WO2015060703A2 - Kit de diagnostic de la leucemie myeloide chronique en reaction multiplex et ses applications dans le suivi du tratement et de la maladie residuelle - Google Patents

Kit de diagnostic de la leucemie myeloide chronique en reaction multiplex et ses applications dans le suivi du tratement et de la maladie residuelle Download PDF

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El Hassane Sefrioui
Abdeladim MOUMEN
Manale EL AMRANI
Nadia BOUCHOUTROUCH
Hicham EL HADI
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to an in vitro diagnostic kit for the identification and quantification of the BCR-ABL genetic translocation present in chronic myeloid leukemia (CML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL).
  • CML chronic myeloid leukemia
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • This kit consists of an innovative combination of new primers and probes sets and a calibrated plasmid dilution series for the specific detection and quantification of the BCR-ABL gene and the ABL1 reference gene using the method real-time PCR (qPCR) in multiplex or simplex format.
  • qPCR real-time PCR
  • Chronic myelogenous leukemia is one of the diseases of the blood grouped under the name of "myeloproliferative syndromes". It is characterized by excessive and persistent production within the bone marrow of white blood cells.
  • CML is linked to the appearance of an abnormality associated with the fusion of two chromosomes of bone marrow stem cells, causing the appearance of a small abnormal chromosome, the Philadelphia chromosome.
  • This anomaly results from the mistaken assembly of a chromosome 9 gene, called ABL, with a chromosome 22 gene called BCR (Shtivelman, 1985. Nature 1985; 315: 550-4). This produces the so-called BCR-ABL gene that is present only in diseased cells.
  • This gene abnormally produces an enzyme, the tyrosine kinase, itself responsible for the increased production of white blood cells. Indeed BCR-ABL genetic translocation is present in 95% of LMC cases and 10% LLA.
  • the fundamental criterion for the diagnosis of CML or LLA is the presence of BCR-ABL fusion gene, which can be demonstrated by current cytogenetic methods such as karyotyping, FISH (Fluorescent in situ hybridization) or hematological examinations. .
  • FISH Fluorescent in situ hybridization
  • hematological examinations are mostly lacking in quantitative and qualitative tests, they are less specific, they use complex hybridizations or isotopes, they take a lot of time (several days), they can be invasive (use of the bone marrow), or they are more expensive.
  • these cytogenetic methods can detect only one CML cell out of 500 cells and therefore can not be used in the case of follow-up treatment of CML or in the case of residual disease that requires high sensitivity (detection of LMC cell on 100,000 cells).
  • qPCR uses in parallel a control gene expressed ubiquitously in all cells of the body and which will facilitate the normalization and quantification of the target gene.
  • control genes such as GAPDH, beta-actin, microglobilin, G6PDH (Glucose-6-Phosphate-dehydrogenase) (Ullmannov V, 2003, Folia Biologica (Praha) 49, 211-216).
  • GAPDH GAPDH
  • beta-actin beta-actin
  • microglobilin G6PDH (Glucose-6-Phosphate-dehydrogenase) (Ullmannov V, 2003, Folia Biologica (Praha) 49, 211-216).
  • G6PDH Glucose-6-Phosphate-dehydrogenase
  • the present invention relates to a kit for the diagnosis, prognosis and follow-up of the disease and the establishment of the residual disease of CML or ALL. It recommends the use of new sets of probes and primers and a conventional PCR or multiplex reaction qPCR method for the detection and quantification of the BCR-ABL gene.
  • the present invention improves the other prior methods mentioned above and allows a) to gain in sensitivity by using new probes and primers BCR-ABL and ABL1 more specific and more sensitive than those cited in the prior art b) a reduction in terms of consumables and in time of realization as well as in reliability because the amplification of the genes BCR-ABL and ABL1 can be done simultaneously in the same well of qPCR c) to detect, contrary to the other methods of the prior art, the 2 variants of LMC b3a2 and b2a2, since the BCR-ABL probes and primers of the present invention are designated in such a manner as to detect both types of transcripts, which will allow a gain in overtime .
  • the quantification of the target genes is done in several steps a) realization of the standard curve generated by a calibrant dilution range consisting of a bacterial plasmid containing both a BCR-ABL gene sequence and ABL1 comprising the amplicons recognized on their corresponding cDNAs b) extrapolation of the copy number of the transcripts of the target genes from the standard curve given in (a) c) Calculation of the absolute copy number of the BCR-ABL gene and ABL1 and / or a ratio between the number of copies of BCR-ABL gene and ABL1 gene copy (BCR-ABL / ABL1) d) the evolution of this ratio before and during the treatment of CML or LLA, allows to confirm whether or not a patient responds to the treatments.
  • the primers allowing the detection of the BCR-ABL transcript in a sample test have oligonucleotide sequences selected from a group of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4, b) the primers for detecting the ABL1 control gene in a sample test have oligonucleotide sequences selected from a group of: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 8.
  • a) the probe for detect BCR-ABL in a sample test has a sequence: SEQ ID: 9
  • the probe to detect ABL1 in a sample test has a sequence SEQ ID: 10
  • the gene described above consists in putting the test sample in an amplification reaction in the presence of amplification reagent.
  • the amplification reaction can be at least a PCR, qPCR or RT-PCR.
  • at least one probe contains a fluorescent unit (reporter) attached to the 5 'region of DNA.
  • at least one probe may contain a quencher portion at the 3 'region of DNA. Quantification of the fluorescence unit allows quantification of the target gene (BCR-ABL or ABL1).
  • the amplification of BCR-ABL and ABL1 by the qPCR of the present invention can be carried out in simplex or multiplex reaction.
  • the present invention relates to a kit for the diagnosis, prognosis and monitoring of treatment and the establishment of the residual disease of CML and ALL.
  • the present invention relates to the use of probes, primers, primer sets, probe sets and primers that can be used to amplify, detect and quantify the BCR-ABL gene and the ABL1 control gene in a test sample.
  • the present invention also relates to the method of detecting BCR-ABL and ABL1 in a test sample using the sets of primers and probes mentioned above.
  • the sets of primers and probes of the present invention allow a better sensitivity and specificity to detect BCR-ABL and ABL1.
  • the amplification of BCR-ABL and the ABL1 control gene is at least qPCR in simplex or multiplexed format thus allowing a better quantification of BCR-ABL and a gain in time, reliability and cost are guaranteed.
  • the more sensitive and more specific quantification of BCR-ABL is done by extrapolation of the number of copies of the transcripts of the target genes from a standard curve.
  • the latter is generated by a calibrant dilution range consisting of a bacterial plasmid which contains both a BCR-ABL and ABL1 gene sequence comprising the amplicons recognized on their corresponding cDNAs.
  • This plasmid is called here V B CR-ABL / ABL- This will allow better monitoring of the treatment of CML and the residual disease.
  • the kit presented here includes:
  • the word 'BCR-ABL' or t (9.22) described in the present invention is a translocation between the ABL1 gene of chromosome 9 and the breakpoint cluster region (BCR) on chromosome 22.
