WO2015056804A1 - 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents

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伸弥 山中
善紀 吉田
日高 横田
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Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the establishment efficiency of artificial pluripotent stem (hereinafter also referred to as iPS) cells and a drug therefor. More specifically, the present invention relates to a method for improving iPS cell establishment efficiency by inhibiting the function of Signal Transducer and Activator for Transcription 1 (hereinafter referred to as STAT1) in the somatic cell nuclear reprogramming process, and STAT1
  • STAT1 Signal Transducer and Activator for Transcription 1
  • the present invention relates to an agent for improving the establishment efficiency of iPS cells, which comprises a substance that inhibits the function of the substance as an active ingredient.
  • Nuclear reprogramming technology provides an opportunity to generate patient-specific or disease-specific pluripotent stem cells.
  • iPS cells are produced by introducing four factors Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc into somatic cells, and are pluripotent cells similar to embryonic stem cells (Non-patent Documents 1-3). ). Since the initial nuclear reprogramming technology was extremely low in establishment efficiency and could not secure a sufficient amount of iPS cells, many studies have been conducted so far to search for an efficient establishment method. (Non-Patent Documents 4-7).
  • STAT1 contains interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF) and interleukin-6 (IL-6). It is a transcriptional activator activated by various growth factors and cytokines, and is known to play an important role in cell survival (Non-patent Documents 15 and 16). However, the relationship with nuclear initialization is not known.
  • An object of the present invention is to provide a means for improving the establishment efficiency of iPS cells, and to provide an efficient method of producing iPS cells using the same.
  • the present invention provides the following matters.
  • a method for improving the establishment efficiency of induced pluripotent stem cells comprising inhibiting STAT1 function in a nuclear reprogramming step of somatic cells, (2) The method according to (1), wherein the function of STAT1 is inhibited by bringing a chemical inhibitor of STAT1 into contact with a somatic cell.
  • the agent according to (6), wherein the inhibitor is EGC (epigallocatechin), (8) The agent according to (5), wherein the inhibitor is a nucleic acid selected from the group consisting of siRNA against STAT1, shRNA and DNA encoding them, (9) A method for producing induced pluripotent stem cells, which comprises contacting a somatic cell with a nuclear reprogramming substance and a STAT1 function inhibitor; (10) The method according to (9), wherein the inhibitor is a chemical inhibitor, (11) The method according to (10), wherein the inhibitor is EGC (epigallocatechin), (12) The method according to (9), wherein the inhibitor is a nucleic acid selected from the group consisting of siRNA against STAT1, shRNA and DNA encoding them, (13)
  • the nuclear reprogramming substance contains Oct3 / 4, a Klf family member and a Sox family member, or nucleic acids encoding them, and the Klf family member is Klf1, Klf2, Klf4 or Klf
  • STAT1 function-inhibiting substances can remarkably increase iPS cell establishment efficiency, and are thus useful in conventional iPS cell induction methods with low establishment efficiency.
  • Fig. 1 shows the introduction of 4 genes (Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-Myc) into human skin-derived fibroblasts (HDF), and the introduction of siRNA against STAT1 two days later. It is a graph showing the number of human ES cell-like colonies obtained on the 16th day from the introduction of the gene.
  • Sicontrol represents a control group
  • SiSTAT1 (HSS110273, Invitrogen) represents siRNA against STAT1. * Indicates p ⁇ 0.05.
  • Fig. 2 shows that four genes (Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-Myc) were introduced into human skin-derived fibroblasts (HDF), and siRNA for STAT1 was introduced two days later.
  • SiControl represents a control group
  • SiSTAT1-1 HSS110273, Invitrogen
  • SiSTAT1-2 HS186128, Invitrogen
  • Figure 3 shows the introduction of 4 genes (Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-Myc) into human skin-derived fibroblasts (HDF), and EGC (epigallocatechin) was added from the 5th to 24th day of infection.
  • EGC epigallocatechin
  • the present invention provides a method for improving iPS cell establishment efficiency by inhibiting STAT1 function in the somatic cell nuclear reprogramming step.
  • the nuclear reprogramming of somatic cells is performed by bringing the somatic cells into contact with a nuclear reprogramming substance described later, preferably by introducing a nuclear reprogramming substance into the somatic cells.
  • the “nuclear reprogramming step” means a period from the contact between a somatic cell and a nuclear reprogramming substance until before the generation of a primary embryonic stem cell (ES cell) -like colony.
  • the means for inhibiting the function of STAT1 is not particularly limited, and a method of contacting a somatic cell with a substance that inhibits the function of STAT1 is preferable.
  • Somatic cell source Somatic cells that can be used as a starting material for producing iPS cells in the present invention are germ cells derived from mammals (eg, humans, mice, monkeys, cows, pigs, rats, dogs, etc.). Any cell other than, eg, keratinized epithelial cells (eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells of the tongue surface layer), exocrine glandular epithelial cells (eg, mammary cells), Hormone-secreting cells (eg, adrenal medullary cells), cells for metabolism / storage (eg, hepatocytes), luminal epithelial cells that make up the interface (eg, type I alveolar cells), luminal epithelium of inner chain vessels Cells (eg, vascular endothelial cells), ciliated cells with carrying ability (eg, airway epithelial cells), cells for extracellular matrix secretion (eg, fibroblasts
  • undifferentiated progenitor cells including somatic stem cells
  • final differentiated mature cells It can be used as the source of somatic cells in the invention.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • somatic cells there are no particular restrictions on the mammalian individual from which somatic cells are collected, but when the resulting iPS cells are used for human regenerative medicine, the patient or the type of HLA is used from the viewpoint that rejection does not occur. It is particularly preferred to collect somatic cells from others who are identical or substantially identical.
  • the type of HLA is “substantially the same” means that when the cells obtained by inducing differentiation from iPS cells derived from the somatic cells are transplanted into a patient by using an immunosuppressant or the like, the transplanted cells are This means that the HLA types match to the extent that they can be engrafted.
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci added with HLA-C
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci added with HLA-C
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci added with HLA-C
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci added with HLA-C
  • Somatic cells isolated from mammals can be pre-cultured in a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • Examples of such a medium include a minimum essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, and F12 medium containing about 5 to 20% fetal calf serum. It is not limited to.
  • introduction efficiency In the case of using an introduction reagent such as a cationic liposome in contact with a nuclear reprogramming substance and a substance that inhibits STAT1 function (and another substance that improves the efficiency of establishment of other iPS cells described later), for example, introduction efficiency In some cases, it may be preferable to replace the serum-free medium.
  • STAT1 function-inhibiting substance may be any substance as long as it can inhibit the function of (1) STAT1 protein or (2) STAT1 gene expression. .
  • STAT1 function inhibitory substance not only substances that directly act on the STAT1 protein and inhibit its function, or substances that act directly on the STAT1 gene and inhibit its expression, but also act on factors involved in STAT1 signal transduction.
  • substances that inhibit STAT1 protein function or STAT1 gene expression are also included in the “STAT1 function inhibitory substance” in the present specification.
  • Substances that inhibit the function of STAT1 protein include, for example, chemical inhibitors of STAT1, dominant negative mutants of STAT1 or nucleic acids that encode it, anti-STAT1 antagonist antibodies or nucleic acids that encode them, and substances that inhibit the STAT1 pathway However, it is not limited to these.
  • a chemical inhibitor of STAT1 is used.
  • (1-1) STAT1 chemical inhibitor refers to expression inhibition due to antisense effect, RNA interference, ribozyme action, etc., function inhibition due to antigen-antibody reaction, dominant negative effect, etc.
  • Inhibitors other than substances that exert an inhibitory effect through biological action, typically nonproteinaceous and nonnucleic acid small molecule inhibitors.
  • EGC epigallocatechin
  • EGC epigallocatechin
  • a chemical inhibitor of STAT1 with a somatic cell can be accomplished by dissolving the inhibitor in an appropriate concentration in an aqueous or non-aqueous solvent and a medium suitable for culturing somatic cells isolated from humans or mice (eg, about In a minimum essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium, etc.) containing 5-20% fetal calf serum, the inhibitor concentration is sufficient to inhibit STAT1 function and The inhibitor solution can be added so that the cytotoxicity is not observed, and the cells can be cultured for a certain period of time.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 medium fetal calf serum
  • the inhibitor concentration varies depending on the type of inhibitor used, but is appropriately selected within the range of about 0.1 nM to about 100 nM.
  • the contact period is not particularly limited as long as it is a time sufficient for the nuclear reprogramming of the cells to be achieved, but it is usually sufficient that the contact period coexists in the medium until a positive colony appears.
  • Dominant negative mutant of STAT1 STAT1 usually has transcriptional activator activity.
  • “dominant negative mutant of STAT1” acts competitively with the wild-type STAT1 protein endogenous to somatic cells. Any substance may be used as long as its function is inhibited. Examples include STAT1S727A in which serine at position 727, which is a phosphorylation site of STAT1 in humans and mice, is point-mutated to alanine (Zilong Wen, et al., Cell, 82 (2): 241-50 (1995) ).
  • the dominant negative mutant of STAT1 can be obtained, for example, by the following method.
