が５％以上になるように撹拌制御を行った。ＯＤ６００が２０付近に到達後、Ｌ－アラビノースを終濃度２０ｍＭになるように培地に添加し、４５時間の培養を実施した。培養中は、培地中のグルコース濃度が１０（ｇ／Ｌ）以上になるよう５００（ｇ／Ｌ）に調製したグルコースを適宜、添加した。経時的に排ガスを１Ｌのガスバックに回収し、排ガスに含まれるイソプレンガスの濃度を測定した。イソプレンガスの分析条件を以下に記載した。ガスクロマトグラフィーの分析条件は、参考例４－３）に記載されるものと同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調製後、１１５℃、１０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を混合し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと１００（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを添加し、培地として使用した。
　対照株とｐｐａ発現強化株における、４５時間培養後のジャー１基あたりのイソプレン生産量（ｍｇ／Ｂ）と対グルコース消費収率％を表２に記載した。ｐｐａ発現強化株は、対照株と比較してジャー１基あたりのイソプレン生産量（ｍｇ／Ｂ）、更には対グルコース消費収率（％）が高い事が確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
参考例１：植物におけるイソプレン生産能の検討
１－１）葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量の測定
　先ず、植物におけるイソプレン生産能を検討するため、植物における葉乾燥重量１ｇあたりのイソプレン発生量を測定した。植物としては、ムクナ、ヤナギ（シダレヤナギ）、モミジバフウ、ギンコウバイ、葛を用いた。
　イソプレン発生量測定には、ガス交換式デシケーター（商品名：真空デシケーター、アズワン社製）を、インキュベーター（商品名：グロースチェンバーＭＬＲ－３５１ＨＳＡＮＹＯ社製）内に収容し、ガス交換式デシケーター内に設置した気体攪拌用ファンを作動させガス交換式デシケーターの空間内の雰囲気を攪拌させつつ、インキュベーターを高温誘導条件（照度１００μｍｏｌＥ／ｍ２／ｓで４０℃）に設定した。ガス交換式デシケーター内の雰囲気の温度が４０℃になった後、プランターに植えられたムクナ植物体を収容し、ガス交換式デシケーターを密閉した状態で３時間保持した。次いで、吸引ポンプにより、シリコンチューブ、吸着管および気体採取管を介して、ガス交換式デシケーター内の空間から、ムクナが放出したガス成分を吸引した。これにより、吸着管において、ムクナが放出したガス成分に含まれる水蒸気（水分）を吸着、分離するとともに、水蒸気が分離されたガス成分を気体採取管に導き、気体採取管において、そのガス成分を採取した。次いで、ガスクロマトグラフ（商品名：ＧＣ－ＦＩＤ６８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、気体採取管に採取されたガス成分に含まれるイソプレンを定量分析した。
　植物の葉乾燥重量は、新鮮個葉の葉面積と、８０℃の乾熱器によって新鮮個葉を８時間乾燥させたときの乾燥重には非常に良い正の相関関係が成り立つので、葉面積からの乾燥重換算式を導いておき、イソプレン発生量測定に用いたムクナ植物体の全葉面積から乾燥重を推定した。
　植物における葉乾燥重量１ｇあたりのイソプレン発生量はムクナ植物体全体からのイソプレン発生量を植物体全体の葉の乾燥重量推定値で割ることにより求めた。
　その結果、ムクナが葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量に優れることが明らかとなった（図２）。
１－２）総タンパク質量あたりのイソプレン発生量の測定
　次いで、種々の植物の葉から抽出された総タンパク質量あたりのイソプレン発生量を測定した。植物としては、ムクナ（サンプル１、２）、ヤナギ（シダレヤナギ）、モミジバフウ、ギンコウバイ、クズを用いた。
　タンパク質抽出には、バッファー液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，　２０ｍＭ　ＭｇＣｌ，　５％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　０．０２％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，　ｐＨ８．０）を作成し、使用直前にＰｏｌｙｃｌａｒ　ＡＴ　１０％、ＤＴＴ　２０ｍＭ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｔａｂｌｅｔ　（１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌ）Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ－ＨＣｌ　１ｍＭ（それぞれ終濃度）となるように加え蛋白抽出バッファーとして用いた。５ｇサンプルに対してタンパク抽出バッファー５０ｍｌ加えて、氷上で冷やしておいた乳鉢でよく摩砕した後、２重に重ねたＭｉｒａｃｌｏｔｈで摩砕液を濾過し、濾液を１２０００Ｇで２０分、４００００Ｇで４０分遠心分離した上清を取得し粗抽出液とした。
　次いで、この粗抽出液について硫安分画を行った。硫安の終濃度４０％から５５％の範囲で析出する蛋白を４００００Ｇで４０分遠心分離し、得られた沈殿を蛋白抽出バッファーに再溶解させて硫安画分を得た。
　総（硫安画分）タンパク質量は、ブラッドフォード法で硫安画分を測定することで求めた。標準蛋白Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎについて、ブラッドフォード試薬を反応させ分光光度計で測定した波長５９５ｎｍの吸光度に対する蛋白量の検量線を作成した。５０倍希釈した硫安画分液について同様に波長５９５ｎｍの吸光度を測定し、標準蛋白の検量線から総（硫安画分）蛋白量を推定した。
　イソプレン発生量は、４ｍｌガラスバイアルに粗抽出液ないしは１００℃で煮沸処理した粗酵素液を１００μｌ入れ、次いで０．５Ｍ　ＭｇＣｌ２溶液を２μｌ、０．２Ｍ　ＤＭＡＰＰ溶液を５μｌ加え、セプタム付きスクリューキャップをしっかり締めたあと、ゆるやかに振とう撹拌し４０℃恒温漕にセットした。０．５時間、１時間、２時間後に、ガスタイトシリンジでＨｅａｄｓｐａｃｅ気層を０．５～２ｍｌサンプリングしガスクロマトグラフ（商品名：ＧＣ－ＦＩＤ６８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてイソプレン発生量を測定した。粗酵素での０．５時間、１時間、２時間後の発生量は、それぞれの測定値から１００℃で煮沸処理した粗酵素液の測定値を引いて求めた。１時間あたりのイソプレン発生量からＴｏｔａｌ蛋白１ｍｇあたりの酵素活性（比活性）を求めた。なお、イソプレン発生量の測定は、イソプレンシンターゼの基質であるＤＭＡＰＰの量を一定にして行った。
　その結果、ムクナが総タンパク質量あたりのイソプレン発生量に優れることが明らかとなった（図３、表３）。以上より、ムクナがイソプレン生産能に優れることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
参考例２：ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子のクローニング
２－１）サンプリング時間の検討
　４０℃の温度下で１，２，３，５時間光照射したムクナの葉が放出するイソプレンガスをサンプリングし、後述するガスクロマトグラフィーにてイソプレン生産量を定量したところ、それぞれ４，８，１２，１０μｇ　ｉｓｏｐｒｅｎｅ／ｇ　ＤＷ　ｌｅａｆのイソプレンの生産が確認され、最適な光照射時間は、３時間であることが確認された。
２－２）Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ溶解液の抽出
　以下の手順でムクナの葉からＴｏｔａｌ　ＲＮＡ溶解液を抽出した。
（１）４０℃の温度下で３時間光照射したムクナの葉をサンプリングした。
（２）葉組織１００ｍｇを液体窒素ですばやく凍結しながら乳鉢で粉砕した後、ＲＮａｓｅフリーの２ｍｌエッペンドルフチューブに液体窒素ごと分注し、液体窒素を気化させた。
（３）このエッペンドルフチューブに、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）に備え付けの溶解バッファーＲＬＴ（２－メルカプトエタノール含有）を４５０μｌ添加し、ボルッテックスで激しく混和し、葉組織溶解物を得た。
（４）この葉組織溶解物をＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔに備え付けのＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムにかけ、１５０００ｒｐｍ、２分間、遠心分離を行った。
（５）カラム濾液の上清のみを、ＲＮａｓｅフリーの新たな２ｍｌエッペンドルフチューブに分注した後、このカラム濾液上清の１／２容量の特級エタノールを添加し、ピペッティングにより混和し、約６５０μｌの溶液を得た。
（６）この溶液をＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔに備え付けのＲＮｅａｓｙスピンカラムにかけ、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（７）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔに備え付けのＲＷ１バッファー７００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（８）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔに備え付けのＢＰＥバッファー５００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（９）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、再度、ＢＰＥバッファー５００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、２分間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（１０）このＲＮｅａｓｙスピンカラムを、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔに備え付けの２ｍｌ回収用チューブにセットし、１５０００ｒｐｍ、１分間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（１１）このＲＮｅａｓｙスピンカラムを、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔに備え付けの１．５ｍｌ回収用チューブにセットした。
（１２）ピペットマンを用いて、このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔに備え付けのＲＮａｓｅフリーの蒸留水を、ＲＮｅａｓｙスピンカラムの膜に直接添加し、１００００ｒｐｍ、１分間、遠心分離を行い、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを回収した。このステップを２回繰り返し、約１００μｌのＴｏｔａｌ　ＲＮＡを得た。
２－３）ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の塩基配列の解析
　抽出したＴｏｔａｌ　ＲＮＡ溶解液について、バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー社）のＲＮＡ用ｎａｎｏチップを用いて、ＲＮＡの品質チェックを行い、溶解液中にゲノムＤＮＡの混入がなく、溶解液中のＲＮＡが分解していないことを確認した。
　このＴｏｔａｌ　ＲＮＡを、逆転写酵素を用いて二本鎖化した後、ネブライザーを用いて断片化した。３’末端にｐｏｌｙＡ配列を有する１９８１７９個の断片の塩基配列を、４５４　Ｔｉｔａｎｉｕｍ　ＦＬＸ高速シークエンサー（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて解析した。得られた断片配列において、重複する配列を連結し、１３４８５個のコンティグ配列を得た。これらコンティグ配列に対して、ＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、登録されている既知の葛及びポプラのイソプレンシンターゼ遺伝子配列と相同性（塩基配列の同一性）を有する６個のコンティグ配列が抽出された。更に配列を詳細に解析したところ、この６個のコンティグ配列のうち３個は、同一の遺伝子由来のものであることが分かり、ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の部分配列が得られた。この部分配列に基づき、５’ＲＡＣＥを行い、配列番号６で表されるムクナ由来イソプレンシンターゼｃＤＮＡの完全長の塩基配列を得た。
参考例３：各植物種由来イソプレンシンターゼの発現プラスミドの調製
３－１）Ｐｕｅｒａｒｉａ　ｍｏｎｔａｎａ　ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼの化学合成
　Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ　ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ由来、イソプレンシンターゼｃＤＮＡの塩基配列、及びアミノ酸配列は既に知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：　ＡＡＱ８４１７０：Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ　ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）　ｉｓｏｐｒｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩｓｐＳ））。Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ由来ＩｓｐＳタンパク質のアミノ酸配列、及びｃＤＮＡの塩基配列を配列番号８、及び配列番号９にそれぞれ示す。ＩｓｐＳ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉで効率的に発現させる為にＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＫと名付けた。ＩｓｐＳＫの塩基配列を配列番号１０に示す。ＩｓｐＳＫ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７－ＩｓｐＳＫと名付けた。
３－２）Ｐｏｐｕｌｕｓ　ａｌｂａ　ｘ　Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｅｍｕｌａ（ポプラ）由来イソプレンシンターゼの化学合成
　Ｐ．ａｌｂａ　ｘ　Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ由来、イソプレンシンターゼｃＤＮＡの塩基配列、及びイソプレンシンターゼのアミノ酸配列は既に知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：　ＣＡＣ３５６９６：Ｐ．ａｌｂａ　ｘ　Ｐ．　ｔｒｅｍｕｌａ　（ポプラ）ｉｓｏｐｒｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）。Ｐ．ａｌｂａ　ｘ　Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ由来ＩｓｐＳタンパク質のアミノ酸配列、及びｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１１、及び配列番号１２にそれぞれ示す。この塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＰと名付けた。ＩｓｐＳＰの塩基配列を配列番号１３に示す。ＩｓｐＳＰ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７－ＩｓｐＳＰと名付けた。
３－３）Ｍｕｃｕｎａ　ｂｒａｃｔｅａｔａ（ムクナ）由来イソプレンシンターゼの化学合成
　Ｍｕｃｕｎａ　ｂｒａｃｔｅａｔａ由来イソプレンシンターゼｃＤＮＡの塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、葉緑体移行シグナルが付与されたものをＩｓｐＳＭ（Ｌ）と名付け、葉緑体移行シグナルを切断したものをＩｓｐＳＭと名付けた。ＩｓｐＳＭ（Ｌ）の塩基配列を配列番号１４に、ＩｓｐＳＭの塩基配列を配列番号１５に示す。ＩｓｐＳＭ遺伝子とＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子は、それぞれ化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７－ＩｓｐＳＭとｐＵＣ５７－ＩｓｐＳＭ（Ｌ）と名付けた。
３－４）発現用プラスミドｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐの構築
　Ｅ．ｃｏｌｉで各植物種由来ＩｓｐＳを発現させる為の発現用プラスミドｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐを構築した。始めに、ｔａｃプロモーター（同意語：Ｐｔａｃ）領域（ｄｅＢｏｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，（１９８３）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１－２５）及びＥ．ｃｏｌｉ由来トリプトファンオペロンのターミネーター（同意語Ｔｔｒｐ）領域（Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，（１９７８）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５４４２－５４４６）を含み、５’末端にＫｐｎＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩサイトを有するＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ）を化学合成した（Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐの塩基配列を配列番号１６に示す）。得られたＰｔａｃ－ＴｔｒｐのＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩにて消化処理し、同様にＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩで消化処理したｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）とをＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐと名付けた（塩基配列を配列番号１７に示す）。本プラスミドは、Ｐｔａｃ下流にＩｓｐＳ遺伝子をクローニングすることで、ＩｓｐＳ遺伝子の発現増幅が可能となる。
