WO2015067669A1 - Multispot-scanning-mikroskop - Google Patents

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WO2015067669A1
WO2015067669A1 PCT/EP2014/073841 EP2014073841W WO2015067669A1 WO 2015067669 A1 WO2015067669 A1 WO 2015067669A1 EP 2014073841 W EP2014073841 W EP 2014073841W WO 2015067669 A1 WO2015067669 A1 WO 2015067669A1
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WO
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telescope
scanning microscope
sample
lens
optical assembly
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PCT/EP2014/073841
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English (en)
French (fr)
Inventor
Matthias Wald
Jörg STEINERT
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Carl Zeiss Microscopy GmbH
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Carl Zeiss Microscopy GmbH
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Publication date
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    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
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    • G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages
    • G02B21/004—Scanning details, e.g. scanning stages fixed arrays, e.g. switchable aperture arrays

Definitions

  • the present invention relates to a multispot laser scanning microscope according to the preamble of claim 1.
  • Such a microscope is described, for example, in DE 10 2004 034 991 A1 and has the following components: A light source for emitting excitation light, optical means for guiding the excitation light in an excitation beam path to a sample and for guiding detection light coming from the sample in one Beam path to a detection unit.
  • the optical means have at least the following components: separation means for separating the excitation light into a plurality of illumination beams, a main color splitter for separating excitation light and detection light coming from the sample, a scanner for scanning the sample with the illumination beams, a microscope objective for simultaneously guiding the different illumination beams in each case different sample areas of the sample and for returning the reflected from the different sample areas detection light to the Detektorein- unit and a telescope to compensate for inaccuracies of the beam forming the detector optics, which is arranged in the excitation beam path in front of the main beam splitter such that the excitation first a first Telescope lens and then passes through a second telescopic lens.
  • a generic multispot scanning microscope has the above-mentioned detector unit which, for the separate detection of detection light which is reflected back from different sample areas, has at least one number of detectors corresponding to the number of illumination light beams, in front of which the detector optics are arranged.
  • Further arrangements in which telescopes are used in the Sirahlengang a microscope are described in DE 10 2009 004 741 A1, EP 0 723 834 B1 and DE 26 03 455 A1.
  • three lens groups are moved to set the magnification and keep the focus and pupil position constant.
  • a disadvantage is the relatively complicated structure that mechanically requires the movements of three components. Although in the structure described in EP 0 723 834 B1 only a single optical component has to be moved. The position of the focal point also remains almost constant there by means of suitable optical compensation. The disadvantage, however, is that the pupil position is not constant.
  • a sample can be scanned simultaneously with a plurality, for example four, illumination spots in a multispot scanning microscope.
  • This plurality of illumination spots can be generated by dividing the incoming illumination beam into four beams by means of beam splitters. These can then be imaged with a telescope on the scanners of the scanning microscope.
  • the telescope has the task of adapting the cross section of the light beam to the requirements of the scanning microscope, at the same time as a distance of the different lighting spots is set in a field level.
  • the imaging optics Due to inaccuracies of the imaging optics, which are not traversed by both the excitation and the detection light, such as an optical system in front of the detector pinholes and some deflection mirrors, there may be deviations in the distance of the illumination spots in a plane of the pinholes. For example, to make four pinholes with a lateral accuracy of about 10% of the diameter of a diffraction disk, the focal length of the pinhole optics would only have an inaccuracy of about 0.3%. Also, the deflection mirror should not have any curvature.
  • the pupil position ie the position of the pupil on the beam path, is important for the distance of the pupil from the telescope.
  • the size of the pupil does not matter.
  • a pupil should be defined for the present application as usual in optics.
  • a pupil is a location on the optical axis where all sub-beam bundles intersect.
  • every image of a diaphragm is a pupil.
  • the location of such an image of a diaphragm in the beam path is then corresponding to the pupil position.
  • it can be considered to use a zoom telescope instead of a fixed telescope in the excitation beam path of the multispot scanning microscope. This can be adjusted with simple means, the distance of the illumination spots without the need for a complicated beam splitter assembly is necessary.
  • there is only a single degree of freedom for the adjustment namely the setting of the zoom telescope, so that the adjustment as such is easy
  • the pupil of the beam path, to which the distance g of the second telescope lens is measured is preferably the pupil closest to the telescope between the telescope and the microscope objective.
  • This pupil can be, for example, an exit pupil of the telescope or an entrance pupil of optical components, which are arranged downstream of the telescope in the beam path.
  • the telescope can be positioned so that the exit pupil of the telescope coincides with the entrance pupil of the following components.
  • the present invention optical assembly may be, for example, a single lens. This embodiment is preferred for its simplicity.
  • the optical assembly may comprise at least two lenses, which may in particular be exactly two in particular identical lenses. It is advantageous here that the positioning of an optical component in an intermediate image plane can be avoided.
  • the lenses of the optical assembly may be rigidly coupled together.
  • the optical assembly can additionally have an achromat for correcting chromatic aberrations.
  • more lenses may be present to correct for aperture errors and / or field errors.