  • mouse STAT1 for example, the sequence of NM_001205313.1, the sequence of NM_001205314.1, the sequence of NM_009283.4, and for human STAT1, for example, the sequence of NM_007315.3, the sequence of NM_139266.2
  • Oligonucleotide is synthesized as a probe or primer, and mouse or human STAT1 cDNA is cloned from mRNA, cDNA or cDNA library derived from mouse or human cell / tissue using hybridization method or (RT-) PCR method, Subcloning into an appropriate plasmid.
  • the contact of the dominant negative mutant with the somatic cell can be performed using a method for introducing a protein into a cell known per se.
  • a method for introducing a protein into a cell known per se examples include a method using a protein introduction reagent, a method using a protein introduction domain (PTD) fusion protein, and a microinjection method.
  • PTD protein introduction domain
  • Protein introduction reagents include cationic lipid-based BioPOTER Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systmes), Pro-Ject TM Protein Transfection Reagent (PIERCE) and ProVectin (IMGENEX), and lipid-based Profect-1 (Targeting Systems) ), Penetrain Peptide (Q biogene) and Chariot Kit (Active Motif) based on a membrane-permeable peptide, GenomONE (Ishihara Sangyo) using HVJ envelope (inactivated Sendai virus), and the like are commercially available.
  • the introduction can be carried out according to the protocol attached to these reagents, but the general procedure is as follows.
  • Dilute the dominant negative mutant of STAT1 in an appropriate solvent for example, buffer solution such as PBS, HEPES, etc.
  • an appropriate solvent for example, buffer solution such as PBS, HEPES, etc.
  • CPP derived from PTD include polyarginine such as 11R (Cell Stem Cell, 4: 381-384 (2009)) and 9R (Cell Stem Cell, 4: 472-476 (2009)).
  • a fusion protein expression vector incorporating cDNA of a dominant negative mutant of STAT1 and a PTD sequence or CPP sequence is prepared and recombinantly expressed, and the fusion protein is recovered and used for introduction. Introduction can be performed in the same manner as described above except that no protein introduction reagent is added. It is suitable for introducing a deletion mutant having a relatively small molecular weight.
  • Microinjection is a method in which a protein solution is placed in a glass needle having a tip diameter of about 1 ⁇ m and puncture is introduced into a cell, and the protein can be reliably introduced into the cell.
  • electroporation method semi-intact cell method (Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365 (2006)), introduction method using Wr-t peptide (Kondo, E. et al. , Mol. Cancer Ther. 3 (12), 1623-1630 (2004)).
  • the protein introduction operation can be performed any number of times of 1 or more (for example, 1 to 10 times, or 1 to 5 times, etc.), and preferably the introduction operation is performed 2 times or more (for example, 3 or 4 times). ) Can be done repeatedly.
  • the interval when the introduction operation is repeated includes, for example, 6 hours to 7 days, preferably 12 to 48 hours or 7 days.
  • the STAT1 function inhibitor is a nucleic acid encoding a dominant negative mutant of STAT1.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera, but is preferably DNA.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded.
  • a cDNA encoding a dominant negative mutant of STAT1 can be cloned by the method described above for the production of the mutant protein.
  • the isolated cDNA is inserted into an appropriate expression vector containing a promoter that can function in the target somatic cells.
  • expression vectors include retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpesviruses and other viral vectors, animal cell expression plasmids (eg, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo) and the like can be used.
  • the type of vector to be used can be appropriately selected according to the intended use of the iPS cell obtained.
  • Examples of the promoter used in the expression vector include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Molone murine leukemia virus) LTR. HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter and the like are used. Of these, EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, MoMuLV LTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, an SV40 replication origin, and the like as desired.
  • the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene, a neomycin resistance gene, a puromycin resistance gene, and the like.
  • An expression vector containing a nucleic acid encoding a dominant negative mutant of STAT1 can be introduced into cells by a technique known per se according to the type of vector.
  • a plasmid containing a nucleic acid encoding a dominant negative mutant is introduced into an appropriate packaging cell (eg, Plat-E cell) or a complementary cell line (eg, 293 cell), and the culture supernatant
  • an appropriate packaging cell eg, Plat-E cell
  • a complementary cell line eg, 293 cell
  • transgene expression may increase the risk of carcinogenesis in tissues regenerated from differentiated cells derived from iPS cells. Is preferably not expressed in the cell chromosome but transiently expressed. From this point of view, it is preferable to use an adenovirus vector that rarely integrates into the chromosome. Specific means using an adenoviral vector is described in Science, 322, 945-949 (2008).
  • adeno-associated virus also has a low frequency of integration into chromosomes, and has lower cytotoxicity and inflammation-inducing action than adenovirus vectors, and thus can be mentioned as another preferred vector.
  • the Sendai virus vector can exist stably outside the chromosome, and can be preferably used in the same manner because it can be decomposed and removed by siRNA as necessary.
  • Sendai virus vector those described in J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007) and patent 3602058 can be used.
  • a method of excising a nucleic acid encoding a STAT1 dominant negative mutant at the time point can be preferably used. That is, loxP sequences are arranged at both ends of the nucleic acid, and after iPS cells are induced, Cre recombinase is allowed to act on the cells using a plasmid vector or an adenovirus vector to cut out the region sandwiched between the loxP sequences. be able to.
  • the enhancer-promoter sequence in the LTR ⁇ U3 region may up-regulate nearby host genes by insertion mutation, so the 3′-self is deleted or replaced with a polyadenylation sequence such as SV40.
  • an inactivated (SIN) LTR is used to avoid expression control of the endogenous gene by an LTR outside the loxP sequence that is not excised and remains in the genome. Specific means using the Cre-loxP system and SIN LTR are disclosed in Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009).
  • plasmid vector which is a non-viral vector
  • the vector is transferred to cells using lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method, etc.
  • lipofection method liposome method
  • electroporation method calcium phosphate coprecipitation method
  • DEAE dextran method microinjection method
  • gene gun method etc.
  • Specific means using a plasmid as a vector are described in, for example, Science, 322, 949-953 (2008).
  • gene introduction can be performed any number of one or more times (for example, 1 to 10 times or 1 to 5 times).
  • time for example, 1 or more and 10 or less, or 1 or more and 5 or less, etc.
  • introduction operation can be preferably repeated by 2 or more times (for example, 3 times or 4 times).
  • transgene may be integrated into the chromosome, it is necessary to finally confirm that there is no gene insertion into the chromosome by Southern blotting or PCR. Therefore, it may be advantageous to use a means for removing the gene after the transgene has been once integrated into the chromosome, as in the Cre-loxP system.
  • there is a method for completely removing a transgene from a chromosome by incorporating a transgene into a chromosome using a transposon and then allowing a transferase to act on the cell using a plasmid vector or an adenovirus vector. Can be used.
  • Preferred transposons include, for example, piggyBac, which is a transposon derived from a lepidopteran insect. Specific means using the piggyBac transposon are disclosed in Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009), Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009).
  • Another preferred non-integrated vector is an episomal vector capable of autonomous replication outside the chromosome. Specific means using an episomal vector is disclosed in Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009).
  • the episomal vector include a vector containing a sequence necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40 or the like as a vector element.
  • vector elements necessary for autonomous replication include a replication origin and a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication.
  • a replication origin for example, in EBV, the replication origin oriP And EBNA-1 gene, SV40 includes the replication origin ori and SV40 large T antigen gene.
  • the episomal expression vector also includes a promoter that controls transcription of the nucleic acid encoding the STAT1 dominant negative mutant. As the promoter, the same promoter as described above can be used.
  • the episomal expression vector may further contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, and the like as desired, as described above.
  • the selection marker gene examples include a dihydrofolate reductase gene, a neomycin resistance gene, a puromycin resistance gene, and the like.
  • Episomal vectors can be introduced into cells using, for example, lipofection, liposome, electroporation, calcium phosphate coprecipitation, DEAE dextran, microinjection, gene gun, and the like. Specifically, for example, the method described in Science, 324: 797-801 (2009) can be used. Whether or not a vector element required for transgene replication has been removed from an iPS cell is determined by using a nucleic acid containing a base sequence in the vector element and / or in the vicinity of the loxP sequence as a probe or primer.
  • the episomal fraction may be prepared by a method well known in the art, for example, a method described in Science, 324: 797-801 (2009) or the like.
  • STAT1 pathway inhibitor The STAT1 pathway is used herein to include any upstream signaling pathway capable of activating STAT1 and any downstream signaling pathway mediated by activated STAT1.
  • a STAT1 pathway inhibitor includes any substance that inhibits either or both of the above signaling pathways.
  • STAT1 signaling pathway it is known that when ligands such as growth factors and cytokines bind to receptors on the cell membrane, receptor complexation occurs, Jak kinase is subsequently activated, and then STAT1 is activated. ing. Activated STAT1 moves into the nucleus and activates transcription of the target gene.
  • inhibitors of STAT1 signaling pathway include PIAS1 protein (LiuASB, et al., Proc Natl Acad Sci, 95 (18): 10626-31 (1998)); histone1998acetyltransferase (HAT) CBP (Kramer OH, et al., Genes Dev.,.
  • the anti-STAT1 antagonist antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the isotype of the antibody is not particularly limited, but preferably IgG, IgM or IgA, particularly preferably IgG.
  • the antibody includes, for example, fragments such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , conjugates prepared by genetic engineering such as scFv, scFv-Fc, minibody, and diabody.
  • An anti-STAT1 antagonist antibody can be produced according to a known method for producing an antibody or antiserum using STAT1 or a partial peptide thereof as an antigen.