  • the word 'MBCR' corresponds to the transcript and produces BCR-ABL translocation at the major translocation site
  • the word 'gene' refers to a nucleic acid sequence in the DNA molecule that occupies a specific region in a chromosome and permits the encoding of instructions for RNA synthesis.
  • the word gene amplification as used in this invention refers to one or more methods capable of copying a nucleic acid thereby allowing an increase in the number of copies of a target nucleic acid sequence.
  • the amplified sequence can be a deoxyribonucleic acid (DNA) or a ribonucleic acid (RNA).
  • the word 'oligonucleotide' as used herein is a sequence composed of DNA or RNA or their combination with a length that ranges from 10 to 70 nucleotides.
  • Oligonucleotides can be synthesized with various methods but not limited to that of 5'-3 'synthesis based on the use of beta-cyanoethyl phosphine protecting groups (Rosenthal et al., Terahedron Letter 24: 1691, 1983; Nude Acids Res 4: 1135, 1977) or the phosphochloridite method (Matteucci J AM CHEM SOC 103: 3185-91, 1981).
  • primer represents an oligonucleotide sequence that can be synthesized chemically or naturally.
  • the primer is the point of initiation of DNA synthesis under optimal temperature conditions and in the presence of specific complementary buffers, enzyme, nucleotides, and nucleotide sequences.
  • the word 'probe' represents a nucleotide sequence that forms a hybrid structure with a target sequence in a molecule of a test sample.
  • the word 'plasmid' represents a circular DNA of bacterial origin containing an origin of replication and an antibiotic resistance gene allowing selection.
  • 'reverse transcription' refers to a method for the synthesis of complementary DNA (cDNA) from an RNA molecule.
  • cDNA complementary DNA
  • the cDNA can be used in the PCR method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • oligonucleotide primers forward and reverse
  • unattached nucleotides eg dNTPs
  • the DNA polymerase enzyme preferably heat-resistant Taq polymerase
  • the solution is heated to 94-96 ° C to denature the DNA molecule and form 2 single strands of DNA.
  • the primers will then bind specifically to the single-stranded DNA thereby allowing the DNA polymerase to catalyze the attachment of the dNTPs to the primers.
  • the word 'RT-PCR' (reverse transcriptase-PCR) of the present invention represents a PCR method whose starting material is not directly DNA but an RNA translated into cDNA after reverse transcription.
  • qPCR quantitative PCR or real time RT-PCR
  • the term "qPCR” refers to a PCR method allowing the study of the PCR reaction products during the first DNA amplification steps.
  • the PCR products are detected by means of probes labeled at their 5 'ends by a transmitting fluorochrome (reporter), and at their 3' ends by a fluorescent or non-fluorescent quencher, which inhibits the emission of the reporter. when they are nearby.
  • the signal intensity of the fluorescence measured during the amplification reaction is proportional to the number of newly formed products (amplicons).
  • the measurement in DNA or cDNA is in logarithm.
  • Ct Chip Threshold
  • TaqMan uses the 5'exonuclease activity of the Taq polymerase enzyme to measure the amount of the DNA sequence in a test sample.
  • the “molecular beacon” quantifies the DNA by releasing fluorescence once hybridized on the target sequence.
  • qPCR is performed using TaqMan probes with an amplification analyzer such as ABI PRISM 7500HT 'Sequence Detection System' which is a screening system that can detect and quantify nucleic acids.
  • ABI PRISM 7500HT 'Sequence Detection System' which is a screening system that can detect and quantify nucleic acids.
  • the amount of BCR-ABL and ABL1 is calculated by the software built into the ABI PRISM 7500HT system using the standard curve method.
  • the reporter of the probe can be FAM, JOE, YAKYE YELLOW (YY) and the quencher BBQ, BHQ1, MGB1 or TAMRA.
  • the word 'standard curve' corresponds to a standard line which is a mathematical presentation of the Ct values obtained experimentally as a function of the log 10 of the fixed target molecule concentrations resulting from series of dilutions of a standard sample.
  • control gene or "reference gene” represents a gene generally similarly expressed by all cells of an organism.
  • control genes are glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), albumin, beta-actin, and ABL1.
  • simplex word of the present invention refers to a test that does not run concurrently with other tests.
  • simplex qPCR reflects the detection of the number of copies of a single gene in a reaction tube.
  • the multiplex word of the present invention refers to a test that runs concurrently with at least one other test.
  • the multiplexed qPCR reflects the detection of the number of copies of at least 2 genes in the same reaction tube.
  • the 2 BCR-ABL and ABL1 genes are simultaneously detected by qPCR.
  • test sample refers to a sample of blood, bone marrow, primary cells, cell lines or other tissues and where LMC or LLA cells or other leukemic cells expressing the BCR-ABL translocation.
  • the test sample of the present invention may be of human origin or other animal expressing the BCR-ABL and ABL1 gene which may be amplified using the primers and probes of the present invention.
  • the qPCR of the present invention makes it possible to determine the number of copies of the BCR-ABL gene in cells of the test sample by quantifying the number of copies of BCR-ABL relative to a control gene.
  • the gene that controls here is ABL1.
  • the efficiency of the qPCR reaction refers to the percentage of DNA molecules that undergo replication at each PCR cycle. An efficiency of 100% reflects a replication of all the target DNA molecules present in the reaction medium after each PCR cycle.
  • the word "limit of quantification" is the average of the BCR-ABL copy number values or the BCR-ABL / ABL1 copy ratio or the copy ratio ratio obtained with, at a minimum, a quarantine measurements made on at least 1 BCR-ABL positive samples whose quantity is known in a precise manner.
  • white limit corresponds to the background noise defined as being a replicate measurement of one or more samples not expressing the BCR-ABL gene (healthy donors).
  • detection limit is the smallest amount of the BCR-ABL transcript, or the BCR-ABL / ABL1 ratio, or the detectable BCR-ABL / ABL1 percentage, with acceptable uncertainty, but not quantified in the described experimental conditions of the method.
  • limit of quantification corresponds to the smallest amount of the BCR-ABL transcript, or the BCR-ABL / ABL 1 ratio, or the BCR-ABL / ABL1 percentage, which can be quantified, with an acceptable uncertainty, under the conditions described methods of the method.
  • Example 1 describes a protocol used in the qPCR assay of the present invention.
  • the protocol also describes the steps of RNA extraction and cDNA synthesis.
  • Example 2 describes a protocol for constructing the standard curve by qPCR. This example also shows the performance of the qPCR of the present invention.
  • a positive sample for the expression of the BCR-ABL gene represented by the human leukemic line (LMC) K562 and another negative represented by the line HL60 not expressing BCR-ABL are also presented.
  • the performance of the qPCR of the present invention is according to international IVD standards (R2> 0.95, slope between -3.0 and 3.9 and efficiency close to 100)
  • Example 3 shows the qPCR of the present invention in simplex or multiplexed format allows the separate or simultaneous detection of BCR-ABL and ABL1 with high accuracy.