３－５）各植物種由来ＩｓｐＳ遺伝子発現用プラスミドの構築
　Ｅ．ｃｏｌｉでＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（L）遺伝子を発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７－ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号１８と配列番号１９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７－ＩｓｐＳＰを鋳型として、配列番号２０と配列番号２１の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７－ＩｓｐＳＭを鋳型として、配列番号２２と配列番号２３の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、更にはｐＵＣ５７－ＩｓｐＳＭ（L）を鋳型として、配列番号２４と配列番号２５の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐを、配列番号２６と配列番号２７の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２１０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ、ＩｓｐＳＰ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ、ＩｓｐＳＭ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ、ＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ（L）と命名した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
参考例４：Ｅ．ｃｏｌｉ由来粗酵素抽出液を用いた各植物種由来イソプレンシンターゼの酵素活性測定
４－１）イソプレン生産能を有するＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株の構築
　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ、更にｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ（Ｌ）を導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株にｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株、更にｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ（Ｌ）が導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株と命名した。
４－２）粗酵素抽出液の調製方法
　ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株、及びＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１／６プレート分の菌体を６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢ２０ｍｌを張り込んだ坂口フラスコに接種し、３７℃にて６時間培養した。培養液より菌体を５０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心分離し、氷冷したイソプレンシンターゼバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２・５％グリセロール）にて２回洗浄した。洗浄菌体を同バッファー１．８ｍｌに懸濁した。２ｍｌ容のマルチビーズショッカー専用チューブに約０．９ｍｌの破砕用ビーズ（ＹＢＧ０１，直径０．１ｍｍ）と菌体懸濁液０．９ｍｌを入れ、安井器械製マルチビーズショッカー（ＭＢ７０１（Ｓ）型）にて２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒ＯＮ・３０秒ＯＦＦを３サイクルの条件で菌体を破砕した。破砕後チューブを２００００ｇ、４℃、２０分の条件で遠心し、上清を粗酵素抽出液とした。
４－３）イソプレンシンターゼ活性の測定
　ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株の粗酵素抽出液（総タンパク量として２ｍｇを含む量）とイソプレンバッファーを合わせて０．５ｍｌをヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製　２２ｍＬ　ＣＬＥＡＲ　ＣＲＩＭＰ　ＴＯＰ　ＶＩＡＬ　ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）に入れ、０．５Ｍ　ＭｇＣｌ２溶液０．０２５ｍｌと０．２Ｍ　ＤＭＡＰＰ（ｃａｙｍａｎ製，Ｃａｔｌｏｇ　Ｎｏ．６３１８０）溶液０．０１ｍｌを加えて軽く攪拌した後、すぐにヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ　ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）にて密栓、３７℃にて２時間保温した。
　反応終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。以下にガスクロマトグラフィーの分析条件を記載する。
Ｈｅａｄｓｐａｃｅ　Ｓａｍｐｌｅｒ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製　Ｔｕｒｂｏ　Ｍａｔｒｉｘ　４０）
バイアル保温温度　４０℃
バイアル保温時間　３０ｍｉｎ
加圧時間　３．０ｍｉｎ
注入時間　０．０２ｍｉｎ
ニードル温度　７０℃
トランスファー温度　８０℃
キャリアガス圧力（高純度ヘリウム）　１２４ｋＰａ
ガスクロマトグラフィー（島津社製　ＧＣ－２０１０　Ｐｌｕｓ　ＡＦ）
カラム（Ｒｘｉ（登録商標）－１ｍｓ：　長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、液相膜厚１．５μｍ　ｃａｔ♯１３３７０）
カラム温度　３７℃
圧力　２４．８ｋＰａ
カラム流量　５ｍＬ／ｍｉｎ
流入方法　スプリット　１：０（実測１：１８）
トランスファー流量　９０ｍＬ
ＧＣ注入量　１．８ｍＬ（トランスファー流量×注入時間）
カラムへの試料注入量　０．１ｍＬ
注入口温度　２５０℃
検出機　ＦＩＤ（水素　４０ｍＬ／ｍｉｎ、空気　４００ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップガス　ヘリウム　３０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出器温度　２５０℃
イソプレン標準試料の調整
　試薬イソプレン（比重０．６８１）を冷却したメタノールで１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈し、添加用標準溶液を調整した。その後、水１ｍＬを入れたヘッドスペースバイアルに各添加用標準溶液を、それぞれ１μＬ添加し、標準試料とした。
　表５に各菌株の反応２時間後のイソプレン生成量を記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５の結果から、イソプレン生成量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株となり、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株とＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株はほぼ同等の値となった。上記の結果から、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株の粗酵素抽出液が最も高いイソプレン生成活性を示した。
参考例５：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
　参考例４の粗酵素活性の結果から、葉緑体移行シグナルを欠失したムクナ由来のイソプレンシンターゼで最も高い活性が確認された。その為、葉緑体移行シグナルを欠失した全てのイソプレンシンターゼ導入株について、グルコースからのイソプレン生産能を比較した。ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株、及びＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ　ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて２４時間培養を行った。Ｍ９グルコース培地の組成は表６に記載のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。また、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｕ－２９００）によって６００ｎｍで測定した。表７に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度とＯＤ値を記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株、そしてＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、野生株では、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。
参考例６：ＭＥＰ（メチルエリスリトール）経路を強化したＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
６－１）ｄｘｓ遺伝子発現用プラスミド（ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ）の構築
　イソプレンシンターゼを導入したＥ．ｃｏｌｉでＭＥＰ経路を構成するｄｘｓ遺伝子（１－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｘｙｌｕｌｏｓｅ－５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現強化を行うと、イソプレン生成量が向上する事が既に報告されている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１１）９０，１９１５－１９２２）。そこで、ｄｘｓ遺伝子の発現を強化した株においても、イソプレンシンターゼの由来の違いで、イソプレン生産能に相違が生じるかを確認した。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ－１２株のゲノムの全塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｕ０００９６）は既に明らかにされている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９７）２７７，１４５３－１４７４）。遺伝子増幅を行うためにｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）を用いた。本プラスミドは、マルチクローニングサイトに目的遺伝子を導入する事で、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加時に目的遺伝子の発現量を増加させる事が出来る。Ｅ．ｃｏｌｉのゲノム配列のｄｘｓ遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：９４５０６０　Ｌｏｃｕｓ　ｔａｇ　ｂ０４２０）に基づいて、配列番号２８と配列番号２９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを合成した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株のゲノムを鋳型として、配列番号２８と配列番号２９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｄｘｓ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＭＷ２１９を鋳型として、配列番号３０と配列番号３１の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２４０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＭＷ２１９を含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたｄｘｓ遺伝子断片と、ｐＭＷ２１９のＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｄｘｓ遺伝子発現用プラスミドをｐＭＷ２１９－ｄｘｓと命名した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
６－２）イソプレン生産能を有するＥ.ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株へのｐＭＷ２１９－ｄｘｓの導入
　ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＭＷ２１９－ｄｘｓを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシン塩酸塩を含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコールとカナマイシンに耐性を示す形質転換体を取得した。ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株にｐＭＷ２１９－ｄｘｓがそれぞれ導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓと命名した。
６－３）ＤＸＳの発現を強化したＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
　ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシン塩酸塩を含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、参考例５に記載したヘッドスペースバイアルでの培養評価を実施した。培養終了時のイソプレン生産量（μｇ/L）とＯＤ値を表９に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株、そしてＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９－ｄｘｓ株となった。上記の結果から、ＭＥＰ経路強化株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。
参考例７：ＭＶＡ（メバロン酸）経路を導入したＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
７－１）酵母由来のメバロン酸経路下流遺伝子のクローニング
　メバロン酸経路の下流領域はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅより取得した（ＷＯ２００９０７６６７６，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／＃　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，Ｊａｎ　２０１２；４０：Ｄ７００－Ｄ７０５）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９遺伝子、イソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをコードするＩＤＩ１遺伝子を次に示すプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅した（表１０）。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＭＡＸ　Ｐｒｅｍｉｘを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５５℃、５秒、７２℃、５秒／ｋｂ）×３０サイクルの条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐベクター（配列番号１７）にｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αに形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。これら増幅した遺伝子の塩基配列、およびその遺伝子がコードする酵素のアミノ酸配列はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／＃にて取得可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
７－２）メバロン酸経路下流の人工オペロンの構築
　メバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子を表１１に示すプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ　ｐｌｕｓを利用し、９４℃、２分、（９４℃、１５秒、４５℃、３０秒、６８℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、６８℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＵＣ１１８ベクターにｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。作成したプラスミドをｐＵＣ－ｍｖｋ－ｐｍｋと名付けた。ｐＵＣ－ｍｖｋ－ｐｍｋの塩基配列を配列番号４０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９遺伝子、イソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをコードするＩＤＩ１遺伝子を表１２に示すプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ　ｐｌｕｓを利用し、９４℃、２分、（９４℃、１５秒、４５℃、３０秒、６８℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、６８℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＴＷＶ２２８ベクターにｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αに形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。作成したプラスミドをｐＴＷＶ－ｄｍｄ－ｙｉｄｉと名付けた。ｐＴＷＶ－ｄｍｄ－ｙｉｄｉの塩基配列を配列番号４５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。ｐＵＣ－ｍｖｋ－ｐｍｋを鋳型とし表１３に示すプライマーを用いてメバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼ配列をＰＣＲ法により増幅し、ｐＴＷＶ－ｄｍｄ－ｙｉｄｉを鋳型とし表１３に示すプライマーを用いてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをＰＣＲ法により増幅した後、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＢベクターにＩｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にてクローニングを行うことで４種の酵素遺伝子を直鎖状に並べた発現プラスミドの構築を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで処理したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。構築した発現ベクターをｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ（β）と名付けた。ｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ（β）の塩基配列を配列番号５０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
７－３）メバロン酸経路下流の染色体固定
　メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列を染色体上で発現させる事とした。遺伝子の発現にはグルコースイソメラーゼプロモーターを利用し、転写終結にはＥ．ｃｏｌｉのａｓｐＡ遺伝子の転写終結領域を利用した（ＷＯ２０１００３１０６２）。染色体固定部位としてＴｎ７の転移部位を用いた（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．１９８１；１８３（２）：３８０－７）。染色体固定後の薬剤マーカーとしてはｃａｔ遺伝子を利用した。表１４に示すプライマーを利用して、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを鋳型としたＰＣＲにより染色体固定領域の内、Ｔｎ７下流領域の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。表１４に示すプライマーを利用して、ｐＭＷ１１８－ａｔｔＬ－Ｃｍ－ａｔｔＲプラスミドを鋳型としたＰＣＲによりλファージアッタチメント部位を含むｃａｔ遺伝子領域の増幅を行った（ＷＯ２０１０－０２７０２２）。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９５℃、３分、（９５℃、１分、３４℃、３０秒、７２℃、４０秒）×２サイクル、（９５℃、３０秒、５０℃、３０秒、７２℃、４０秒）×２５サイクル、７２℃、５分の条件で反応を行った。表１４に示すプライマーを利用して、ｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ（β）を鋳型としたＰＣＲによりプロモータと転写終結領域を付与したメバロン酸経路下流配列（以下ＫＫＤｙＩと略す）の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。これらのＰＣＲ産物と、制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＭＷ２１９を用い、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。得られたプラスミドをｐＭＷ２１９－ＫＫＤｙＩ－ＴａｓｐＡと名づけた。ｐＭＷ２１９－ＫＫＤｙＩ－ＴａｓｐＡの塩基配列を配列番号５５に示す。
　次に、表１４に示すプライマーを利用して、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを鋳型としたＰＣＲにより染色体固定領域の内、Ｔｎ７上流領域の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ産物と、制限酵素ＳａｌＩで処理したｐＭＷ２１９－ＫＫＤｙＩ－ＴａｓｐＡを用い、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。得られたプラスミドをｐＭＷ－Ｔｎ７－Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩ－ＴａｓｐＡ－Ｔｎ７と名づけた。構築したプラスミドの配列を配列番号５６に示す。
　続いて、λ－Ｒｅｄ法を用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子、グルコースイソメラーゼプロモーター、メバロン酸経路下流オペロン、ａｓｐＡ遺伝子転写終結領域を含む領域の染色体固定を行った。染色体固定用の断片は、プラスミドｐＭＷ－Ｔｎ７－Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩ－ＴａｓｐＡ－Ｔｎ７を抽出後、制限酵素ＰｖｕＩとＳａｌＩで処理した後、精製することで調整した。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５に温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５（以下ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６と表記する）をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０－６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ　アクセッション番号　Ｊ０２４５９，第３１０８８番目～３３２４１番目）を含む。エレクトロポレーションの後、クロラムフェニコール耐性を獲得したコロニーを取得した。続いてゲノムＤＮＡを抽出し、表１６に示すプライマーを用いたＰＣＲにより目的領域が染色体に固定されていることを確認した。更に、ＰＣＲ断片の配列を確認することで目的領域の配列を確認した。染色体固定したメバロン酸経路下流とその周辺領域の塩基配列を配列番号５７に、構築概要を図４に示す。得られた変異体をＭＧ１６５５　ｃａｔ－Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩと名づけた。
　ＭＧ１６５５　ｃａｔ－Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩの薬剤マーカーを以下の手順で除去した。ＭＧ１６５５　ｃａｔ－Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩのコンピテントセルを作成後ｐＭＷ－ｉｎｔ－ｘｉｓを導入した。ｐＭＷ－ｉｎｔ－ｘｉｓは、λファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（ＷＯ２００７／０３７４６０、特開２００５－０５８８２７）。
　ｐＭＷ－ｉｎｔ－ｘｉｓの導入により、λファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲで挟まれた領域にあるクロラムフェニコール耐性遺伝子が染色体から脱落する。その結果として、宿主はクロラムフェニコール耐性を失うことが知られている。そこで、得られたコロニーからクロラムフェニコール感受性株を取得した。この後、４２度、ＬＢ培地で６時間培養の後、ＬＢプレート培地に塗布し、コロニーを出現させた。この中からアンピシリン耐性を失ったクローンを選抜することで、薬剤耐性を除去した。このようにして取得した変異体をＭＧ１６５５　Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩと名づけた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
７－４）染色体上メバロン酸経路下流のプロモーター置換
　染色体上のメバロン酸経路下流オペロンのプロモーターをλ－ｒｅｄ法により置換した。ＰＣＲの鋳型として、ａｔｔＬ－Ｔｅｔ－ａｔｔＲ－Ｐｔａｃを有するゲノム断片を使用した。これは、ｔａｃプロモーターとテトラサイクリン耐性薬剤マーカー及びλファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲが並ぶものである。これらの配列を配列番号６８に示す。表１７に示すプロモーターを用いてＰＣＲ断片を調整した。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＬＡ－Ｔａｑポリメラーゼを利用し、９２℃、１分、（９２℃、１０秒、５０℃、２０秒、７２℃、１分／ｋｂ）×４０サイクル、７２℃、７分の条件で反応を行った。ＰＣＲ産物を精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むＭＧ１６５５　Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩ（以下ＭＧ１６５５　Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６と表記する）をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０－６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ　アクセッション番号　Ｊ０２４５９，第３１０８８番目～３３２４１番目）を含む。プラスミドｐＫＤ４６はＰＣＲ産物をＭＧ１６５５　Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩに組み込むために必要である。
　エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地中で３０℃、一晩培養したＭＧ１６５５　Ｐｇｉ－ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６を、アンピシリンとＬ－アラビノース（１ｍＭ）を含んだ５ｍＬのＬＢ培地で１００倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ６００が約０．６になるまで生育させた後、氷冷した１０％　グリセロール溶液で３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは５０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地［モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）］を加えて３７℃で１時間培養した後、ＬＢ寒天培地上、３７℃で平板培養し、クロラムフェニコール耐性組換え体を選択した。次に、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、テトラサイクリン入りのＬＢ寒天培地上、３７℃で継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、ｐＫＤ４６が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。テトラサイクリン耐性遺伝子によって識別できるｔａｃプロモーター置換を含む変異体を取得した。得られた変異体をＭＧ１６５５　ｔｅｔ－Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩと名づけた。
　薬剤マーカーを以下の手順で除去した。ＭＧ１６５５　ｔｅｔ－Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩのコンピテントセルを作成後ｐＭＷ－ｉｎｔ－ｘｉｓを導入した。ｐＭＷ－ｉｎｔ－ｘｉｓは、λファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（ＷＯ２００７／０３７４６０、特開２００５－０５８８２７）。ｐＭＷ－ｉｎｔ－ｘｉｓの導入により、λファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲで挟まれた領域にあるテトラサイクリン耐性遺伝子が染色体から脱落する。その結果として、宿主はテトラサイクリン耐性を失うことが知られている。そこで、得られたコロニーからテトラサイクリン感受性株を取得した。この後、４２℃、ＬＢ培地で６時間培養の後、ＬＢプレート培地に塗布し、コロニーを出現させた。この中からアンピシリン耐性を失ったクローンを選抜することで、薬剤耐性を除去した。得られた変異体をＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩと名づけた。染色体上にてｔａｃプロモーターで支配されたメバロン酸経路下流およびその周辺領域の塩基配列を配列番号６９に、概要を図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
７－５）ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ株への各植物種由来イソプレンシンターゼの導入
　ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ、更にｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ株にｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐが導入された株をＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫが導入された株をＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭが導入された株をＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰが導入された株をＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株と命名した。
７－６）ＭＶＡ経路を強化したＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
　ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製　２２　ｍＬ　ＣＬＥＡＲ　ＣＲＩＭＰ　ＴＯＰ　ＶＩＡＬ　ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）のＭ９グルコース（メバロン酸含有）培地１ｍＬに接種し、その後、参考例２に記載した方法に従って、培養評価を実施した。Ｍ９グルコース（メバロン酸含有）培地の組成を表１８に記載した。培養終了時のイソプレン生産量とＯＤ値を表１９に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　表１９の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＰ株、そしてＭＧ１６５５　Ｐｔａｃ－ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、ＭＶＡ経路導入株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。
実施例５：Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＡＧ１０２６５の構築
５－１）ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐの構築
５－１－１）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥ遺伝子の化学合成
　ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｇｌｕｔａｒｙｌ－ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、（１４７９．．３８９０）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３９）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９－４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号７２、及び配列番号７３にそれぞれ示す。ｍｖａＥ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＥ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＥと名付けた。この塩基配列を配列番号７４に示す。ｍｖａＥ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＥと名付けた。
５－１－２）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳ遺伝子の化学合成
　ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ－ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１４２．．１２９３）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３８）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９－４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号７５、及び配列番号７６にそれぞれ示す。ｍｖａＳ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＳ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＳと名付けた。この塩基配列を配列番号７７に示す。ｍｖａＳ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＳと名付けた。
５－１－３）アラビノース誘導型ｍｖａＥＳ発現ベクターの構築
　アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクターは次の手順で構築した。プラスミドｐＫＤ４６を鋳型として配列番号７８と配列番号７９に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ由来ａｒａＣとａｒａＢＡＤプロモーター配列からなるＰａｒａを含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＥを鋳型として配列番号８０と配列番号８１に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＳを鋳型として配列番号８２と配列番号８３に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐを鋳型として配列番号８４と配列番号８５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＴｔｒｐ配列を含むＰＣＲ断片を取得した。これら４つのＰＣＲ断片を得るためのＰＣＲにはＰｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。精製したＰａｒａを含むＰＣＲ産物とＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号７８と配列番号８１に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号８２と配列番号８５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。その結果、ＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子、ＥＦｍｖａＳとＴｔｒｐ含むＰＣＲ産物を取得した。プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）は常法に従ってＳｍａＩ消化した。ＳｍａＩ消化後ｐＭＷ２１９と精製したＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物、ＥＦｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドは、ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐと命名した。
５－２）ｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築
　先ず、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列を含む発現ベクターの構築を、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。ｐＵＣ－ｍｖｋ－ｐｍｋ（参考例７－２）を参照）（配列番号４０）を鋳型とし配列番号８６～８９の塩基配列からなるプライマーを用いてメバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼ配列をＰＣＲ法により増幅し、ｐＴＷＶ－ｄｍｄ－ｙｉｄｉ（参考例７－２）を参照）（配列番号４５）を鋳型とし配列番号８６～８９の塩基配列からなるプライマーを用いてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをＰＣＲ法により増幅した後、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＢベクターにＩｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にてクローニングを行うことで４種の酵素遺伝子を直鎖状に並べた発現プラスミドの構築を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで処理したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。構築した発現ベクターをｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ（α）と名付けた。ｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ（α）の塩基配列を配列番号９０に示す。
　次いで、得られたｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ（α）（配列番号９０）にＩｓｐＳ（Ｋ）を付加したプラスミドｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築は以下の手順で行った。
　ｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ（α）を制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社製）で消化処理し、ｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ（α）／ＰｓｔＩを得た。ｐＵＣ５７－ｉｓｐＳＫを鋳型とし、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＳＳ＿６０８３－１０－１（配列番号９１）、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＳＡ＿６０８３－１０－２（配列番号９２）をプライマーとし、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を３０サイクル行った。その結果ＩｓｐＳＫ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子断片と、ｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ（α）／ＰｓｔＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドをｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）（配列番号９３）と命名した。
５－３）ｐＳＴＶ－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ－Ｍｍａｍｖｋの構築
５－３－１）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｍａｚｅｉ由来メバロン酸キナーゼの化学合成
　Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｍａｚｅｉ　Ｇｏ１由来、メバロン酸キナーゼの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＣ＿００３９０１．１（２１０１８７３．．２１０２７７８、ＬＯＣＵＳ　ＴＡＧ　ＭＭ＿１７６２，アミノ酸配列の番号：ＮＰ＿６３３７８６．１））。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｍａｚｅｉ由来ＭＶＫタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号９４、及び配列番号９５にそれぞれ示す。ＭＶＫ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したＭＶＫ遺伝子を設計し、これをＭｍａｍｖｋと名付けた。Ｍｍａｍｖｋの塩基配列を配列番号９６に示す。Ｍｍａｍｖｋ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７－Ｍｍａｍｖｋと名付けた。
５－３－２）Ｐｕｅｒａｒｉａ　ｍｏｎｔａｎａ　ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼとＭＶＫ遺伝子発現用プラスミドの構築
　Ｅ．ｃｏｌｉでＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｍａｍｖｋ遺伝子とを発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７－ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号９７と配列番号９８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果ＩｓｐＳＫ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐを、配列番号９９と配列番号１００の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２１０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫと命名した。次に、ｐＵＣ５７－Ｍｍａｍｖｋを鋳型として、配列番号１０１と配列番号１０２の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果Ｍｍａｍｖｋ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫを、配列番号１０３と配列番号１０４の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＭｍａｍｖｋ遺伝子と、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＫのＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｍａｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＫ－Ｍｍａｍｖｋと名付けた。
５－４）ｐＭＷ－Ｐｔａｃ－Ｍｃｌｍｖｋ－Ｔｔｒｐの構築
　次に、ＭＶＫ発現プラスミド（ｐＭＷ－Ｐｔａｃ－ｍｖｋ－Ｔｔｒｐ）を構築した。
　ｐＵＣ５７－Ｍｃｌｍｖｋを鋳型として、Ｍｃｌ＿ｍｖｋ＿Ｎ（配列番号１０５）とＭｃｌ＿ｍｖｋ＿Ｃ（配列番号１０６）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＭＷ２１９－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐ（ＷＯ２０１３０６９６３４Ａ１を参照）を、ＰｔＴｔ２１９ｆ（配列番号１０７）とＰｔＴｔ２１９ｒ（配列番号１０８）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ｐＭＷ２１９－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＭｃｌｍｖｋ遺伝子と、ｐＭＷ２１９－Ｐｔａｃ－ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＭｃｌｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＭＷ－Ｐｔａｃ－Ｍｃｌｍｖｋ－Ｔｔｒｐと名付けた。
５－５）メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
　メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ　ＮＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。
　ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－ＴｔｒｐのＫｐｎＩ－ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲのＳｐｈＩ－ＳａｌＩ認識部位中にクローニングした。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳプラスミドを構築した（図６）。
　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼ遺伝子、および葛由来ｉｓｐＳ遺伝子のコーディング部分を含むｐＴｒｃ－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）プラスミドのＥｃｌ１３６ＩＩ－ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲのＳｐｈＩ－ＳａｌＩ部位中にサブクローニングし、得られたプラスミドを、ｐＡＨ１６２－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）と命名した（図７）。
　Ｐｔａｃの制御下にあるｉｓｐＳ（ムクナ）およびｍｖｋ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）遺伝子を含むｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ－ＭｍａｍｖｋのＢｇｌＩＩ－ＥｃｏＲＩフラグメントを、組込み型ベクターｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲのＢａｍＨＩ－Ｅｃｌ１３６ＩＩ認識部位中にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｍ）－ｍｖｋ（Ｍｍａ）を、図８に示す。
５－６）ｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位をゲノムの異なる部位に保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）誘導体の構築
　ａｍｐＣ遺伝子、ａｍｐＨ遺伝子またはｃｒｔオペロンを置換したｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）誘導体を構築した（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２３２．１およびＡＰ０１２０３３．１として入手可能）。これらの株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同である４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０を保有するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存性組込みを、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがって行った。エレクトロポレーション後、５０ｍｇ／ｌカナマイシン含有Ｌ－アガー上で細胞を培養した。ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０によるａｍｐＣおよびａｍｐＨ遺伝子ならびにｃｒｔオペロンの置換に用いたＤＮＡフラグメントを、それぞれ、オリゴヌクレオチド１および２、３および４、ならびに５および６（表２０）を用いた反応で増幅した。ＰＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ　ＮＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を、これらの反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０と命名した。オリゴヌクレオチド７および８、９および１０、ならびに１１および１２（表２０）を、それぞれ、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０株のＰＣＲによる検証のために用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびΔｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０、ゲノム改変体のマップを、それぞれ、図９Ａ）、図１０Ａ）および図１１Ａ）に示す。
　カナマイシン耐性マーカーからの構築株のキュアリングを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５－６０）の手法にしたがい、ｐＡＨ１２９－ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った。オリゴヌクレオチド７および８、９および１０、ならびに１１および１２（表２０）を、それぞれ、得られたＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株のＰＣＲによる検証のために用いた。
５－７）ＩＳＰ３－Ｓ株の構築
　５－５）に記載されるｐＡＨ１６２－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）のプラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５－６０）の手法にしたがい、ヘルパープラスミドｐＡＨ１２３－ｃａｔを用いて、５－６）に記載されるＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株に組み込んだ。オリゴヌクレオチド対１３－７および１４－８（表２０）を、得られた組込み体のＰＣＲによる検証のために用いた。得られたＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）株を、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがい、λファージのｉｎｔおよびｘｉｓ遺伝子を保有するｐＭＷｉｎｔｘｉｓ－ｃａｔヘルパープラスミドを用いて、ｐＡＨ１６２－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）のベクター部分からキュアした。その結果、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）株を得た。オリゴヌクレオチド７および１５（表２０）を、カナマイシン感受性誘導体のＰＣＲによる検証のために用いた。ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築を図９に示す。
　ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ細菌性ゲノムＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて上記ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０株から単離したゲノムＤＮＡを、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の染色体エレクトロポレーションの方法にしたがって、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）株にエレクトロポレーションした。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０変異の移入を、プライマー９および１０を用いたＰＣＲにより確認した。
　最後の株を、ｐｈｉ８０　Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性手法（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５－６０）を用いてカナマイシン耐性マーカーからキュアした。得られたＫｍＳ組換え体においてプライマー７および１５を用いてΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体をＰＣＲにより検証した後、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）　ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株を選択した。
　上記ｐＡＨ１６２－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳプラスミドを、ｐＡＨ１２３－ｃａｔヘルパープラスミド（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５－６０）を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０に組み込んだ。オリゴヌクレオチド１３および９、ならびにオリゴヌクレオチド１４および１０（表２０）を、得られた組込み体のＰＣＲによる検証のために用いた。この組込み体を、ファージλ　Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性技術（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）を用いて、ｐＡＨ１６２－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳのベクター部分からキュアした。染色体からのベクターの除去は、プライマー９および１６を用いたＰＣＲにより確認した。その結果、マーカーを含まないＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳを得た。ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ染色体改変体の構築物を、図１０に示す。
　５－５）に記載されるｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｋ）－ｍｖｋ（Ｍｍａ）プラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５－６０）に記載されるプロトコルを用いて、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノムに組み込んだ。プラスミド組込みを、プライマー１１－１３および１２－１４を用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。
　このようにして構築された染色体改変体ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｋ）－ｍｖｋ（Ｍｍａ）を、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）のゲノムＤＮＡによるエレクトロポレーションの方法を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ株に移した。得られた組込み体を、ファージλ　Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性技術（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）を用いて、ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｋ）－ｍｖｋ（Ｍｍａ）のベクター部分からキュアした。最終構築物Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｋ）－ｍｖｋ（Ｍｍａ）の構造（図１１）は、プライマー１１および１７を用いたＰＣＲで確認した。
　この最終株に導入された組込み型発現カセットをＰＣＲにより検証したところ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤおよびｙｌｄＩ遺伝子を含むＫＫＤｙＩオペロンの５’－部分で幾つか予想外に再構成していることが判明した。このカセットを修復するため、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがい、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ細菌性ゲノムＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）株から単離したゲノムＤＮＡをこの株にエレクトロポレーションした。得られた株は、イソプレン産生に必要な全ての遺伝子を含んでいた。
　ｐＡＨ１６２－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）（上記を参照）のベクター部分からファージλ　Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性でキュアした後、マーカーを含まないＩＳＰ３－Ｓ株（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）　ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）－ａｔｔＲｐｈｉ８０　ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－ａｔｔＲｐｈｉ８０　Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳ（Ｋ）－ｍｖｋ（Ｍｍａ）－ａｔｔＲｐｈｉ８０）を得た。
５－８）異なるメバロン酸キナーゼ遺伝子を保有する組込み型プラスミドの構築
　ｐＭＷ－Ｐｔａｃ－Ｍｃｌｍｖｋ－ＴｔｒｐのＫｐｎＩ－ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲ組込み型ベクターのＫｐｎＩ－Ｅｃｌ１３６ＩＩ認識部位中にサブクローニングした。その結果、ｔａｃプロモーターの制御下にあるＭ．ｃｏｎｃｉｌｌｉ由来ＭＶＫ遺伝子を保有するｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－Ｍｃｌｍｖｋプラスミドを構築した。
５－９）ＡＧ１０２６５株の構築
　５－８）に記載されるｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－Ｍｃｌｍｖｋプラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５－６０）のプロトコルにしたがい、ｐＡＨ１２３－ｃａｔヘルパープラスミドを用いて、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノム中に組み込んだ。
　構築されたΔｃｒｔ：：ｐＡＨ１２３－Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）染色体改変体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－Ｍｃｌｍｖｋから単離したゲノムＤＮＡのエレクトロポレーションを介して、ＩＳＰ３－Ｓ株〔５－７）を参照〕に移入した。得られた組込み体を、ＡＧ１０２６５（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）　ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ＫＫＤｙＩ－ｉｓｐＳ（Ｋ）－ａｔｔＲｐｈｉ８０　ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－ａｔｔＲｐｈｉ８０　Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲ－Ｐｔａｃ－Ｍｃｌｍｖｋ－ａｔｔＲｐｈｉ８０）と命名した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
実施例６：ｐｐａ遺伝子の発現が向上したＰａｎｔｏｅａ株の作製およびそれを用いた培養によるイソプレンの生産
　Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ株において、内因性ｐｐａ遺伝子（ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子）に固有のプロモーターが別の強力なプロモーターに置換され、内因性ｐｐａ遺伝子の発現が増強された株を、以下の手順により作製した。
６－１）ＡＧ１０２６５株におけるｐｐａ遺伝子発現強化
６－１－１）野生型ＳＣ１７（０）株ｐｐａ遺伝子プロモーター置換株の作製
　Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　にはＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）とＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）の２種類のピロリン酸ホスファターゼをコードする遺伝子が存在する。ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）遺伝子とＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）遺伝子の発現を強化すべく、Ｐ．　ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）株でＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）遺伝子とＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）遺伝子のプロモーター配列とＳＤ配列をそれぞれＰｔａｃとφ１０に置換した株をλＲｅｄ法で作製した。λＲｅｄ法はＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　２００９；　１０：３４に記載の方法に従った。アノテーションが付与されたＰ．　ａｎａｎａｔｉｓ　ＡＪ１３３５５のゲノム配列情報はＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＰ０１２０３２．１とＡＰ０１２０３３．１で利用可能である。
　Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）　株Ｐｔａｃ－ｌａｃＺ（ＲＵ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　２００６１３４５７４，ＷＯ２００８／０９０７７０，ＵＳ２０１００６２４９６）よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲの鋳型として利用した。Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）　株Ｐｔａｃ－ｌａｃＺにおいて、λａｔｔＬ－Ｋｍｒ－λａｔｔＲの下流にＰｔａｃプロモーターが連結された、λａｔｔＬ－Ｋｍｒ－λａｔｔＲ－ＰｔａｃがｌａｃＺ遺伝子の上流に組み込まれている（ＷＯ２０１１／８７１３９　Ａ１を参照）。
　ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）遺伝子のプロモーター領域を置換するために、表２１のＰＡＪ＿２３４４－Ｆ及び　ＰＡＪ＿２３４４－Ｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとし、ＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）遺伝子のプロモーター領域を置換するために、表２１のＰＡＪ＿２７３６－Ｆ及び　ＰＡＪ＿２７３６－Ｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＭＡＸ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて２０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、λａｔｔＬ－Ｋｍｒ－λａｔｔＲ－φ１０を含むプロモーター置換用断片を取得した。
　ＳＣ１７（０）にＲＳＦ－Ｒｅｄ－ＴＥＲ（ＵＳ７９１９２８４Ｂ２）プラスミドを常法に従いエレクトロポレーションにより導入し、得られた株をＳＣ１７（０）／ＲＳＦ－Ｒｅｄ－ＴＥＲと命名した。ＳＣ１７（０）／ＲＳＦ－Ｒｅｄ－ＴＥＲのコンピテントセルを調整後、精製したλａｔｔＬ－Ｋｍｒ－λａｔｔＲ－φ１０を含むプロモーター置換用断片をエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーションの後、カナマイシン耐性を獲得したコロニーを取得した。
　次に、ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）遺伝子上流領域、あるいはＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）遺伝子上流領域にＰＣＲ断片由来の配列が挿入されたことを、ｐｐａ＿ｐ１－Ｆ（表２１）とｐｐａ＿ｐ１－Ｒ（表２１）あるいはｐｐａ＿ｐ２－Ｆ（表２１）とｐｐａ＿ｐ２－Ｒ（表２１）に示される合成ＤＮＡプライマー２本を用いたＰＣＲにより確認し、断片の挿入が確認できた菌株を取得した。このようにして得られた菌株をＰ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ１及びＰ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ２と命名した。
６－１－２）ＡＧ１０２６５株でのｐｐａ遺伝子プロモーター置換株作成
　ＳＣ１７（０）Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ１からＰｕｒＥｌｕｔｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｋｉｔ（ＥｄｇｅＢｉｏ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。これを鋳型にＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）遺伝子の上流１ｋｂから下流１ｋｂを表２１のｐｐａ－１－ｇ１０００－Ｆとｐｐａ－１－ｇ１０００－Ｒ　ｐｒｉｍｅｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲで増幅した。また、ＳＣ１７（０）Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）遺伝子の上流１ｋｂから下流１ｋｂを表２１のｐｐａ－２－ｇ１０００－Ｆとｐｐａ－２－ｇ１０００－Ｒ　ｐｒｉｍｅｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲで増幅した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、６０℃にて１５秒、６８℃にて５分の反応を４０サイクル行った。その結果、ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）遺伝子あるいはＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）遺伝子の上流１ｋｂから下流１ｋｂを含む断片を取得した。得られた断片を精製し、当該ＰＣＲ産物６００ｎｇをエレクトロポレーションによりＡＧ１０２６５に導入して形質転換を行い、カナマイシン耐性を獲得したコロニーを取得した。
　得られた形質転換体について、ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）遺伝子のプロモーターが置換されていることを、表２１のＰｐａ＿ｐ１－ＦとＰｐａ＿ｐ１－Ｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとしたコロニーＰＣＲにより確認した。同様に、ＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）遺伝子のプロモーターが置換されていることを、表２１のＰｐａ＿ｐ２－ＦとＰｐａ＿ｐ２－Ｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとしたコロニーＰＣＲにより確認した。これらの株はＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ－１）遺伝子、あるいはＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ－２）遺伝子のプロモーター領域がＰｔａｃ－φ１０に置換されている。そのうちのそれぞれ１クローンを選び、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ１、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ２と名付けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
６－１－３）ピロリン酸ホスファターゼ発現量の確認
　ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ１株、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ２株におけるピロリン酸ホスファターゼ（ＰＰＡ）のタンパク質発現量をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。ＡＧ１０２６５株、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ１株、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ２株を３ｍＬの５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加したＬＢ培地にて、一晩、３０℃で振盪培養を実施した。集菌後の菌体は、氷冷した５０ｍＭのトリスバッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０）で２回洗浄を行い、マルチビーズショッカー（Ｙａｓｕｉ　Ｋｉｋａｉ，　Ｊａｐａｎ、４℃、６０秒ＯＮ　６０秒ＯＦＦ、２５００ｒｐｍ、５ｃｙｃｌｅｓ）にて菌体を破砕した。破砕した菌体溶液は、１４０００ｒｐｍで２０分間の遠心を行い、未破砕細胞を取り除いた。得られた上清画分を可溶性タンパク質画分として取り扱った。可溶性タンパク質画分をＢＣＡ法にて定量後、５μｇの可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＮｕＰＡＧＥ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　Ｇｅｌ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて電気泳動を行った。その後、定法に従って、ＣＢＢ染色と脱色を行った。図１２にＰＰＡタンパク質量付近のゲルの写真を示した。その結果、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ１株、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ２株において、それぞれＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量の増加を確認した。電気泳動後のＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンドの濃さから、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ１株、およびＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ２株におけるＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量は、元の菌株（ＡＧ１０２６５）のものに比し、約１．５～２．０倍であると見積もられた。
６－１－４）イソプレンシンターゼ発現プラスミドの導入
　常法に従いＡＧ１０２６５株、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ１株、ＡＧ１０２６５　Ｐｔａｃ－φ１０－ｐｐａ２株のエレクトロセルを作成し、エレクトロポレーションによりｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ＩｓｐＳＭ〔参考例３－５を参照〕を導入した。得られたイソプレン生産菌株をそれぞれ、ＡＧ１０２６５（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＡＧ１０２６５　ＰＰＡ１、ＡＧ１０２６５　ＰＰＡ２と命名した。
６－２）Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌のジャー培養条件
　Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌の培養には１Ｌ容積の発酵槽を使用した。グルコース培地は表２２に示す組成になるように調整した。クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートにイソプレン生産菌株を塗布し、３４℃にて１６時間培養を実施した。０．３Ｌのグルコース培地を１Ｌ容積の発酵槽に投入後、充分に生育したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、ｐＨ７．０（アンモニアガスにて制御）、３０℃、１５０ｍＬ／ｍｉｎの通気にて行い、培地中の酸素濃度が５％以上になるように撹拌制御を行った。培養中は、培地中のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌ以上になるよう５００ｇ／Ｌに調整したグルコースを連続的に添加した。最終的に、７１時間の培養でＡＧ１０２６５（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は９２．２ｇ、ＡＧ１０２６５　ＰＰＡ１は９５．８ｇ、ＡＧ１０２６５　ＰＰＡ２は８５．７ｇのグルコースを消費した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調整後、１１５℃、１０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用した。
６－３）イソプレン生産期への誘導方法
　Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌は、メバロン酸経路上流遺伝子をアラビノース誘導型プロモーターにて発現させるため、Ｌ－アラビノース（和光純薬工業）存在下でイソプレン生産量が顕著に向上する。イソプレン生産期への誘導方法として、発酵槽におけるブロスを経時的に分析し、６００ｎｍの吸光度が１６になった時点で終濃度２０ｍＭとなるようにＬ－アラビノースを添加した。
６－４）発酵ガス中のイソプレンガス濃度測定方法
　培養開始直後から、経時的に排ガスを１Ｌのガスバックに回収し、排ガスに含まれるイソプレンガスの濃度を、参考例４－３）に記載される条件に基づきガスクロマトグラフィーにより測定した。
６－５）ジャー培養におけるイソプレン生成量
　ＡＧ１０２６５（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＡＧ１０２６５　ＰＰＡ１、ＡＧ１０２６５　ＰＰＡ２を上記のジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量を測定した。図１３に菌体生育のプロファイルを、図１４に培養開始後７１時間までのイソプレン生産量を測定した結果を示す。全イソプレン生産量の高い順に、ＡＧ１０２６５　ＰＰＡ２、ＡＧ１０２６５　ＰＰＡ１、ＡＧ１０２６５　Ｃｏｎｔｒｏｌであった（図３）。それぞれの全イソプレン生成量はＡＧ１０２６５　ＰＰＡ２が２４７８ｍｇ、ＡＧ１０２６５　ＰＰＡ１が２３６５ｍｇ、ＡＧ１０２６５（Ｃｏｎｔｒｏｌ）が２０１３ｍｇであった。このことから、ピロリン酸ホスファターゼの発現量が増加したＰ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌は、ピロリン酸ホスファターゼの発現量を強化していないＰ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌よりも優れたイソプレン生産能を示した。
参考例８．ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）株の作製
＜１．ＭＶＡ経路上流染色体固定用プラスミドの作成＞
　ＭＶＡ経路上流染色体固定用プラスミドｐＡＨ１６２－ＰｐｈｏＣ－ｍｖａＥＳを、以下のとおり構築した。
（１－１）アラビノース誘導型のエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｅ．　ｆａｅｃａｌｉｓ）由来メバロン酸経路上流遺伝子（ｍｖａＥＳ（Ｅ．　ｆａｅｃａｌｉｓ））発現用プラスミドｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐの構築
（１－１－１）ｍｖａＥＳ（Ｅ．　ｆａｅｃａｌｉｓ）遺伝子の化学的合成及びクローニング
　エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｅ．　ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のメバロン酸経路上流遺伝子（ｍｖａＥＳ（Ｅ．　ｆａｅｃａｌｉｓ））をコードするｍｖａＥＳ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＩＤ　ＡＦ２９００９２．１）、及びアミノ酸配列（ｍｖａＳ，　ＧｅｎＰｅｐｔ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＩＤ　ＡＡＧ０２４３８．１，　ｍｖａＥ，　ＧｅｎＰｅｐｔ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＩＤ　ＡＡＧ０２４３９．１）は公知である（Ｗｉｌｄｉｎｇ，ＥＩ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１８２　（１５），　４３１９－４３２７　（２０００）参照）。これらの情報に基づいて、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）のコドン使用頻度に最適化されたｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を設計し、これらを、それぞれＥＦｍｖａＥ及びＥＦｍｖａＳと名付けた。ＥＦｍｖａＥの塩基配列を配列番号１３９に、ＥＦｍｖａＳの塩基配列を配列番号１４０に示す。化学合成により準備されたＥＦｍｖａＥ及びＥＦｍｖａＳのＤＮＡ配列を、常法により発現用プラスミドｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドを、それぞれ、ｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＥ、ｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＳと名付けた。ｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＥの塩基配列を配列番号１４１に、ｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＳの塩基配列を配列番号１４２に示す。
（１－１－２）Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法に用いるプラスミドｐＭＷ－Ｐｔｒｃ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐの構築
　Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法に用いるためのプラスミドｐＭＷ－Ｐｔｒｃ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐを、下記の手順に従って構築した。
　プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製、品番：３１０－０２５７１）を、ＳｍａＩで消化処理し、この消化処理したプラスミドを精製した。得られたプラスミドをｐＭＷ２１９／ＳｍａＩと名付けた。
　ｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域の遺伝子を得るために、鋳型としてＰｔｒｃ領域を有するプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂを、プライマーとして配列番号１４３及び配列番号１４４の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
　ｍｖａＥ遺伝子部分を得るために、鋳型としてプラスミドｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＥを、プライマーとして配列番号１４５及び配列番号１４６の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
　ｍｖａＳ遺伝子部分を得るために、鋳型としてプラスミドｐＵＣ５７－ＥＦｍｖａＳを、プライマーとして配列番号１４６及び配列番号１４７の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
　ｔｒｐターミネーター（Ｔｔｒｐ）領域の遺伝子を得るために、鋳型としてＴｔｒｐ領域を有するプラスミドｐＳＴＶ－Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐを、プライマーとして配列番号１４８と配列番号１４９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。
　上記４つのＰＣＲ反応においては、酵素としてＰｒｉｍｅ　Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、反応溶液は、酵素の製造業者により提供される説明書に従って調製し、反応条件は、９８℃：１０秒、５５℃：５秒、７２℃：６０秒／ｋｂ、サイクル数：３０とした。その結果、Ｐｔｒｃ領域の遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、Ｔｔｒｐ領域の遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。
（１－１－３）Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法に用いるプラスミドｐＭＷ－Ｐｔｒｃ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐの構築
　続いて、鋳型として精製したＰｔｒｃを含むＰＣＲ産物とｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物とを、プライマーとして配列番号１４３及び配列番号１４６からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。また、鋳型として精製したｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を、プライマーとして配列番号１４７及び配列番号１５０からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
　その結果、Ｐｔｒｃ領域の遺伝子とｍｖａＥ遺伝子とを含むＰＣＲ産物、及びｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐ領域の遺伝子とを含むＰＣＲ産物を取得した。
　その後、Ｐｔｒｃ領域の遺伝子とｍｖａＥ遺伝子とを含むＰＣＲ産物、及びｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐ領域の遺伝子とを含むＰＣＲ産物と、前述の消化処理したプラスミドｐＭＷ２１９／ＳｍａＩ　とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドを、ｐＭＷ－Ｐｔｒｃ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐと名付けた。得られたｐＭＷ－Ｐｔｒｃ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐの配列を配列番号１５１に示す。
（１－１－４）プラスミドｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐの構築
　アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現用プラスミドｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐを、下記の手順に従って構築した。
　鋳型として（１－２－３）で調製したプラスミドｐＭＷ－Ｐｔｒｃ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐを、プライマーとして配列番号１５２及び配列番号１５３の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
　鋳型としてＰａｒａＣ領域の遺伝子、ａｒａＣ遺伝子、及びＰａｒａＢＡＤ領域の遺伝子を含む領域の遺伝子（以下、合わせて「Ｐａｒａ領域の遺伝子」ともいう）を含むプラスミドｐＫＤ４６（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　２０００，　ｖｏｌ．９７，　Ｎｏ．１２，　ｐ６６４０－６６４５参照）を、プライマーとして配列番号１５４及び配列番号１５５の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
　その結果、ｐＭＷプラスミドとｍｖａＥＳ遺伝子とを含むＰＣＲ産物と、Ｐａｒａ領域の遺伝子を含むＰＣＲ産物とを取得した。精製したこれらのＰＣＲ産物同士を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたアラビノース誘導型のＥ．　ｆａｅｃａｌｉｓ由来メバロン酸経路上流遺伝子（ｍｖａＥＳ（Ｅ．　ｆａｅｃａｌｉｓ））発現用プラスミドをｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐと名付けた。ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－Ｔｔｒｐの塩基配列を配列番号１５６に示す。
１－２）メバロン酸経路上流を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
　メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ　ＮＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。
　オペロンのプロモーター欠損バリアントを得るために、ｐＭＷ－Ｐａｒａ－ｍｖａＥＳ－ＴｔｒｐのＥｃｌ１３６ＩＩ－ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲベクター中にサブクローニングした。得られたプラスミドのマップを、図１５に示す。