  • known anti-STAT1 antagonist antibodies include sc-464, sc-346 (Santa Cruz Biotechnology), # 9172 (Cell Signaling Technology), and the like.
  • Nucleic acids encoding anti-STAT1 antagonist antibodies can be isolated from anti-STAT1 monoclonal antibody-producing hybridomas by conventional methods. The obtained H chain and L chain genes can be linked to produce a nucleic acid encoding a single chain antibody.
  • An anti-STAT1 antagonist antibody can be introduced into a cell in the same manner as a dominant negative mutant of STAT1, and a nucleic acid encoding the antibody can be introduced into a cell in the same manner as a nucleic acid encoding the mutant.
  • examples of substances that inhibit the expression of STAT1 gene include siRNA or shRNA against STAT1, a vector expressing siRNA or shRNA against STAT1, an antisense nucleic acid against STAT1, and a ribozyme against STAT1.
  • siRNA and shRNA against STAT1 The siRNA for STAT1 is based on the mouse or human STAT1 cDNA sequence information shown in the NCBI accession numbers below, for example, according to the rules proposed by Elbashir et al. (Genes Dev., 15, 188-200 (2001)). Can be designed.
  • the target sequence of siRNA is AA + (N) 19 in principle, but may be AA + (N) 21 or NA + (N) 21. Also, the 5 'end of the sense strand need not be AA.
  • the position of the target sequence is not particularly limited, but it is desirable to select the target sequence from 5'-UTR and the start codon to about 50 bases, and from regions other than 3'-UTR.
  • the GC content of the target sequence is also not particularly limited, but is preferably about 30 to about 50%, and a sequence with no bias in GC distribution and less repetition is desirable.
  • a sequence of 4 or more bases of T or A is continuous so that transcription of polymerase does not stop. Should not be selected.
  • BLAST http: //www.ncbi.nlm. Use a homology search software such as nih.gov/BLAST/) to confirm the specificity of the selected target sequence.
  • a sense strand having a 3 'end overhang of TT or UU at 19-21 bases after AA (or NA) a sequence complementary to the 19-21 bases and TT or
  • a double-stranded RNA consisting of an antisense strand having a 3 'end overhang of UU is designed as an siRNA.
  • the shRNA is designed by appropriately selecting an arbitrary linker sequence (for example, about 8-25 bases) that can form a loop structure, and linking the sense strand and the antisense strand via the linker sequence. be able to.
  • siRNA Target Finder http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html
  • pSilencer TM Expression Vector insert design tool http: / /www.ambion.com/techlib/misc/psilencer_converter.html
  • GeneSeer provided by RNAi Codex http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi
  • QIAGEN Searches are also possible on websites such as Takara Bio, SiSearch, Dharmacon, Whitehead Institute, Invitrogen, and Promega.
  • the siRNA for STAT1 is prepared by synthesizing the sense strand and antisense strand oligonucleotide designed as described above with a DNA / RNA automatic synthesizer, for example, at about 90 to about 95 ° C. in a suitable annealing buffer. It can be prepared by denaturing for about 1 minute and then annealing at about 30 to about 70 ° C. for about 1 to about 8 hours.
  • shRNA against STAT1 can be prepared by synthesizing an oligonucleotide having an shRNA sequence designed as described above with a DNA / RNA automatic synthesizer and performing self-annealing in the same manner as described above.
  • the nucleotide molecules that make up siRNA and shRNA may be natural RNA, but various chemical modifications may be applied to improve stability (chemical and / or enzyme) and specific activity (affinity with mRNA). Can be included.
  • the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense nucleic acid is chemically modified, for example, phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. It can be substituted with a phosphate residue.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate methylphosphonate
  • phosphorodithionate etc. It can be substituted with a phosphate residue.
  • the 2′-position hydroxyl group of the sugar (ribose) of each nucleotide is represented by —OR (R is, for example, CH 3 (2′-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2′-O-MOE), CH 2 CH 2 NHC (NH) NH 2 , CH 2 CONHCH 3 , CH 2 CH 2 CN and the like may be substituted).
  • R is, for example, CH 3 (2′-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2′-O-MOE), CH 2 CH 2 NHC (NH) NH 2 , CH 2 CONHCH 3 , CH 2 CH 2 CN and the like may be substituted).
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • BNA LNA
  • ENA ENA
  • RNAi activity may be lost if all ribonucleoside molecules in the natural RNA are replaced with a modified form, and therefore, it is necessary to introduce a minimum modified nucleoside capable of functioning the RISC complex.
  • the siRNA against STAT1 can also be purchased from, for example, Santa Cruz Biotechnology (eg Cat # sc-44123), Invitrogen (eg Invitrogen Stealth RNAi TM siRNA, oligo ID: HSS110273).
  • Santa Cruz Biotechnology eg Cat # sc-44123
  • Invitrogen eg Invitrogen Stealth RNAi TM siRNA, oligo ID: HSS110273
  • siRNA or shRNA against STAT1 is performed by introducing the nucleic acid into the cell using the liposome method, polyamine method, electroporation method, bead method, etc. can do.
  • the method using cationic liposomes is the most common, and the introduction efficiency is high.
  • introduction reagents suitable for siRNA introduction such as GeneEraser TM siRNA transfection reagent (Stratagene) are also commercially available.
  • One or more siRNAs or shRNAs to be introduced can be introduced simultaneously.
  • siRNA sense strand expression cassette and antisense strand expression cassette are linked in tandem, and each strand is expressed and annealed in the cell to form double stranded siRNA (dsRNA). It is.
  • shRNA expression cassette is inserted into a vector, in which shRNA is expressed in cells and processed by dicer to form dsRNA.
  • a pol II promoter for example, a CMV immediate early promoter
  • a pol III promoter is generally used.
  • polIII promoters examples include mouse and human U6-snRNA promoters, human H1-RNase P RNA promoter, and human valine-tRNA promoter. Further, a sequence in which 4 or more Ts are continuous is used as a transcription termination signal.
  • the siRNA or shRNA expression cassette constructed in this way is then inserted into a plasmid vector or virus vector.
  • a vector those similar to those described above for the nucleic acid encoding a dominant negative mutant of STAT1 can be preferably used (virus vectors such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, etc. And animal cell expression plasmids).
  • the vector to be used can be appropriately selected depending on the intended use of the iPS cell to be obtained.
  • a viral vector such as a retrovirus prepared based on a commercially available plasmid (for example, Cat. Code: psirna42-hstat1 available from Invitrogen) is used. You can also.
  • STAT1 Other substances that inhibit the expression of the STAT1 gene include antisense nucleic acids and ribozymes against STAT1.
  • the antisense nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera.
  • the antisense nucleic acid is DNA
  • the RNA DNA hybrid formed by the target RNA and the antisense DNA can be recognized by endogenous RNase H and cause selective degradation of the target RNA. Therefore, in the case of antisense DNA directed to degradation by RNase H, the target sequence may be not only the sequence in STAT1 mRNA, but also the sequence of the intron region in the initial transcript of the STAT1 gene.
  • the length of the target region of the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as the antisense nucleic acid hybridizes, and as a result, the translation into the STAT1 protein is inhibited.
  • the short sequence may be about 15 bases
  • the long sequence may be the entire sequence of mRNA or initial transcription product.
  • an oligonucleotide consisting of about 15 to about 40 bases, particularly about 18 to about 30 bases is preferred.
  • Examples of the target sequence position include, but are not limited to, 5'- and 3'-UTR, the vicinity of the start codon, and the like.
  • Ribozyme refers to RNA having an enzyme activity that cleaves nucleic acids in a narrow sense, but in this specification, it is used as a concept including DNA as long as it has sequence-specific nucleic acid cleaving activity.
  • the most versatile ribozyme is self-splicing RNA found in infectious RNA such as viroid and virusoid, and the hammerhead type and hairpin type are known.
  • the hammerhead type exhibits enzyme activity at about 40 bases, and several bases at both ends (about 10 bases in total) adjacent to the part having the hammerhead structure are made complementary to the desired cleavage site of mRNA. By doing so, it is possible to specifically cleave only the target mRNA.
  • Antisense nucleic acids and ribozymes can be synthesized using a DNA / RNA automatic synthesizer.
  • the nucleotide molecules constituting them may also be modified in the same manner as in the above siRNA in order to improve stability, specific activity and the like.
  • antisense nucleic acids and ribozymes can also be used in the form of nucleic acids that encode them, as in the case of siRNA.
  • the STAT1 function-inhibiting substance needs to be brought into contact with the somatic cell in a manner sufficient to inhibit the STAT1 function in the somatic cell nuclear reprogramming process.
  • nuclear reprogramming of somatic cells can be performed by bringing a nuclear reprogramming substance into contact with somatic cells.
  • nuclear reprogramming substance is a substance (group) that can induce iPS cells from somatic cells by introduction into somatic cells. It may be composed of any substance such as a nucleic acid encoding it (including a form incorporated in a vector) or a low molecular weight compound.
  • the nuclear reprogramming substance is a protein factor or a nucleic acid encoding the same, the following combinations are preferably exemplified (in the following, only the name of the protein factor is described).
  • Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, See also Nature, 451, 141-146 (2008) for "SV40LT” combinations.
  • Oct3 / 4, Klf4, Sox2 See Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)) (where Sox2 can be replaced with Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 or Sox18.