  • a dilution series of plasmid V BC -ABL / ABL is used to construct the different standard curves
  • Example 4 describes a protocol for making a standard plate for analyzing CMC by qPCR using LMC patient samples.
  • Example 1 qPCR protocol of the present invention for the detection of
  • This process consists of several steps:
  • RNA extraction of cellular RNA is done with RNeasy mini kit from Qiagen according to the supplier's recommendations (Qiagen Inc).
  • the quality of the test is related to the quality of the initial RNA.
  • the degree of purification as well as the quality of the RNA are analyzed either on agarose gel electrophoresis or on Bioanalyzer (Agilant).
  • the cDNA is obtained from total RNA extracted from test sample.
  • the cDNA synthesis is carried out using the Thermocycler (Applied Biosystems) using the "RNA to cDNA Reverse Transcription" kit according to the recommendations of the Applied Biosystems supplier. In short, in a test tube and in a final volume of 20 ⁇ 3 ⁇ , mix:
  • reaction medium in a thermocycler using the following temperatures 25 ° C for 10min 37 ° C for 60 min 37 ° C for 60 min 84 ° C for 5s 4 ° C until use 3- The reaction of qPCR.
  • 3a Simplex format. It is made in a final volume of 25 ⁇ by mixing: 50 to 200 ng of the cDNA resulting from the reverse transcription.
  • the fluorescent TaqMan probe selected from the sequences, SEQ ID No. 9 (for the detection of transcripts of the BCR-ABL gene) or SEQ ID No. 10 (for the detection of transcripts of the ABL1 gene).
  • reaction medium in a 96-well plate placed in the thermal cycler making it possible to carry out the PCR reaction
  • detection of the fluorescence released during the reaction and the quantification of the amplified material (ABI PRISM 7500HT type thermocylator is an example of this. ).
  • the temperature cycles used for the reaction are:
  • reaction medium in a 96-well plate placed in the thermal cycler making it possible to carry out the PCR reaction
  • detection of the fluorescence released during the reaction and the quantification of the amplified material (ABI PRISM 7500HT type thermocylator is an example of this. ).
  • the temperature cycles used for the reaction are:
  • Example 2 Protocol of the construction of a standard curve by qPCR ( Figure 2).
  • the standard curve corresponds to a standard line which is a mathematical presentation of the Ct values obtained experimentally as a function of the logio of the fixed target molecule concentrations, resulting from series of dilutions of a sample standard.
  • the standard curve is used for the quantification of expression levels of the BCR-ABL and ABL1 genes. These quantifications are given as a copy number of the transcripts of each of the BCR-ABL and ABL1 genes.
  • the standard curve also allows the measurement of the efficiency of the PCR reaction and the correlation value R2.
  • the standard sample used here to prepare the dilution series corresponds to a bacterial plasmid called VBCR-ABL / ABL containing a fragment of the BCR-ABL gene and a fragment of the ABL1 gene comprising the amplicons recognized by the same sets of primer and probe. used for qPCR performed on a test sample.
  • the standard curve is made as follows:
  • the plasmid concentration of 137 ng / ⁇ is given as an example.
  • a qPCR reaction is performed as indicated above using only the dilution series of 10 6 to 10 plasmid copies (labeled in pink in the table above).
  • the value of Ct is therefore determined for each of the concentrations and a standard straight line is constructed by software integrated in the PCR apparatus used or by hand (see Figure 2).
  • the efficiency of the PCR reaction must be between 95% and 110% and the R2 value must always be greater than 0.95 according to international IVD standards.
  • This protocol uses the same qPCR protocol described in Example 1.
  • the transcripts of the BCR-ABL and ABL1 genes are amplified in two separate wells.
  • two different standard curves are made using plasmid V BC R-ABL / ABL with dilutions ranging from 10 6 to 10 1 .
  • a standard curve is made with the primers and probe recognizing the part of the BCR-ABL gene, and another with the primers and probe amplifying the part of the ABL1 gene.
  • the transcripts of the BCR-ABL and ABL1 genes are amplified in the same reaction well containing a mixture of the two sets of primers and probes recognizing both the BCR-ABL and ABL1 genes.
  • the two probes that specifically recognize the two different genes are labeled with two different fluorochromes.
  • the probe recognizing the BCR-ABL gene is labeled with the FAM fluorochromes while the ABL1 probe is labeled with Yakima Yellow fluorochromes.
  • Example 4 Protocol for Making a Typical CML Analysis Plate Using LMC Patient Samples ( Figure 4).
  • the table below describes a schematic presentation of a qPCR type plate in multiplex format for the analysis of the presence or absence of the BCR-ABL gene characteristic of the CML.
  • the dilution series of plasmid V BC . AB L / ABL generating the standard curve is shown in the first line of the plate.
  • Each of the samples, including the plasmid of the standard curve, is analyzed in duplicate for better accuracy.
  • the positive control K562 cell line RNA
  • the negative HL60 cell line RNA
  • the N RT Negative Reverse Transcription
  • the NAC No Amplification Controi

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Abstract

La présente invention concerne un kit de diagnostic in vitro pour l'identification et la quantification de la translocation génétique BCR-ABL présent dans le cas de leucémie myéloïde chronique (LMC) et la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA). Le présent kit est composée d'une combinaison innovante de nouveaux sets d'amorces et de sondes et d'une série de dilution plasmidique calibrant permettant la détection spécifique et la quantification du gène BCR-ABL et du gène de référence ABLl en utilisant la méthode de PCR en temps réel (qPCR) en format multiplex ou simplex. Le présent kit est destiné pour le diagnostic, le suivi du traitement et l'établissement de la maladie résiduelle dans le cas de la LMC et LLA.

Description

KIT DE DIAGNOSTIC DE LA LEUCEMIE MYELOIDE CHRONIQUE EN REACTION MULTIPLEX ET SES APPLICATIONS DANS LE SUIVI DU TRATEMENT ET DE LA MALADIE RESIDUELLE
Domaine de l'invention :
La présente invention concerne un kit de diagnostic in vitro pour l'identification et la quantification de la translocation génétique BCR-ABL présent dans le cas de leucémie myéloïde chronique (LMC) et la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA). Le présent kit est composée d'une combinaison innovante de nouveaux sets d'amorces et de sondes et d'une série de dilution plasmidique calibrant permettant la détection spécifique et la quantification du gène BCR-ABL et du gène de référence ABL1 en utilisant la méthode de PCR en temps réel (qPCR) en format multiplex ou simplex. Le présent kit est destiné pour le diagnostic, le suivi du traitement et l'établissement de la maladie résiduelle dans le cas de la LMC et LLA.