  • Excitation light in the sense of the invention described herein is electromagnetic radiation, in particular the infrared, visible and ultraviolet parts of the spectrum are meant.
  • all radiation sources that provide the required electromagnetic radiation with the desired intensity can be used as light sources.
  • Particular preference is given to using lasers.
  • light-emitting diodes or other lamps can also be used.
  • Confocal is an aperture when positioned in or near a confocal plane.
  • a confocal plane denotes a plane of the detection beam path which is optically conjugate to a sample focal plane of the microscope objective.
  • a confocal aperture in front of a detector limits the light exposure of this detector to a small target volume at the sample site.
  • detectors in principle all detectors can be used which are sufficiently sensitive to the electromagnetic radiation to be detected and have a sufficiently good signal-to-noise ratio.
  • semiconductor detectors can be used for this purpose. Because counting rates are comparatively small in the main field of fluorescence microscopy, photomultipliers are very often used.
  • the present invention telescope may be in particular a Kepler telescope. This ensures that the illumination beam bundles intersect in the pupil of the scanner and accordingly have a common pupil position.
  • the scanner can also be positioned at a distance g from the second telescope lens.
  • the advantages of the present invention in particular the constancy of the focus and pupil position can be achieved in a special way in one embodiment of the invention, in which the zoom range of the telescope is very small.
  • an enlargement of the telescope can be variable by less than 15%, preferably less than 10% and particularly preferably less than 5%, due to the optical assembly.
  • FIG. 1 shows an embodiment of a multispot scanning microscope according to the invention
  • Fig. 2 is a detail of the microscope of Fig. 1;
  • FIG. 3 is a further detail of Fig. 1;
  • Fig. 4 shows a variant of the situation shown in Fig. 3.
  • the microscope 100 shown there has a light source 10, as well as optical means 20, 30, 40, 48, 60 for guiding excitation light 2 in an excitation beam path A to a sample 70 and for guiding detection light 54 coming from the sample 70, 56, 58 in a detection trajectory D to a detection unit 90.
  • the optical means include in detail separation means 20, which may also be referred to as a separating means, for separating the excitation light 12 into a plurality of illumination beams 14, 16, 18th
  • a telescope 30 which is positioned between the severing device 20 and a main color splitter 40 and has as essential components a first telescope lens 32, a second telescope lens 36 and the optical assembly 34 according to the invention.
  • the excitation light 12 passes in a plurality of illumination beams 14, 16, 18 onto a scanner 48, which is positioned in a pupil of the excitation beam path.
  • This pupil has in the excitation beam A a distance g from the second Teieskoplinse 36.
  • the distance g is to be understood as a path in the optical excitation beam A, in other words is deflected at the main color divider by 90 °.
  • This distance or path is shown schematically in FIG. 1 as a line h between the second telescope lens 36 and the scanner 48 and lies on the axis of symmetry of the excitation beam A.
  • the main color divider 40 as shown in FIG.
  • this path h from the second telescopic lens 36, deflected by 90 ° in the direction of the scanner 48.
  • the illumination beam 14, 16, 18 are deflected by the scanner 48 again by an angle of about 90 ° and pass through a microscope optics having at least one microscope objective 60 on a sample 70 and are there as illumination spots 24, 26, 28 on sample areas 74, 76, 78 focused. Inter- see the scanner 48 and the microscope objective 60 are still other beam-forming optical components, which are not shown in Fig. 1, in particular a scanning optics. This is shown in Fig. 2 in detail.
  • the sample areas 74, 76, 78 emit detection light 54, 56, 58, which is also shown schematically in FIG.
  • This detection light 54, 56, 58 passes from the specimen 70 via the microscope objective 60 on a detection beam path D via the scanner 48, the further optical components 46, 44, 42 to the main color splitter 40.
  • the detection light is intended 54, 56, 58 are longer wavelength fluorescent light than the excitation light 12.
  • This light is transmitted by the main color splitter 40 and passes via detectors 80, which is shown here schematically as a single lens, on detectors 94, 96, 98 of the defector unit 90 via confocal apertures 84, 86, 88, which are formed in a single aperture disk 82 ,
  • the detector optics 80 may, instead of as in the example from FIG. 1, also be a single lens for each detector section with a confocal diaphragm and a downstream detector.
  • Essential for the invention is the optical assembly 34 of the telescope 30, which is formed by a single lens 38 in the example shown.
  • the telescope 30 of Fig. 1 is shown again in Fig. 3.
  • the optical assembly 34 formed by a single lens 38 is According to the invention positioned in an intermediate image plane of the first telescopic lens 32 and the second telescopic lens 36.
  • FIG. 4 An alternative embodiment is shown in FIG. 4.
  • the optical assembly is formed by two identical lenses 33, 35, which are moved in a constant distance d, which is illustrated by a curly bracket in Fig. 4, in the directions illustrated by the double arrow 37 parallel to the optical axis.
  • the invention relates generally to a structure for varying the magnification of a telescope, in particular a Kepler telescope, with a single movement, while simultaneously focus and Pupülenlage should be kept as constant as possible.