  • a combination in which c-Myc is changed to L-Myc in the above is also an example of a preferable nuclear reprogramming substance.
  • nucleotide sequences of mouse and human cDNA of each nuclear reprogramming substance and amino acid sequence information of the protein encoded by the cDNA refer to NCBI accession numbers described in WO 2007/069666, and L-Myc, Lin28 , Lin28b, Esrrb, Esrrg and Glis1 mouse and human cDNA sequences and amino acid sequence information can be obtained by referring to the following NCBI accession numbers, respectively.
  • a person skilled in the art can prepare a desired nuclear reprogramming substance by a conventional method based on the cDNA sequence or amino acid sequence information.
  • the obtained cDNA is inserted into an appropriate expression vector, introduced into a host cell, and cultured from the resulting culture. Can be prepared by recovering.
  • the obtained cDNA is treated with a virus vector, episomal vector or plasmid in the same manner as in the case of a nucleic acid encoding a dominant negative mutant of STAT1.
  • An expression vector is constructed by inserting it into a vector, and is subjected to a nuclear reprogramming step. If necessary, the above Cre-loxP system or piggyBac transposon system can also be used.
  • each nucleic acid may be carried on a separate vector, or a plurality of nucleic acids connected in tandem to a polycistronic vector It can also be.
  • a polycistronic vector for example, 2A sequence of foot-and-mouth disease virus (PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007), IRES sequence (US Patent No. 4,937,190) etc., preferably 2A sequences can be used.
  • the nuclear reprogramming substance When the nuclear reprogramming substance is contacted with a somatic cell, (a) when the substance is a proteinous factor, (b) the substance is a proteinous factor of (a) in the same manner as the dominant negative mutant of STAT1 above. Can be carried out in the same manner as the nucleic acid encoding the dominant negative mutant of STAT1. On the other hand, when (c) the hemorrhoid reprogramming substance is a low molecular weight compound, it can be carried out in the same manner as the above chemical inhibitor of STAT1.
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • trichostatin Nucleic acid expression such as A, sodium butyrate
  • small molecule inhibitors such as MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg, HDAC1 siRNA Smartpool TM (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.) Inhibitors, etc.]
  • DNA methyltransferase inhibitors eg 5'-azacytidine
  • G9a histone methyltransferase inhibitors [eg BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)) and other small molecule inhibitors, G9a siRNA and shRNA (eg, G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology) etc.) and other nucleic acid expression inhibitors], L -channel calcium agonist (eg Bayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)), p53 inhibitor (eg against p53) siRNA and shRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), UTF1 (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), Wnt Signaling activator (eg soluble Wnt3a) (Cell Stem Cell, 3 , 132-135 (2008)), 2i / LIF (2i is an inhibitor of mitogen-activated protein kinase signaling and glycogen synthase kinase-3, Plo
  • a p53 function inhibitor is used.
  • the nucleic acid expression inhibitor may be in the form of an expression vector containing DNA encoding siRNA or shRNA.
  • SV40 large T is not an essential factor for somatic cell nuclear reprogramming, but is an auxiliary factor. It can also be included in a category.
  • auxiliary factors other than those essential for nuclear reprogramming are positioned as nuclear reprogramming substances or substances that improve the establishment efficiency of iPS cells. It may be convenient.
  • the nuclear reprogramming process of somatic cells is regarded as an overall event caused by the contact of somatic cells with the nuclear reprogramming substance and the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells. There will be no gender.
  • the contact of these other iPS cell establishment efficiency improving substances with the somatic cells may be carried out when the substance is (a) a protein factor, (b) a nucleic acid encoding the protein factor, or (c) Depending on the low molecular weight compound, the STAT1 function-inhibiting substance can be carried out by the same method as described above.
  • the iPS cell establishment efficiency can be further improved by culturing cells under hypoxic conditions in the somatic cell nuclear reprogramming step.
  • the “hypoxic condition” means that the oxygen concentration in the atmosphere when cells are cultured is significantly lower than that in the air. Specifically, the oxygen concentration condition is lower than the oxygen concentration in the atmosphere of 5-10% CO 2 / 95-90% air generally used in normal cell culture. For example, oxygen in the atmosphere Conditions with a concentration of 18% or less apply.
  • the oxygen concentration in the atmosphere is 15% or less (eg, 14% or less, 13% or less, 12% or less, 11% or less, etc.), 10% or less (eg, 9% or less, 8% or less, 7% or less) 6% or less), or 5% or less (eg, 4% or less, 3% or less, 2% or less, etc.).
  • the oxygen concentration in the atmosphere is preferably 0.1% or more (eg, 0.2% or more, 0.3% or more, 0.4% or more), 0.5% or more (eg, 0.6% or more, 0.7% or more, 0.8% or more, 0.95 Or 1% or more (eg, 1.1% or more, 1.2% or more, 1.3% or more, 1.4% or more, etc.).
  • a method for creating a hypoxic state in the cell environment is not particularly limited, but a method of culturing the cells in a CO 2 incubator in which the oxygen concentration can be adjusted is the easiest and is a preferable example.
  • CO 2 incubators with adjustable oxygen concentration are sold by various equipment manufacturers (for example, CO for low oxygen culture by manufacturers such as Thermo scientific, Ikemoto Rika Kogyo, Toji Field, and Waken Pharmaceutical Co., Ltd.) 2 incubators can be used).
  • the time when cell culture is started under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the establishment efficiency of iPS cells from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%). It may be before contact with the reprogramming substance and the STAT1 function-inhibiting substance, simultaneously with the contact, or after the contact. Under hypoxic conditions immediately after contact with a function-inhibiting substance or after a certain period of time (eg, 1 to 10 (eg, 2,3,4,5,6,7,8 or 9) days) after contact It is preferable to culture.
  • the period for culturing cells under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the establishment efficiency of iPS cells from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%). Examples include, but are not limited to, a period of 7 days or more, 10 days or more, 50 days or less, 40 days or less, 35 days or less, or 30 days or less.
  • a preferable culture period under low oxygen conditions varies depending on the oxygen concentration in the atmosphere, and those skilled in the art can appropriately adjust the culture period according to the oxygen concentration used. In one embodiment, when selection of iPS cell candidate colonies is performed using drug resistance as an index, it is preferable to return from a low oxygen condition to a normal oxygen concentration before drug selection is started.
  • the preferred time and preferred culture period for starting cell culture under hypoxic conditions vary depending on the type of nuclear reprogramming substance used, iPS cell establishment efficiency under normoxic conditions, and the like.
  • the cells After contacting the nuclear reprogramming substance and the STAT1 function-inhibiting substance, the cells can be cultured under conditions suitable for ES cell culture, for example.
  • Leukemia® Inhibitory® Factor LIF
  • LIF Leukemia® Inhibitory® Factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF stem cell factor
  • Co-culture with feeder cells may be started before contact with the nuclear reprogramming substance and STAT1 function inhibitor, or at the time of the contact or after the contact (for example, 1-10 days later). May be.
  • the selection of iPS cell candidate colonies includes a method using drug resistance and reporter activity as indicators and a method using visual morphological observation.
  • Examples of the former include a drug resistance gene and / or a gene locus that is specifically highly expressed in differentiated pluripotent cells (for example, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, etc., preferably Nanog or Oct3 / 4).
  • a recombinant cell targeted with a reporter gene is used to select colonies positive for drug resistance and / or reporter activity.
  • Such recombinant cells include, for example, MEF (Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663) derived from a mouse in which a ⁇ geo (encoding a fusion protein of ⁇ -galactosidase and neomycin phosphotransferase) gene is knocked in at the Fbx15 locus. -676 (2006)), or MEFs derived from transgenic mice incorporating the green fluorescent protein (GFP) gene and puromycin resistance gene at the Nanog locus (Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)) Etc.
  • MEF green fluorescent protein
  • examples of a method for selecting candidate colonies by visual morphological observation include the methods described in Takahashi et al., Cell, 131, 861-872-8 (2007).
  • a method using a reporter cell is simple and efficient, when iPS cells are produced for the purpose of human therapeutic use, visual colony selection is desirable from the viewpoint of safety.
  • IPS cells established in this way can be used for various purposes.
  • the differentiation induction method reported for ES cells is used to induce differentiation of iPS cells into various cells (eg, cardiomyocytes, blood cells, nerve cells, vascular endothelial cells, insulin secreting cells, etc.). be able to. Therefore, if iPS cells are induced using somatic cells collected from the patient or another person who has the same or substantially the same type of HLA, the desired cells (ie, the organ in which the patient is affected) Stem cell therapy by autotransplantation is possible, in which cells and cells that exhibit therapeutic effects on diseases are differentiated and transplanted into the patient.
  • the desired cells ie, the organ in which the patient is affected
  • Stem cell therapy by autotransplantation is possible, in which cells and cells that exhibit therapeutic effects on diseases are differentiated and transplanted into the patient.
  • iPS cells differentiated from iPS cells eg, hepatocytes
  • drug candidates It can also be suitably used for in vitro screening of the efficacy and toxicity of compounds.
  • Example 1 Effect of STAT1 inhibition by siRNA According to the method described in Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007) against human skin-derived fibroblasts (HDF 1616 strain)
  • the mouse ecotropic virus receptor Slc7a1 gene was expressed using (pLenti6 / UbC-Slc7a1).