　異なるプロモーターの制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを構築した。この目的のために、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ認識部位を含むポリリンカーを、ｍｖａＥＳ遺伝子の上流に位置する唯一のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位中に挿入した。この目的を達成するために、配列番号１５７及び配列番号１５８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドキナーゼを用いてアニーリングを行い、得られたフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩにて切断したｐＡＨ１６２－ｍｖａＥＳプラスミドにライゲーション反応により挿入した。得られたｐＡＨ１６２－ＭＣＳ－ｍｖａＥＳプラスミド（図１６）は、ｍｖａＥＳ遺伝子の前で所望の配向性を保ちながらプロモーターをクローニングに都合が良いものである。ｐｈｏＣ遺伝子の調節領域を保持するＤＮＡフラグメントを、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）株（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　２００９；１０：３４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ならびに配列番号１５９及び配列番号１６０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲにより生成し、ｐＡＨ１６２－ＭＣＳ－ｍｖａＥＳの適切な制限酵素認識部位中にクローニングした。得られたプラスミドを、図１７に示す。クローニングされたプロモーターフラグメントの配列決定を行い、予想されるヌクレオチド配列に正確に対応することを確認した。得られたプラスミドをｐＡＨ１６２－ＰｐｈｏＣ－ｍｖａＥＳと命名した。
＜２．ＭＶＡ経路下流染色体固定用プラスミドの作成＞
　ＭＶＡ経路下流染色体固定用プラスミドとして、ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩ組込み型プラスミドを、以下のとおり構築した。
　ｔｅｔＡＲ遺伝子を含むｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲ（Ｍｉｎａｅｖａ　ＮＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２００８；８：６３）のＡａｔＩＩ－ＡｐａＩフラグメントを、プライマーとして配列番号１６１（プライマー１１）および配列番号１６２（プライマー１２）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ならびにｐＵＣ４Ｋプラスミド（Ｔａｙｌｏｒ　ＬＡおよびＲｏｓｅ　ＲＥ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１６，３５８，１９８８）を鋳型として用いたＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントと置換した。その結果、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＫｍＲ－λａｔｔＲが得られた（図１８）。
　Ｐｔａｃプロモーターを、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＴｃＲ－λａｔｔＲ組込み型ベクター（Ｍｉｎａｅｖａ　ＮＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２００８；８：６３）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＳｐｈＩ認識部位に挿入した。その結果、組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃが構築された。クローニングされたプロモーターフラグメントを配列決定した。ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃのマップを、図１９に示す。
　ＡＴＧ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｇｅｎｅ（ロシア）により化学合成された、置換レアコドンを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＰＭＫ、ＭＶＤおよびｙｌｄＩ遺伝子を保持するＤＮＡフラグメント（図２０）を、組込み型ベクターｐＡＨ１６２－ＰｔａｃのＳｐｈＩ－ＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位中にサブクローニングした。化学合成されたＫＤｙＩオペロンを含むＤＮＡ配列を配列番号１８４に示す。Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩ発現カセットを保持する得られたプラスミドｐＡＨ１６２－Ｔｃ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩを、図２１Ａに示す。その後、ｔｅｔＡＲ遺伝子を保持するｐＡＨ１６２－Ｔｃ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩのＮｏｔＩ－ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－ＫｍＲ－λａｔｔＲの対応フラグメントにより置換した。その結果、カナマイシン耐性遺伝子ｋａｎをマーカーとするｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩプラスミドを得た（図２１Ｂ）。
＜３．ＭＶＡ遺伝子組込み型プラスミドの作成＞
　古典的ＳＤ配列に連結された、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ　ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株であるＳＡＮＡＥ［完全ゲノム配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１１５３２を参照］由来の推定ｍｖｋ遺伝子のコーディング部分を含む化学合成ＤＮＡフラグメントを、上記組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２－ＰｔａｃのＰｓｔＩ－ＫｐｎＩ認識部位中にクローニングした。
　ｍｖｋ遺伝子を保持する組込み型プラスミドのマップを、図２２に示す。
＜４．レシピエント株ＳＣ１７（０）　ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０　ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０　Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）の構築＞
　ａｔｔＬｐｈｉ８０およびａｔｔＲｐｈｉ８０に隣接した遺伝子ｋａｎ、ならびに標的染色体部位に相同な４０ｂｐ配列を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存組込み（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）、続いて、カナマイシン耐性マーカーのファージｐｈｉ８０　Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存切除（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５－６０）を含む２段階の手法を用いて、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０染色体改変を、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）株に段階的に導入した。ＳＣ１７（０）は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＡＪ１３３５５のλＲｅｄ耐性誘導体である（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　２００９；１０：３４）；Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２０３２．１およびＡＰ０１２０３３．１として利用可能である。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド［Ｍｉｎａｅｖａ　ＮＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２００８；８：６３］を鋳型として用いて、配列番号１６３（プライマー１３）と配列番号１６４（プライマー１４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、及び、配列番号１６５（プライマー１５）と配列番号１６６（プライマー１６）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、それぞれａｍｐＨおよびａｍｐＣ遺伝子中への組込みに使用されるＤＮＡフラグメントを生成した。配列番号１６７（プライマー１７）と配列番号１６８（プライマー１８）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、及び、配列番号１６９（プライマー１９）と配列番号１７０（プライマー２０）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、得られた染色体改変物のＰＣＲ検証に用いた。
　並行して、（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＡＪ１３３５５ゲノムの一部である、ｐＥＡ３２０　３２０ｋｂメガプラスミド上に位置する）ｃｒｔオペロンの代わりにｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保持するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）の誘導体を構築した。この株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同な４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０を保持するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存組込みを、以前に記載された手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　２００９；１０：３４）にしたがって行った。ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０によるｃｒｔオペロンの置換に用いられるＤＮＡフラグメントを、配列番号１７１（プライマー２１）と配列番号１７２（プライマー２２）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応で増幅した。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ　ＮＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２００８；８：６３）を、この反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０と名付けた。配列番号１７３（プライマー２３）と配列番号１７４（プライマー２４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０．の染色体構造のＰＣＲ検証に用いた。構築株からのカナマイシン耐性マーカーの除去を、既報の手法に従いｐＡＨ１２９－ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．　２０１１；３１８（１）：５５－６０）。配列番号１７３（プライマー２３）と配列番号１７４（プライマー２４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを、得られたＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株のＰＣＲ検証に用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ゲノム改変物のマップをそれぞれ、図２３Ａ）、７Ｂ）、および７Ｃ）に示す。
　上記ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）プラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．　２０１１；３１８（１）：５５－６０）にしたがってＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノムに組み込んだ。プラスミドの組込みを、配列番号１７１（プライマー２１）と配列番号１７３（プライマー２３）、配列番号１７２（プライマー２２）と配列番号１７４（プライマー２４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。その結果、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株を得た。Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）改変物のマップを、図２４Ａ）に示す。
　その後、ゲノムＤＮＡエレクトロポレーション手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　２００９；１０：３４）を介したＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）からＳＣ１７（０）　ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０　ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０への移入を行った。得られた株を、既報のｐＭＷ－ｉｎｔｘｉｓ－ｃａｔヘルパープラスミド［Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．　２００９；１０：３４］を用いてｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）組込み型プラスミドのベクター部分からキュアリングした。その結果、マーカー欠損株ＳＣ１７（０）　ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０　ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０　Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）を得た。Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）ゲノム改変物のマップを、図２４Ｂ）に示す。
＜５．ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ株の構築＞
　ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩプラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．　２０１１；３１８（１）：５５－６０）にしたがい、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０　ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０　Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）／ｐＡＨ１２３－ｃａｔ株の染色体に組み込んだ。電気泳動後、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢアガー上に細胞を撒いた。増殖したＫｍＲクローンを、配列番号１６３（プライマー１３）と配列番号１６７（プライマー１７）、及び、配列番号１６３（プライマー１３）と配列番号１６９（プライマー１９）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたポリメラーゼ連鎖反応で試験した。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０またはｐＣ：：ａｔｔＢφ８０ｍに組み込まれたｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩプラスミドを保持する株を選択した。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩ染色体改変物のマップを、図２５（ＡおよびＢ）に示す。
　ｐＡＨ１６２－ＰｐｈｏＣ－ｍｖａＥＳを、既報のプロトコル［Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．　２０１１；３１８（１）：５５－６０］にしたがってｐＡＨ１２３－ｃａｔヘルパープラスミドを用いてＳＣ１７（０）　ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩ　ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０　Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）およびＳＣ１７（０）　ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０　ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－Ｐｔａｃ－ＫＤｙＩ　Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ－ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）レシピエント株の染色体中に挿入した。その結果、ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１およびＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－２とそれぞれ名付けられた２セットの株を得た。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２－ＰｐｈｏＣ－ｍｖａＥＳおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２－ＰｐｈｏＣ－ｍｖａＥＳ染色体改変物のマップを図２６に示す。
　ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１からのテトラサイクリン及びカナマイシン耐性マーカーの除去を、既報の手法に従いファージｐｈｉ８０　Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存的な除去により行った（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．　ＢＭＣ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２００９；１０：３４）。得られた株をＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）株と命名した。