Description de l'art antécédent
La leucémie myéloïde chronique fait partie des maladies du sang regroupées sous le nom de « syndromes myéloprolifératifs ». Elle se caractérise par une production excessive et persistante au sein de la moelle osseuse des globules blancs. La LMC est liée à l'apparition d'une anomalie associée à la fusion de deux chromosomes des cellules souches de la moelle osseuse, provoquant l'apparition d'un petit chromosome anormal, le chromosome Philadelphie. Cette anomalie résulte de l'assemblage par erreur d'un gène du chromosome 9, dénommée ABL, avec un gène du chromosome 22, nommé BCR (Shtivelman, 1985. Nature 1985; 315:550-4). Cela produit le gène dit BCR-ABL qui est présent uniquement dans les cellules malades. Ce gène produit anormalement une enzyme, la tyrosine kinase, elle même responsable de la production accrue des globules blancs. En effet la translocation génétique BCR-ABL est présent dans 95% des cas LMC et 10% LLA.
Le critère fondamental du diagnostic de la LMC ou LLA est la présence de gène de fusion BCR-ABL, qui peut être mis en évidence par des méthodes cytogénétiques actuelles comme celles du caryotype, la FISH (Fluorescent in situe hybridation) ou d'examens hématologiques. Cependant, ces méthodes manquent surtout d'essais quantitatifs et qualitatifs, elles sont moins spécifiques, utilisent des hybridations complexes ou des isotopes, prennent énormément de temps (plusieurs jours), peuvent être invasives (utilisation de la moelle osseuse), ou plus coûteuses. De plus, ces méthodes cytogénétiques peuvent détecter seulement une cellule LMC sur 500 cellules et donc ne peuvent pas être utilisées dans le cas du suivie de traitement de la LMC ni dans le cas de la maladie résiduelle qui nécessite une grande sensibilité (détection d'une cellule LMC sur 100000 cellules).
C'est pour ces raisons que la recherche d'autres méthodes de quantification de BCR-ABL devient une nécessité. Ces méthodes doivent présenter plus de sensibilité et de fiabilité, une meilleure répetabilité quantitative et qualitative. De plus, elles doivent être moins coûteuses que les méthodes de l'art antérieur et capables de détecter facilement la maladie résiduelle. Une méthode alternative à l'art antérieur décrit ci-dessus est la PCR quantitative en temps réel (qPCR) qui a été bien décrite auparavant pour l'amplification et la détection de différents gènes dont BCR-ABL (Fossey S et al ; Mol Diagn. 2005;9(4):187-93; Gibson et al, 1996 Genomic Res 6 :995-1001).
Pour la quantification d'un gène cible, la qPCR utilise en parallèle un gène contrôle exprimé de manière ubiquitaire dans toutes les cellules du corps et qui facilitera la normalisation et la quantification du gène cible. Dans le cas de BCR-ABL, plusieurs gènes contrôles ont été testés comme GAPDH, beta-actine, microglobiline, G6PDH (Glucose-6-Phosphate- Déshydrogénase) (Ullmannov. V, 2003 ; Folia Biologica (Praha) 49, 211-216 (2003). Plus tard, une étude incluant 38 laboratoires Nord Américains a étudié certains gènes contrôles en parallèle pour quantifier BCR-ABL (Tong et al ; 2007 ; Journal of molecular Diagnostics, vol 9, N4 : p 421-429). Dans cette étude, l'amplification et la détection de BCR-ABL et les gènes contrôles a été faite avec des séquences nucléotidiques spécifiques tout en utilisant la qPCR en format simplex. Avec cette méthode, la sensibilité et le cout reste raisonnables et meilleure que l'art antérieur.
Il est souhaitable d'identifier une méthode de qPCR pour quantifier BCR-ABL qui peut être encore plus sensible et plus fiable mais surtout moins coûteuse que l'art antérieur décrit ci- dessus.
Expose de l'invention. La présente invention concerne un kit pour le diagnostic, le pronostic et le suivie de la maladie et l'établissement de la maladie résiduelle de la LMC ou LLA. Elle préconise l'utilisation de nouveaux sets de sondes et d'amorces et d'un procédé de PCR conventionnelle ou qPCR en réaction multiplexe pour la détection et la quantification du gène BCR-ABL.
La présente invention améliore les autres méthodes antérieures citées ci-dessus et permet a) de gagner en sensibilité en utilisant des nouvelles sondes et amorces de BCR-ABL et ABL1 plus spécifiques et plus sensibles que celles citées dans l'art antérieur b) une réduction en cout de consommables et en temps de réalisation ainsi qu'en fiabilité car l'amplification des gènes BCR-ABL et de ABL1 peut se faire simultanément dans le même puits de qPCR c) de détecter, à l'inverse des autres méthodes de l'art antérieur, les 2 variants de la LMC b3a2 et b2a2, étant donné que les sondes et amorces de BCR-ABL de la présente invention sont désignées de tel manière à détecter les 2 types de transcrits, ce qui permettra un gain en temps supplémentaire.
Selon une caractéristique de l'invention, la quantification des gènes cibles se fait en plusieurs étapes a) réalisation de la courbe standard générée par une gamme de dilution de calibrant constituée d' un plasmide bactérien contenant à la fois une séquence du gène BCR-ABL et ABL1 comprenant les amplicons reconnus sur leurs ADNc correspondants b) extrapolation du nombre de copie des transcrits des gènes cibles à partir de la courbe standard cité en (a) c) Calcul du nombre de copie absolu du gène BCR-ABL et d'ABLl et/ou d'un rapport entre le nombre de copie de gène BCR-ABL et de copie du gène ABL1 (BCR-ABL/ABLl) d) l'évolution de ce rapport avant et durant le traitement de la LMC ou LLA, permet de confirmer si un patient répond ou non aux traitements. Une réduction du rapport BCR-ABL/ABLl après traitement suggère une réponse positive e) en accordance avec (d), le rapport BCR-ABL/ABLl permet aussi de détecter la maladie résiduelle, difficile à détecter avec les méthodes antérieures, en raison de leur faible sensibilité de détection.
Selon une autre caractéristique de l'invention, a) les amorces permettant la détection du transcrit BCR-ABL dans un test échantillon ont des séquences d'oligonucleotides sélectionnées parmi un groupe de : SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3, et SEQ ID NO :4, b) les amorces pour détecter le gène contrôle ABL1 dans un test échantillon ont des séquences d'oligonucleotides sélectionnées parmi un groupe de : SEQ ID NO :5, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7, et SEQ ID NO :8. En accord avec cette invention, a) la sonde pour détecter BCR-ABL dans un test échantillon a une séquence : SEQ ID : 9. b) la sonde pour détecter ABL1 dans un test échantillon a une séquence SEQ ID : 10
En accord avec la méthode d'amplification de la présente invention, le gène décrit ci dessus consiste à mettre le test échantillon dans une réaction d'amplification en présence de réactif d'amplification. La réaction d'amplification peut être au moins une PCR, qPCR ou RT-PCR. Selon cette invention et en accordance avec, au moins une sonde contient une unité fluorescente (reporter) attachée à la région 5' d'ADN. En plus au moins une sonde peut contenir une partie quencher à la région 3' d'ADN. La quantification de l'unité fluorescence permet la quantification du gène cible (BCR-ABL ou ABL1).
Selon une autre caractéristique de l'invention, l'amplification de BCR-ABL et ABL1 par la qPCR de la présente invention peuvent se faire en réaction simplex ou multiplex.