  • the optical assembly 34 is arranged in the intermediate image of the telescope with the lenses 36 and 32.
  • g denotes the entrance pupil position, that is to say the distance between a pupil of the excitation beam path in front of the second telescope lens 36.
  • the optical assembly 34 instead of a single lens 38, two rigidly coupled lenses that are to be moved together as a lens group. This is illustrated in FIG. 4, where the optical assembly is formed by the lenses 33 and 35.
  • the above-mentioned relationships remain the same.
  • the lenses 35 and 33 may in particular be identical.
  • the structure shown in FIG. 4 also solves the problem on which the invention is based, which is varied with a mechanical movement, in particular a single mechanical movement, of a magnification of a lens group, while the focus and pupil position remain very well constant.
  • g is the distance of the entrance pupil in front of the second telescopic lens (36). gl, g2 sections

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Muitispot-Scanning-Mikroskop mit einer Licht¬ quelle zum Aussenden von Anregungslicht, mit Optikmittein, zum Leiten des Anre¬ gungslichts in einem Anregungsstrahlengang zu einer Probe und zum Leiten von von der Probe kommendem Detektionslicht in einem Detektionsstrahlengang zu einer Detektionseinheit, wobei die Optikmittel mindestens folgende Bestandteile aufweisen: Auftrennmittel zum Auftrennen des Anregungslichts in mehrere Beleuchtungsstrahlenbündel, einen Hauptfarbteiler zum Auftrennen von Anregungslicht und von der Probe kommendem Detektionslicht, einen Scanner zum Abrastern der Probe mit den Beleuchtungsstrahlenbündeln, ein Mikroskopobjektiv zum gleichzeitigen Leiten der verschiedenen Beleuchtungsstrahlenbündel auf jeweils verschiedene Probenbereiche der Probe und zum Zurückleiten des von den verschiedenen Probenbereichen zurückgestrahlten Detektionslichts zu der Detektoreinheit, und ein Teleskop zum Ausgleichen von Ungenauigkeiten der Strahlformung der Detektoroptik, welches in dem Anregungsstrahlengang vor dem Hauptstrahlteiier dergestalt angeordnet ist, dass das Anregungslicht zuerst eine erste Teleskoplinse und danach eine zweite Teleskoplinse durchläuft, und mit der Detektoreinheit, die zum getrennten Nachweisen von Detektionslicht, welches von verschiedenen Probenbereichen zurückgestrahlt wird, mindestens eine der Anzahl der Beleuchtungslichtbündel entsprechende Anzahl von Detektoren aufweist, vor denen jeweils eine Detektoroptik angeordnet ist. Das Muitispot-Scanning-Mikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass das Teleskop eine optische Baugruppe aufweist, die in einer Zwischenbildebene der ersten Teleskoplinse und der zweiten Teleskoplinse positioniert ist, und dass eine Brechkraft φ der optischen Baugruppe folgender Bedingung genügt: φ = 2 φ2(1 - g φ2), wobei φ2 eine Brechkraft der zweiten Teleskoplinse und g der Abstand der Eintrittspupille vor der zweiten Teleskoplinse ist.

Description

MULTISPOT-SCANNING MIKROSKOP
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Multispot-Laser-Scanning Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Ein solches Mikroskop ist beispielsweise in DE 10 2004 034 991 A1 beschrieben und weist folgende Komponenten auf: Eine Lichtquelle zum Aussenden von Anregungs- licht, Optikmittel zum Leiten des Anregungslichts in einem Anregungsstrahlengang zu einer Probe und zum Leiten von von der Probe kommendem Detektionslicht in einem Strahlengang zu einer Detektionseinheit. Die Optikmittel weisen dabei mindestens folgende Komponenten auf: Auftrennmittel zum Auftrennen des Anregungslichts in mehrere Beleuchtungsstrahlenbündel, einen Hauptfarbteiler zum Auftrennen von Anregungslicht und von der Probe kommendem Detektionslicht, einen Scanner zum Abrastern der Probe mit den Beleuchtungsstrahlenbündeln, ein Mikroskopobjektiv zum gleichzeitigen Leiten der verschiedenen Beleuchtungsstrahlenbündel auf jeweils verschiedene Proben bereiche der Probe und zum Zurückstrahlen des von den verschiedenen Probenbereichen zurückgestrahltem Detektionslichts zu der Detektorein- heit und eine Teleskop zum Ausgleichen von Ungenauigkeiten der Strahlformung der Detektoroptik, welches in dem Anregungsstrahlengang vor dem Hauptstrahlteiler dergestalt angeordnet ist, dass das Anregungsiicht zuerst eine erste Teleskoplinse und danach eine zweite Teleskoplinse durchläuft. Schließlich weist ein gattungsgemäßes Multispot-Scanning-Mikroskop die vorhin erwähnte Detektoreinheit auf, die zum getrennten Nachweisen von Detektionslicht, das von verschiedenen Probenbereichen zurückgestrahlt wird, mindestens eine der Anzahl der Beleuchtungslichtbündel entsprechende Anzahl von Detektoren aufweist, vor denen die Detektoroptik angeordnet ist. Weitere Anordnungen, bei denen Teleskope im Sirahlengang eines Mikroskops verwendet werden sind in DE 10 2009 004 741 A1 , EP 0 723 834 B1 und DE 26 03 455 A1 beschrieben. Bei den in DE 10 2004 034 991 A1 und DE 10 2009 004 741 A1 beschriebenen Teleskopen werden zur Einstellung der Vergrößerung und zum Kon- stanthalten der Fokus- und Pupillenlage drei Linsengruppen bewegt. Nachteilig ist dabei der vergleichsweise komplizierte Aufbau, der mechanisch die Bewegungen von drei Komponenten erfordert. Bei dem in EP 0 723 834 B1 beschriebenen Aufbau muss zwar nur eine einzige optische Komponente bewegt werden. Die Lage des Brennpunkts bleibt auch dort durch geeigneten optischen Ausgleich nahezu kon- stant. Nachteilig ist aber, dass die Pupillenlage nicht konstant ist.