実施例７．ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）株におけるＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５（ｂ４２２６）のｐｐａ遺伝子を高発現させたＰａｎｔｏｅａ株の作製およびそれを用いた培養によるイソプレン生産
　Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ株において、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５（ｂ４２２６）のｐｐａ遺伝子（ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子）を強力なプロモーターで発現が増強された株を以下の手順により作製した。
７－１）ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａの構築
　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５株より単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１７５と配列番号１７６の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてｐｐａ遺伝子（ｂ４２２６）をＰＣＲにより単離し、ｐＳＴＶ２８Ｐｔａｃ－Ｔｔｒｐベクター（参考例３）を制限酵素ＳｍａＩで切断した部位に、ＰＣＲで単離したｐｐａ遺伝子をｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法で導入し、プラスミドｐＳＴＶ２８Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａ－Ｔｔｒｐを構築した。次に、このプラスミドを鋳型に配列番号１７７と配列番号１７８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＴａｃプロモーター、ｐｐａ遺伝子、Ｔｒｐターミネーターを含む領域をＰＣＲにより単離し、ｐＡＨ１６２－Ｋｍ－ａｔｔＬＲベクターを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した部位にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてで導入し、プラスミドｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａを構築した。
７－２）Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５　ｐｐａ遺伝子発現強化イソプレン生産菌株及びコントロール株の構築
　先ず、ｙｄｃＩ遺伝子（ＰＡＪ＿１３２０、Ｈａｒａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ　ＡＪ１３３５５，　ａｎ　ｏｒｇａｎｉｓｍ　ｗｉｔｈ　ｇｒｅａｔ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２０１２　Ｊａｎ；９３（１）：３３１－４１）を置換したｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）誘導体を構築した。この株を得るために、配列番号１７９と配列番号１８０の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）のゲノムを鋳型として用いて、ゲノム中のｙｄｃＩ標的部位に相同である４０ｂｐ領域に隣接した部位に、ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０を保有するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを取得した。続いて、ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存性組込みを、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがって行った。エレクトロポレーション後、５０ｍｇ／ｌカナマイシン含有Ｌ－アガー上で細胞を培養した。ａｔｔＬｐｈｉ８０－ｋａｎ－ａｔｔＲｐｈｉ８０によるｙｄｃＩ遺伝子の置換株は配列番号１８１と配列番号１８２の塩基配列からなるプライマーで確認した。次に、ｐＡＨ１６２－Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａのプラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５－６０）の手法に従い、ヘルパープラスミドｐＡＨ１２３－ｃａｔを用いて組み込んだ株ＳＣ１７（０）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａを作製した。この株より単離したゲノムＤＮＡを既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の染色体エレクトロポレーションの方法に従って、ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）株にエレクトロポレーションした。配列番号１８２と配列番号１８３の塩基配列からなるプライマーを用いてΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａ改変体がＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）株の染色体に組み込まれた事をＰＣＲにより検証した。このようにして、Ｅ．ｃｏｉ　ＭＧ１６５５　由来のｐｐａ遺伝子を導入したイソプレン生産株であるＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａ株を取得した。
　次に、ｙｄｃＩ遺伝子を置換したｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ　ＳＣ１７（０）誘導株よりゲノムＤＮＡを単離し、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ　ＪＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の染色体エレクトロポレーションの方法に従って、ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）株にエレクトロポレーションした。配列番号１８１と配列番号１８２からなる塩基配列のプライマーを用いてΔｙｄｃＩ改変体をＰＣＲにより検証した後、コントロール用のイソプレン生産株ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ株を選択した。
７－３）ピロリン酸ホスファターゼ発現量の確認
　ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａ株におけるピロリン酸ホスファターゼ（ＰＰＡ）のタンパク質発現量をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。この株を３ｍＬの５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加したＬＢ培地にて、一晩、３０℃で振盪培養を実施した。集菌後の菌体は、氷冷した５０ｍＭのトリスバッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０）で２回洗浄を行い、マルチビーズショッカー（Ｙａｓｕｉ　Ｋｉｋａｉ，　Ｊａｐａｎ、４℃、６０秒ＯＮ　６０秒ＯＦＦ、２５００ｒｐｍ、５ｃｙｃｌｅｓ）にて菌体を破砕した。破砕した菌体溶液は、１４０００ｒｐｍで２０分間の遠心を行い、未破砕細胞を取り除いた。得られた上清画分を可溶性タンパク質画分として取り扱った。可溶性タンパク質画分をＢＣＡ法にて定量後、５μｇの可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＮｕＰＡＧＥ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　Ｇｅｌ　Ｓｙｓｔｅｍ）にて電気泳動を行った。その後、定法に従って、ＣＢＢ染色と脱色を行った。図２７にＰＰＡタンパク質量付近のゲルの写真を示した。その結果、ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａ株において、ＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量の増加を確認した。
７－４）イソプレンシンターゼ発現プラスミドの導入
　常法に従いＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ－ＭＧ－ｐｐａ株及びＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ（コントロール）のエレクトロセルを作製し、ｐＳＴＶ２８－Ｐｔａｃ－ｉｓｐＳＭ（ＵＳ２０１４１１３３４４Ａ１）を導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。得られたイソプレン生産菌株をそれぞれ、ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ｙｄｃＩ：：ＭＧ－ＰＰＡ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ／ｉｓｐＳＭ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と命名した。
７－５）イソプレンシンターゼ活性測定
　ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ｙｄｃＩ：：ＭＧ－ＰＰＡ／ｉｓｐＳＭ株、ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ／ｉｓｐＳＭ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）株を、各々クロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３４℃にて１６－２４時間培養した。得られたプレートから１白金耳分の菌体をヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製　２２ｍＬ　ＣＬＥＡＲ　ＣＲＩＭＰ　ＴＯＰ　ＶＩＡＬ　ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）中のＰＳ培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ　ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）にて密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて４８時間培養を行った。
　ＰＳ培地の組成は表２３の記載の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。表２４に各菌株のイソプレン生成量を記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　表２４の結果から、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５のｐｐａ遺伝子を導入したＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ｙｄｃＩ：：ＭＧ－ＰＰＡ／ｉｓｐＳＭ株は、ＳＷＩＴＣＨ－ＰｐｈｏＣ－１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）株より高いイソプレン生成活性を示した。
実施例８：ポリイソプレンの製造
　イソプレンを、発酵排気管を通過させることにより液体窒素冷却トラップで回収する。回収したイソプレンを、十分に乾燥した１００ｍＬガラス容器中で、窒素雰囲気下で３５ｇのヘキサン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびに１０ｇのシリカゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２３６７７２）、および１０ｇのアルミナ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２６７７４０）と混合する。得られた混合液を、室温で５時間放置する。次いで、上清液を採取し、十分に乾燥した５０ｍＬガラス容器中に加える。
　一方で、グローブ・ボックスにおいて窒素雰囲気下、４０．０μｍｏｌのトリス［ビス（トリメチルシリル）アミド］ガドリニウム、１５０．０μｍｏｌのトリブチルアルミニウム、４０．０μｍｏｌのビス［２－（ジフェニルホスフィノ）フェニル］アミン、４０．０μｍｏｌのトリフェニルカーボニウム・テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレート（Ｐｈ３ＣＢＣ６Ｆ５）４）をガラス溶液に用意し、これを５ｍＬのトルエン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２４５５１１）中に溶解させて、触媒液を得る。その後、触媒液をグローブ・ボックスから採り、モノマー液に加え、次いで、これをポリマー反応（５０℃で１２０分間）に供する。
　ポリマー反応後、５質量％の２，２’－メチレン－ビス（４－エチル－６－ｔ－ブチルフェノール）（ＮＳ－５）を含む１ｍＬのイソプロパノール溶液を加えて、反応を停止させる。次いで、多量のメタノールをさらに加えて、ポリマーを単離し、７０℃で真空乾燥させて、ポリマーを得る。
実施例９：ゴム組成物の製造
　表２５に示されるように処方されるゴム組成物を調製し、１４５℃で３５分間加硫処理する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　その好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に記述したが、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更が為され得ること、および均等物が採用され得ることは、当業者に明らかである。本明細書中の全ての引用文献は、本願の一部として参照により援用される。
　本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンの生産に有用である。

Claims (17)

  1. 　ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上した、イソプレンシンターゼ発現微生物。
  2. 　前記微生物が、イソプレンシンターゼ発現ベクターで形質転換された微生物である。請求項１記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  3. 　ピロリン酸ホスファターゼが前記微生物に対して同種由来である、請求項１または２記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  4. 　ピロリン酸ホスファターゼの発現の向上が、前記微生物に固有のピロリン酸ホスファターゼ遺伝子のプロモーター領域の改変によるものである、請求項３記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  5. 　ピロリン酸フォスファターゼの発現の向上が、ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子の染色体でのコピー数の上昇によるものである、請求項１～４のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  6. 　前記微生物が、腸内細菌科に属する微生物である、請求項１～５のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  7. 　前記微生物が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項１～６のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  8. 　前記微生物がエシェリヒア属細菌である、請求項７記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  9. 　前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、請求項８記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  10. 　前記微生物が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項１～７のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  11. 　前記微生物がパントエア属細菌である、請求項１～７および１０のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  12. 　前記パントエア属細菌がパントエア・アナナティスである、請求項１１記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  13. 　請求項１～１２のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養培地中で培養してイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法。
  14. 　以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
    （Ｉ）請求項１３記載の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
    （ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
  15. 　請求項１３記載の方法により製造されるイソプレンモノマーに由来するポリマー。
  16. 　請求項１５記載のポリマーを含むゴム組成物。
  17. 　請求項１６記載のゴム組成物を使用することにより製造されるタイヤ。
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