EXPOSE DETAILLE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un kit pour le diagnostic, le pronostic et le suivie du traitement et l'établissement de la maladie résiduelle de la LMC et LLA.
La présente invention concerne l'utilisation des sondes, amorces, set d'amorces, set de sondes et amorces qui peuvent être utilisés pour amplifier, détecter et quantifier le gène BCR-ABL et le gène contrôle ABL1 dans un échantillon test.
La présente invention concerne aussi la méthode de détection de BCR-ABL et d'ABLl dans un échantillon test en utilisant les sets d'amorces et sondes cités ci-dessus. Les sets d'amorces et sondes de la présente invention permettent une meilleure sensibilité et spécificité pour détecter BCR-ABL et ABL1.
Selon la présente invention, l'amplification de BCR-ABL et du gène contrôle ABL1 se fait au moins en qPCR en format simplex ou multiplexe permettant ainsi une meilleure quantification de BCR-ABL et un gain en temps, fiabilité et en coût sont garanties.
Selon une autre caractéristique de l'invention, la quantification plus sensible et plus spécifique de BCR-ABL se fait par extrapolation du nombre de copie des transcrits des gènes cibles à partir d'une courbe standard. Cette dernière est générée par une gamme de dilution de calibrant constitués par un plasmide bactérien qui contient à la fois une séquence du gène BCR-ABL et ABL1 comprenant les amplicons reconnus sur leurs ADNc correspondants. Ce plasmide est dénommé ici VBCR-ABL/ABL- Cela permettra un meilleur suivi du traitement de la LMC ainsi que la maladie résiduelle.
Le kit présenté ici comprend :
a) six tubes contenant chacun une concentration précise du plasmide VBCR-ABL/ABL allant du 106 à 10 copies de plasmide. Ces tubes constituent la série de dilution du calibrant qui va générer la courbe standard de quantification.
b) un tube contenant un mélange de 6μΜ de l'amorce « forward » BCR-ABL, 6μΜ de l'amorce « reverse » BCR-ABL, 4Ι3μΜ de la probe BCR-ABL, 6μΜ de l'amorce « forward » ABL1, 6μΜ de l'amorce « reverse » ABL1 et 40μΜ de la probe pour ABL1.
d) un tube contenant un ARN extrait de la lignée positive pour BCR-ABL constituant le contrôle positif.
e) un tube contenant un ARN extrait de la lignée négatif pour BCR-ABL constituant le contrôle négatif.
Le mot 'BCR-ABL' ou t(9,22) décrit dans la présente invention est une translocation entre le gène ABL1 du chromosome 9 et le breakpoint cluster région (BCR) sur le chromosome 22.
Le mot 'MBCR' correspond au transcrit produis de la translocation BCR-ABL au niveau du site majeur de translocation
Le mot 'gène' réfère à une séquence d'acide nucléique dans la molécule d'ADN qui occupe une région précise dans un chromosome et permet de coder les instructions pour la synthèse de l'ARN.
Le mot amplification de gène comme utilisé dans cette invention réfère à une ou plusieurs méthodes capables de copier un acide nucléique permettant ainsi une augmentation du nombre de copie d'une séquence d'acide nucléique cible. La séquence amplifiée peut être un acide desoxyribonucléique (ADN) ou un acide ribonucléique (ARN). Le mot 'oligonucléotide' comme utilisé ici est une séquence composée d'ADN ou d'ARN ou leur combinaison avec une longueur qui varie de 10 à 70 nucléotides. Les oligonuclétides peuvent être synthétisés avec différentes méthodes mais pas limitées à celle de la synthèse 5'-3' basée sur l'utilisation des groupes protégeant beta-cyanoethyl phosphine (Rosenthal et al, Terahedron Letter 24 : 1691, 1983; Gait et al, Nue Acids Res 4: 1135, 1977) ou la méthode des phosphochloridites (Matteucci J AM CHEM SOC 103: 3185-91, 1981).
Le mot 'amorce' représente une séquence d'oligonucléotides qui peut être synthétisée chimiquement ou naturellement. L'amorce est le point d'initiation de la synthèse d'ADN dans des conditions optimales de température et en présence de tampons, d'enzyme, de nucléotides et de séquences nucléotidiques complémentaires spécifiques.
Le mot 'sonde' représente une séquence nucléotidique qui forme une structure hybride avec une séquence cible dans une molécule d'un échantillon test.
Le mot 'plasmide' représente un ADN circulaire d'origine bactérienne contenant une origine de réplication et un gène de résistance à un antibiotique permettant la sélection.
Le mot 'transcription inverse' comme utilisé dans cette invention réfère à une méthode permettant la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc) à partir de molécule d'ARN. L'ADNc peut être utilisée dans la méthode PCR.
Le mot 'PCR' (polymerase chain reaction) de la présente invention réfère à une méthode dont un échantillon d'ADN ou ADNc est ajouté dans une solution en présence de 2 oligonucleotides amorces (forward et reverse) ; de nucléotides non attachés (exemple les dNTPs) ; et de l'enzyme ADN polymérase (préférablement la Taq polymérase qui résiste à la chaleur) qui catalyse la formation d'ADN à partir des 2 amorces et dNTPs. La solution est chauffée à 94-96 C° pour dénaturer la molécule d'ADN et former 2 simples brins d'ADN. Les amorces vont ensuite se fixer spécifiquement sur l'ADN simple brin permettant ainsi à l'ADN polymérase de catalyser l'attachement des dNTPs aux amorces. Le mot 'RT-PCR' (reverse transcriptase-PCR) de la présente invention représente une méthode de PCR dont le produit de départ n'est pas directement un ADN mais un ARN traduit en ADNc après transcription inverse.
Le mot 'qPCR' (quantitative PCR ou real time RT-PCR) cité dans la présente invention réfère à une méthode de PCR permettant l'étude des produits de la réaction PCR durant les premières étapes d'amplification de l'ADN. La détection des produits de PCR se fait grâce à des sondes marquées à leurs extrémités 5' par un fluorochrome émetteur (reporter), et à leurs extrémités 3' par un fluorochrome suppresseur (quencher) fluorescent ou non, qui inhibe l'émission du reporter lorsqu'ils sont à proximité. De ce fait, l'intensité du signal de la fluorescence mesurée au cours de la réaction d'amplification est proportionnelle au nombre de produits nouvellement formés (amplicons). La mesure en ADN ou ADNc se fait en logarithme. Pour déterminer la positivité d'une PCR et/ou quantifier un échantillon par qPCR, on détermine le nombre de cycles à partir duquel le produit PCR est détectable. Le moment d'apparition de ce signal seuil dénommé cycle seuil ou Ct (Cycle Threshold) est dépendant de la quantité de matrice initialement présente dans l'échantillon amplifié. Le Ct calculé est inversement proportionnel au logarithme décimal du nombre de copies initiales.