Dies trifft auch auf die in DE 26 03 455 A1 offenbarte Vorrichtung zu, wobei dort aber eine konstante Pupillenlage nicht gefordert ist.
Zur Beschleunigung der Bildaufnahme kann bei einem Multispot-Scanning-Mikroskop eine Probe zeitgleich mit einer Mehrzahl, beispielsweise vier, Beleuchtungsspots ab- gerastert werden. Diese Mehrzahl von Beieuchtungsspots kann erzeugt werden, indem der einkommende Beleuchtungsstrahl mit Hilfe von Strahlteilern auf vier Bündel aufgeteilt wird. Diese können dann mit einem Teleskop auf die Scanner des Scan- ning-Mikroskops abgebildet werden. Das Teleskop hat dabei die Aufgabe, den Querschnitt der Lichtbündel an die Erfordernisse des Scanning-Mikroskops anzupassen, wobei gleichzeitig damit auch ein Abstand der verschiedenen Beleuchtungsspots in einer Feldebene festgelegt wird. Aufgrund von Ungenauigkeiten der Abbildungsoptiken, die nicht sowohl vom Anregungs- als auch vom Detektionslicht durchlaufen werden, beispielsweise eine Optik vor den Detektor-Pinholes und einiger Umlenkspiegel, kann es zu Abweichungen des Abstands der Beleuchtungsspots in einer Ebene der Pinholes kommen. Um beispielsweise vier Pinholes mit einer lateralen Genauigkeit von etwa 10% des Durchmessers eines Beugungsscheibchens zu treffen, dürfte die Brennweite der Pinholeoptik nur eine Ungenauigkeit von etwa 0,3 % aufweisen. Auch die Umlenkspiegel dürften keinerlei Krümmung aufweisen.
Als eine A u f g a b e der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, ein Mul- tispot-Scanning-Mikroskop bereitzustellen, bei dem mit möglichst einfachen Mitteln ein Abstand der Beleuchtungsspots justiert werden kann. Diese Aufgabe wird durch das Multispot-Scanning-Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.
Das Multispot-Scanning-Mikroskop der oben angegebenen Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass das Teleskop eine optische Baugruppe aufweist, die in einer Zwischenbildebene der ersten Teleskoplinse und der zweiten Teleskoplinse positioniert ist, dass eine Brechkraft <p der optischen Baugruppe folgender Bedingung genügt: φ = 2 φ2{1 - g φ2), wobei φ2 eine Brechkraft der zweiten Teleskoplinse und g der Abstand der zweiten Teleskoplinse zu einer Pupille des Anregungsstrahlengangs ist.
Für den Abstand der Pupille von dem Teleskop ist die Pupillenlage, also die Position der Pupille auf dem Strahlengang, wichtig. Die Größe der Pupille spielt dabei keine Rolle. Eine Pupille soll für die vorliegende Anmeldung wie in der Optik üblich definiert sein. Demnach ist eine Pupille ein Ort auf der optischen Achse, in dem sich alle Teilstrahlbündel schneiden. Nach einer äquivalenten Definition ist jede Abbildung einer Blende eine Pupille. Die Lage eines solchen Bilds einer Blende im Strahlengang ist dann entsprechend die Pupillenlage. Als ein Grundgedanke der vorliegenden Erfindung kann angesehen werden, anstelle eines festen Teleskops im Anregungsstrahlengang des Multispot-Scanning- Mikroskops ein Zoom-Teleskop zu verwenden. Damit kann mit einfachen Mitteln der Abstand der Beleuchtungsspots eingestellt werden ohne dass hierzu eine komplizierte Strahlteilerbaugruppe notwendig ist. Insbesondere besteht für die Justage nur ein einziger Freiheitsgrad, nämlich die Einstellung des Zoom-Teleskops, so dass auch das Justieren als solches einfach ist
Als weiterer wesentlicher Vorteil wird durch das erfindungsgemäße Multispot- Scanning-Mikroskop erreicht, dass sowohl die Fokus- als auch die Pupillenlage über den Zoombereich sehr gut konstant bleiben. Bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Multispot-Scanning-Mikroskops werden im Folgenden, insbesondere mit Bezug auf die abhängigen Ansprüche sowie die beigefügten Figuren beschrieben.