  • the cells were seeded at 1.0 ⁇ 10 5 cells per well in each well of a 6-well culture plate (Falcon) coated with 0.1% gelatin (Sigma).
  • four human genes (Oct3 / 4, Klf4, Sox2, c-Myc) were introduced by retrovirus according to the method described in Takahashi, K.
  • siRNA against STAT1 was introduced on the second day of infection using Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen).
  • Invitrogen Stealth RNAi TM siRNA oligo ID: HSS110273 or HSS186128 purchased from Invitrogen was used.
  • As a negative control non-specific siRNA (Sicontrol; Stealth RNAi TM siRNA Negative Control, Med GC, purchased from product number 12935-300 (Invitrogen)) was introduced.
  • the obtained cells were seeded at 2.0 ⁇ 10 5 cells on a 100 mm dish on which feeder cells had been seeded in advance on the fourth day of infection.
  • the results of measuring the number of iPS cell colonies on the 16th day of infection (16th day after introduction of 4 genes) are shown in FIGS. In the introduction of 4 genes, it was confirmed that the number of human iPS cell colonies was significantly increased by inhibiting STAT1 with each siRNA as compared with the Sicontrol (control) group.
  • Example 2 Effect of STAT1 inhibition by EGC (epigallocatechin) According to the method described in Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007) against human skin-derived fibroblasts (HDF 1616 strain).
  • the mouse ecotropic virus receptor Slc7a1 gene was expressed using lentivirus (pLenti6 / UbC-Slc7a1).
  • the cells were seeded at 1.0 ⁇ 10 5 cells per well in each well of a 6-well culture plate (Falcon) coated with 0.1% gelatin (Sigma). The next day, in accordance with the method described in Takahashi, K.
  • STAT1 function inhibitor can significantly increase iPS cell establishment efficiency, it is useful for establishing iPS cells efficiently in the iPS cell induction method, which has been low in establishment efficiency.

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Abstract

　本発明は、人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程においてSTAT1の機能を阻害することを含む、方法を提供する。

Description

効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
　本発明は、人工多能性幹（以下、iPSともいう）細胞の樹立効率の改善方法およびそのための薬剤に関する。より詳細には、本発明は、体細胞の核初期化工程においてSignal Transducer and Activator for Transcription 1（以下、STAT1と記す）の機能を阻害することによる、iPS細胞の樹立効率の改善方法、並びにSTAT1の機能阻害物質を有効成分とするiPS細胞の樹立効率改善剤に関する。
　核初期化技術は、患者特異的もしくは疾患特異的な多能性幹細胞を作製する機会を提供する。iPS細胞は、体細胞にOct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycの4因子を導入することにより作製され、胚性幹細胞と同様の多能性を有する細胞である（非特許文献1-3）。当初の核初期化技術は、樹立効率が極めて低く、十分なiPS細胞量を確保することができていなかったため、効率的な樹立方法を探索すべく、現在に至るまで多くの研究がなされてきた（非特許文献4-7）。これらの成果として、例えば、p53のノックダウン、TGF-βシグナル伝達経路の阻害、DNAメチルトランスフェラーゼの阻害およびp38の阻害などのようないくつかの種類の干渉が、iPS細胞の樹立効率を促進することが明らかとなってきている（特許文献1ならびに非特許文献4および8-14）。
　しかしながら、iPS細胞の樹立効率は未だに十分とは言えず、また、多くの初期化細胞が十分な初期化を達成できない理由も明らかとなっていない。
　ところで、STAT1は、インターフェロン-α（IFN-α）、インターフェロン-γ（IFN-γ）、上皮細胞増殖因子（EGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）およびインターロイキン-6（IL-6）を含む種々の増殖因子やサイトカインにより活性化される転写アクチベーターであり、細胞の生存において重要な役割を果たすことが知られている（非特許文献15および16）。しかしながら、核初期化との関連については知られていない。
WO2012/036299
Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006) Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007) Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007) Huangfu, D. et al., Nat. Biotechnol., 26: 795-797 (2008) Huangfu, D. et al., Nat. Biotechnol., 26: 1269-1275 (2008) Esteban, MA. et al., Cell Stem Cell, 6: 71-79 (2010) Yoshida, Y. et al., Cell Stem Cell, 5: 237-241 (2009) Hong, H. et al., Nature, 460: 1132-1135 (2009) Kawamura, T. et al., Nature, 460: 1140-1144 (2009) Li, H. et al., Nature, 460: 1136-1139 (2009) Marion, R.M. et al., Nature, 460: 1149-1153 (2009) Utikal, J. et al., Nature, 460: 1145-1148 (2009) Maherali, N. et al., Curr. Biol., 19: 1718-1723 (2009) Millelsen, T.S. et al., Nature, 454: 794 (2008) Stark, G.R. et al., Immunity, 36(4): 503-14 (2012) Ivashkiv, L.B. et al., Arthritis Res. Ther., 6: 159-168 (2004)
　本発明の目的は、iPS細胞の樹立効率を改善する手段を提供することであり、それを用いた効率的なiPS細胞の製造方法を提供することである。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、体細胞の核初期化工程においてSTAT1の機能を阻害することにより、iPS細胞の樹立効率を顕著に増大させ得ることを明らかにした。本発明は、そのような知見を基にして完成に至ったものである。
　すなわち、本発明は、次に記載の事項を提供するものである。
（１）人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程においてSTAT1の機能を阻害することを含む、方法、
（２）STAT1の化学的阻害物質を体細胞に接触させることによりSTAT1の機能を阻害する、（１）に記載の方法、
（３）前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、（２）に記載の方法、
（４）STAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸を体細胞に接触させることによりSTAT1の機能を阻害する、（１）に記載の方法、
（５）STAT1の機能阻害物質を含有してなる、人工多能性幹細胞の樹立効率改善剤、
（６）前記阻害物質がSTAT1の化学的阻害物質である、（５）に記載の剤、
（７）前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、（６）に記載の剤、
（８）前記阻害物質がSTAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、（５）に記載の剤、
（９）体細胞に核初期化物質およびSTAT1の機能阻害物質を接触させることを含む、人工多能性幹細胞の製造方法、
（１０）前記阻害物質が化学的阻害物質である、（９）に記載の方法、
（１１）前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、（１０）に記載の方法、
（１２）前記阻害物質がSTAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、（９）に記載の方法、
（１３）核初期化物質がOct3/4、KlfファミリーメンバーおよびSoxファミリーメンバー、またはそれらをコードする核酸を含み、当該Klfファミリーメンバーが、Klf1、Klf2、Klf4またはKlf5、好ましくはKlf2またはKlf4であり、当該Soxファミリーメンバーが、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox17またはSox18、好ましくはSox1、Sox2、Sox3、Sox15またはSox17である、（９）～（１２）のいずれかに記載の方法、および
（１４）核初期化物質がさらにMycファミリーメンバー、またはそれをコードする核酸を含み、当該Mycファミリーメンバーが、c-Myc、c-MycT58A（活性型変異体）、N-MycまたはL-Mycである、（１３）に記載の方法。
　STAT1の機能阻害物質はiPS細胞の樹立効率を顕著に増大させることができるので、従来の樹立効率の低かったiPS細胞誘導法において有用である。
図１は、ヒト皮膚由来線維芽細胞（HDF）に4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc)を導入し、その２日後にSTAT1に対するsiRNAを導入し、感染16日目（4遺伝子の導入から16日目）に得られたヒトES細胞様コロニーの数を示すグラフである。図中、Sicontrolは対照群を示し、SiSTAT1（HSS110273、Invitrogen社）はSTAT1に対するsiRNAを示す。*はp<0.05示す。 図２は、ヒト皮膚由来線維芽細胞（HDF）に4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc)を導入し、その２日後にSTAT1に対するsiRNAを導入し、感染16日目（4遺伝子の導入から16日目）に得られたヒトES細胞様コロニーの数を示すグラフである。図中、SiControlは対照群を示し、SiSTAT1-1（HSS110273、Invitrogen社）およびSiSTAT1-2（HSS186128、Invitrogen社）は、それぞれSTAT1の異なる配列を標的としたSTAT1に対するsiRNAを示す。 図３は、ヒト皮膚由来線維芽細胞（HDF）に4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc)を導入し、EGC(epigallocatechin)を感染5日目から24日目まで添加し、感染24日目（4遺伝子の導入から24日目）に得られたヒトES細胞様コロニーの数を示すグラフである。*はp<0.05示す。
　本発明は、体細胞の核初期化工程においてSTAT1の機能を阻害することによる、iPS細胞の樹立効率の改善方法を提供する。体細胞の核初期化は、該体細胞を後述する核初期化物質と接触させる、好ましくは該体細胞に核初期化物質を導入することにより行われる。ここで「核初期化工程」とは、体細胞と核初期化物質との接触から、初代の胚性幹細胞（ES細胞）様コロニーを生じる前までの期間を意味する。
　STAT1の機能を阻害する手段は特に制限されないが、好ましくは、体細胞にSTAT1の機能阻害物質を接触させる方法が挙げられる。
(a) 体細胞ソース
　本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ウシ、ブタ、ラット、イヌ等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例えば、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例えば、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例えば、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例えば、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例えば、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例えば、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例えば、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例えば、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例えば、線維芽細胞）、収縮性細胞（例えば、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例えば、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例えば、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例えば、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例えば、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例えば、星状グリア細胞）、色素細胞（例えば、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
　体細胞を採取するソースとなる哺乳動物個体は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。たとえば主たるHLA(例えばHLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、あるいはさらにHLA-Cを加えた4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。また、ヒトに投与（移植）しない場合、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取することが望ましい。