Parmi les sondes les plus utilisées en qPCR on trouve les sondes TaqMan et « molecular beacons ». La TaqMan utilise l'activité 5'exonucléase de l'enzyme Taq polymerase pour mesurer la quantité de la séquence d'ADN dans un échantillon test. Tandis que le « molecular beacon » quantifie l'ADN en libérant de la fluorescence une fois hybridé sur la séquence cible.
Préférentiellement, dans la présente invention, la qPCR est réalisée en utilisant les sondes TaqMan avec un analyseur d'amplification comme ABI PRISM 7500HT 'séquence détection System' qui est un système de screening qui peut détecter et quantifier des acides nucléiques. La quantité de BCR-ABL et ABL1 est calculée par le logiciel intégré dans le système ABI PRISM 7500HT en utilisant la méthode de la courbe standard. Selon une autre caractéristique de la présente invention, le reporteur de la sonde peut être FAM, JOE, YAKYE YELLOW (YY) et le quencher BBQ, BHQ1, MGB1 ou TAMRA. Le mot 'courbe standard' correspond à une droite standard qui est une présentation mathématique des valeurs de Ct obtenues expérimentalement en fonction du log10 des concentrations en molécules cibles fixées, issues de séries de dilutions d'un échantillon standard.
Le mot 'gène contrôle' ou 'gène de référence' représente un gène exprimé en général da façon similaire par toutes les cellules d'un organisme. Parmi les gènes contrôle, on trouve le glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), l'albumine, la beta-actine, et ABL1.
Le mot simplex de la présente invention réfère à un essai qui ne se déroule pas simultanément avec d'autres essais. Dans notre invention, la qPCR en simplex reflète la détection du nombre de copies d'un seul gène dans un tube de réaction.
Le mot multiplex de la présente invention réfère à un essai qui se déroule simultanément avec au moins un autre essai. La qPCR en multiplexe reflète la détection du nombre de copies d'au moins 2 gènes dans un même tube de réaction. Par exemple, dans la présente invention, les 2 gènes BCR-ABL et ABL1 sont détectés simultanément par qPCR.
Le mot 'échantillon test' comme utilisé dans la présente invention réfère à un échantillon de sang, de moelle osseuse, de cellules primaires, lignées cellulaires ou autre tissus et où des cellules LMC ou LLA ou autres cellules leucémiques exprimant la translocation BCR-ABL. L'échantillon test de la présente invention peut être d'origine humaine ou autre animal exprimant le gène BCR-ABL et ABL1 qui peuvent être amplifié en utilisant les amorces et sondes de la présente invention.
La qPCR de la présente invention permet de déterminer le nombre de copies du gène BCR- ABL dans des cellules de l'échantillon test en quantifiant le nombre de copies de BCR-ABL relative à un gène contrôle. Le gène contrôle ici est ABL1.
Le mot efficacité de la réaction de la qPCR réfère au pourcentage des molécules d'ADN subissant une réplication à chaque cycle de PCR. Une efficacité de 100% reflète une réplication de toutes les molécules d'ADN cibles présent dans le milieu réactionnel après chaque cycle de PCR. Le mot « limite de quantification » correspond à la moyenne des valeurs de nombre de copies de BCR-ABL ou du rapport de copie du BCR-ABL/ABL1 ou bien du pourcentage de rapport de nombre de copies obtenues avec, au minimum, une quarantaine de mesures effectuées sur au moins 1 échantillons positifs pour BCR-ABL dont la quantité est connu d'une façon précise.
Le mot « limite du blanc » : correspond au bruit de fond définit comme étant un réplicat de mesure de un ou plusieurs échantillons n'exprimant pas le gène BCR-ABL (donneurs sains).
Le mot «limite de détection » correspond à la plus petite quantité du transcrit BCR-ABL ,ou du ratio BCR-ABL/ ABL1 , ou du pourcentage BCR-ABL/ ABL1, pouvant être détectée, avec une incertitude acceptable, mais non quantifiée dans les conditions expérimentales décrites de la méthode .
Le mot «limite de quantification » correspond à la plus petite quantité du transcrit BCR-ABL, ou du ratio BCR-ABL/ ABL 1, ou du pourcentage BCR-ABL/ ABL1, pouvant être quantifiée, avec une incertitude acceptable, dans les conditions expérimentales décrites de la méthode .
L'exemple 1 décrit un protocole utilisé dans le test de qPCR de la présente invention. Le protocole décrit aussi les étapes d'extraction d'ARN et de synthèse d'ADNc.
Exemple 2 décrit un protocole de construction de la courbe standard par qPCR. Cet exemple montre aussi la performance de la qPCR de la présente invention. Un échantillon positif pour l'expression du gène BCR-ABL représenté par la lignée leucémique (LMC) humaine K562 et une autre négative représentée par la lignée HL60 n'exprimant pas du BCR-ABL sont aussi présentés.
La performance de la qPCR de la présente invention est suivant les normes IVD internationales (R2>0,95, pente entre -3,0 et 3,9 et efficacité proche de 100)
L'exemple 3 montre la qPCR de la présente invention en format simplex ou multiplexe permet la détection séparée ou simultanée de BCR-ABL et ABL1 avec une grande précision. Une série de dilution du plasmide VBC -ABL/ABL est utilisée pour construire les différentes courbes standards Exemple 4 décrit un protocole de réalisation d'une plaque-type d'analyse de la LMC par qPCR en utilisant des échantillons de patient LMC.
EXPERIENCES
Exemple 1 : Protocole de qPCR de la présente invention pour la détection de
BCR-ABL et ABL1 (Figure 1)
Ce procédé est constitué de plusieurs étapes :
1- Extraction de l'ARNm totale cellulaire
L'extraction de l'ARN cellulaire se fait avec RNeasy mini kit de Qiagen suivant les recommandations du fournisseur (Qiagen Inc). La qualité du test est liée à la qualité de l'ARN initiale. De ce fait, le degré de la purification ainsi que la qualité de l'ARN sont analysés soit sur électrophorèse en gel d'agarose ou sur Bioanalyzer (Agilant).
2- Synthèse de l'ADNc par transcription inverse.
L'ADNc est obtenue à partir d'ARN total extrait d'échantillon test. La synthèse d'ADNc est réalisée à l'aide du Thermocycieur (Applied Biosystems) en utilisant le kit «RNA to cDNA Reverse Transcription» suivant les recommandations du fournisseur Applied Biosystems. En bref, dans un tube à essai et dans un volume final de 20Ε3μΙ, mélanger :
1-2 μg de l'ARN (maximum 14.2 μΙ total de l'ARN)
0.8 μΙ de dNT Mix (lOOmM)
2(2μΙ de 10X RT random primers
2μΙ de 10X RT Buffer
ΙΙΕμΙ de MultiScribe reverse transcriptase Qsp Nuclease free H20 20μΙ
Mettre le milieu réactionnel dans un thermocycieur en utilisant les températures suivantes 25°C pour 10min 37°C pour 60 min 37°C pour 60 min 84°C pour 5s 4°C jusqu'à utilisation 3- La réaction de qPCR.