Die Pupille des Strahlengangs, zu weicher der Abstand g der zweiten Teleskoplinse gemessen wird, ist bevorzugt die dem Teleskop nächstgelegene Pupille zwischen Teleskop und Mikroskopobjektiv. Diese Pupille kann beispielsweise eine Austrittspupille des Teleskops oder eine Eintrittspupille von optischen Komponenten sein, die dem Teleskop im Strahlengang nachgeordnet sind. Insbesondere kann das Teleskop so positioniert werden, dass die Austrittspupille des Teleskops mit der Eintrittspupille der nachfolgenden Komponenten zusammenfällt.
Die erfindungsgemäß vorhandene optische Baugruppe kann beispielsweise eine Einzellinse sein. Diese Ausführungsform ist wegen ihrer Einfachheit bevorzugt.
Sodann kann die optische Baugruppe mindestens zwei Linsen aufweisen, wobei es sich insbesondere um genau zwei insbesondere identische Linsen handeln kann. Vorteilhaft ist hierbei, dass die Positionierung einer optischen Komponente in einer Zwischenbildebene vermieden werden kann.
Die Linsen der optischen Baugruppe können starr aneinander gekoppelt sein.
Bei einer weiteren bevorzugten Variante kann die optische Baugruppe zusätzlich einen Achromat zur Korrektur von Farbfehlern aufweisen. Darüber hinaus können zur Korrektur von Öffnungsfehlern und/oder Feldfehlern weitere Linsen vorhanden sein.
Besonders zweckmäßig sind vor den Detektoren konfokale Blenden angeordnet, so dass das Multispot-Scanning-Mikroskop ein konfokales Mikroskop ist, mit allen, prinzipiell bekannten Vorteilen und Eigenschaften.
Anregungslicht im Sinn der hier beschriebenen Erfindung ist elektromagnetische Strahlung, wobei insbesondere die infraroten, sichtbaren und ultravioletten Teile des Spektrums gemeint sind. Als Lichtquellen können prinzipiell alle Strahlungsquellen verwendet werden, die die erforderliche elektromagnetische Strahlung mit der gewünschten Intensität bereitstellen. Besonders bevorzugt werden Laser verwendet. Prinzipiell können aber auch Leuchtdioden oder andere Leuchtmittel verwendet werden.
Als konfokal wird eine Blende bezeichnet, wenn sie in oder in der Nähe einer konfokalen Ebene positioniert ist. Unter einer konfokalen Ebene wird eine zu einer proben- seitägen Brennebene des Mikroskopobjektivs optisch konjugierte Ebene des Detekti- onsstrahlengangs bezeichnet. Eine konfokale Blende vor einem Detektor beschränkt die Lichtaufnahme dieses Detektors auf ein kleines Zielvolumen am Probenort.
Als Detektoren können prinzipiell alle Detektoren verwendet werden, welche für die nachzuweisende elektromagnetische Strahlung hinreichend empfindlich sind und ein ausreichend gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis aufweisen. Grundsätzlich können Halbleiterdetektoren hierfür verwendet werden. Weil bei dem Haupteinsatzbereich der Fluoreszenzmikroskopie die Zählraten vergleichsweise klein sind, werden aber sehr häufig Photomultiplier verwendet.
Das erfindungsgemäß vorhandene Teleskop kann insbesondere ein Kepler-Teleskop sein. Dadurch wird gewährleistet, dass sich die Beleuchtungsstrahlenbündel in der Pupille des Scanners schneiden und demgemäß eine gemeinsame Pupillenlage aufweisen.
Besonders bevorzugt kann außerdem der Scanner mit einem Abstand g zu der zweiten Teleskoplinse positioniert sein. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung, insbesondere die Konstanz der Fokus- und Pupillenlage können in besonderer Weise bei einer Ausgestaltung der Erfindung erreicht werden, bei der der Zoombereich des Teleskops sehr klein ist. Insbesondere kann durch die optische Baugruppe eine Vergrößerung des Teleskops um weniger als 15 %, bevorzugt weniger als 10 % und besonders bevorzugt weniger als 5 %, veränderbar sein.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden mit Bezug auf die beigefügten Figuren erläutert. Hierin zeigt:
Fig. 1 : ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Multispot-Scanntng- Mikroskops; Fig. 2 ein Detail des Mikroskops aus Fig. 1 ;
Fig. 3 ein weiteres Detail aus Fig. 1 ; und
Fig. 4 eine Variante der in Fig. 3 dargestellten Situation.
Ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Multispot-Scanning- Mikroskops 100 wird mit Bezug auf Fig. 1 erläutert. Als wesentliche Komponenten weist das dort gezeigte Mikroskop 100 eine Lichtquelle 10, sowie Optikmittel 20, 30, 40, 48, 60 auf zum Leiten von Anregungslicht 2 in einem Anregungsstrahlengang A zu einer Probe 70 und zum Leiten von von der Probe 70 kommendem Detektionslicht 54, 56, 58 in einem Detektionsstrahiengang D zu einer Detektionseinheit 90. Die Optikmittel beinhalten im Einzelnen Auftrennmittel 20, die auch als Auftrenneinrichtung bezeichnet werden können, zum Auftrennen des Anregungslichts 12 in mehrere Beleuchtungsstrahlenbündel 14, 16, 18.
Sodann ist ein Teleskop 30 vorhanden, welches zwischen der Auftrenneinrichtung 20 und einem Hauptfarbteiler 40 positioniert ist und als wesentliche Komponenten eine erste Teleskoplinse 32, eine zweite Teleskoplinse 36 und die erfindungsgemäß vorhandene optische Baugruppe 34 aufweist.
Über das Teleskop 30 und den Hauptfarbteiler 40 gelangt das Anregungslicht 12 in mehreren Beleuchtungsstrahlenbündeln 14, 16, 18 auf einen Scanner 48, der in einer Pupille des Anregungsstrahlengangs positioniert ist. Diese Pupille hat im Anre- gungsstrahlengang A einen Abstand g von der zweiten Teieskoplinse 36. Zu beachten ist dabei, dass der Abstand g dabei als Wegstrecke im optischen Anregungsstrahlengang A zu verstehen ist, mit anderen Worten also an dem Hauptfarbteiler um 90° abgelenkt wird. Dieser Abstand oder Weg ist in Fig. 1 schematisch als Linie h zwischen der zweiten Teleskoplinse 36 und dem Scanner 48 eingetragen und liegt auf der Symmetrieachse des Anregungsstrahlengangs A. An dem Hauptfarbteiler 40 wird, wie aus Fig. 1 ersichtlich, dieser Weg h von der zweiten Teleskoplinse 36 kommend, um 90° in Richtung des Scanners 48 abgelenkt. Die Gesamtlänge g des Wegs h ergibt sich, wie in Fig. 1 ebenfalls schematisch dargestellt, als Summe der Teilstrecken gl und g2, das heißt g = gl + g2. Die Beleuchtungsstrahlenbündel 14, 16, 18 werden durch den Scanner 48 nochmals um einen Winkel von etwa 90° abgelenkt und gelangen über eine Mikroskopoptik, die mindestens ein Mikroskopobjektiv 60 aufweist, auf eine Probe 70 und werden dort als Beleuchtungsspots 24, 26, 28 auf Probenbereiche 74, 76, 78 fokussiert. Zwi- sehen dem Scanner 48 und dem Mikroskopobjektiv 60 befinden sich noch weitere strahlformende optische Komponenten, die in Fig. 1 nicht dargestellt sind, insbesondere eine Scanoptik. Das ist in Fig. 2 im Detail dargestellt. Als Antwort oder Response auf diese Bestrahlung durch die Beleuchtungsstrahlenbündel 14, 16, 18 strahlen die Probenbereiche 74, 76, 78 Detektionslicht 54, 56, 58 ab, was in Fig. 2 ebenfalls schematisch dargestellt ist.
Dieses Detektionslicht 54, 56, 58 gelangt von der Probe 70 über das Mikroskopob- jektiv 60 auf einem Detektionsstrahlengang D über den Scanner 48, die weiteren optischen Komponenten 46, 44, 42 bis zum Hauptfarbteiler 40. im gezeigten Beispiel soll es sich bei dem Detektionslicht 54, 56, 58 um Fluoreszenzlicht mit längerer Wellenlänge als das Anregungslicht 12 handeln. Dieses Licht wird vom Hauptfarbteiler 40 transmittiert und gelangt über eine Detektoroptik 80, die hier schematisch als Einzellinse dargestellt ist, über konfokale Blenden 84, 86, 88, die in einer einzigen Blendenscheibe 82 gebildet sind, auf Detektoren 94, 96, 98 der Defektoreinheit 90.
Die Detektoroptik 80 kann statt wie im Beispiel aus Fig. 1 auch für jede Detektorstre- cke mit einer konfokalen Blende und nachgeordnetem Detektor eine Einzellinse sein.
Für die Erfindung wesentlich ist die optische Baugruppe 34 des Teleskops 30, die im gezeigten Beispiel durch eine Einzellinse 38 gebildet ist.
Durch Verstellung der Linse 38 in Richtung der optischen Achse, können Ungenau- igkeiten der Detektoroptik 80, die dazu führen, dass die Fokalpunkte des Detektions- lichts 54, des Detektionslichts 56 und des Detektionslichts 58, die hierfür vorgesehenen konfokalen Blenden 84, 86, 88 nicht mehr genau treffen, ausgeglichen werden. Diese Bewegung entlang der optischen Achse ist in Fig. 1 schematisch durch den Doppelpfeil 37 dargestellt.