　哺乳動物から分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5～20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。核初期化物質及びSTAT1の機能阻害物質（さらに必要に応じて、後述する他のiPS細胞の樹立効率改善物質）との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。
(b) STAT1の機能阻害物質
　本明細書において「STAT1の機能阻害物質」とは、(1)STAT1タンパク質の機能もしくは(2)STAT1遺伝子の発現を阻害し得る限り、いかなる物質であってもよい。すなわち、STAT1タンパク質に直接作用してその機能を阻害する物質や、STAT1遺伝子に直接作用してその発現を阻害する物質のみならず、STAT1のシグナル伝達に関与する因子に作用することにより、結果的にSTAT1タンパク質の機能やSTAT1遺伝子の発現を阻害する物質も、本明細書における「STAT1の機能阻害物質」に含まれる。
　STAT1タンパク質の機能を阻害する物質としては、例えば、STAT1の化学的阻害物質、STAT1のドミナントネガティブ変異体もしくはそれをコードする核酸、抗STAT1アンタゴニスト抗体もしくはそれをコードする核酸、STAT1経路を阻害する物質などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、STAT1の化学的阻害物質が挙げられる。
(1-1) STAT1の化学的阻害物質
　本明細書において「化学的阻害物質」とは、アンチセンス効果、RNA干渉、リボザイム作用などによる発現阻害や、抗原抗体反応、ドミナントネガティブ効果などによる機能阻害を含む、生物学的作用を介して阻害効果を発揮する物質以外の阻害物質を意味し、典型的には、非タンパク性かつ非核酸性の低分子阻害物質である。本発明で使用しうる「STAT1の化学的阻害物質」としては、(2R,3S,4S,5R)-2-(6-amino-2-fluoro-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol(別名、Fludarabine)；peptidomimetics (Gunning PT, et al., Bioorg Med Chem Lett, 17(7):1875-8 (2007))；4-(3'-bromo-4'-hydroxylphenyl)-amino-6,7-dimethoxyquinazoline（WHI-P154）（Sareila O et al., Int Immunopharmacol., 8(1):100-8 (2008)；Outi Sareila, et al., Mediators Inflamm., (2):16161 (2006)）；α-Cyano-(3,4-dihydroxy)-N-benzylcinnamide (AG-490 (別名、Tyrphostin B42))(Outi Sareila, et al., Mediators Inflamm., (2):16161 (2006))；カテキン類［例えば、epigallocatechin (EGC) (本明細書においては、特にことわらない限り、フリー体およびエステル体（例えば、epigallocatechin gallate (EGCG)）を包含する意味で用いる。） (Paul A. Townsend, et al., FASEB J., 18(13):1621-3 (2004); Menegazzi M. et al., FASEB J., 15(7):1309-11(2001)）］などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、EGCである。これらは市販されており、例えば、EGCは、Sigma‐aldrich（E4143）などから入手可能である。
　体細胞へのSTAT1の化学的阻害物質の接触は、該阻害物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたはマウスより単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、約5～20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）中に、阻害物質濃度がSTAT1の機能阻害に十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該阻害物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。阻害物質濃度は用いる阻害物質の種類によって異なるが、約0.1nM～約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
(1-2) STAT1のドミナントネガティブ変異体
　STAT1は通常転写アクチベーター活性を有するが、本明細書において「STAT1のドミナントネガティブ変異体」は、体細胞に内在する野生型STAT1タンパク質と競合的に作用して、その機能を阻害する限り、いかなる物質であってもよい。例えば、ヒトおよびマウスにおけるSTAT1のリン酸化部位である727位のセリンをアラニンに点変異させたSTAT1S727Aなどが挙げられる（Zilong Wen, et al., Cell, 82(2):241-50 (1995)）。
　STAT1のドミナントネガティブ変異体は、例えば、以下の手法により得ることができる。まず、マウスSTAT1については、例えば、NM_001205313.1の配列、NM_001205314.1の配列、NM_009283.4の配列、ヒトSTAT1については、例えば、NM_007315.3の配列、NM_139266.2の配列に基づいて適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、マウスまたはヒトの細胞・組織由来のmRNA、cDNAもしくはcDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーション法や(RT-)PCR法を用いてマウスまたはヒトSTAT1 cDNAをクローニングし、適当なプラスミドにサブクローニングする。変異を導入しようとする部位のコドンを所望の他のアミノ酸をコードするコドンに置換した形で、当該部位を含むプライマーを合成し、これを用いてSTAT1 cDNAを挿入したプラスミドを鋳型とするインバースPCRを行うことにより、目的のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸を取得する。欠失変異体の場合には、欠失させる部位の外側にプライマーを設計して、同様にインバースPCRを行えばよい。このようにして得られたドミナントネガティブ変異体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク質を回収することにより、所望のドミナントネガティブ変異体を取得することができる。
　体細胞へのドミナントネガティブ変異体の接触は、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。STAT1のドミナントネガティブ変異体を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
　PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT(Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988); Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynBl (Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R (Cell Stem Cell, 4:381-384(2009)) や9R (Cell Stem Cell, 4:472-476(2009))等のポリアルギニンが挙げられる。STAT1のドミナントネガティブ変異体のcDNAとPTD配列もしくはCPP配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。比較的分子量の小さい欠失変異体の導入などに好適である。
　マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
　その他、エレクトロポレーション法、セミインタクトセル法（Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365(2006))、Wr-t ペプチドによる導入法（Kondo, E. et al., Mol. Cancer Ther. 3(12), 1623-1630(2004))などのタンパク質導入法も用いることができる。
　タンパク質導入操作は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上（たとえば3回又は4回）繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば6時間～7日間、好ましくは12～48時間もしくは7日間が挙げられる。
(1-3) STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸
　しかしながら、体細胞への導入の容易さを考慮すると、STAT1のドミナントネガティブ変異体は、タンパク質自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。したがって、本発明の別の好ましい実施態様において、STAT1機能阻害物質は、STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸である。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードするcDNAは、該変異体タンパク質の作製について上記した手法によりクローニングすることができる。
　単離されたcDNAは、目的の体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。
　発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
　発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、ドミナントネガティブ変異体をコードする核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。iPS細胞を再生医療のための細胞ソースとして利用する場合、導入遺伝子の発現（再活性化）は、iPS細胞由来の分化細胞から再生された組織における発癌リスクを高める可能性があるので、導入遺伝子は細胞の染色体に組み込まれず、一過的に発現することが好ましい。かかる観点からは、染色体への組込みが稀なアデノウイルスベクターの使用が好ましい。アデノウイルスベクターを用いる具体的手段は、Science, 322, 945-949 (2008) に記載されている。また、アデノ随伴ウイルスも染色体への組込み頻度が低く、アデノウイルスベクターと比べて細胞毒性や炎症惹起作用が低いので、別の好ましいベクターとして挙げられる。センダイウイルスベクターは染色体外で安定に存在することができ、必要に応じてsiRNAにより分解除去することができるので、同様に好ましく利用され得る。センダイウイルスベクターについては、J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007) や特許第3602058号に記載のものを用いることができる
　レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いる場合は、いったん導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、後に再活性化される可能性があるので、例えば、Cre/loxPシステムを用いて、不要となった時点でSTAT1ドミナントネガティブ変異体をコードする核酸を切り出す方法が好ましく用いられ得る。即ち、該核酸の両端にloxP配列を配置しておき、iPS細胞が誘導された後で、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞にCreリコンビナーゼを作用させ、loxP配列に挟まれた領域を切り出すことができる。また、LTR U3領域のエンハンサー－プロモーター配列は、挿入突然変異によって近傍の宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、当該配列を欠失、もしくはSV40などのポリアデニル化配列で置換した3’-自己不活性化（SIN）LTRを使用して、切り出されずゲノム中に残存するloxP配列より外側のLTRによる内因性遺伝子の発現制御を回避することがより好ましい。Cre-loxPシステムおよびSIN LTRを用いる具体的手段は、Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009)に開示されている。
　一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている。
　プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができる。2種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は１回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上(たとえば3回又は4回)繰り返して行うことができる。
　尚、アデノウイルスやプラスミドを用いる場合でも、導入遺伝子が染色体に組み込まれることがあるので、結局はサザンブロットやPCRにより染色体への遺伝子挿入がないことを確認する必要がある。そのため、上記Cre-loxPシステムのように、いったん染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、該遺伝子を除去する手段を用いることは好都合であり得る。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)、Woltjen et al., Nature,458: 766-770 (2009) に開示されている。
　別の好ましい非組込み型ベクターとして、染色体外で自律複製可能なエピソーマルベクターが挙げられる。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)に開示されている。必要に応じて、エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素の5’側および3’側にloxP配列を同方向に配置したエピソーマルベクターにSTAT1ドミナントネガティブ変異体をコードする核酸を挿入した発現ベクターを構築し、これを体細胞に導入することもできる。
　該エピソーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。
　また、エピソーマル発現ベクターは、STAT1ドミナントネガティブ変異体をコードする核酸の転写を制御するプロモーターを含む。該プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが用いられ得る。また、エピソーマル発現ベクターは、前記と同様に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などをさらに含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　エピソーマルベクターは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797-801 (2009)等に記載される方法を用いることができる。
　iPS細胞から導入遺伝子の複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクター要素内部および／またはloxP配列近傍の塩基配列を含む核酸をプローブまたはプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析またはPCR分析を行い、バンドの有無または検出バンドの長さを調べることにより実施することができる。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法と用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797-801 (2009)等に記載される方法を用いることができる。
(1-4) STAT1経路阻害物質
　ここでSTAT1経路とは、STAT1を活性化し得るあらゆる上流のシグナル伝達パスウェイおよび活性化STAT1によって媒介されるあらゆる下流のシグナル伝達パスウェイを包含する意味で用いられる。したがって、STAT1経路阻害物質には、上記シグナル伝達パスウェイのいずれかまたは両方を阻害するいかなる物質も含まれる。