3a. Format simplex. Il est réalisé dans un volume final de 25μΙ en mélangeant: 50 à 200ng de l'ADNc issu de la transcription inverse.
300 nM (2,5 μΙ d'une solution mère de 3μΜ) de l'amorce « Forward » sélectionnée parmi les séquences, SEQ ID N° 1 et SEQ ID N°2 (pour la détection des transcrits du gène BCR-AB) ou bien les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 (pour la détection des transcrits du gène ABL1).
300 nM (2,5 μΙ d'une solution mère de 3μΜ) de l'amorce « Reverse » sélectionnée parmi les séquences, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N"4 (pour la détection des transcrits du gène BCR-AB) ou bien les séquences SEQ ID N°7 ou SEQ ID N°8 (pour la détection des transcrits du gène ABL1).
200nM (2,5 μΙ d'une solution mère de 2μΜ) de la Sonde TaqMan fluorescente sélectionnée parmi les séquences, SEQ ID N° 9 (pour la détection des transcrits du gène BCR-ABL) ou bien SEQ ID N°10 (pour la détection des transcrits du gène ABL1).
12,5 μΙ du TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2x) contenant tous les éléments nécessaires pour la réalisation de la réaction de polymérisation à savoir l'enzyme ADN polymérase, les dNTPs et le tampon de la réaction avec des quantités optimales.
Mettre le milieu réactionnel dans une plaque 96 puits placée dans le thermocycleur permettant la réalisation de la réaction de PCR, la détection de la fluorescence libérée au cours de la réaction et la quantification du matériel amplifié (thermocyleur de type ABI PRISM 7500HT en est un exemple). Les cycles de température utilisés pour la réaction sont :
95°C pour 20s (1 cycle) 95°C pour ls et 60°C pour 30s (50 cycles)
3b. Format multiplex (duplex). Il est réalisé dans un volume final de 25μΙ en mélangeant: 50 à 200ng de l'ADNc issu de la transcription inverse.
300 nM (1,25 μΙ d'une solution mère de 6μΜ) de l'amorce « Forward » sélectionnée parmi les séquences, SEQ ID N° 1 et SEQ ID N°2 (pour la détection des transcrits du gène BCR-AB) et les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 (pour la détection des transcrits du gène ABL1).
300 nM (1,25 μΙ d'une solution mère de 6μΜ) de l'amorce « Reverse » sélectionnée parmi les séquences, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N°4 (pour la détection des transcrits du gène BCR-AB) et les séquences SEQ ID IM°7 ou SEQ ID N°8 (pour la détection des transcrits du gène ABL1).
200nM (1,25 μΙ d'une solution mère de 4μΜ) de la Sonde TaqMan fluorescente correspondant à la SEQ ID N° 9 (pour la détection des transcrits du gène BCR-ABL) et 300nM (1,25 μΙ d'une solution mère de 6μΜ) de la Sonde TaqMan fluorescente correspondant à la SEQ ID N°10 (pour la détection des transcrits du gène ABL1).
12,5 μΙ du TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2x) contenant tous les éléments nécessaires pour la réalisation de la réaction de polymérisation à savoir l'enzyme ADN polymérase, les dNTPs et le tampon de la réaction avec des quantités optimales.
Mettre le milieu réactionnel dans une plaque 96 puits placée dans le thermocycleur permettant la réalisation de la réaction de PCR, la détection de la fluorescence libérée au cours de la réaction et la quantification du matériel amplifié (thermocyleur de type ABI PRISM 7500HT en est un exemple). Les cycles de température utilisés pour la réaction sont :
95°C pour 20s (1 cycle)
95°C pour ls et 60°C pour 30s (50 cycles)
Exemple 2. : Protocole de la construction d'une courbe standard par qPCR (Figure 2).
La courbe standard correspond à une droite standard qui est une présentation mathématique des valeurs de Ct obtenues expérimentalement en fonction du logio des concentrations en molécules cibles fixées, issues de séries de dilutions d'un échantillon standard. La courbe standard est utilisée pour la quantification des taux d'expression des gènes BCR-ABL et ABLl. Ces quantifications sont données sous forme de nombre de copies des transcrits de chacun des gènes BCR-ABL et ABLl.
Outre la quantification, la courbe standard permet aussi la mesure de l'efficacité de la réaction de PCR et de la valeur de corrélation R2. L'échantillon standard utilisé ici pour préparer les séries de dilution correspond à un plasmide bactérien dénommé VBCR-ABL/ABL contenant un fragment du gène BCR-ABL et un fragment du gène ABLl comprenant les amplicons reconnus par les mêmes sets d'amorce et sonde utilisés pour la qPCR effectuée sur un échantillon test.
La courbe standard est réalisée de la manière suivante:
A partir d'une solution mère contenant 1010 copies de plasmide VBCR.ABL/ABL, une série de dilution allant jusqu'à 10 copies est préparée comme indiqué sur le tableau suivant
La concentration de plasmide de 137 ng/μΙ est donnée à titre d'exemple.
Figure imgf000014_0001
Une réaction de qPCR est effectuée comme indiqué ci-dessus en utilisant seulement les séries de dilution de 106 à 10 copies de plasmide (marqué en rose sur le tableau ci-dessus). La valeur de Ct est donc déterminée pour chacune des concentrations et une droite standard est construite par un logiciel intégré dans l'appareil de PCR utilisée ou à la main (Voir Figure 2). Pour que la courbe standard soit valide l'efficacité de la réaction de la PCR doit être comprise entre 95% et 110% et la valeur R2 doit être toujours supérieure à 0,95 selon les normes IVD internationales.
Exemple 3 Protocole de la qPCR de la présente invention en format simplex ou multiplexe (Figure 3)
Ce protocole utilise le même protocole de la qPCR décrit en Exemple 1. Pour le format simplex les transcrits des gènes BCR-ABL et ABLl sont amplifiés dans deux puits séparés. De ce faite, deux différentes courbes standard sont réalisées en utilisant le plasmide VBCR-ABL/ABL avec des dilutions allant de 106 à 101. Une courbe standard est réalisée avec les amorces et sonde reconnaissant la partie du gène BCR-ABL, et une autre avec les amorces et sonde amplifiant la partie du gène ABLl. Pour le format duplex, les transcrits des gènes BCR-ABL et ABLl sont amplifies dans le même puits réactionnel contenant un mélange des deux sets d'amorces et sondes reconnaissant à la fois les gènes BCR-ABL et ABLl. Dans ce cas, une seule courbe standard est réalisée avec des dilutions de plasmide VBCR-ABi ABL allant de 105 à 101 copies. Les deux sondes qui reconnaissent spécifiquement les deux différents gènes sont marquées par deux fluorochromes différents. Dans cet exemple, la sonde reconnaissant le gène BCR-ABL est marquée par le fluorochromes FAM tandis que la sonde d'ABLl est marquée par le fluorochromes Yakima Yellow.
Exemple 4: Protocole de la réalisation d'une plaque type d'analyse de la LMC en utilisant des échantillons de patient LMC (Figure 4).