In übersichtlicherer Anordnung ist das Teleskop 30 aus Fig. 1 noch einmal in Fig. 3 dargestellt. Die optische Baugruppe 34, die durch eine Einzeilinse 38 gebildet ist, ist erfindungsgemäß in einer Zwischenbildebene der ersten Teleskoplinse 32 und der zweiten Teleskoplinse 36 positioniert.
Eine alternative Ausgestaltung ist in Fig. 4 dargestellt. Dort wird die optische Baugruppe durch zwei identische Linsen 33, 35 gebildet, die in einem konstanten Ab- stand d, der durch eine geschweifte Klammer in Fig. 4 veranschaulicht ist, in den durch den Doppelpfeil 37 veranschaulichten Richtungen parallel zur optischen Achse bewegt werden. Durch das Bewegen der optischen Baugruppe 34 entlang der optischen Achse in den Ausführungsbeispielen aus Figuren 1 , 3 und 4 können die relativen Abstände der Fokalpunkte des Detektionslichts 54, 56, 58 um einen Faktor ver- größert oder verkleinert werden, wobei dieser Faktor durch die Position der optischen Baugruppe 34 in Richtung der optischen Achse des Anregungsstrahlengangs A definiert ist. Als besonderer Vorteil wird demgemäß bei der Erfindung erreicht, dass nur ein einziger Parameter eingestellt werden muss, was für einen Benutzer besonders praktisch ist. Die Erfindung bezieht sich insgesamt auf einen Aufbau zur Variierung des Abbildungsmaßstabs eines Teleskops, insbesondere eines Kepler-Teleskops, mit einer einzigen Bewegung, wobei gleichzeitig Fokus und Pupülenlage möglichst konstant gehalten werden sollen. Dazu ist im Zwischenbild des Teleskops mit den Linsen 36 und 32 die optische Baugruppe 34 angeordnet. Durch axiale Bewegung dieser opti- sehen Baugruppe 34, die im Beispiel aus Fig. 3 als Einzellinse 38 gebildet ist, um einen Weg Δ ändert sich der Abbildungsmaßstab Γ in paraxialer Näherung, das heißt für achsnahe Strahlen, gemäß
Γ = Γ0 (1 + Δφ), Γ0 = - <ρι / φ2
wobei ( i die Brechkraft der Linse 32, <p2 die Brechkraft der Linse 36 und φ die Brechkraft der optischen optischen Baugruppe 34 bedeuten. Die Anordnung der Linsen gemäß Fig. 3 garantiert bei Bewegung der Linse 38 um eine Strecke Δ eine quadratische Abhängigkeit der Defokussierung von Δ gemäß
D = < i φ2 φ Δ2.
Damit schwankt die Fokuslage über einen ausreichenden Bereich sehr wenig und zwar deutlich unterhalb der Schärfentiefe. Damit auch die Pupillenlage Vergleichs- weise konstant bleibt, muss die Brechkraft φ der Linse 38, also der optischen Baugruppe 34, folgender Bedingung genügen: φ = 2φ2 (1 - g Φ2)·
Hier bedeutet g die Eintrittspupillenlage, das heißt den Abstand einer Pupille des An- regungsstrahlengangs vor der zweiten Teleskoplinse 36. Dann weist die Pupillenlage p, das heißt der Abstand der Pupille vor der ersten Teleskoplinse 32, ebenfalls eine quadratische Abhängigkeit von Δ auf, gemäß ρ = φ3 Δ2/ 4 (φι)2.
Weil es wegen der hohen Sauberkeitsanforderungen nicht ratsam ist, eine Linse im Zwischenbild des Teleskops 30 zu positionieren, besteht eine vorteilhafte Lösung darin, für die optische Baugruppe 34 statt einer Einzellinse 38 zwei starr gekoppelte Linsen zu verwenden, die gemeinsam als Linsengruppe zu verschieben sind. Dies ist in Fig. 4 dargestellt, wo die optische Baugruppe durch die Linsen 33 und 35 gebildet ist. Die oben genannten Zusammenhänge bleiben dabei dieselben. Die Linsen 35 und 33 können insbesondere identisch sein.
Auch durch den in Fig. 4 gezeigten Aufbau wird das der Erfindung zugrunde liegende Problem gelöst, das mit einer mechanischen Bewegung, insbesondere einer einzigen mechanischen Bewegung, einer Linsengruppe der Abbildungsmaßstab variiert wird, während Fokus und Pupillenlage sehr gut konstant bleiben.