　STAT1シグナル伝達経路においては、増殖因子やサイトカインなどのリガンドが細胞膜における受容体に結合すると受容体の複合化が起こり、続いてJakキナーゼが活性化され、次いでSTAT1が活性化されることが知られている。活性化されたSTAT1は核内に移行し、標的遺伝子の転写を活性化する。STAT1シグナル伝達経路の阻害剤としては、例えば、PIAS1タンパク質（Liu B, et al., Proc Natl Acad Sci, 95(18):10626-31(1998)）；histone acetyltransferase (HAT) CBP (Kramer OH, et al., Genes Dev., 23(2):223-35 (2009))；cAMP、カルシウムイオノフォアおよびGM-CSF (Sengupta TK, et al., Proc Natl Acad Sci, 93:9499-9504 (1996)；Yoshimura, et al., Cytokine Growth Factor Rev, 9(3-4):197-204 (1998)) ；peptidomimetics (Gunning PT, et al., Bioorg Med Chem Lett, 17(7):1875-8 (2007))；(2R,3S,4S,5R)-2-(6-amino-2-fluoro-9H-purin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-3,4-diol(別名、Fludarabine) ；CP-690,550 (tofacitinib) (Rosengren S, et al., Ann Rheum Dis, 71(3):440-7 (2012))；4-(3'-bromo-4'-hydroxylphenyl)-amino-6,7-dimethoxyquinazoline（WHI-P154）（Sareila O et al., Int Immunopharmacol., 8(1):100-8 (2008)；Outi Sareila, et al., Mediators Inflamm., (2):16161 (2006)）；α-Cyano-(3,4-dihydroxy)-N-benzylcinnamide (AG-490 (別名、Tyrphostin B42))(Outi Sareila, et al., Mediators Inflamm., (2):16161 (2006))；カテキン類（例えば、epigallocatechin (EGC)（例えば、epigallocatechin gallate (EGCG) 等） (Paul A. Townsend, et al., FASEB J., 18(13):1621-3 (2004); Menegazzi M. et al., FASEB J., 15(7):1309-11(2001))）などが挙げられる。
(1-5) その他の物質
　STAT1タンパク質の機能を阻害するその他の物質として、例えば、抗STAT1アンタゴニスト抗体もしくはそれをコードする核酸が挙げられる。抗STAT1アンタゴニスト抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。抗STAT1アンタゴニスト抗体は、STAT1またはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。また、公知の抗STAT1アンタゴニスト抗体として、例えば、sc-464、sc-346（Santa Cruz Biotechnology）、#9172（Cell Signaling Technology）等が挙げられる。抗STAT1アンタゴニスト抗体をコードする核酸は、抗STAT1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから常法により単離することができる。得られるH鎖及びL鎖遺伝子を連結して単鎖抗体をコードする核酸を作製することもできる。
　抗STAT1アンタゴニスト抗体はSTAT1のドミナントネガティブ変異体と同様に、また、該抗体をコードする核酸は該変異体をコードする核酸と同様にして、それぞれ細胞に導入することができる。
　一方、STAT1遺伝子の発現を阻害する物質としては、例えば、STAT1に対するsiRNAもしくはshRNA、STAT1に対するsiRNAもしくはshRNAを発現するベクター、STAT1に対するアンチセンス核酸及びSTAT1に対するリボザイム等が挙げられる。
(2-1) STAT1に対するsiRNA及びshRNA
　STAT1に対するsiRNAは、下記のNCBI accession numbersで示されたマウスまたはヒトの各STAT1 cDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら（Genes Dev., 15, 188-200 (2001)）の提唱する規則に従って設計することができる。
マウス　　　　　ヒト　　　
NM_001205313.1　NM_007315.3
NM_001205314.1　NM_139266.2
NM_009283.4
　siRNAの標的配列としては、原則的にはAA+(N)19であるが、AA+(N)21もしくはNA+(N)21であってもよい。また、センス鎖の5’末端がAAである必要はない。標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。標的配列のGC含量も特に制限はないが、約30-約50%が好ましく、GC分布に偏りがなく繰り返しが少ない配列が望ましい。尚、下記(2-2)のsiRNAもしくはshRNAを発現するベクターの設計において、プロモーターとしてpolIII系プロモーターを使用する場合、ポリメラーゼの転写が停止しないように、4塩基以上TまたはAが連続する配列は選択しないようにすべきである。
　上述の規則に基づいて選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。特異性の確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19-21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19-21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計する。また、shRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、8-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
　siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）及びpSilencerTM Expression Vector用 インサート デザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）、RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）がこれらに限定されず、QIAGEN、タカラバイオ、SiSearch、Dharmacon、Whitehead Institute、Invitrogen、Promega等のwebサイト上でも同様に検索が可能である。
　STAT1に対するsiRNAは、上記のようにして設計されたセンス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、約90～約95℃で約1分程度変性させた後、約30～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、STAT1に対するshRNAは、上記のようにして設計されたshRNA配列を有するオリゴヌクレオチドをDNA/RNA自動合成機で合成し、上記と同様にしてセルフアニーリングさせることによって調製することができる。
　siRNA及びshRNAを構成するヌクレオチド分子は、天然型のRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（mRNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2'位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2'-O-Me）、CH2CH2OCH3（2'-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
　RNAの糖部のコンフォーメーションはC2'-endo（S型）とC3'-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2'酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。
　但し、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
　STAT1に対するsiRNAは、例えば、Santa Cruz Biotechnology（例えば、Cat# sc-44123）、Invitrogen（例えば、Invitrogen Stealth RNAiTM siRNA、oligo ID: HSS110273）等から購入することもできる。
　STAT1に対するsiRNAもしくはshRNAの体細胞への接触は、プラスミドDNAの場合と同様に、リポソーム法、ポリアミン法、エレクトロポレーション法、ビーズ法等を用いて、該核酸を細胞内へ導入することにより実施することができる。カチオニックリポソームを用いた方法が最も一般的で、導入効率も高い。Lipofectamine2000やOligofectamine（Invitrogen）などの一般的な遺伝子導入試薬の他、例えば、GeneEraserTMsiRNA transfection reagent（Stratagene）等のsiRNA導入に適した導入試薬も市販されている。導入されるsiRNAもしくはshRNAは１種以上同時に導入することもできる。
(2-2) STAT1に対するsiRNAもしくはshRNAを発現するベクター
　siRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより2本鎖のsiRNA（dsRNA）を形成するというものである。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成するというものである。プロモーターとしては、polII系プロモーター（例えば、CMV前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。
　このようにして構築したsiRNAもしくはshRNA発現カセットを、次いでプラスミドベクターやウイルスベクターに挿入する。このようなベクターとしては、STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸について上記したと同様のものが、好ましく利用され得る（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミドなど）。使用するベクターは、ドミナントネガティブ変異体の場合と同様、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択され得る。あるいは、STAT1に対するshRNAをコードする発現ベクターとして、市販のプラスミド（例えば、Invitrogen社から市販されているCat. Code: psirna42-hstat1等）をもとに作製したレトロウイルス等のウイルスベクターなどを使用することもできる。
　STAT1に対するsiRNAもしくはshRNAを発現するベクターの体細胞への接触は、上記のようにして調製されるプラスミドベクターもしくはウイルスベクターを細胞に導入することにより行われる。これらの遺伝子導入は、STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸について上記したと同様の手法で行うことができる。
(2-3) その他の物質
　STAT1遺伝子の発現を阻害する他の物質として、STAT1に対するアンチセンス核酸やリボザイムが挙げられる。
　アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、STAT1 mRNA中の配列だけでなく、STAT1遺伝子の初期転写産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてSTAT1蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、STAT1 mRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約15塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約15～約40塩基、特に約18～約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。標的配列の位置としては、5’-及び3’-UTR、開始コドン近傍などが挙げられるが、それらに限定されない。
　リボザイムとは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。
　アンチセンス核酸やリボザイムはDNA/RNA自動合成機を用いて合成することができる。これらを構成するヌクレオチド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のsiRNAの場合と同様の修飾を受けていてもよい。
　あるいは、アンチセンス核酸やリボザイムは、siRNAの場合と同様に、それらをコードする核酸の形態で使用することもできる。
　上記STAT1の機能阻害物質は、体細胞の核初期化工程においてSTAT1の機能を阻害するのに十分な様式で体細胞に接触させる必要がある。ここで体細胞の核初期化は、核初期化物質を体細胞に接触させることにより実施することができる。
(c) 核初期化物質
　本発明において「核初期化物質」とは、体細胞に導入することにより該体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18、好ましくはSox1, Sox3, Sox15または Sox17、より好ましくはSox1またはSox3で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5、好ましくはKlf2で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2（またはKlf5）, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009)も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。）
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research (2008) 600-603を参照）
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(14) Oct3/4, Klf4（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008)を参照）
(15) Oct3/4, c-Myc（Nature 454:646-650 (2008)を参照）
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EsrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4 (Cell 136: 411-419 (2009)、Nature, 08436, doi:10.1038 published online(2009))
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）
(25) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28
(26) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28, Glis1
　上記(1)-(26)において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2（またはSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。また、上記(1)-(26)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)-(26)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
　これらの組み合わせの中で、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-MycもしくはL-Myc, Nanog、Lin28およびSV40LTから選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。
　とりわけ、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4, Sox2およびKlf4の3因子の組み合わせ（即ち、上記(9)）が好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4, Sox2およびKlf4の3因子のほか、それにc-Mycを加えた4因子を例示することができる。あるいは、iPS細胞の使用態様にかかわらず、Oct3/4, Sox2およびKlf4の3因子にL-MycとLin28を加えた5因子（即ち、上記(25)）、さらにGlis1（即ち、上記(26)）やSV40 Large Tを加えた6因子などを例示することができる。