Le tableau ci-dessous décrit une présentation schématique d'une plaque-type de qPCR en format multiplex pour l'analyse de la présence ou non du gène BCR-ABL caractéristique de la LMC. La série de dilution du plasmide VBC .ABL/ABL générant la courbe standard est représentée dans la première ligne de la plaque. Chacun des échantillons, y compris le plasmide de la courbe standard, est analysé en duplicat pour une meilleure précision. Le contrôle positif (ARN de la lignée cellulaire K562), le négatif (ARN de la lignée cellulaire HL60), le N RT (Négatif Reverse Transcription) et le NAC (No Amplification Controi) qui contient de l'eau à la place de l'acide nucléique sont mis dans la dernière ligne de la plaque. La réaction de la qPCR est effectuée dans les mêmes conditions décrites dans l'Exe ple 1. Puisque la réaction est réalisée dans son format duplex, le Master Mix de la réaction doit contenir les deux sets des amorces et sondes reconnaissant les deux gènes BCR-ABL et ABL.
Figure imgf000016_0001

Claims

Revendications :
1. Kit pour le diagnostic, le pronostic, le suivie du traitement et l'établissement de la maladie résiduelle dans le cas de LMC et LLA caractérisé en ce que ledit kit utilise la technologie de qPCR ou PCR conventionnelle pour la détection et la quantification du gène BCR-ABL et ABLl en format multiplex ou simplex selon la procédure suivante : a) Mélange de l'ADNc synthétisé à partir de l'ARNm extrait d'un échantillon test avec un mastermix contenant tous les réactifs nécessaire pour la détection spécifique en condition multiplex ou simplex d'un amplicon au sein du gène BCR-ABL et du gène ABLl. b) Préparation d'une gamme de calibrant constituée par une série de dilutions d'un vecteur plasmidique bactérien contenant à la fois une séquence du gène BCR-ABL et ABLl. Ces séquences comprennent les amplicons reconnus sur les ADNc des deux gènes. Les différentes dilutions contiennent un nombre de copie prédéterminé du vecteur allant de 106 à 101 pour la gamme d'étalonnage de l'ampiicon BCR-ABL et ABLl en format multiplex et de 106 à 101 pour BCR-ABL et de 106 à 103 pour ABLl dans le cas de réaction en simplex. c) application des cycles thermiques pour la réalisation de la PCR conventionnelle ou la qPCR. d) analyse du produit de la qPCR et extrapolation du nombre de copie de l'ADNc de BCR- ABL et d'ABLl de l'échantillon test à partir de la gamme d'étalonnage.
2. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que le Mastermix contient une combinaison d'amorces constituée : pour BCR-BL d'une amorce «forward» ayant des séquences sélectionnées parmi le groupe de séquences [SEQ ID N° 1 , SEQ ID l\T 2] , d'une amorce «reverse» sélectionnée parmi le groupe de séquences [SEQ ID NT 3, SEQ ID N° 4], la sonde de détection SEQ ID N° 9 ; pour ABLl d'une amorce «forward» ayant des séquences sélectionnées parmi le groupe de séquences [SEQ ID N° 5 , SEQ ID N° 6], d'une amorce «reverse» sélectionnée parmi le group de séquences [SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8] et la sonde de détection SEQ ID N° 10.
3. Kit selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la sonde de détection des transcrits de gènes BCR-ABL et ABL en qPCR soient attachées à des entités fluorescentes (reporters) et non fluorescentes (quenchers). Le reporteur peut être FAM, JOE, YY, VIC ou similaire, attaché à l'extrémité 5' et le quencher peut être BBQ, BHQ1, GB ou TAMRA ou similaire attaché à l'extrémité 3'.
4. Kit selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la détection des gènes BCR- ABL et ABL1 dans un échantillon test est effectuée par qPCR ou PCR conventionnelle en format multiplex ou simplex.
5. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que : a) l'ADN plasmidique de la gamme de dilution du calibrant est linéarisé par une enzyme de restriction ayant un site unique sur le plasmide
b) l'ADNc et l'ADN plasmidique de la gamme d'étalonnage sont préparés dans un milieu de dilution comportant en outre des acides nucléiques ne présentant pas d'homologie avec les séquences d'intérêt de l'ADNc et du calibrant
c) l'acide nucléique utilisé pour la dilution peut être de l'ADN génomique, l'ADN plasmidique circulaire ou linéarisé ou de l'ARN.
6. Kit selon la revendication 1, caractérisé a ce que :
a) l'ARNm est extrait a partir d'un échantillon test, ainsi sa concentration et sa pureté sont mesurées par électrophorèse, nanodrop ou bien bioanalyser
b) l'ARNm est converti en une copie d'ADN (ADNc) par le biais d'une transcription inverse.
7. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que :
a) la quantification du nombre de copie de l'ADNc des gènes BCR-ABL et ABL1 est effectuée par extrapolation à partir de la courbe standard générée par la gamme de dilution du calibrant
b) la quantification des transcrits des gènes BCR-ABL et ABL1 s'effectue soit en calculant le nombre des copies absolues de chacun des gènes BCR-ABL et ABL1 ou bien calculer un rapport de nombre de copies de BCR-ABL sur le nombre des copies d'ABLl pour le même échantillon ou bien un pourcentage de rapport de nombre de copies.
8. Kit selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le nombre de copie absolu de chacun des transcrits de gènes BCR-ABL et ABLl ou le rapport du nombre de copie du BCR-ABL sur le nombre de copies d'ABLl ou bien le pourcentage de rapport de nombre de copies est comparé à une limite de détection et une limite de quantification.
9. Kit selon les revendications 1 à 8 caractérisé en ce que la décision prise pour l'arrêt ou non de la LMC ou LLA dépend de la valeur obtenue du nombre de copie de BCR- ABL ou du rapport BCR-ABL /ABLl ou bien du pourcentage de rapport de nombre de copies et sa position par apport aux deux limites de quantification et de détection.
10. Kit selon les revendications 1 à 9 caractérisé en ce que : a) un échantillon test de LMC ou LLA est considéré positif pour BCR-ABL lors que la valeur obtenue du nombre de copie de BCR-ABL ou du rapport BCR-ABL /ABLl ou bien du pourcentage de rapport de nombre de copies est positionnée au-dessus de la limite de quantification
b) un échantillon de LMC ou LLA test considéré négatif pour BCR-ABL lors que la valeur obtenue du nombre de copie de BCR-ABL ou du rapport BCR-ABL /ABLl ou bien du pourcentage de rapport de nombre de copies est positionnée entre la limite de quantification et la limite de détection.
PCT/MA2014/000031 2013-10-10 2014-11-11 Kit de diagnostic de la leucemie myeloide chronique en reaction multiplex et ses applications dans le suivi du tratement et de la maladie residuelle WO2015060703A2 (fr)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
MA36330A MA36330B1 (fr) 2013-10-10 2013-10-10 Kit de diagnostic de la leucemie myeloide chronique en reaction multiplex et ses applications dans le suivi du traitement et de la maladie residuelle
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