Bezugszeicheniiste
A Anregungsstrahlengang
d konstanter Abstand
D Detektionsstrahlengang
D Defokussierung
g der Abstand der Eintrittspupille vor der zweiten Teleskoplinse (36) ist. gl , g2 Teilstrecken
h Weg in Strahlengang
p Pupillenlage
φ Brechkraft der optischen Baugruppe 34
φ-ι Brechkraft der ersten Teleskoplinse 32
<p2 Brechkraft der zweiten Teleskoplinse 36
Δ Weg, Strecke
Γ Abbildungsmaßstab
Γ0 Abbildungsmaßstab
10 Lichtquelle
12 Anregungslicht
4 Beleuchtungsstrahlenbündel
16 Beleuchtungsstrahlenbündel
8 Beleuchtungsstrahlenbündel
20, 30, 40, 48, 60 Optikmittel
20 Auftrennmittel
30 Teleskop
32 erste Teleskoplinse
33 Linse
34 optische Baugruppe
35 Linse
36 zweite Teleskoplinse
37 Doppelpfeil
38 Einzellinse
40 Hauptfarbteiler
48 Scanner
54 Detektionslicht Detektionslicht Detektionslicht Mikroskopobjektiv Probe
Probenbereich Probenbereich Probenbereich Detektoroptik konfokale Blende konfokale Blende konfokale Blende Detektoreinheit Detektionseinheit Detektor
Detektor
Detektor

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Multispot-Scanning-Mikroskop
mit einer Lichtquelle (10) zum Aussenden von Anregungslicht (12),
mit Optikmitteln (20, 30, 40, 48, 60) zum Leiten des Anregungslichts (12) in einem Anregungsstrahlengang (A) zu einer Probe (70) und zum Leiten von von der Probe (70) kommendem Detektionslicht (54, 56, 58) in einem Detekti- onsstrahlengang (D) zu einer Detektionseinheit (90),
wobei die Optikmittel mindestens folgende Bestandteile aufweisen:
Auftrennmittel (20) zum Auftrennen des Anregungslichts (12) in mehrere Beleuchtungsstrahlenbündel (14, 16, 18),
einen Hauptfarbteiler (40) zum Auftrennen von Anregungslicht (14, 16, 18) und von der Probe kommendem Detektionslicht (54, 56, 58),
einen Scanner (48) zum Abrastern der Probe (70) mit den Beleuchtungsstrahlenbündeln (14, 16, 18),
ein Mikroskopobjektiv (60) zum gleichzeitigen Leiten der verschiedenen Beleuchtungsstrahlenbündel (14, 16, 18) auf jeweils verschiedene Probenbereiche (74, 76, 78) der Probe (70) und zum Zurückleiten des von den verschiedenen Probenbereichen (74, 76, 78) zurückgestrahlten Detektionslichts (54, 56, 58) zu der Detektoreinheit (90), und
ein Teleskop (30) zum Ausgleichen von Ungenauigkeiten der Strahlformung der Detektoroptik (80), welches in dem Anregungsstrahlengang (A) vor dem Hauptstrahlteiler (40) dergestalt angeordnet ist, dass das Anregungslicht (12, 14, 16, 18) zuerst eine erste Teleskoplinse (32) und danach eine zweite Tele- skopiinse (36) durchläuft, und
mit der Detektoreinheit (90), die zum getrennten Nachweisen von Detektionslicht (54, 56, 58), welches von verschiedenen Probenbereichen (74, 76, 78) zurückgestrahlt wird, mindestens eine der Anzahl der Beleuchtungslichtbün- del(14, 16, 18) entsprechende Anzahl von Detektoren (94, 96, 98) aufweist, vor denen jeweils eine Detektoroptik (80) angeordnet ist,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Teleskop (30) eine optische Baugruppe (34) aufweist, die in einer Zwischenbildebene der ersten Teleskoplinse (32) und der zweiten Teleskoplinse (36) positioniert ist,
dass eine Brechkraft φ der optischen Baugruppe (34) folgender Bedingung genügt:
φ = 2 φ2(1 -g φ2), wobei φ2 eine Brechkraft der zweiten Teleskoplinse (36) und g der Abstand der zweiten Teleskoplinse (36) zu einer Pupille des Anregungsstrahlengangs (A) ist.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach Anspruch ,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Baugruppe (34) eine Einzellinse (38) ist.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Baugruppe (34) mindestens zwei Linsen (33, 35) aufweist.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach einem der Anspruch 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Baugruppe (34) zwei identische Linsen (33, 35) aufweist.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Baugruppe (34) einen Achromat zur Korrektur von Farbfehlern aufweist.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Linsen der optischen Baugruppe (34) starr aneinander gekoppelt sind. Multispot-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass vor den Detektoren (94, 96, 98) konfokale Blenden (84, 86, 88) angeordnet sind.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Baugruppe (34) zur Korrektur von Öffnungsfehlern, insbesondere sphärischen Aberrationen, und/oder zur Korrektur von Feldfehlem weitere Linsen aufweist.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Teleskop (30) ein Kepler-Teleskop ist.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass sich die Beleuchtungsstrahlenbündel (14, 16, 18) in einer Pupille des Scanners (48) schneiden.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass durch die optische Baugruppe (34) eine Vergrößerung des Teleskops (30) um weniger als 15 %, bevorzugt weniger als 10 % und besonders bevorzugt weniger als 5 %, veränderbar ist.
Multispot-Scanning-Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Scanner (48) mit einem Abstand g zu der zweiten Teleskoplinie (36) positioniert ist.
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