　さらに、上記におけるc-MycをL-Mycに変更した組み合わせも、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。
　上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトcDNAのヌクレオチド配列並びに当該cDNAにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照すること、またL-Myc、Lin28、Lin28b、Esrrb、EsrrgおよびGlis1のマウスおよびヒトのcDNA配列およびアミノ酸配列情報については、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
遺伝子名　　マウス　　　　　ヒト　　　
L-Myc　　　 NM_008506　　　 NM_001033081
Lin28　　　 NM_145833　　　 NM_024674
Lin28b　　　NM_001031772　　NM_001004317
Esrrb　　　 NM_011934　　　 NM_004452
Esrrg　　　 NM_011935　　　 NM_001438
Glis1　　　 NM_147221　　　 NM_147193
　核初期化物質としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、上記STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸の場合と同様にして、ウイルスベクター、エピソーマルベクターもしくはプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。必要に応じて、上記Cre-loxPシステムやpiggyBacトランスポゾンシステムを利用することもできる。尚、核初期化物質として2以上のタンパク性因子をコードする核酸を細胞に導入する場合、各核酸を別個のベクターに担持させてもよいし、複数の核酸をタンデムに繋いでポリシストロニックベクターとすることもできる。後者の場合、効率的なポリシストロニック発現を可能にするために、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（U.S. Patent No. 4,937,190）など、好ましくは2A配列を用いることができる。
　核初期化物質の体細胞への接触は、(a) 該物質がタンパク性因子である場合、上記STAT1のドミナントネガティブ変異体と同様にして、(b) 該物質が(a)のタンパク性因子をコードする核酸である場合、上記STAT1のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸と同様にして、実施することができる。一方、(c) 核初期化物質が低分子化合物である場合、上記STAT1の化学的阻害物質と同様にして実施することができる。
(d) iPS細胞の樹立効率改善物質
　上記STAT1の機能阻害物質に加え、公知の他の樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（商標）(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human)(Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling活性化剤（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、ES細胞特異的miRNA（例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294およびmiR-295(以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009))）、3’-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) acitvator（例、PS48 (Cell Stem Cell, 7: 651-655 (2010)) など）、神経ペプチドY（WO 2010/147395）、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）（WO 2010/068955）等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい一実施態様においては、p53の機能阻害物質が使用される。p53の機能阻害物質の具体例、それらの取得方法および体細胞との接触方法については、WO 2009/157593に詳細に記載されている。
　前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
　尚、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質およびiPS細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。
　これら他のiPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、STAT1の機能阻害物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。
(e) 培養条件による樹立効率の改善
　体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下（例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など）、10%以下（例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など）、または5%以下（例、4%以下、3%以下、2%以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上（例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など）、0.5%以上（例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など）、または1%以上（例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など）である。
　細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
　低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、体細胞への核初期化物質およびSTAT1の機能阻害物質の接触より前であっても、該接触と同時であっても、該接触より後であってもよいが、例えば、体細胞に核初期化物質およびSTAT1の機能阻害物質を接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2,3,4,5,6,7,8または9）日）おいた後に低酸素条件下で培養することが好ましい。
　低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上または10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下または30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
　さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期および好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の種類、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率などによっても変動する。
　核初期化物質およびSTAT1の機能阻害物質を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および／または幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質およびSTAT1の機能阻害物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。
　iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanogまたはOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子および／またはレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性および／またはレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)）、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。
　選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）および目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、アルカリフォスファターゼ染色や、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
　このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例えば、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例えば、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例１：siRNAによるSTAT1阻害の効果
　ヒトの皮膚由来線維芽細胞（HDF 1616株）に対して、Takahashi, K.ら, Cell, 131: 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルス (pLenti6/UbC-Slc7a1) を用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。この細胞を0.1% ゼラチン (Sigma) でコートした6 well培養プレート (Falcon) の各wellに、1 well当り1.0 x 105細胞で播種した。翌日、Takahashi, K.ら, Cell, 131: 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来の4遺伝子（Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc）をレトロウイルスで導入した。続いて、感染2日目に、Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen)を用いて、STAT1に対するsiRNAを導入した。STAT1に対するsiRNA としては、Invitrogen社から購入した、Invitrogen Stealth RNAiTM siRNA、oligo ID: HSS110273またはHSS186128を用いた。陰性対照として、非特異的siRNA（Sicontrol; Stealth RNAiTMsiRNA Negative Control, Med GC、製品番号12935-300（Invitrogen）より購入）を導入した。得られた細胞を感染4日目に、あらかじめフィーダー細胞を播いておいた100 mmディッシュに2.0 x 105細胞で播種した。
　感染16日目（4遺伝子の導入から16日目）にiPS細胞コロニー数を測定した結果を図１および２に示す。4遺伝子の導入において、それぞれのsiRNAによりSTAT1を阻害することで、Sicontrol（対照）群と比較して有意にヒトiPS細胞コロニー数が増大することが確認された。
実施例２：EGC(epigallocatechin)によるSTAT1阻害の効果
　ヒトの皮膚由来線維芽細胞（HDF 1616株）に対して、Takahashi, K.ら, Cell, 131: 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルス (pLenti6/UbC-Slc7a1) を用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。この細胞を0.1% ゼラチン (Sigma) でコートした6 well培養プレート (Falcon) の各wellに、1 well当り1.0 x 105細胞で播種した。翌日、Takahashi, K.ら, Cell, 131: 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来の4遺伝子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）をレトロウイルスで導入し、感染4日目に、あらかじめフィーダー細胞を播いておいた100 mmディッシュに2.0 x 105細胞で播種した。STAT1阻害剤の作用効果を検討するため、感染5日目から24日目まで、EGC(epigallocatechin)（Sigma‐aldrich, E4143）のDMSO溶液をEGC濃度が10μMとなるように添加した培地中で細胞を培養し、DMSOのみを添加した場合と樹立効率の比較検討を行った。
　感染24日目（4遺伝子の導入から24日目）にiPS細胞コロニー数を測定した結果を図３に示す。4遺伝子の導入において、EGC(epigallocatechin)を添加することで、DMSO（対照）群と比較して有意にヒトiPS細胞コロニー数が増大することが確認された。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、2013年10月17日付で日本国に出願された特願2013-216817を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
　STAT1の機能阻害物質はiPS細胞の樹立効率を顕著に増大させることができるので、従来樹立効率の低かったiPS細胞誘導法において、効率よくiPS細胞を樹立するのに有用である。

Claims (14)

  1. 　人工多能性幹細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程においてSTAT1の機能を阻害することを含む、方法。
  2. 　STAT1の化学的阻害物質を体細胞に接触させることによりSTAT1の機能を阻害する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、請求項２に記載の方法。
  4. 　STAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸を体細胞に接触させることによりSTAT1の機能を阻害する、請求項１に記載の方法。
  5. 　STAT1の機能阻害物質を含有してなる、人工多能性幹細胞の樹立効率改善剤。
  6. 　前記阻害物質がSTAT1の化学的阻害物質である、請求項５に記載の剤。
  7. 　前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、請求項６に記載の剤。
  8. 　前記阻害物質がSTAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、請求項５に記載の剤。
  9. 　体細胞に核初期化物質およびSTAT1の機能阻害物質を接触させることを含む、人工多能性幹細胞の製造方法。
  10. 　前記阻害物質が化学的阻害物質である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記阻害物質がEGC(epigallocatechin)である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記阻害物質がSTAT1に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、請求項９に記載の方法。
  13. 　核初期化物質がOct3/4、KlfファミリーメンバーおよびSoxファミリーメンバー、またはそれらをコードする核酸を含み、当該Klfファミリーメンバーが、Klf1、Klf2、Klf4またはKlf5であり、当該Soxファミリーメンバーが、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox17またはSox18である、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　核初期化物質がさらにMycファミリーメンバー、またはそれをコードする核酸を含み、当該Mycファミリーメンバーが、c-Myc、c-MycT58A（活性型変異体）、N-MycまたはL-Mycである、請求項１３に記載の方法。
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